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WO2017065563A1 - Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2017065563A1
WO2017065563A1 PCT/KR2016/011571 KR2016011571W WO2017065563A1 WO 2017065563 A1 WO2017065563 A1 WO 2017065563A1 KR 2016011571 W KR2016011571 W KR 2016011571W WO 2017065563 A1 WO2017065563 A1 WO 2017065563A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
seq
pharmaceutical composition
nucleotide sequence
rna oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/011571
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English (en)
French (fr)
Inventor
최병석
강석조
이장현
민지연
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority to US15/327,596 priority Critical patent/US10337016B2/en
Priority to JP2018519475A priority patent/JP6630824B2/ja
Priority to CN201680060637.7A priority patent/CN108472388B/zh
Priority to EP16855780.9A priority patent/EP3363464B1/en
Publication of WO2017065563A1 publication Critical patent/WO2017065563A1/ko
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an RNA oligonucleotide having a specific sequence and structure.
  • Cancers divide and grow by the regulatory function of the cells themselves, and die off at the end of their life or damage, balancing the overall number. However, if there is a problem in the control function of these cells by various causes, abnormal cells to die are multiplied indefinitely, invading the surrounding normal tissues or organs to form agglomerates and destroy or modify existing structures. The condition is called cancer. Treatment for cancer includes surgery, radiotherapy, chemotherapy, but there are problems such as low cure rate and many side effects. Therefore, there is a need for the development of new anticancer drugs that can increase the treatment rate while reducing side effects.
  • Pancreatic cancer has a lower incidence than other cancers, but is known to have the highest mortality rate among cancer patients.
  • Pancreatic cancer is a cancer that is difficult to diagnose early and is easily metastasized to surrounding organs or lymph nodes, resulting in an increase in mortality.
  • Chemotherapy and radiotherapy are used to treat pancreatic cancer.
  • Gemcitabine the most commonly used anticancer agent for the treatment of pancreatic cancer, is used in combination with other drugs such as oxalate or 5-FU (5-fluorouracil), but it has a significant effect on the significant survival rate of pancreatic cancer patients. I'm not crazy.
  • RNA oligonucleotides for the treatment of various diseases are in progress.
  • U.S. Patent Application Publication No. 2012/0288476 discloses that oligonucleotides in which a phosphate group is bound to the 5'-end and a cap-free oligonucleotide expresses type 1 interferon, interleukin-18, interleukin-1 ⁇ , and the like. It is disclosed that it can increase.
  • RNA consisting of four nucleotides induces the activity of interferon- ⁇ to promote an immune response.
  • RNAs have in common that they contain triphosphate at the 5'-end. As described above, it is known that RNA does not have a cap at its 5'-end and contains triphosphate, thereby activating expression of interferon by binding to a retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) protein in cells.
  • RAG-I retinoic acid-inducible gene I
  • Interferon is a glycoprotein derived from most cells in which the nucleus is present. Since the interferon- ⁇ and interferon- ⁇ genes of the type I interferon gene cluster have been reported to be deleted in tumor cells, interferon is known as an important factor for tumor growth, and recombinant interferon- ⁇ has been an anticancer agent since the 1980s. (Jun Yoshida et al ., Cancer Sci ., 2004, Vol. 95, No. 11, 858-865).
  • the inventors of the present invention have studied interferon activators in which RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure are expressed by interferon- ⁇ , even though there is no triphosphate at the 5'-end.
  • the present invention was completed by increasing the expression of interferon stimulated gene 56 (ISG56) and inducing apoptosis of cancer cells.
  • ISG56 interferon stimulated gene 56
  • RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure comprising RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for cancer treatment containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3- 3 ') and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are complementary to each other to form a double strand, the double strand is a helical bend structure Has a 3'-terminal end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the 5'-end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is connected in a loop (hairpin) structure, the sequence number Provided is a pharmaceutical composition for treating cancer, wherein the nucleotide sequence represented by 1 has a hydroxyl group (OH) at its 5′-end.
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3- 3 '
  • RNA oligonucleotides having a specific sequence and helical bending structure increases the expression of ISG56 and induces apoptosis of cancer cells.
  • the composition comprising the RNA oligonucleotides may be useful for treating cancer. Can be.
  • RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the structure of 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows FACS apoptosis induction effect of pancreatic cancer cell line (Panc02) by RNA oligonucleotides 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-Long_Bend prepared according to one embodiment of the present invention. This graph is checked using.
  • Figure 6 FACS apoptosis induction effect of the normal cell line (HEK293) by 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention This graph is checked using.
  • Figure 7 is a graph confirming the cell death induction effect of the liver cancer cell line (SNU886) by 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention using FACS.
  • 8A and 8B show the effect of inducing apoptosis of gastric cancer cell lines SNU216 and MKN74 by 5′-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotides prepared according to one embodiment of the present invention, respectively, using FACS. Checked graph.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for cancer treatment containing RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2
  • the base sequence represented by (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is complementary to each other to form a double strand, the double strand has a helical bend structure, SEQ ID NO:
  • the 3'-terminal end of the nucleotide sequence represented by and the 5'-terminal end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is connected in a loop to have a hairpin structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 It provides a pharmaceutical composition for treating cancer having a hydroxyl group (OH) at its 5'-end.
  • RNA oligonucleotides according to the present invention are 8 to 100, 8 to 50, 8 to 30, 8 to 20, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30, 20 to 500, 20 to It may have 300, 10 to 200, 10 to 100, 20 to 100, 20 to 90 or 20 to 50 bases.
  • N 1 to N 6 may be any one selected from the group consisting of A, G, C and U, specifically, G or C Can be.
  • N 1 may be G
  • N 2 is C
  • N 3 may be G (corresponding to SEQ ID NO: 3)
  • SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of N 4 may be a C
  • 5 N is G
  • N 6 is a C (corresponding to SEQ ID NO: 4).
  • RNA oligonucleotide according to the present invention has a helical bend structure between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Characterized in that form.
  • the helical bending structure has a shape bent 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees based on the plane of the double-stranded RNA.
  • the loop may consist of at least 4 bases, for example, 4 to 80, 4 to 75, 4 to 70, 4 to 65, 4 to 60, 4 to 55, It may consist of 4 to 50, 4 to 45, 4 to 40, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15 or 4 to 10 bases.
  • the loop may consist of 4 or 73 bases.
  • the four base sequences constituting the loop are UUCG.
  • a part of the base sequence constituting it in the loop when a part of the base sequence constituting it in the loop is complementary to each other to form a Watson-Crick base pair may have a stem (stem) structure.
  • the stem structure may comprise an AU motif with a Watson-Crick base pair formed between A and U.
  • the AU motif may be composed of 10 to 50, 15 to 40, 20 to 35, 25 to 30 AU base pairs. In one embodiment according to the invention, the AU motif may consist of 26 consecutive AU base pairs.
  • the oligonucleotide having a hairpin RNA structure may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • RNA oligonucleotide according to the present invention is at least one or more of the phosphodiester bond (phosphodiester bond) forming the RNA oligonucleotide in order to inhibit degradation by the endonuclease (improving in vivo stability) It may be modified with one or more bonds selected from the group consisting of phosphorothioate bonds, boranophosphate bonds and methylphosphonate bonds. In a specific embodiment according to the invention said modification is at least one phosphorothioate linkage.
  • RNA oligonucleotides having a hairpin RNA structure (FIG. 1), wherein 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav has a spiral bend structure (FIG. 2), and the spiral bent structure RNA oligonucleotides were found to increase the expression of ISG56 (FIGS. 3 and 4).
  • RNA oligonucleotide having the spiral bending structure induces apoptosis of pancreatic cancer, liver cancer and gastric cancer cell lines without inducing apoptosis of normal cells (FIGS. 5 to 8b).
  • the composition comprising the RNA oligonucleotide can be usefully used for the treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer of the present invention is pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, cervical cancer, breast cancer, blood cancer, skin cancer, epithelial cancer, brain cancer, central nervous cancer Or for treating various cancers such as ovarian cancer.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer according to the present invention may include 10 to 95% by weight of the RNA oligonucleotide according to the present invention as an active ingredient based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable additives such as excipients, carriers, diluents, other auxiliaries, and the like, in addition to the active ingredients described above for administration.
  • pharmaceutically acceptable additives such as excipients, carriers, diluents, other auxiliaries, and the like, in addition to the active ingredients described above for administration.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general state of health, sex and diet of the patient, It may be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the effective amount of the RNA oligonucleotides included in the pharmaceutical composition according to the present invention is such that the intracellular concentration is 1 to 1,000 nM, specifically 100 to 500 nM. In this case, the administration may be administered once a day, may be divided into several times.
  • compositions of the present invention can be administered to a subject in a variety of ways known in the art.
  • the route of administration may be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the method of administration, the volume of body fluid, viscosity, and the like.
  • RNA oligonucleotides were constructed that could increase the expression of interferon- ⁇ or ISG56.
  • RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having triphosphate at the 5′-end was prepared using a technique known in the art.
  • RNA oligonucleotides composed of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 5 to 8 and having a hydroxyl group at the 5'-end or a phosphodiester bond substituted with a phosphorothioate linkage are integrated DNA technology ( Customized DNA) or Dharmacon.
  • 5'-OH-Bend which consists of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 7, has a hydroxyl group at the 5'-end, and the phosphodiester bond which forms RNA oligonucleotide is substituted by the phosphorothioate bond.
  • -GC-8bp-PS RNA oligonucleotides were prepared.
  • a 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and having a hydroxyl group at its 5'-end was prepared.
  • RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was dissolved in a buffer containing 10 mM sodium phosphate (pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v / v)% D 2 O, to prepare a sample in the art
  • Various spectroscopic experiments were carried out by known methods.
  • NOESY two-dimensional NOE spectroscopy
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • 1 H- 13 C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY and 3D HCCH-TOCSY spectroscopy were performed.
  • the ⁇ dihedral angle was obtained from 3 J H1 ', H2' values obtained from DQF-COSY, and all ⁇ back angles were fixed at -158 ⁇ 15 degrees.
  • Other dihedral angles eg, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇
  • the bulge portion did not limit the other back angles, except for some ⁇ and ⁇ back angles.
  • Residual dipolar coupling values were measured by HSQC experiments with increased sensitivity with an accuracy of ⁇ 1 dB.
  • the alignment tensor was analyzed by singular value decomposition to obtain anisotropy value of -8.0 ⁇ and rhombicity value of 0.32.
  • 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav RNA oligonucleotides were forming a spiral bent structure.
  • Such a helical bending structure is composed of two single strands consisting of 5'-GUAGA-3 'and 5'-UUUGC-3' sequences of the 5'-PPP-iav and 5'-OH-iav sequences. It was confirmed that the structure formed by forming double strands through Watson-Crick bond.
  • 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-Long_Bend RNA which are RNA oligonucleotides of the present invention comprising the sequences of 5'-GUAGA-3 'and 5'-UUUGC-3'. It can be seen that the oligonucleotide also forms a helical bent structure.
  • RNA oligonucleotides having the bent structure produced in the present invention it was confirmed whether RNA oligonucleotides (5'-OH-Bend-GC-8bp-PS) linked by phosphorothioate bonds had increased interferon- ⁇ expression activity. In order to confirm the expression change of ISG56 induced by the expression of interferon- ⁇ .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the cell line prepared in Experimental Example 1.1 was treated with the 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide.
  • the cultured cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco, USA) to remove the cells, and counted and divided into 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates. Then, it was incubated for 42 hours at 37 ° C., 5% CO 2 , and after removing the medium, 400 ⁇ l OPTI-MEM (Gibco, USA) and RNA oligonucleotides without FBS were treated.
  • trypsin-EDTA Gibco, USA
  • RNA oligonucleotides Treatment of RNA oligonucleotides consisted of 4 ⁇ l of lipofectamine LTX (Invitrogen, USA), and 1.6 at 1 ⁇ M of 5′-OH-Cont-GC-8bp and 5′-OH-Bend-GC-8bp-PS, respectively, and 1.6. ⁇ l of Plus-Reagent (Invitrogen, USA) was mixed and treated with 200 ⁇ l of cells. Thereafter, the cells were incubated for 4 hours at 37 ° C. and 5% CO 2. In this case, poly (I: C) [poly (I: C)] known as RIG-I ligand was used as a positive control group. As a negative control, only the embryos were treated. After 4 hours, the medium was removed, and 2 ml of DMEM medium containing 10% FBS was added thereto, followed by further incubation for 2 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • RNA was isolated in the following manner to confirm the expression of ISG56 in the cells treated with the RNA oligonucleotide.
  • RNA was removed and the cells were recovered with 500 ⁇ l of TRI-reagent (Ambion, USA), and then the chloroform was added to the collected cells to separate the RNA layer. Isopropanol was added thereto to make pellets. The pellets were washed with 75% ethanol and dried, and then dissolved in sterile distilled water. DNase (Promega, USA) was added to the separated RNA and treated at room temperature for 30 minutes to remove contaminated DNA, and then inactivated with a stop solution. Subsequently, cDNA was synthesized from RNA by using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, USA) for 1 hour at 50 ° C.
  • Real-time PCR was performed using the thus synthesized cDNA as a template. Specifically, real-time PCR was performed on h-tag DNA polymerase (solgent, Korea), dNTP, tetraethylammonium chloride, evagreen dye (Biogreen dye, Biotium, USA), and the target gene interferon- ⁇ and the control. The primers for the gene GAPDH were mixed. Real-time PCR was fixed at 95 ° C. for 15 minutes and then repeated 40 times at 95 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds. At this time, primers targeting ISG56 and GAPDH are shown in Table 1 below.
  • RNA oligonucleotides having a bent structure produced in the present invention in order to confirm whether long-length hairpin RNA oligonucleotides (5'-OH-Long_Bend) have increased interferon- ⁇ expression activity, the expression change of ISG56 was confirmed. It was.
  • RNA oligonucleotide (5'-OH-Bend-GC-8bp-PS or 5'-OH-Long_Bend) and poly (I: C) [poly (I: C)] (Invivogen, USA )
  • OPTI-MEM OPTI-MEM
  • 1 ⁇ l of lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) and 0.6 ⁇ l of Plus-Reagent (Invitrogen, USA) were mixed, which was added to 40 ⁇ l of OPTI-MEM (Gibco, USA) and allowed to react at room temperature for 5 minutes. .
  • RNA oligonucleotides or poly (I: C) [poly (I: C)] and 40 ⁇ l of the mixture of lipofectamine-plus reagent are respectively mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
  • Poly I: C and lipofectamine may be combined with each other.
  • RNA oligonucleotide-lipopeptamine conjugate 80 ⁇ l was administered to the well containing Panc02 cells, and the cells were incubated for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the positive control group was treated with poly (I: C) [poly (I: C)] known as RIG-I ligand, and the negative control group was treated only with medium and 5′-OH-Cont-GC-8bp.
  • RNA oligonucleotides or poly (I: C) [poly (I: C)] as in Example 3.1 were prepared using 5% round-bottom tubes using 0.25% trypsin-EDTA (Gibco, USA). After recovery, the supernatant was removed by spin-down for 5 minutes at 4 ° C. at a speed of 1500 rpm. Cells were then 100 ⁇ L of 1 ⁇ binding buffer (10 mM HEPES, including FITC bound Annexin V (Biolegend, USA) and 7-aminoactinomycin D (7-AAD; BD Bioscience, USA) , 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 ) in the dark for 15 minutes. Thereafter, the stained cells were measured by LSRFortessa flow cytometry (BD Bioscience, USA), and the measurement results were analyzed by FlowJo software (Treestar, USA).
  • 1 ⁇ binding buffer (10 mM HEPES, including FITC bound Annexin V (Biolegen
  • 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide and 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end and having a bent structure have significant levels in pancreatic cancer. Cell line death was induced.
  • FIG. 6 the percentage of cells killed by cell death is shown in FIG. 6.
  • poly I C induced death of the HEK293 cell line
  • 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotides did not induce significant killing of HEK293 cell lines.
  • RNA oligonucleotide and 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide were separated between normal cells (HEK293) and cancer cells (pancreatic cancer cells; Panc02). Only cancer cells were selectively killed in.
  • Liver cancer cell line (SNU886; Korean Cell Line Bank, Republic of Korea) was dispensed in DMEM medium (WELGENE, USA) as in Experimental Example 3.1, and 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS oligonucleotide was prepared in Experimental Example Treatment was carried out as in 3.1. Thereafter, cell death effects were confirmed using FACS as in Experimental Example 3.2.
  • FIG. 7 As shown in FIG. 7, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end and a bending structure induced death of liver cancer cell lines to a significant level.
  • Gastric cancer cell lines (SNU216 and MKN74; Korean Cell Line Bank, Republic of Korea) were dispensed in DMEM medium (WELGENE, USA) as in Experimental Example 3.1 above, and 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS oligonucleotides The treatment was carried out as in Experimental Example 3.1. Thereafter, cell death effects were confirmed using FACS as in Experimental Example 3.2.
  • Figs. 8A and 8B the percentage of cells killed by cell death are shown in Figs. 8A and 8B, respectively.
  • Figures 8a and 8b 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at the 5'-end and a bending structure induced death of gastric cancer cell lines to a significant level.

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Abstract

본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 ISG56의 발현을 증가시키고 암 세포의 세포사멸을 유도하므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
세포는 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 이러한 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 사멸해야 할 비정상 세포들이 무제한 증식하게 되고, 주위의 정상 조직 또는 기관에 침입하여 덩어리를 형성하며 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 암에 대한 치료법에는 수술요법, 방사선요법, 화학요법 등이 있으나 적은 완치율, 많은 부작용 등의 문제점이 있다. 따라서, 부작용을 줄이면서 치료율을 높일 수 있는 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다.
췌장암은 다른 암에 비해 발생 빈도는 낮으나, 기간별 암환자 사망율이 가장 높은 것으로 알려져 있다. 췌장암은 조기 진단이 어려운 암으로 주변 장기나 림프절로 쉽게 전이되는 특징이 있어, 이로 인한 사망률이 계속 증가하고 있다.
췌장암의 치료를 위해서는 화학요법과 방사선요법이 사용되고 있다. 췌장암 치료를 위해 가장 많이 사용되는 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)은 옥살레이트(oxalate)나 5-FU(5-fluorouracil) 등의 다른 약물과 병용되고 있으나, 췌장암 환자의 유의적인 생존율 증가에는 큰 영향을 미치지 못하고 있다.
한편, 최근 RNA 올리고뉴클레오티드를 다양한 질환의 치료에 사용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 미국 특허공개 제2012/0288476호는 5'-말단에 포스페이트기(phosphate group)가 결합되고, 캡(cap)이 없는 상태의 올리고뉴클레오티드가 1형 인터페론, 인터루킨-18, 인터루킨-1β 등의 발현을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다.
또한, 미국 특허공개 제2012/0121551호는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA가 인터페론-α의 활성을 유도하여 면역반응을 촉진함을 개시하고 있다.
상기 공개된 RNA들은 모두 5'-말단에 트리포스페이트를 포함한다는 공통점이 있다. 이와 같이 RNA가 이의 5'-말단에 캡이 존재하지 않고, 트리포스페이트를 포함하면 세포 내의 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 단백질과 결합하여 인터페론의 발현을 활성화시키는 것이 알려져 있다.
인터페론은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질이다. 제 1형 인터페론 유전자 클러스터(cluster)의 인터페론-α 및 인터페론-β 유전자가 종양 세포에서 결실되어 있음이 보고된 이후, 인터페론이 종양의 성장에 중요한 인자로 알려져, 재조합 인터페론-β는 1980년대부터 항암제로 사용되어 왔다(Jun Yoshida et al., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865).
본 발명자들은 암의 치료에 사용가능한 물질을 연구하던 중, 기존에 알려진 바와 달리, 5'-말단에 트리포스페이트가 없어도 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β에 의해 발현되는 인터페론 활성인자 56(interferon stimulated gene 56; ISG56)의 발현을 증가시키고, 암 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 ISG56의 발현을 증가시키고 암 세포의 세포사멸을 유도하므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav의 구조를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS와 5'-OH-Long_Bend에 의한 췌장암 세포주(Panc02)의 세포사멸 유도효과를 FACS를 이용하여 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS와 5'-OH-Long_Bend에 의한 정상 세포주(HEK293)의 세포사멸 유도효과를 FACS를 이용하여 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 간암 세포주 (SNU886)의 세포 사멸 유도효과를 FACS를 이용하여 확인한 그래프이다.
도 8a 및 8b는 각각 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 위암 세포주들 SNU216 및 MKN74의 세포 사멸 유도효과를 FACS를 이용하여 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 100개, 20 내지 90개 또는 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).
또한, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 적어도 4개의 염기로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.
상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 헤어핀 RNA 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond) 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.
본 발명자들은 헤어핀 RNA 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하여(도 1), 그 중 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav가 나선형 굽힘 구조를 갖고(도 2), 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 및 4).
또한, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 정상세포의 세포사멸을 유도하지 않으면서, 췌장암, 간암 및 위암 세포주들의 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다(도 5 내지 8b).
따라서, 본 발명에 따른 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 ISG56의 발현을 증가시키고 암 세포의 세포사멸을 유도하므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 혈액암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 또는 난소암 등 다양한 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어, 부형제, 담체, 희석제, 기타 보조제 등을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 RNA 올리고뉴클레오티드의 유효량은 세포 내 농도가 1 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조
인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
먼저, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 5 내지 8로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.
이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 가지며, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 나아가, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시켜 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800㎒ 의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200㎳ 의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.
NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4Å, 1.8 내지 5.0Å 및 3.8 내지 7.0Å, 또는 1.8 내지 3.4Å, 2.5 내지 4.5Å, 3.5 내지 6.0Å 및 4.0 내지 7.0Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1 ',H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최소화(restrained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정 값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있다.
실험예 1. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 ISG56의 발현 증가 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 포스포로티오에이트 결합으로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
1.1. 세포주의 준비
먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3×106개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.
1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리
상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1×103개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM(Gibco, 미국) 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-OH-Cont-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX(Invitrogen, 미국), 및 1.6 ㎕의 플러스-시약(Invitrogen, 미국)을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.
1.3. ISG56의 발현 확인
상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 ISG56의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.
먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만든 뒤, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, ISG56 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 이름 서열
서열번호 9 ISG56 forward 5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 10 ISG56 reverse 5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'
서열번호 11 GAPDH forward 5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 12 GAPDH reverse 5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 나선형 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드는 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 2. 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Long_Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 나선형 굽힘 구조가 있으며, 긴 길이의 헤어핀을 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 3. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드의 췌장암 세포 사멸 유도 효과 확인
3.1. 세포주의 준비 및 RNA 올리고뉴클레오티드 처리
먼저, 24-웰 플레이트의 각 웰에, 0.5×105 개의 Panc02 세포(Prof. Dr. med. Christiane Bruns, Universittsklinikum Magdeburg) 및 50배 희석시킨 2X 비타민 (Gibco, USA)과 2X NEAA (Non-essential Amino Acid solution; Sigma, USA)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; WELGENE, USA) 배지 300㎕를 분주하였다.
한편, 1 μg/mL의 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 또는 5'-OH-Long_Bend)와 폴리(I:C)[poly(I:C)] (Invivogen, USA)를 각각 40 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco, USA)과 섞어주었다. 그리고, 1 ㎕의 리포펙타민 LTX (Invitrogen, USA) 및 0.6 ㎕의 플러스-시약 (Invitrogen, USA)을 혼합하여, 이를 40 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco, USA)에 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 준비된 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]의 혼합물 40 ㎕와 리포펙타민-플러스시약의 혼합물 40 ㎕을 각각 혼합하고, 20분간 상온에 두어 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 Poly I:C와 리포펙타민이 서로 결합체를 이룰 수 있도록 하였다.
그 후, 80 ㎕의 RNA 올리고뉴클레오티드-리포펙타민 결합체를 Panc02 세포가 들어 있는 웰에 투여하였고, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지와 5'-OH-Cont-GC-8bp만 처리하였다.
3.2. FACS (Fluorecence-activated Cell Sorting)를 이용한 세포사멸 확인
실시예 3.1과 같이 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리한 세포주를 0.25% 트립신-EDTA (Gibco, USA)를 사용해 5 mL 둥근바닥(round-bottom) 튜브에 회수한 뒤, 1500 rpm의 속도로 4oC에서 5분간 스핀-다운(spin-down)하여 상등액을 제거하였다. 그 후, 세포들을 FITC가 결합된 아넥신(Annexin) V (Biolegend, USA)와 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD; BD Bioscience, USA)를 포함한 100 ㎕의 1x 결합 버퍼 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 암실에서 15분간 염색하였다. 그 후, 염색된 세포들을 LSRFortessa flow cytometry (BD Bioscience, USA)로 측정하였고, FlowJo software (Treestar, USA)를 통해 측정 결과를 분석하였다.
그 결과, 세포사멸에 의해 사멸한 세포의 비율을 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드와 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 유의미한 수준으로 췌장암 세포주의 사멸을 유도하였다.
실험예 4. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드의 정상 세포 사멸 유도 효과 확인
정상 세포주 (HEK293; ATCC, USA)를 상기 실험예 3.1과 같이 DMEM 배지 (WELGENE, USA)에 분주하고, RNA 올리고뉴클레오티드를 상기 실험예 3.1과 같이 처리하였다. 그 후, 실험예 3.2와 같이 FACS를 이용해 세포 사멸효과를 확인하였다.
그 결과, 세포 사멸에 의해 사멸한 세포 비율을 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 폴리 I:C는 HEK293 세포주의 사멸을 유도한 반면, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드와 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 유의미한 수준으로 HEK293 세포주의 사멸을 유도하지 않았다.
실험예 3과 4를 종합한 결과, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드와 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 정상세포 (HEK293)와 암세포 (췌장암세포; Panc02) 사이에서 암세포만을 선택적으로 사멸시켰다.
실험예 5. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드의 간암 세포 사멸 유도 효과 확인
간암 세포주 (SNU886; Korean Cell Line Bank, Republic of Korea)를 상기 실험예 3.1과 같이 DMEM 배지 (WELGENE, USA)에 분주하고, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드를 상기 실험예 3.1과 같이 처리하였다. 그 후, 실험예 3.2와 같이 FACS를 이용해 세포 사멸효과를 확인하였다.
그 결과, 세포 사멸에 의해 사멸한 세포 비율을 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드가 유의미한 수준으로 간암 세포주의 사멸을 유도하였다.
실험예 6. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드의 위암 세포 사멸 유도 효과 확인
위암 세포주들 (SNU216 및 MKN74; Korean Cell Line Bank, Republic of Korea)을 상기 실험예 3.1과 같이 DMEM 배지 (WELGENE, USA)에 분주하고, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드를 상기 실험예 3.1과 같이 처리하였다. 그 후, 실험예 3.2와 같이 FACS를 이용해 세포 사멸효과를 확인하였다.
그 결과, 세포 사멸에 의해 사멸한 세포 비율을 도 8a 및 8b에 각각 나타내었다. 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드가 유의미한 수준으로 위암 세포주들의 사멸을 유도하였다.

Claims (11)

  1. RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 암 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6는 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 루프가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 갖고, 상기 스템 구조가 AU 염기쌍으로 이루어진 AU 모티프(motif)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 AU 모티프가 10 내지 50개의 AU 염기쌍으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 7 또는 8로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 암이 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 혈액암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는, 암 치료용 약학 조성물.
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