[go: up one dir, main page]

WO2016125236A1 - 多色蛍光分析装置 - Google Patents

多色蛍光分析装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2016125236A1
WO2016125236A1 PCT/JP2015/052852 JP2015052852W WO2016125236A1 WO 2016125236 A1 WO2016125236 A1 WO 2016125236A1 JP 2015052852 W JP2015052852 W JP 2015052852W WO 2016125236 A1 WO2016125236 A1 WO 2016125236A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
filter
dielectric multilayer
wavelength band
multilayer interference
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/052852
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
加藤　宏一
庄司　智広
高橋　智
彰 前川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi High Tech Corp
Original Assignee
Hitachi High Technologies Corp
Hitachi High Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi High Technologies Corp, Hitachi High Tech Corp filed Critical Hitachi High Technologies Corp
Priority to US15/545,422 priority Critical patent/US10908083B2/en
Priority to PCT/JP2015/052852 priority patent/WO2016125236A1/ja
Priority to DE112015005747.1T priority patent/DE112015005747B4/de
Priority to JP2016572964A priority patent/JP6351766B2/ja
Priority to GB1710394.6A priority patent/GB2548763B/en
Priority to CN201580073959.0A priority patent/CN107209120B/zh
Publication of WO2016125236A1 publication Critical patent/WO2016125236A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G01N21/6454—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates using an integrated detector array
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6463—Optics
    • G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6484—Optical fibres

Definitions

  • the present invention relates to a multicolor fluorescence analyzer.
  • the analyzer includes an exchangeable interference filter for separating excitation light and extracting only fluorescence of a specific wavelength, and the fluorescence transmitted through the interference filter is arranged so as to correspond to each sample.
  • the light is guided by a large number of optical fibers, and analysis is performed using an image sensor attached to the other end of these optical fibers.
  • a fiber optic plate in which a large number of optical fibers are bundled is used as a means for guiding fluorescence, and the fluorescence transmitted by the bundled optical fibers is collectively collected as a two-dimensional image by an image sensor. Since it is processed to determine the presence or absence of fluorescence, it is possible to simultaneously perform fluorescence analysis on a large number of samples.
  • the present invention has been made based on the above circumstances, and its purpose is to provide multicolor fluorescence that can accurately detect fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes contained in a sample.
  • An analyzer is provided.
  • the present invention (1) A multicolor fluorescence analyzer that detects fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths included in a sample by irradiation with excitation light, An irradiation unit that irradiates the sample with excitation light having a plurality of excitation wavelength bands different from each other; At least a part of the sample abuts, and receives and guides light including fluorescence emitted from the sample by irradiation of the excitation light from the first incident portion, and on the side opposite to the first incident portion.
  • a first fiber optic plate that emits the light from a first exit section;
  • a second fiber optic that receives and guides the light emitted from the first emitting portion from the second incident portion and emits the light from the second emitting portion opposite to the second incident portion.
  • Plates A single dielectric multilayer interference filter that is provided on an end face of the second emission part and transmits at least part of the fluorescence and transmits light in a plurality of transmission wavelength bands not including the excitation wavelength band;
  • a multicolor fluorescence analyzer comprising: a two-dimensional detection unit that is provided so as to be in close contact with the dielectric multilayer interference filter and detects light transmitted through the dielectric multilayer interference filter; (2)
  • the dielectric multilayer interference filter according to (1) is a first dielectric multilayer interference filter, and the irradiation unit has a predetermined excitation wavelength band among a light source and light emitted from the light source.
  • the multicolor fluorescence analyzer according to (1) further including a second dielectric multilayer interference filter that selectively transmits the excitation light having (3) a rising wavelength ( ⁇ 1i ) satisfying a relationship in which the light transmittance ( ⁇ 1 ) in the transmission wavelength band of the first dielectric multilayer interference filter is smaller than a predetermined value ( ⁇ ), and the second dielectric
  • the falling wavelength ( ⁇ 2j ) satisfying the relationship in which the light transmittance ( ⁇ 2 ) in the transmission wavelength band of the multilayer interference filter is smaller than the predetermined value ( ⁇ ) is represented by the following formula (1):
  • the multicolor fluorescence analyzer according to (2) wherein (In formula (1), each of i and k is an integer equal to or greater than 1.
  • ⁇ max is the maximum incident angle of light incident on the first dielectric multilayer interference filter.
  • N eff is the first This is the effective refractive index of the dielectric multilayer interference filter.
  • the outer diameter of the optical fiber constituting the second fiber optic plate is smaller than the outer diameter of the optical fiber constituting the first fiber optic plate, according to any one of (1) to (6) Multicolor fluorescence analyzer, (8) The multicolor fluorescence analyzer according to any one of (3) to (7), wherein excitation light in each excitation wavelength band is sequentially irradiated. (9) The multicolor fluorescence analyzer according to any one of (3) to (7), wherein excitation light having at least two excitation wavelength bands is irradiated simultaneously. (10) The multicolor fluorescence analyzer according to any one of (1) to (7), wherein the sample is a DNA fragment containing a fluorescent dye, and is used for analysis of a base sequence of the DNA fragment.
  • the second dielectric multilayer interference filter has a first filter, a second filter, a third filter, and a fourth filter,
  • the transmittance of the first filter is 85% or more in the wavelength band of 380 to 396 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 380 to 396 nm;
  • the transmittance of the second filter is 85% or more in the wavelength band of 474 to 497 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 474 to 497 nm;
  • the transmittance of the third filter is 85% or more in the wavelength band of 561 to 575 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 561 to 575 nm;
  • the transmittance of the fourth filter is 85% or more in the wavelength band of 641 to 657 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the
  • the transmittance of the first dielectric multilayer interference filter is 85% or more in the wavelength bands of 436 to 462 nm, 536 to 548 nm, 620 to 632 nm, and 713 to 800 nm, and is 0 in the wavelength band other than the above wavelength bands
  • the multicolor fluorescence analyzer according to (12) or (13), which is less than 1%, and (15) the surface of the first fiber optic plate on the side where the sample abuts on the end face of the core of the optical fiber The multicolor fluorescence analyzer according to any one of (10) to (14), wherein an aminosilane treatment is performed and a surface other than the end face of the core portion of the optical fiber is subjected to a HMDS treatment.
  • a fiber optic plate (hereinafter also referred to as “FOP”) means that a large number of optical fibers are integrally bundled so that both ends in the axial direction of the optical fiber have a planar shape. Means a device capable of guiding light incident from one end of the optical fiber to the other end of the optical fiber.
  • This fiber optic plate is a concept including a fiber optic taper (hereinafter also referred to as “FOT”).
  • the present invention can provide a multicolor fluorescence analyzer that can accurately detect fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes contained in a sample. Therefore, the multicolor fluorescence analyzer can be suitably used, for example, for DNA base sequence analysis using the SBS method in which a plurality of fluorescent dyes are used simultaneously.
  • FIG. 3A and 3B are schematic views showing the fluorescence detection means of FIG. 2, wherein FIG. 3A shows a state before the flow chip is mounted, and FIG. FIGS. 3A and 3B are schematic views illustrating a propagation state of fluorescence in the fluorescence detection unit of FIG. 2, where FIG.
  • FIG. 3A is a propagation state in first and second fiber optic plates
  • FIG. 3B is a view in first and second optical fibers. Each propagation state is shown.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the relationship between fluorescence and excitation light with the incident angle of fluorescence on the first fiber optic plate as a parameter in the fluorescence detection means of FIG. 2, (a) is a state where the incident angle is 0 °; (B) shows the state when the incident angle changes, (c) shows the state where the incident angle is 30 °, and (d) shows the state where the incident angle is 0 ° and short wavelength shift is taken into consideration. It is the schematic which actualizes and shows one form of the irradiation part in the fluorescence detection means of FIG. FIG.
  • FIG. 8 is a schematic transmission characteristic diagram of each filter in the irradiation section of the fluorescence detection means of FIG. 7, where (a) is the transmittance of the first filter, (b) is the transmittance of the second filter, and (c) is the third filter. (D) shows the transmittance of the fourth filter, and (e) shows the transmittance of the first dielectric multilayer interference filter.
  • FIG. 10 is a schematic spectral characteristic diagram of the fluorescence detection means of FIG. 9, wherein (a) is a characteristic that does not consider a short wavelength shift in the first and second dielectric multilayer interference filters, and (b) is the first and second characteristics.
  • FIG. 3 is a schematic characteristic diagram of a two-dimensional detection unit in the fluorescence detection unit of FIG. 2, where (a) is a fluorescence spectrum transmitted through a first dielectric multilayer interference filter, and (b) is a diagram of each sensor in the two-dimensional detection unit. Each wavelength characteristic is shown. It is the schematic which shows the other form of the two-dimensional detection part in the fluorescence detection means of FIG.
  • FIG. 13 is a schematic characteristic diagram of the two-dimensional detection unit in the fluorescence detection unit of FIG.
  • FIG. 15 is a schematic view showing one form which used the irradiation part of the fluorescence detection means of FIG. 15 as oblique illumination.
  • FIG. 5 is a schematic view showing another form of the first and second fiber optic plates in the fluorescence detection means of FIG. 2, wherein (a) is a cross-sectional view of the first and second fiber optic plates, and (b) is a first view. Cutaway perspective views of the first and second optical fibers are shown, respectively.
  • It is the schematic which shows the form which provided the optical partition between the 1st dielectric multilayer interference filter and the two-dimensional photosensor in the fluorescence detection means of FIG.
  • the multicolor fluorescence analyzer of the present invention is a multicolor fluorescence analyzer that detects fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths contained in a sample by irradiation with excitation light, An irradiation unit that irradiates the sample with excitation light having a plurality of excitation wavelength bands different from each other; At least a part of the sample abuts, and receives and guides light including fluorescence emitted from the sample by irradiation of the excitation light from the first incident portion, and on the side opposite to the first incident portion.
  • a first fiber optic plate that emits the light from a first exit section;
  • a second fiber optic that receives and guides the light emitted from the first emitting portion from the second incident portion and emits the light from the second emitting portion opposite to the second incident portion.
  • Plates A single dielectric multilayer interference filter that is provided on an end face of the second emission part and transmits at least part of the fluorescence and transmits light in a plurality of transmission wavelength bands not including the excitation wavelength band; , And a two-dimensional detection unit that detects light transmitted through the dielectric multilayer interference filter, and is provided so as to be in close contact with the dielectric multilayer interference filter.
  • the multicolor fluorescence analysis apparatus includes the irradiation unit, the first and second fiber optic plates, the dielectric multilayer interference filter, and the two-dimensional detection unit. Fluorescence emitted from a plurality of fluorescent dyes can be accurately detected collectively. As described later, this can suppress the overlapping of the wavelength band of excitation light and the wavelength band of fluorescence used for detection, and as a result, the analysis accuracy can be improved by spectroscopically analyzing only fluorescence. It is guessed that.
  • the multicolor fluorescence analyzer of the present invention is used as an analyzer for detecting fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths included in a sample as described above, and the sample to be analyzed is the above-mentioned requirement
  • the sample is preferably a DNA fragment containing a fluorescent dye, and used for analysis of the base sequence of the DNA fragment.
  • four types of nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) labeled with a fluorescent dye can be quickly and accurately identified, and the DNA base sequence can be efficiently decoded.
  • the sample is a DNA fragment containing a fluorescent dye
  • a multicolor fluorescence analyzer hereinafter also referred to as “DNA sequencer”
  • DNA sequencer used for analyzing the base sequence of the DNA fragment using the SBS reaction method.
  • the first fiber optic plate is used as a substrate for a flow chip.
  • a single dielectric multilayer interference filter provided on the end face of the second emission part is referred to as a first dielectric multilayer interference filter.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of the multicolor fluorescence analyzer of the present invention.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 is roughly composed of a reagent storage means 10, a liquid feeding means 20, a waste liquid storage means 30, and a fluorescence detection means 40.
  • the reagent storage means 10 is a means for storing reagents used in the DNA sequencer.
  • the reagent storage means 10 includes a reagent cartridge 101, and each of the reagent cartridge 101 contains a primer reagent, a polymerase enzyme, an extension reagent containing nucleotides having four types of fluorescent dyes, a protecting group cleavage reagent, a washing reagent, an imaging reagent, and the like.
  • a plurality of reagent storage containers 102 to be stored separately are stored.
  • the liquid feeding means 20 is a means for supplying a reagent or the like into a flow chip 42 (to be described later) and feeding the reagent discharged from the flow chip 42 to a waste liquid storage means 30 (to be described later).
  • the liquid feeding means 20 includes a switching valve 201 that selectively switches a reagent to be supplied to the flow chip 42 from among the plurality of reagent storage containers 102, a flow path 202 for feeding the reagent or the like to the flow chip 42, and the flow chip 42. And a flow path 203 for feeding the reagent discharged from the waste liquid storage means 30 to the waste liquid storage means 30.
  • the flow path 203 is provided with a syringe 204 and two two-way valves 205 and 206, which are used to supply a reagent and the like to the flow chip 42 and discharge the reagent and the like from the flow chip 42.
  • the waste liquid storage means 30 is a means for storing waste liquid such as reagents discharged from the flow chip 42.
  • the waste liquid storage means 30 includes a waste liquid tank 301 that receives the waste liquid discharged from the end of the flow path 203 of the liquid feeding means 20, and a liquid receiving tray 302 that serves as a tray when the waste liquid leaks from the waste liquid tank 301. And a lid 303 for preventing the waste liquid from evaporating, and a micro photo sensor 304 for monitoring the presence or absence of the waste liquid tank 301.
  • the fluorescence detection means 40 includes an irradiation unit 41, a flow chip 42, and a fluorescence detection unit 43.
  • the irradiation unit 41 irradiates the sample s with excitation light having a plurality of mutually different excitation wavelength bands. As shown in FIG. 2A, the irradiation unit 41 includes a light source 411, a parabolic mirror 412, a first fly-eye lens 413, a second fly-eye lens 414, a tatami mat lens 415, and a field lens. 416 and a second dielectric multilayer interference filter 417.
  • the light source 411 is an excitation light source. This light source 411 emits light used to generate excitation light. As the light source 411, a xenon short arc lamp is usually used. Since this xenon short arc lamp has a good continuous spectrum in the visible light region due to discharge in xenon gas, it is a discharge lamp suitable as a light source for generating light in a plurality of excitation wavelength bands.
  • the parabolic mirror 412 reflects the light emitted from the light source 411 and converts it into parallel light.
  • the first fly-eye lens 413, the second fly-eye lens 414, the tatami mat lens 415, and the field lens 416 cooperate to convert the parallel light converted by the parabolic mirror 412 into parallel light having uniformity.
  • the tatami-fold lens 415 overlaps the image of each lens cell of the first fly-eye lens 413 on the field lens 416, and superimposes the illuminance distribution of each lens cell of the first fly-eye lens 413 to thereby adjust the illuminance. Uniformity is achieved.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 selectively transmits excitation light having a predetermined excitation wavelength band from the light emitted from the light source 411.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 includes a glass substrate (not shown) that is transparent to visible light and a dielectric multilayer film (not shown) formed on the glass substrate. It is configured.
  • the material constituting the dielectric multilayer film examples include SiO 2 , TiO 2 , Ta 2 O 5 , Nb 2 O 5 and the like.
  • the dielectric multilayer film is formed by selecting a high refractive index material and a low refractive index material from the above materials and alternately laminating about 10 to 40 layers thereof.
  • the thickness of each layer is appropriately determined based on a desired wavelength band that transmits the dielectric multilayer interference filter 417.
  • the total thickness of the dielectric multilayer film is usually about 10 ⁇ m.
  • a vacuum deposition method As a method for forming the dielectric multilayer film, a vacuum deposition method, an ion assist method, an ion plating method, a sputtering method and an ion assisted ion beam sputtering method are preferable, and a vacuum deposition method is more preferable.
  • excellent optical characteristics such as good stability with respect to temperature and humidity and a steep rise characteristic can be imparted.
  • the wavelength range of the excitation wavelength band can be distinguished from that of a conventionally used dye filter, which will be described later.
  • the first dielectric multilayer interference filter can reliably block the excitation light and improve the fluorescence detection accuracy in the two-dimensional detection unit.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 described above is used to sequentially irradiate the sample s with excitation light in each excitation wavelength band.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 includes a first filter 417a, a second filter 417b, a third filter 417c, and a fourth filter 417d.
  • the fourth filters 417a to 417d are sequentially switched and used, and selectively transmit light in a predetermined excitation wavelength band, whereby the transmitted light can be irradiated to the sample s as excitation light.
  • the first to fourth filters 417a to 417d constituting the second dielectric multilayer interference filter 417 are attached to a filter wheel 418, and the filter wheel 418 is fast (for example, using a driving device not shown). , So that it can move to a different filter within 50 ms.
  • the fluorescence emitted from each fluorescent dye can be reliably identified by sequentially irradiating the excitation light in each excitation wavelength band.
  • Fluorescent dyes suitably used in the base sequence analysis of this embodiment are Alexa405, FAM, Texas Red, and Cy5.5.
  • Alexa405 binds to dCTP
  • FAM binds to dATP
  • Texas Red binds to dGTP
  • Cy5.5 binds to dTTP. Therefore, by irradiating excitation light that can excite the fluorescent dye, the corresponding fluorescence is emitted from the nucleotide to which the fluorescent dye is bound (hereinafter also referred to as “fluorescent nucleotide”). Is deciphered.
  • fluorescent nucleotide to which the fluorescent dye is bound
  • the transmittance of the first filter 417a is 85% or more in the wavelength band of 380 to 396 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 380 to 396 nm.
  • the transmittance of the second filter 417b is 85% or more in the wavelength band of 474 to 497 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 474 to 497 nm
  • the transmittance of the third filter 417c is 85% or more in the wavelength band of 561 to 575 nm and less than 0.1% in the wavelength band other than the wavelength band of 561 to 575 nm
  • the transmittance of the fourth filter 417d is 85% or more in the wavelength band of 641 to 657 nm. And less than 0.1% in a wavelength band other than the wavelength band of 641 to 657 nm.
  • FIGS. 8A to 8D reference numerals 601 to 604 denote transmission wavelength bands of the first to fourth filters 417a to 417d, respectively.
  • FIG. 8E shows a transmission wavelength band 605 of a first dielectric multilayer interference filter 432 (described later) when the first to fourth filters 417a to 417d are used.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 includes the first to fourth filters 417a to 417d, and the transmittance of each filter satisfies the above requirements. It can be excited and detected efficiently.
  • excitation light having at least two excitation wavelength bands is irradiated simultaneously.
  • the several fluorescent dye corresponding to the said excitation wavelength range can be excited simultaneously efficiently, and a fluorescence analysis can be performed rapidly.
  • the fluorescent dyes used are Alexa 405, FAM, Texas Red, and Cy 5.5
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 is a single filter, and FIGS.
  • the transmittance of the second dielectric multilayer interference filter 417 is 85% or more in the wavelength bands of 380 to 396 nm, 474 to 497 nm, 561 to 575 nm, and 641 to 657 nm, and the above wavelength band In other wavelength bands, it is preferably less than 0.1%.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 is a single filter, and the second dielectric multilayer interference filter 417 transmits the plurality of wavelength bands. The dye can be excited more efficiently at the same time, and the fluorescence analysis can be performed more quickly.
  • FIG. 3 is a schematic perspective view of the flow chip of FIG. As illustrated in FIG. 3, the flow chip 42 includes a cover glass 421, a spacer 422, and a substrate 423.
  • the cover glass 421 is light transmissive and transmits visible light having a wavelength of not less than 400 nm and not more than 800 nm.
  • Examples of the material of the cover glass 421 include glass, quartz, and sapphire.
  • the cover glass 421 has an inlet 421a for injecting a liquid such as a reagent into a flow path in the flow chip 42 and an outlet 421b for discharging a used liquid.
  • the spacer 422 is formed with a punched hole 422a leaving a frame-shaped peripheral edge.
  • the spacer 422 is sandwiched between the cover glass 421 and a substrate 423 (to be described later), and together with these, forms a flow path for supplying the liquid to the sample s.
  • the spacer 422 is usually formed using polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the thickness of the spacer 422 is usually 30 to 100 ⁇ m, preferably 40 to 60 ⁇ m, more preferably 45 to 55 ⁇ m, from the viewpoint of smoothly flowing a liquid such as a reagent.
  • the substrate 423 fixes a DNA fragment to be the sample s.
  • the substrate 423 is configured by a first fiber optic plate 424. As shown in FIG. 5A, the first fiber optic plate 424 is in contact with at least a part of the sample s, and receives the first incident light including the fluorescence emitted from the sample s by the irradiation of the excitation light. The light is received from the portion 425a and guided, and the light is emitted from the first emitting portion 425b opposite to the first incident portion 425a.
  • the first fiber optic plate 424 includes a large number of optical fibers (hereinafter also referred to as “first optical fibers 425”) arranged in a lattice shape for guiding light, and the first optical fibers 425. It is comprised from the absorber glass (not shown) which covers the light which leaks from the said 1st optical fiber 425 concerned. As shown in FIG. 5B, the first optical fiber 425 includes a core portion 426 and a clad portion 427 that covers the core portion 426. The core portion 426 and the clad portion 427 are formed of core glass and clad glass, respectively, and these glasses have different refractive indexes.
  • the refractive index of the glass constituting the core portion 426 and the clad portion 427 can be appropriately selected. Therefore, by appropriately selecting the refractive index of the glass constituting the core portion 426 and the clad portion 427, total reflection can be caused at the interface between the two, and the light received from the first incident portion 425a is the first The light can be guided in the optical axis direction of the optical fiber 425 and guided to the first emitting portion 425b (see FIG. 5A).
  • each optical fiber 425 is subjected to aminosilane treatment on the end surface of the core portion 426 of the first optical fiber 425 on the surface of the first fiber optic plate 424 on the side where the sample s comes into contact.
  • a surface other than the end surface of the core portion 426 is subjected to HMDS treatment (hexamethyldisilazane treatment).
  • Adsorption of the DNA fragment on the membrane made of can be suppressed, and the DNA fragment can be selectively fixed on the end face of the core part 426.
  • the fluorescence emitted from the DNA fragment can be reliably taken in through the end face of the core part 426.
  • the method as described in US Patent application publication 2009/0270273 is applicable, for example.
  • the diameter of the first optical fiber 425 (the outer diameter of the cladding portion 427) is about 1.4 ⁇ m, and the diameter of the spot portion is about 0.3 ⁇ m. Therefore, by setting the DNA fragment to be the sample s to an appropriate size, one DNA fragment can be arranged on the end surface of the core portion 426 of one first optical fiber 425, and one DNA fragment ( The sample s) can be associated with one first optical fiber 425.
  • the refractive indexes of the core glass and the clad glass used in this embodiment are 1.80 and 1.67, respectively. Therefore, the numerical aperture (Numerical Aperture), which is generally an index of the light collecting ability of a single fiber, can be calculated as 0.67 using the following equation (2).
  • NA is the numerical aperture.
  • n 2 and n 3 are the refractive indexes of the core glass and the clad glass, respectively.
  • the refractive index (n 1 ) of an aqueous solution such as a reagent used in the present embodiment is 1.33. Therefore, the maximum incident angle of light at the first incident portion 425a is calculated as 30 ° using the following formula (3).
  • ⁇ max is the maximum incident angle.
  • NA is synonymous with the said Formula (2).
  • the incident angle ( ⁇ 1 ) in order to guide the light incident on the first optical fiber 425 while totally reflecting the light and reach the first emission part 425b, the incident angle ( ⁇ 1 ) (see FIG. 5B) needs to satisfy the requirement of ⁇ 1 ⁇ 30 °.
  • a light beam having an incident angle ( ⁇ 1 ) of ⁇ 1 > 30 ° at the first incident portion 425a exceeds 30 ° which is the maximum incident angle ( ⁇ max ), and therefore the core portion 426 and the cladding portion 427 Cannot be totally reflected at the interface, and is absorbed by the absorber glass through the cladding portion 427 and cannot reach the first emission portion 425b.
  • the fluorescence detection unit 43 includes a second fiber optic plate 431, a first dielectric multilayer interference filter 432, and a two-dimensional detection unit 433.
  • the second fiber optic plate 431 receives and guides the light emitted from the first emitting portion 425b from the second incident portion 434a, and the second emitting portion 434b opposite to the second incident portion 434a. The above light is emitted from (see FIG. 5A). Similar to the first fiber optic plate 424, the second fiber optic plate 431 includes an optical fiber including a core portion 435 and a clad portion 436 (hereinafter also referred to as “second optical fiber 434”), and an absorber. And glass (not shown). Further, as shown in FIG. 5A, the outer diameters of the first and second optical fibers 425 and 434 are the same, and the optical axes of the first and second optical fibers 425 and 434 coincide.
  • first emitting portion 425b and the second incident portion 434a are arranged so as to contact or be close to each other.
  • the proximity means that the light emitted from the first light emitting portion 425b is received by the second light incident portion 434a without leaking, and the first light emitting portion 425b and the second light incident portion 434a are within the range. It means a state of being separated.
  • the second fiber optic plate 431 is a pedestal on which the flow chip 42 is placed.
  • the outer diameters of the first and second optical fibers 425 and 434 are the same, but the optical fiber (second optical fiber) constituting the second fiber optic plate 431 is used. It is also preferable that the outer diameter of 434) is smaller than the outer diameter of the optical fiber (first optical fiber 425) constituting the first fiber optic plate 424. Thereby, it can suppress that the light radiate
  • the diameter of the core portion 426 of the first optical fiber 425 is secondly smaller than the diameter of the core portion 435 of the optical fiber 434. Therefore, the light emitted from the core portion 426 of the first optical fiber 425 in the first emission portion 425a is reliably transmitted into the core portion 435 of the second optical fiber 434 in the second incidence portion 434a. And fluorescence detection can be performed more accurately.
  • FIG. 14 is a schematic view of a fiber optic taper employed as the second fiber optic plate in the fluorescence detection means of FIG.
  • the FOT 437 is a bundle of second optical fibers having different sizes of the second incident part and the second emission part, and enlarges or reduces the image of the second incident part. can do.
  • the magnification of the image is simply the ratio of the diameters of both end faces of one second optical fiber. This ratio is usually about 5 times maximum.
  • the FOT has the same number of second optical fibers, although the size of the second incident part and the second emission part are different.
  • FOT heats the central part of a cylindrical FOP and applies forces in opposite directions to both ends of the FOP to roll the central part of the FOP.
  • the cut surface is polished to form one side of the FOT, whereby FOT having different sizes of the two surfaces can be manufactured.
  • the shape of the optical fiber of the FOT can be freely changed, for example, from circular to circular, from circular to square, from square to square, or from square to rectangular by controlling the rolling.
  • an imaging surface having a large aperture such as an image intensifier (light amplification optical device) is a CMOS having a small imaging surface. It is used when coupling directly to each element of the image sensor. As a result, a bright image can be transmitted to the image sensor without reducing the combined resolving power.
  • the cross-sectional area of the second optical fiber gradually increases toward the second emitting portion (see FIG. 14)
  • the incident light enters the first dielectric multilayer interference filter according to the repetition of total light reflection. The corner becomes smaller.
  • short wavelength shift the shift to the short wavelength side of the transmission spectral characteristic accompanying the incident angle to the first dielectric multilayer interference filter (hereinafter also referred to as “short wavelength shift”) can be reduced, and the second incident The transmission wavelength band of the first dielectric multilayer interference filter can be expanded as compared with the case where the portion and the second emitting portion have the same cross-sectional area.
  • the first dielectric multilayer interference filter 432 is provided on the end face of the second emission part 434b, and transmits light in a plurality of transmission wavelength bands that transmits at least part of the fluorescence and does not include the excitation wavelength band. It is a single filter. Similar to the second dielectric multilayer interference filter 417 described above, the first dielectric multilayer interference filter 432 is formed on a glass substrate (not shown) that is transparent to visible light and on this glass substrate. And a dielectric multilayer film (not shown). However, the film thickness and the number of layers constituting the dielectric multilayer film are appropriately determined so as to block excitation light and transmit light in a desired wavelength band (part or all of fluorescence). Thereby, it is possible to more accurately detect fluorescence while suppressing noise derived from excitation light.
  • the incident angle to each filter is 0 ⁇ 5 ° with respect to the normal filter surface. It is required as a specification. This is because when the incident angle to the filter increases, the wavelength band transmitted through the filter shifts to the short wavelength side. This phenomenon can be expressed by a mathematical formula represented by the following formula (4).
  • ⁇ is an incident angle.
  • n eff is an effective refractive index and is a value specific to each filter.
  • ⁇ 0 is the wavelength when the light beam is incident at an incident angle of 0 °.
  • ⁇ ( ⁇ ) / ⁇ 0 is a ratio of a short wavelength shift that occurs when the incident angle of a light beam incident on the filter is ⁇ .
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the relationship between fluorescence and excitation light using the incident angle of fluorescence on the first fiber optic plate as a parameter in the fluorescence detection means of FIG. This figure shows the relationship when Cy3 is used as the fluorescent dye. Note that the characteristic represented by reference numeral 503 indicates the fluorescence spectrum of Cy3.
  • the first dielectric multilayer interference filter 432 since the light incident on the first optical fiber 425 is totally reflected and propagated in the core portions 426 and 435, the first dielectric multilayer interference filter 432 has a maximum incident angle of 30 °. It is necessary to make it incident.
  • the transmission wavelength band is shifted to a shorter wavelength side than light having an incident angle of 0 ° (for example, the transmission wavelength band 502 at an incident angle of 0 ° has an incident angle of 30 It shifts to the transmission wavelength band 504 at °, and to the transmission wavelength band 505 at an incident angle of 40 °).
  • the first dielectric multilayer interference filter 432 having the transmission wavelength band 502 at the incident angle of 0 ° is used, as shown in FIG.
  • the relationship between the two dielectric multilayer interference filters 432 and 417 is that the light transmittance ( ⁇ 1 ) in the transmission wavelength band of the first dielectric multilayer interference filter 432 is smaller than a predetermined value ( ⁇ ).
  • 2j ) preferably satisfies the relationship represented by the above formula (1).
  • i and k are each an integer of 1 or more.
  • ⁇ max is the maximum incident angle of light incident on the first dielectric multilayer interference filter.
  • n eff is the effective refractive index of the first dielectric multilayer interference filter.
  • the transmission wavelength bands of the first and second dielectric multilayer interference filters 432 and 417 satisfy the above relationship, thereby preventing the two transmission wavelength bands from overlapping even if a short wavelength shift occurs. And fluorescence and excitation light can be reliably distinguished.
  • the predetermined value ( ⁇ ) is preferably 0.1%.
  • the first dielectric multilayer interference filter 432 The rising wavelength of the transmission wavelength band at an incident angle of 0 ° is 600 nm (see reference numeral 506), and the falling wavelength of the transmission wavelength band of excitation light in the second dielectric multilayer interference filter 417 is 560 nm. Can be mentioned.
  • the falling wavelength ( ⁇ 2j ) of the transmission wavelength band of the excitation light is set to 560 nm, the rising wavelength satisfies the relationship of the above formula (1), and therefore, a short wavelength shift occurs.
  • the transmission wavelength bands of the first and second dielectric multilayer interference filters 432 and 417 do not overlap, and the OD (Optical Density) is maintained at 6 or more by blocking the excitation light, so that it is surely weak. Fluorescence can be detected.
  • the effective refractive index (n eff ) of the first dielectric multilayer interference filter 432 is 1.5 has been described.
  • the first dielectric The effective refractive index (n eff ) of the multilayer multilayer interference filter 432 is preferably 1.5 or more and 2.2 or less.
  • the effective refractive index is preferably 1.7 or more and 2.2 or less, more preferably 2.0 or more and 2.2 or less, from the viewpoint of reducing the short wavelength shift.
  • the maximum incident angle ( ⁇ max ) of light incident on the first dielectric multilayer interference filter 432 is preferably 30 °.
  • the maximum incident angle in the first dielectric multilayer interference filter 432 is set to the above value from the viewpoint of suppressing loss of guided light, as in the analysis of the base sequence of the DNA fragment of the present embodiment, the first incident portion 425a is an aqueous solution or a pure solution. It is more effective for analysis that comes into contact with liquids containing water such as water.
  • the maximum incident angle is more preferably 20 °, further preferably 10 °.
  • the fluorescent dyes used for the fluorescence analysis are Alexa405, FAM, Texas Red, and Cy5.5
  • the transmittance of the second dielectric multilayer interference filter 417 is 380 to 396 nm, 474 to 497 nm, 561 to 575 nm, and 641.
  • the transmittance of the first dielectric multilayer interference filter 432 is as shown in FIG. It is preferably 85% or more in the wavelength bands of 436 to 462 nm, 536 to 548 nm, 620 to 632 nm, and 713 to 800 nm, and less than 0.1% in the wavelength bands other than the above wavelength bands.
  • Such a preferred configuration is such that the maximum absorption and maximum fluorescence wavelengths of Alexa405, FAM, Texas Red and Cy5.5 are 401 nm, 421 nm for Alexa405, 494 nm, 518 nm for FAM, 596 nm, 615 nm for Texas Red, Cy5, respectively. .5 for 675 nm and 694 nm (refer to reference numerals 704 to 707 in FIG. 10C for the fluorescence wavelength) and the maximum incident angle to the first dielectric multilayer interference filter 432 is 30 °
  • the rising wavelength of the transmission wavelength band 702 of the first dielectric multilayer interference filter shown in FIG. 10A is moved to the long wavelength side by 0.06 wavelengths (0.06 ⁇ 0 ) (see reference numeral 703). It is based on what was made to do.
  • the transmittance of the first dielectric multilayer interference filter 432 to the wavelength band, when the fluorescent dye and the second dielectric multilayer interference filter 417 are used, for example, incident light is transmitted. Even when incident on the first dielectric multilayer interference filter 432 with a maximum incident angle of 30 ° (when a short wavelength shift occurs), the excitation light can be reliably blocked by the optical density of OD6. Each fluorescent dye can be identified more reliably.
  • the fluorescence spectrum transmitted through the first dielectric multilayer interference filter 432 is the excitation light cut off as shown in FIG.
  • the fluorescence spectrum shown in this figure has a 25% probability that an arbitrary DNA fragment takes in a specific type of fluorescent dye among the above four types of fluorescent dyes, and the number of fluorescent dyes contained in each DNA fragment ( The number of fluorescent molecules) is the same, and the light absorption coefficient, quantum yield, etc. are taken into account.
  • the two-dimensional detection unit 433 is provided so as to be in close contact with the first dielectric multilayer interference filter 432, and detects light (fluorescence) transmitted through the first dielectric multilayer interference filter 432.
  • the two-dimensional detection unit 433 includes, for example, a two-dimensional optical sensor that can detect incident light (fluorescence), and detects the light (fluorescence) as a two-dimensional image.
  • a multi-layer CMOS image sensor having a wavelength resolution in the optical axis direction is preferable because color separation can be performed at the same position in the light receiving surface direction of the two-dimensional photosensor. This CMOS image sensor is also preferable from the viewpoint of cost reduction and miniaturization.
  • the pixel size of the CMOS image sensor and the size (outer diameter) of the optical fiber are formed to be the same.
  • the two-dimensional optical sensor is bonded to the first dielectric multilayer interference filter 432 with an adhesive.
  • a three-layer sensor (a first layer sensor 433a, a second layer sensor 433b, and a third layer sensor 433c) is provided.
  • the sensor of each layer one having a detection sensitivity corresponding to the wavelength of fluorescence to be detected is used.
  • the first to third layer sensors 433a to 433c have detection sensitivities of 500 nm, 585 nm, and 550 nm, respectively, as shown in FIG. What has a peak in 675 nm is employable.
  • the signals detected by the sensors have the intensity ratios shown in Table 1.
  • the intensity ratio of each signal is, for example, when the first layer sensor 433a is 83%, Alexa 405, the first layer sensor 433a, and the second layer sensor 433b are 43% and 49%, respectively. Is FAM, and the second layer sensor 433b and the third layer sensor 433c are 46% and 46%, respectively, Texas Red, the second layer sensor 433b and the third layer sensor 433c are 14% and 66%, respectively. If there is, it can be determined as Cy5.5.
  • the two-dimensional optical sensor as shown in FIG. 12, for example, a four-layer sensor (first layer sensor 433a ′, second layer sensor 433b ′, third layer sensor 433c ′, and fourth layer sensor 433d). '), And the detection sensitivities of the first to fourth layer sensors 433a' to 433d 'may have a peak at 450 nm, 550 nm, 625 nm, and 725 nm, respectively, as shown in FIG. it can.
  • each sensor The signal detected in (1) has the intensity ratio shown in Table 2.
  • the intensity ratio of each signal is, for example, Alexa 405 when the first layer sensor 433a ′ is 98%, FAM when the second layer sensor 433b ′ is 83%,
  • the layer sensor 433c ′ is 78%, it can be determined as Texas Red
  • the fourth layer sensor 433d ′ is 98%, it can be determined as Cy5.5.
  • the fluorescence detection unit 43 is an optical partition that reflects light at the boundary between adjacent pixels between the first dielectric multilayer interference filter 432 and the two-dimensional detection unit 433. 438 may be provided. Thereby, in the two-dimensional detection unit 433, it is possible to prevent the light from sneaking to other adjacent pixels and improve the light collection efficiency. As a result, the S / N improvement of the signal detection and the DNA sequence can be improved. It is possible to suppress the decrease in the number of samples that can be detected in one reaction due to the improvement in color separation performance and the reduction in contamination between pixels.
  • the optical partition 438 is preferably a thin film made of aluminum, silver, gold, copper and tungsten, and alloys thereof from the viewpoint of obtaining high reflectance, and more preferably an aluminum thin film from the viewpoint of improving reliability and workability. .
  • the height is 500 nm or more and 1,000 nm or less and the width is 200 nm or more and 500 nm or less from the viewpoint of improving the ease of manufacturing.
  • Such an optical partition 438 can be formed by evaporating the above material on the first dielectric multilayer interference filter 432 using, for example, a CVD method, a sputtering method, or the like.
  • the amount of signal detected by the first to fourth layer sensors 433a ′ to 433d ′ is 0.00, 0.11, and 0.78, respectively. , 0.11.
  • the main component of Texas Red single-color fluorescence can be basically detected by the third layer sensor 433c ′, the first layer sensor 433a ′, the second layer sensor 433b ′, and the fourth layer sensor 433d ′ are also made by Texas Red.
  • This means that fluorescence is detected as crosstalk.
  • the relationship between the fluorescence intensities of these four types of fluorescent dyes and the signal amounts detected by the four-layer sensors 433a 'to 433d' is expressed by a determinant represented by the following equation (5).
  • S 1 , S 2 , S 3 , and S 4 are signal amounts detected by the first layer sensor, the second layer sensor, the third layer sensor, and the fourth layer sensor, respectively.
  • Dye 1 , Dye 2 , Dye 3, and Dye 4 are the fluorescence intensities emitted by Alexa 405, FAM, Texas Red, and Cy 5.5, respectively.
  • the fluorescence intensity from which the above-described crosstalk has been removed is obtained as shown in the following formula (6) by multiplying W -1 which is an inverse matrix of W from the left.
  • Dye 1 to Dye 4 and S 1 to S 4 are synonymous with the above formula (5).
  • W ⁇ 1 is an inverse matrix of W.
  • the obtained fluorescence intensity is normalized and converted so that different fluorescence intensities are equal for each fluorescent dye.
  • the fluorescent dye incorporated in the sample can be efficiently identified.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 described here is a CMOS image sensor in which a two-dimensional photosensor has a pixel number of 41 mega, and this CMOS image sensor has a four-layer sensor 433a having a wavelength resolution in the optical axis direction. It is assumed that “ ⁇ 433d” is included. Further, only one DNA fragment serving as the sample s is adsorbed to one first optical fiber 425 on the substrate 423, and one first optical fiber 425 and one second optical fiber 434 are adsorbed. Thus, one optical waveguide is formed, and one pixel of the CMOS image sensor (one pixel group in the two-dimensional optical sensor as shown in FIG. 14) corresponds to one optical waveguide. It shall be.
  • an SBS reaction is performed on the substrate 423 in order to analyze the base sequence of the DNA fragment to be the sample s.
  • Reagents necessary for the above reaction are a primer reagent, a polymerase enzyme, an extension reagent containing nucleotides having four types of fluorescent dyes, a protecting group cleavage reagent, a washing reagent, and an imaging reagent. These reagents are stored in a reagent storage container 102 in the reagent cartridge 101.
  • the reagent cartridge 101 is installed in the reagent rack 103 and cooled to 4 ° C.
  • the heat block 105 and the heat sink 106 are cooled using the Peltier element 104, and the air cooled by the heat sink 106 and the like is blown into the reagent rack 103 by the fan 107 to cool the reagent to 4 ° C. To do.
  • heat exhausted from the Peltier element 104 is performed using the fan 108.
  • the reagent cooled to 4 ° C. in the reagent rack 103 is introduced into the flow path 202.
  • an arbitrary reagent can be introduced into the flow path 202 by switching with the switching valve 201.
  • the reagent introduced into the flow path 202 is fed by driving the syringe 204 disposed in the flow path 203 on the downstream side of the flow chip 42.
  • two two-way valves 205 and 206 are installed in the flow path 203, and a reagent or the like is sucked into the syringe 204 (reagent supply to the flow chip 42 and used from the flow chip 42).
  • the two-way valve 205 is opened and the two-way valve 206 is closed, the syringe 204 is driven.
  • the syringe 204 is driven with the two-way valve 205 closed and the two-way valve 206 opened. As a result, the reagent can be sucked and discharged by one syringe 204.
  • the reagent or the like that has become waste liquid is sent to the waste liquid tank 301 and stored.
  • the waste liquid tank 301 is provided in order to prevent electric shock, rust of the apparatus, generation of a strange odor, and the like caused by waste liquid spillage.
  • the presence or absence of the waste liquid tank 301 is monitored by a micro photo sensor 304.
  • the extension reagent contains four types of nucleotides labeled with a fluorescent dye and a polymerase.
  • the four types of fluorescent nucleotides are Alexa405-dCTP, FAM-dATP, Texas Red-dGTP, and Cy5.5-dTTP, and each fluorescent nucleotide is contained in the extension reagent at a concentration of 200 nM.
  • the salt concentration, magnesium concentration and pH are optimized so that the extension reaction can be carried out efficiently.
  • the extension reagent due to the action of the polymerase contained in the extension reagent, only one base of fluorescent nucleotide complementary to the base to be analyzed is incorporated into the location where the primer in the DNA fragment has hybridized.
  • the reason why the fluorescent nucleotides for two bases do not extend at a time is that the first base fluorescent dye contains a site that inhibits the extension of the second base fluorescent nucleotide.
  • the cleaning reagent is fed into the flow chip 42.
  • fluorescent nucleotides that do not contribute to the reaction floating in the flow chip 42 are removed.
  • a merging reagent is fed into the flow chip 42 to replace the washing reagent, and then fluorescence detection is performed.
  • a protecting group cleaving reagent is fed into the flow chip 42.
  • the fluorescent dye is cleaved from the fluorescent nucleotide, and the next extension reaction (extension reaction of the second base fluorescent nucleotide) becomes possible.
  • extension reaction extension reaction of the second base fluorescent nucleotide
  • the fluorescence detection will be described with reference to FIG.
  • white light emitted from the light source is reflected by the parabolic mirror 412 and converted into parallel light.
  • the light converted into parallel light forms a light source image on the second fly-eye lens 414 by the first fly-eye lens 413, and becomes uniform parallel light through the convolutional lens 415 and the field lens 416.
  • the parallel light is converted into excitation light having a plurality of mutually different excitation wavelength bands by using the second dielectric multilayer interference filter 417 (see the characteristic of the solid line in FIG. 10B), and the DNA fragment that becomes the sample s
  • the four types of fluorescent nucleotides incorporated in are excited independently of each other.
  • the light emitted from the DNA fragment includes excitation light reflected by the DNA fragment or the like in addition to the fluorescence.
  • the light containing the fluorescence travels while totally reflecting the inside of the optical waveguide described above, and reaches the first dielectric multilayer interference filter 432.
  • the first dielectric multilayer interference filter 432 only light in a wavelength band that can pass through the first dielectric multilayer interference filter 432 is transmitted, so that excitation light is blocked and only fluorescence is transmitted.
  • the fluorescence that has reached the two-dimensional detection unit 433 is detected by the four-layer sensors 433a 'to 433d' provided in the two-dimensional photosensor.
  • the type of fluorescent nucleotide is identified by the difference in the intensity ratio of the light detected by the first to fourth layer sensors 433a ′ to 433d ′. As a result, the base of the DNA fragment can be determined.
  • each DNA fragment has 500 bases in order to associate one DNA fragment with each pixel of the two-dimensional photosensor.
  • Analysis using a CMOS image sensor results in a total read base number of 20 Gbase. If the SBS chemistry time required for incorporation per base is 3 minutes / base and the imaging time is 3 seconds, the extension reaction for 500 bases can be completed in about 1 day.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 a DNA sequencer constituted by the reagent storage means 10, the liquid feeding means 20, the waste liquid storage means 30, and the fluorescence detection means 40 is exemplified.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 is not limited to the DNA sequencer.
  • the present invention is also applicable to a multicolor fluorescence analyzer that does not have the reagent storage means 10, the liquid feeding means 20, and the waste liquid storage means 30. Within the intended range.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 is used to obtain excitation light.
  • other means such as a dye filter may be employed as long as the effects of the present invention are not impaired. Good.
  • the fluorescent dyes are four types of Alexa 405, FAM, Texas Red, and Cy 5.5. Can do.
  • the peak wavelengths absorbed by different fluorescent dyes are preferably 50 nm or more apart, more preferably 80 nm or more, and further preferably 120 nm or more.
  • the peak wavelengths of fluorescence emitted by different fluorescent dyes are preferably 50 nm or more, more preferably 80 nm or more, and further preferably 120 nm or more.
  • the second dielectric multilayer interference filter 417 described above mainly transmits light in the wavelength bands of 380 to 396 nm, 474 to 497 nm, 561 to 575 nm, and 641 to 657 nm. As long as the excitation light that can excite all the fluorescent dyes can be emitted and the excitation light can be blocked by the first dielectric multilayer interference filter 432, it is limited to the wavelength band. It is not something.
  • the different wavelength bands that pass through the second dielectric multilayer interference filter 417 are preferably separated by 50 nm or more, more preferably by 80 nm or more, and by 120 nm or more. Is more preferable.
  • the transmittance is 85% or more in the wavelength bands of 436 to 462 nm, 536 to 548 nm, 620 to 632 nm, and 713 to 800 nm, and a wavelength other than the above wavelength band.
  • a filter having a band of less than 0.1% has been described as a suitable filter.
  • the filter is not limited to the wavelength band as long as excitation light can be blocked.
  • the different wavelength bands that pass through the first dielectric multilayer interference filter 432 are preferably separated by 50 nm or more, more preferably by 80 nm or more, and by 120 nm or more. Is more preferable.
  • a two-dimensional photosensor composed of a plurality of layers has been described as the two-dimensional detection unit 433.
  • a two-dimensional photosensor composed of a single layer may be employed.
  • a two-dimensional optical sensor for example, as shown in FIG. 14, one pixel group 439 in which a square array of 2 ⁇ 2 pixels (for example, a Bayer array) is provided for one second optical fiber 434.
  • the four pixels 439a to 439d constituting the one pixel group 439 have, for example, wavelengths similar to the wavelength characteristics of the first to fourth layer sensors 433a ′ to 433d ′ shown in FIG.
  • An element having characteristics can be used.
  • the two-dimensional photosensor for example, a known single-plate color CMOS image sensor or the like is employed.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 using a xenon short arc lamp as the light source 411 has been described.
  • an LED such as a high-intensity LED may be used as the light source.
  • the life of the xenon short arc lamp is 500 to 1,000 hours, the life of the LED is more than 20,000 hours, which exceeds the lifetime of the multicolor fluorescence analyzer 1, so the light source associated with the life No replacement is required. Further, it is possible to eliminate the need for a mechanical shutter and reduce power consumption.
  • an aspheric lens 4191 is used for the purpose of obtaining parallel light. Adopted.
  • a light pipe 4192 and aspherical lenses 4193 and 4194 may be used instead of the aspherical lens 4191 shown in FIG.
  • the light pipe 4192 has a function of making light uniform by totally reflecting light incident from the end face of the light pipe 4192 inside.
  • the light pipe 4192 is close to the light emitting surface of the light pipe 4192 so that the distance between the light incident surface and the light emitting surface of the LED is within 1 mm, and the first and Second aspherical lenses 4193 and 4194 are provided. Thereby, the light emitted from the LED can be efficiently collected, converted into parallel light, and guided to the second dielectric multilayer interference filter 417.
  • the multicolor fluorescence analysis apparatus 1 including one set of irradiation units 41 has been described.
  • a multicolor fluorescence analysis apparatus including a plurality of sets of irradiation units may be used.
  • nine LEDs 411a serving as light sources are arranged in a hemispherical shape, and nine sets of irradiation units 41a each having the LEDs 411a are provided.
  • a multicolor fluorescence analyzer 1a capable of irradiating the sample s with excitation light by using the irradiation unit 41a is exemplified.
  • the intensity of the excitation light irradiated to the sample s can be increased, and a large intensity of fluorescence corresponding to the excitation light can be obtained (in this example, the intensity increases 9 times).
  • the fluorescence analyzer 2 using an objective lens as shown in FIG. 21 it is necessary to bring the objective lens 21 and the flow chip 22 close to about 0.5 mm to 5 mm. It was difficult to dispose the part.
  • the multicolor fluorescence analyzer 1 in which the irradiation unit 41 is positioned in the direction perpendicular to the plate surface of the substrate 423 of the flow chip 42 has been described.
  • excitation light is emitted to the substrate 423.
  • It may be a multi-color fluorescence analyzer in which one set or a plurality of sets of irradiation units are arranged so that irradiation can be performed obliquely.
  • FIGS. 18A and 18B for example, eight LEDs 411b are arranged in a ring shape, and eight sets of irradiation units 41b including the respective LEDs 411b are provided.
  • irradiatable multicolor fluorescence analysis apparatus 1b and the like as the excitation light to the substrate 423 is incident at a predetermined angle theta 3 by 41b.
  • the incident angle ⁇ 1 of the light incident on the first optical fiber 425 constituting the first fiber optic plate 424 is ⁇ 1 ⁇ 30 °. It is necessary to satisfy. Therefore, by limiting the angle ⁇ 3 at which the excitation light is incident on the flow chip 42 to ⁇ 3 > 30 °, the excitation light incident on the first optical fiber 425 is in the first and second optical fibers 425 and 434. Therefore, it is possible to suppress total reflection and to detect fluorescence with certainty.
  • Such illumination is called oblique illumination.
  • This oblique illumination is particularly effective for measuring weak fluorescence represented by single molecule fluorescence measurement.
  • the total number of photons emitted by one molecule of fluorescent dye is 104 to 105.
  • the excitation light is the background light. Therefore, by using the multicolor fluorescence analyzer 1b, excitation light as background light can be removed, and fluorescence can be reliably detected.
  • the present invention can provide a multicolor fluorescence analyzer that can accurately detect fluorescence emitted from a plurality of types of fluorescent dyes contained in a sample. Therefore, the multicolor fluorescence analyzer can be suitably used, for example, for DNA base sequence analysis using the SBS method in which a plurality of fluorescent dyes are used simultaneously.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

　本発明の多色蛍光分析装置１は、複数の励起波長帯を有する励起光を試料ｓに照射する照射部４１と、励起光の照射により試料ｓから発せられた蛍光を含む光を導光すると共に、第１の出射部４２５ｂから出射する第１のファイバオプティックプレート４２４と、第１の出射部４２５ｂから出射した光を第２の入射部４３４ａから受け入れて導光すると共に、第２の出射部４３４ｂから上記光を出射する第２のファイバオプティックプレート４３１と、第２の出射部４３４ｂの端面上に設けられ、上記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ上記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と、誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に密着するように設けられ、誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過した光を検出する二次元検出部４３３とを備えている。

Description

多色蛍光分析装置
　本発明は、多色蛍光分析装置に関する。
　例えば生物学的試験において、蛍光色素でラベルされた多数の微小な試料に一括して励起光を照射し、上記蛍光色素が発した蛍光を検出して各試料を特定する分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。
　上記分析装置では、励起光を分離して特定の波長の蛍光のみを取り出すための交換式の干渉フィルタを備えており、この干渉フィルタを透過した蛍光を上記各試料に対応するよう配設された多数の光ファイバで導光し、これら光ファイバの他端に取り付けられた画像センサを用いて分析を行う。
　このような分析装置では、蛍光を導光する手段として多数の光ファイバが束ねられたファイバオプティックプレートが用いられており、束ねられた光ファイバにより伝送される蛍光を画像センサで二次元画像として一括処理して蛍光の有無を判別するため、同時に多数の試料について蛍光分析を行うことが可能である。
特開平１１－２４１９４７号公報
　しかしながら、例えばＳｅｑｕｅｎｃｅ　ｂｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（以下、「ＳＢＳ」ともいう）法を用いたＤＮＡの塩基配列分析に代表されるような異なる蛍光波長を有する複数の蛍光色素を含む試料を分析する場合、上述したような従来の分析装置では、分析対象とする蛍光色素ごとに干渉フィルタを交換しなければならず、繰り返し行われる塩基伸長反応のたびに干渉フィルタを交換するとなれば分析に膨大な時間を要してしまい、分析迅速化の要求を満足することができない。
　本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することにある。
　本発明は、
（１）励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
　互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
　前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
　前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
　前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
　前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする多色蛍光分析装置、
（２）前記（１）に記載の誘電体多層膜干渉フィルタが第１の誘電体多層膜干渉フィルタであり、照射部が光源と前記光源から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる第２の誘電体多層膜干渉フィルタとを有している前記（１）に記載の多色蛍光分析装置、
（３）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α２）が前記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、下記式（１）で表される関係を満たす前記（２）に記載の多色蛍光分析装置、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。）
（４）所定値（α）が０．１％である前記（３）に記載の多色蛍光分析装置、
（５）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下である前記（３）または（４）に記載の多色蛍光分析装置、
（６）第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角（θｍａｘ）が３０°である前記（３）から（５）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（７）第２のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径が第１のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径より小さい前記（１）から（６）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（８）各励起波長帯の励起光が順次照射される前記（３）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（９）少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射される前記（３）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（１０）試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、前記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる前記（１）から（７）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置、
（１１）蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ およびＣｙ５．５である前記（１０）に記載の多色蛍光分析装置、
（１２）第２の誘電体多層膜干渉フィルタが第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタを有し、
　第１フィルタの透過率が、３８０～３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０～３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
　第２フィルタの透過率が、４７４～４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４～４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
　第３フィルタの透過率が、５６１～５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１～５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
　第４フィルタの透過率が、６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１～６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
　前記第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタが切り替えて用いられる前記（１１）に記載の多色蛍光分析装置、
（１３）第２の誘電体多層膜干渉フィルタが単一のフィルタであり、前記第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が３８０～３９６ｎｍ、４７４～４９７ｎｍ、５６１～５７５ｎｍおよび６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である前記（１１）に記載の多色蛍光分析装置、
（１４）第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が、４３６～４６２ｎｍ、５３６～５４８ｎｍ、６２０～６３２ｎｍおよび７１３～８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である前記（１２）または（１３）に記載の多色蛍光分析装置、並びに
（１５）第１のファイバオプティックプレートの試料が当接する側の面において、光ファイバのコア部端面にアミノシラン処理が施され、前記光ファイバの前記コア部端面以外の面にＨＭＤＳ処理が施されている前記（１０）から（１４）のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置
に関する。
　なお、本明細書において、ファイバオプティックプレート（Ｆｉｂｅｒ　Ｏｐｔｉｃ　Ｐｌａｔｅ、以下「ＦＯＰ」ともいう）とは、多数の光ファイバが一体的に束ねられて当該光ファイバの軸方向の両端部が平面形状をなすものであり、上記光ファイバの一端から入射した光を上記光ファイバの他端に導光可能なデバイスを意味する。このファイバオプティックプレートは、ファイバオプティックテーパ（Ｆｉｂｅｒ　Ｏｐｔｉｃ　Ｔａｐｅｒ、以下「ＦＯＴ」ともいう）を含む概念である。
　本発明は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することができる。したがって、当該多色蛍光分析装置は、例えば、複数の蛍光色素を同時に用いるようなＳＢＳ法を用いたＤＮＡの塩基配列分析などに好適に使用することができる。
本発明の多色蛍光分析装置の一実施形態を示す概略図である。 図１の多色蛍光分析装置における蛍光検出手段を示す概略図であって、（ａ）は試料が１個の状態、（ｂ）は試料が複数の状態をそれぞれ示す。 図２のフローチップの概略斜視図であって、（ａ）は分解した状態、（ｂ）は組み立てた状態をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段を示す概略図であって、（ａ）はフローチップを装着する前の状態、（ｂ）はフローチップを装着した状態をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における蛍光の伝搬状態を示す概略図であって、（ａ）は第１および第２のファイバオプティックプレート内の伝搬状態、（ｂ）は第１および第２の光ファイバ内の伝搬状態をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段において第１のファイバオプティックプレートへの蛍光の入射角をパラメータとした蛍光と励起光との関係を示す概略図であって、（ａ）は入射角が０°の状態、（ｂ）は入射角が変化したときの状態、（ｃ）は入射角が３０°の状態、（ｄ）は入射角が０°かつ短波長シフトを考慮した状態をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における照射部の一形態を具体化して示す概略図である。 図７の蛍光検出手段の照射部における各フィルタの概略透過特性図であって、（ａ）は第１フィルタの透過率、（ｂ）は第２フィルタの透過率、（ｃ）は第３フィルタの透過率、（ｄ）は第４フィルタの透過率、（ｅ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における二次元検出部の一形態を説明するための概略図である。 図９の蛍光検出手段における概略分光特性図であって、（ａ）は第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタにおいて短波長シフトを考慮していない特性、（ｂ）は第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタにおいて短波長シフトを考慮した特性、（ｃ）は各蛍光色素の蛍光スペクトルをそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における二次元検出部の概略特性図であって、（ａ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタを透過する蛍光スペクトル、（ｂ）は二次元検出部における各センサの波長特性をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における二次元検出部の他の形態を示す概略図である。 図１２の蛍光検出手段における二次元検出部の概略特性図であって、（ａ）は第１の誘電体多層膜干渉フィルタを透過する蛍光スペクトル、（ｂ）は二次元検出部における各センサの波長特性をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における第２のファイバオプティックプレートとしてファイバオプティックテーパを採用したものの概略図である。 図２の蛍光検出手段における照射部の光源としてＬＥＤを用いた一形態を示す概略図である。 図１６の蛍光検出手段の照射部としてライトパイプを用いた一形態を示す概略図である。 図１５の蛍光検出手段の照射部として複数セットの照射部を用いた一形態を示す概略図であって、（ａ）は正面図、（ｂ）は平面図をそれぞれ示す。 図１５の蛍光検出手段の照射部を斜光照明とした一形態を示す概略図である。 図２の蛍光検出手段における第１および第２のファイバオプティックプレートの他の形態を示す概略図であって、（ａ）は第１および第２のファイバオプティックプレートの断面図、（ｂ）は第１および第２の光ファイバの切断斜視図をそれぞれ示す。 図２の蛍光検出手段における第１の誘電体多層膜干渉フィルタと二次元光センサとの間に光隔壁を設けた形態を示す概略図である。 対物レンズを用いた多色蛍光分析装置における蛍光検出手段の一形態を示す概略図である。
　本発明の多色蛍光分析装置は、励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
　互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
　前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
　前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
　前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
　前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする。
　このように、当該多色蛍光分析装置は、上記照射部と、第１および第２のファイバオプティックプレートと、誘電体多層膜干渉フィルタと、二次元検出部とを備えているので、試料に含まれる複数の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる。これは、後述するように、励起光の波長帯と検出に用いる蛍光の波長帯とが重なるのを抑制することができ、その結果、蛍光のみを分光して分析精度を向上することができるためであると推察される。
　本発明の多色蛍光分析装置は、上述したように試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する分析装置として用いられ、その分析対象となる試料は上記要件を満たす限り特に限定されないが、好適には、試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、上記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる。これにより、蛍光色素でラベルされた４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を迅速かつ正確に識別することができ、ＤＮＡの塩基配列を効率よく解読することができる。
　以下に、本発明の多色蛍光分析装置を図面に基づいて説明するが、本発明は、当該図面に記載の実施態様のみに限定されるものではない。なお、以下の実施形態では、試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、ＳＢＳ反応方式を用いたＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる多色蛍光分析装置（以下、「ＤＮＡシーケンサ」ともいう）を例示して説明する。また、以下の実施形態では、第１のファイバオプティックプレートがフローチップの基板として用いられている。また、以下に示す実施形態では、第２の出射部の端面上に設けられている単一の誘電体多層膜干渉フィルタを第１の誘電体多層膜干渉フィルタと称する。
　図１は、本発明の多色蛍光分析装置の一実施形態を示す概略図である。当該多色蛍光分析装置１は、図１に示すように、概略的に、試薬保管手段１０と、送液手段２０と、廃液保管手段３０と、蛍光検出手段４０とにより構成されている。
　試薬保管手段１０は、ＤＮＡシーケンサに用いられる試薬等を保管する手段である。試薬保管手段１０は試薬カートリッジ１０１を備え、試薬カートリッジ１０１内にはプライマ試薬、ポリメラーゼ酵素、４種の蛍光色素を有するヌクレオチドを含んだ伸長試薬、保護基切断試薬、洗浄試薬、イメージング試薬等を各別に収納する複数の試薬保管容器１０２が格納されている。
　送液手段２０は、試薬等を後述する後述するフローチップ４２内に供給すると共にフローチップ４２から排出された試薬等を後述する廃液保管手段３０に送液する手段である。送液手段２０は複数の試薬保管容器１０２の中からフローチップ４２へ供給する試薬等を選択的に切り替える切り替えバルブ２０１と、試薬等をフローチップ４２に送液する流路２０２と、フローチップ４２から排出された試薬等を廃液保管手段３０に送液する流路２０３とを備えている。また、流路２０３にはシリンジ２０４と２個の二方弁２０５、２０６が設けられ、これらを用いてフローチップ４２への試薬等の供給とフローチップ４２からの試薬等の排出とを行う。
　廃液保管手段３０は、フローチップ４２から排出された試薬等の廃液を保管する手段である。具体的には、廃液保管手段３０は、送液手段２０の流路２０３端部から排出された廃液を受け入れる廃液タンク３０１と、廃液が廃液タンク３０１から漏れた場合の受け皿となる液受けトレイ３０２と、廃液の蒸散を防止する蓋３０３と、廃液タンク３０１の有無を監視するマイクロフォトセンサ３０４とにより構成されている。
　蛍光検出手段４０は、照射部４１と、フローチップ４２と、蛍光検出部４３とを備えている。
　照射部４１は、互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を試料ｓに照射する。照射部４１は、図２（ａ）に示すように、光源４１１と、放物面鏡４１２と、第１フライアイレンズ４１３と、第２フライアイレンズ４１４と、畳重レンズ４１５と、フィールドレンズ４１６と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７とを有している。
　光源４１１は、励起用の光源である。この光源４１１は、励起光を生成するのに用いられる光を発する。光源４１１としては、通常キセノンショートアークランプが採用される。このキセノンショートアークランプはキセノンガス中での放電によって可視光領域に良好な連続スペクトルを有するので、複数の励起波長帯の光を発生させるための光源として好適な放電灯である。
　放物面鏡４１２は、光源４１１から発せられた光を反射して平行光に変換する。第１フライアイレンズ４１３、第２フライアイレンズ４１４、畳重レンズ４１５およびフィールドレンズ４１６は、協働して放物面鏡４１２で変換された平行光を均一性を持つ平行光に変換する。ここで、畳重レンズ４１５は、第１フライアイレンズ４１３の各レンズセルの像をフィールドレンズ４１６上で重なり合わせ、第１フライアイレンズ４１３の各レンズセルの照度分布を重ね合わせることにより照度の均一化を実現している。
　第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、光源４１１から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる。第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、具体的には、可視光に対して透明なガラス基板（不図示）と、このガラス基板上に形成された誘電体多層膜（不図示）とにより構成されている。
　上記誘電体多層膜を構成する材料としては、例えば、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５等が挙げられる。当該誘電体多層膜は、上記材料の中から高屈折率材料と低屈折率材料とを選択し、これらを交互に１０～４０層程度積層することで形成されている。各層の膜厚等は、当該誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を透過させる所望の波長帯に基づき適宜決定される。上記誘電体多層膜の全厚さは、通常１０μｍ程度である。上記誘電体多層膜の形成方法としては、真空蒸着法、イオンアシスト法、イオンプレーティング法、スパッタ法およびイオンアシステッド・イオンビームスパッタリング法が好ましく、真空蒸着法がより好ましい。上記形成方法とすることで、温度や湿度に対する良好な安定性、急峻な立ち上がり特性などの優れた光学特性を付与することができる。
　このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を有していることで、例えば、従来から用いられている色素フィルタに比べて励起波長帯の波長範囲を峻別することができ、後述する第１の誘電体多層膜干渉フィルタにより励起光を確実に遮断して二次元検出部での蛍光検出精度を向上させることができる。
　当該多色蛍光分析装置１では、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用い、各励起波長帯の励起光が順次試料ｓに照射される。具体的には、図７に示すように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７は、第１フィルタ４１７ａ、第２フィルタ４１７ｂ、第３フィルタ４１７ｃおよび第４フィルタ４１７ｄを有し、これら第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄが順次切り替えて用いられ、所定の励起波長帯の光を選択的に透過することで、透過した光を励起光として試料ｓに照射することができる。第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を構成する第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄはフィルタホイール４１８に取り付けられており、このフィルタホイール４１８が図示していない駆動装置を用いてが高速（例えば、５０ｍｓ以内に異なるフィルタに移動可能な程度の高速）に回転する。このように、各励起波長帯の励起光が順次照射されることで、各蛍光色素から発せられる蛍光を確実に識別することができる。
　本実施形態の塩基配列の分析において好適に用いられる蛍光色素は、Ａｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５の４種である。Ａｌｅｘａ４０５はｄＣＴＰ、ＦＡＭはｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄはｄＧＴＰ、Ｃｙ５．５はｄＴＴＰにそれぞれ結合する。そのため、上記蛍光色素を励起可能な励起光を照射することで、当該蛍光色素が結合したヌクレオチド（以下、「蛍光ヌクレオチド」ともいう）から対応する蛍光が発せられ、この蛍光を検出することで塩基が解読される。このように、蛍光色素が上記色素であることで、４種のヌクレオチドを確実に識別することができ、これに対応するＤＮＡ断片中の塩基を正確に特定することができる。
　上記４種の蛍光色素を励起させるため、第１フィルタ４１７ａの透過率は、３８０～３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０～３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第２フィルタ４１７ｂの透過率は、４７４～４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４～４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第３フィルタ４１７ｃの透過率は、５６１～５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１～５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、第４フィルタ４１７ｄの透過率は、６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１～６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満である。その結果、第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄの中から適当なフィルタを選択することで、３８０～３９６ｎｍ（主としてＡｌｅｘａ４０５を励起）、４７４～４９７ｎｍ（主としてＦＡＭを励起）、５６１～５７５ｎｍ（主としてＴｅｘａｓ　Ｒｅｄを励起）および６４１～６５７ｎｍ（主としてＣｙ５．５を励起）の各励起波長帯の励起光を適宜得ることができる。なお、図８（ａ）～（ｄ）において、符号６０１～６０４は、それぞれ第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄの透過波長帯を示している。また、図８（ｅ）は、上記第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄを用いる場合の第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２（後述）の透過波長帯６０５を示している。このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が第１～第４フィルタ４１７ａ～４１７ｄを有し、各フィルタの透過率が上記要件を満たしていることで、上記４種の蛍光色素を効率よく励起および検出することができる。
　なお、少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射されることも好ましい。これにより、上記励起波長帯に対応する複数の蛍光色素を同時に効率よく励起させることができ、蛍光分析を迅速に行うことができる。具体的には、用いる蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５である場合、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が単一のフィルタであり、図１０（ａ）、（ｂ）の符号７０１で示すように、この第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過率が３８０～３９６ｎｍ、４７４～４９７ｎｍ、５６１～５７５ｎｍおよび６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であることが好ましい。このように、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が単一のフィルタであり、かつ第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７が上記複数の波長帯を透過させることで、上記４種の蛍光色素を同時により効率よく励起させることができ、蛍光分析をより迅速に行うことができる。
　図３は、図２のフローチップの概略斜視図である。フローチップ４２は、図３に示すように、カバーガラス４２１と、スペーサ４２２と、基板４２３とを備えている。
　カバーガラス４２１は、光透過性を有し、特に４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の可視光を透過する。カバーガラス４２１の材質としては、例えば、ガラス、石英、サファイヤ等が挙げられる。カバーガラス４２１は、フローチップ４２内の流路に試薬等の液体を注入する注入口４２１ａおよび使用済みの液体を排出する排出口４２１ｂを有している。
　スペーサ４２２は、額縁状の周縁部を残して打ち抜き穴４２２ａが形成されている。このスペーサ４２２は、カバーガラス４２１と後述する基板４２３との間に挟み込まれ、これらと共に上記液体を試料ｓに供給する流路を形成する。スペーサ４２２は、通常ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて形成されている。スペーサ４２２の厚さは、試薬等の液体を円滑に流通させる観点から、通常３０～１００μｍであり、好ましくは４０～６０μｍであり、より好ましくは４５～５５μｍである。
　基板４２３は、試料ｓとなるＤＮＡ断片を固定する。基板４２３は、第１のファイバオプティックプレート４２４により構成されている。この第１のファイバオプティックプレート４２４は、図５（ａ）に示すように、試料ｓの少なくとも一部が当接し、励起光の照射により試料ｓから発せられた蛍光を含む光を第１の入射部４２５ａから受け入れて導光すると共に、第１の入射部４２５ａと反対側の第１の出射部４２５ｂから上記光を出射する。
　第１のファイバオプティックプレート４２４は、光を導光する格子状に配設された多数の光ファイバ（以下、「第１の光ファイバ４２５」ともいう）と、これらの第１の光ファイバ４２５を覆い当該第１の光ファイバ４２５から漏れる光を吸収する吸収体ガラス（不図示）とから構成されている。第１の光ファイバ４２５は、図５（ｂ）に示すように、コア部４２６とこのコア部４２６を被覆するクラッド部４２７とから構成されている。これらコア部４２６およびクラッド部４２７は、それぞれコアガラスおよびクラッドガラスで形成されており、これら両ガラスは屈折率が異なっている。そのため、コア部４２６およびクラッド部４２７を構成するガラスの屈折率を適宜選択することで、両者の界面において全反射を生じさせることができ、第１の入射部４２５ａから受け入れた光を第１の光ファイバ４２５の光軸方向に導光させて第１の出射部４２５ｂに導びくことができる（図５（ａ）参照）。
　また、各光ファイバ４２５は、第１のファイバオプティックプレート４２４の試料ｓが当接する側の面において、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面にアミノシラン処理が施され、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面以外の面にＨＭＤＳ処理（ヘキサメチルジシラザン処理）が施されている。このようにアミノシラン処理およびＨＭＤＳ処理を施されていることで、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面に形成されたアミノシランからなる膜（以下、アミノシランからなる膜が形成された領域を「スポット部」ともいう）上にＤＮＡ断片を強固に吸着させると共に、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面以外の面に形成された１，１，１，３，３，３－ヘキサメチルジシラザンからなる膜上へのＤＮＡ断片の吸着を抑制することができ、ＤＮＡ断片をコア部４２６端面上に選択的に固定することができる。この結果、ＤＮＡ断片から発せられた蛍光をコア部４２６端面を介して確実に取り込むことができる。なお、上記スポット部およびスポット部以外の領域の形成方法としては、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書に記載の方法を適用することができる。
　本実施形態においては、第１の光ファイバ４２５の直径（クラッド部４２７の外径）は約１．４μｍであり、上記スポット部の直径が約０．３μｍである。このため試料ｓとなるＤＮＡ断片を適当な大きさとすることで、１本の第１の光ファイバ４２５のコア部４２６端面に１個のＤＮＡ断片を配置することができ、１個のＤＮＡ断片（試料ｓ）と１本の第１の光ファイバ４２５とを対応させることができる。
　本実施形態で用いられるコアガラスおよびクラッドガラスの屈折率は、それぞれ１．８０、１．６７である。そのため、一般にシングルファイバの集光能力の指標となる開口数（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ａｐｅｒｔｕｒｅ）は、下記式（２）を用いて０．６７と算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　上記式（２）中、ＮＡは、開口数である。ｎ２およびｎ３は、それぞれコアガラスおよびクラッドガラスの屈折率である。
　ここで、本実施形態で用いられる試薬等の水溶液の屈折率（ｎ１）は１．３３である。そのため下記式（３）を用いて第１の入射部４２５ａにおける光の最大入射角が３０°と算出される。なお、下記式（３）中、θｍａｘは、最大入射角である。ＮＡは、上記式（２）と同義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　そこで、本実施形態では、第１の光ファイバ４２５内に入射した光を全反射させながら導光して第１の出射部４２５ｂに到達させるためには、第１の入射部４２５ａにおける入射角（θ1）（図５（ｂ）参照）がθ1≦３０°の要件を満たす必要がある。他方、第１の入射部４２５ａにおける入射角（θ1）がθ1＞３０°の光線は、最大入射角（θｍａｘ）である３０°を超えているためにコア部４２６とクラッド部４２７との界面で全反射をすることができず、クラッド部４２７を通過して吸収体ガラスに吸収されてしまい、第１の出射部４２５ｂに到達することができない。
　蛍光検出部４３は、図２（ａ）に示すように、第２のファイバオプティックプレート４３１と、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と、二次元検出部４３３とを備えている。
　第２のファイバオプティックプレート４３１は、第１の出射部４２５ｂから出射した光を第２の入射部４３４ａから受け入れて導光すると共に、第２の入射部４３４ａと反対側の第２の出射部４３４ｂから上記光を出射する（図５（ａ）参照）。この第２のファイバオプティックプレート４３１は、第１のファイバオプティックプレート４２４と同様に、コア部４３５およびクラッド部４３６からなる光ファイバ（以下、「第２の光ファイバ４３４」ともいう）と、吸収体ガラス（不図示）とにより構成されている。また、図５（ａ）に示すように、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４の外径は同一であり、これら第１および第２の光ファイバ４２５、４３４どうしの光軸が一致し、かつ第１の出射部４２５ｂと第２の入射部４３４ａとが当接または近接するように配置されている。ここで、近接とは、第１の出射部４２５ｂから出射した光が漏光せずに第２の入射部４３４ａに受け入れられる範囲内で、第１の出射部４２５ｂと第２の入射部４３４ａとが離間している状態を意味する。なお、第２のファイバオプティックプレート４３１は、フローチップ４２を載置するための台座となっている。
　なお、本実施形態では、上述したように、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４の外径が同一であるが、第２のファイバオプティックプレート４３１を構成する光ファイバ（第２の光ファイバ４３４）の外径が、第１のファイバオプティックプレート４２４を構成する光ファイバ（第１の光ファイバ４２５）の外径より小さいことも好ましい。これにより、隣接した複数の第１の光ファイバ４２５から出射される光が単一の第２の光ファイバ４３４に入射するの抑制することができ、蛍光検出における空間分解能を向上させることができる。
　また、図１９（ｂ）に示すように、第１の光ファイバ４２５のコア部４２６の直径は、第２に光ファイバ４３４のコア部４３５の直径よりも小さいことが好ましい。これにより、第１の出射部４２５ａにおける第１の光ファイバ４２５のコア部４２６から出射された光を第２の入射部４３４ａにおける第２の光ファイバ４３４のコア部４３５内に確実に伝達することができ、蛍光検出をより正確に行うことができる。
　また、上述した第１および第２のファイバオプティックプレートとして、それぞれファイバオプティックテーパ（ＦＯＴ）を採用することもできる。図１４は、図２の蛍光検出手段における第２のファイバオプティックプレートとしてファイバオプティックテーパを採用したものの概略図である。ＦＯＴ４３７は、図１４に示すように、第２の入射部と第２の射出部との大きさが異なる第２の光ファイバを束ねたものであり、第２の入射部の像を拡大または縮小することができる。上記像の拡大率は、単純に１本の第２の光ファイバの両端面の直径の比となる。この比は、通常最大５倍程度である。なお、ＦＯＴは、第２の入射部と第２の射出部の大きさが異なるものの、第２の光ファイバの本数は同じである。
　ＦＯＴは、例えば、円柱状のＦＯＰの中央部を加熱し、このＦＯＰの両末端に反対方向の力を加えること当該ＦＯＰの中央部を圧延する。次いで、圧延したＦＯＰの中央部を切断した後、切断面を研磨してＦＯＴの片面とすることで、二つの面の大きさが異なるＦＯＴを製造することができる。なお、ＦＯＴの光ファイバの形状は、上記圧延を制御することで、例えば円形から円形、円形から正方形、正方形から正方形、正方形から長方形など、自在に変更することができる。
　このように、ＦＯＴは、第２の入射部と第２の射出部の大きさが異なるので、例えばイメージインテンシファイア（光増幅光学装置）など大口径を持つ撮像面を小さい撮像面を持つＣＭＯＳイメージセンサの各素子に直接カップリンングするときに用いられる。これにより、結合解像力を落とさずに明るい像を撮像素子に伝達することができる。また、第２の光ファイバの断面積が第２の出射部に向かって漸次大きくなる（図１４参照）場合、光の全反射の繰り返しに応じて第１の誘電体多層膜干渉フィルタへの入射角が小さくなる。これにより、第１の誘電体多層膜干渉フィルタへの入射角に伴う透過分光特性の短波長側へのシフト（以下、「短波長シフト」ともいう）を小さくすることができ、第２の入射部と第２の出射部とが同じ断面積である場合に比べて第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯を拡げることができる。
　第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２は、第２の出射部４３４ｂの端面上に設けられ、蛍光の少なくとも一部を透過しかつ励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一のフィルタである。第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２は、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７と同様に、可視光に対して透明なガラス基板（不図示）と、このガラス基板上に形成された誘電体多層膜（不図示）とにより構成されている。但し、上記誘電体多層膜を構成する各層の膜厚や層数は、励起光を遮断しかつ所望の波長帯の光（蛍光の一部または全部）を透過できるように適宜決定される。これにより、励起光由来のノイズを抑制して蛍光検出をより正確に行うことができる。
　なお、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７における各波長帯の透過性能を十分に発揮させるため、上記各フィルタへの入射角は、通常フィルタ面に対して０±５°であることが仕様として求められている。これは、上記フィルタへの入射角が増大すると、当該フィルタを透過する波長帯が短波長側にシフトするためである。この現象は下記式（４）で表される数式で表現することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　上記式（４）中、θは、入射角である。ｎｅｆｆは、実効的屈折率であり、それぞれのフィルタに特有の値である。λ０は、光線が入射角０°で入射するときの波長である。λ（θ）／λ０は、フィルタに入射する光線の入射角がθであるときに発生する短波長シフトの割合である。
　上記式（４）において、フィルタの実効屈折率ｎｅｆｆを１．５とすると、例えば入射角が３０°（θ＝３０°）である場合、短波長シフトの割合（λ（θ）／λ０）は０．９４程度となる。これは、誘電体多層膜干渉フィルタを透過する波長帯が、入射角０°（θ＝０°）である場合に比べて０．０６波長（０．０６λ０）分、短波長側にシフトすることを意味する。
　図６は、図２の蛍光検出手段において第１のファイバオプティックプレートへの蛍光の入射角をパラメータとした蛍光と励起光との関係を示す概略図である。この図は、蛍光色素としてＣｙ３を用いる場合の関係を示している。なお、符号５０３で表される特性はＣｙ３の蛍光スペクトルを示している。
　本実施形態では、第１の光ファイバ４２５内に入射した光をコア部４２６、４３５内で全反射して伝搬させるため、最大３０°の入射角をもって第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射させる必要がある。この場合、図６（ｂ）に示すように、透過波長帯は入射角０°の光に比べて短波長側にシフトする（例えば、入射角０°での透過波長帯５０２が、入射角３０°では透過波長帯５０４に、入射角４０°では透過波長帯５０５にそれぞれシフトする）。そのため、例えば、上記入射角０°での透過波長帯５０２を有する第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を用いる場合、図６（ｃ）に示すように、上述した短波長シフトにより第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過波長帯５０１と最大入射角が３０°である第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過波長帯５０４とが重なってしまい、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２での励起光の一部透過により微弱な蛍光が強大な励起光に埋もれて上記蛍光を検出できなくなる虞がある。
　そこで、あらかじめ上記短波長シフトを考慮して第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯を決定することが好ましい。上記両誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の関係としては、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過波長帯における光の透過率（α２）が上記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、上記式（１）で表される関係を満たすことが好ましい。
　上記式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。
　このように、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯が上記関係を満たすことで、短波長シフトが発生したとしても両透過波長帯が重なり合うのを防止することができ、蛍光と励起光とを確実に区別することができる。
　ここで、所定値（α）は、０．１％であることが好ましい。このように所定値（α）を設定することで、透過光が短波長側にシフトしたとしても両透過波長帯が重なり合うのを効果的に防止することができ、蛍光と励起光とをより確実に区別することができる。
　上記所定値（α）が０．１％であり、かつ上記式（１）の関係を満たす一例としては、例えば図６（ｄ）に示すように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の入射角０°での透過波長帯の立ち上がり波長が６００ｎｍ（符号５０６参照）であり、かつ第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７における励起光の透過波長帯の立ち下がり波長が５６０ｎｍであるものが挙げられる。
　上記一例では、入射光が入射角０°で第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する場合、透過波長帯の立ち上がりは６００ｎｍであるが、入射光が入射角３０°である場合、上記立ち上がり波長は、上記式（１）の右辺から５６４ｎｍと算出される（ｎｅｆｆ＝１．５で計算）。ここで、励起光の透過波長帯の立ち下がり波長（λ２ｊ）を５６０ｎｍに設定した場合、上記立ち上がり波長は、上記式（１）の関係を満たすので、短波長シフトが発生した場合であっても、第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯は重ならず、励起光の遮断によりＯＤ（光学濃度：Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）が６以上を維持して確実に微弱な蛍光を検出することができる。
　なお、本実施形態では第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５である例について説明したが、本発明の多色蛍光分析装置では、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下であることが好ましい。このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の実効屈折率（ｎｅｆｆ）を上記範囲とすることで、短波長シフトが発生したとしても第１および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２、４１７の透過波長帯が重なり合うのを効果的に防止することができ、蛍光と励起光とをさらに確実に区別することができる。上記実効屈折率としては、短波長シフトを低減する観点から、１．７以上２．２以下がより好ましく、２．０以上２．２以下がさらに好ましい。
　また、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する光の最大入射角（θｍａｘ）は３０°であることが好ましい。このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２における最大入射角を上記値とすることで、第１および第２の光ファイバ４２５、４３４で導光される光の損失を抑制することができ、蛍光をより確実に検出することができる。なお、最大入射角を上記値とすることは、導光される光の損失抑制の観点から、本実施形態のＤＮＡ断片の塩基配列の分析のように、第１の入射部４２５ａが水溶液や純水等の水を含む液体に接するような分析により有効である。上記最大入射角としては、２０°がより好ましく、１０°がさらに好ましい。
　また、蛍光分析に用いられる蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５であり、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７の透過率が３８０～３９６ｎｍ、４７４～４９７ｎｍ、５６１～５７５ｎｍおよび６４１～６５７ｎｍの波長において８５％以上、かつ上記波長以外の波長において０．１％未満である場合、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過率は、図１０（ｂ）に示すように、４３６～４６２ｎｍ、５３６～５４８ｎｍ、６２０～６３２ｎｍおよび７１３～８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であることが好ましい。
　このような好適な構成は、上記Ａｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５の最大吸収波長および最大蛍光波長が、それぞれＡｌｅｘａ４０５について４０１ｎｍ、４２１ｎｍ、ＦＡＭについて４９４ｎｍ、５１８ｎｍ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄについて５９６ｎｍ、６１５ｎｍ、Ｃｙ５．５について６７５ｎｍ、６９４ｎｍである（蛍光波長については、図１０（ｃ）の符号７０４～７０７参照）こと、並びに第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２への最大入射角が３０°である場合を考慮し、図１０（ａ）に示す第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯７０２の立ち上がり波長を長波長側に０．０６波長（０．０６λ０）分移動（符号７０３参照）させたことに基づくもである。
　このように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２の透過率を上記波長帯とすることで、上記蛍光色素および第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いた場合、例えば、入射光が最大３０°の入射角をもって第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に入射する場合（短波長シフトが発生する場合）であっても、ＯＤ６の光学濃度で励起光を確実に遮断することができ、各蛍光色素をより確実に識別することができる。
　その結果、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過する蛍光スペクトルは、図１１（ａ）に示すように、励起光がカットされたものとなる。なお、この図に示された蛍光スペクトルは、任意のＤＮＡ断片が上記４種の蛍光色素うちの特定種の蛍光色素を取り込む確率が２５％であって各ＤＮＡ断片に含まれる蛍光色素の数（蛍光分子数）を同数とし、かつ吸光係数、量子収率等を加味したものである。
　二次元検出部４３３は、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に密着するように設けられ、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過した光（蛍光）を検出する。二次元検出部４３３としては、例えば、入射する光（蛍光）を検出可能な二次元光センサにより構成され、上記光（蛍光）を二次元画像として検出する。上記二次元光センサとしては、当該二次元光センサの受光面方向の同一位置での色分離ができる点から、光軸方向に波長分解能を持つ複層方式のＣＭＯＳイメージセンサが好ましい。このＣＭＯＳイメージセンサは、低価格化および小型化の観点からも好ましい。本実施形態では、空間分解能を最大限に高める目的で、ＣＭＯＳイメージセンサの画素の大きさと光ファイバの大きさ（外径）が同一となるように形成されている。なお、上記二次元光センサは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に接着剤で接合されている。
　上記二次元光センサとしては、図９に示すように、例えば３層のセンサ（第１層センサ４３３ａ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃ）を備えている。これら各層のセンサは、検出する蛍光の波長に対応した検出感度のものが用いられる。例えば、本実施形態のような上記４種の蛍光色素を用いる場合、上記第１～第３層センサ４３３ａ～４３３ｃとしては、図１１（ｂ）に示すように、検出感度がそれぞれ５００ｎｍ、５８５ｎｍおよび６７５ｎｍにピークを有するものを採用することができる。
　これら第１～第３層センサ４３３ａ～４３３ｃを用いて上述の図１１（ａ）に示す蛍光スペクトルを有する蛍光を検出した場合、各センサで検出される信号は表１に示す強度比となる。表１からも明らかなように、各信号の強度比として、例えば、第１層センサ４３３ａが８３％である場合はＡｌｅｘａ４０５、第１層センサ４３３ａおよび第２層センサ４３３ｂがそれぞれ４３％、４９％である場合はＦＡＭ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃがそれぞれ４６％、４６％である場合はＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ、第２層センサ４３３ｂおよび第３層センサ４３３ｃがそれぞれ１４％、６６％である場合はＣｙ５．５と判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、上記二次元光センサとしては、図１２に示すように、例えば、４層のセンサ（第１層センサ４３３ａ’、第２層センサ４３３ｂ’、第３層センサ４３３ｃ’および第４層センサ４３３ｄ’）を備え、第１～第４層センサ４３３ａ’～４３３ｄ’の検出感度が、図１３（ｂ）に示すように、それぞれ４５０ｎｍ、５５０ｎｍ、６２５ｎｍおよび７２５ｎｍにピークを有するものを採用することもできる。
　これら第１～第４層センサ４３３ａ’～４３３ｄ’を用いて図１３（ａ）に示す蛍光スペクトル（図１１（ａ）に示す蛍光スペクトルと同様の蛍光スペクトル）の蛍光を検出した場合、各センサで検出される信号は表２に示す強度比となる。表２からも明らかなように、各信号の強度比として、例えば、第１層センサ４３３ａ’が９８％である場合はＡｌｅｘａ４０５、第２層センサ４３３ｂ’が８３％である場合はＦＡＭ、第３層センサ４３３ｃ’が７８％である場合はＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ、第４層センサ４３３ｄ’が９８％である場合はＣｙ５．５と判定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　なお、蛍光検出部４３は、図２０に示すように、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２と二次元検出部４３３との間における隣接する画素どうしの境界部に、光を反射する光隔壁４３８を設けてもよい。これにより、二次元検出部４３３において、隣接する他の画素への光の回り込みを防止することができると共に集光効率を向上させることができ、結果として信号検出のＳ／Ｎ向上、ＤＮＡシーケンスの色分離能の向上、画素間のコンタミ低減に起因した１回の反応で検出可能な試料数の低下抑制を図ることができる。
　光隔壁４３８としては、高反射率が得られる観点から、アルミニウム、銀、金、銅およびタングステン、並びにこれらの合金からなる薄膜が好ましく、信頼性および加工性向上の観点から、アルミニウム薄膜がより好ましい。光隔壁４３８の寸法としては、作製容易性向上の観点から、高さが５００ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であり、幅が２００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましい。このような光隔壁４３８は、例えば、ＣＶＤ法、スパッタ法等を用いて第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２上に上記材料を蒸着することで形成することができる。
　次に、蛍光色素の種類を判定する方法について説明する。蛍光色素の種類を判定するには、まずクロストーク除去を行う。クロストーク除去は、例えば、上記表２に示すＴｅｘａｓ　Ｒｅｄの場合、第１層～第４層センサ４３３ａ’～４３３ｄ’で検出される信号量は、それぞれ０．００、０．１１、０．７８、０．１１となる。これは、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ単色蛍光の主な成分は基本的に第３層センサ４３３ｃ’で検出できるものの、第１層センサ４３３ａ’、第２層センサ４３３ｂ’、第４層センサ４３３ｄ’でもＴｅｘａｓ　Ｒｅｄの蛍光がクロストークとして検出されてしまうということを意味している。これらの４種の蛍光色素の蛍光強度と４層のセンサ４３３ａ’～４３３ｄ’が検出する信号量の関係は下記式（５）で表される行列式のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　上記式（５）中、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、それぞれ第１層センサ、第２層センサ、第３層センサおよび第４層センサが検出する信号量である。また、Ｄｙｅ１、Ｄｙｅ２、Ｄｙｅ３およびＤｙｅ４は、それぞれＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５が発する蛍光強度である。Ｗは、ｗｉｊ（ｉ＝１、２、３、４、ｊ＝１、２、３、４）を要素にもつ行列であり、上記蛍光強度と信号量とを関連づける行列である。
　ここで、上述したクロストークを除去した蛍光強度は、Ｗの逆行列であるＷ－１を左から掛け合わせることで、下記式（６）のように求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　上記式（６）中、Ｄｙｅ１～Ｄｙｅ４およびＳ１～Ｓ４は、上記式（５）と同義である。Ｗ－１は、Ｗの逆行列である。
　次いで得られた蛍光強度をノーマライズし、蛍光色素毎に異なる蛍光強度が等しくなるように変換する。以上のようにクロストーク除去等を行うことで、試料中に取り込まれた蛍光色素を効率よく識別することができる。
　次に、当該多色蛍光分析装置１（ＤＮＡシーケンサ）を用いてＤＮＡシーケンスを行う方法について説明する。なお、ここで説明する多色蛍光分析装置１は、二次元光センサが４１メガの画素数を有するＣＭＯＳイメージセンサであり、このＣＭＯＳイメージセンサが光軸方向に波長分解能を有する４層のセンサ４３３ａ’～４３３ｄ’を有しているものとする。また、基板４２３における１本の第１の光ファイバ４２５に対して試料ｓとなるＤＮＡ断片が１個のみ吸着し、かつ１本の第１の光ファイバ４２５と１本の第２の光ファイバ４３４とにより１つの光導波路が形成されていると共に、この光導波路１つに対してＣＭＯＳイメージセンサの１個の画素（図１４に示すような二次元光センサでは１つの画素群）が対応しているものとする。
　まず、試料ｓとなるＤＮＡ断片の塩基配列を解析するためにＳＢＳ反応を基板４２３上で行う。上記反応に必要な試薬は、プライマ試薬、ポリメラーゼ酵素、４種の蛍光色素を有するヌクレオチドを含んだ伸長試薬、保護基切断試薬、洗浄試薬、イメージング試薬である。これらの試薬は、試薬カートリッジ１０１内の試薬保管容器１０２に格納されている。また、試薬カートリッジ１０１は、試薬ラック１０３に設置され、４℃に冷却されている。
　冷却方法としては、例えば、ペルチェ素子１０４を用いてヒートブロック１０５およびヒートシンク１０６を冷却し、これらヒートシンク１０６等により冷却された空気をファン１０７で試薬ラック１０３内に送風して試薬を４℃に冷却する。なお、ペルチェ素子１０４からの排熱は、ファン１０８を用いて行う。
　次いで、試薬ラック１０３内で４℃に冷却された試薬を流路２０２に導入する。このとき、切り替えバルブ２０１により切り替えることで、任意の試薬を流路２０２に導入することができる。流路２０２に導入された試薬は、フローチップ４２よりも下流側の流路２０３に配置されたシリンジ２０４を駆動させることで送液される。具体的には、流路２０３には２個の二方弁２０５、２０６が設置されており、シリンジ２０４に試薬等を吸引（フローチップ４２への試薬等の供給およびフローチップ４２からの使用済みの試薬等の排出）するときは、二方弁２０５を開かつ二方弁２０６を閉の状態でシリンジ２０４を駆動させる。
　一方、シリンジ２０４内の試薬等（廃液）を廃液タンク３０１に排出するときは、二方弁２０５を閉かつ二方弁２０６を開の状態でシリンジ２０４を駆動させる。これにより、一つのシリンジ２０４で試薬の吸引および排出が可能となる。廃液となった試薬等は、廃液タンク３０１へ送液されて貯蔵される。この廃液タンク３０１は、廃液こぼれにより生じる感電、装置の錆、異臭の発生などを防止するために設けられている。廃液タンク３０１の有無はマイクロフォトセンサ３０４で監視される。
　ここで、試薬等が供給されたフローチップ４２において行われるＳＢＳ反応について説明する。この反応方式では、フローチップ４２内に伸長試薬を送液する。この伸長試薬は、蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼを含んでいる。上記４種類の蛍光ヌクレオチドは、Ａｌｅｘａ４０５－ｄＣＴＰ、ＦＡＭ－ｄＡＴＰ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ－ｄＧＴＰおよびＣｙ５．５－ｄＴＴＰであり、各蛍光ヌクレオチドが上記伸長試薬中それぞれ２００ｎＭの濃度で含まれている。この伸長試薬は、伸長反応が効率よく行なわれるように、塩濃度、マグネシウム濃度およびｐＨが最適化されている。また、伸長試薬に含まれるポリメラーゼの作用により、ＤＮＡ断片内のプライマがハイブリダイズした箇所に、分析対象となる塩基に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基分だけ取り込まれる。なお、一度に２塩基分の蛍光ヌクレオチドが伸長しないのは、１塩基目の蛍光色素中に２塩基目の蛍光ヌクレオチドの伸長を阻害する部位が含まれているからである。
　次いで、フローチップ４２内に洗浄試薬を送液する。この洗浄試薬を送液することで、フローチップ４２内に浮遊する反応に寄与しない蛍光ヌクレオチドが除去される。次いで、フローチップ４２内にメージング試薬を送液し、上記洗浄試薬を置換した後、蛍光検出を行う。蛍光検出後は、フローチップ４２内に保護基切断試薬を送液する。この保護基切断試薬を送液することで、蛍光ヌクレオチドから蛍光色素が切断され、次の伸長反応（２塩基目の蛍光ヌクレオチドの伸長反応）が可能となる。以降、上述した操作を繰り返すことで、ＤＮＡシーケンスを行うことができ、１個のＤＮＡ断片から５００塩基を超える塩基配列を解析することができる。
　ここで、上記蛍光検出について、図２（ａ）を参照して説明する。当該多色蛍光分析装置１の蛍光検出手段において、光源から発せられた白色光は放物面鏡４１２で反射して平行光に変換される。平行光に変換された光は第１フライアイレンズ４１３により第２フライアイレンズ４１４上に光源像を結像させ、畳重レンズ４１５およびフィールドレンズ４１６を経て均一な平行光となる。この平行光は第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いて互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光に変換され（図１０（ｂ）の実線の特性参照）、試料ｓとなるＤＮＡ断片に取り込まれた４種類の蛍光ヌクレオチドをそれぞれ独立に励起する。その際、ＤＮＡ断片の塩基に相補的な蛍光ヌクレオチドが取り込まれるため、各蛍光ヌクレオチドに含まれる蛍光色素の種類に対応した蛍光が発せられる（図１０（ｃ）参照）。なお、ＤＮＡ断片から発せられる光には、上記蛍光の他に上記ＤＮＡ断片等で反射した励起光が含まれている。
　この蛍光を含む光は上述した光導波路内を全反射しながら進行して第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２に到達する。この光が第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を通過する際、当該第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過可能な波長帯の光のみが透過するため励起光は遮断され、蛍光のみが二次元検出部４３３に到達する。この二次元検出部４３３に到達した蛍光は、二次元光センサに設けられた４層のセンサ４３３ａ’～４３３ｄ’により蛍光検出される。その際、蛍光色素の種類に応じて発せられる蛍光の波長が異なるため、第１～第４層センサ４３３ａ’～４３３ｄ’で検出される光の強度比の違いにより蛍光ヌクレオチドの種類を同定することができ、その結果、ＤＮＡ断片の塩基を決定することができる。
　なお、上記方法を用いてＤＮＡシーケンスを行う場合、二次元光センサの各画素に１個のＤＮＡ断片を対応させるため、例えば、１個のＤＮＡ断片が５００塩基を有し、これを４１Ｍ画素のＣＭＯＳイメージセンサを用いて分析すると、結果として総読取塩基数は２０Ｇｂａｓｅとなる。また、１塩基あたりの取り込みに要するＳＢＳケミストリ時間を３分／ｂａｓｅ、イメージング時間を３秒とすると、５００塩基分の伸長反応を約１日で完了することができる。
　なお、本発明は、上述した実施形態の構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
　例えば、上述の実施形態では、多色蛍光分析装置１として、試薬保管手段１０と、送液手段２０と、廃液保管手段３０と、蛍光検出手段４０とにより構成されているＤＮＡシーケンサを例示して説明したが、当該多色蛍光分析装置１はＤＮＡシーケンサ用に限定されず、例えば、試薬保管手段１０、送液手段２０および廃液保管手段３０を有していない多色蛍光分析装置も本発明が意図する範囲内である。
　また、上述した実施形態では、励起光を得るために第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を用いたが、本発明の効果を損なわない限り、色素フィルタなどの他の手段を採用してもよい。
　また、上述した実施形態では、蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５の４種であるものについて説明したが、用いる蛍光色素の種類やその数は、試料に応じて適宜決定することができる。なお、互いに異なる蛍光色素が吸収するピーク波長どうしは、５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。また、互いに異なる蛍光色素が発する蛍光のピーク波長どうしは、５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
　また、上述した第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７では、主として３８０～３９６ｎｍ、４７４～４９７ｎｍ、５６１～５７５ｎｍおよび６４１～６５７ｎｍの波長帯の光を透過するものについて説明したが、分析対象となる全ての蛍光色素を励起可能な励起光を発することができ、かつ第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２で上記励起光を遮断することができるようなものであれば、上記波長帯に限定されるものではない。なお、第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７を透過する互いに異なる波長帯は、それらの帯域が５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
　また、上述した第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２では、その透過率が４３６～４６２ｎｍ、５３６～５４８ｎｍ、６２０～６３２ｎｍおよび７１３～８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ上記波長帯以外の波長帯において０．１％未満であるものを好適なフィルタとして説明したが、励起光を遮断することができれば、上記波長帯に限定されるものではない。なお、第１の誘電体多層膜干渉フィルタ４３２を透過する互いに異なる波長帯は、それらの帯域が５０ｎｍ以上離れていることが好ましく、８０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、１２０ｎｍ以上離れていることがさらに好ましい。
　また、上述した実施形態では、二次元検出部４３３として、複数の層からなる二次元光センサについて説明したが、単一の層からなる二次元光センサを採用することもできる。このような二次元光センサとしては、例えば図１４に示すように、第２の光ファイバ４３４の１本に対して２×２画素の正方配列（例えば、ベイヤ配列など）した１つの画素群４３９が対応するように配置されたもの等が挙げられる。この場合、上記１つの画素群４３９を構成する４つの画素４３９ａ～４３９ｄは、例えば、それぞれ図１３（ｂ）に示される第１～第４層センサ４３３ａ’～４３３ｄ’の波長特性と同様の波長特性を有する素子を用いることができる。上記二次元光センサとしては、例えば、公知の単板方式のカラーＣＭＯＳイメージセンサ等が採用される。
　また、上述した実施形態においては、光源４１１としてキセノンショートアークランプを用いた多色蛍光分析装置１について説明したが、高輝度ＬＥＤ等のＬＥＤを光源として用いてもよい。上記キセノンショートアークランプの寿命が５００～１，０００時間であるのに対し、上記ＬＥＤの寿命は２０，０００時間超であり、多色蛍光分析装置１の生涯稼働時間を超えるので寿命に伴う光源の取り替えが不要となる。また、機械的なシャッタの不要化および低消費電力化を図ることができる。なお、このようなＬＥＤを用いる場合、キセノンショートアークランプが点光源であるのに対し、このＬＥＤは面光源であるため、図１５に示すように、平行光を得る目的で非球面レンズ４１９１が採用される。
　また、光源４１１としてＬＥＤを用いる場合、図１６に示すように、図１５で図示した非球面レンズ４１９１等の代替としてライトパイプ４１９２および非球面レンズ４１９３、４１９４を用いてもよい。ライトパイプ４１９２は、当該ライトパイプ４１９２の端面から入射した光を内部で全反射させることにより光を均一化する作用を有する。具体的には、例えば、ライトパイプ４１９２の光が入射する側の端面と上記ＬＥＤの発光面との間隔が１ｍｍ以内となるように近接させ、ライトパイプ４１９２の上記ＬＥＤと反対側に第１および第２の非球面レンズ４１９３、４１９４を配設する。これにより、ＬＥＤから発せられる光を効率良く集光し、かつ平行光に変換して第２の誘電体多層膜干渉フィルタ４１７に光を導光することができる。
　また、上述した実施形態においては、１セットの照射部４１を備えている多色蛍光分析装置１について説明したが、複数セットの照射部を備えている多色蛍光分析装置であってもよい。具体的には、図１７（ａ）、（ｂ）に示すように、例えば、光源となるＬＥＤ４１１ａを半球面状に９個配設され、上記各ＬＥＤ４１１ａを有する９セットの照射部４１ａが設けられ、これらの照射部４１ａにより試料ｓに対して励起光を照射可能な多色蛍光分析装置１ａが挙げられる。これにより、試料ｓに照射される励起光の強度を増加させることができ、この励起光に対応した大きな強度の蛍光を得ることができる（この例では強度が９倍に増加）。なお、図２１に示すような対物レンズを用いた蛍光分析装置２では、対物レンズ２１とフローチップ２２とを０．５ｍｍ～５ｍｍ程度に接近させる必要があるため、上述のように複数セットの照射部を配設することが困難であった。
　また、上述した実施形態においては、照射部４１がフローチップ４２の基板４２３の板面に対して垂直方向に位置する多色蛍光分析装置１について説明したが、上記基板４２３に対して励起光を斜めに照射できるように、１セットまたは複数セットの照射部が配設されている多色蛍光分析装置であってもよい。具体的には、図１８（ａ）、（ｂ）に示すように、例えば、輪帯状にＬＥＤ４１１ｂを８個配設し、上記各ＬＥＤ４１１ｂを含む８セットの照射部４１ｂを設け、これらの照射部４１ｂにより基板４２３に対して励起光が所定の角度θ３で入射するように照射可能な多色蛍光分析装置１ｂが挙げられる。
　本実施形態のように多色蛍光分析装置１をＤＮＡシーケンサとして用いる場合、第１のファイバオプティックプレート４２４を構成する第１の光ファイバ４２５に入射する光線の入射角θ１がθ１≦３０°を満たす必要がある。そこで、励起光がフローチップ４２に入射する角度θ３をθ３＞３０°に限定することで、第１の光ファイバ４２５に入射する励起光が第１および第２の光ファイバ４２５、４３４内で全反射するのを抑制することができ、蛍光を確実に検出することができる。
　このような照明を斜光照明という。この斜光照明は特に１分子蛍光測定などに代表される微弱な蛍光の計測に有効である。ちなみに１分子の蛍光色素が発する総光子数は１０４～１０５個である。一方、二次元光センサとして公知の高感度カメラを用いれば、バックグラウンドが十分低ければ光子を１００個受光できれば上記１分子を検出することができる。したがって、上記高感度カメラを用いることで１分子蛍光測定に必要な光子数は既に十分な数が確保されており、必要なのはバックグラウンド（背景光）の低減であることがわかる。本発明においては、励起光が背景光となる。そこで、上記多色蛍光分析装置１ｂとすることで、背景光となる励起光を除去することができ、蛍光を確実に検出することができる。
　本発明は、試料に含まれる複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を一括して正確に検出することができる多色蛍光分析装置を提供することができる。したがって、当該多色蛍光分析装置は、例えば、複数の蛍光色素を同時に用いるようなＳＢＳ法を用いたＤＮＡの塩基配列分析などに好適に使用することができる。
　ｓ　試料
　１、１ａ、１ｂ　多色蛍光分析装置
　１０　試薬保管手段
　２０　送液手段
　３０　廃液保管手段
　４０　蛍光検出手段
　４１　照射部
　４２　フローチップ
　４３　蛍光検出部
　４１１　光源
　４１７　第２の誘電体多層膜干渉フィルタ
　４１７ａ　第１フィルタ
　４１７ｂ　第２フィルタ
　４１７ｃ　第３フィルタ
　４１７ｄ　第４フィルタ
　４２３　基板
　４２４　第１のファイバオプティックプレート
　４２５　第１の光ファイバ
　４２５ａ　第１の入射部
　４２５ｂ　第１の出射部
　４２６　コア部
　４２７　クラッド部
　４３１　第２のファイバオプティックプレート
　４３２　誘電体多層膜干渉フィルタ（第１の誘電体多層膜干渉フィルタ）
　４３３　二次元検出部
　４３４　第２の光ファイバ
　４３４ａ　第２の入射部
　４３４ｂ　第２の出射部
　４３５　コア部
　４３６　クラッド部

Claims (15)

  1. 　励起光の照射により試料が含む異なる蛍光波長を有する複数種の蛍光色素から発せられた蛍光を検出する多色蛍光分析装置であって、
    　互いに異なる複数の励起波長帯を有する励起光を前記試料に照射する照射部と、
    　前記試料の少なくとも一部が当接し、前記励起光の照射により前記試料から発せられた蛍光を含む光を第１の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第１の入射部と反対側の第１の出射部から前記光を出射する第１のファイバオプティックプレートと、
    　前記第１の出射部から出射した光を第２の入射部から受け入れて導光すると共に、前記第２の入射部と反対側の第２の出射部から前記光を出射する第２のファイバオプティックプレートと、
    　前記第２の出射部の端面上に設けられ、前記蛍光の少なくとも一部を透過しかつ前記励起波長帯を含まない複数の透過波長帯の光を透過する単一の誘電体多層膜干渉フィルタと、
    　前記誘電体多層膜干渉フィルタに密着するように設けられ、前記誘電体多層膜干渉フィルタを透過した光を検出する二次元検出部とを備えていることを特徴とする多色蛍光分析装置。
  2. 　請求項１に記載の誘電体多層膜干渉フィルタが第１の誘電体多層膜干渉フィルタであり、照射部が光源と前記光源から発せられた光の中から所定の励起波長帯を有する励起光を選択的に透過させる第２の誘電体多層膜干渉フィルタとを有している請求項１に記載の多色蛍光分析装置。
  3. 　第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α１）が所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち上がり波長（λ１ｉ）と、第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過波長帯における光の透過率（α２）が前記所定値（α）よりも小さい関係を満たす立ち下がり波長（λ２ｊ）とが、下記式（１）で表される関係を満たす請求項２に記載の多色蛍光分析装置。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     （式（１）中、ｉおよびｋは、それぞれ１以上の整数である。θｍａｘは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角である。ｎｅｆｆは、第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率である。）
  4. 　所定値（α）が０．１％である請求項３に記載の多色蛍光分析装置。
  5. 　第１の誘電体多層膜干渉フィルタの実効屈折率（ｎｅｆｆ）が１．５以上２．２以下である請求項３または請求項４に記載の多色蛍光分析装置。
  6. 　第１の誘電体多層膜干渉フィルタに入射する光の最大入射角（θｍａｘ）が３０°である請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
  7. 　第２のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径が第１のファイバオプティックプレートを構成する光ファイバの外径より小さい請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
  8. 　各励起波長帯の励起光が順次照射される請求項３から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
  9. 　少なくとも２つの励起波長帯を有する励起光が同時に照射される請求項３から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
  10. 　試料が蛍光色素を含むＤＮＡ断片であり、前記ＤＮＡ断片の塩基配列の分析に用いられる請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
  11. 　蛍光色素がＡｌｅｘａ４０５、ＦＡＭ、Ｔｅｘａｓ　ＲｅｄおよびＣｙ５．５である請求項１０に記載の多色蛍光分析装置。
  12. 　第２の誘電体多層膜干渉フィルタが第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタを有し、
    　第１フィルタの透過率が、３８０～３９６ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ３８０～３９６ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
    　第２フィルタの透過率が、４７４～４９７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ４７４～４９７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
    　第３フィルタの透過率が、５６１～５７５ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ５６１～５７５ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
    　第４フィルタの透過率が、６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ６４１～６５７ｎｍの波長帯以外の波長帯において０．１％未満であり、
    　前記第１フィルタ、第２フィルタ、第３フィルタおよび第４フィルタが切り替えて用いられる請求項１１に記載の多色蛍光分析装置。
  13. 　第２の誘電体多層膜干渉フィルタが単一のフィルタであり、前記第２の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が３８０～３９６ｎｍ、４７４～４９７ｎｍ、５６１～５７５ｎｍおよび６４１～６５７ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である請求項１１に記載の多色蛍光分析装置。
  14. 　第１の誘電体多層膜干渉フィルタの透過率が、４３６～４６２ｎｍ、５３６～５４８ｎｍ、６２０～６３２ｎｍおよび７１３～８００ｎｍの波長帯において８５％以上、かつ前記波長帯以外の波長帯において０．１％未満である請求項１２または請求項１３に記載の多色蛍光分析装置。
  15. 　第１のファイバオプティックプレートの試料が当接する側の面において、光ファイバのコア部端面にアミノシラン処理が施され、前記光ファイバの前記コア部端面以外の面にＨＭＤＳ処理が施されている請求項１０から請求項１４のいずれか１項に記載の多色蛍光分析装置。
PCT/JP2015/052852 2015-02-02 2015-02-02 多色蛍光分析装置 Ceased WO2016125236A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/545,422 US10908083B2 (en) 2015-02-02 2015-02-02 Multicolor fluorescence analysis device
PCT/JP2015/052852 WO2016125236A1 (ja) 2015-02-02 2015-02-02 多色蛍光分析装置
DE112015005747.1T DE112015005747B4 (de) 2015-02-02 2015-02-02 Mehrfarb-Fluoreszenz-Analysevorrichtung
JP2016572964A JP6351766B2 (ja) 2015-02-02 2015-02-02 多色蛍光分析装置
GB1710394.6A GB2548763B (en) 2015-02-02 2015-02-02 Multicolor fluorescence analysis device
CN201580073959.0A CN107209120B (zh) 2015-02-02 2015-02-02 多色荧光分析装置

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2015/052852 WO2016125236A1 (ja) 2015-02-02 2015-02-02 多色蛍光分析装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016125236A1 true WO2016125236A1 (ja) 2016-08-11

Family

ID=56563602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/052852 Ceased WO2016125236A1 (ja) 2015-02-02 2015-02-02 多色蛍光分析装置

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10908083B2 (ja)
JP (1) JP6351766B2 (ja)
CN (1) CN107209120B (ja)
DE (1) DE112015005747B4 (ja)
GB (1) GB2548763B (ja)
WO (1) WO2016125236A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019039993A (ja) * 2017-08-23 2019-03-14 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 蛍光観察用フィルタ及び蛍光観察顕微鏡
WO2019078230A1 (ja) * 2017-10-19 2019-04-25 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
JP2020046208A (ja) * 2018-09-14 2020-03-26 株式会社東芝 光学センサ
JP2021044694A (ja) * 2019-09-11 2021-03-18 富士フイルム株式会社 蛍光撮影装置
JP7058816B1 (ja) 2022-02-14 2022-04-22 株式会社レフ・テクノロジー 光学検出装置及び該光学検出装置を備えたシステム

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016226212A1 (de) * 2016-12-23 2018-06-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Analyseeinrichtung
SG10201801853WA (en) * 2018-03-02 2019-10-30 Delta Electronics Int’L Singapore Pte Ltd Portable multi-color fluorescence detection device
CN113544493A (zh) * 2019-03-05 2021-10-22 宽腾矽公司 用于集成装置的光学吸收滤光器
CN110208187B (zh) * 2019-04-29 2024-03-19 吉林亚泰中科医疗器械工程技术研究院股份有限公司 一种用于滤光片和光纤自动同步更换的装置
EP3742476B1 (en) * 2019-05-20 2024-11-06 Infineon Technologies AG Method of implanting an implant species into a substrate at different depths
DE102020108432A1 (de) * 2020-03-25 2021-09-30 Jenoptik Optical Systems Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Lumineszenzanalyse mehrerer Proben
CN113237818A (zh) * 2021-05-28 2021-08-10 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞分析方法和系统
DE102020131374B4 (de) * 2020-11-26 2024-02-08 Dionex Softron Gmbh Fluoreszenzdetektion
GB2607603A (en) * 2021-06-08 2022-12-14 Spectrum Logic Ltd Imaging apparatus

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0778469B2 (ja) * 1990-12-26 1995-08-23 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 蛍光パターン読取り装置
JP2809422B2 (ja) * 1989-04-12 1998-10-08 株式会社日立製作所 多色蛍光検出型電気泳動装置
JPH10513553A (ja) * 1995-01-23 1998-12-22 マーレイ，アンソニー・ジェイ 生物学的分子の分析
JP2005077260A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Fuji Photo Film Co Ltd 化学発光検出方法およびシステム
JP2006177955A (ja) * 2004-12-20 2006-07-06 Palo Alto Research Center Inc 特殊細胞検知器用改良型走査集光方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63298137A (ja) 1987-05-29 1988-12-05 Soken:Kk イメ−ジファイバを用いた検体分析装置
US5216485A (en) 1991-09-04 1993-06-01 International Business Machines Corporation Advanced via inspection tool (avit)
EP0706646B1 (de) 1993-07-02 1998-03-25 Institut Für Molekulare Biologie E.V. Probenträger und seine verwendung
WO1998001743A1 (en) * 1996-07-10 1998-01-15 Cambridge Imaging Limited Improvements in and relating to imaging
EP0990142A4 (en) 1996-12-31 2000-09-27 Genometrix Genomics Inc MULTIPLEXED MOLECULAR ANALYSIS METHOD AND DEVICE
US6043880A (en) 1997-09-15 2000-03-28 Becton Dickinson And Company Automated optical reader for nucleic acid assays
DE19745373A1 (de) 1997-10-14 1999-04-15 Bayer Ag Optisches Meßsystem zur Erfassung von Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignalen
GB9815702D0 (en) 1998-07-21 1998-09-16 Cambridge Imaging Ltd Improved imaging system for fluorescence assays
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
JP2002098696A (ja) 2000-09-26 2002-04-05 Inst Of Physical & Chemical Res 集積型生体分子センサー
DK1412725T3 (en) * 2001-06-29 2019-03-25 Meso Scale Technologies Llc Multi-well plates for LUMINESCENSE TEST MEASUREMENTS
CA2513535C (en) 2003-01-29 2012-06-12 454 Corporation Bead emulsion nucleic acid amplification
US7095176B2 (en) * 2004-03-09 2006-08-22 Lynn Judd B Miniature tubular gas discharge lamp and method of manufacture
EP1907571B1 (en) * 2005-06-15 2017-04-26 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
WO2007056490A2 (en) * 2005-11-08 2007-05-18 Incom, Inc. Fiber optic interrogated microslide, microslide kits and uses thereof
JP4185939B2 (ja) * 2006-03-15 2008-11-26 オムロン株式会社 紫外線硬化樹脂の状態推定方法
JP5026851B2 (ja) * 2007-04-23 2012-09-19 株式会社日立製作所 化学発光検出装置
WO2009132028A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Complete Genomics, Inc. Array structures for nucleic acid detection
EP2333524A4 (en) * 2008-09-18 2013-03-27 Shimadzu Corp FLUORESCENT IMAGE DETECTOR AND METHOD FOR DETECTING FLUORESCENT IMAGES
DE202010018011U1 (de) 2009-01-08 2013-07-10 It-Is International Ltd Optisches System für chemische und/oder biochemische Reaktionen
JP5297887B2 (ja) * 2009-05-19 2013-09-25 日本板硝子株式会社 蛍光分析用光分波検出器及び蛍光検出システム
DE102010010741A1 (de) 2010-03-09 2011-09-15 Beckman Coulter, Inc. Lichtleitervorrichtung zum Abstrahlen und Empfangen von Licht, System, Verfahren und Computerprogrammprodukt
DE102012204128B4 (de) 2012-03-15 2023-11-16 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie
WO2014165554A1 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Life Technologies Corporation Systems and methods for genetic sequencing
DE102014111167A1 (de) 2014-08-06 2016-02-11 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie mit der Unterscheidung mindestens zweier Wellenlängenbereiche

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2809422B2 (ja) * 1989-04-12 1998-10-08 株式会社日立製作所 多色蛍光検出型電気泳動装置
JPH0778469B2 (ja) * 1990-12-26 1995-08-23 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 蛍光パターン読取り装置
JPH10513553A (ja) * 1995-01-23 1998-12-22 マーレイ，アンソニー・ジェイ 生物学的分子の分析
JP2005077260A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Fuji Photo Film Co Ltd 化学発光検出方法およびシステム
JP2006177955A (ja) * 2004-12-20 2006-07-06 Palo Alto Research Center Inc 特殊細胞検知器用改良型走査集光方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019039993A (ja) * 2017-08-23 2019-03-14 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 蛍光観察用フィルタ及び蛍光観察顕微鏡
WO2019078230A1 (ja) * 2017-10-19 2019-04-25 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
JPWO2019078230A1 (ja) * 2017-10-19 2020-12-17 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
JP7184046B2 (ja) 2017-10-19 2022-12-06 コニカミノルタ株式会社 生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラム
US11600020B2 (en) 2017-10-19 2023-03-07 Konica Minolta, Inc. Biological substance quantification method, image processing device, pathological diagnosis support system, and recording medium storing computer readable program
JP2020046208A (ja) * 2018-09-14 2020-03-26 株式会社東芝 光学センサ
JP2021044694A (ja) * 2019-09-11 2021-03-18 富士フイルム株式会社 蛍光撮影装置
JP7112994B2 (ja) 2019-09-11 2022-08-04 富士フイルム株式会社 蛍光撮影装置
JP7058816B1 (ja) 2022-02-14 2022-04-22 株式会社レフ・テクノロジー 光学検出装置及び該光学検出装置を備えたシステム
JP2023117777A (ja) * 2022-02-14 2023-08-24 株式会社レフ・テクノロジー 光学検出装置及び該光学検出装置を備えたシステム

Also Published As

Publication number Publication date
DE112015005747B4 (de) 2023-01-26
CN107209120B (zh) 2020-05-15
US20180017492A1 (en) 2018-01-18
US10908083B2 (en) 2021-02-02
GB2548763B (en) 2021-07-21
JP6351766B2 (ja) 2018-07-04
GB2548763A (en) 2017-09-27
CN107209120A (zh) 2017-09-26
JPWO2016125236A1 (ja) 2017-09-14
DE112015005747T5 (de) 2017-09-14
GB201710394D0 (en) 2017-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6351766B2 (ja) 多色蛍光分析装置
US8680484B2 (en) Fluorescence analyzing apparatus and fluorescence detecting apparatus
US12461032B2 (en) Light energy fluorescence excitation
US7348573B2 (en) Excitation and emission filter
JP6581707B2 (ja) 核酸分析装置、および核酸分析方法
US20180369820A1 (en) Cell screening method
JP3934090B2 (ja) 蛍光分析用光合分波器、蛍光分析用光学モジュール、蛍光分析装置、及び蛍光・光熱変換分光分析装置
JP6416530B2 (ja) 蛍光観察装置、および蛍光観察方法
WO2018012436A1 (ja) 光学的検出装置及び光学的検出方法
JP2007132792A (ja) 光計測装置と試料との光結合系
US20120020840A1 (en) Detection system
JP2009517653A (ja) サンプルコンパートメント及び感光要素を有するバイオチップ装置、バイオチップ装置の少なくとも１つのサンプルコンパートメント内の蛍光粒子を検出する方法
JP2008180567A (ja) 蛍光分光光度計
KR20240006033A (ko) 축소된 규모의 단위 셀을 갖는 통합 분석 장치의 어레이
WO2025119819A1 (en) Optical design for a fiber-coupled, single-molecule detection instrument
HK40007478A (en) Light energy fluorescence excitation
JP2005180963A (ja) 光学分析装置

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15881053

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016572964

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 201710394

Country of ref document: GB

Kind code of ref document: A

Free format text: PCT FILING DATE = 20150202

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 112015005747

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15545422

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15881053

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1