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WO2017051969A1 - 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 이를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획의 분리 방법 - Google Patents

지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 이를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획의 분리 방법 Download PDF

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WO2017051969A1
WO2017051969A1 PCT/KR2015/010974 KR2015010974W WO2017051969A1 WO 2017051969 A1 WO2017051969 A1 WO 2017051969A1 KR 2015010974 W KR2015010974 W KR 2015010974W WO 2017051969 A1 WO2017051969 A1 WO 2017051969A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
separation
receiving space
adipose tissue
separation tube
kit
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2015/010974
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English (en)
French (fr)
Inventor
김대용
양민아
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nbiotek Inc
Original Assignee
Nbiotek Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nbiotek Inc filed Critical Nbiotek Inc
Priority to US15/762,301 priority Critical patent/US20180265829A1/en
Publication of WO2017051969A1 publication Critical patent/WO2017051969A1/ko
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    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a kit for separating adipose tissue-derived stromal vascular fraction and a method for separating adipose tissue-derived stromal vascular fraction using the same, and more particularly, to easily separate stromal vascular fraction from adipose tissue without using expensive equipment by using a breakthrough structure.
  • the present invention relates to a kit for separating adipose tissue-derived stromal blood vessel fraction and a method for separating adipose tissue-derived stromal blood vessel fraction using the same.
  • Stromal Vascular Fraction is extracted from adipose tissue and contains adipose stem cells, fibroblasts, immune cells, and vascular endothelial cells. These cells include various growth factors and cells such as collagen and hyaluronic acid. It is a cell that secretes abundant foreign protein. Therefore, when stromal vascular fraction is injected into the skin, the amount of hyaluronic acid secretion is increased to increase the moisturizing effect of the skin and the elasticity of the collagen, elastin, etc. is enriched and the skin elasticity is increased. Due to these effects, the demand for cosmetic procedures using stromal vascular fraction has recently increased rapidly.
  • Korean Patent Publication No. 2015-0051026 discloses a tube that can separate adipose derived stem cells (stromal vascular fraction) in large quantities.
  • the patent has a disadvantage in that the recovery rate is not high because the stromal vascular fraction is likely to flow out through the mesh network of the first chamber in the process of mixing the reagents required to separate the fat-derived stromal vascular fraction, and the centrifugation is repeated. It is necessary to continue to remove specific layers created, which is a cumbersome and difficult process for non-specialists such as nurses and doctors working in hospitals.
  • the present inventors have developed a kit that is not difficult to use while having a high recovery rate and survival rate of stromal vascular fraction cells.
  • An object of the present invention comprises a first separation tube for separating stromal vascular fraction from adipose tissue and a second separation tube for washing or suspending the stromal vascular fraction separated from the first separation tube, adipose tissue-derived stromal blood vessel It is to provide a kit for fraction separation.
  • another object of the present invention is to provide a method for cleanly separating the stromal vascular fraction from adipose tissue using the kit.
  • a first separation tube for separating the stromal vascular fraction from adipose tissue including;
  • the upper receiving space is narrow in the downward direction, the upper receiving space has a spiral formed at the top, the lower receiving space narrowing in the upper direction and the lower direction, the passage portion connecting the upper receiving space and the lower receiving space, One or more openings for entry or exit of material or air, a closure cap for blocking the openings, a control screw for closing the passage portion that can move up and down and seal the passage portion and that can be combined with the spiral formed on the upper receiving space.
  • a bottom hole located at the bottom of the lower receiving space, and a material which can be drilled by an injection needle or a syringe, and located at the bottom of the bottom hole, the bottom hole blocking film blocking the bottom hole and the outside.
  • a kit for separating adipose tissue-derived stromal blood vessels comprising a second separation tube for suspension.
  • the head of the adjusting screw for closing the passage portion coupled to the spiral formed on the upper end of the upper receiving space of the second separation tube may be a lid of the upper receiving space.
  • the upper receiving space of the second separation tube further includes a fitting protrusion at the top, and a spiral to which the adjustment screw for closing the passage part may be formed inside or outside the fitting protrusion.
  • a silicone cap for sealing the passage part may be coupled to the end of the adjustment screw for closing the second separation tube.
  • the passage portion of the second separation tube may be marked with a scale for adjusting the volume of the contents contained in the lower receiving space.
  • a pressure adjusting ring including a plurality of holes may be mounted at an end of the adjusting screw for closing the passage part of the second separation tube, and the opening or closing of the plurality of holes may be performed at the upper or upper and lower ends of the pressure adjusting ring.
  • the blocking plate may be provided. When the blocking plate is provided at both the upper and lower ends, it is preferable that the blocking plate provided at the top and the blocking plate provided at the bottom open and close different holes from each other.
  • the bottom blocking film of the first separation tube or the second separation tube may have a groove on the bottom surface thereof to indicate the position of the bottom hole of the lower end of the lower receiving space.
  • the first separation tube or the second separation tube may further include a sealing membrane under the lower receiving space blocking membrane, and the sealing membrane may be a material that can be drilled with an injection needle or a syringe.
  • the present invention provides a kit for separating adipose tissue-derived stromal blood vessel fraction, injecting the collected adipose tissue and a lysate through an opening into the first separation tube of the kit, followed by centrifugation, and the centrifugation is completed. Inserting an injection needle or syringe into the bottom of the first separation tube to remove the contents including the stromal vascular fraction from the lower receiving space; and the washing liquid and the contents including the stromal vascular fraction from the first opening through the first opening.
  • Substrate vascular fraction washing step of injecting and mixing into the separation tube and centrifugation, and after blocking the passage portion of the second separation tube after the centrifugation with a closing adjustment screw and shaking the second separation tube, the bottom hole of the second separation tube Inserting an injection needle or syringe into the adipose tissue-derived stromal blood vessel, comprising extracting a solution containing the stromal blood vessel fraction; And it provides separation methods.
  • Adipose tissue-derived stromal vascular fraction separation kit is easy to operate so that even non-experts can be used, and because the exposure and air cleaning process of the stromal vascular fraction can be repeatedly performed together in one tube. Since the risk of secondary infection from the outside is minimized, the survival rate and recovery rate of the stromal vascular fraction compared to the amount of the adipose tissue are increased, so that less adipose tissue is required. Therefore, the stromal vascular fraction can be separated from the adipose tissue very efficiently and easily. Can be.
  • FIG. 1 shows a cross-sectional view of a first separation tube.
  • FIG 3 shows a cross-sectional view of another embodiment of a second separation tube.
  • Figure 4 shows a cross-sectional view of the second separation tube closed the passage portion with a closing adjustment screw.
  • Figure 5 shows a cross-sectional view of another embodiment of a second separation tube plugging the passageway with a closing adjustment screw.
  • FIG. 6 shows a top cross-sectional view of a first separation tube comprising two openings and a stopper blocking the openings.
  • FIG. 7 shows a top sectional view of a second separation tube comprising two openings and a stopper blocking the openings.
  • Figure 9 shows a cross-sectional view of the adjustment screw for closing the passage portion is equipped with a pressure control ring including a plurality of holes, the blocking plate for opening and closing the hole.
  • FIG. 10 is a front view of the pressure adjusting ring and the blocking plate existing on the pressure adjusting ring from the top.
  • FIG. 11 is a schematic view illustrating a phenomenon in which the pressure generated when the adjustment screw for closing the passage part is moved upward by pressing the upper blocking plate to block the hole of the pressure adjusting ring in a sectional view.
  • FIG. 12 is a front view of the upper blocking plate and the lower blocking plate viewed from above, in a shape covering different holes.
  • FIG. 13 is a front view of a top blocking plate and a lower blocking plate respectively formed as a separate type instead of an integrated body as shown in FIG. 10, covering the different holes of the pressure adjusting ring.
  • Figure 14 shows a view from the top of the upper surface of the upper receiving space of the first separation tube in which the air outlet is formed.
  • a membrane having a plurality of fine holes can be mounted.
  • FIG. 16 shows a view of the upper surface of the upper receiving space of the second separation tube in which the air inlet is formed.
  • FIG. 17 illustrates a cross-sectional view of an air inlet formed at an upper end of an upper accommodating space of the second separation tube, in which an air purification filter membrane is present at an upper portion and a membrane having a plurality of fine holes may be present at a lower portion thereof.
  • kits for separating adipose tissue-derived stromal vascular fraction according to the present invention and a method for separating adipose tissue-derived stromal vascular fraction using the kit will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
  • the detailed description and the detailed illustration will be omitted.
  • the accompanying drawings are not drawn to scale to facilitate understanding of the invention, some of the dimensions of the components may be exaggerated.
  • FIGS. 2 and 3 show cross-sectional views of embodiments of the second separation tube 200 constituting the present invention kit, respectively.
  • 5 is a cross-sectional view illustrating a state in which the passage part 220 is sealed with the adjusting screw 260 for closing the passage part in the second separation tube 200 of FIGS. 2 and 3.
  • 6 and 7 illustrate cross-sectional views of each of the first separation tube 100 and the second separation tube 200 in which two openings are formed.
  • the first separation tube 100 constituting the kit for separating adipose tissue-derived stromal blood vessel separation according to the present invention is the upper receiving space 110, the lower receiving space narrowing in the downward direction ( 120, distinguishing the upper receiving space 110 and the lower receiving space 120, one or more openings 150 for entry and exit of the filter 130, the substance or the air, which the matrix blood vessel passes through and the fat tissue cannot pass through. ), A stopper 151 for blocking the opening, a bottom hole 121 positioned at the bottom of the lower receiving space, and a material positioned at the bottom of the bottom hole to block the bottom hole and the outside and to be drilled by an injection needle or a syringe. And a bottom blocking film 140.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of the first separation tube in the case of two openings 150.
  • the first separation tube includes a plurality of openings 150 and 180, each of the openings may be used for access of air or materials used for separating the vascular fraction.
  • the plugs 151 and 181 blocking the plurality of openings may be mounted in various forms, and the plugs may be connected and open together at once.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the second separation tube in the case of two openings 270.
  • the openings 270 and 290 may be used for the purpose of accessing the openings to the materials used for separation of air or matrix blood vessel fractions, and plugs for blocking the plurality of openings ( 271 and 291 may be mounted in various forms, and may have a configuration in which the plugs are connected and opened together at once.
  • Plugs 151, 181, 271, and 291 for blocking the openings 150, 180, 270, and 290 of the first separation tube 100 and the second separation tube 200 are coupled to the top of the upper receiving space. Although shown as being, but not limited to, it may be in a separated state.
  • the material of the stoppers 151, 181, 271, and 291 is preferably a material that can be securely blocked by the opening having flexibility.
  • the first separation tube 100 is a tube for separating the stromal vascular fraction from the collected adipose tissue, and put together the adipose tissue and lipase in the upper receiving space 110 through the opening 150 of the first separation tube After centrifugation, the stromal vascular fraction except the adipose tissue moves to the lower receiving space 120.
  • a filter 130 that separates the upper receiving space 110 and the lower receiving space 120 of the first separation tube.
  • the matrix blood vessel fraction may pass through the filter 130, but the adipose tissue may pass through. Because there is not.
  • the filter 130 may filter not only adipose tissue but also other unnecessary tissue.
  • the filter 130 may have a very dense hole, but the diameter of the hole is not limited thereto, but preferably 40 to 100 ⁇ m.
  • the second separation tube 200 constituting the kit for separating adipose tissue-derived stromal blood vessel separation according to the present invention is narrow in the downward direction, the spiral 261 is formed on the top
  • the adjustment screw 260 for closing the passage portion which can be coupled to the spiral 261, the lower hole 231 located at the lower end of the lower accommodation space, and the lower hole 231.
  • the coupling form of the adjusting screw 260 for closing the passage part in the second separation tube and the upper receiving space 210 is not limited thereto, but may be implemented as shown in FIGS. 2 and 3.
  • the upper receiving space 210 of the second separation tube further includes a fitting protrusion 262 at the top 211, and a spiral to which the adjustment screw 260 for closing the passage part is coupled ( 261 may be formed inside or outside the fitting protrusion.
  • the head of the adjustment screw 260 for closing the passage portion coupled to the spiral 261 formed on the upper receiving space of the second separation tube has a cross-sectional area of the upper receiving space 260. It can be in the form of serving as a lid by covering all.
  • the opening 270 is not limited thereto, but may be mounted to the head of the adjusting screw 260 for closing the passage.
  • the passage part 220 may be closed by turning the adjusting screw 260 for closing the passage part.
  • the second separation tube 200 is a tube for washing or suspending the matrix vessel fraction separated from the first separation tube 100.
  • the matrix vessel fraction separated from the first separation tube 100 needs to be washed because it exists together with foreign substances such as lipolytic enzymes. In some cases, the washing may be repeated several times. There is a possibility that the stromal vascular fraction may be lost in the process of exchanging the washing liquid.
  • the second separation tube 200 according to the present invention may prevent the outflow of the matrix blood vessel fraction present in the lower receiving space 230 by closing the passage part 220 with the closing adjustment screw 260. No stromal vessel fractions are lost during the wash.
  • the passage portion 220 is sealed with a closing adjustment screw 260 and then shakes the second separation tube 200 in the lower receiving space 230.
  • the stromal vascular fraction exists only in the lower receiving space 230, thereby obtaining a suspension in which the stromal blood fraction is present at a high concentration.
  • the silicone cap 263 may be coupled to the end of the closing adjustment screw 260 to further increase the sealing force.
  • the lower hole blocking layers 140 and 240 of the first separation tube 100 or the second separation tube 200 may have grooves 141 for indicating the positions of the lower holes 121 and 231 at the lower ends of the lower receiving spaces 120 and 230.
  • 241 may have a lower surface.
  • the grooves 141, 241 can indicate the location of the bottom holes 121, 231 to indicate the proper location for the syringe.
  • first separation tube 100 or the second separation tube 200 may further include sealing membranes 160 and 250 under the lower receiving space blocking membranes 140 and 240, and the sealing membranes 160,
  • the material of 250) is preferably a material that can be pierced with a needle. If the sealing membranes 160 and 250 are further included, the vascular vascular fraction may be collected more hygienically.
  • the overall appearance of the first separation tube 100 or the second separation tube 200 is not limited to this, but a cylindrical shape may be preferable, and in the case of a cylindrical shape, the convenience may be increased.
  • the upper receiving space (110, 210), the lower receiving space (120, 230) and the passage portion 220 of the second separation tube is preferably a transparent material so that it can be observed from the outside.
  • FIG. 8 shows the passage part 220 in which the scale 221 of the second separation tube is indicated.
  • the purpose of separating the stromal vascular fraction may be various, such as storage and transplantation, and the appropriate volume of the stromal vascular suspension is different for each purpose.
  • most of the techniques have been performed to extract the stromal vascular fraction and then suspend it again to adjust the volume according to the purpose.
  • the stromal vascular fraction may be exposed to air and contaminated or necrotic. Therefore, many people in the art are urgent in need of a kit that can be adjusted in volume.
  • the length or cross-sectional area of the passage portion 220 is increased or widened to adjust the volume between the lower end portion of the passage portion 220 at the bottom end of the closing adjustment screw 260, thereby providing a solution containing the matrix blood vessel fraction. You can add the ability to adjust the volume. In this case, by displaying the scale 221 on the passage portion 220, accurate volume control is possible. If the length or cross-sectional area of the passage part 220 is changed, the adjusting screw 260 for closing the passage part may be extended to reach the bottom of the passage part 220, or the passage part 220 may be closed. It is desirable that the thickness be changed as much as possible.
  • the passage closing adjustment screw 260 moves up or down the passage portion 220. If the pressure is not adjusted, the passage closing adjustment screw 260 may not move smoothly.
  • the volume of the solution including the stromal blood vessel fraction is reduced by the adjustment screw 260 for closing the passage part, the pressure applied to the solution may increase and the matrix blood vessel fraction may be stressed and necrotic. Therefore, a configuration for adjusting the pressure may be added, and specific embodiments of the configuration for adjusting the pressure will be described below with reference to FIGS. 9 to 13.
  • 9 to 13 is a view showing a pressure adjusting ring 264 for adjusting the pressure so that the vertical movement of the passage closing closing adjustment screw 260 is smooth.
  • 9 is a cross-sectional view of a passage portion closing adjustment screw 260 equipped with a pressure adjusting ring 264 that includes a plurality of holes 265 and includes a blocking plate 266 for opening and closing the holes 265.
  • FIG. 10 is a front view of the pressure adjusting ring 264 and the blocking plate 266 existing at the upper end of the pressure adjusting ring, and FIG. 11 is generated when the adjusting portion 260 for closing the passage part is moved upward.
  • FIG. 12 is a front view of the upper blocking plate 266 and the lower blocking plate 267 covering the different holes 265 of the pressure adjusting ring 264 from the top
  • FIG. 13 is an upper blocking plate ( 266 and the lower blocking plate 267 are each formed in a separate type rather than in one piece as shown in FIG. 10, and are front views of the shapes covering the different holes of the pressure control ring.
  • the pressure adjusting configuration may be implemented by a pressure adjusting ring 264 including a plurality of holes 265. Since the movement of air or liquid is free through the plurality of holes 265, the movement of the adjusting screw 260 for closing the passage is smooth.
  • the pressure adjusting ring 264 may be provided with a blocking plate 266 for opening and closing the hole 265 at the top or top and bottom, the reason that the blocking plate 266 is present, the material in the lower accommodation space This is to prevent the inflow and outflow of the material in the upper receiving space when taken out.
  • a barrier plate 266 for more accurate volume extraction, it may be desirable to have a barrier plate 266.
  • the blocking plate 266 is present only at the top of the pressure adjusting ring 264, or as shown in FIGS. 12 and 13, the blocking plate is the upper portion of the pressure adjusting ring 264. And it may be present in both the lower, in this case, it is preferable that the upper blocking plate 266 and the lower blocking plate 267 open and close the plurality of holes 265 so as not to overlap each other. Being able to open and close without overlapping each other, more specifically, means that the upper blocking plate 266 and the lower blocking plate 267 open and close different holes from each other.
  • the volume control ring 260 in which only the upper blocking plate 266 is present may further include one or more micro holes 268, and the micro holes 268 may pass through the liquid. It is not characterized by passing only gas. Since only the gas may pass through the fine holes 268, it is preferable to move the adjusting screw 260 for closing the passage part after emptying the liquid existing in the upper space of the pressure adjusting ring 264.
  • the blocking plate 266 is preferably a flexible material because it must be easy to open and close according to the flow of liquid or gas, and the flexible material may be silicon, rubber, or plastic, and preferably silicon.
  • FIG. 14 shows a top view 111 of the upper accommodating space 111 of the first separating tube 100 in which the air outlet 170 is formed
  • FIG. 15 is a top accommodating space of the upper accommodating space of the first separating tube.
  • a membrane having a plurality of fine holes 171 may be mounted to the air outlet 170.
  • an air outlet may be further formed at the upper end 111 of the upper receiving space of the first separation tube 100 to allow air inside the first separation tube to be discharged when the adipose tissue is injected.
  • the air outlet may be in the form of a simple hole 170.
  • a membrane 171 having a plurality of fine holes is formed in the hole 170. There may be.
  • FIG. 16 illustrates a view of an upper surface of the upper receiving space of the second separation tube in which the air entrance 280 is formed
  • FIG. 17 illustrates an air entrance 280 formed at the upper end of the upper receiving space of the second separation tube.
  • the contents may be frequently removed from the inside of the second separation tube, such as exchanging the washing solution several times, or removing the washing solution and injecting the suspension again.
  • the contents When the contents are injected or taken out into the interior of the air, the corresponding internal air is discharged or the external air is introduced into the second separation tube. Therefore, the upper accommodation space 211 of the upper portion of the second separation tube 200 may further include an air inlet through which air may enter.
  • the air inlet may be in the form of a simple hole 280, and as illustrated in FIG. 17, a membrane 281 having a plurality of fine holes formed therein may be formed in the hole 280. Can be.
  • the second separation tube When the outside air is introduced into the second separation tube 200, the second separation tube may be contaminated, so that the air purifying filter 282 that can filter the outside air cleanly may have a hole 280 for entering or exiting the air. It may be further mounted in the opening 290 for air entry. As shown in FIG. 17, when the air purification filter 282 is mounted together with the membrane 281 having a plurality of fine holes, the air purification filter 282 is preferably positioned above the membrane 281. can do.
  • the minute holes 171 and 281 formed in the air outlet 170 or the air inlet 280 allow only air to enter and exit the inside of the first separation tube 100 or the second separation tube 200. It is desirable that the contents of do not leak.
  • the kit according to the invention can be used to separate stromal vascular fractions from adipose tissue.
  • the separation method may be performed through the following steps.
  • Providing a kit for separating adipose tissue-derived stromal vascular fraction according to the present invention injecting the collected adipose tissue and lipolytic agent through the opening 150 to the first separation tube 100 of the kit, followed by centrifugation; Inserting an injection needle or a syringe into the bottom hole 121 of the first separation tube where centrifugation has been completed, and extracting the contents including the stromal vascular fraction from the lower receiving space 120, and the contents and the washing liquid containing the stromal vascular fraction;
  • the vascular vascular fraction washing step of injecting and mixing the second separation tube 200 of the kit through the first opening 270, followed by centrifugation, and passage passage 220 of the second separation tube after the centrifugation has been completed. Closing the secondary closing control screw 260 and shaking the second separation tube 200, and inserting a needle or syringe into the bottom hole 231 of the second separation tube to take out the solution containing the matrix blood vessel fraction Contains .
  • the lipolytic agent may include a lipase, fibrous protease, and the like, and the lipase may be a two-cement solution, a lipase, a phospholipase or an esterase, and the fibrous protease is collagenase. , Accutease, feptidase, endfeptidase or exespfeptidase.
  • the passage part 220 of the second separation tube is blocked with the adjusting screw 260 for closing the passage part, and then the upper receiving space 210 of the second separation tube. Emptying the upper accommodating space by taking out the contents therein, releasing the adjusting screw 260 for closing the passage part to open the passage part 220 and suspending through the first opening 270 inside the empty upper accommodating space 210. Injection and centrifuging the second separation tube, and blocking the passage part 220 of the second separation tube after the centrifugation is finished with the adjustment screw 260 for closing the passage part and shaking the second separation tube 200.
  • the stromal vascular fraction can be obtained in the form of a suspension.
  • the total number of stromal vascular fraction cells contained in the collected solution was 2.5 ⁇ 10 7 cells, and thus, the number of stromal vascular fractions separated per 1 mL of adipose tissue was 1.25 ⁇ 10 6 cells.
  • the survival rate was measured using a matrix automatic cell counting device (Logos LUNA Stem or Life technologies Countess II automated cell counter), resulting in 96.5%. Table 1 below shows the performance of the existing machines for extracting stromal blood vessel fractions from adipose tissue (Source: 2011.03.18. Publicly available at the Center).
  • the kit of the present invention has a very good recovery of matrix vascular fraction.

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Abstract

분획의 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트는 비전문가도 사용이 가능할 정도로 작동 방법이 쉽고, 기질혈관분획의 세척 및 현탁 과정을 한 개의 튜브 내에서 반복적으로 함께 수행할 수 있기 때문에 공기노출이 최소화되므로 외부를 통한 2차 감염의 위험성이 낮으며, 이에 따라 지방조직 양 대비 기질혈관분획의 생존율 및 회수율이 높아져서 지방조직이 적게 필요한바, 지방조직으로부터 매우 효율적이면서 쉽게 기질혈관분획을 깨끗이 분리해낼 수 있다.

Description

지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 이를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획의 분리 방법
본 발명은 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 이를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획의 분리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 획기적인 구조를 이용하여 고가의 장비 없이도 지방조직으로부터 기질혈관분획을 쉽게 분리할 수 있는 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 이를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획의 분리 방법에 관한 것이다.
기질혈관분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)은 지방조직에서 추출되는 것으로, 지방줄기세포, 섬유 모세포, 면역세포 및 혈관내피세포 등을 포함하고 있는데, 이러한 세포들은 각종 성장인자와 콜라겐, 히알루론산 같은 세포외기질 단백질을 풍부하게 분비하는 세포이다. 따라서 기질혈관분획을 피부에 주입하면, 히알루론산 분비량이 증가하여 피부의 보습 작용이 상승하고 콜라겐, 엘라스틴 등의 탄력 단백질들이 풍부해져서 피부 탄력이 올라간다. 이러한 효과 때문에 최근 들어 기질혈관분획을 이용한 미용시술에 대한 수요가 급격히 증가하고 있다.
그러나 지방조직으로부터 깨끗한 기질혈관분획을 추출하는 것은 까다롭기 때문에 고가의 장비가 필요하고, 이에 따라 기질혈관분획을 이용한 미용시술의 가격은 매우 높은 편이다. 따라서 간편하게 기질혈관분획을 분리할 수 있는 키트에 대한 필요성이 높아지고 있고, 한국공개특허 제2015-0051026호는 지방유래 줄기세포(기질혈관분획)를 대용량으로 분리할 수 있는 튜브를 공지하고 있다. 그러나 상기 특허는 지방유래 기질혈관분획을 분리하는데 필요한 시약들을 혼합하는 과정에서 기질혈관분획이 제1챔버의 메쉬망을 통해 밖으로 유출될 가능성이 크기 때문에 회수율이 높지 않은 단점이 있고, 원심분리를 반복적으로 하면서 생성된 특정 층을 계속해서 제거해줘야 하는데, 이는 병원에 종사하는 간호사나 의사 같은 비전문가가 실행하기에는 번거롭고 까다로운 공정이다.
따라서 회수율이 높으면서 사용법이 어렵지 않은 지방유래 기질혈관분획 분리용 키트를 개발할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자, 기질혈관분획 세포의 회수율 및 생존율이 높으면서도 사용법이 어렵지 않은 키트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지방조직으로부터 기질혈관분획을 분리하기 위한 제1분리튜브 및 상기 제1분리튜브에서 분리된 기질혈관분획을 세척 또는 현탁하기 위한 제2분리튜브를 포함하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 지방조직으로부터 기질혈관분획을 깨끗하게 분리할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
(a) 상부 수용공간, 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간, 상기 상부 수용공간과 하부 수용공간을 구분 지으면서, 기질혈관분획은 통과하고 지방조직은 통과할 수 없는 필터, 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부, 상기 개구부를 막는 마개, 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍, 및 상기 밑구멍 하단에 위치하여 상기 밑구멍과 외부를 차단하고 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성된 밑구멍 차단막을 포함하는, 지방조직으로부터 기질혈관분획을 분리하기 위한 제1분리튜브; 및
(b) 아랫방향으로 폭이 좁아지고, 상단에 나선이 형성되어 있는 상부 수용공간, 윗방향 및 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간, 상기 상부 수용공간과 하부 수용공간을 연결하는 통로부, 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부, 상기 개구부를 막는 마개, 상하로 이동이 가능하고 상기 통로부를 밀폐시킬 수 있으며 상기 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 나선과 결합이 가능한 통로부 폐쇄용 조절나사, 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍, 및 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성되어 있고 상기 밑구멍 하단에 위치하여 상기 밑구멍과 외부를 차단하는 밑구멍 차단막을 포함하는, 기질혈관분획의 세척 또는 현탁을 위한 제2분리튜브를 포함하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 제공한다.
상기 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 나선과 결합하는 통로부 폐쇄용 조절나사의 머리 부분이 상기 상부 수용공간의 뚜껑일 수 있다.
상기 제2분리튜브의 상부 수용공간이 상단에 끼움 돌기를 추가로 포함하고, 통로부 폐쇄용 조절나사가 결합되는 나선이 상기 끼움 돌기 내부 또는 외부에 형성되어 있을 수 있다.
상기 제2분리튜브의 폐쇄용 조절나사의 말단에는 통로부를 밀폐시키기 위한 실리콘 캡이 결합되어 있을 수 있다.
상기 제2분리튜브의 통로부에는 하부 수용공간에 포함되는 내용물의 부피 조절을 위해서 눈금이 표시되어 있을 수 있다.
상기 제2분리튜브의 통로부 폐쇄용 조절나사의 말단에는, 복수 개의 구멍을 포함하는 압력조절용 링이 장착되어 있을 수 있고, 또한, 상기 압력조절용 링의 상단 또는 상하단에는 상기 복수 개의 구멍을 개폐하는 차단판이 구비되어 있을 수 있다. 상기 차단판이 상하단에 모두 구비되어 있는 경우, 상단에 구비된 차단판과 하단에 구비된 차단판은 서로 상이한 구멍을 개폐하는 것이 바람직하다.
상기 제1분리튜브 또는 제2분리튜브의 밑구멍 차단막은 상기 하부 수용공간 하단의 밑구멍의 위치를 표시하는 홈을 하단면에 가질 수 있다.
상기 제1분리튜브 또는 제2분리튜브는 하부 수용공간 차단막의 하부에 실링막을 추가로 포함할 수 있고, 상기 실링막은 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재일 수 있다.
본 발명은 상기 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 제공하는 단계, 채취된 지방조직 및 지방용해제를 상기 키트의 제1분리튜브에 개구부를 통하여 주입한 후 원심분리 하는 단계, 원심분리가 완료된 상기 제1분리튜브의 밑구멍에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 하부 수용공간에서 기질혈관분획을 포함하는 내용물을 꺼내는 단계, 세척액 및 상기 기질혈관분획을 포함하는 내용물을 제1개구부를 통해 상기 키트의 제2분리튜브에 주입하여 혼합한 후 원심분리 하는 기질혈관분획 세척 단계, 및 원심분리가 끝난 상기 제2분리튜브의 통로부를 폐쇄용 조절나사로 막고 제2분리튜브를 흔들어 준 후, 제2분리튜브의 밑구멍에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 기질혈관분획을 함유하는 용액을 꺼내는 단계를 포함하는, 지방조직 유래 기질혈관 분획 분리 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트는 비전문가도 사용이 가능할 정도로 작동 방법이 쉽고, 기질혈관분획의 세척 및 현탁 과정을 한 개의 튜브 내에서 반복적으로 함께 수행할 수 있기 때문에 공기노출이 최소화되므로 외부를 통한 2차 감염의 위험성이 낮으며, 이에 따라 지방조직 양 대비 기질혈관분획의 생존율 및 회수율이 높아져서 지방조직이 적게 필요한바, 지방조직으로부터 매우 효율적이면서 쉽게 기질혈관분획을 깨끗이 분리해낼 수 있다.
도 1은 제1분리튜브의 단면도를 나타낸다.
도 2는 제2분리튜브의 단면도를 나타낸다.
도 3은 제2분리튜브의 다른 실시예의 단면도를 나타낸다.
도 4는 폐쇄용 조절나사로 통로부를 막은 제2분리튜브의 단면도를 나타낸다.
도 5는 폐쇄용 조절나사로 통로부를 막은 제2분리튜브 다른 실시예의 단면도를 나타낸다.
도 6은 2개의 개구부 및 상기 개구부를 막는 마개를 포함하는 제1분리튜브의 상부 단면도를 나타낸다.
도 7은 2개의 개구부 및 상기 개구부를 막는 마개를 포함하는 제2분리튜브의 상부 단면도를 나타낸다.
도 8은 제2분리튜브의 눈금이 표시되어 있는 통로부를 나타낸다.
도 9는 복수 개의 구멍을 포함하며, 상기 구멍을 개폐하는 차단판을 포함하는 압력조절링이 장착된 통로부 폐쇄용 조절나사의 단면도를 나타낸다.
도 10은 압력조절용 링 및 상기 압력조절용 링 상단에 존재하는 차단판의 모습을 상부에서 바라본 정면도이다.
도 11은 통로부 폐쇄용 조절나사를 위로 이동시킬 때 발생되는 압력이 상부 차단판을 눌러서 압력조절용 링의 구멍이 막히는 현상을 단면도 형식으로 나타낸 모식도이다.
도 12는 상부 차단판 및 하부 차단판이, 서로 다른 구멍들을 덮고 있는 형상을 상부에서 바라본 정면도이다.
도 13은 상부 차단판 및 하부 차단판이 각각 도 10처럼 일체형이 아닌 분리형으로 형성되어, 압력조절용 링의 서로 다른 구멍들을 덮고 있는 형상을 상부에서 바라본 정면도이다.
도 14는 공기 출구가 형성되어 있는 제1분리튜브의 상부 수용공간 상단면을 상부에서 바라본 모습을 나타낸다.
도 15는 제1분리튜브의 상부 수용공간 상단면에 형성되어 있는 공기 출구의 단면도를 나타낸 것으로, 복수 개의 미세한 구멍이 있는 막이 장착될 수 있다.
도 16은 공기 출입구가 형성되어 있는 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단면을 상부에서 바라본 모습을 나타낸다.
도 17은 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 공기 출입구의 단면도를 나타낸 것으로, 공기정화필터막이 상부에 존재하고 복수 개의 미세한 구멍이 뚫려있는 막이 하부에 존재할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트 및 상기 키트를 이용한 지방조직 유래 기질혈관분획 분리 방법에 대하여 자세히 설명한다. 다만, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기능 혹은 구성 요소에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명 및 구체적인 도시를 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 발명의 이해를 돕기 위하여 실제 축적대로 도시된 것이 아니고, 일부 구성요소의 치수가 과장되게 도시될 수 있다.
도 1은 본 발명 키트를 구성하는 제1분리튜브(100)의 단면도, 도 2 및 도 3은 본 발명 키트를 구성하는 제2분리튜브(200)의 실시예들의 단면도를 각각 나타내며, 도 4 및 도 5는 도 2 및 도 3의 제2분리튜브(200)에서 통로부 폐쇄용 조절나사(260)로 통로부(220)를 밀폐시킨 상태를 나타내는 단면도이다. 또한, 도 6 및 도 7은 개구부가 2개 형성된 각각의 제1분리튜브(100) 및 제2분리튜브(200)의 단면도를 나타낸다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 구성하는 제1분리튜브(100)는 상부 수용공간(110), 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간(120), 상부 수용공간(110)과 하부 수용공간(120)을 구분 지으면서, 기질혈관분획은 통과하고 지방조직은 통과할 수 없는 필터(130), 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부(150), 상기 개구부를 막는 마개(151), 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍(121), 및 상기 밑구멍 하단에 위치하여 상기 밑구멍과 외부를 차단하고 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성된 밑구멍 차단막(140)을 포함한다.
개구부(150)가 2개인 경우의 제1분리튜브 단면도를 도 6에 기재하였다. 복수 개의 개구부(150, 180)를 제1분리튜브가 포함할 경우, 각 개구부를 공기, 또는 기질혈관분획 분리에 사용되는 물질들의 출입을 위한 용도로 사용할 수 있다. 복수 개의 개구부를 막는 마개(151, 181)들은 여러 가지 형태로 장착될 수 있으며, 마개들이 연결되어 한 번에 같이 열리는 구성을 가질 수도 있다.
개구부(270)가 2개인 경우의 제2분리튜브 단면도를 도 7에 기재하였다. 이 역시 상기 도 6에 서술한 바와 같이, 각 개구부(270, 290)들을 각 개구부를 공기, 또는 기질혈관분획 분리에 사용되는 물질들의 출입을 위한 용도로 사용할 수 있고, 복수 개의 개구부를 막는 마개(271, 291)들은 여러 가지 형태로 장착될 수 있으며, 마개들이 연결되어 한 번에 같이 열리는 구성을 가질 수도 있다.
제1분리튜브(100) 및 제2분리튜브(200)의 개구부들(150, 180, 270, 290)을 막는 마개(151, 181, 271, 291)들은 도면에는 상부 수용공간 상단에 결합되어 있는 것으로 도시되어 있지만, 이에 한정되지 않고 분리된 상태일 수 있다. 또한 마개(151, 181, 271, 291)의 소재는 유연성을 가짐으로서 개구부를 확실히 막을 수 있는 소재가 바람직하다.
제1분리튜브(100)는 채취된 지방조직으로부터 기질혈관분획을 분리하기 위한 튜브로서, 제1분리튜브의 개구부(150)를 통해 상부 수용공간(110)에 지방조직 및 지방분해효소를 함께 넣은 후 원심분리를 하면 지방조직을 제외한 기질혈관분획은 하부 수용공간(120)으로 이동한다. 이는 제1분리튜브의 상부 수용공간(110) 및 하부 수용공간(120)을 구분 짓는 필터(130)에 의해 가능한데, 기질혈관분획은 필터(130)를 통과할 수 있지만, 지방조직은 통과할 수 없기 때문이다. 필터(130)는 지방조직 뿐 만 아니라, 불필요한 다른 조직도 걸러낼 수 있다. 또한, 필터(130)는 매우 촘촘한 구멍을 가질 수 있는데 상기 구멍의 지름은 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게는 40~100㎛일 수 있다.
도 2 및 3에 도시된바와 같이, 본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 구성하는 제2분리튜브(200)는 아랫방향으로 폭이 좁아지고, 상단에 나선(261)이 형성되어 있는 상부 수용공간(210), 윗방향 및 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간(230), 상부 수용공간(210)과 하부 수용공간(230)을 연결하는 통로부(220), 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부(270), 개구부(270)를 막는 마개(271), 상하로 이동이 가능하고 상기 통로부(220)를 밀폐시킬 수 있으며 상부 수용공간(210) 상단에 형성되어 있는 나선(261)과 결합이 가능한 통로부 폐쇄용 조절나사(260), 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍(231), 및 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성되어 있고 밑구멍(231) 하단에 위치하여 밑구멍(231)과 외부를 차단하는 밑구멍 차단막(240)을 포함하는, 기질혈관분획의 세척 또는 현탁을 위한 제2분리튜브(200)를 포함한다.
제2분리튜브에서 통로부 폐쇄용 조절나사(260)와 상부 수용공간(210)의 결합 형태는 이에 한정되지 않으나, 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 구현될 수 있다.
도 2에 도시된바와 같이, 제2분리튜브의 상부 수용공간(210)이 상단(211)에 끼움 돌기(262)를 추가로 포함하고, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)가 결합되는 나선(261)이 상기 끼움 돌기 내부 또는 외부에 형성될 수 있다.
또는, 도 3에 도시된바와 같이, 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 나선(261)과 결합하는 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 머리 부분이 상부 수용공간(260) 단면적을 모두 덮음으로서 뚜껑 역할을 하는 형태일 수 있다. 이때, 개구부(270)는 이에 한정되지 않으나, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 머리 부분에 장착될 수 있다.
도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 돌림으로서 통로부(220)을 폐쇄할 수 있다.
제2분리튜브(200)는 제1분리튜브(100)에서 분리된 기질혈관분획을 세척하거나 현탁하기 위한 튜브이다.
제1분리튜브(100)에서 분리된 기질혈관분획은 지방분해효소 등의 이물질과 같이 존재하기 때문에 세척할 필요가 있다. 세척은 경우에 따라 여러 번 반복해야 하는 경우도 있는데, 세척액을 교환하는 과정에서 기질혈관분획이 부유하여 유실될 가능성이 있다. 그러나 본 발명에 따른 제2분리튜브(200)는 폐쇄용 조절나사(260)로 통로부(220)를 밀폐시킴으로서 하부 수용공간(230)에 존재하는 기질혈관분획이 유출되는 것을 막을 수 있으므로, 추가적인 세척 과정에서 기질혈관분획이 유실되지 않는다.
또한, 현탁하는 과정에서도 제2분리튜브(200)에 주입한 후 폐쇄용 조절나사(260)로 통로부(220)를 밀폐시킨 후 제2분리튜브(200)를 흔들어 하부 수용공간(230)에 침전되어 있던 기질혈관분획을 부유시키면, 하부 수용공간(230)에만 기질혈관분획이 존재하므로 기질혈관분획이 높은 농도로 존재하는 현탁액을 얻을 수 있다.
상기 폐쇄용 조절나사(260)의 말단에 실리콘 캡(263)을 결합시켜 밀폐력을 더욱 상승시킬 수 있다.
제1분리튜브(100) 또는 제2분리튜브(200)의 밑구멍 차단막(140, 240)은 하부 수용공간(120, 230)의 하단의 밑구멍(121, 231)의 위치를 표시하는 홈(141, 241)을 하단면에 가질 수 있다. 홈(141, 241)은 밑구멍(121, 231)의 위치를 알려줌으로서 주사기가 투입될 적절한 위치를 알려줄 수 있다.
또한, 제1분리튜브(100) 또는 제2분리튜브(200)는 하부 수용공간 차단막(140, 240)의 하부에 실링막(160, 250)을 추가로 포함할 수 있고, 실링막(160, 250)의 소재는 주사 바늘로 뚫릴 수 있는 소재인 것이 바람직하다. 실링막(160, 250)을 추가로 포함하면 더욱 위생적으로 기질혈관분획을 채취할 수 있다.
덧붙여, 제1분리튜브(100) 또는 제2분리튜브(200)의 전체적인 외형은 이에 한정되지는 않으나, 원기둥 형태가 바람직할 수 있고, 원기둥 형태일 경우 바닥에 세울 수 있기 때문에 편의성이 높아진다. 또한, 상부 수용공간(110, 210), 하부 수용공간(120, 230) 및 제2분리튜브의 통로부(220)는 바깥에서 관찰이 가능하도록 투명한 소재인 것이 바람직하다.
도 8은 제2분리튜브의 눈금(221)이 표시되어 있는 통로부(220)를 나타낸다.
기질혈관분획을 분리하는 목적은 보관, 이식 등 다양하게 있는데, 각 목적에 따라 기질혈관분획 현탁액의 적합한 부피가 다르다. 현재 대부분의 기술은 기질혈관분획을 추출한 후, 다시 목적에 맞게 부피를 맞추기 위해 현탁시키는 과정을 추가로 실시하고 있고 이러한 과정 중에 기질혈관분획이 공기에 노출되어 오염되거나 괴사하는 경우가 발생할 수 있다. 따라서 당업계에 종사하는 많은 관계자들이 부피 조절도 가능한 키트의 필요성을 절실히 느끼고 있다.
이에 통로부(220)의 길이 또는 단면적을 늘리거나 넓혀서, 폐쇄용 조절나사(260) 아래 끝부분에서 통로부(220)의 아래 끝부분 사이의 부피를 조절하여, 기질혈관분획을 포함하는 용액의 부피를 조절할 수 있는 기능을 추가할 수 있다. 이럴 경우 통로부(220)에 눈금(221)을 표시함으로서 정확한 부피 조절이 가능해진다. 통로부(220)의 길이 또는 단면적이 변한다면, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)는 통로부(220)의 제일 아랫부분까지 도달이 가능하도록 길이가 연장되거나, 통로부(220)의 밀폐가 가능하도록 굵기가 변경되는 것이 바람직하다.
통로부 폐쇄용 조절나사(260)는 통로부(220) 내부를 위 또는 아래로 이동하는데, 이때 압력을 조절하지 않으면, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 이동이 원활하지 않을 수 있고, 또한 통로부 폐쇄용 조절나사(260)로 기질혈관분획을 포함하는 용액의 부피를 줄일 때, 상기 용액이 받는 압력이 커져서 기질혈관분획이 스트레스를 받아 괴사될 수도 있다. 따라서, 압력을 조절하는 구성을 추가할 수 있는데, 도 9 내지 도 13을 참조하여 상기 압력을 조절하는 구성의 구체적인 구현예를 설명하면 아래와 같다.
도 9 내지 도 13은 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 상하 이동이 원활하도록 압력을 조절해주는 압력조절용 링(264)을 나타내는 도면이다. 도 9는 복수 개의 구멍(265)을 포함하며, 구멍(265)을 개폐하는 차단판(266)을 포함하는 압력조절용 링(264)이 장착된 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 단면도이고, 도 10은 압력조절용 링(264) 및 압력조절용 링 상단에 존재하는 차단판(266)의 모습을 상부에서 바라본 정면도이며, 도 11은 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 위로 이동시킬 때 발생되는 압력이 상부 차단판(266)을 눌러서 압력조절용 링(264)의 구멍(265)이 막히는 현상을 단면도로 나타낸 모식이다. 또한, 도 12는 상부 차단판(266) 및 하부 차단판(267)이 압력조절용 링(264)의 서로 다른 구멍(265)들을 덮고 있는 형상을 상부에서 바라본 정면도이고, 도 13은 상부 차단판(266) 및 하부 차단판(267)이 각각 도 10처럼 일체형이 아닌 분리형으로 형성되어, 압력조절용 링의 서로 다른 구멍들을 덮고 있는 형상을 상부에서 바라본 정면도이다.
도 9에 도시된 바와 같이, 상기 압력을 조절하는 구성은 복수 개의 구멍(265)을 포함하는 압력조절용 링(264)으로 구현될 수 있다. 복수 개의 구멍(265)을 통하여 공기 또는 액체의 이동이 자유롭기 때문에, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 이동이 원활해진다.
또한, 압력조절용 링(264)은 상단 또는 상하단에 상기 구멍(265)을 개폐하는 차단판(266)이 구비되어 있을 수 있는데, 차단판(266)이 존재하는 이유는, 하부 수용공간의 물질을 외부로 빼낼 때 상부 수용공간의 물질까지 유입되어 같이 배출되는 것을 방지하기 위함이다. 따라서 보다 더 정확한 부피의 추출을 위해서는, 차단판(266)을 구비하는 것이 바람직할 수 있다.
도 9 및 도 10에 도시된 바와 같이, 차단판(266)이 압력조절용 링(264)의 상단에만 존재하거나, 도 12 및 도 13에 도시된 바와 같이, 차단판이 압력조절용 링(264)의 상부 및 하부 모두에 존재할 수 있으며, 이때 상부 차단판(266) 및 하부 차단판(267)은 복수 개의 구멍(265)을 서로 겹치지 않게 개폐하는 것이 바람직하다. 상기 서로 겹치지 않게 개폐할 수 있다는 것은, 더 구체적으로, 상부 차단판(266) 및 하부 차단판(267)이 서로 상이한 구멍을 개폐한다는 것을 의미한다.
도 9 및 도 10의 구현예처럼 차단판(266)이 부피조절용 링(264)의 상부에만 있을 경우에는 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 아래로 이동시키는 것이 원활하다. 그러나 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 위로 이동시킬 때에는, 도 11에 도시된 바와 같이, 차단판(266)을 누르는 압력이 작용하여 구멍(265)을 차단시키기 때문에 부피조절용 링(260)의 상부에 존재하는 액체 또는 기체가 압력조절용 링(260)을 통과하여 아래로 이동할 수 없으므로, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)의 이동이 어렵고 따라서 부피를 늘리는 것이 힘들다. 따라서 도 10에 도시된 바와 같이, 상부 차단판(266)만 존재하는 부피조절용 링(260)은 1개 이상의 미세 구멍(268)을 추가로 포함할 수 있고, 미세 구멍(268)은 액체는 통과 못하지만 기체만 통과하는 것을 특징으로 한다. 미세 구멍(268)은 기체만 통과할 수 있으므로, 압력조절용 링(264)의 상부 공간에 존재하는 액체를 비운 후, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 위로 이동시키는 것이 바람직하다.
도 12 및 도 13과 같이, 상부 차단판(266) 및 하부 차단판(267)을 모두 갖춘 경우에는, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)가 위로 이동할 때 하부 차단판(267)이 열리고, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)가 아래로 이동할 때에는 상부 차단판(266)이 열리므로, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 항상 원활히 이동시킬 수 있다.
차단판(266)은 액체 또는 기체의 흐름에 따라 개폐가 쉬워야 하므로 유연한 소재인 것이 바람직하고, 상기 유연한 소재는 실리콘, 고무 또는 플라스틱일 수 있으며, 바람직하게는 실리콘일 수 있다.
도 14는 공기 출구(170)가 형성되어 있는 제1분리튜브(100)의 상부 수용공간 상단면(111)을 상부에서 바라본 모습을 나타내고, 도 15는 제1분리튜브의 상부 수용공간 상단면에 형성되어 있는 공기 출구(170)의 단면도를 나타낸 것으로, 복수 개의 미세한 구멍이 있는 막(171)이 공기 출구(170)에 장착될 수 있다.
지방조직을 제1분리튜브(100)로 주입할 시, 그에 상응하는 제1분리튜브 내부의 공기가 외부로 배출될 필요가 있다. 따라서, 제1분리튜브(100)의 상부 수용공간 상단(111)에는 지방조직 주입 시 제1분리튜브 내부의 공기가 배출될 수 있는 공기 출구가 추가로 형성되어 있을 수 있다. 상기 공기 출구는 도 14에 도시된 바와 같이, 단순한 구멍(170)의 형태일 수 있고, 도 15에 도시된 바와 같이, 구멍(170)에 복수 개의 미세한 구멍이 뚫려 있는 막(171)이 형성되어 있을 수 있다.
도 16은 공기 출입구(280)가 형성되어 있는 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단면을 상부에서 바라본 모습을 나타내고, 도 17은 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 공기 출입구(280)의 단면도를 나타낸 것으로, 공기정화필터막(282)이 상부에 존재하고 복수 개의 미세한 구멍이 뚫려있는 막(281)이 하부에 존재하는 것을 나타낸다.
제2분리튜브(200)를 사용할 시, 세척액을 여러 번 교환하거나, 세척액을 빼낸 후 현탁액을 다시 주입하는 등 제2분리튜브 내부에서 내용물을 밖으로 빼내는 경우가 빈번하게 발생할 수 있는데, 제2분리튜브(200) 내부로 내용물을 주입하거나 빼낼 경우 이에 상응하는 내부의 공기가 배출되거나 외부의 공기가 제2분리튜브 내부로 들어오게 된다. 따라서 제2분리튜브(200)의 상부 수용공간 상단(211)은 윗부분에 공기가 출입할 수 있는 공기 출입구를 추가로 포함할 수 있다. 상기 공기 출입구는 도 16에 도시된 바와 같이, 단순한 구멍(280)의 형태일 수 있고, 도 17에 도시된 바와 같이 구멍(280)에 복수 개의 미세한 구멍이 뚫려 있는 막(281)이 형성되어 있을 수 있다.
외부의 공기가 제2분리튜브(200) 내부로 유입되는 경우, 제2분리튜브가 오염될 수 있으므로 외부 공기를 깨끗하게 걸러줄 수 있는 공기정화필터(282)가 공기 출입을 위한 구멍(280) 또는 공기 출입을 위한 개구부(290) 내에 추가로 장착될 수 있다. 도 17에 도시된 바와 같이, 공기정화필터(282)가 복수 개의 미세한 구멍이 뚫려 있는 막(281)과 같이 장착될 경우, 공기정화필터(282)가 막(281)의 상부에 위치하는 것이 바람직할 수 있다.
공기 출구(170) 또는 공기 출입구(280)에 형성되어 있는 미세한 구멍이 뚫려 있는 막(171, 281)은 공기만 출입이 가능하고, 제1분리튜브(100) 또는 제2분리튜브(200) 내부의 내용물은 새어 나오지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 키트를 이용하여 지방조직으로부터 기질혈관분획을 분리할 수 있다. 분리하는 방법은 아래의 단계를 거쳐 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 제공하는 단계, 채취된 지방조직 및 지방용해제를 키트의 제1분리튜브(100)에 개구부(150)를 통하여 주입한 후 원심분리 하는 단계, 원심분리가 완료된 제1분리튜브의 밑구멍(121)에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 하부 수용공간(120)에서 기질혈관분획을 포함하는 내용물을 꺼내는 단계, 상기 기질혈관분획을 포함하는 내용물 및 세척액을 상기 키트의 제2분리튜브(200)에 제1개구부(270)를 통해 주입하여 혼합한 후 원심분리 하는 기질혈관분획 세척 단계, 및 원심분리가 끝난 제2분리튜브의 통로부(220)를 통로부 폐쇄용 조절나사(260)로 막고 제2분리튜브(200)를 흔들어 준 후, 제2분리튜브의 밑구멍(231)에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 기질혈관분획을 함유하는 용액을 꺼내는 단계를 포함한다.
상기 지방용해제는 지방분해효소, 섬유성 단백질 분해효소 등을 포함할 수 있고, 상기 지방분해효소는 투세멘트 용액, 리파아제, 포스포리파아제 또는 에스테라아제일 수 있고, 상기 섬유성 단백질 분해효소는 콜라게나제, 아큐테아제, 페프치다제, 엔드페프치다제 또는 엑키스페프치다제일 수 있다.
상기 방법에서 기질혈관분획 세척 단계 후, 원심분리가 완료된 상기 제2분리튜브의 통로부(220)를 통로부 폐쇄용 조절나사(260)로 막은 후, 제2분리튜브의 상부 수용공간(210) 안에 있는 내용물을 꺼내어 상부 수용공간을 비우는 단계, 통로부 폐쇄용 조절나사(260)를 풀어서 통로부(220)를 개방하고 비어진 상부 수용공간(210) 내부에 제1개구부(270)를 통하여 현탁액을 주입하고 제2분리튜브를 원심분리하는 단계, 및 원심분리가 끝난 상기 제2분리튜브의 통로부(220)를 통로부 폐쇄용 조절나사(260)로 막고 제2분리튜브(200)를 흔들어 준 후, 제2분리튜브의 밑구멍(231)에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 현탁액과 기질혈관분획이 혼합된 기질혈관분획 현탁액을 꺼내는 단계를 추가로 포함함으로서 기질혈관분획을 현탁액 형태로 수득할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 - 지방으로부터 기질혈관분획 추출 >
1. 지방조직 20mL 및 콜라게나제 20mL을 제1분리튜브에 주입한 후, 지방조직과 콜라게나제 솔루션을 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 40분간 반응시킨다.
2. 1500rpm으로 5분 동안 원심분리 시키고, 제1분리튜브의 하부 수용공간에 침전된 기질혈관분획을 포함하는 용액을 주사기로 약 10ml만큼 꺼낸 후, 제2분리튜브에 주입한다.
3. 세척용액 60mL를 주입하여 기질혈관분획을 세척하고, 1500rpm으로 5분 동안 원심분리한다.
4. 원심분리가 완료되면 폐쇄용 조절나사로 통로부를 막고, 상층의 세척용 액을 버리고 깨끗한 세척용액을 넣어주고, 폐쇄용 조절나사를 올려서 하 층의 현탁액과 새로 넣은 세척용액을 섞어준다.
5. 1500rpm으로 5분 동안 원심분리 한다.
6. 원심분리가 완료되면 폐쇄용 조절나사로 통로부를 막고, 제2분리튜브의 하부 수용공간에 있는 기질혈관분획을 포함하는 용액 5ml~10ml(마지막 볼륨조절)를 주사기로 채취하였다.
상기 채취된 용액에 포함된 기질혈관분획 총 세포수는 2.5×107 cell 이었고, 따라서 지방조직 1mL당 분리된 기질혈관분획의 수는 1.25×106 cells이라는 것을 알 수 있다. 또한, 기질혈관분획의 세포자동계수장비(Logos사 LUNA Stem 또는 Life technologies사 CountessⅡ automated cell counter)를 이용하여 생존율을 측정해보았는데, 96.5%에 달하는 결과가 나왔다. 하기 표 1은 지방조직에서 기질혈관분획을 추출해내는 기존의 기계들의 성능을 나타낸다(출처 : 2011.03.18.에 실시된 줄기세포 관련 산업 활성화 연계 기술세미나(주최 : (재)경기과학기술진흥원 경기바이오센터)에서 공개된 내용).
지방조직 1mL에서 추출한 기질혈관분획 세포의 수(×106)
Multi-station(Spectronix) 0.304±0.16
CHA-Station(PNC International) 0.361±0.19
Cytori’s Celution(Cytori) 0.290±0.10
Maxstem YC-100(Biomaster) 1.09
TGI-1000TM(TGI) 1.180±0.45
상기 표 1의 내용으로부터, 본 발명의 키트가 매우 우수한 기질혈관분획 회수율을 갖는다는 것을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 상부 수용공간, 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간, 상기 상부 수용공간과 하부 수용공간을 구분 지으면서, 기질혈관분획은 통과하고 지방조직은 통과할 수 없는 필터, 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부, 상기 개구부를 막는 마개, 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍, 및 상기 밑구멍 하단에 위치하여 상기 밑구멍과 외부를 차단하고 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성된 밑구멍 차단막을 포함하는, 지방조직으로부터 기질혈관분획을 분리하기 위한 제1분리튜브; 및
    (b) 아랫방향으로 폭이 좁아지고, 상단에 나선이 형성되어 있는 상부 수용공간, 윗방향 및 아랫방향으로 폭이 좁아지는 하부 수용공간, 상기 상부 수용공간과 하부 수용공간을 연결하는 통로부, 물질 또는 공기의 출입을 위한 하나 이상의 개구부, 상기 개구부를 막는 마개, 상하로 이동이 가능하고 상기 통로부를 밀폐시킬 수 있으며 상기 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 나선과 결합이 가능한 통로부 폐쇄용 조절나사, 상기 하부 수용공간의 하단에 위치하는 밑구멍, 및 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재로 구성되어 있고 상기 밑구멍 하단에 위치하여 상기 밑구멍과 외부를 차단하는 밑구멍 차단막을 포함하는, 기질혈관분획의 세척 또는 현탁을 위한 제2분리튜브를 포함하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리튜브의 상부 수용공간 상단에 형성되어 있는 나선과 결합하는 통로부 폐쇄용 조절나사의 머리 부분이 상기 상부 수용공간의 뚜껑인 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리튜브의 상부 수용공간이 상단에 끼움 돌기를 추가로 포함하고, 통로부 폐쇄용 조절나사가 결합되는 나선이 상기 끼움 돌기 내부 또는 외부에 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리튜브의 폐쇄용 조절나사의 말단에는 통로부를 밀폐시키기 위한 실리콘 캡이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리튜브의 통로부에는 하부 수용공간에 포함되는 내용물의 부피 조절을 위해서 눈금이 표시되어 있는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2분리튜브의 통로부 폐쇄용 조절나사의 말단에는, 복수 개의 구멍을 포함하는 압력조절용 링이 장착되어 있는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관 분획 분리용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 압력조절용 링의 상단 또는 상하단에는 상기 복수 개의 구멍을 개폐하는 차단판이 구비되어 있는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관 분획 분리용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 차단판이 상기 압력 조절용 링의 상하단에 모두 구비되어 있는 경우, 상단에 구비된 차단판과 하단에 구비된 차단판은 서로 상이한 구멍을 개폐하는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관 분획 분리용 키트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1분리튜브 또는 제2분리튜브의 밑구멍 차단막은 상기 하부 수용공간 하단의 밑구멍의 위치를 표시하는 홈을 하단면에 갖는 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1분리튜브 또는 제2분리튜브는 상기 하부 수용공간 차단막의 하부에 실링막을 추가로 포함하고, 상기 실링막은 주사 바늘 또는 주사기로 뚫릴 수 있는 소재인 것을 특징으로 하는, 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트.
  11. 제1항의 지방조직 유래 기질혈관분획 분리용 키트를 제공하는 단계;
    채취된 지방조직 및 지방용해제를 상기 키트의 제1분리튜브에 개구부를 통하여 주입한 후 원심분리 하는 단계;
    원심분리가 완료된 상기 제1분리튜브의 밑구멍에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 하부 수용공간에서 기질혈관분획을 포함하는 내용물을 꺼내는 단계;
    세척액 및 상기 기질혈관분획을 포함하는 내용물을 상기 키트의 제2분리튜브의 개구부를 통해 제2분리튜브 내부에 주입하여 혼합한 후 원심분리 하는 기질혈관분획 세척 단계; 및
    원심분리가 끝난 상기 제2분리튜브의 통로부를 폐쇄용 조절나사로 막고 제2분리튜브를 흔들어 준 후, 제2분리튜브의 밑구멍에 주사 바늘 또는 주사기를 삽입하여 기질혈관분획을 함유하는 용액을 추출하는 단계를 포함하는, 지방조직 유래 기질혈관 분획 분리 방법.
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