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WO2016136508A1 - ２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法 - Google Patents

２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法 Download PDF

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WO2016136508A1
WO2016136508A1 PCT/JP2016/054182 JP2016054182W WO2016136508A1 WO 2016136508 A1 WO2016136508 A1 WO 2016136508A1 JP 2016054182 W JP2016054182 W JP 2016054182W WO 2016136508 A1 WO2016136508 A1 WO 2016136508A1
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WO
WIPO (PCT)
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aoh
ahx
bacteria
reaction
concentration
Prior art date
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PCT/JP2016/054182
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French (fr)
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真治 徳山
宰熏 崔
河岸　洋和
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Shizuoka University NUC
Original Assignee
Shizuoka University NUC
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Publication date
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 2-aza-8 oxohypoxanthine.
  • Patent Document 1 discloses a method for obtaining AOH by allowing xanthine oxidase (hereinafter, sometimes referred to as “XOD”) to act on 2-azahypoxanthine (hereinafter, sometimes referred to as “AHX”). Yes.
  • XOD xanthine oxidase
  • AHX 2-azahypoxanthine
  • a method for mass production of AOH by chemical synthesis has not been established. Further, the method of obtaining AOH by causing XOD to act on AHX is not suitable for producing a large amount of AOH because the production efficiency is low and the XOD is very expensive.
  • the object of the present invention is to provide a novel method capable of producing AOH.
  • the present invention is a method for producing AOH, which includes a step of reacting AHX with a microorganism to thereby generate AOH, and a step of isolating AOH from the reaction solution.
  • the microorganism is a Burkholderia genus, Butiauxella genus, Pseudomonas genus, Escherichia coli, Bacillus genus, Saccharomyces genus, Kriveromyces genus, Candida genus, Chizosaccharomyces genus, Pichia genus, It is preferably at least one selected from the group consisting of Aspergillus and Trichoderma.
  • the above microorganisms include Burkholderia Contaminance, Burkhoharta cepacia, Burkhostagea hungorum, Butiauxera Gabiniae, Butiauxera Aggressis, Shuudomonas petitda, Shudomonas synxanta, Shuudomonasnadooubenensis More preferably, it is at least one selected from the group consisting of Pseudomonas plecogrossida.
  • a novel method capable of producing AOH can be provided.
  • the method for producing AOH according to the present embodiment includes a step of reacting AHX with a microorganism to thereby generate AOH, and a step of isolating AOH from the reaction solution.
  • 2-Aza-8 oxohypoxanthine is also represented by 3H-imidazo [4,5-d] [1,2,3] triazine-4,6 (5H, 7H) -dione and has the following formula (I) It is a compound represented by these.
  • AHX 2-Azahypoxanthine
  • 7H-imidazo [4,5-d] [1,2,3] triazin-4 (3H) -one is also represented by 7H-imidazo [4,5-d] [1,2,3] triazin-4 (3H) -one, and is a compound represented by the following formula (II). is there.
  • the microorganism used in the present embodiment may be any microorganism that has the ability to generate AOH from AHX. According to the production method according to the present embodiment, reaction inhibition by the product (AOH) is suppressed compared to the case of using XOD, and therefore AOH can be produced efficiently even if the AHX concentration in the reaction solution is high. Can do. Moreover, it is not necessary to use expensive XOD, and AOH can be manufactured at low cost.
  • microorganisms include bacteria and fungi.
  • bacteria that can be used include Burkholderia bacteria, Butiauxella bacteria, Pseudomonas bacteria, Escherichia coli, Bacillus bacteria, and the like.
  • fungi that can be used include Saccharomyces sp., Criveromyces sp., Candida sp., Tizosaccharomyces sp., Pichia sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp.
  • These microorganisms may be used individually by 1 type, and may use multiple types together.
  • the microorganism is preferably a Burkholderia bacterium, a Butiauxella bacterium, or a Pseudomonas bacterium, and more preferably a Butiauxella bacterium or a Pseudomonas bacterium. When these microorganisms are used, AOH can be generated with higher efficiency.
  • Examples of bacteria belonging to the genus Burkholderia include Burkholderia contamination, Burkholderia cepacia, Burkholderia, and the like.
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Butiauxella include Butiauxella gaviniae, Butiauxella agretis, and the like.
  • Pseudomonas genus bacterium Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Pseudomonas and new Santa (Pseudomonas synxantha), Pseudomonas & vandalism Belem cis (Pseudomonas vancouverensis), Pseudomonas & Jesusenyi (Pseudomonas jessenii), Pseudomonas & plecos Gross Shi fern (Pseudomonas plecoglossicida ) And the like.
  • microorganisms include Burkholderia Contaminance, Burkho foundeda cepacia, Burkho foundeda hungorum, Butiauxera Gabiniae, Butiauxera Aggressis, Pseudomonas petitda, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas sayhouberensis It is preferably Jesseni, more preferably Burkholderia Contaminance, Butiauxera Gabiniae, Butiauxera Aggressis, Pseudomonas petitda, Pseudomonas synxanta, Pseudomonas vancouverensis or Pseudomonas jesuseni Gabiniae, Pseudomonas petitda, Pseudomonas synxanta or Pseudomonas More preferably from vandalism Belem cis, particularly preferably Butiaukusera-Gabinia
  • the step of reacting AHX with microorganisms and thereby generating AOH can be performed, for example, by mixing a suspension containing microorganisms prepared in advance and a solution containing AHX.
  • the step of reacting AHX with a microorganism to thereby generate AOH includes, for example, contacting AHX with a microorganism to thereby generate AOH, or contacting AHX with a microorganism, thereby converting AHX to AOH. It can also be referred to as a process of converting into
  • Microorganisms can be cultured under general culture conditions for microorganisms.
  • the culture can be performed, for example, under conditions of pH 6 to 8, temperature 25 to 42 ° C. for 6 to 24 hours.
  • the culture can be performed, for example, by shaking with aeration.
  • As a culture medium for culturing microorganisms various media containing nutrient components such as carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and minerals used for microorganism culture can be used. Examples of the medium suitable for bacteria such as Burkholderia include TSB medium, YM medium, and the like. It is preferable to use a microorganism in the late logarithmic growth phase.
  • the cultured microorganisms can be collected from the medium by centrifugation or the like and used for the reaction with AHX. Microorganisms washed after collection may be used for the reaction with AHX.
  • the solvent for performing the reaction between AHX and the microorganism is preferably a buffer solution.
  • a buffer solution for example, phosphate buffered saline (PBS) can be used.
  • the AHX concentration in the reaction solution can be arbitrarily set.
  • the AOH generation efficiency can be kept high for a long time.
  • the AOH produced by the reaction can be recovered, for example, by centrifuging the reaction solution to separate the cells, and collecting and concentrating the supernatant.
  • the recovered supernatant may be subjected to a heat treatment or the like.
  • the recovered AOH may be further purified and crystallized.
  • the medium used has the composition shown in Table 1.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a 10 ⁇ PBS solution having the composition shown in Table 2 was diluted 10-fold with distilled water.
  • Each platinum strain was inoculated in 5 ml of TSB medium dispensed into a test tube, and cultured with shaking at 30 ° C. and 180 rpm, and this was used as a preculture solution.
  • 1% of the preculture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask into which 100 ml of TSB medium was dispensed, and cultured at 30 ° C. for 6 hours at 180 rpm.
  • 1 ml of the obtained culture broth was centrifuged at 11000 rpm for 5 minutes to collect bacteria.
  • 1 ml of PBS was added and washed by centrifugation at 11000 rpm for 5 minutes.
  • a certain amount of the washed cells was suspended in 900 ⁇ l of PBS, and 100 ⁇ l of 0.7 mg / ml AHX in PBS was added to the suspension to prepare a reaction solution having an AHX concentration of 70 ⁇ g / ml.
  • the reaction solution was transferred to a round bottom Spitz and reacted at 30 ° C. for 24 hours. After a predetermined time, the reaction solution was centrifuged to separate the cells, and the supernatant was collected and heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes.
  • the AHX and AOH concentrations in the reaction supernatant were analyzed by HPLC.
  • HPLC analysis conditions were as follows: Column: Develosil C30-UG-5 (Nomura Chemical Co., Ltd.), mobile phase: water + 0.02% TFA, temperature: room temperature, flow rate: 0.8 ml / min, wavelength: 254 nm, injection: 20 ⁇ l It was. The retention times of AHX and AOH were 25.2 minutes and 26.6 minutes, respectively. The results are shown in Table 3. It should be noted that, under the HPLC analysis conditions of this example, separation from impurities may be insufficient, and therefore the AOH concentration may be apparently measured higher than it actually is.
  • any bacteria used had the ability to produce AOH using AHX as a substrate.
  • the CH-1 strain, Burkholderia cepacia and Burkholderia fungorum all converted AHX in the medium into AOH and had a conversion efficiency of 100%.
  • Test Example 2 Comparison of AOH production activity
  • CH-1 Burkholderia cepacia
  • Burkholderia fungorum AOH generation activity up to 6 hours after the start of the reaction was examined.
  • the reaction conditions were the same as in Test Example 1 except that the reaction time was a predetermined time.
  • the AHX and AOH concentrations in the reaction solution were analyzed by HPLC in the same manner as in Test Example 1 at a predetermined time. The results are shown in FIG. 1 (CH-1 strain), FIG. 2 (Burkholderia cepacia), and FIG. 3 (Burkholderia fungorum).
  • the CHOH strain had the highest AOH production activity.
  • Test Example 3 Examination of reaction inhibition by products
  • the reaction was conducted for 96 hours under the same conditions as in Test Example 1, except that the initial concentration of AHX in the reaction solution was 2 mg / ml and the bacterial cell concentration was 3 times that of Test Example 1. It was.
  • the AHX concentration and AOH concentration in the reaction solution were measured by HPLC in the same manner as in Test Example 1 at a predetermined time. The results are shown in FIG.
  • the AHX concentration was similarly 2 mg / ml, and AOH was produced at 30 ° C. using 0.5 U of xanthine oxidase (from buttermilk, Oriental Yeast Co., Ltd.).
  • the AHX concentration and AOH concentration in the reaction solution Measurements were made. The results are shown in FIG.
  • Test Example 4 AOH decomposition reaction evaluation
  • the reaction was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the bacterial cell concentration in the reaction solution was twice that of Test Example 1 and AOH was used as the substrate instead of AHX.
  • the concentration of AOH in the reaction solution was measured by HPLC as in Test Example 1. The results are shown in FIG. Suspending AOH with the CH-1 strain did not reduce the AOH concentration. It was confirmed that the AOH degradation activity of the CH-1 strain was extremely weak.
  • Test Example 5 AOH yield evaluation
  • concentration of cells in the reaction solution was 3 times the amount of Test Example 1 and the initial concentration of AHX and the reaction temperature were as shown in Table 4.
  • the reaction was carried out for 8 hours. After the reaction, the reaction solution was centrifuged to separate the cells, and a supernatant was obtained. The supernatant was heat treated at 98 ° C. for 5 minutes, concentrated to 1/7 volume with a rotary evaporator, and allowed to stand at 4 ° C. for 3 days to form a precipitate.
  • AOH can be produced with high efficiency by a method using microorganisms such as CH-1 strain (microbe method).
  • XOD method XOD method
  • reaction inhibition due to the produced AOH is less likely to occur, so that the substrate concentration in the medium can be increased by about 60 times. It was possible.
  • the amount of the reaction solution used can be reduced to about 1/45 of that in the case of the XOD method by the microbial method.
  • the microbial method could produce AOH at a significantly lower cost than the XOD method.
  • Test Example 6 AOH production activity of various microorganisms
  • AOH production activity was examined using various microorganisms and CH-1 strains shown in Table 5 below. Collect strains that have been cultured in advance according to the type of various microorganisms, suspend a certain amount of cells in PBS, add AHX solution to an AHX concentration of 70 ⁇ g / ml, and The reaction was performed for 24 hours. After a predetermined time, the reaction solution was centrifuged to separate the cells, and the supernatant was collected and heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes. The AHX and AOH concentrations in the supernatant of the reaction solution were measured by the same method as in Test Example 1. The results are shown in Table 5. It was confirmed that all the microorganisms have an activity to generate AOH from AHX.
  • Each of the above strains was inoculated into 5 mL of TSB medium dispensed into a test tube, cultured with shaking at 30 ° C. and 180 rpm, and this was used as a preculture solution. 1% of the preculture was inoculated into TSB medium and cultured at 30 ° C. for 8 hours at 180 rpm. The resulting culture solution (1 ml) was collected by centrifugation.
  • Test Example 8 Using the above 10 strains and the CH-1 strain, the reaction with AHX was carried out under the same conditions as in Test Example 7, except that the reaction time was 2.5 hours. The AHX concentration in the supernatant of the reaction solution was analyzed by HPLC in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 10. All strains had higher AOH production activity than the CH-1 strain.
  • Test Example 9 Among the strains used in Test Example 8, 7 strains having high AOH production activity were reacted with AHX under the same conditions as in Test Example 7 except that the reaction time was 0.5 hour or 1 hour. The AHX concentration in the supernatant of the reaction solution was analyzed by HPLC in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 11.
  • Test Example 10 (Test Example 10) Among the strains used in Test Example 9, four strains with higher AOH production activity were tested except that the AHX concentration in the reaction solution was 2 mg / ml and the reaction time was 1 hour, 2 hours or 4 hours. Reaction with AHX was carried out under the same conditions as in Example 7. AHX and AOH concentrations in the reaction solution were measured by HPLC in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in Table 12 and FIGS.

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Abstract

　本発明は、２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法であって、２－アザヒポキサンチンと微生物とを反応させ、それにより２－アザ－８オキソヒポキサンチンを生成させる工程と、反応液から２－アザ－８オキソヒポキサンチンを単離する工程と、を含む、方法を提供する。

Description

２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法
　本発明は、２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法に関する。
　２－アザ－８オキソヒポキサンチン（以下、場合により「ＡＯＨ」と称する。）は、植物成長促進活性を示すことが知られている化合物である。特許文献１には、２－アザヒポキサンチン（以下、場合により「ＡＨＸ」と称する。）にキサンチンオキシダーゼ（以下、場合により「ＸＯＤ」と称する。）を作用させてＡＯＨを得る方法が開示されている。
国際公開第２０１２／１４７７５０号
　化学合成によってＡＯＨの大量生産を行う方法は確立されていない。また、ＡＨＸにＸＯＤを作用させてＡＯＨを得る方法は、生成効率が低く、また、ＸＯＤが非常に高価であるため、多量にＡＯＨの製造を行うには適していない。
　本発明は、ＡＯＨを製造することができる新規な方法を提供することを目的とする。
　本発明は、ＡＯＨの製造方法であって、ＡＨＸと微生物とを反応させ、それによりＡＯＨを生成させる工程と、反応液からＡＯＨを単離する工程と、を含む。
　上記方法において、微生物は、バークホリデリア属細菌、ブティアウクセラ属細菌、シュウドモナス属細菌、大腸菌、バチルス属細菌、サッカロマイセス属菌、クリベロマイセス属菌、キャンディダ属菌、チゾサッカロマイセス属菌、ピチア属菌、アスペルギルス属菌及びトリコデルマ属菌からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。上記微生物は、バークホリデリア・コンタミナンス、バークホリデリア・セパシア、バークホリデリア・フンゴルム、ブティアウクセラ・ガビニアエ、ブティアウクセラ・アグレスチス、シュウドモナス・プチダ、シュウドモナス・シンキサンタ、シュウドモナス・バンコウベレンシス、シュウドモナス・ジェスセニィ及びシュウドモナス・プレコグロスシシダからなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。これらの微生物を用いることによって、より高効率でＡＯＨを生成することができる。
　本発明により、ＡＯＨを製造することができる新規な方法を提供することができる。
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａを用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍを用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 ＸＯＤを用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１を用いた反応液中のＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｎｘａｎｔｈａ　Ａ１３を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ａ８２を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｇａｖｉｎｉａｅ　Ａ１１１を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ　Ａ１１２を用いた反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を示すグラフである。 Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｇａｖｉｎｉａｅ　Ａ１１１を用いた反応液中のＡＨＸ残存率を示すグラフである。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本実施形態に係るＡＯＨの製造方法は、ＡＨＸと微生物とを反応させ、それによりＡＯＨを生成させる工程と、反応液からＡＯＨを単離する工程と、を含む。
　２－アザ－８オキソヒポキサンチン（ＡＯＨ）は３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｄ］［１，２，３］トリアジン－４，６（５Ｈ，７Ｈ）－ジオンとも表され、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　２－アザヒポキサンチン（ＡＨＸ）は、７Ｈ－イミダゾ［４，５－ｄ］［１，２，３］トリアジン－４（３Ｈ）－オンとも表され、下記式（ＩＩ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本実施形態において用いられる微生物は、ＡＨＸからＡＯＨを生成する能力を有しているものであればよい。本実施形態に係る製造方法によれば、ＸＯＤを用いる場合と比べて生成物（ＡＯＨ）による反応阻害が抑えられるため、反応液中のＡＨＸ濃度が高くても、効率的にＡＯＨを製造することができる。また、高価なＸＯＤを用いる必要がなく、安価にＡＯＨを製造することができる。
　微生物としては、例えば、細菌、真菌等が挙げられる。細菌としては、例えば、バークホリデリア属細菌、ブティアウクセラ属細菌、シュウドモナス属細菌、大腸菌、バチルス属細菌等を用いることができる。真菌としては、例えば、サッカロマイセス属菌、クリベロマイセス属菌、キャンディダ属菌、チゾサッカロマイセス属菌、ピチア属菌、アスペルギルス属菌、トリコデルマ属菌等を用いることができる。これらの微生物は１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。微生物は、バークホリデリア属細菌、ブティアウクセラ属細菌又はシュウドモナス属細菌であることが好ましく、ブティアウクセラ属細菌又はシュウドモナス属細菌であることがより好ましい。これらの微生物を用いると、より高効率でＡＯＨを生成させることができる。
　バークホリデリア属細菌としては、例えば、バークホリデリア・コンタミナンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、バークホリデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、バークホリデリア・フンゴルム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）等が挙げられる。ブティアウクセラ属細菌としては、ブティアウクセラ・ガビニアエ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブティアウクセラ・アグレスチス（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ　ａｇｒｅｓｔｉｓ）等が挙げられる。シュウドモナス属細菌としては、シュウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュウドモナス・シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュウドモナス・バンコウベレンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）、シュウドモナス・ジェスセニィ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｊｅｓｓｅｎｉｉ）、シュウドモナス・プレコグロスシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）等が挙げられる。
　微生物は、これらの中でも、バークホリデリア・コンタミナンス、バークホリデリア・セパシア、バークホリデリア・フンゴルム、ブティアウクセラ・ガビニアエ、ブティアウクセラ・アグレスチス、シュウドモナス・プチダ、シュウドモナス・シンキサンタ、シュウドモナス・バンコウベレンシス又はシュウドモナス・ジェスセニィであることが好ましく、バークホリデリア・コンタミナンス、ブティアウクセラ・ガビニアエ、ブティアウクセラ・アグレスチス、シュウドモナス・プチダ、シュウドモナス・シンキサンタ、シュウドモナス・バンコウベレンシス又はシュウドモナス・ジェスセニィであることがより好ましく、ブティアウクセラ・ガビニアエ、シュウドモナス・プチダ、シュウドモナス・シンキサンタ又はシュウドモナス・バンコウベレンシスであることが更に好ましく、ブティアウクセラ・ガビニアエ又はシュウドモナス・プチダであることが特に好ましい。上記微生物を用いると、より高効率でＡＨＸからＡＯＨを生成することができる。
　ＡＨＸと微生物とを反応させ、それによりＡＯＨを生成させる工程は、例えば、予め培養して用意した微生物を含む懸濁液とＡＨＸを含む溶液とを混合することにより行うことができる。ＡＨＸと微生物とを反応させ、それによりＡＯＨを生成させる工程は、例えば、ＡＨＸと微生物とを接触させ、それによりＡＯＨを生成させる工程、または、ＡＨＸと微生物とを接触させ、それによりＡＨＸをＡＯＨに変換する工程ということもできる。
　微生物の培養は、微生物の一般的な培養条件で行うことができる。培養は、例えば、６～２４時間、ｐＨ６～８、温度２５～４２℃の条件で行うことができる。培養は例えば通気振とうして行うことができる。微生物を培養するための培地としては、微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、その他ビタミン、ミネラル等の栄養成分を含む各種の培地を使用することができる。バークホリデリア属菌等の細菌に適した培地としては、例えば、ＴＳＢ培地、ＹＭ培地等が挙げられる。微生物は、対数増殖期後期のものを用いることが好ましい。培養した微生物は、培地から遠心分離等を行うことにより集菌して、ＡＨＸとの反応に用いることができる。微生物は集菌後に洗浄したものをＡＨＸとの反応に用いてもよい。
　ＡＨＸと微生物との反応を行うための溶媒は緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を用いることができる。
　反応液中のＡＨＸ濃度は任意に設定することができる。本実施形態における製造方法では、ＸＯＤを用いてＡＨＸからＡＯＨの生成を行う場合と異なり、反応液中のＡＨＸ濃度が高くても、ＡＯＨの生成効率を長時間高く保つことができる。
　反応により生成したＡＯＨは、例えば、反応液を遠心分離して菌体を分離し、上澄みを回収して濃縮することによって回収することができる。回収した上澄みには加熱処理等を行ってもよい。回収したＡＯＨは更に精製、結晶化等を行ってもよい。
　以下、実施例により本発明の実施形態を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（試験例１：ＡＯＨの生成活性評価）
　下記の微生物を用いて、ＡＯＨ生成活性を調べた。
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ　ＮＢＲＣ　１３５９１
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ　ＮＢＲＣ　１４５９５
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ　ＮＢＲＣ　１０２４８８
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ　ＮＢＲＣ　１０２４８９
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｅｒｒａｒｉａｅ　ＮＢＲＣ　１０６２３３
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ　ＮＢＲＣ　１００９６５
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｍｉｍｏｓａｒｕｍ　ＮＢＲＣ　１０６３３８
　上記微生物の内、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ　ＣＨ－１（以下、「ＣＨ－１株」ともいう。）は、採取した空中落下菌から分離したものであり、１６Ｓ　ｒＤＮＡ系統解析によってＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓの標準株（ｓｔｒａｉｎ　Ｊ２９５６）との類似性が１００％であったことから、当該種であることが確認された。その他の微生物は、いずれもＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）より分譲された。
　培地は表１に示す組成のものを用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）としては表２に示す組成の１０×ＰＢＳ溶液を蒸留水で１０倍希釈して使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試験管に分注した５ｍｌのＴＳＢ培地に上記各菌株を１白金耳植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、これを前培養液とした。１００ｍｌのＴＳＢ培地を分注した５００ｍｌ容三角フラスコに、前培養液を１％植菌し、３０℃、６時間、１８０ｒｐｍで培養した。得られた培養液１ｍｌについて１１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って集菌した。集めた菌体にＰＢＳ１ｍｌを加え、１１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って洗浄した。
　洗浄した菌体の一定量をＰＢＳ９００μｌに懸濁し、懸濁液に０．７ｍｇ／ｍｌのＡＨＸのＰＢＳ溶液を１００μｌ加え、ＡＨＸ濃度７０μｇ／ｍｌの反応液を作製した。反応液を丸底スピッツに移し、３０℃で２４時間反応させた。所定時間経過後、反応液を遠心分離して菌体を分離し、上澄みを回収して９８℃で５分間加熱処理した。反応液上澄み中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの分析条件は、カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　Ｃ３０－ＵＧ－５（野村化学株式会社）、移動相：水＋０．０２％ＴＦＡ、温度：室温、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、波長：２５４ｎｍ、注入：２０μｌとした。ＡＨＸ及びＡＯＨの保持時間はそれぞれ２５．２分、２６．６分であった。結果を表３に示す。なお、本実施例のＨＰＬＣの分析条件では、不純物との分離が不十分である可能性があり、そのため、ＡＯＨ濃度は見かけ上実際より高く測定されている可能性がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　用いたいずれの細菌においても、ＡＨＸを基質としてＡＯＨを生成する能力があることが確認された。中でもＣＨ－１株、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍは、培地中のＡＨＸを全てＡＯＨに変換しており、１００％の変換効率を有していた。
（試験例２：ＡＯＨ生成活性の比較）
　ＣＨ－１株、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍの３種を用いて、反応開始６時間までのＡＯＨ生成活性を調べた。反応条件は、反応時間を所定時間とした以外は、上記試験例１と同様とした。所定時間に反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を試験例１と同様にＨＰＬＣで分析した。結果を図１（ＣＨ－１株）、図２（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）、図３（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）に示す。上記３種の中ではＣＨ－１株のＡＯＨ生成活性が最も高かった。
（試験例３：生成物による反応阻害の検討）
　ＣＨ－１株を用いて、反応液中のＡＨＸ初期濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、菌体濃度を試験例１の３倍量とした他は試験例１と同様の条件で９６時間の反応を行った。反応中、所定の時間に反応液中のＡＨＸ濃度及びＡＯＨ濃度を試験例１と同様にＨＰＬＣにより測定した。結果を図４に示す。また、ＡＨＸの濃度を同じく２ｍｇ／ｍｌとし、キサンチンオキシダーゼ（バターミルク由来、オリエンタル酵母社）０．５Ｕを用いて３０℃でＡＯＨの生成を行い、同様に反応液中のＡＨＸ濃度及びＡＯＨ濃度の測定を行った。結果を図５に示す。
　キサンチンオキシダーゼを用いた反応では、一定時間経過後にＡＨＸ濃度が一定量を保ったまま変化しなくなり、生成されたＡＯＨによる反応阻害が起きていることが示唆された（図５）。一方、ＣＨ－１株を用いた反応では、反応によって反応液中のＡＨＸ濃度が０ｍｇ／ｍｌとなり、使用した全てのＡＨＸがＡＯＨに変換されたことが示された（図４）。
（試験例４：ＡＯＨ分解反応評価）
　ＣＨ－１株を用いて、反応液中の菌体濃度を試験例１の２倍量とし、基質をＡＨＸの代わりにＡＯＨを用いた以外は試験例１と同様の方法で反応を行った。反応液中のＡＯＨの濃度を試験例１と同様にＨＰＬＣにより測定した。結果を図６に示す。ＡＯＨをＣＨ－１株とともに懸濁させても、ＡＯＨの濃度は減少しなかった。ＣＨ－１株のＡＯＨ分解活性は極めて弱いことが確認された。
（試験例５：ＡＯＨ収率評価）
　ＣＨ－１株を用いて、反応液中の菌体濃度を試験例１の３倍量とし、ＡＨＸの初期濃度及び反応温度を表４に示す条件とした以外は試験例１と同様の反応条件により、８時間の反応を行った。反応後、反応液を遠心分離して菌体を分離し、上澄みを得た。上澄みを９８℃で５分間加熱処理し、ロータリーエバポレーターで１／７の容積まで濃縮し、４℃で３日間放置して沈殿を形成させた。その後、沈殿を含む液をろ紙でろ過し、得られた生成物を乾燥させてＡＯＨを回収し、使用したＡＨＸ量に基づくＡＯＨの収率を算出した。初期のＡＨＸ使用量及び３０時間培養後のＡＯＨ収率を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＣＨ－１株等の微生物を用いる方法（微生物法）により、高効率でＡＯＨの生成を行うことができた。また、ＸＯＤを用いてＡＯＨ生成反応を行う方法（ＸＯＤ法）と比較すると、微生物法では、生成されたＡＯＨによる反応阻害が生じにくいことから、培地中の基質濃度を約６０倍に高めることが可能であった。結果、ＡＯＨの生成量当たりで比較すると、微生物法によって、使用する反応液量をＸＯＤ法の場合の約４５分の１に減らすことができ、それに伴い生成後の濃縮操作を約１４分の１に短縮することができた。また、微生物法では、ＸＯＤ法と比較して著しく低いコストでＡＯＨ生成を行うことができた。
（試験例６：各種微生物のＡＯＨ生成活性）
　下記表５に示す各種微生物及びＣＨ－１株を用いてＡＯＨ生成活性を調べた。各種微生物の種類に応じた方法で予め培養しておいた菌株を集菌し、一定量の菌体をＰＢＳに懸濁し、ＡＨＸ濃度が７０μｇ／ｍｌとなるようＡＨＸ溶液を添加し、４０℃で２４時間反応させた。所定時間経過後、反応液を遠心分離して菌体を分離し、上澄みを回収して９８℃で５分間加熱処理した。反応液上澄み中のＡＨＸ及びＡＯＨ濃度を試験例１と同様の方法で測定した。結果を表５に示す。いずれの微生物もＡＨＸからＡＯＨを生成する活性を有することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（試験例７：ＡＯＨ生成微生物の探索）
　森林土壌を採取し、薬さじ一すくい分を３ｍｌの生理食塩水に懸濁した。懸濁液を静置し、上清を希釈し、培地に塗抹した。培地としては、表６、７に示す組成のＴＳＢ培地又はＹＭ培地を５倍希釈したものを用いた。培地上に現れたコロニーをＴＳＡ培地にストリークし、各菌株を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　試験管に分注した５ｍＬのＴＳＢ培地に、上記各菌株を植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、これを前培養液とした。前培養液をＴＳＢ培地に１％植菌し、３０℃、８時間、１８０ｒｐｍで培養した。得られた培養液１ｍｌについて遠心分離を行って集菌した。
　集めた菌体をＰＢＳで洗浄した後、一定量の菌体をＰＢＳ９００ｍｌに懸濁した、懸濁液に０．７ｍｇ／ｍｌのＡＨＸのＰＢＳ溶液を１００μｌ加え、ＡＨＸ濃度７０μｇ／ｍｌの反応液を作製した。反応液を丸底スピッツに移し、３０℃で５時間反応させた。所定時間経過後、反応液を遠心分離して菌体を分離し、上澄みを回収して９８℃で５分間処理した。反応液上澄み中のＡＨＸ濃度を試験例１と同様の方法によりＨＰＬＣで分析し、ＡＨＸ残存率を算出した。結果を表８に示す。森林土壌から分離された１９２株の内、少なくともＣＨ－１株と同程度以上のＡＯＨ生成活性を示す株が１１株得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ＡＨＸ残存率が低い１１株の内、１０株について１６Ｓ　ｒＤＮＡ系統解析を行った。解析により、それぞれの菌株は表９に示す標準株と同種であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（試験例８）
　上記１０菌株及びＣＨ－１株を用いて、反応時間を２．５時間とした他は試験例７と同様の条件でＡＨＸとの反応を行った。反応液上澄み中のＡＨＸ濃度を試験例１と同様の方法によりＨＰＬＣで分析した。結果を表１０に示す。いずれの菌株もＣＨ－１株よりもＡＯＨ生成活性が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（試験例９）
　試験例８で用いた菌株の内、ＡＯＨ生成活性の高かった７株について、反応時間を０．５時間又は１時間とした他は試験例７と同様の条件でＡＨＸとの反応を行った。反応液上澄み中のＡＨＸ濃度を試験例１と同様の方法によりＨＰＬＣで分析した。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（試験例１０）
　試験例９で用いた菌株の内、さらにＡＯＨ生成活性の高かった４菌株について、反応液中のＡＨＸ濃度を２ｍｇ／ｍｌとし、反応時間を１時間、２時間又は４時間とした他は、試験例７と同様の条件でＡＨＸとの反応を行った。試験例１と同様の方法によりＨＰＬＣで反応液中のＡＨＸ及びＡＯＨの濃度を測定した。結果を表１２及び図７、８、９、１０、１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（試験例１１）
　Ａ１１１株について、以下のとおり反応液容量を大きくしてＡＨＸとの反応実験を行った。表１３に示すとおり、反応液量を３．２ｌ、３．４ｌ又は６．０ｌとし、反応液中のＡＨＸ濃度を４ｇ／ｌ又は５ｇ／ｌ、反応時間を２４時間とした他は、試験例７と同様の条件でＡ１１１株とＡＨＸとの反応を行った。反応後、得られたＡＯＨを結晶化して回収し、定量した。初期のＡＨＸ使用量及び回収されたＡＯＨ量に基づいて、ＡＯＨ収率を算出した。結果を表１３に示す。また、表１３中のＮｏ．３について、所定時間に反応液中のＡＨＸ濃度を測定し、ＡＨＸ残存率を算出した。結果を図１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　反応液容量が大きい場合にも、微生物法により高効率でＡＯＨを生成させることができた。

Claims (3)

  1. 　２－アザ－８オキソヒポキサンチンの製造方法であって、
    　２－アザヒポキサンチンと微生物とを反応させ、それにより２－アザ－８オキソヒポキサンチンを生成させる工程と、
    　反応液から２－アザ－８オキソヒポキサンチンを単離する工程と、
    を含む、方法。
  2. 　微生物が、バークホリデリア属細菌、ブティアウクセラ属細菌、シュウドモナス属細菌、大腸菌、バチルス属細菌、サッカロマイセス属菌、クリベロマイセス属菌、キャンディダ属菌、チゾサッカロマイセス属菌、ピチア属菌、アスペルギルス属菌及びトリコデルマ属菌からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
  3. 　微生物が、バークホリデリア・コンタミナンス、バークホリデリア・セパシア、バークホリデリア・フンゴルム、ブティアウクセラ・ガビニアエ、ブティアウクセラ・アグレスチス、シュウドモナス・プチダ、シュウドモナス・シンキサンタ、シュウドモナス・バンコウベレンシス、シュウドモナス・ジェスセニィ及びシュウドモナス・プレコグロスシシダからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
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