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WO2017061615A1 - キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変ｔ細胞の調製方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変ｔ細胞の調製方法 Download PDF

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WO2017061615A1
WO2017061615A1 PCT/JP2016/079989 JP2016079989W WO2017061615A1 WO 2017061615 A1 WO2017061615 A1 WO 2017061615A1 JP 2016079989 W JP2016079989 W JP 2016079989W WO 2017061615 A1 WO2017061615 A1 WO 2017061615A1
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WO
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cells
cell
preparation
antibody
culture
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PCT/JP2016/079989
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French (fr)
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信博 西尾
洋三 中沢
美幸 田中
大介 盛田
義行 ▲高▼橋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Shinshu University NUC
Original Assignee
Nagoya University NUC
Shinshu University NUC
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Publication date
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Priority to US15/766,380 priority patent/US11517590B2/en
Priority to EP23202460.4A priority patent/EP4289944A3/en
Priority to JP2017544248A priority patent/JP6857360B2/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a genetically modified T cell expressing a chimeric antigen receptor and its use.
  • CAR therapy Genetically modified T-cell therapy (CAR therapy) using a chimeric antigen receptor (Chimeric Antigen Receptor, hereinafter also referred to as “CAR”) is being clinically applied.
  • CAR typically has a structure in which a single-chain variable region of an antibody is an extracellular domain, which is connected to a transmembrane region, CD3 ⁇ , and an intracellular domain of a molecule that transmits a costimulatory signal.
  • CD3 ⁇ transmembrane region
  • CD3 ⁇ transmembrane region
  • CD3 ⁇ transmembrane region
  • intracellular domain of a molecule that transmits a costimulatory signal By binding to an antigen according to the specificity of the antibody, CAR-T cells are activated and damage target cells (such as cancer cells).
  • CAR therapy has advantages such as relatively easy cell preparation, high cytotoxic activity, and expected long-lasting effects, and is especially resistant to refractory and conventional therapies.
  • CAR-T cells cells used for CAR therapy
  • retroviruses have a high frequency of insertion mutations in proto-oncogenes (leukemia frequently occurs in gene therapy using hematopoietic stem cells), and safety is a problem.
  • cell lines and fetal bovine serum are used for culturing in the conventional method, and long-term safety is a concern particularly in pediatric patients.
  • a dedicated cell culture facility is required when using a viral vector, there is also an economical problem that the treatment cost is very high (Non-patent Document 4).
  • the use of the transposon method which is one of the gene modification techniques using non-viral vectors, is being studied.
  • the transposon method enables permanent gene transfer in the same way as the virus vector method, the gene transfer efficiency is lower than that of the virus vector method, and it can be used for gene transfer operations (such as electroporation and its improved methods).
  • gene transfer operations such as electroporation and its improved methods.
  • An object of the present invention is to eliminate these problems and contribute to clinical application of CAR therapy and improvement of treatment results.
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems. As a result, gene transfer efficiency and survival rate / proliferation rate are improved and finally obtained by co-culturing T cells (gene-modified T cells) after gene transfer operation with separately prepared activated T cells. It was revealed that the number of CAR-T cells increased. On the other hand, efficient preparation of virus-specific CAR-T cells by the strategy of co-culturing T cells (gene-modified T cells) after gene transfer operation with activated T cells retaining viral peptides Successful. The following invention is mainly based on these results.
  • a method for preparing a genetically modified T cell expressing a chimeric antigen receptor comprising the following steps (1) to (4): (1) A step of preparing a non-proliferative cell obtained by stimulating a cell population containing T cells with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody and then performing a treatment for losing the proliferation ability; (2) obtaining a genetically modified T cell into which a target antigen-specific chimeric antigen receptor gene has been introduced by a transposon method; (3) mixing the non-proliferating cells prepared in step (1) and the genetically modified T cells obtained in step (2) and co-culturing while stimulating with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody; (4) A step of collecting the cultured cells.
  • [2] The preparation method according to [1], wherein a step of culturing the cells after co-culture in the presence of a T cell growth factor is performed between step (3) and step (4).
  • [3] The preparation method according to [1] or [2], wherein the co-culture period in step (3) is 1 day to 14 days.
  • [4] The preparation method according to any one of [1] to [3], wherein step (3) is performed in the presence of a T cell growth factor.
  • the preparation method according to [4], wherein the T cell growth factor is IL-15.
  • the preparation method according to [4], wherein IL-15 and IL-7 are used in combination as T cell growth factors.
  • a method for preparing a genetically modified T cell expressing a chimeric antigen receptor comprising the following steps (i) to (iv): (I) After stimulating a cell population containing T cells with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, the virus peptide antigen obtained by culturing in the presence of the virus peptide antigen and treatment for losing the proliferation ability was retained.
  • non-proliferating cells Providing non-proliferating cells; (Ii) obtaining a genetically modified T cell into which a target antigen-specific chimeric antigen receptor gene has been introduced by a transposon method; (Iii) mixing the non-proliferating cells prepared in step (i) with the genetically modified T cells obtained in step (ii) and co-culturing; (Iv) A step of collecting the cultured cells.
  • the preparation method according to [7] wherein a step of culturing the co-cultured cells in the presence of a T cell growth factor is performed between step (iii) and step (iv).
  • the preparation method according to [7] or [8], wherein the co-culture period in step (iii) is 1 day to 14 days.
  • step (iii) is performed in the presence of a T cell growth factor.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • [15] The preparation method according to any one of [1] to [14], wherein the transposon method is a PiggyBac transposon method.
  • a genetically modified T cell that expresses a chimeric antigen receptor obtained by the preparation method according to any one of [1] to [17].
  • a cell preparation comprising a therapeutically effective amount of the genetically modified T cell according to [18].
  • a method for treating cancer comprising administering a therapeutically effective amount of the genetically modified T cell according to [18] to a cancer patient.
  • Preparation and culture of CAR-T cells by conventional methods (culture method 1).
  • Preparation and culture of CAR-T cells by a new method (culture method 2).
  • Preparation and culture of CAR-T cells by a new method (culture method 3).
  • Construction of pIRII-CAR.CD19.28z vector (SEQ ID NO: 1).
  • the CD19CAR gene has a structure sandwiched between a 5 ′ inverted repeat (5′IR) and a 3 ′ inverted repeat (3′IR).
  • CD19CAR consists of a leader sequence (SEQ ID NO: 2), light chain variable region (VL) (SEQ ID NO: 3), heavy chain variable region (VH) (SEQ ID NO: 4), Fc region (CH2, CH3) (SEQ ID NO: 5), It contains the transmembrane region and intracellular domain of CD28 (SEQ ID NO: 6) and CD3 ⁇ (SEQ ID NO: 7).
  • Construction of pCMV-pigBac vector SEQ ID NO: 8).
  • the piggyBac transposase gene is located under the control of the CMV early promoter (CMV immediate ear1y promoter). Number of CAR-T cells obtained by each culture method (mean ⁇ standard error).
  • the Fc region (CH2, CH3) is deleted.
  • the present invention relates to a method for preparing a genetically modified T cell (CAR-T cell) expressing a chimeric antigen receptor.
  • CAR-T cells obtained by the preparation method of the present invention can be used for CAR therapy.
  • the present invention is broadly classified into two types of preparation methods, that is, a method including co-culture with activated T cells (sometimes referred to as “first preparation method” for convenience of explanation) and a viral peptide.
  • a method comprising co-culturing with activated T cells (sometimes referred to as “second preparation method” for convenience of explanation) is provided.
  • various cells for example, T cells in this specification are human cells.
  • Step (1) A step of preparing a non-proliferative cell obtained by stimulating a cell population containing T cells with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody and then performing a treatment for losing proliferative ability.
  • Target antigen by transposon method Step of obtaining genetically modified T cells into which a specific chimeric antigen receptor gene has been introduced
  • the non-proliferative cells prepared in step (1) and the genetically modified T cells obtained in step (2) are mixed together to produce anti-CD3 Step of co-culture while stimulating with antibody and anti-CD28 antibody (4) Step of collecting cells after culture
  • Step (1) is a step of obtaining non-proliferating cells used for protecting T cells after the gene transfer operation (gene-modified T cells used in step (2)). Stimulate with CD3 antibody and anti-CD28 antibody. This treatment yields activated T cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs purified and T cell content increased, or mononuclear cells collected from peripheral blood by pheresis can be used as the “cell population containing T cells”.
  • a culture vessel eg, a culture dish coated with a culture surface with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.
  • Stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies can be applied to T cells in the cell population.
  • Anti-CD3 antibodies for example, the trade name CD3pure antibody provided by Miltenyi Biotech can be used
  • anti-CD28 antibodies for example, the trade name CD28pure antibody provided by Miltenyi Biotech can be used
  • step (1) it is also possible to perform the stimulation of step (1) using magnetic beads coated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody (for example, Dynabeads T-Activator CD3 / CD28 provided by VERITAS).
  • anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody for example, Dynabeads T-Activator CD3 / CD28 provided by VERITAS.
  • the “OKT3” clone is preferably used as the anti-CD3 antibody.
  • Cells that have been stimulated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody are subjected to a treatment for losing their proliferative ability, but before that, they may be cultured in the presence of T cell growth factor.
  • This culture increases the activity of the cells after the stimulation treatment.
  • the culture period here is, for example, 1 to 10 days, preferably 2 to 7 days, more preferably 3 to 4 days. If the culture period is too short, sufficient activation cannot be expected, and if the culture period is too long, costimulatory molecules may be attenuated.
  • the cultured cells may be once stored frozen. In this case, the cells are thawed at the time of use, and after being stimulated again with the anti-CD3 antibody and CD28 antibody (conditions are the same as described above), the cells may be subjected to “treatment for loss of proliferation ability”.
  • Activating T cells that have lost their proliferative ability can be obtained by undergoing a “treatment to lose their proliferative ability”.
  • the treatment for losing the proliferation ability is typically irradiation, but a drug may be used.
  • An example of the irradiation conditions is a treatment for 15 to 30 minutes using gamma rays at an intensity of 25 Gy to 50 Gy.
  • step (2) genetically modified T cells into which a target antigen-specific chimeric antigen receptor gene has been introduced are obtained by the transposon method. That is, in the present invention, the CAR gene is introduced into T cells using the transposon method to obtain CAR-T cells.
  • the transposon method is one of non-viral gene transfer methods.
  • a transposon is a generic term for a short gene sequence that causes gene rearrangement, which has been conserved during evolution. Gene transposition is caused by a pair of gene enzyme (transposase) and its specific recognition sequence.
  • the transposon method for example, the PiggyBac transposon method can be used.
  • the PiggyBac transposon method uses a transposon isolated from an insect (Fraser MJ et al., Insect Mol Biol. 1996 May; 5 (2): 141-51 .; Wilson MH et al., Mol Ther . 2007 Jan; 15 (1): 139-45.), Enabling highly efficient integration into mammalian chromosomes.
  • the PiggyBac transposon method is actually used for the introduction of CAR genes (eg Nakazawa Y, et al., J Immunother 32: 826-836, 2009; Nakazawa Y et al., J Immunother 6: 3-10, 2013, etc. See).
  • the transposon method applicable to the present invention is not limited to the one using PiggyBac.
  • the introduction operation by the transposon method may be performed by a conventional method.
  • a conventional method for example, in the past literature (for example, for the PiggyBac transposon method, Nakazawa Y, et al., J Immunother 32: 826-836, 2009, Nakazawa Y et al., J Immunother 6: 3-10, 2013, or Saha S, Nakazawa Y, Huee LE, Doherty JE, Galvan DL, Rooney CM, Wilson MH. J Vis Exp. 2012 Nov 5; (69): e4235).
  • the PiggyBac transposon method is employed.
  • a vector holding a gene encoding a PiggyBac transposase (transposase plasmid) and a vector having a structure in which a gene encoding a target protein (CAR gene) is sandwiched between inverted repeats of piggyBac (Transposon plasmid) is prepared, and these two vectors are introduced (transfected) into target cells.
  • various techniques such as electroporation, nucleofection, lipofection, and calcium phosphate method can be used.
  • Examples of cells (target cells) into which the CAR gene is introduced include CD4 positive CD8 negative T cells, CD4 negative CD8 positive T cells, T cells prepared from iPS cells, ⁇ -T cells, and ⁇ -T cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood is one of the preferred target cells. That is, in a preferred embodiment, a gene introduction operation is performed on PBMC.
  • PBMC may be prepared by a conventional method. For the preparation method of PBMC, see, for example, Saha S, Nakazawa Y, Huye LE, Doherty JE, Galvan DL, Rooney CM, Wilson MH. J Vis Exp. 2012 Nov 5; (69): e4235. it can.
  • T cell growth factor eg, IL-15 or IL-7. You may decide to culture in presence.
  • the CAR gene encodes a chimeric antigen receptor (CAR) that recognizes a specific target antigen.
  • CAR is a structure containing a target-specific extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain for immune cell effector functions. Hereinafter, each domain will be described.
  • Extracellular domain exhibits specific binding to the target.
  • the extracellular domain includes an scFv fragment of an anti-target monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody used here include rodent (mouse, rat, rabbit, etc.) antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and the like.
  • a humanized monoclonal antibody is an antibody in which the structure of a monoclonal antibody of another animal species (eg, mouse or rat) is similar to that of a human antibody, and only the constant region of the antibody is replaced with that of a human antibody.
  • a chimeric antibody and a human-type CDR-grafted antibody (PTJohons et al., Nature 321,522 (1986) in which parts other than CDRs (complementarity determining regions) present in constant regions and variable regions are substituted with those of human antibodies. ))including.
  • a method for selecting a human antibody framework (FR) highly homologous to a mouse antibody a method for producing a humanized antibody having a high homology, a mouse CDR for a human antibody
  • Techniques for further substitution of amino acids in the FR region after transplantation have already been developed (US Patent No. 5585089, US Patent No. 5693761, US Patent No. 5693762, US Patent No. 6180370, European Patent No. 451216) , European Patent No. 682040, Patent No. 2828340, etc.) and can also be used for the production of humanized antibodies.
  • An scFv fragment is a structure in which an immunoglobulin light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) are linked via a linker, and retains the ability to bind to an antigen.
  • a linker for example, a peptide linker can be used.
  • a peptide linker is a linker consisting of a peptide in which amino acids are linked in a straight chain.
  • a typical example of a peptide linker is a linker composed of glycine and serine (GGS linker or GS linker).
  • the GGS linker and glycine and serine, which are amino acids constituting the GS linker have a small size per se and are difficult to form higher-order structures in the linker.
  • the length of the linker is not particularly limited. For example, a linker having 5 to 25 amino acid residues can be used. The length of the linker is preferably 8 to 25, more preferably 15 to 20.
  • target antigens include CD19 antigen, CD20 antigen, GD2 antigen, CD22 antigen, CD30 antigen, CD33 antigen, CD44 variant7 / 8 antigen, CEA antigen, Her2 / neu antigen, MUC1 antigen, MUC4 antigen, MUC6 antigen, IL-13 receptor -alpha2, immunoglobulin light chain, anti-PSMA, VEGF receptor 2 etc.
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony stimulating factor receptor expressed in leukemic stem cells / progenitor cells
  • GM-CSF which is a ligand of the GM-CSF receptor
  • Myeloid tumor leukemia stem cells, leukemia progenitor cells, leukemia cells, etc. are targets of CAR-T cells, and myeloproliferative tumors, myelodysplastic / myeloproliferative tumors (CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC) ), Cells applicable to prevention and treatment of myelodysplastic syndrome, acute myeloid leukemia, etc. are prepared.
  • CMML myelodysplastic / myeloproliferative tumors
  • transmembrane domain The transmembrane domain is interposed between the extracellular domain and the intracellular signal domain.
  • a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4 or 4-1BB can be used. You may decide to use the transmembrane domain which consists of the polypeptide constructed artificially.
  • the intracellular signal domain transmits a signal necessary for exerting an effector function of an immune cell. That is, an intracellular signal domain that can transmit a signal necessary for activation of immune cells when an extracellular domain binds to a target antigen is used.
  • the intracellular signal domain includes a domain for transmitting a signal via the TCR complex (for convenience, referred to as “first domain”) and a domain for transmitting a costimulatory signal (for convenience, “second domain”). Called).
  • an intracellular domain such as Fc ⁇ RI ⁇ can be used as the first domain.
  • CD3 ⁇ is preferably used.
  • an intracellular domain of a costimulatory molecule is used as the second domain.
  • costimulatory molecules include CD28, 4-1BB (CD137), CD2, CD4, CD5, CD134, OX-40, or ICOS.
  • the intracellular domain of CD28 or 4-1BB is employed.
  • connection mode of the first domain and the second domain is not particularly limited, but preferably, it is known that costimulation was strongly transmitted when CD3 ⁇ was connected distally in the past case.
  • the second domain is arranged on the side. A plurality of identical or different intracellular domains may be linked in tandem to form the first domain. The same applies to the second domain.
  • the first domain and the second domain may be linked directly or a linker may be interposed between them.
  • a linker for example, a peptide linker can be used.
  • a peptide linker is a linker consisting of a peptide in which amino acids are linked in a straight chain. The structure, characteristics, etc. of the peptide linker are as described above. However, as a linker here, you may use what consists only of glycine.
  • the length of the linker is not particularly limited. For example, a linker having 2 to 15 amino acid residues can be used.
  • a leader sequence (signal peptide) is used to promote secretion of CAR.
  • the leader sequence of GM-CSF receptor can be used.
  • the extracellular domain and the transmembrane domain may be linked via a spacer domain.
  • the spacer domain is used to promote binding between CAR and the target antigen.
  • an Fc fragment of human IgG eg, human IgG1, human IgG4
  • a part of the extracellular domain of CD28, a part of the extracellular domain of CD8 ⁇ , and the like can be used as the spacer domain.
  • a spacer domain can also be provided between the transmembrane domain and the intracellular signal domain.
  • a poly A addition signal sequence is placed downstream of the CAR gene. Transcription is terminated by the use of a poly A addition signal sequence.
  • a poly A addition signal sequence SV40 poly A addition sequence, bovine-derived growth hormone gene poly A addition sequence, and the like can be used.
  • the transposon plasmid may contain a detection gene (reporter gene, cell or tissue-specific gene, selection marker gene, etc.), enhancer sequence, WRPE sequence, and the like.
  • the detection gene is used for determining the success or failure of the introduction of the expression cassette and determining the efficiency, detecting the CAR gene expression or determining the expression efficiency, selecting and sorting the cells in which the CAR gene is expressed, and the like.
  • the use of an enhancer sequence can improve the expression efficiency.
  • detection genes the neo gene conferring resistance to neomycin, the npt gene conferring resistance to kanamycin and the like (Herrera Estrella, EMBO J.
  • nptII gene (Messing & Vierra. Gene 1) 9: 259-268 (1982)), hph gene conferring resistance to hygromycin (Blochinger & Diggl mann, Mol Cell Bio 4: 2929-2931), dhfr gene conferring resistance to metatrexate (Bourouis et al. , EMBO J.2 (7)) etc. (above, marker gene), luciferase gene (Giacomin, P1. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact.
  • GUS ⁇ -Glucuronidase
  • fluorescent protein gene such as reporter gene
  • intracellular domain such as GFP (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) and its variants (EGFP, d2EGFP, etc.)
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the detection gene is linked to the CAR gene via, for example, a bicistronic regulatory sequence (for example, a ribosome internal recognition sequence (IRES)) or a sequence encoding a self-cleaving peptide.
  • a bicistronic regulatory sequence for example, a ribosome internal recognition sequence (IRES)
  • IRS ribosome internal recognition sequence
  • a self-cleaving peptide is the 2A peptide (T2A) derived from Thosea asigna virus, but is not limited thereto.
  • Known as self-cleaving peptides are 2A peptide (F2A) from horseshoe disease virus (FMDV), 2A peptide (E2A) from equine rhinitis A virus (ERAV), 2A peptide (P2A) from porcine teschovirus (PTV-1), etc. It has been.
  • step (3) the non-proliferating cells prepared in step (1) and the genetically modified T cells obtained in step (2) are mixed and co-cultured while stimulating with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody.
  • stimulation through costimulatory molecules by non-proliferating cells and stimulation by anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody are added, and genetically modified T cells are activated and their survival and proliferation are promoted.
  • the ratio of the number of non-proliferating cells and the number of genetically modified T cells used for co-culture is not particularly limited, but is, for example, 0.025 to 0.5.
  • a culture solution to which T cell growth factor is added during co-culture IL-15 is preferred as the T cell growth factor.
  • IL-15 is preferred as the T cell growth factor.
  • a culture solution to which IL-7 is added in addition to IL-15 is used.
  • the amount of IL-15 added is, for example, 5 ng / ml to 10 ng / ml.
  • the amount of IL-7 added is, for example, 5 ng / ml to 10 ng / ml.
  • T cell growth factors such as IL-15 and IL-7 can be prepared according to conventional methods. Moreover, a commercial item can also be utilized.
  • T cell growth factors of animal species other than humans are not excluded, usually, T cell growth factors are derived from humans (may be recombinant). Growth factors such as human IL-15 and human IL-7 can be obtained in advance (for example, provided by Miltenyi Biotech, R & D Systems, etc.).
  • a medium supplemented with serum (human serum, fetal bovine serum, etc.) may be used, but by using a serum-free medium, the safety in clinical application is high and the culture efficiency due to the difference between serum lots is improved. It becomes possible to prepare cells having the advantage that differences are difficult to make.
  • Specific examples of the serum-free medium for T cells are TexMACS TM (Miltenyi Biotech) and AIM V (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific).
  • serum autologous serum, that is, an individual derived from the genetically modified T cell obtained in step (2) (typically the chimeric antigen receptor genetically modified T cell obtained by the preparation method of the present invention). It is recommended to use serum collected from the patient.
  • a medium suitable for T cell culture may be used, and specific examples include TexMACS TM and AIM V (registered disease trademark) described above.
  • Other culture conditions may be any suitable culture conditions as long as they are suitable for the survival and proliferation of T cells. For example, it may be cultured in a CO 2 incubator set at 37 ° C. (CO 2 concentration 5%).
  • CO 2 concentration 5% the stimulation by the anti-CD3 antibody and the anti-CD28 antibody is the same as that in the step (1), the description thereof is omitted.
  • the period of co-culture in step (3) is, for example, 1 to 10 days, preferably 1 to 7 days, more preferably 2 to 4 days. If the culturing period is too short, a sufficient effect cannot be expected, and if the culturing period is too long, there is a risk of cell activity (life force) being reduced.
  • step (4) following step (3) the cultured cells are collected.
  • the collection operation may be performed by a conventional method. For example, it collect
  • a step of culturing the co-cultured cells in the presence of T cell growth factor is performed between step (3) and step (4). This step enables efficient expansion culture and has the advantage of increasing cell viability.
  • IL-15, IL-7, etc. can be used as T cell growth factors.
  • the cells are cultured in a medium supplemented with IL-15 and IL-7.
  • the culture period is, for example, 1 to 21 days, preferably 5 to 18 days, more preferably 10 to 14 days. If the culture period is too short, a sufficient increase in the number of cells cannot be expected, and if the culture period is too long, there is a risk of cell activity (life force) decrease, cell exhaustion / fatigue, and the like. You may subculture during culture
  • the medium is changed as necessary. For example, about 1/3 to 2/3 of the culture solution is replaced with a new medium once every three days.
  • virus-specific CAR ⁇ virus-specific chimeric antigen receptor gene-modified T cell
  • T cells virus-specific CAR ⁇
  • Virus-specific CAR-T cells can be expected to improve persistence in the body by stimulation from viral T cell receptors when used for autologous transplantation, and further allogeneic immune response (GVHD) when used for allogeneic transplantation This reduction has an important advantage in clinical applications such as the possibility of preparing CAR-T from a transplant donor and the possibility of formulating CAR-T cells from a third-party donor.
  • the preparation method of this embodiment includes the following steps (i) to (iv).
  • matters that are not mentioned for example, a method for preparing a cell population containing T cells, a basic operation for stimulation with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, a method for treatment for losing proliferation ability, an operation for gene introduction by a transposon method, Since the basic operation of co-culture, the cell recovery method, and the like are the same as those in the first preparation method described above, the overlapping description is omitted and the corresponding description is used.
  • Step of preparing non-proliferating cells Step of preparing non-proliferating cells (ii) Step of obtaining genetically modified T cells into which a target antigen-specific chimeric antigen receptor gene has been introduced by transposon method (iii) Non-proliferating cells prepared in step (i) Mixing and co-culturing the genetically modified T cells obtained in step (ii) (iv) recovering the cultured cells
  • step (i) first, a cell population containing T cells is stimulated with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody to obtain activated T cells. Then, the culture
  • the order of the culture in the presence of the viral peptide antigen and the treatment for losing the growth ability is not particularly limited.
  • the growth ability may be lost after culturing in the presence of the viral peptide antigen, or the culture may be performed in the presence of the viral peptide antigen after the growth ability is lost.
  • the former order is employed because of the expectation that viral peptide antigen uptake will be better before loss of growth ability.
  • a medium supplemented with a viral peptide antigen may be used.
  • a viral peptide antigen may be added to the medium during culture. The concentration of the viral peptide antigen added is, for example, 0.5 ⁇ g / ml to 1 ⁇ g / ml.
  • the culture period is, for example, 10 minutes to 5 hours, preferably 20 minutes to 3 hours.
  • viral peptide antigen refers to an epitope peptide that can induce cytotoxic T cells (CTL) specific for a specific virus or a long peptide containing an epitope.
  • viral peptide antigens include, but are not limited to, adenoviral (AdV) antigenic peptides (see, for example, WO 2007015540 A1), cytomegalovirus (CMV) antigenic peptides (see, for example, JP2002 -255997, JP-A-2004-242599, JP-A-2012-87126), Epstein-Barr virus (EBV) antigen peptide (for example, WO2007049737A1, Japanese Patent Application No. 2011-177487, JP 2006-188513), etc. can be used.
  • AdV adenoviral
  • CMV cytomegalovirus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Viral peptide antigens can be prepared by conventional methods (eg, liquid phase synthesis method, solid phase synthesis method) based on sequence information. Some viral peptide antigens are commercially available (for example, provided by Medical Biology Laboratory, Takara Bio, Miltenyi Biotech, etc.).
  • antigen peptide mixture usually two or more types of antigen peptides (antigen peptide mixture) are used.
  • antigen peptide mixture usually two or more types of antigen peptides (antigen peptide mixture) are used.
  • two or more types of antigen peptides in combination a plurality of activated T cells with different targets (antigen peptides) can be obtained, and CAR-T cells obtained by the preparation method of the present invention are effective treatment subjects (patients) ) (Increased coverage).
  • an antigen peptide mixture of EBV virus may be used alone or in combination with an antigen peptide mixture of another virus.
  • AdV antigen peptide mixture AdV antigen peptide mixture, CMV antigen peptide mixture and EBV antigen peptide mixture are also commercially available (for example, PepTivator (registered trademark) AdV5 Hexon, PepTivator (registered trademark) CMV pp65, PepTivator (provided by Miltenyi Biotech) (Registered trademark) EBV EBNA-1, PepTivator (registered trademark) EBV BZLF1, PepMix TM Collection HCMV provided by JPT Peptide Technologies, PepMix TM EBV (EBNA1), etc.) can be easily obtained.
  • Step (ii) is the same as step (2) of the first preparation method of the present invention. This step yields genetically modified T cells (CAR-T cells).
  • CAR-T cells genetically modified T cells
  • step (iii) the non-proliferating cells (viral peptide-retaining non-proliferating cells) prepared in step (i) and the genetically modified T cells obtained in step (ii) are mixed and co-cultured.
  • stimulation through costimulatory molecules and virus antigen peptides by non-proliferating cells is added, and virus antigen-specific genetically modified T cells are activated and their survival and proliferation are promoted.
  • the ratio of the number of non-proliferating cells and the number of genetically modified T cells used for co-culture is not particularly limited, but is, for example, 0.025 to 0.5.
  • This step is mainly for anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody for the purpose of selectively expanding virus-specific CAR-T cells, avoiding strong stimulation and preventing T cell exhaustion / fatigue, etc. Do not apply irritation.
  • a culture solution to which T cell growth factor is added during co-culture IL-15 is preferred as the T cell growth factor.
  • IL-7 is preferred as the T cell growth factor.
  • a culture solution to which IL-7 is added in addition to IL-15 is used.
  • the amount of IL-15 added is, for example, 5 ng / ml to 10 ng / ml.
  • the amount of IL-7 added is, for example, 5 ng / ml to 10 ng / ml.
  • the conditions not mentioned are the same as in step (3) of the first preparation method of the present invention.
  • Viral peptide-retaining non-proliferating cells may be added during step (iii). Alternatively, the cells after the co-culture may be collected and mixed with the virus peptide-retaining nonproliferative cells, and then co-culture may be performed again. These operations may be repeated twice or more. Thus, if stimulation is performed multiple times without activation using viral peptide-retaining nonproliferative cells, the induction rate of virus-specific CAR-T cells is improved, and the number of virus-specific CAR-T cells is increased. We can expect increase. In addition, what was prepared anew or what preserve
  • the period of co-culture in step (iii) is, for example, 1 to 21 days, preferably 5 to 18 days, and more preferably 10 to 14 days. If the culturing period is too short, a sufficient effect cannot be expected, and if the culturing period is too long, there is a risk of cell activity (life force) decrease, cell exhaustion / fatigue, and the like.
  • the genetically modified T cells obtained in step (ii) may be co-cultured with viral peptide-retaining non-proliferating PBMC (peripheral blood mononuclear cells).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a cell obtained by co-culturing the genetically modified T cell obtained in step (ii) and the non-proliferative PBMC retaining virus peptide, and the non-proliferating cell retaining virus peptide prepared in step (i) Are mixed and co-cultured.
  • the viral peptide-retaining non-proliferative PBMC here can be prepared by subjecting PBMC to culture in the presence of a viral peptide antigen and a treatment to lose the proliferation ability. Specifically, for example, PBMCs isolated from peripheral blood are treated with radiation and then cultured in the presence of viral peptide antigens to obtain viral peptide-retaining nonproliferative PBMCs. In addition, while preparing a viral peptide-retaining nonproliferative PBMC using a part of PBMC isolated from peripheral blood obtained by one blood collection, and preparing a genetically modified T cell from the other part, The number of blood collections associated with the implementation of the present invention can be reduced, which is a great advantage in clinical application.
  • step (i) is performed using the remaining PBMC to prepare non-proliferating cells that retain viral peptides (cells used for the second stage of co-culture)
  • the necessary three types of cells A genetically modified T cell, a non-proliferative PBMC retaining viral peptide used for co-culture with the cell, and a non-proliferating cell retaining viral peptide used for the second stage co-culture can be prepared by a single blood collection. Therefore, the burden on the patient in the treatment using the CAR-T cells obtained in the present invention is greatly reduced.
  • step (iv) following step (iii) the cultured cells are collected.
  • a step (expansion culture) of culturing the co-cultured cells in the presence of T cell growth factor is performed between step (iii) and step (iv). It may be.
  • Viral peptide-retaining non-proliferating cells may be added during expansion culture, or viral peptide-retaining non-proliferating cells may be added during expansion culture.
  • a further aspect of the present invention provides a genetically modified T cell expressing a chimeric antigen receptor (hereinafter referred to as “the present invention”) obtained by the preparation method of the present invention. Called “Car-T cells”) and their uses.
  • the CAR-T cells of the present invention can be used for the treatment, prevention or amelioration of various diseases for which CAR therapy is considered effective (hereinafter referred to as “target diseases”).
  • a representative target disease is cancer, but is not limited thereto.
  • target diseases include various B-cell lymphomas (such as follicular malignant lymphoma, diffuse malignant lymphoma, mantle cell lymphoma, MALT lymphoma, intravascular B-cell lymphoma, CD20 positive Hodgkin lymphoma), myeloproliferative tumors, bone marrow Dysplasia / myeloproliferative tumor (CMML, JMML, CML, MDS / MPN-UC), myelodysplastic syndrome, acute myeloblastic leukemia, neuroblastoma, brain tumor, Ewing sarcoma, osteosarcoma, retinoblastoma, small lung Cellular tumor, melanoma, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, kidney cancer, pancreatic cancer, malignant mesothelioma, prostate cancer and the like.
  • B-cell lymphomas such as follicular malignant lymphoma, diffuse malignant lymphoma, mantle
  • Treatment includes alleviation of symptoms or concomitant symptoms characteristic of the target disease (mildness), prevention or delay of deterioration of symptoms, and the like. “Prevention” refers to preventing or delaying the onset / onset of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset / onset. On the other hand, “improvement” means that a disease (disorder) or a symptom thereof is alleviated (lightened), improved, ameliorated, or cured (including partial healing).
  • the CAR-T cells of the present invention can also be provided in the form of cell preparations.
  • the cell preparation of the present invention contains a therapeutically effective amount of the CAR-T cell of the present invention.
  • a therapeutically effective amount of the CAR-T cell of the present invention for example, for a single administration, 10 4 to 10 10 cells are contained.
  • Various components (vitamins) for the purpose of cell activation, proliferation or differentiation induction, such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and serum albumin for the purpose of cell protection, such as antibiotics for the purpose of blocking bacterial contamination , Cytokines, growth factors, steroids, etc.) may be included in the cell preparation.
  • the administration route of the CAR-T cell or cell preparation of the present invention is not particularly limited.
  • administration is by intravenous injection, intraarterial injection, intraportal injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection.
  • Local administration may be used instead of systemic administration. Examples of the local administration include direct injection into a target tissue / organ / organ.
  • the administration schedule may be prepared in consideration of the subject's (patient) sex, age, weight, disease state, and the like. In addition to single administration, multiple administration may be performed continuously or periodically.
  • CAR therapy using the transposon method is particularly advantageous in terms of safety compared to the case of using a viral vector.
  • problems such as low gene transfer efficiency, easy cell damage due to the operation during gene transfer (for example, electroporation), and a small number of cells obtained. In order to overcome these problems, the following examination was conducted.
  • Method (1) Preparation of activated T cells (1-1) Preparation of anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody-coated (sensitized) plate
  • Anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody were diluted with PBS to 1 mg / ml, Add 0.5 ml / well to a 24-well uncoated plate. Leave the plate in a 37 ° C incubator for 2-4 hours. Aspirate antibody-diluted PBS and wash once with 1 ml PBS per well.
  • Day 1 Stimulate with anti-CD3 / anti-CD28 antibody coated plate.
  • Day 4 Cells are transferred to G-Rex10 and cultured in TexMACS TM supplemented with IL-7 10 ng / ml and IL15 5 ng / ml.
  • Day 7 Half of the culture medium is replaced with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 10 Half of the culture is exchanged with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 14 End culture.
  • Day 1 Stimulate with anti-CD3 / anti-CD28 antibody coated plate.
  • Day 4 Transfer cells to G-Rex10 and culture with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 7 Half of the culture medium is replaced with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 10 Half of the culture is exchanged with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 14 End culture.
  • Transfected cells and activated virus cells supplemented with irradiated virus peptide are mixed, floated on TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml, and cultured in a 24-well plate in a 37 ° C incubator To start. Day 2 to Day 5: If necessary, exchange half of the culture medium with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml. Day 7: Cells are collected and counted.
  • Virus peptide-added activated T cells 2x10 6 prepared in the same manner as above and the recovered cells were suspended in 30 ml of IL-15 (5 ng / ml) and IL-7 (10 ng / ml) -added culture solution, Start culture with G-Rex10.
  • Day 10 Half of the culture is exchanged with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • Day 14 End culture.
  • the number of CAR-T cells is 1.18 ⁇ 10 6 ( ⁇ 0.509 ⁇ 10 6 ) in culture method 1, 7.13 ⁇ 10 6 ( ⁇ 3.25 ⁇ 10 6 ) in culture method 2, and 1.09 ⁇ 10 7 ( ⁇ 2.98) in culture method 3. ⁇ 10 6 ) (FIG. 6).
  • the gene transfer efficiency was 3.22% ( ⁇ 1.42) for culture method 1, 10.3% ( ⁇ 4.21) for culture method 2, and 26.9% ( ⁇ 2.79) for culture method 3 (FIG. 7).
  • the parentheses are standard errors.
  • the number of CAR-T cells increased and the gene transfer efficiency also increased.
  • the number of CAR-T cells increases due to cell stimulation by the expression of costimulatory molecules (protective effect of transgenic cells damaged during electroporation) and cytokine stimulation by the culture microenvironment. It is thought that an increase in gene transfer efficiency was brought about.
  • culture method 3 the number of CAR-T cells and gene transfer efficiency are increased by cell stimulation by expression of costimulatory molecules, cytokine stimulation by culture microenvironment, and relatively gentle cell stimulation from virus-specific T cell receptors. It is thought that the rise of
  • Method Day 0 Isolate mononuclear cells (PBMC) from peripheral blood. After irradiating a part ( 6 PBMC 1x10), add viral peptides (PepTivator CMV pp65, PepTivator AdV5 Hexon, PepTivator EBV EBNA-1 and PepTivator EBV BZLF1 50ng each) and incubate at 37 ° C for 30 minutes.
  • pIRII-CAR.CD19_optimized vector FIG. 10
  • pCMV-pigBac vector FIG.
  • virus peptides (PepTivator CMV pp65, PepTivator AdV5 Hexon, PepTivator EBV EBNA-1 and PepTivator EBV BZLF1 50ng each) were added, 37 Incubate at 30 ° C for 30 minutes.
  • the virus peptide-added activated T cells 2x10 6 thus obtained and the recovered cells were suspended in 30 ml of a culture solution supplemented with IL-15 (5 ng / ml) and IL-7 (10 ng / ml), and G -Start culture at Rex10.
  • Day 10 Half of the culture is exchanged with TexMACS TM supplemented with IL-7 10ng / ml and IL15 5ng / ml.
  • CAR-T cells prepared by the novel culture method were evaluated by the following methods.
  • CAR-T cells (1 ⁇ 10 5 cells) and CD19 positive leukemia cell lines (5 ⁇ 10 5 cells) were co-cultured in RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum for 7 days (effector cells: target cells 1: 5 ).
  • mice treated with expanded CAR-T cells in contrast to tumor cells grown in mice treated with non-transgenic activated T cells (control (NT)). No tumor cell growth was observed. That is, CAT cells strongly suppressed tumor growth in tumor-bearing mice.
  • CAR gene introduction efficiency and cell proliferation rate when CAR-T cells are prepared using the transposon method can be increased. That is, the present invention enhances the practicality of a highly safe method of preparing CAR-T cells using the transposon method, thereby promoting the clinical application of CAR therapy and contributing to the increase in the therapeutic effect of CAR therapy.

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Abstract

トランスポゾン法を利用したCAR療法における遺伝子導入効率の向上を図る。（１）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ；（２）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；（３）ステップ（１）で用意した非増殖性細胞とステップ（２）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ；（４）培養後の細胞を回収するステップを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法が提供される。また、（ｉ）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ；（ｉｉ）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で用意した非増殖性細胞とステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ；（ｉｖ）培養後の細胞を回収するステップを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法が提供される。

Description

キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法
　本発明はキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法及びその用途に関する。本出願は、２０１５年１０月８日に出願された日本国特許出願第２０１５－２００４５８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor。以下、「CAR」とも呼ぶ）を用いた遺伝子改変T細胞療法(CAR療法)が臨床応用されつつある。CARは、典型的には、抗体の単鎖可変領域を細胞外ドメインとし、それに膜貫通領域、CD3ζ及び共刺激シグナルを伝える分子の細胞内ドメインをつないだ構造を備える。抗体の特異性に従って抗原に結合することによりCAR-T細胞は活性化し、標的細胞（がん細胞など）を傷害する。CAR療法は、細胞の調製が比較的容易であること、高い細胞傷害活性を示すこと、持続的な効果を期待できることなどの利点を有し、特に、難治性や従来の治療法に抵抗性の症例に対する新たな治療手段として期待されている。実際、化学療法抵抗性急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia）患者に対して、細胞表面に発現するCD19抗原に対するCARを、患者から採取した末梢血T細胞に遺伝子導入し、培養して輸注する臨床試験が欧米で行われ、寛解率80～90％の良好な成績が報告されている(非特許文献１～３)。CAR療法は、米国では難治性がんに対して最も将来有望な治療法の1つとして注目されている。
　従来、CAR療法に用いる細胞（CAR-T細胞）はウイルスベクターを用いて調製されてきた。しかしながら、一般に使用されるレトロウイルスは、がん原遺伝子への挿入変異の頻度が高く（造血幹細胞を用いた遺伝子治療では白血病が多発している）、安全性が問題となる。また、従来法では細胞株や牛胎児血清を培養に用いており、特に小児患者においては長期安全性が懸念される。更には、ウイルスベクターを使用する際には専用細胞培養設備が必要となるため、治療費が非常に高額となるという、経済性の問題もある（非特許文献４)。
Grupp SA, Kalos M, Barrett D, Aplenc R, Porter DL, Rheingold SR, Teachey DT, Chew A, Hauck B, Wright JF, Milone MC, Levine BL, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med, 368(16):1509-18. 2013 Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ, Chew A, Gonzalez VE, Zheng Z, Lacey SF, Mahnke YD, Melenhorst JJ, Rheingold SR, Shen A, Teachey DT, Levine BL, June CH, Porter DL, Grupp SA. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med, 371(16):1507-17. 2014 Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, Cui YK, Delbrook C, Feldman SA, Fry TJ, Orentas R, Sabatino M, Shah NN, Steinberg SM, Stroncek D, Tschernia N, Yuan C, Zhang H, Zhang L, Rosenberg SA, Wayne AS, Mackall CL. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2014 Morgan RA. Faster, cheaper, safer, T-cell engineering. J Immunother, 36(1):1-2. 2013
　ウイルスベクターを利用した従来のCAR療法における問題点を解決するために、非ウイルスベクターを用いた遺伝子改変技術の一つであるトランスポゾン法の利用が検討されている。トランスポゾン法は、ウイルスベクター法と同様に永続的な遺伝子導入を可能にするものの、ウイルスベクター法と比較して遺伝子導入効率が低く、また、遺伝子導入操作（エレクトロポレーション及びその改良法など）に伴い細胞が傷害を受け、細胞生存率や細胞増殖率が低下するといった問題を抱える。本発明の課題は、これらの問題点を解消し、CAR療法の臨床応用及び治療成績の向上に資することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、遺伝子導入操作後のT細胞（遺伝子改変T細胞）を、別途用意した活性化T細胞と共培養することによって、遺伝子導入効率及び生存率／増殖率が向上し、最終的に得られるCAR-T細胞の数が増大することが明らかとなった。一方、遺伝子導入操作後のT細胞（遺伝子改変T細胞）を、ウイルスペプチドを保持させた活性化T細胞と共培養するという戦略によって、ウイルス特異的CAR-T細胞を効率的に調製することに成功した。以下の発明は、主としてこれらの成果に基づく。
　［１］以下のステップ（１）～（４）を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法：
　（１）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ；
　（２）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；
　（３）ステップ（１）で用意した非増殖性細胞とステップ（２）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ；
　（４）培養後の細胞を回収するステップ。
　［２］ステップ（３）とステップ（４）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、［１］に記載の調製方法。
　［３］ステップ（３）の共培養の期間が1日～14日である、［１］又は［２］に記載の調製方法。
　［４］ステップ（３）を、T細胞増殖因子の存在下で行う、［１］～［３］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［５］T細胞増殖因子がIL-15である、［４］に記載の調製方法。
　［６］T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、［４］に記載の調製方法。
　［７］以下のステップ（ｉ）～（ｉｖ）を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法：
　（ｉ）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ；
　（ｉｉ）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；
　（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で用意した非増殖性細胞とステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ；
　（ｉｖ）培養後の細胞を回収するステップ。
　［８］ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、［７］に記載の調製方法。
　［９］ステップ（ｉｉｉ）の共培養の期間が1日～14日である、［７］又は［８］に記載の調製方法。
　［１０］ステップ（ｉｉｉ）を、T細胞増殖因子の存在下で行う、［７］～［９］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１１］T細胞増殖因子がIL-15である、［１０］に記載の調製方法。
　［１２］T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、［１０］に記載の調製方法。
　［１３］T細胞を含む細胞集団が末梢血単核細胞（PBMCs）である、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１４］増殖能を喪失させる処理が放射線照射である、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１５］トランスポゾン法がPiggyBacトランスポゾン法である、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１６］標的抗原がCD19、GD2、GMCSF受容体又はIGF受容体である、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１７］非増殖性細胞と、遺伝子改変T細胞が同一の個体に由来する、［１］～［１６］のいずれか一項に記載の調製方法。
　［１８］［１］～［１７］のいずれか一項に記載の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞。
　［１９］［１８］に記載の遺伝子改変T細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
　［２０］［１８］に記載の遺伝子改変T細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
従来の方法（培養法１）によるCAR-T細胞の作製・培養。 新規方法（培養法２）によるCAR-T細胞の作製・培養。 新規方法（培養法３）によるCAR-T細胞の作製・培養。 pIRII-CAR.CD19.28zベクター（配列番号１）の構成。CD19CAR遺伝子が5'逆向き反復配列（5'IR）と3'逆向き反復配列（3'IR）に挟まれた構造を備える。CD19CARは、リーダー配列（配列番号２）、軽鎖可変領域（VL）（配列番号３）、重鎖可変領域（VH）（配列番号４）、Fc領域（CH2、CH3）（配列番号５）、CD28の膜貫通領域及び細胞内ドメイン（配列番号６）及びCD3ζ（配列番号７）を含む。 pCMV-pigBacベクター（配列番号８）の構成。CMV最初期プロモーター（CMV immediate ear1y promoter）の制御下にpiggyBacトランスポザーゼ遺伝子が配置されている。 各培養法で得られたCAR-T細胞の数（平均±標準誤差）。 各培養法の遺伝子導入率（平均±標準誤差）。 各培養法で得られたCAR-T細胞の数（平均±標準誤差）。N=9。新規方法（培養法２、３）と従来の方法（培養法１）の間に有意差が認められる。また、培養法３は培養法２に比べて有意に多いCAR-T細胞数をもたらした。 各培養法の遺伝子導入率（平均±標準誤差）。N=9。新規方法（培養法２、３）と従来の方法（培養法１）の間に有意差が認められる。また、培養法３は培養法２に比べて有意に高い遺伝子導入率を示した。 最適化したCAR遺伝子導入用ベクターであるpIRII-CAR.CD19_optimizedベクター（配列番号９）の構成。pIRII-CAR.CD19.28zベクターの構造と比較して、Fc領域（CH2、CH3）が削除されている。 pIRII-CAR.CD19_optimizedベクターを用いた場合の遺伝子導入率。フローサイトメトリーの結果（左）とCD3陽性T細胞中のCAR発現細胞の割合（右）を示す。N=9。 細胞障害活性試験の結果。フローサイトメトリーの結果（上）と腫瘍細胞残存率（下）を示す。３種類のCD19陽性白血病細胞株（KOPN30bi、SK-9、TCC-Y/sr）とCAR-T細胞を共培養し、細胞障害活性を評価した。N=6。 抗腫瘍活性試験の結果。担癌マウスにCAR-T細胞を投与した後、生体内イメージングシステムで腫瘍細胞の増殖をモニターした。
　本発明はキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞（CAR-T細胞）の調製方法に関する。本発明の調製方法で得られるCAR-T細胞はCAR療法に利用することができる。本発明は、大別して２種類の調製方法、即ち、活性化T細胞との共培養を含む方法（説明の便宜上、「第１の調製方法」と呼ぶことがある）と、ウイルスペプチドを保持した活性化T細胞との共培養を含む方法（説明の便宜上、「第２の調製方法」と呼ぶことがある）を提供する。尚、特に言及しない限り、本明細書における各種細胞（例えばT細胞）はヒト細胞である。
１．活性化T細胞との共培養を含む方法
　この調製方法（第１の調製方法）では、以下のステップ（１）～（４）を行う。
　（１）T細胞含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ
　（２）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ
　（３）ステップ（１）で用意した非増殖性細胞とステップ（２）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ
　（４）培養後の細胞を回収するステップ
　ステップ（１）は、遺伝子導入操作後のT細胞（ステップ（２）に使用する遺伝子改変T細胞）の保護に用いる非増殖性細胞を得るステップであり、まず、T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激する。この処理によって、活性化T細胞が得られる。「T細胞を含む細胞集団」として、好ましくは、末梢血から採取されるPBMC（末梢血単核細胞）を用いる。PBMCを精製し、T細胞の含有率を高めたものや、末梢血からフェレーシスによって採取した単核球等を、ここでの「T細胞を含む細胞集団」として用いることも可能である。
　例えば、抗CD3抗体と抗CD28抗体で培養面をコートした培養容器（例えば培養皿）で３時間～３日、好ましくは６時間～２日、更に好ましくは１２時間～１日、培養することによって、細胞集団内のT細胞に対して抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激を加えることができる。抗CD3抗体（例えばミルテニーバイオテク社が提供する商品名CD3pure抗体を用いることができる）と抗CD28抗体（例えばミルテニーバイオテク社が提供する商品名CD28pure抗体を用いることができる）は市販もされており、容易に入手可能である。抗CD3抗体と抗CD28抗体がコートされた磁気ビーズ（例えば、VERITAS社が提供するDynabeads T-Activator CD3/CD28）を利用してステップ（１）の刺激を行うことも可能である。尚、抗CD3抗体として「OKT3」クローンを用いることが好ましい。
　抗CD3抗体と抗CD28抗体による刺激を行った細胞は、増殖能を喪失させる処理に供されるが、その前に、T細胞増殖因子の存在下で培養することにするとよい。この培養によって、刺激処理後の細胞の活性が高められる。ここでの培養の期間は例えば１日～１０日、好ましくは２日～７日、更に好ましくは３日～４日である。培養期間が短すぎると十分な活性化を望めず、培養期間が長すぎると共刺激分子減弱のおそれがある。培養後の細胞を一旦、凍結保存することにしてもよい。この場合には、使用時に細胞を融解し、再度、抗CD3抗体及びCD28抗体による刺激（条件は上記に準ずる）を行った後に「増殖能を喪失させる処理」に供するとよい。
　「増殖能を喪失させる処理」を経ることによって、増殖能を喪失した活性化T細胞（非増殖性細胞）が得られる。増殖能を喪失させる処理は、典型的には放射線照射であるが、薬剤を用いることにしてもよい。放射線照射の条件の一例を示すと、ガンマ線を用い、25Gy～50Gyの強度で15～30分間の処理である。
　ステップ（２）では、トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得る。即ち、本発明では、トランスポゾン法を利用してCAR遺伝子をT細胞に導入し、CAR-T細胞を得る。トランスポゾン法とは、非ウイルス遺伝子導入法の一つである。トランスポゾンは、進化の過程で保存されてきた、遺伝子転位を引き起こす短い遺伝子配列の総称である。遺伝子酵素（トランスポザーゼ）とその特異認識配列のペアで遺伝子転位を引き起こす。トランスポゾン法として、例えば、PiggyBacトランスポゾン法を用いることができる。PiggyBacトランスポゾン法は、昆虫から単離されたトランスポゾンを利用するものであり（Fraser MJ et al., Insect Mol Biol. 1996 May;5(2):141-51.; Wilson MH et al., Mol Ther. 2007 Jan;15(1):139-45.）、哺乳類染色体への高効率な組込みを可能にする。PiggyBacトランスポゾン法は実際にCAR遺伝子の導入に利用されている（例えばNakazawa Y, et al., J Immunother 32:826-836, 2009；Nakazawa Y et al., J Immunother 6:3-10, 2013等を参照）。本発明に適用可能なトランスポゾン法はPiggyBacを利用したものに限定されるものではなく、例えば、Sleeping Beauty（Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvak Z (1997) Cell 91: 501-510.）、Frog Prince（Miskey C, Izsvak Z, Plasterk RH, Ivics Z (2003) Nucleic Acids Res 31: 6873-6881.）、Tol1（Koga A, Inagaki H, Bessho Y, Hori H. Mol Gen Genet. 1995 Dec 10;249(4):400-5.；Koga A, Shimada A, Kuroki T, Hori H, Kusumi J, Kyono-Hamaguchi Y, Hamaguchi S. J Hum Genet. 2007;52(7):628-35. Epub 2007 Jun 7.）、Tol2（Koga A, Hori H, Sakaizumi M (2002) Mar Biotechnol  4: 6-11.；Johnson Hamlet MR, Yergeau DA, Kuliyev E, Takeda M, Taira M, Kawakami K, Mead PE (2006) Genesis 44: 438-445.；Choo BG, Kondrichin I, Parinov S, Emelyanov A, Go W, Toh WC, Korzh V (2006) BMC Dev Biol 6: 5.）等のトランスポゾンを利用した方法を採用することにしてもよい。
　トランスポゾン法による導入操作は常法で行えばよく、過去の文献（例えばPiggyBacトランスポゾン法については上掲のNakazawa Y, et al., J Immunother 32:826-836, 2009、Nakazawa Y et al., J Immunother 6:3-10, 2013、或いはSaha S, Nakazawa Y, Huye LE, Doherty JE, Galvan DL, Rooney CM, Wilson MH. J Vis Exp. 2012 Nov 5;(69):e4235）が参考になる。本発明の好ましい一態様では、PiggyBacトランスポゾン法が採用される。典型的には、PiggyBacトランスポゾン法ではPiggyBacトランスポザーゼをコードする遺伝子を保持したベクター（トランスポザーゼプラスミド）と、目的のタンパク質をコードする遺伝子（CAR遺伝子）がpiggyBac逆向き反復配列に挟まれた構造を備えるベクター（トランスポゾンプラスミド）を用意し、これら二つのベクターを標的細胞に導入（トランスフェクション）する。トランスフェクションには、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム法など、各種手法を利用できる。
　CAR遺伝子を導入する細胞（標的細胞）として、CD4陽性CD8陰性T細胞、CD4陰性CD8陽性T細胞、iPS細胞から調製されたT細胞、αβ-T細胞、γδ-T細胞を挙げることができる。上記の如きT細胞又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。末梢血から採取されるPBMC（末梢血単核細胞）は好ましい標的細胞の一つである。即ち、好ましい一態様では、PBMCに対して遺伝子導入操作を行う。PBMCは常法で調製すればよい。尚、PBMCの調製方法については、例えば、Saha S, Nakazawa Y, Huye LE, Doherty JE, Galvan DL, Rooney CM, Wilson MH. J Vis Exp. 2012 Nov 5;(69):e4235を参照することができる。
　遺伝子導入操作を経た細胞はステップ（３）の共培養に供されるが、ステップ（３）の前に、遺伝子導入操作後の細胞をT細胞増殖因子（例えばIL-15やIL-7）の存在下で培養することにしてもよい。
　CAR遺伝子は、特定の標的抗原を認識するキメラ抗原受容体（CAR）をコードする。CARは、標的に特異的な細胞外ドメインと、膜貫通ドメイン、及び免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナルドメインを含む構造体である。以下、各ドメインについて説明する。
（ａ）細胞外ドメイン
　細胞外ドメインは標的に特異的な結合性を示す。例えば、細胞外ドメインは、抗標的モノクローナル抗体のscFv断片を含む。ここでのモノクローナル抗体として、例えば、齧歯類（マウス、ラット、ウサギなど）の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等が用いられる。ヒト化モノクローナル抗体は、他の動物種（例えばマウスやラット）のモノクローナル抗体の構造をヒトの抗体の構造に類似させた抗体であり、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在するCDR（相補性決定領域）以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型CDR移植（CDR-grafted）抗体（P.T.Johons et al., Nature 321,522(1986)）を含む。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体フレームワーク（FR）を選択する方法、相同性の高いヒト型化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスCDRを移植した後さらにFR領域のアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され（米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216号、欧州特許第682040号、特許第2828340号などを参照）、ヒト化抗体の作製に利用することもできる。
　scFv断片とは、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（VL）と重鎖可変領域（VH）がリンカーを介して連結された構造体であり、抗原との結合能を保持している。リンカーとしては、例えばペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーである。ペプチドリンカーの代表例は、グリシンとセリンから構成されるリンカー（GGSリンカーやGSリンカー）である。GGSリンカー及びGSリンカーを構成するアミノ酸であるグリシンとセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくい。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸残基数が５～２５個のリンカーを用いることができる。リンカーの長さは好ましくは８～２５、更に好ましくは１５～２０である。
　標的には、典型的には、腫瘍細胞に特異的な発現が認められる抗原が用いられる。ここでの「特異的な発現」とは、腫瘍以外の細胞に比較して有意ないし顕著な発現が認められることをいい、腫瘍以外の細胞において全く発現がないものに限定する意図はない。標的抗原の例として、CD19抗原、CD20抗原、GD2抗原、CD22抗原、CD30抗原、CD33抗原、CD44variant7/8抗原、CEA抗原、Her2/neu抗原、MUC1抗原、MUC4抗原、MUC6抗原、IL-13 receptor-alpha2、イムノグロブリン軽鎖、PSMA抗、VEGF receptor2などを挙げることができる。
　白血病性幹細胞／前駆細胞に発現しているGM-CSF（顆粒球単球コロニー刺激因子）受容体を標的にすることもできる。この場合、CARを構成する細胞外ドメインには、GM-CSF受容体のリガンドであるGM-CSFが用いられる。そして、骨髄系腫瘍の白血病幹細胞、白血病前駆細胞、白血病細胞等がCAR-T細胞の標的となり、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍（CMML、JMML、CML、MDS/MPN-UC）、骨髄異形成症候群、急性骨髄生白血病等の予防・治療へ適用可能な細胞が調製される。
（ｂ）膜貫通ドメイン
　膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインの間に介在する。膜貫通ドメインとしては、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることにしてもよい。
（ｃ）細胞内シグナルドメイン
　細胞内シグナルドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。即ち、細胞外ドメインが標的の抗原と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能な細胞内シグナルドメインが用いられる。細胞内シグナルドメインには、TCR複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン（便宜上、「第１ドメイン」と呼ぶ）と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン（便宜上、「第２ドメイン」と呼ぶ）が含まれる。第１ドメインとして、CD3ζの他、FcεRIγ等の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、CD3ζが用いられる。また、第２ドメインとしては共刺激分子の細胞内ドメインが用いられる。共刺激分子としてCD28、4-1BB（CD137）、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40又はICOSを例示することができる。好ましくは、CD28又は4-1BBの細胞内ドメインを採用する。
　第１ドメインと第２ドメインの連結態様は特に限定されないが、好ましくは、過去の事例においてCD3ζを遠位につないだ場合に共刺激が強く伝わったことが知られていることから、膜貫通ドメイン側に第２ドメインを配置する。同一又は異種の複数の細胞内ドメインをタンデム状に連結して第１ドメインを構成してもよい。第２ドメインについても同様である。
　第１ドメインと第２ドメインは、これらを直接連結しても、これらの間にリンカーを介在させてもよい。リンカーとしては例えばペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーとは、直鎖状にアミノ酸が連結したペプチドからなるリンカーである。ペプチドリンカーの構造、特徴等は前述の通りである。但し、ここでのリンカーとしては、グリシンのみから構成されるものを用いてもよい。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸残基数が２～１５個のリンカーを用いることができる。
（ｄ）その他の要素
　CARの分泌を促すために、リーダー配列（シグナルペプチド）が用いられる。例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列を用いることができる。また、細胞外ドメインと膜貫通ドメインがスペーサードメインを介して連結した構造にするとよい場合がある。スペーサードメインは、CARと標的抗原との結合を促進させるために用いられる。例えば、ヒトIgG（例えばヒトIgG1、ヒトIgG4）のFc断片をスペーサードメインとして用いることがきる。その他、CD28の細胞外ドメインの一部やCD8αの細胞外ドメインの一部等をスペーサードメインとして用いることもできる。尚、膜貫通ドメインと細胞内シグナルドメインの間にもスペーサードメインを設けることもできる。
　尚、これまでにCARを利用した実験、臨床研究などの報告がいくつかあり（例えばRossig C, et al. Mol Ther 10:5-18, 2004; Dotti G, et al. Hum Gene Ther 20:1229-1239, 2009; Ngo MC, et al. Hum Mol Genet 20 (R1):R93-99, 2011; Ahmed N, et al. Mol Ther 17:1779-1787, 2009; Pule MA, et al. Nat Med 14:1264-1270, 2008; Louis CU, et al. Blood 118:6050-6056, 2011; Kochenderfer JN, et al. Blood 116:4099-4102, 2010; Kochenderfer JN, et al. Blood 119 :2709-2720, 2012; Porter DL, et al. N Engl J Med 365:725-733, 2011; Kalos M, et al. Sci Transl Med 3:95ra73,2011; Brentjens RJ, et al. Blood 118:4817-4828, 2011; Brentjens RJ, et al. Sci Transl Med 5:177 ra38, 2013）、これらの報告を参考にして本発明のCARを構築することができる。
　トランスポゾンプラスミド内において、CAR遺伝子の下流にはポリA付加シグナル配列を配置する。ポリA付加シグナル配列の使用によって転写を終了させる。ポリA付加シグナル配列としてはSV40のポリA付加配列、ウシ由来成長ホルモン遺伝子のポリA付加配列等を用いることができる。
　トランスポゾンプラスミドに検出用遺伝子（レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など）、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることにしてもよい。検出用遺伝子は、発現カセットの導入の成否や効率の判定、CAR遺伝子の発現の検出又は発現効率の判定、CAR遺伝子が発現した細胞の選択や分取、等に利用される。一方、エンハンサー配列の使用によって発現効率の向上が図られる。検出用遺伝子としては、ネオマイシンに対する耐性を付与するneo遺伝子、カナマイシン等に対する耐性を付与するnpt遺伝子(Herrera Estrella、EMBO J. 2（1983）、987-995)やnptII遺伝子(Messing & Vierra．Gene 1 9:259-268(1982))、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931)、メタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al.，EMBO J．2(7))等（以上、マーカー遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子（Giacomin、P1. Sci. 116（1996）、59～72；Scikantha、J. Bact. 178（1996）、121）、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子、GFP（Gerdes、FEBS Lett. 389（1996）、44-47）やその改変体（EGFPやd2EGFPなど）等の蛍光タンパク質の遺伝子（以上、レポーター遺伝子）、細胞内ドメインを欠く上皮成長因子受容体（EGFR）遺伝子等の遺伝子を用いることができる。検出用遺伝子は、例えば、バイシストロニック性制御配列（例えば、リボソーム内部認識配列（IRES））や自己開裂ペプチドをコードする配列を介してCAR遺伝子に連結している。自己開裂ペプチドの例はThosea asigna virus由来の2Aペプチド（T2A）であるが、これに限定されるものではない。自己開裂ペプチドとして蹄疫ウイルス（FMDV）由来の2Aペプチド（F2A）、ウマ鼻炎Aウイルス（ERAV）由来の2Aペプチド（E2A）、porcine teschovirus（PTV-1）由来の2Aペプチド（P2A）等が知られている。
　ステップ（３）では、ステップ（１）で用意した非増殖性細胞と、ステップ（２）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養する。これによって、非増殖性細胞による共刺激分子を介した刺激と抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激が加わり、遺伝子改変T細胞が活性化するとともに、その生存・増殖が促される。
　共培養に使用する非増殖性細胞の数と遺伝子改変T細胞の数の比率（非増殖性細胞の数／遺伝子改変T細胞の数）は特に限定されないが、例えば、0.025～0.5とする。
　細胞の生存率／増殖率を高めるために、共培養の際、T細胞増殖因子が添加された培養液を使用するとよい。T細胞増殖因子としてはIL-15が好適である。好ましくは、IL-15に加えIL-7が添加された培養液を用いる。IL-15の添加量は例えば5ng/ml～10ng/mlとする。同様にIL-7の添加量は例えば5ng/ml～10ng/mlとする。IL-15、IL-7等のT細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のT細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、T細胞増殖因子はヒト由来のもの（組換え体であってもよい）を用いる。ヒトIL-15、ヒトIL-7等の増殖因子は用意に入手することができる（例えばミルテニーバイオテク社、R＆Dシステムズ社等が提供する）。
　血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清など）を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、且つ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。T細胞用の無血清培地の具体例はTexMACSTM（ミルテニーバイオテク社）、AIM V（登録商標）（Thermo Fisher Scientific社）である。血清を用いる場合には、自己血清、即ち、ステップ（２）で得られる遺伝子改変T細胞の由来である個体（典型的には本発明の調製方法で得られるキメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞の投与を受ける患者）から採取した血清を用いるとよい。基本培地にはT細胞の培養に適したものを用いればよく、具体例を挙げれば、上掲のTexMACSTM、AIM V（登録症商標）である。その他の培養条件は、T細胞の生存、増殖に適したものであればよく、一般的なものを採用すればよい。例えば、37℃に設定したCO2インキュベーター（CO2濃度5%）内で培養すればよい。尚、抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激はステップ（１）の場合と同様であるため、その説明を省略する。
　ステップ（３）における共培養の期間は、例えば１日～１０日、好ましくは１日～７日、更に好ましくは２日～４日である。培養期間が短すぎると十分な効果が望めず、培養期間が長すぎると細胞の活性（生命力）の低下等のおそれがある。
　ステップ（３）に続くステップ（４）では、培養後の細胞を回収する。回収操作は常法で行えばよい。例えば、ピペッティング、遠心処理等によって回収する。
　好ましい一態様では、ステップ（３）とステップ（４）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う。このステップによれば、効率的な拡大培養が可能になり、また、細胞の生存率を高める利点もある。
　T細胞増殖因子としてはIL-15、IL-7等を用いることができる。好ましくは、ステップ（３）と同様に、IL-15とIL-7を添加した培地で培養する。培養期間は例えば１日～２１日、好ましくは５日～１８日、更に好ましくは１０日～１４日である。培養期間が短すぎると細胞数の十分な増加を望めず、培養期間が長すぎると細胞の活性（生命力）の低下、細胞の疲弊／疲労等のおそれがある。培養の途中で継代してもよい。また、培養中は必要に応じて培地交換をする。例えば３日に１回の頻度で培養液の１／３～２／３程度を新しい培地に交換する。
２．ウイルスペプチドを保持したT細胞との共培養を含む方法
　本発明の別の態様（第２の調製方法）は、ウイルス特異的なキメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞（以下、「ウイルス特異的CAR-T細胞」と呼ぶ）を調製する方法に関する。ウイルス特異的CAR-T細胞は、自家移植に利用する場合にはウイルスT細胞受容体からの刺激による体内持続性の向上が望めること、同種移植に利用する場合には更に同種免疫反応(GVHD)の軽減により移植ドナーからのCAR-T作製が可能になり、しかも第３者ドナーからのCAR-T細胞を製剤化できる可能性があることなど、臨床応用上、重要な利点を有する。実際、ウイルス特異的CAR-T細胞がより長期に体内に持続することが報告されている（Pule MA, et al. Nat Med. 2008 Nov;14(11):1264-70.）。また、第３者由来EBV特異的CTL臨床研究の報告（Annual Review血液2015、2015年1月発行、中外医学社）により、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の安全性が高いことが裏づけられている。
　この態様の調製方法は以下のステップ（ｉ）～（ｉｖ）を含む。尚、言及しない事項（例えば、T細胞を含む細胞集団の調製方法、抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激の基本的な操作、増殖能を喪失させる処理の方法、トランスポゾン法による遺伝子導入の操作、共培養の基本的な操作、細胞の回収方法等）については上記の第１の調製方法と同様であるため、重複する説明を省略し、対応する説明を援用する。
　（ｉ）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ
　（ｉｉ）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ
　（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で用意した非増殖性細胞とステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ
　（ｉｖ）培養後の細胞を回収するステップ
　ステップ（ｉ）では、まず、T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激し、活性化T細胞を得る。その後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養と増殖能を喪失させる処理を行う。これによって、非増殖性の「ウイルスペプチド抗原を細胞表面に保持した活性化T細胞」（以下、「ウイルスペプチド保持非増殖性細胞」と呼ぶ）が得られる。ウイルスペプチド抗原存在下での培養と、増殖能を喪失させる処理の順序は特に限定されない。従って、ウイルスペプチド抗原存在下で培養した後に増殖能を喪失させても、或いは増殖能を喪失させた後にウイルスペプチド抗原存在下で培養することにしてもよい。好ましくは、増殖能を喪失する前の方がウイルスペプチド抗原の取り込みがより良好であろうという期待から前者の順序を採用する。ウイルスペプチド抗原存在下で培養するためには、例えば、ウイルスペプチド抗原が添加された培地を用いればよい。或いは、培養中にウイルスペプチド抗原を培地に添加すればよい。ウイルスペプチド抗原の添加濃度は例えば0.5μg／ml～1μg/mlとする。培養期間は例えば１０分～５時間、好ましくは２０分～３時間とする。本明細書における「ウイルスペプチド抗原」とは、特定のウイルスに特異的な細胞傷害性T細胞（CTL）を誘導しうるエピトープペプチドまたはエピトープを含むロングペプチドをいう。ウイルスペプチド抗原としては、これらに限定されるものではないが、例えばアデノウイルス（AdV）の抗原ペプチド（例えば、WO 2007015540 A1を参照）、サイトメガロウイルス（CMV）の抗原ペプチド（例えば、特開2002-255997号公報、特開2004-242599号公報、特開2012-87126号公報を参照）、エプスタインバールウイル（EBV）の抗原ペプチド（例えば、WO 2007049737 A1、特願2011-177487号公報、特開2006-188513号公報を参照）、等を用いることができる。ウイルスペプチド抗原は配列情報に基づき常法（例えば液相合成法、固相合成法）で調製することができる。また、ウイルスペプチド抗原の中には市販されているものもある（例えば株式会社医学生物学研究所、タカラバイオ、ミルテニーバイオテックなどが提供する。）
　１種類の抗原ペプチドを用いることも可能であるが、通常は２種類以上の抗原ペプチド（抗原ペプチド混合物）を使用する。例えば、AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物又はEBV抗原ペプチド混合物、或いはこれら抗原ペプチド混合物の中の二つ以上を組み合わせたもの（例えば、AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物及びEBV抗原ペプチド混合物を混合したもの）を用いる。２種類以上の抗原ペプチドを併用することにより、標的（抗原ペプチド）が異なる複数の活性化T細胞を得ることができ、本発明の調製方法で得られるCAR-T細胞が有効な治療対象（患者）の増大（カバー率の向上）を望める。いずれのウイルスに由来する抗原ペプチドを使用するかを決定するにあたっては、本発明の調製方法で得られるCAR-T細胞の用途、具体的には治療対象となる疾患や患者の病態を考慮するとよい。例えば、造血幹細胞移植後の再発性白血病の治療を目的とする場合には、EBVウイルスの抗原ペプチド混合物を単独で又は他のウイルスの抗原ペプチド混合物との併用で用いるとよい。AdV抗原ペプチド混合物、CMV抗原ペプチド混合物、EBV抗原ペプチド混合物については市販もされており（例えば、ミルテニーバイオテク社が提供する、PepTivator（登録商標） AdV5 Hexon、PepTivator（登録商標） CMV pp65、PepTivator（登録商標） EBV EBNA-1、PepTivator（登録商標） EBV BZLF1、JPT Peptide Technologies社が提供するPepMixTM Collection HCMV、PepMixTM EBV (EBNA1)等）、容易に入手することができる。
　ステップ（ｉｉ）は上記本発明の第１の調製方法のステップ（２）と同様である。このステップによって遺伝子改変T細胞（CAR-T細胞）が得られる。
　ステップ（ｉｉｉ）では、ステップ（ｉ）で用意した非増殖性細胞（ウイルスペプチド保持非増殖性細胞）と、ステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養する。これによって、非増殖性細胞による共刺激分子及びウイルス抗原ペプチドを介した刺激が加わり、ウイルス抗原特異的な遺伝子改変T細胞が活性化するとともに、その生存・増殖が促される。
　共培養に使用する非増殖性細胞の数と遺伝子改変T細胞の数の比率（非増殖性細胞の数／遺伝子改変T細胞の数）は特に限定されないが、例えば、0.025～0.5とする。
　このステップは、ウイルス特異的CAR-T細胞を選択的に増殖させるため、強力な刺激を避けてT細胞の疲弊／疲労を防ぐため、等の理由から、原則として、抗CD3抗体及び抗CD28抗体による刺激を加えない。一方、細胞の生存率／増殖率を高めるために、共培養の際、T細胞増殖因子が添加された培養液を使用するとよい。T細胞増殖因子としてはIL-15が好適である。好ましくは、IL-15に加えIL-7が添加された培養液を用いる。IL-15の添加量は例えば5ng/ml～10ng/mlとする。同様にIL-7の添加量は例えば5ng/ml～10ng/mlとする。尚、言及しない条件（血清の利用の可能性、基本培地、培養温度など）は、上記本発明の第１の調製方法のステップ（３）の場合と同様である。
　ウイルスペプチド保持非増殖性細胞をステップ（ｉｉｉ）の途中で追加してもよい。或いは、共培養後の細胞を回収し、ウイルスペプチド保持非増殖性細胞と混合した後に再度、共培養を行うことにしてもよい。これらの操作を２回以上繰り返すことにしてもよい。このように、ウイルスペプチド保持非増殖性細胞を利用した刺激なしし活性化を複数回行うことにすれば、ウイルス特異的CAR-T細胞の誘導率の向上、ウイルス特異的CAR-T細胞数の増加を望める。尚、改めて用意したもの、又はステップ（ｉ）で用意した細胞の一部を保存しておいたものを、ここでのウイルスペプチド保持非増殖性細胞として使用する。
　ステップ（ｉｉｉ）における共培養の期間は、例えば１日～２１日、好ましくは５日～１８日、更に好ましくは１０日～１４日である。培養期間が短すぎると十分な効果をを望めず、培養期間が長すぎると細胞の活性（生命力）の低下、細胞の疲弊／疲労等のおそれがある。
　ウイルスペプチド保持非増殖性細胞との共培養の前に、ステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞をウイルスペプチド保持非増殖性PBMC（末梢血単核球）と共培養することにしてもよい。この態様の場合、ステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞とウイルスペプチド保持非増殖性PBMCを共培養して得られた細胞と、ステップ（ｉ）で用意したウイルスペプチド保持非増殖性細胞とを混合し、共培養することになる。ここでのウイルスペプチド保持非増殖性PBMCは、PBMCをウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理に供することによって調製することができる。具体的には、例えば、末梢血から分離したPBMCを放射線処理した後、ウイルスペプチド抗原存在下で培養し、ウイルスペプチド保持非増殖性PBMCを得る。尚、１回の採血で得た末梢血から分離したPBMCの一部を用いてウイルスペプチド保持非増殖性PBMCを調製するとともに、他の一部から遺伝子改変T細胞を調製することにすれば、本発明の実施に伴う採血回数を低減することができ、臨床応用上、極めて大きな利点となる。特に、残りのPBMCを用いてステップ（ｉ）を行い、ウイルスペプチド保持非増殖性細胞（２段階目の共培養に使用する細胞）を調製することにすれば、必要な３種類の細胞、即ち、遺伝子改変T細胞、当該細胞との共培養に使用するウイルスペプチド保持非増殖性PBMC、２段階目の共培養に使用するウイルスペプチド保持非増殖性細胞を１回の採血によって用意することができることから、本発明で得られるCAR-T細胞を用いた治療における、患者の負担は大幅に軽減される。
　ステップ（ｉｉｉ）に続くステップ（ｉｖ）では、培養後の細胞を回収する。上記本発明の第１の調製方法と同様に、ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップ（拡大培養）を行うことにしてもよい。この拡大培養に際してウイルスペプチド保持非増殖性細胞を追加したり、或いは拡大培養の途中でウイルスペプチド保持非増殖性細胞を追加したりすることにしてもよい。
３．キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞及びその用途
　本発明の更なる局面は、本発明の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞（以下、「本発明のCAR-T細胞」と呼ぶ）及びその用途に関する。本発明のCAR-T細胞はCAR療法が有効と考えられる各種疾患（以下、「標的疾患」と呼ぶ）の治療、予防又は改善に利用され得る。標的疾患の代表はがんであるが、これに限定されるものではない。標的疾患の例を挙げると、各種B細胞リンパ腫（濾胞性悪性リンパ腫、びまん性悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫など）、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髄異形成症候群、急性骨髄生白血病、神経芽腫、脳腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、肺小細胞腫、メラノーマ、卵巣がん、横紋筋肉腫、腎臓がん、膵臓がん、悪性中皮腫、前立腺がん等である。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止又は遅延すること、或いは発症／発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病（障害）又はその症状が緩和（軽症化）、好転、寛解、又は治癒（部分的な治癒を含む）することをいう。
　本発明のCAR-T細胞を細胞製剤の形態で提供することもできる。本発明の細胞製剤には、本発明のCAR-T細胞が治療上有効量含有される。例えば１回の投与用として、104個～1010個の細胞を含有させる。細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（DMSO）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的とした各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）等の成分を細胞製剤に含有させてもよい。
　本発明のCAR-T細胞又は細胞製剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射によって投与する。全身投与によらず、局所投与することにしてもよい。局所投与として、目的の組織・臓器・器官への直接注入を例示することができる。投与スケジュールは、対象（患者）の性別、年齢、体重、病態などを考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。
＜CAR-T細胞の調製効率と遺伝子導入効率の検討＞
　トランスポゾン法を利用したCAR療法は、ウイルスベクターを利用した場合に比べ、特に安全性の面で有利である。その一方で、遺伝子導入効率が低いこと、遺伝子導入時の操作（例えばエレクトロポレーション）で細胞がダメージを受けやすく、得られる細胞数が少ないことなどが問題となる。これらの問題点を克服すべく、以下の検討を行った。
１．材料
（１）抗体
　抗CD3抗体(ミルテニーバイオテク社)
　抗CD28抗体（ミルテニーバイオテク社）
（２）培地
　TexMACS（ミルテニーバイオテク社）
（３）サイトカイン
　リコンビナントヒトIL-7（ミルテニーバイオテク社）
　リコンビナントヒトIL-15（ミルテニーバイオテク社）
（４）ウイルスペプチドミックス
　PepTivator（登録商標）CMV pp65-premium grade, ヒト（ミルテニーバイオテク社社）
　PepTivator（登録商標）AdV5 Hexon-premium grade, ヒト（ミルテニーバイオテク社）
　PepTivator（登録商標）EBV EBNA-1-premium grade, ヒト（ミルテニーバイオテク社）
　PepTivator（登録商標）EBV BZLF1-premium grade, ヒト（ミルテニーバイオテク社）
（５）プラスミド
　pIRII-CD19CARベクター（CARを発現する）
　pCMV-piggyBacベクター（piggyBacトランスポサーゼを発現する）
（６）細胞培養容器
　24ウェル非コート組織培養プレート（Falcon）
　24ウェル組織培養プレート（Falcon）
　G-Rex10 (Wilson Wolf)
２．方法
（１）活性化T細胞の準備
（１－１）抗CD3抗体/抗CD28抗体コート（感作）プレートの作製
　抗CD3抗体と抗CD28抗体を1mg/mlとなるようにPBSで希釈し、24ウェルの非コートプレートに0.5ml/ウェルになるように加える。プレートは37℃のインキュベーターにて2～4時間静置する。抗体希釈PBSを吸引し、1ウェルあたり1mlのPBSで１回洗浄する。
（１－２）抗CD3抗体/抗CD28抗体コートプレートでの培養
　０日目：末梢血から分離したPBMCを、IL-15 5ng/mlになるように添加したTexMACSで5x105/mlになるように希釈し、抗CD3抗体/抗CD28抗体コートプレートに1ウェルあたり2mlずつ分注する。
　1日目：24ウェル組織培養プレートへ細胞を移す。培養液は半量交換し、IL-15 5ng/mlとなるように添加する。
　４日目：IL-15を5ng/mlとなるように添加する。
　７日目：細胞を回収し、分注して凍結保存する。
（１－３）活性化T細胞の再刺激
　０日目：凍結保存したあった細胞を解凍し、２回洗浄後に、1x106個/mlとなるようにIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで希釈し、抗CD3抗体/抗CD28抗体コートプレートへ1ウェル 2mlずつ分注する。
　３日目：細胞を回収し、CAR-T培養に使用する。
（２）従来法によるCAR-Tの作製及び培養（培養法１、図１を参照）
　０日目：末梢血から単核球を分離し、カウントする。1x107個の単核球に対し、pIRII-CAR.CD19.28zベクター（図４）とpCMV-pigBacベクター（図５）を5μgずつ添加して、4D nucleofector（ロンザ）を使用してエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）にて遺伝子導入する。その後、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMに浮かべて24ウェルプレートにて37℃のインキュベーター中で培養を開始する。
　１日目：抗CD3抗体/抗CD28抗体コートプレートで刺激する。
　４日目：G-Rex10に細胞を移し、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養する。
　７日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１０日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１４日目：培養を終了する。
（３）活性化T細胞添加法によるCAR-Tの作製及び培養（培養法２、図２を参照）
　０日目：末梢血から単核球を分離し、1x107個の単核球に対し、pIRII-CAR.CD19.28zベクター（図４）とpCMV-pigBacベクター（図５）を5μgずつ添加してエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）にて遺伝子導入する。遺伝子導入した細胞と放射線照射した5x105個の活性化T細胞を混合し、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMに浮かべて24ウェルプレートにて37℃のインキュベーター中で培養を開始する。
　１日目：抗CD3抗体/抗CD28抗体コートプレートで刺激する。
　４日目： G-Rex10に細胞を移し、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養する。
　７日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１０日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１４日目：培養を終了する。
（４）ウイルスペプチド添加活性化T細胞添加法によるCAR-Tの作製及び培養（培養法３、図３を参照）
　０日目：放射線照射した活性化T細胞5x105個にウイルスペプチド（PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5 Hexon、PepTivator EBV EBNA-1及びPepTivator EBV BZLF1を各50ng）を添加し、37℃で30分インキュベートする。1x107個の末梢血単核球に対し、pIRII-CAR.CD19.28zベクター（図４）とpCMV-pigBacベクター（図５）を5μgずつ添加してエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）にて遺伝子導入する。遺伝子導入した細胞と放射線照射したウイルスペプチド添加活性化T細胞を混合し、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/mlを添加したTexMACSTMに浮かべて24ウェルプレートにて37℃のインキュベーター中で培養を開始する。
　２日目～５日目：必要に応じてIL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　７日目：細胞を回収しカウントする。上記と同様の方法で調製したウイルスペプチド添加活性化T細胞2x106個と回収した細胞を、IL-15(5ng/ml)とIL-7(10ng/ml)添加培養液30ml中に浮遊させ、G-Rex10で培養を開始する。
　１０日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１４日目：培養を終了する。
３．結果
　培養終了後（１４日目）、培養法毎に増殖細胞数、CAR-T細胞数及び遺伝子導入効率（CAR-T細胞／全生細胞）を求め、培養法１～３の間で比較した。尚、増殖細胞数の計測には血球計算盤を用い、CAR-T細胞数及び遺伝子導入効率はフローサイトメトリー解析の結果から算出した。
　CAR-T細胞数は、培養法１が1.18×106（±0.509×106）、培養法２が7.13×106(±3.25×106)、培養法３が1.09×107(±2.98×106)であった（図６）。また、遺伝子導入効率は、培養法１が3.22%（±1.42）、培養法２が10.3%（±4.21）、培養法３が26.9%（±2.79）であった（図７）。尚、括弧内は標準誤差である。
　CAR-T細胞の調製に使用する末梢血のドナー数（N=9）を増やして更に検討した。その結果、CAR-T細胞数は、培養法１が2.5×106（±0.72×106）、培養法２が7.6×106(±2.6×106)、培養法３が17.2×106(±5.8×106)となった（図８）。また、遺伝子導入効率は、培養法１が4.6%（±1.1）、培養法２が10.7%（±2.7）、培養法３が33.0%（±3.4）となった（図９）。尚、括弧内は標準誤差である。
　一方、プラスミドの最適化（図１０）により、培養法３では平均約５０％の遺伝子導入効率を達成した（図１１）。
　以上のように、新規培養法（培養法２、３）では、従来法（培養法１）と比較して、CAR-T細胞数が増加し、遺伝子導入効率も上昇した。培養法２の場合、共刺激分子の発現による細胞刺激（エレクトロポレーションの際にダメージを受けた遺伝子導入細胞の保護作用）、培養微小環境によるサイトカイン刺激などによって、CAR-T細胞数の増加と遺伝子導入効率の上昇がもたらされたと考えられる。培養法３では、共刺激分子の発現による細胞刺激、培養微小環境によるサイトカイン刺激、ウイルス特異的T細胞受容体からの比較的緩やかな細胞刺激などによって、CAR-T細胞数の増加と遺伝子導入効率の上昇がもたらされたと考えられる。
　新規な二つの培養法、即ち、活性化T細胞を用いた新規培養法（培養法２）とウイルスペプチド添加活性化T細胞を用いた新規培養法（培養法３）が、トランスポゾン法を利用したCAR療法の問題点を克服できることが明らかになった。これらの培養法を利用することでCAR療法の臨床応用の更なる促進・拡大が期待される。培養法３については、同種反応性の低下（ウイルス特異的CTLに期待できる効果）、そのことによる第三者由来のCAR-T細胞を利用できる可能性、体内ウイルスによりウイルス抗原受容体に刺激が入ることによる体内持続性（persistency）が上昇する可能性などがあり、安全性の更なる向上や治療効果の増大などが期待される。
＜培養法３の改良＞
１．方法
　０日目：末梢血から単核球（PBMC）を分離する。一部（PBMC 1x106個）に放射線照射した後、ウイルスペプチド（PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5 Hexon、PepTivator EBV EBNA-1及びPepTivator EBV BZLF1を各50ng）を添加し、37℃で30分インキュベートする。一方、1x107個のPBMCに対し、pIRII-CAR.CD19_optimizedベクター（図１０）とpCMV-pigBacベクター（図５）を5μgずつ添加してエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）にて遺伝子導入する。遺伝子導入した細胞と放射線照射したウイルスペプチド添加PBMCを混合し、IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/mlを添加したTexMACSTMに浮かべて24ウェルプレートにて37℃のインキュベーター中で培養を開始する。尚、上記（１）の方法に従い、残りのPBMCから活性化T細胞を調製しておく。
　２日目～５日目：必要に応じてIL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　７日目：細胞を回収しカウントする。一方、上記の方法で調製した活性化T細胞2x106個に放射線照射した後、ウイルスペプチド（PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5 Hexon、PepTivator EBV EBNA-1及びPepTivator EBV BZLF1を各50ng）を添加し、37℃で30分インキュベートする。このようにして得たウイルスペプチド添加活性化T細胞2x106個と、回収した細胞を、IL-15(5ng/ml)とIL-7(10ng/ml)添加培養液30ml中に浮遊させ、G-Rex10で培養を開始する。
　１０日目：IL-7 10ng/mlとIL15 5ng/ml添加TexMACSTMで培養液を半量交換する。
　１４日目：培養を終了する。
２．結果
　培養終了後（１４日目）、CAR-T細胞数及び遺伝子導入効率（CAR-T細胞／全生細胞）を求めた。CAR-T細胞数と遺伝子導入効率は、１回目の実験が2.81×107個と55.1%、２回目の実験が1.03×107個と52.0%、３回目の実験が9.22×106個と42.3%であった。このように高い遺伝子導入効率を達成した。尚、この培養法は１回の採血によってCAT-T細胞を得ることを可能にするものであり、患者への負担が軽減するという利点を有する。
＜CAR-T細胞の活性評価＞
　新規培養法で調製したCAR-T細胞の細胞障害活性及び抗腫瘍活性を以下の方法で評価した。
１．CD19陽性白血病細胞株との共培養実験
　６人の健常人末梢血から培養法３を用いてCAR-T細胞を作製した。CAR-T細胞（1×105個）とCD19陽性白血病細胞株（5×105個）を10%ウシ胎仔血清含RPMI1640培地下で7日間共培養した（エフェクター細胞：標的細胞=1:5）。CAR-T細胞の代わりに、遺伝子非導入活性化T細胞（培養法３から遺伝子導入操作を省略して調製したT細胞）を用いたものをコントロールとした。7日間の共培養後に細胞を回収し、抗CD19抗体と抗CD3抗体で染色後、counting beadsとフローサイトメーターで細胞数をカウントした。以下の計算式で残存腫瘍細胞数を算出し、CAR-T細胞の細胞障害活性を評価した。尚、３種類のCD19陽性白血病細胞株（KOPN30bi、SK-9、TCC-Y/sr）を用いて以上の実験を行った。
　標準化腫瘍細胞残存率（％）＝100×（T細胞と共培養したウェルの残存腫瘍細胞数－T細胞と共培養していないウェルの腫瘍細胞数）／T細胞と共培養していないウェルの腫瘍細胞数
　結果を図１２に示す。CAR-T細胞と共培養した場合、KOPN30biの残存率は0.2%（コントロールは89%）、SK-9の残存率は0.03%（コントロールは87%）、TCC-Y/srは0.03%（コントロールは86%）であり、CAR-T細胞は強力な細胞障害活性を示した。
２．担癌マウスによる評価
　3日前（D-3）に尾静脈からCD19陽性細胞株（ルシフェラーゼ遺伝子導入Daudi、1×106個）を注射したNSGマウス（各試験区　５匹）に対し、培養法３で作製したCAR-T細胞（1×107個）を尾静脈から注射した（D0）。コントロール（NT）では、遺伝子非導入活性化T細胞（培養法３から遺伝子導入操作を省略して調製したT細胞）を注射した。適宜ルシフェリンを腹腔内投与し、生体内イメージングシステムを用いてマウスを撮像した。
　図１３に示すように、遺伝子非導入活性化T細胞（コントロール（NT））で治療されたマウスでは腫瘍細胞が増殖したのとは対照的に、増殖CAR-T細胞で治療されたマウスにおいては腫瘍細胞の増殖は認められなかった。即ち、CAT細胞は担癌マウスにおいて腫瘍増殖を強力に抑制した。
３．まとめ
　以上の通り、新規培養法で作製したCAR-T細胞が優れた活性を示すことがin vitro及びin vivoの実験で確認された。即ち、治療効果の高いCAR-T細胞を効率的に作製する手段として、新規培養法が極めて有効であることが示された。
　本発明によれば、トランスポゾン法を利用してCAR-T細胞を調製する場合のCAR遺伝子導入効率と細胞増殖率が高められる。即ち、本発明は、トランスポゾン法を利用した安全性の高いCAR-T細胞の調製方法の実用性高め、それによってCAR療法の臨床応用を促し、また、CAR療法の治療効果の増大に貢献する。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (20)

  1. 　以下のステップ（１）～（４）を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法：
    　（１）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ；
    　（２）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；
    　（３）ステップ（１）で用意した非増殖性細胞とステップ（２）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ；
    　（４）培養後の細胞を回収するステップ。
  2. 　ステップ（３）とステップ（４）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、請求項１に記載の調製方法。
  3. 　ステップ（３）の共培養の期間が1日～14日である、請求項１又は２に記載の調製方法。
  4. 　ステップ（３）を、T細胞増殖因子の存在下で行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。
  5. 　T細胞増殖因子がIL-15である、請求項４に記載の調製方法。
  6. 　T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、請求項４に記載の調製方法。
  7. 　以下のステップ（ｉ）～（ｉｖ）を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法：
    　（ｉ）T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ；
    　（ｉｉ）トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ；
    　（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で用意した非増殖性細胞とステップ（ｉｉ）で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ；
    　（ｉｖ）培養後の細胞を回収するステップ。
  8. 　ステップ（ｉｉｉ）とステップ（ｉｖ）の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、請求項７に記載の調製方法。
  9. 　ステップ（ｉｉｉ）の共培養の期間が1日～14日である、請求項７又は８に記載の調製方法。
  10. 　ステップ（ｉｉｉ）を、T細胞増殖因子の存在下で行う、請求項７～９のいずれか一項に記載の調製方法。
  11. 　T細胞増殖因子がIL-15である、請求項１０に記載の調製方法。
  12. 　T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、請求項１０に記載の調製方法。
  13. 　T細胞を含む細胞集団が末梢血単核細胞（PBMCs）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の調製方法。
  14. 　増殖能を喪失させる処理が放射線照射である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の調製方法。
  15. 　トランスポゾン法がPiggyBacトランスポゾン法である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の調製方法。
  16. 　標的抗原がCD19、CD19、GD2、GMCSF受容体又はIGF受容体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の調製方法。
  17. 　非増殖性細胞と、遺伝子改変T細胞が同一の個体に由来する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の調製方法。
  18. 　請求項１～１７のいずれか一項に記載の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞。
  19. 　請求項１８に記載の遺伝子改変T細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。
  20. 　請求項１８に記載の遺伝子改変T細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
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Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107119021A (zh) * 2017-07-04 2017-09-01 王小平 Pd‑1敲除cd19car‑t细胞的制备
WO2018052142A1 (ja) * 2016-09-16 2018-03-22 キッセイ薬品工業株式会社 遺伝子改変細胞及びその作製方法
US10227574B2 (en) 2016-12-16 2019-03-12 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US20190119640A1 (en) * 2016-09-30 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
WO2019128999A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 获得高阳性率car-t细胞的方法
WO2020085480A1 (ja) 2018-10-26 2020-04-30 キッセイ薬品工業株式会社 高効率な遺伝子改変細胞の作製方法
WO2021020526A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 国立大学法人信州大学 Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
JPWO2021100585A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27
US11278570B2 (en) 2016-12-16 2022-03-22 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
JP2022521486A (ja) * 2019-02-08 2022-04-08 ディーエヌエイ ツーポイント インコーポレイテッド トランスポゾンに基づく免疫細胞の改変
JP2022171485A (ja) * 2021-04-30 2022-11-11 国立大学法人東海国立大学機構 キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変ｔ細胞の調製方法
JP2023523619A (ja) * 2020-04-27 2023-06-06 ベイラー カレッジ オブ メディスン キメラ抗原受容体を発現するウイルス特異的免疫細胞による癌の治療及び予防
US11760983B2 (en) 2018-06-21 2023-09-19 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
WO2024024551A1 (ja) * 2022-07-26 2024-02-01 国立大学法人京都大学 シェディング構造を有する人工受容体
US12419913B2 (en) 2019-02-08 2025-09-23 Dna Twopointo, Inc. Modification of CAR-T cells

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034669B (zh) * 2017-11-17 2021-07-30 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗vegf基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用
CN108841792A (zh) * 2018-06-14 2018-11-20 浙江大学 靶向cd19和ebna1基因修饰的t细胞及其制备方法与应用
CN115461361B (zh) * 2020-05-08 2025-03-14 玛希敦大学 嵌合抗原受体和携带该受体的经修饰的细胞
CN112625901B (zh) * 2020-12-01 2023-01-06 山东大学第二医院 一种微流控装置及其在嵌合抗原受体t细胞感染中的应用
CN114457037B (zh) * 2022-01-26 2023-12-22 徐州医科大学 C57bl/6j小鼠来源cd19嵌合抗原受体t细胞的构建方法及应用
CN115109774B (zh) * 2022-06-24 2023-06-06 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种新型同种异体car-t细胞的制备及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014179759A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 Ohio State Innovation Foundation Cs1-specific chimeric antigen receptor engineered immune effector cells
WO2015028444A1 (en) * 2013-08-26 2015-03-05 Universität Zu Köln Anti cd30 chimeric antigen receptor and its use
WO2015058018A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 National University Of Singapore Chimeric receptor that triggers antibody-dependent cell cytotoxicity against multiple tumors

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP1612217A3 (en) 2000-03-27 2006-01-18 City of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
JP2002255997A (ja) 2001-06-07 2002-09-11 Aichi Prefecture Ｃｄ８＋細胞傷害性ｔリンパ球エピトープペプチド及びその用途
JP2004242599A (ja) 2003-02-14 2004-09-02 Aichi Prefecture Ｃｄ８＋細胞傷害性ｔリンパ球エピトープペプチド及びその用途
JP4976294B2 (ja) 2005-08-03 2012-07-18 株式会社医学生物学研究所 細胞傷害性ｔ細胞エピトープペプチド及びその用途
US20070036773A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
JP4824389B2 (ja) 2005-10-28 2011-11-30 株式会社医学生物学研究所 エプスタイン−バールウイルス感染細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性ｔ細胞エピトープペプチド及びその用途
JP2006188513A (ja) 2005-12-26 2006-07-20 Aichi Prefecture Ｃｄ８＋細胞傷害性ｔリンパ球エピトープペプチド及びその用途
JP2011177487A (ja) 2010-02-04 2011-09-15 Imasen Electric Ind Co Ltd 電動車いす向け車輪格納装置
PH12013501201A1 (en) * 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
BR112014014591A8 (pt) 2011-12-12 2017-07-04 Baylor College Medicine processo para a expansão in vitro de células t específicas de antígeno, produto de células t autólogas ou alogênicas expandidas, composição farmacêutica, e, método de tratamento de um paciente, e, usos de uma linhagem de células engenheirada, de células dendríticas pulsadas com misturas de antígeno-peptídeo, de t-apcs pulsadas com misturas de antígeno-peptídeo/peptídeo, e de misturas de antígeno-peptídeo com pbmcs
JP6275530B2 (ja) 2014-04-08 2018-02-07 ホシザキ株式会社 冷却貯蔵庫

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014179759A1 (en) * 2013-05-03 2014-11-06 Ohio State Innovation Foundation Cs1-specific chimeric antigen receptor engineered immune effector cells
WO2015028444A1 (en) * 2013-08-26 2015-03-05 Universität Zu Köln Anti cd30 chimeric antigen receptor and its use
WO2015058018A1 (en) * 2013-10-17 2015-04-23 National University Of Singapore Chimeric receptor that triggers antibody-dependent cell cytotoxicity against multiple tumors

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENIGER DREW C. ET AL.: "Sleeping Beauty Transposition of Chimeric Antigen Receptors Targeting Receptor Tyrosine Kinase-Like Orphan Receptor-1 (ROR1) into Diverse Memory T- cell Populations", PLOS ONE, pages e0128151, XP055369652 *
NISHIO NOBUHIRO ET AL.: "PiggyBac mediated CD 19 chimeric antigen receptor modified T cells for a clinical trial", THE JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL HEMATOLOGY, vol. 56, no. 9, September 2015 (2015-09-01), pages 361, XP009509194 *
SAITO SHOJI ET AL.: "Anti-leukemic potency of piggyBac-mediated CD 19-specific T cells against refractory Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia", CYTOTHERAPY, vol. 16, no. 9, 2014, pages 1257 - 1269, XP055181626 *
SINGH HARJEET ET AL.: "Manufacture of Clinical-Grade CD 19-Specific T Cells Stably Expressing Chimeric Antigen Receptor Using Sleeping Beauty System and Artificial Antigen Presenting Cells", PLOS ONE, vol. 8, no. 5, 2013, pages 2 - 3, XP055181345 *
YOZO NAKAZAWA: "Gene -modified T- cell Therapy Using Chimeric Antigen Receptor", THE SHINSHU MEDICAL JOURNAL, vol. 61, no. 4, 2013, pages 197 - 203, XP055516593 *

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018052142A1 (ja) * 2016-09-16 2019-06-24 キッセイ薬品工業株式会社 遺伝子改変細胞及びその作製方法
WO2018052142A1 (ja) * 2016-09-16 2018-03-22 キッセイ薬品工業株式会社 遺伝子改変細胞及びその作製方法
US10683355B2 (en) 2016-09-16 2020-06-16 Kissei Pharmaceutical Co., Ltd. Genetically-modified cells and method for producing same
US10513686B2 (en) 2016-09-30 2019-12-24 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
US20190119640A1 (en) * 2016-09-30 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US20190119637A1 (en) * 2016-09-30 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US10415016B2 (en) * 2016-09-30 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
US11802269B2 (en) 2016-09-30 2023-10-31 Poseida Therapeutics, Inc. Superpiggybac transposase compositions
US11278570B2 (en) 2016-12-16 2022-03-22 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US11111483B2 (en) 2016-12-16 2021-09-07 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems and methods
US12097220B2 (en) 2016-12-16 2024-09-24 R&D Systems, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US10227574B2 (en) 2016-12-16 2019-03-12 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US12037611B2 (en) 2016-12-16 2024-07-16 R&D Systems, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US11162084B2 (en) 2016-12-16 2021-11-02 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
CN107119021A (zh) * 2017-07-04 2017-09-01 王小平 Pd‑1敲除cd19car‑t细胞的制备
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
CN109971718A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 获得高阳性率car-t细胞的方法
CN109971718B (zh) * 2017-12-28 2023-09-01 上海细胞治疗研究院 获得高阳性率car-t细胞的方法
WO2019128999A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 获得高阳性率car-t细胞的方法
US11760983B2 (en) 2018-06-21 2023-09-19 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
JPWO2020085480A1 (ja) * 2018-10-26 2021-09-16 国立大学法人信州大学 高効率な遺伝子改変細胞の作製方法
JP7632868B2 (ja) 2018-10-26 2025-02-19 国立大学法人信州大学 高効率な遺伝子改変細胞の作製方法
WO2020085480A1 (ja) 2018-10-26 2020-04-30 キッセイ薬品工業株式会社 高効率な遺伝子改変細胞の作製方法
US12419913B2 (en) 2019-02-08 2025-09-23 Dna Twopointo, Inc. Modification of CAR-T cells
JP2022521486A (ja) * 2019-02-08 2022-04-08 ディーエヌエイ ツーポイント インコーポレイテッド トランスポゾンに基づく免疫細胞の改変
JP2023153231A (ja) * 2019-07-23 2023-10-17 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
US12398190B2 (en) 2019-07-23 2025-08-26 Kabushiki Kaisha Toshiba Method of producing CAR-T cells, nucleic acid-introducing carrier and kit
JP7653113B2 (ja) 2019-07-23 2025-03-28 株式会社東芝 Ｃａｒ－ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
WO2021020526A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 国立大学法人信州大学 Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
JPWO2021020526A1 (ja) * 2019-07-31 2021-02-04
WO2021019706A1 (ja) * 2019-07-31 2021-02-04 国立大学法人信州大学 Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
JP7576547B2 (ja) 2019-07-31 2024-10-31 国立大学法人信州大学 Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
WO2021100585A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27 国立大学法人東海国立大学機構 キメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球の調製方法
JPWO2021100585A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27
JP2023523620A (ja) * 2020-04-27 2023-06-06 ベイラー カレッジ オブ メディスン キメラ抗原受容体を発現するウイルス特異的免疫細胞
JP2023523621A (ja) * 2020-04-27 2023-06-06 ベイラー カレッジ オブ メディスン キメラ抗原受容体を発現するウイルス特異的免疫細胞によるアロ反応性の治療及び予防
JP2023523619A (ja) * 2020-04-27 2023-06-06 ベイラー カレッジ オブ メディスン キメラ抗原受容体を発現するウイルス特異的免疫細胞による癌の治療及び予防
JP2022171485A (ja) * 2021-04-30 2022-11-11 国立大学法人東海国立大学機構 キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変ｔ細胞の調製方法
WO2024024551A1 (ja) * 2022-07-26 2024-02-01 国立大学法人京都大学 シェディング構造を有する人工受容体

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