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WO2016119031A1 - Composto, processo de síntese do composto, uso, composição farmacêutica, método de tratamento de inflamações ou de doença neurodegenerativa, forma de dosagem oral e método de inibição de enzima acetilcolinesterase - Google Patents

Composto, processo de síntese do composto, uso, composição farmacêutica, método de tratamento de inflamações ou de doença neurodegenerativa, forma de dosagem oral e método de inibição de enzima acetilcolinesterase Download PDF

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WO2016119031A1
WO2016119031A1 PCT/BR2016/050010 BR2016050010W WO2016119031A1 WO 2016119031 A1 WO2016119031 A1 WO 2016119031A1 BR 2016050010 W BR2016050010 W BR 2016050010W WO 2016119031 A1 WO2016119031 A1 WO 2016119031A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lfqm
compound
spectrum
group
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/BR2016/050010
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2016119031A8 (pt
Inventor
Eliezer DE JESUS LACERDA BARREIRO
Cláudio VIEGAS JÚNIOR
Flávio PEREIRA DIAS VIEGAS
Miguel DIVINO DA ROCHA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade Federal De Alfenas Unifal-Mg
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMIG
Original Assignee
Universidade Federal De Alfenas Unifal-Mg
Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ
Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMIG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from BR102015002132-1A external-priority patent/BR102015002132B1/pt
Application filed by Universidade Federal De Alfenas Unifal-Mg, Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais FAPEMIG filed Critical Universidade Federal De Alfenas Unifal-Mg
Publication of WO2016119031A1 publication Critical patent/WO2016119031A1/pt
Publication of WO2016119031A8 publication Critical patent/WO2016119031A8/pt
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D227/00—Heterocyclic compounds containing rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, according to more than one of groups C07D203/00 - C07D225/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms

Definitions

  • the present invention is in the fields of
  • AD Alzheimer's disease
  • AD is a progressive neurodegenerative process and is related to a set of pathophysiological factors such as age, the appearance of senile plaque deposits (p-amyloid protein aggregates) and neurofibrillary tangles in the brain, loss of cholinergic neurons, especially of the acetylcholine (ACh) 4 and the installation of a neuroinflammatory process.
  • the AD patient suffers from a series of symptoms that are related to the loss of cholinergic neurons in the central nervous system (CNS), such as progressive impairment of memory and cognitive abilities, disorientation, lack of attention, impairment of language ability and depression 5 ' 6 .
  • CNS central nervous system
  • AD Alzheimer's disease
  • Secretases are enzymes responsible for the normal proteolytic process of APP, leading to the formation of ⁇ fragments and, depending on the site of proteolysis, are classified as a-, p- and Y- secretases.
  • A-secretases are probably fixed in the plasma membrane and cleave APP between residues 16 and 17 of the ⁇ sequence, generating soluble extracellular fragments known as sAPPa, which are normally phagocytized by the microglia and eliminated. Therefore, APP breakdown by a-secretases inhibits the formation of ⁇ deposits and constitutes the major physiological route of APP breakdown.
  • Tau protein The function of Tau protein is to stabilize the microtubules of axons, structures responsible for the formation and maintenance of interneuronal contacts. When accumulating intracellularly, due to a process of hyperphosphorylation of poorly understood origin, the Tau protein generates neurofibrillary tangles.
  • AD is related to the reduction of neurotransmitters as dopamine, serotonin, norepinephrine, glutamate, substance P and mainly acetylcholine (ACh).
  • Cholinergic deficit may be delayed or mitigated by partial inhibition of acetylcholinesterase (AChE) activity, a strategy known as the "cholinergic hypothesis", which has inspired the drugs currently available for the treatment of AD, as well as others in preclinical stages.
  • AChE acetylcholinesterase
  • these drugs act to restore cholinergic function, relieving symptoms and delaying the evolution of the disease, thus ensuring a better quality of life for the patient, but without offering effective cure.
  • NEQs acetylcholine
  • IAChEs Acetylcholinesterase inhibitors
  • Pseudo-irreversible include the class of carbamates that form a carbamoylant complex with a serine residue. in the AChE catalytic triad and prototyped with physostigmine, a natural product whose basic structure led to the development of rivastigmine;
  • Reversible they have reversibly interacting ligands with the enzyme in a region near the catalytic site, such as, for example, aminoacridines (eg tacrina), some alkaloids (eg galantamine) and W-benzylpiperidines (eg donepezil). ), 29
  • aminoacridines eg tacrina
  • alkaloids eg galantamine
  • W-benzylpiperidines eg donepezil
  • the first commercial drug for the treatment of AD was tacrin (THA, Cognex®, 1), approved in 1993. Its mechanism of action is based on inhibition of both AChE and butyrylcholinesterase (BuChE), effective in patients with AD of mild to moderate intensity.
  • tacrin tacrin
  • BuChE butyrylcholinesterase
  • its use has been restricted in some countries due to its liver toxicity and low bioavailability, being recommended only for patients who do not respond or tolerate the other available drugs.
  • its structure has been widely used in the planning of many other active analogs, with different selectivity indices and lower toxicity, such as huprines, bis-tacrines, tacripyrines among other derivatives of hybrid structure.
  • Galantamine is a natural product that acts as a nicotinic receptor agonist and has been extensively studied as a prototype for the development of new anticholinesterase drug candidates. 55 Your Effect The therapeutic effect is a consequence of a dual action mechanism: inhibiting AChE and modulating the presynaptic nicotinic receptor, thus promoting greater release of ACh in the synaptic cleft. 56
  • Rivastigmine is a reversible cholinesterase inhibitor designed by structural modification of physostigmine capable of inhibiting both AChE and BuChE. Its use is indicated for the treatment of mild to moderate stages of AD. It is also prescribed for the treatment of Parkinson's disease (PD), and its oral use for AD was approved 2000 and, only in 2006, for the treatment of PD. 57 ⁇
  • memantine (5) was the last FDA-approved drug in 2006, and it is also the only drug that does not act on AChE inhibition. Memantine acts as a W-methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate receptor antagonist, preventing an excessive influx of calcium (Ca 2+ ). 59 At synapses, after presynaptic neuron stimulation, glutamate is released, which binds to NMDA receptors and stimulates the entry of Ca 2+ ions into the neuron cytoplasm.
  • NMDA W-methyl-D-aspartate
  • nNOS neuronal NO synthase
  • NO nitric oxide
  • 61-63 Donepezil (6) also known as E2020, emerged in the late 1980s as a reversible, noncompetitive AChE inhibitor, 55, 64-66 being the second FDA-approved drug (1996) that rapidly It was noted for being much less toxic than tacrine, and was also 1250 times more selective for AChE than for BuChE. 64-66 Several computational and mechanism of action studies indicate that the selectivity of this drug is due to the N-benzylpiperidine and indanone subunits, which confer greater affinity and specificity for AChE.
  • donepezil acts to inhibit AChE by increasing the availability of intra-synaptic ACh 64 , with few side effects, mostly cholinergic and transient in nature such as nausea, vomiting and tremors.
  • 68 '69 As regards the pharmacokinetic aspects donepezil shows linear absorption, reaching maximum plasma concentration within 3-5 hours after administration, without the influence of food. 64 '69 In addition, the donepezil shows good implementation of blood brain barrier to reach the brain concentration of about 7 times higher than in plasma and is therefore considered a centrally acting inhibitor.
  • Donepezil is extensively metabolized in the liver and its major route of excretion, with its metabolites is the kidney, which requires caution in the management of patients with kidney and liver failure.
  • BuChE also known as serum cholinesterase or acylcholine acylhydrolase, is present mainly in glial cells, endothelial tissue and neurons. Together with AChE, BuChE is responsible for modulating acetylcholine levels and therefore is also a therapeutic target compatible with the cholinergic hypothesis, the main therapeutic strategy for the treatment of AD. 71 '72 Among the commercial drugs, only tacrine (1) and rivastigmine (3) concomitantly inhibit AChE and BuChE. The hydrolysis kinetics of ACh by these two enzymes are distinct, varying according to the available substrate concentration. Therefore, under conditions where ACh concentration is low, BuChE is less efficient.
  • helper amino acid residues such as Trp-84, which interact with a quaternary group of ACh and Trp-279, 76 located at the neck opening giving access to the catalytic site, are being considered as sites of additional interaction in the design of new AChE inhibitors.
  • Trp-84 which interact with a quaternary group of ACh and Trp-279, 76 located at the neck opening giving access to the catalytic site.
  • Trp-84 which interact with a quaternary group of ACh and Trp-279, 76 located at the neck opening giving access to the catalytic site
  • the direct inhibition of the active site prevent the binding of the substrate molecule , or its hydrolysis by occupying the site with a high affinity (an example of tacrine) or by an irreversible reaction with the catalytic serine mechanism by which they act organophosphorous insecticides and carbamates.
  • a peripheral anionic site is located near the enzyme surface, above the access to the catalytic site, where the Trp-286 residue has a particular function as a binding site with the ACh quaternary ammonium subunit; an acyl binding cavity, which in human AChE (huAChE) consists of residues Gly-122, Trp-236, Phe-295, Phe-297 and Phe-338, is responsible for recognition and interaction with the ACh acetyl subunit.
  • a hydrophobic sub-site comprising residues Trp-84, Tyr-130, Tyr-330 to Phe-331, which interacts by stacking n electrons (n-type interactions - stacking n) and / or apolar , is responsible for accommodating the alcoholic subunit of a tetrahedral intermediate formed prior to choline release in the process of hydrolysis.
  • Stabilization of charged subunits substrates or other ligands active site of the enzyme is mediated by interactions n-type cation.
  • Inflammation is the result of a complex set of reactions in vascularized tissues, in response to the action of harmful agents responsible for injury or tissue damage, manifested by cell migration, leukocyte activation and various systemic reactions. 55 This type of response, recruitment and migration of defense cells may occur in the CNS, characterizing neuroinflammation. 84
  • brain inflammation is a feature of AD since acute inflammatory features such as flushing, swelling, heat and pain are not present and structures such as microglia, astrocytes and neurons are responsible for the inflammatory reaction.
  • Inflammatory mediators such as cytokines, interleukin-1p (IL-1P), IL-6 and TNF-a, as well as leukotrienes, thromboxanes, prostaglandins, coagulation factors, reactive oxygen species and other radicals such as nitric oxide, complementary factors, proteases
  • cytokines interleukin-1p (IL-1P)
  • IL-6 and TNF-a as well as leukotrienes, thromboxanes, prostaglandins, coagulation factors, reactive oxygen species and other radicals such as nitric oxide, complementary factors, proteases
  • Protease inhibitors and pentraxins are produced by cells activated by tissue damage. Since the production of ⁇ represents a chronic stimulus, the immune system is activated to clear these potentially toxic products
  • one of the therapeutic alternatives is the combination of "multiple treatment drugs", also known as cocktails. This approach consists of the combination of two or more drugs that act by different therapeutic mechanisms.
  • Another alternative is to use a "multi-compound medication” where Different drugs are contained in the formulation of a single drug.
  • LDMAs multi-target ligands
  • LDMA synthesis strategy is based on the hybridization of pharmacophoric subunits of two or more molecules, and both should maintain their ability to interact with their respective targets simultaneously, and thus seek to prevent disease progression by blockade. of multiple pathophysiological processes.
  • US 2004/0087658 A1 discloses combinations of dementia drugs such as the combination of a 1-aminocyclohexane derivative and an acetylcholinesterase inhibitor.
  • the molecules disclosed in said US document 2004/0087658 A1 are distinct from those disclosed by the present invention.
  • WO 99/25363 A1 discloses the combination of tetrahydropyridines and acetylcholinesterase inhibitors for the treatment of senile dementia, including Alzheimer's. However, such compounds or combinations thereof disclosed in WO 99/25363 A1 differ from those disclosed in the present invention.
  • WO 2010/019560 A1 discloses deuterated derivatives of donepezil, its metabolites and pharmaceutically acceptable salts thereof. However, in said patent application WO 2010/019560 A1 the combinations of the compounds of the present invention are not disclosed. Nor is the double profile (antiinflammatory and anticholinesterase) of the compounds of the present invention disclosed.
  • WO 2014/008629 A1 discloses compounds derived from the donepezil drug. However, in said patent application WO 2010/019560 A1 the compounds of the present invention or combinations thereof and the dual profile (anti-inflammatory and anticholinesterase) feature are not disclosed.
  • the present invention aims to solve the constant problems in the state of the art from a novel compound, designed by molecular hybridization with the prototype LASSBio-767 and arylhydrazonic alkaloid derivatives, contemplating the N-benzyl piperidine subunit of the donepezil drug. and an N-acylhydrazone spacer unit.
  • Said compound in several embodiments, has been shown to possess important pharmacological properties, and may act as anti-cholinesterase, anti-inflammatory, anti-amyloid, neuroprotective, and additionally has multiple action profile, contemplating both the property of inhibiting the enzyme acetylcholinesterase and the anti-inflammatory property.
  • the pharmacological properties and multiple action profile of said compound are particularly useful in curative or prophylactic treatment of neurodegenerative diseases.
  • the present invention features a compound represented by formula I:
  • R 1 is selected from the group consisting of: OH, CH 3 CHOO, oxyalkyl, oxyaryl and carbamoyl;
  • R2 is chosen from the group consisting of: H, Br, Cl, NO2,
  • OMe 3-pyrrolidinyl, F, NH2, 4-morpholinyl, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc, triazolyl, aminoalkyl, aminoaryl, O-alkyl, aryl, carbamoyl, NHCO-alkyl, and NHCO-aryl.
  • the present invention provides a process for synthesizing the compound represented by formula I, comprising the following steps:
  • the present invention discloses the use of the compound as defined above for the manufacture of a composition for the curative or prophylactic treatment of neurodegenerative disease.
  • the present invention discloses the use of the compound as defined above for the manufacture of an antiinflammatory and anticholinesterase composition.
  • the present invention provides a method of treating neurodegenerative disease comprising administering the compound as defined above to an individual prone to or having neurodegenerative disease at a dose regimen ranging from ⁇ / kg to the subject. and 30 ° C mol / kg of the subject.
  • the present invention provides a method of treating inflammation comprising administering the compound as defined above to an individual prone to or carrying an inflammation in a dose regimen ranging from ⁇ / kg to 300 ⁇ 1 /] ⁇ of the individual.
  • the present invention provides a method of inhibiting the acetylcholinesterase enzyme comprising contacting the compound as defined above with the acetylcholinesterase enzyme.
  • inventive concept common to all claimed protection contexts lies in the compound's unprecedented structural pattern, which results in important pharmacological properties and novel mechanisms of action, useful in the curative or prophylactic treatment of inflammation and / or neurodegenerative diseases.
  • Figure 1 shows the molecular design of a new series of dual-acting prototype drug candidates for the treatment of AD.
  • Figure 2 shows the synthetic route used for preparing the target compounds of some embodiments of the invention.
  • FIG. 3 shows Spectrum 1. Spectrum in
  • Figure 6 shows Spectrum 4. High resolution mass spectrum of methyl 4-formylbenzoate (13).
  • Figure 9 shows Spectrum 7. 13 C NMR Spectrum (50 MHz, MeOD) of methyl 4 [(3-hydroxypiperididin-1-yl) methyl] benzoate (11).
  • Figure 10 shows Spectrum 8. High resolution mass spectrum of methyl 4- [(3-hydroxypiperididin-1-yl) methyl] benzoate.
  • FIG. 11 shows Spectrum 9. Spectrum at
  • FIG. 12 shows Spectrum 10.
  • Figure 14 shows Spectrum 12. High resolution mass spectrum of 4 [(3-hydroxypiperididin-1-yl) methyl] benzoylhydrazide (10).
  • Figure 15 shows Spectrum 13. Spectrum at
  • Figure 16 shows Spectrum 14. 1 H NMR Spectrum (200 MHz, MeOD) of substance LFQM-54.
  • Figure 17 shows Spectrum 15.
  • Figure 18 shows Spectrum 16. High resolution mass spectrum of LFQM-54 substance.
  • Figure 19 shows Spectrum 17. Spectrum in the
  • Figure 20 shows Spectrum 18. High resolution mass spectrum of substance LFQM-55.
  • Figure 21 shows Spectrum 19. Spectrum at
  • FIG. 22 shows Spectrum 20.
  • Figure 23 shows Spectrum 21. 13 C NMR Spectrum (200 MHz, DMSO-d 6) of substance LFQM-56.
  • Figure 24 shows Spectrum 22. High resolution mass spectrum of substance LFQM-56.
  • Figure 25 shows Spectrum 23. Spectrum at
  • Figure 26 shows Spectrum 24. High resolution mass spectrum of LFQM-57 substance.
  • FIG. 27 shows Spectrum 25. Spectrum in the
  • Figure 28 shows Spectrum 26. 1 H NMR Spectrum (500 MHz, MeOD) of substance LFQM-65.
  • Figure 29 shows Spectrum 27.
  • Figure 30 shows Spectrum 28. High resolution mass spectrum of LFQM-65 substance.
  • Figure 31 shows Spectrum 29. Spectrum at
  • Figure 32 shows Spectrum 30. High resolution mass spectrum of substance LFQM-66.
  • Figure 33 shows Spectrum 31. IR spectrum (KBr) of substance LFQM-67.
  • Figure 34 shows Spectrum 32.
  • Figure 35 shows Spectrum 33.
  • Figure 36 shows Spectrum 34. High resolution mass spectrum of substance LFQM-67.
  • Figure 37 shows Spectrum 31. Spectrum no.
  • Figure 38 shows Spectrum 32. 1 H NMR Spectrum (200 MHz, MeOD) of substance LFQM-72.
  • Figure 39 shows Spectrum 33.
  • Figure 40 shows Spectrum 35. High resolution mass spectrum of LFQM-72 substance.
  • Figure 41 shows Spectrum 36. Spectrum no.
  • Fig. 42 shows Spectrum 37.
  • Figure 43 shows Spectrum 38. 13 C NMR Spectrum (50 MHz, DMSO-d 6) of substance LFQM-75.
  • Figure 44 shows Spectrum 39. High resolution mass spectrum of substance LFQM-75.
  • Figure 45 shows Spectrum 40. Spectrum no.
  • Figure 46 shows Spectrum 41. High resolution mass spectrum of LFQM-76 substance.
  • Figure 47 shows Spectrum 42. Spectrum no.
  • Figure 48 shows Spectrum 43. 1 H NMR Spectrum (200 MHz, MeOD) of substance LFQM-88.
  • Figure 49 shows Spectrum 44.
  • Figure 50 shows Spectrum 45. High resolution mass spectrum of substance LFQM-88.
  • Figure 51 shows Spectrum 46. Spectrum no.
  • Figure 52 shows Spectrum 47. High resolution mass spectrum of substance LFQM-58.
  • Figure 53 shows Spectrum 48. IR spectrum (KBr) of substance LFQM-68.
  • Figure 54 shows Spectrum 49. High resolution mass spectrum of substance LFQM-68.
  • Figure 55 shows Spectrum 50. Spectrum no.
  • Figure 56 shows Spectrum 51.
  • Figure 57 shows Spectrum 52.
  • Figure 58 shows Spectrum 53. High resolution mass spectrum of LFQM-73 substance.
  • Figure 59 shows Spectrum 54. Spectrum no.
  • Fig. 60 shows Spectrum 55.
  • Figure 61 shows Spectrum 56.
  • Figure 62 shows Spectrum 57. High resolution mass spectrum of substance LFQM-84.
  • Fig. 63 shows Spectrum 58. IR spectrum (KBr) of substance LFQM-87.
  • Fig. 64 shows Spectrum 59 - High Resolution Mass Spectrum of LFQM-87.
  • Figure 66 shows the study of the mechanism of action of the substances LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-75, LFQM-76 and LFQM-88.
  • Fig. 67 shows a scheme 1 indicating the experimental design of the new object recognition test on the fourth day of the experiment.
  • Fig. 68 shows the effect of LFQM-56, LFQM-
  • Figure 69 shows the Effect of LFQM-56, LFQM-
  • Figure 70 shows an experiment performed with administration of donepezil at doses of 1, 3 and 5 mg / kg in animals undergoing intrathecal administration of the folded amyloid protein.
  • Figure 71 shows the anti-inflammatory effect of the target substances (100 ⁇ M) of some embodiments of the invention in the von Frey assay using indomethacin (100 ⁇ M) as a positive standard, (a) - (h) .
  • Figure 72 shows the anti-inflammatory effect of the target substances (100 ⁇ M) of some embodiments of the invention in the von Frey assay using indomethacin (100 ⁇ M) as a positive standard, (i) - (p) .
  • Figure 73 shows the area plot on the anti-inflammatory effect curve of all target substances (100 ⁇ M) of some embodiments of the invention in the von Frey assay using indomethacin (100 ⁇ M) as standard. . ### p ⁇ 0.001 when compared to the control group without carrageenan. * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001 when compared to the carrageenan control group.
  • Figure 74 shows the effect of test substances LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-74, LFQM-75, LFQM-76, LFQM-84 (100 ⁇ / kg) , indomethacin (100 ⁇ / kg) and morphine (39 ⁇ / kg) on the neurogenic and inflammatory phases of the formalin test.
  • Figure 75 shows the effect of acylhydrazones.
  • Figure 76 shows the dose-response curve and ID50 estimate of the acylidrazones LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73 and LFQM-74 in the carrageenan-induced mouse paw edema assay following 3 hour.
  • MDA malondialdehyde
  • B sixth day
  • RBC non-parasitized red blood cells
  • RBC non-parasitized red blood cells
  • Figure 81 shows the experimental design of the procedure for assessing the effect on mnemonic deficit induced by hippocampal administration of ⁇ -amyloid protein.
  • Figure 82 shows the data from the evaluation of the substances LFQM-56 and LFQM-67 in the new object recognition model following administration of the ⁇ -amyloid protein in the hippocampus.
  • N groups 10, 7, 9, 8, 11, 11, respectively.
  • Figure 83 shows data from the evaluation of substance LFQM-88 in the novel object recognition model following administration of the ⁇ -amyloid protein to the hippocampus.
  • Figure 84 shows the data from the evaluation of the substances LFQM-57 and LFQM-75 in the novel object recognition model following administration of the ⁇ -amyloid protein in the hippocampus.
  • Post-hoc Duncan amyloid beta LFQM-57 and LFQM-75 different from the control.
  • Figure 85 shows the data from the evaluation of the substances LFQM-56 and LFQM-67 and donepezil administered in the novel object recognition model following administration of the ⁇ -amyloid protein to the hippocampus. Difference PBS + vehicle group statistics. Experimental N: 5, 8, 8, 8, 6, 8, 8, 6, 6, 6 respectively.
  • LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73 and LFQM-74 in the 100 ⁇ M dose open field assay.
  • Figure 87 shows HepG2 cells that were treated with the different compounds (50 ⁇ M) for 3h. There was a reduction in IDN in the experimental conditions tested indicating that the compounds exerted cytostatic activity on HepG2 cells.
  • DMSO negative control.
  • Doxorubicin (DXR) positive control. * Significant difference (p ⁇ 0.05) compared to the control.
  • Figure 88 shows HepG2 cells that were treated with the different compounds (20 ⁇ M) for 3h. There was no significant difference in IDN.
  • DMSO negative control.
  • Figure 89 shows the frequency of micronuclei evaluated in HepG2 cell cultures treated with the different compounds at 20 ⁇ for 3h according to the criteria proposed by Fenech, 2000. There was a significant increase (p ⁇ 0.05) in the frequency of MNs. in cultures treated with the compounds LFQM-57, LFQM-67 and LFQM-75.
  • DMSO negative control.
  • Doxorubicin (DXR) positive control.
  • the present invention provides a compound according to formula I:
  • R 1 is selected from the group consisting of: OH, CH 3 CHOO, oxyalkyl, oxyaryl and carbamoyl;
  • R 2 is chosen from the group consisting of: H, Br, Cl, NO 2, OMe, 3-pyrrolidinyl, F, NH 2, 4-morpholinyl, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc, triazolyl, aminoalkyl, aminoaryl, 0-alkyl , aryl, carbamoyl, NHCO-alkyl, and NHCO-aryl.
  • the compound is according to formula I, wherein R 1 is selected from the group consisting of: OH or AcO; and R2 is selected from the group consisting of: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pyrrolidinyl, F, NH 2, 4-morfolil, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc.
  • the compound is according to formula II:
  • R 1 is selected from the group consisting of: OH, CH 3 CHOO, oxyalkyl, oxyaryl and carbamoyl;
  • R 2 is chosen from the group consisting of: H, Br, Cl, NO 2, OMe, 3-pyrrolidinyl, F, NH 2, 4-morpholinyl, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc, triazolyl, aminoalkyl, aminoaryl, 0-alkyl , aryl, carbamoyl, NHCO-alkyl, and NHCO-aryl.
  • the compound is according to formula II, wherein R 1 is selected from the group consisting of: OH or AcO; and R2 is selected from the group consisting of: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pyrrolidinyl, F, NH 2, 4-morfolil, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc.
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VI, formula VII, formula IV, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides a compound synthesis process as defined above comprising the steps:
  • the process further comprises step f) reacting acetylation with acetic anhydride and 4- (N, N-dimethylamino) pyridine (4-DMAP).
  • step a) occurs at reflux for a time ranging from 20 minutes to 60 minutes.
  • step a) takes place over a time period of 40 minutes.
  • step b) occurs within a time range of 5 minutes to 20 minutes.
  • step b) takes place over a time period of 10 minutes.
  • step d) occurs in the presence of refluxing alcohol within a time range of 1 hour to 5 hours.
  • the alcohol is ethanol.
  • the time interval is 3 hours.
  • the R2-substituted benzaldehyde of step e) is an R2-substituted benzaldehyde wherein R2 is selected from the group consisting of: H, Br, Cl, NO2, OMe, 3-pyrrolidinyl, F, 3 4-morpholyl, 4-piperidinyl, imidazole, SMe, OAc.
  • step e) occurs within a time range of 1 hour to 24 hours.
  • the present invention features a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and the compound as defined above.
  • said compound is present in the composition in a ratio of 0.01% w / w to 95% w / w.
  • the present invention provides the use of the compound defined above for the manufacture of a composition for the curative or prophylactic treatment of neurodegenerative disease, which may be: Alzheimer's disease, Huntington's disease, Amnesia, Nervous depression, Disorder obsessive compulsive disorder and / or amyotrophic lateral sclerosis.
  • neurodegenerative disease which may be: Alzheimer's disease, Huntington's disease, Amnesia, Nervous depression, Disorder obsessive compulsive disorder and / or amyotrophic lateral sclerosis.
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VI, formula VII, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides the use of the compound defined above for the manufacture of a composition for the curative or prophylactic treatment of inflammations.
  • the compound is according to formula IV, formula VI, formula VII, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides the use of compound as defined above for the manufacture of an antiinflammatory and anticholinesterase composition.
  • the antiinflammatory and anticholinesterase composition is useful for the curative or prophylactic treatment of neurodegenerative disease chosen from the group consisting of: Alzheimer's disease, Huntington's disease, amnesia, nervous depression, obsessive compulsive disorder and / or amyotrophic lateral sclerosis.
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VI, formula VII, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides an oral dosage form comprising at least a compound or a pharmaceutically acceptable salt of said compound as defined in the present application and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the compound or pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount ranging from 0.0001 wt% to 99 wt%.
  • the compound or pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount ranging from 0.001 wt% to 99 wt%.
  • the compound or pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount ranging from 0.01 wt% to 50 wt%.
  • the compound or pharmaceutically acceptable salt thereof is present in an amount ranging from 0.1 wt% to 20 wt%.
  • the compound is in a dosage ranging from 1 ng to 5 g.
  • the compound is in a dosage ranging from 1 ⁇ g to 1g.
  • the oral dosage form is solid or liquid.
  • the oral dosage form is solid.
  • the present invention provides a method of treating neurodegenerative disease comprising administering a previously defined compound to a prone individual or carrier of neurodegenerative disease at a dose regimen ranging from 1 pmol / kg mass. body weight and 1 mol / kg body mass of the individual.
  • the dose regimen ranges from 1 pmol / kg of individual body mass to 1 mmol / kg of individual body mass.
  • the dose regimen ranges from 1 nmol / kg individual body mass to 900 ⁇ / kg individual body mass.
  • the dose regimen ranges from 1 nmol / kg of the subject to 900 nmol / kg of the subject.
  • the dose regimen ranging from 1 nmol / kg of the subject to 600 nmol / kg of the subject.
  • the dose regimen ranging from 1 nmol / kg of the subject to 300 nmol / kg of the subject.
  • the dose regimen is from 1 nmol / kg of the subject to 100 nmol / kg of the subject.
  • the dose regimen ranging from 1 nmol / kg of the subject to 20 nmol / kg of the subject.
  • the dose regimen ranging from 1 ⁇ / kg of the individual to 900 ⁇ / kg of the individual.
  • the dose regimen ranging from 1 ⁇ / kg of the individual to 600 ⁇ / kg of the individual.
  • the dose regimen ranging from 1 ⁇ / kg of the individual to 300 ⁇ / kg of the individual. [0185] In one embodiment, the dose regimen ranging from 1 ⁇ / kg of the individual to 100 ⁇ / kg of the individual.
  • the dose regimen ranging from 1 ⁇ / kg of the individual to 20 ⁇ / kg of the individual.
  • the dose administered is
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides a method of treating inflammation comprising administering compound as defined above to an individual prone to or afflicted with inflammation, at a dose regimen ranging from ⁇ / kg to the subject and 30 ° C mol / kg of the subject.
  • the dose administered is
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VI, formula VII, formula VIII or formula IX:
  • the present invention provides a method of inhibiting the acetylcholinesterase enzyme comprising contacting a compound as defined above with the acetylcholinesterase enzyme.
  • the compound is according to formula III, formula IV, formula V, formula VIII or formula IX:
  • chlorinated solvent should be understood as any type of solvent suitable for organic reactions such as carbon tetrachloride, chloroform, dichloromethane, among others.
  • non-chlorinated solvent should be understood as solvents comprising acetonitrile, ethers and toluenes, dimethylformamide, among others.
  • halogen group transfer compound should be understood as any reagent having the function of performing halogen group transfer.
  • Non-limiting examples of halogen group transfer compounds include oxalyl chloride, thionyl chloride, PCls, PCI3, PBrs, PBr3, among others.
  • primary, secondary or tertiary alcohol comprises alcohols such as methanol, ethanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol, pentanol, isopentanol, among others.
  • Lewis acids comprise acids such as zinc chloride (Z11Cl2), aluminum chloride (AlCl3), iron (III) chloride, among others.
  • Example 1 Process of synthesis and characterization of obtained compounds
  • a new series of donepezil analog derivatives designed by molecular hybridization with the prototype LASSBio-767 and anti-inflammatory arylhydrazonic alkaloid derivatives, synthesized with the donepezil W-benzyl-piperidin subunit and a W spacer subunit, has been synthesized.
  • -acylidrazone described as an important anti-inflammatory biophor.
  • the variation of the benzyl nucleus substitutes aimed to provide important structure-activity relationship information, in a probable double or symbiotic profile of the new molecules, which could act as anticholinesterase and anti-inflammatory agents, being both the mechanism of action. as the structural pattern, unpublished in the literature ( Figure 1).
  • a reductive amination reaction between (12) and (13) in the presence of NaBH3CN / ZnCl2 / MeOH could provide the N-benzylpiperidine ester (11), which under reaction with hydrazine monohydrate would yield hydrazide ( 10), key intermediary in the proposed synthetic route.
  • Hydrazide (10) when reacting with a series of substituted benzaldehydes (9) should generate the target N-acylhydrazones series, with different substituents on the aromatic ring of the N-acylhydrazonyl benzyl subunit.
  • the reductive amination technique used was the preparation of a methanolic solution of ester (13) with amine (12).
  • NaBHsCN and anhydrous ZnCl2 in MeOH were stirred. Both solutions were kept under stirring under N 2 atmosphere. After 1h, the two solutions were transferred to a single reaction flask, maintaining temperature, stirring and atmosphere until complete conversion of the starting ester.
  • Methyl 4- ((3-hydroxypiperid-1-yl) methyl) benzoate (11) was purified by column chromatography and characterized by IR, 1 H NMR, 13 C and mass spectrometry.
  • N-benzylpiperidine (11) was then converted to hydrazide (10), a key intermediate in the proposed synthetic route to the target series via hydrazinolysis reaction with hydrazine monohydrate (NH2NH2). H 2 O) in ethanol and under reflux.
  • hydrazide (10) was coupled with a series of commercially functionalized benzaldehydes (9) in ethanol under HC1103 catalysis to generate the respective 3-hydroxy- (W-benzyl) - target piperidinylacylhydrazones in 15-96% yields
  • Nuclear magnetic resonance (NMR) analyzes are still being performed at external collaborating institutions (UFRRJ and UFMG) and not all Spectra are available. On the other hand, all series 7 and 8 substances were characterized by infrared and high resolution mass spectrometry.
  • LFQM u OH-54 has bands at 3410 cm @ 1, u NH at 3172 cm-1, u 2 CH sp at 3034 cm -1, u s CH 3 in SP 2827 cm -1, the u
  • LFQM-68 can verify the presence of the following bands: NH at 3232 cm @ u 1, u 2 CH sp in 3053 cc 1, mares CH 3 in 2943 cc sp 1, sp u s CH 3 in 2798 cm @ 1.
  • LFQM-73 the following bands can be found: u Primary amine NH at 3446 and 3350 cnr 1 , u Secondary amine N-H at 3217 cnr 1 , u CH sp 2 at 3032 cnr 1 , u as CH sp 3 at 2943 cm -1 , us CH sp 3 at 2802 cm -1 .
  • the new object recognition task was conducted in a circular arena (40 cm diameter x 30 cm height) with black background and walls and in a dim environment. For 3 consecutive days the animals were acclimatized to the experimental conditions, placing them in the arena for free exploration of the environment by a period of 10 min each day. On the fourth day, the training session and the test session were held. In the training session, the animals were again placed in the arena for a period of 10 min in the presence of two identical objects.
  • Exploratory behavior was defined as the act of smelling or touching the object with the muzzle or the front paws and the exploration time was recorded.
  • the test session was performed with animals placed in contact with a familiar object and a new object and, again, the exploration time of the objects was recorded over a period of 5 minutes.
  • the objects were made of the same material, had the same texture, similar sizes, but different shapes and colors. Both the identity of the new object and its position in the arena were randomized. They were properly cleaned with 10% ethanol between sessions to avoid the influence of olfactory cues. The following parameters were evaluated: 1) total exploration time of the objects in the training and test sessions (s); 2) distance traveled by animals inside the arena during training and testing sessions (cm); 3) percentage exploration time of the familiar object and the new object in the test session.
  • Figure 69A shows the results of the object recognition test for animals treated with test and saline only.
  • the control group saline treatment only
  • t 4.405; P ⁇ 0.001
  • Figure 69B demonstrates the effect of test substances on scopolamine-induced amnesia in animals.
  • LFQM-88 failed to reverse cholinergic amnesia.
  • Figure 70 shows the total distance traveled (in cm) by animals inside the arena in training and testing sessions. We can observe that the test substances do not alter the animals' locomotion in any of the sessions (neither in training, neither in the test). This data corroborates data previously reported by the group for LFQM-56 and LFQM-67 in the open field model. However, a significant increase in locomotion was detected in animals treated with scopolamine. This effect is already reported in the literature for this drug and may be related to blockade of muscarinic receptors in the striatum region.
  • the hyperlocomotor effect of scopolamine is not inhibited by pretreatment with LFQM-56 and LFQM-88.
  • LFQM-57 and LFQM-67 cause partial inhibition of the hyperlocomotor effect of scopolamine, as there is no significant difference in displacement compared with the negative control (SAL + SAL) or the positive control (SAL + scopolamine).
  • LFQM-75 has a more complex profile, partially reversing hyperlocomotion only in the training session, not in the test session.
  • This experimental model revealed the substances LFQM-56, LFQM-65, LFQM-66, LFQM-67, LFQM-68, LFQM-73, LFQM-74, LFQM-75, LFQM-76, LFQM-83 and LFQM -84 with the best anti-inflammatory profile, being able to decrease the hypernociception intensity of mice in a comparable or better way than indomethacin.
  • the substances with the best activity profile were then submitted to the formalin-induced hyperalgesia assay to evaluate the analgesic properties associated with the anti-inflammatory effect.
  • a formalin solution received intraplantar administration of a formalin solution and exhibited spontaneous nociceptive behavior recognized and quantified by observing the amount of licking in the injured paw.
  • This assay is characterized by two distinct evaluation phases: a first phase, called a neurogenic or early phase, which comprises the first 5 minutes and is associated with peripheral nociceptor excitation before the inflammatory response is initiated.
  • a second phase during 10-15 minutes, the central sensitization response of the animals to the painful sensation, mediated by cytokines and chemokines derived from the tissue inflammatory process, is evaluated, being, therefore, the phase that best represents the anti-inflammatory evaluation of substances. of interest.
  • Inflammation is known to be the consequence of the body's response to physical damage, infection or antigenic stimulation, in which local accumulation of fluid, plasma proteins, and cells of the immune system generally occurs. Although complex, the inflammatory response is triggered mainly by the action of proinflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor-a (TNF-a), interleukin-6 and interleukin-ip.
  • TNF-a tumor necrosis factor-a
  • interleukin-6 interleukin-6
  • interleukin-ip interleukin-ip.
  • the macrophage is the main cell responsible for the synthesis of these cytokines in many tissues, which occurs after the recognition of immunogenic substances by intra or extracellular receptors. Many types of endogenous or microorganism substances can activate these receptors, known as the pattern recognition receptor, triggering the activation of a series of intracellular cascades, which ultimately lead to activation of transcription factors.
  • NF-kB nuclear transcription factor-kB
  • REL nuclear transcription factor-kB
  • RELA RelA / p65
  • RELB RelB
  • p50 / p05 NFKB1
  • p52 / pl00 NFKB2
  • NF-kB NF-kB enters the nucleus and promotes expression of various genes, including proinflammatory cytokines, cyclooxygenase and selectins.
  • the compounds LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65 and LFQM-67 have shown active activity. anti-inflammatory in in vivo models of carrageenan-induced inflammation. Given the importance of NF-kB in inducing and maintaining the inflammatory process, the effect of compounds on NF-kB activation was investigated in RAW 264.7 macrophages in vitro.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Cerebral malaria is the major complication of Plasmodium falciparum infection.
  • the pathophysiology of the disease is associated with the adhesion of parasitized red blood cells to the cerebral endothelium, leading to its activation.
  • cellular events such as leukocyte activation and migration to the site, production of proinflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , INF- ⁇ , IL-6, IL-12 as well as chemokines such as MCP- 1, RANTES, IL-8) and vascular (increased adhesion molecule expression and vascular permeability) are triggered.
  • phagocytic cells produce reactive species of oxygen and nitrogen (ROS / NOS) for infection control.
  • ROS / NOS reactive species of oxygen and nitrogen
  • the imbalance of this response may lead to blood vessel obstruction, hypoxia and hemorrhage, characteristic of cerebral malaria.
  • glial cells are activated, corroborating production of proinflammatory cytokines and ROS / NOS, generating a neuroinflammatory process analogous to many neurodegenerative diseases with Alzheimer's disease.
  • oxidative stress may be considered a marker of cerebral dysfunction associated with cerebral malaria and may be assessed by lipid peroxidation (such as the formation of by-products as malondialdehyde), proteins or DNA.
  • lipid peroxidation such as the formation of by-products as malondialdehyde
  • proteins or DNA In order not to exacerbate the production of ROS, which is also harmful to cells and tissues, the body uses the glutathione system that is capable of detoxifying free radicals. However, when the latter are in excess, system consumption occurs, which experimentally can be detected in colorimetric reaction by the use of Ellman's reagent (DTNB).
  • DTNB Ellman's reagent
  • granulocyte activation is marked by the enzyme myeloperoxidase present in neutrophil granules.
  • the substances LFQM-56, LFQM-57 and LFQM-67 were evaluated at doses of 1, 5 and 10 ⁇ , with treatment performed between days 3 and 6 after oral infection.
  • This animal model was performed under conditions similar to that described for the scopolamine-induced amnesia reversal model for the treatment and setting of the animals.
  • Abeta protein was dissolved as per manufacturer specification at a concentration of 6mg / mL in deionized water. Subsequently, it was dissolved in sterile PBS at a concentration of 3mg / mL and placed for 48h in a 37 ° C oven for protein activation. On the day of the experiment, the already activated protein was redissolved in sterile PBS to the concentration of 400pmol.
  • the CAI region of the hippocampus was identified and with the aid of a drill, the skullcap was pierced and the needle inserted in the correct position for the injection of protein Abeta or PBS ( coordinates from the bregma). After injection of 500 nL of Abeta or PBS the surgery site was sutured and the animals returned to their boxes where they remained in artificial heating until the end of the anesthetic effect. To avoid dehydration, the animals received a saline support.
  • Pretest On the sixth day, the animals were again exposed to the box for 10 minutes; but this time in the presence of two exactly the same objects. After exposure, the animals returned to their boxes. This is the so-called pretest where animals have contact with objects and acquire the memory of objects that on the 7th day (test) will be old and will not represent novelty in behavioral conditions in which the mnemonic process is intact.
  • Test 24 hours after the pretest, the animals are again exposed to the box. However this time one of the old objects (exposed to the animals in the pretest) was replaced by a completely new object for the animal. This procedure evaluates the long-term memory of animals closely related to hippocampal function, injection site of Abeta protein. Animals are left in the box for 5 minutes to interact with objects (new and old) ( Figure 86).
  • the recognition index is calculated by the following formula:
  • Animals with mnemonic deficits have a recognition rate of less than 65%.
  • Figures 88 and 89 show the same model assessment data for the substances LFQM-88 (at doses of 50 and 100 pM), LFQM-75 (100 pM) and LFQM-57 (100 pM). Again, all demonstrated the same anti-amyloid profile previously observed for LFQM-56 and LFQM-67, apparently without compromising the locomotor pattern.
  • Figure 85 shows the results obtained with animals that survived stereotactic surgery, following the initial protocol, with administration of test substances before the surgical procedure.
  • Cytotoxicity was assessed by cell viability in the MTT test which is a test used to assess fast and objective cell viability based on a colorimetric reaction.
  • the MTT Salt (3- (4,5-Dimethylazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) enters the viable cell mitochondria and is cleaved by the enzyme succinate dehydrogenase, producing dark blue formazan crystals. The amount of crystals formed is directly proportional to the number of viable cells. Thus, the darker the staining at the end of the reaction, the greater the cell viability.
  • the cell suspension of normal monocytes obtained from human blood at a concentration of 2.4x10 6 cells / mL was distributed in a 96-well plate, 90 pL per well, and incubated at 37 ° C in a 5% incubator. CO2 together with another 10 pL of the test sample.
  • concentrations 100; 62.5; 31.2; 15.6; 7.8; 3.9; 1.95; 0.48; 0.24; 0.06 pg / mL
  • CC50 and CC90 values cytotoxic concentration for 50% and 90% of cells, respectively.
  • Table 4 shows the data obtained from the cell viability assay, which indicated that the most active substances in the series appear to be low. cytotoxic.
  • Substance LFQM-56 is the most cytotoxic with a CC50 (cytotoxic concentration for 50% of cells) of 197.4 pmol / L.
  • CC50 cytotoxic concentration for 50% of cells
  • the LFQM-56 IC50 for AChE inhibition is 25.9 pM, approximately 8 times lower than its cytotoxic dose.
  • Table 4 Human blood monocyte cytotoxicity assessment data for LFQM-56, LFQM-57, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-
  • Cytokines is-blocked micronucleus using cells derived from human hepatocellular carcinoma (HepG2). This model has been extensively studied to evaluate the genotoxic activity of different compounds including drug prototypes. HepG2 cells maintain the activity of enzymes related to biotransformation, which play an important role in the activation of carcinogens and genotoxic agents.
  • Micronuclei appear at the end of the cell division process and consist of either acenic chromosomal fragments (clastrogenic effect) or whole chromosomes (aneugenic effect) that have been excluded from the main nucleus due to chromosomal breaks or alterations, respectively. in the mitotic apparatus. Therefore, the micronucleus test represents one of the methodological approaches commonly employed in genotoxicity studies.
  • HepG2 cells were seeded in plaques of
  • This method allows the enrichment of binucleated cells in the culture, which are used to determine the frequency of MNs.
  • the cells were collected by enzymatic digestion (trypsin / EDTA), centrifuged at 800 rpm, immersed in hypotonic solution (1% sodium citrate at 4 ° C) and fixed in methanol / acetic acid (3: 1). Cytological preparations were made using previously cleaned slides which were immersed in distilled water at 4 ° C. After drying, the slides were stained with Giemsa (1:20 in phosphate buffer) for 10 minutes. The analysis was performed under light microscope (400x magnification) and the data presented represent the average of 3 samples per treatment.
  • IDN nuclear division index
  • IDN nuclear division index
  • ADME parameters as well as some chemical and physicochemical data were predicted in silico using the QikProp v. 3.5, developed by the Schrodinger Company.

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Abstract

A presente invenção descreve um novo composto, seu processo de síntese e os usos deste composto, bem como uma composição farmacêutica contendo o referido composto. Especificamente, a presente invenção revela um composto de acordo com a fórmula (I) : seu processo de síntese e composições compreendendo o referido composto. Adicionalmente, a presente invenção também descreve o uso do composto para fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doenças neurodegenerativas, de inflamações, além de composições anticolinesterásicas. Ainda, a presente invenção descreve métodos de tratamento envolvendo a administração do referido composto.

Description

COMPOSTO, PROCESSO DE SÍNTESE DO COMPOSTO, USO, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE INFLAMAÇÕES OU DE DOENÇA NEURODEGENERATIVA, FORMA DE DOSAGEM ORAL E MÉTODO DE
INIBIÇÃO DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE
Campo da Invenção
[0001] A presente invenção se situa nos campos da
Química Farmacêutica e da Farmacologia. Mais especificamente, a presente invenção descreve um novo composto, seu processo de síntese e os usos deste composto e uma composição farmacêutica contendo o referido composto. Antecedentes da Invenção
[0002] A forma de demência mais comum em pessoas acima de 65 anos é a doença de Alzheimer (DA)1. A DA é um processo neurodegenerativo progressivo e está relacionada com um conjunto de fatores fisiopatológicos tais como a idade, o surgimento de depósitos de placas senis (agregados da proteína p-amiloide) e de emaranhados neurofibrilares no cérebro, perda de neurónios colinérgicos , principalmente da acetilcolina (ACh) 4 e da instalação de um processo neuro- inflamatório .
[0003] O paciente com DA sofre com uma série de sintomas que estão relacionados com a perda de neurónios colinérgicos no sistema nervoso central (SNC) , tais como a diminuição progressiva da memória e das habilidades cognitivas, desorientação, falta de atenção, comprometimento da aptidão linguística e depressão5 ' 6.
[0004] Estima-se que 35,6 milhões de pessoas no mundo sofrem da DA e que no Brasil existem cerca de 1,2 milhão de portadores. Devido ao envelhecimento da população global, espera-se que esses números aumentem acentuadamente, sendo estimado que em 2030 sejam 65,7 milhões e, em 2050, 115,4 milhões de portadores da DA. Espera-se também que dois terços dessa população sejam de países em desenvolvimento. 7
[0005] Ao comparar os dados dos censos demográficos de 1960 a 2010, o número de pessoas com idade superior a 60 anos praticamente triplicou ao longo desses 50 anos e, atualmente, representa 10,8% da população brasileira, totalizando 20,5 milhões de pessoas.8 No mundo, segundo o Fundo de População das Nações Unidas (UNFPA, na sigla em inglês), espera-se que a população de pessoas acima de 60 anos aumente em 200 milhões nos próximos 10 anos e, em 2050, serão 2 bilhões de idosos representando 20% da população mundial.9 A idade é o principal fator de risco da DA, uma vez que na maioria das pessoas os sintomas aparecem após os 60 anos. A proporção de idosos entre os 65 e 74 anos de idade com DA é de 5% e quase a metade das pessoas com 85 anos ou mais são portadoras da doença.10
Aspectos fisiopatológicos e formas de tratamento da DA
[0006] O envelhecimento cerebral e a perda localizada de neurónios, principalmente do hipocampo e do pró-encéfalo basal, estão diretamente relacionados com a DA.11 Histopatologicamente a DA caracteriza-se pelo depósito extraneuronal de placas senis e depósito intraneuronal de emaranhados neurofibrilares , acompanhada por morte massiva de neurónios.12 O principal componente das placas senis é o peptídeo p-amiloide (βΑ) 13-14 e é o produzido pela ação de endoproteases (secretases) da membrana glicoprotéica, a partir da proteína precursora amilóide (APP) , codificada por um gene presente no cromossomo 21.15-17 Fragmentos do βΑ formam agregados fibrilares não-covalentes que depositam-se no tecido neuronal e estão relacionados à neurotoxicidade da DA.18-20 As secretases são enzimas responsáveis pelo processo proteolitico normal da APP, levando à formação de fragmentos βΑ e, dependendo do sitio de proteólise, são classificadas em a-, p- e Y- secretases. As a-secretases são, provavelmente, fixadas na membrana plasmática e clivam a APP entre os resíduos 16 e 17 da sequencia do βΑ, gerando fragmentos extracelulares solúveis conhecidos como sAPPa, que são normalmente fagocitados pelas micróglias e eliminados. Portanto, a quebra da APP por a-secretases inibe a formação de depósitos de βΑ e constitui a maior rota fisiológica de quebra da APP.18-22 Por outro lado, quando a proteólise da APP ocorre por ação de p e Y-secretases, entre os resíduos de aminoácidos 596-597 e 637-639, respectivamente, ocorre a liberação de fragmentos insolúveis de βΑ.22 ' 23 A APP pode ser quebrada pelas y- secretases em quatro posições diferentes, originando peptídeos βΑ que variam de 39 a 43 resíduos de aminoácidos, sendo o resíduo βΑι-40 formado ma oritariamente . Resíduos βΑι-42 e βΑι-43 são minoritários, porém são as espécies mais encontradas em placas cerebrais24 e estão relacionados à progressão da DA.
25
[0007] A função da proteína Tau é estabilizar os microtúbulos dos axônios, estruturas responsáveis pela formação e manutenção dos contatos interneuronais . Ao se acumular intracelularmente, devido a um processo de hiperfosforilação de origem pouco esclarecida, a proteína Tau gera os emaranhados neurofibrilares .26
[0008] Vários estudos demostraram que a DA está relacionada com a redução de neurotransmissores como dopamina, serotonina, noradrenalina, glutamato, substância P e principalmente da acetilcolina (ACh) . O déficit colinérgico pode ser retardado ou amenizado pela inibição parcial da atividade da acetilcolinesterase (AChE) , estratégia conhecida como "Hipótese colinégica", que inspirou os fármacos disponíveis atualmente para o tratamento da DA, além de outros em estágios pré-clínicos . Entretanto, estes fármacos atuam no restabelecimento da função colinérgica, aliviando os sintomas e retardando a evolução da doença, garantindo assim, uma melhor qualidade de vida ao paciente, porém, sem oferecer a cura efetiva.25
[0009] Atualmente existem também muitas pesquisas na busca por novos fármacos que abordam a "Hipótese Amilóide", que é baseada na intervenção da formação dos fragmentos insolúveis de p-amiloide e, assim, na formação e deposição das placas amiloides.25
Inibidores de AChE e o arsenal terapêutico disponível ao tratamento da DA
[0010] A maioria das novas entidades químicas (NEQs) desenvolvidas para o tratamento da DA atua inibindo a atividade da enzima AChE, responsável pela hidrólise de acetilcolina (ACh) em colina e acetato. 27<28
[0011] Os inibidores de acetilcolinesterase (IAChEs) são classificados de acordo com a estrutura e com o mecanismo de ação em:
•Irreversíveis: possuem ligantes que interagem de maneira reversível com a enzima, em uma região próxima ao sítio catalítico;
• Pseudo-irreversíveis : incluem a classe dos carbamatos que formam um complexo carbamoilante com um resíduo de serina na tríade catalítica da AChE e possuem como protótipo a fisostigmina, produto natural cu a estrutura básica levou ao desenvolvimento da rivastigmina;
•Reversíveis: possuem ligantes que interagem de maneira reversível com a enzima, em uma região próxima ao sítio catalítico, como acontece, por exemplo, com as aminoacridinas (p.e. tacrina) , alguns alcalóides (p.e. galantamina) e as W-benzilpiperidinas (p.e. donepezil) ,29
[0012] O primeiro fármaco comercial para o tratamento da DA foi a tacrina (THA, Cognex®, 1), aprovada em 1993. Seu mecanismo de ação está baseado na inibição tanto da AChE como da butirilcolinesterase (BuChE) , efetiva em pacientes com DA de intensidade leve a moderada. Entretanto, após pouco tempo de comercialização, teve seu uso restrito em alguns países devido a sua toxicidade hepática e baixa biodisponibilidade, sendo recomendada apenas para pacientes que não respondem ou toleram os demais medicamentos disponíveis. Apesar disso, sua estrutura tem sido amplamente utilizada no planejamento de muitos outros análogos ativos, com diferentes índices de seletividade e menor toxicidade, a exemplo das huprinas, bis- tacrinas, tacripirinas dentre outros derivados de estrutura híbrida. 30~54
[0013] Atualmente, existem somente 4 fármacos aprovados e disponíveis comercialmente para o tratamento da DA: donepezil (Aricept®) , rivastigmina (Exelon®) , galantamina (Reminyl®) e memantina (Namenda®) .
[0014] A galantamina é um produto natural que atua como agonista de receptores nicotínicos e tem sido bastante estudada como protótipo para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos anticolinesterásicos .55 Seu efeito terapêutico é consequência de um mecanismo de ação duplo: inibindo a AChE e modulando o receptor nicotinico pré- sináptico, promovendo assim uma maior liberação de ACh na fenda sináptica.56
[0015] A rivastigmina é um inibidor reversível de colinesterases , planejado por modificação estrutural da fisostigmina, capaz de inibir tanto a AChE como a BuChE . Sua utilização é indicada para o tratamento dos estágios leve a moderado da DA. Também é prescrita na terapêutica da doença de Parkinson (DP) , sendo que seu uso oral para a DA foi aprovado 2000 e, somente em 2006, para o tratamento da DP .57~
58
[0016] Dentre os fármacos disponíveis atualmente, a memantina (5) foi o último fármaco aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) em 2006, sendo também o único que não atua na inibição da AChE. A memantina atua como antagonista de receptores de glutamato do tipo W-metil-D- aspartato (NMDA) , evitando um influxo excessivo de cálcio (Ca2+) .59 Nas sinapses, após o estímulo do neurônio pré- sináptico, ocorre a liberação de glutamato, que liga-se aos receptores NMDA e estimula a entrada de íons de Ca2+ no citoplasma do neurônio. O influxo de Ca2+ induz a produção de nNOS (NO sintase neuronal) que, por sua vez, leva à liberação de óxido nítrico (NO) nos neurónios pós- sinápticos, funcionando como mensageiro para a pré-sinapse e reiniciando todo o processo.60 Devido ao seu mecanismo de ação diferenciado, evitando a liberação excessiva de glutamato, que em altas concentrações torna-se excitotóxico e leva à morte neuronal, a memantina vem sendo indicada para os casos de evolução moderada a severa da DA.61-63 [0017] O donepezil (6), também conhecido como E2020, surgiu no final da década de 80 como um inibidor reversível e não-competitivo da AChE, 55, 64-66 sendo o segundo fármaco aprovado pelo FDA (1996) e que rapidamente ganhou destaque por ser muito menos tóxico que a tacrina, sendo também 1250 vezes mais seletivo para AChE do que para BuChE .64-66 Vários estudos computacionais e de mecanismo de ação apontam que a seletividade deste fármaco é decorrente das subunidades N- benzilpiperidina e indanona, que conferem maior afinidade e especificidade para AChE.66 Quanto aos aspectos farmacodinâmicos , o donepezil atua na inibição da AChE, aumentando a disponibilidade de ACh intra-sináptica64, com poucos efeitos colaterais, a maioria de natureza colinérgica e de caráter transitório como náuseas, vómitos e tremores.68 ' 69 Quanto aos aspectos farmacocinéticos o donepezil apresenta uma absorção linear, atingindo a concentração plasmática máxima em 3-5 horas após a administração, sem influência da alimentação.64 ' 69 Além disso, o donepezil demonstra boa transposição da barreira hematoencefálica, atingindo concentração cerebral cerca de 7 vezes maior que no plasma, sendo, portanto, considerado um inibidor de ação central.66 O donepezil é largamente metabolizado no fígado e a sua via principal de excreção, juntamente com seus metabólitos, é a renal, o que exige cautela na administração em pacientes com insuficiência renal e hepática .55 ' 64-67 Estudos controlados duplo-cego, com mais de 1000 pacientes, revelaram que o uso de donepezil resultou em significativa melhora na memória, concentração, linguagem e raciocínio, sem sinais de toxicidade hepática.60 Em virtude do perfil farmacocinético e de sua menor toxicidade em relação aos demais inibidores de AChE, o donepezil vem sendo utilizado como fármaco de primeira escolha no tratamento de pacientes com DA.69 ' 70
As enzimas butirilcolinesterase (BuCHE ) e acetilcolinesterase (AChE) como alvos contra a DA
[0018] A BuChE, também conhecida como colinesterase sérica ou acilcolina- acilidrolase, está presente principalmente nas células gliais, no tecido endotelial e nos neurónios. Juntamente com a AChE, a BuChE é responsável pela modulação dos níveis de acetilcolina e, portanto, também é um alvo terapêutico compatível com a hipótese colinérgica, a principal estratégia terapêutica para o tratamento da DA.71 ' 72 Dentre os fármacos comerciais, apenas a tacrina (1) e a rivastigmina (3) inibem concomitantemente a AChE e a BuChE. As cinéticas de hidrólise da ACh por estas duas enzimas são distintas, variando de acordo com a concentração disponível do substrato. Assim sendo, em condições onde a concentração de ACh é baixa, a BuChE é menos eficiente. Por outro lado, altas concentrações de ACh levam à inibição da AChE, tornando a BuChE mais eficiente no processo de hidrólise. Este comportamento diferenciado vem sendo explorado racionalmente no planejamento e desenvolvimento de novos inibidores seletivos, uma vez que a inibição da BuChE é considerada uma via terapêutica útil e eficaz na manutenção dos níveis colinérgicos em pacientes em que atividade da AChE esteja suprimida.72
[0019] A alta reatividade e sua eficiência catalítica da AChE frente a inúmeros inibidores covalentes e não-covalentes parece originar-se da arquitetura singular do sítio ativo, constituído por uma tríade de aminoácidos, Glu-327, Ser-200 e His-440 para a AChE de Torpedo californica (TcAChE) . 73-75 A existência de dois gargalos de profundidades distintas, que se estendem por meio caminho da enzima e contêm o sitio catalítico a 4 Á de sua base foram reveladas pela análise das estruturas de AChE por raio-x. Além do sítio catalítico, vários resíduos de aminoácidos auxiliares, como o Trp-84, que interage com um grupo quaternário da ACh e o Trp-279,76 localizado na abertura do gargalo que dá acesso ao sítio catalítico, estão sendo considerados como sítios de interação adicional no planejamento de novos inibidores de AChE.76 ' 77 A inibição direta do sítio ativo impede a ligação da molécula substrato ou sua hidrólise por ocupação do sítio com uma afinidade alta (a exemplo da tacrina) ou por uma reação irreversível com a serina catalítica, mecanismo pelo qual agem os inseticidas organofosforados e carbamatos .70
[0020] Além da tríade catalítica, vários sub-sítios funcionais periféricos foram identificados. Um sítio aniônico periférico está localizado próximo da superfície da enzima, acima do acesso ao sítio catalítico, no qual o resíduo de Trp-286 exerce função particular como sítio de ligação com a subunidade amónio quaternária da ACh; uma cavidade acílica de ligação, que na AChE humana (huAChE) é constituída por resíduos Gly-122, Trp-236, Phe-295, Phe-297 e Phe-338, é responsável pelo reconhecimento e interação com a subunidade acetila da ACh.75 ' 78-80 Um sub-sítio hidrofóbico, que inclui resíduos Trp-84, Tyr-130, Tyr-330 e Phe-331, que interage por empilhamento de elétrons n (interações do tipo n - n stacking) e/ou apoiares, é responsável pela acomodação da subunidade alcoólica de um intermediário tetraédrico formado antes da liberação de colina no processo de hidrólise.76 A estabilização de subunidades carregadas dos substratos ou outros ligantes do sitio ativo da enzima é mediado por interações do tipo cátion-n .78 ' 81 Ao final do processo de hidrólise da ACh mediado pela AChE, ocorre acetilação do grupo OH de um resíduo de serina (Ser-200) que, posteriormente, sofre hidrólise, recompondo a estrutura enzimática original.75 ' 82 ' 83
Influências do processo neuroinflamatório na instalação e progresso da DA
[0021] A inflamação é o resultado de um conjunto de reações complexas em tecidos vascularizados, em resposta à ação de agentes nocivos responsáveis por injúria ou dano tecidual, manifestando-se por migração celular, ativação de leucócitos e reações sistémicas diversas.55 Este tipo de resposta, recrutamento e migração de células de defesa, pode ocorrer no SNC, caracterizando a neuroinflamação .84
[0022] Em nível crónico, a inflamação cerebral é uma característica da DA visto que as características inflamatórias agudas, tais como rubor, inchaço, calor e dor não estão presentes e estruturas como micróglia, astrócitos e neurónios são os responsáveis pela reação inflamatória. Mediadores inflamatórios como citocinas, interleucina-1 p (IL-1P), IL-6 e TNF-a , bem como leucotrienos , tromboxanos, prostaglandinas , fatores de coagulação, espécies reativas de oxigénio e outros radicais como óxido nítrico, fatores complementares, proteases, inibidores de protease e pentraxinas são produzidos pelas células ativadas pela lesão tecidual. Uma vez que a produção de βΑ representa um estímulo crónico, o sistema imunológico é ativado no sentido de limpar estes produtos potencialmente tóxicos. A hipótese é que a natureza intratável das placas e emaranhados estimula uma reação inflamatória crónica.85 A morte de neurónios adjacentes pode ocorrer por ação das células da glia ativadas cronicamente. A morte neuronal ocorre pela liberação de produtos altamente tóxicos, tais como intermediários reativos de oxigénio, óxido nítrico, enzimas proteolíticas e fatores complementares produzidos por estas células.86
[0023] Recentemente, inúmeros estudos têm sido publicados abordando os benefícios adicionais que poderiam ser alcançados pelo uso de fármacos anti-inflamatórios esteroidais (AIES) e não-esteroidais (AINES) para o tratamento da neuroinflamação ocasionada pelo estresse oxidativo associado ao depósito de fragmentos tóxicos, à produção de substâncias reativas de oxigénio (ROS), espécies reativas de nitrogénio (RNS) e pela formação de radicais livres associados à instalação e progressão da DA.63 ' 86~88
[0024] Estudos epidemiológicos indicam que o uso continuado de AINEs foi capaz de reduzir o risco de desenvolvimento da DA.89 Um possível modo de ação desta classe de fármacos seria a inibição seletiva da COX-2, isoforma induzida expressa de modo elevado no cérebro de pacientes portadores da DA, 90 o que é reforçado por alguns estudos que demonstram que o RNA mensageiro (RNAm) da COX-2 está presente em níveis elevados em áreas cerebrais afetadas pela DA.91 Em várias partes do mundo, estudos clínicos têm sido conduzidos para avaliar o efeito de alguns AINEs como tratamento auxiliar da DA, mas os resultados continuam controversos .
[0025] A hipótese de que a inflamação no tecido cerebral possa contribuir para o desenvolvimento da DA está fundamentada em estudos envolvendo pacientes com artrite reumatóide tratados com AINEs.92-94 A inibição das enzimas COX-1 e COX-2, pelos AINEs pode diminuir significativamente a síntese de prostaglandinas , resultando em supressão do processo inflamatório. Porém, o uso prolongado destes fármacos tradicionais pode levar a distúrbios gastrintestinais .
Fármacos multi-funcionais no tratamento da DA
[0026] A busca de novos candidatos a fármacos para doenças neurodegenerativas tem sido intensa, como é o caso da doença de Alzheimer. Porém, o foco passou a ser os fármacos com ação múltipla, e não mais em um único alvo, uma vez que aliado a esta patologia atua um conjunto de fatores que unidos, como por exemplo, na DA, ocasionam o processo inflamatório, a redução de neurotransmissores , principalmente da acetilcolina, além da exacerbação da produção de radicais livres, estresse oxidativo, deposição de placas senis e neurofibrilas .95
[0027] Com isso, pesquisas recentes estão sendo centradas em candidatos a fármacos de ação múltipla 96 capazes de atuar simultaneamente em mais de um alvo envolvido na fisiopatologia da DA.
[0028] Quando um único medicamento não é suficiente para o tratamento de uma doença, uma das alternativas terapêuticas é a associação de "medicamentos de tratamento múltiplo", também conhecido como coquetéis. Esta abordagem consiste na combinação de dois ou mais fármacos que atuam por diferentes mecanismos terapêuticos. Outra alternativa é o uso de uma "medicação com vários compostos", onde diferentes fármacos estão contidos na formulação de um único medicamento .96
[0029] Partindo desse mesmo pressuposto, novas abordagens estão sendo pesquisadas para um tratamento mais eficaz no caso de doenças neurodegenerativas , como é o caso dos "ligantes direcionados a múltiplos alvos" (LDMAs)96, o que evita o risco de interações entre medicamentos diferentes e facilita o regime terapêutico dos pacientes.
[0030] A estratégia de síntese dos LDMAs está baseada na hibridização de subunidades farmacofóricas de duas ou mais moléculas, e ambas deverão manter a sua capacidade de interagir com seus respectivos alvos simultaneamente, e, desta forma, procurar impedir o avanço da doença pelo bloqueio de múltiplos processos fisiopatológicos .96
[0031] Exemplos recentes da literatura demonstram resultados promissores com novas entidades químicas capazes de atuarem como inibidores de AChE, antioxidantes, quelantes de metais, anti-amiloides, neuroprotetores e inibidores de β- secretase .97' 98
[0032] Para o presente pedido de patente, são utilizadas as seguintes referêcias bibliográficas:
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[0033] Na busca pelo estado da técnica em literaturas cientifica e patentária foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:
[0034] O documento US 2004/0087658 Al revela combinações de fármacos para o tratamento de demências como, por exemplo, a combinação entre um derivado 1- aminociclohexano e um inibidor da acetilcolinesterase . Entretanto, as moléculas reveladas no referido documento US 2004/0087658 Al são distintas daquelas reveladas pela presente invenção.
[0035] O documento WO 99/25363 Al revela a combinação de tetraidropiridinas e inibidores da acetilcolinesterase para o tratamento de demência senil, incluindo Alzheimer. No entanto, tais compostos ou suas combinações reveladas pelo documento WO 99/25363 Al diferem daquelas reveladas na presente invenção.
[0036] O documento WO 2010/019560 Al revela derivados deuterados do donepezil, seus metabólitos e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Entretanto, não se revelam no referido pedido de patente WO 2010/019560 Al as combinações dos compostos da presente invenção. Também não se revela o perfil duplo ( anti-inflamatório e anticolinesterásico ) dos compostos da presente invenção.
[0037] O documento WO 2014/008629 Al revela compostos derivados do fármaco donepezil. Entretanto, não estão revelados no referido pedido de patente WO 2010/019560 Al os compostos da presente invenção ou suas combinações e a característica de perfil duplo ( anti-inflamatório e anticolinesterásico) .
[0038] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que aos olhos dos inventores a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.
[0039] Resta na técnica a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos e novas combinações de fármacos com atividade biológica para o tratamento de doenças neurodegenerativas como, por exemplo, as demências, incluindo-se Alzheimer. Também resta na técnica a necessidade do desenvolvimento de tratamentos mais eficazes para patologias neurodegenerativas . Tendo em vista que as doenças neurodegenerativas muitas vezes são reflexos de um conjunto de fatores, tem-se a necessidade de centrar as pesquisas em candidatos a fármacos de ação múltipla capazes de atuar simultaneamente em mais de um alvo envolvido na fisiopatologia da Doença de Alzheimer (DA) .
Sumário da Invenção
[0040] A presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de um novo composto, planejado por hibridação molecular com o protótipo LASSBio-767 e com derivados alcaloidicos arilidrazônicos , contemplando a subunidade N-benzil piperidinica do fármaco donepezil e uma unidade espaçadora N-acilidrazona . Através de uma análise retrossintética, foi possível estabelecer uma rota de síntese para o referido composto. O referido composto, em diversas concretizações, demonstrou possuir importantes propriedades farmacológicas, podendo atuar como anti-colinesterásico, anti-inflamatório, anti-amilóide, neuroprotetor, além de apresentar adicionalmente perfil múltiplo de ação, contemplando tanto a propriedade de inibir a enzima acetilcolinesterase quanto a propriedade anti-inflamatória . As propriedades farmacológicas e o perfil de ação múltiplo do referido composto são particularmente úteis no tratamento curativo ou profilático de doenças neurodegenerativas.
[0041] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um composto representado pela fórmula I :
Figure imgf000025_0001
em que
RI é escolhido do grupo que consiste de: OH, CH3CHOO, oxialquila, oxiarila e carbamoila; e
R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, NO2,
OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolinil , 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc, triazolila, aminoalquila, aminoarila, 0- alquila, arila, carbamoila, NHCO-alquila, e NHCO-arila.
[0042] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um processo de síntese do composto representado pela fórmula I, que compreende as seguintes etapas:
a) reação de esterificação do ácido 4-formil-benzóico (ou 4-carboxibenzaldeído ) em solvente clorado ou em solvente não clorado, na presença de composto transferidor de grupo halogênio e de dimetilformamida (DMF) ;
b) adição de álcool primário, secundário ou terciário ;
c) reação de aminação redutiva entre o produto obtido em b) e 3-hidroxipiperidina, na presença de NaBHsCN, ácido de Lewis, MeOH e N2;
d) reação do produto obtido em c) com monoidrato de hidrazina; e e) reação do produto obtido em d) com benzaldeido R2- substituido .
[0043] Em outro objeto, a presente invenção apresenta o uso do composto conforme definido acima para a fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa.
[0044] Em outro objeto, a presente invenção apresenta o uso do composto conforme definido acima para a fabricação de uma composição anti-inflamatória e anti- colinesterásica .
[0045] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de doença neurodegenerativa que compreende administração do composto conforme definido acima a um individuo propenso a ou portador de doença neurodegenerativa, em um regime de dose que varia entre Ιμπιοΐ/kg do individuo e 30C^mol/kg do individuo.
[0046] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de inflamações que compreende administração do composto conforme definido acima a um individuo propenso a ou portador de inflamação, em um regime de dose que varia entre Ιμπιοΐ/kg do individuo e 300μπιο1/]^ do individuo.
[0047] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um método de inibição da enzima acetilcolinesterase que compreende contatar o composto conforme definido acima com a enzima acetilcolinesterase.
[0048] O conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados reside no padrão estrutural inédito do composto, que resulta em importantes propriedades farmacológicas e novos mecanismos de ação, úteis no tratamento curativo ou profilático de inflamação e/ou de doenças neurodegenerativas .
[0049] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir .
Breve Descrição das Figuras
[0050] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente são apresentadas as presentes figuras:
[0051] A figura 1 mostra o planejamento molecular de uma nova série de candidatos a protótipos de fármacos de ação dupla para o tratamento da DA.
[0052] A figura 2 mostra a rota sintética utilizada para a preparação dos compostos-alvo de algumas concretizações da invenção.
[0053] A figura 3 mostra o Espectro 1. Espectro no
IV (KBr) do 4-formilbenzoato de metila (13) .
[0054] A figura 4 mostra o Espectro 2. Espectro de
RMN IH (200 MHz, MeOD) do 4-formilbenzoato de metila (13) .
[0055] A figura 5 mostra o Espectro 3. Espectro de
RMN de 13C (50 MHz, MeOD) do 4-formilbenzoato de metila (13) .
[0056] A figura 6 mostra o Espectro 4. Espectro de massas de alta resolução do4-formilbenzoato de metila (13) .
[0057] A figura 7 mostra o Espectro 5. Espectro no
IV (KBr) do 4- ( ( 3-hidroxipiperid-l-ila) metil ) benzoato de metila (11) . [0058] A figura 8 mostra o Espectro 6. Espectro de
RMN IH (200 MHz, MeOD) do 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoato de metila (11) .
[0059] A figura 9 mostra o Espectro 7. Espectro de RMN 13C (50 MHz, MeOD) do 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoato de metila (11) .
[0060] A figura 10 mostra o Espectro 8. Espectro de massas de alta resolução do4 [ (3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoato de metila.
[0061] A figura 11 mostra o Espectro 9. Espectro no
IV (KBr) da 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoilidrazida (10) .
[0062] A figura 12 mostra o Espectro 10. Espectro de
RMN IH (200 MHz, MeOD) da 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoilidrazida (10) .
[0063] A figura 13 mostra o Espectro 11. Espectro de
RMN 13C (50 MHz, MeOD) da 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoilidrazida (10) .
[0064] A figura 14 mostra o Espectro 12. Espectro de massas de alta resolução de 4 [ ( 3-hidroxipiperididin-l- il ) metil ] benzoilidrazida (10) .
[0065] A figura 15 mostra o Espectro 13. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-54.
[0066] A figura 16 mostra o Espectro 14. Espectro de RMN IH (200 MHz, MeOD) da substância LFQM-54.
[0067] A figura 17 mostra o Espectro 15. Espectro de
RMN 13C (50 MHz, MeOD) da substância LFQM-54.
[0068] A figura 18 mostra o Espectro 16. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-54. [0069] A figura 19 mostra o Espectro 17. Espectro no
IV (KBr) da substâncias LFQM-55.
[0070] A figura 20 mostra o Espectro 18. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-55.
[0071] A figura 21 mostra o Espectro 19. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-56.
[0072] A figura 22 mostra o Espectro 20. Espectro de
RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-56.
[0073] A figura 23 mostra o Espectro 21. Espectro de RMN 13C (200 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-56.
[0074] A figura 24 mostra o Espectro 22. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-56.
[0075] A figura 25 mostra o Espectro 23. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-57.
[0076] A figura 26 mostra o Espectro 24. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-57.
[0077] A figura 27 mostra o Espectro 25. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-65.
[0078] A figura 28 mostra o Espectro 26. Espectro de RMN IH (500 MHz, MeOD) da substância LFQM-65.
[0079] A figura 29 mostra o Espectro 27. Espectro de
RMN 13C dept Q (100 MHz, MeOD) da substância LFQM-65.
[0080] A figura 30 mostra o Espectro 28. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-65.
[0081] A figura 31 mostra o Espectro 29. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-66
[0082] A figura 32 mostra o Espectro 30. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-66.
[0083] A figura 33 mostra o Espectro 31. Espectro no IV (KBr) da substância LFQM-67. [0084] A figura 34 mostra o Espectro 32. Espectro de
RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-67.
[0085] A figura 35 mostra o Espectro 33. Espectro de
RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-67.
[0086] A figura 36 mostra o Espectro 34. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-67.
[0087] A figura 37 mostra o Espectro 31. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-72.
[0088] A figura 38 mostra o Espectro 32. Espectro de RMN IH (200 MHz, MeOD) da substância LFQM-72.
[0089] A figura 39 mostra o Espectro 33. Espectro de
RMN 13C (50 MHz, MeOD) da substância LFQM-72.
[0090] A figura 40 mostra o Espectro 35. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-72.
[0091] A figura 41 mostra o Espectro 36. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-75.
[0092] A figura 42 mostra o Espectro 37. Espectro de
RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-75.
[0093] A figura 43 mostra o Espectro 38. Espectro de RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-75.
[0094] A figura 44 mostra o Espectro 39. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-75.
[0095] A figura 45 mostra o Espectro 40. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-76.
[0096] A figura 46 mostra o Espectro 41. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-76.
[0097] A figura 47 mostra o Espectro 42. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-88.
[0098] A figura 48 mostra o Espectro 43. Espectro de RMN IH (200 MHz, MeOD) da substância LFQM-88. [0099] A figura 49 mostra o Espectro 44. Espectro de
RMN 13C (50 MHz, MeOD) da substância LFQM-88.
[0100] A figura 50 mostra o Espectro 45. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-88.
[0101] A figura 51 mostra o Espectro 46. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-58.
[0102] A figura 52 mostra o Espectro 47. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-58.
[0103] A figura 53 mostra o Espectro 48. Espectro no IV (KBr) da substância LFQM-68.
[0104] A figura 54 mostra o Espectro 49. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-68.
[0105] A figura 55 mostra o Espectro 50. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-73.
[0106] A figura 56 mostra o Espectro 51. Espectro de
RMN de IH (500 MHz, MeOD) da substância LFQM-73.
[0107] A figura 57 mostra o Espectro 52. Espectro de
RMN dept Q (100 MHz, MeOD) da substância LFQM-73
[0108] A figura 58 mostra o Espectro 53. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-73.
[0109] A figura 59 mostra o Espectro 54. Espectro no
IV (KBr) da substância LFQM-84
[0110] A figura 60 mostra o Espectro 55. Espectro de
RMN IH (200 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-84.
[0111] A figura 61 mostra o Espectro 56. Espectro de
RMN 13 C (50 MHz, DMSO-d6) da substância LFQM-84.
[0112] A figura 62 mostra o Espectro 57. Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-84.
[0113] A figura 63 mostra o Espectro 58. Espectro no IV (KBr) da substância LFQM-87. [0114] A figura 64 mostra o Espectro 59 -Espectro de massas de alta resolução da substância LFQM-87.
[0115] A figura 65 mostra o estudo da seletividade
AChE x BUChE das substâncias mais ativas in vitro.
[0116] A figura 66 mostra o estudo do mecanismo de ação das substâncias LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-75, LFQM-76 e LFQM-88.
[0117] A figura 67 mostra um esquema 1 indicando o desenho experimental do teste de reconhecimento de objeto novo no quarto dia de experimento.
[0118] A figura 68 mostra o efeito de LFQM-56, LFQM-
57, LFQM-67, LFQM-75 e LFQM-88 (100 μπιοΐ/kg v.o.) no teste de reconhecimento de objeto novo em camundongos (n = 05-19) . Diferença significativa no tempo de exploração dos diferentes objetos dentro do mesmo grupo (Teste t pareado, **P<0,01, ***P<0,001) . B) Efeito de LFQM-56, LFQM-57, LFQM- 67, LFQM-75 e LFQM-88 (100 μπιοΐ/kg v.o.) sobre a amnésia induzida por escopolamina (0,3 mg/kg i.p.) no teste de reconhecimento de objeto novo em camundongos (n = 08-19) . Diferença significativa no tempo de exploração dos diferentes objetos dentro do mesmo grupo (Teste t pareado, **P<0, 01, ***P<0, 001) .
[0119] A figura 69 mostra o Efeito de LFQM-56, LFQM-
57, LFQM-67, LFQM-75 e LFQM-88 (100 μπιοΐ/kg v.o.) sobre o deslocamento total dos animais no interior da arena. (A) Sessão treino. ANOVA (Fll,126 = 7,095; P < 0.001) . Diferença significativa com relação ao grupo SAL+SAL no teste post-hoc de Turkey. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001. (B) Sessões teste. ANOVA (Fll,126 = 5,800; P < 0,001) . Diferença significativa com relação ao grupo SAL+SAL no teste post-hoc de Turkey. * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001
[0120] A figura 70 mostra experimento realizado com administração de donepezil nas doses de 1, 3 e 5 mg/kg em animais submetidos à administração intratecal de proteína beta-amiloide enovelada.
[0121] A figura 71 mostra o efeito anti-inflamatório das substâncias-alvo (100 uM) de algumas concretizações da invenção, no ensaio de Von Frey, utilizando a indometacina (100 uM) como padrão positivo, (a) -(h) .
[0122] A figura 72 mostra o efeito anti-inflamatório das substâncias-alvo (100 uM) de algumas concretizações da invenção, no ensaio de Von Frey, utilizando a indometacina (100 uM) como padrão positivo, (i)-(p) .
[0123] A figura 73 mostra o gráfico de área sobre a curva do efeito anti-inflamatório de todas as substâncias- alvo (100 uM) de algumas concretizações da invenção, no ensaio de Von Frey, utilizando a indometacina (100 uM) como padrão. ### p < 0.001 quando comparado com o grupo controle sem carragenina. *p < 0.05; **p <0.01; ***p < 0.001 quando comparado ao grupo controle com carragenina.
[0124] A figura 74 mostra o efeito das substâncias- teste LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-74, LFQM-75, LFQM-76, LFQM-84 (100 μπιοΐ/kg) , indometacina (100 μπιοΐ/kg) e morfina (39 μπιοΐ/kg) sobre as fases neurogênica e inflamatória do teste de formalina.
[0125] A figura 75 mostra o efeito das acilidrazonas
LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73 e LFQM-74 (100 μπιοΐ/kg) , no ensaio de edema de pata de camundongo induzido por carragenina. [0126] A figura 76 mostra a curva dose-resposta e estimativa da ID50 das acilidrazonas LFQM-56, LFQM-65, LFQM- 67, LFQM-73 e LFQM-74, no ensaio de edema de pata de camundongo induzido por carragenina após a 3a hora.
[0127] A figura 77 mostra que as substâncias LFQM-
56, LFQM-57, LFQM-65 e LFQM-67 não modulam a ativação de NF- kB induzida por LPS em macrófagos RAW 264.7. As células foram pré-incubadas com meio, veiculo, LFQM-56 (A) , LFQM-57 (B) , LFQM-65 (C) ou LFQM-67 (D) , 30 minutos antes da adição do LPS. Dados representam unidades de luminescência, que indiretamente representam a atividade do NF-kB. Barras representam a média de quatro experimentos independentes ± E.P.M. (A) F5,85 = 7,91; (B) F5, 63 = 5,88; (C) F5, 62 = 7,62; (D) F5, 68 = 9, 72. #P < 0,05 comparado ao grupo meio.
[0128] A figura 78 mostra a avaliação da produção de malondialdeido (MDA) sexto dia (B) após a infecção com PbA em camundongos C57BL6 (n=5/grupo) . Como controle, um grupo de animais foi inoculado com hemácias não parasitadas (RBC) (p>0,05, teste de Tukey) .
[0129] A figura 79 mostra a avaliação da produção de tiol livre no sexto dia após a infecção com PbA em camundongos C57BL6 (n=5/grupo) . Como controle, um grupo de animais foi inoculado com hemácias não parasitadas (RBC) (p>0,05, teste de Tukey) .
[0130] A figura 80 mostra a avaliação da produção de mieloperoxidase (MPO) no sexto dia após a infecção com PbA em camundongos C57BL6 (n=5/grupo) . Como controle, um grupo de animais foi inoculado com hemácias não parasitadas (RBC) (p>0,05, teste de Tukey) . [0131] A figura 81 mostra o desenho experimental do procedimento para avaliação do efeito sobre o déficit mnemónico induzido pela administração hipocampal de proteína β-amiloide .
[0132] A figura 82 mostra os dados da avaliação das substâncias LFQM-56 e LFQM-67 no modelo de reconhecimento do objeto novo após administração da proteína β-amiloide no hipocampo. Dados estatísticos: One way ANOVA F(5,50) = 4.3; p< 0.01. * Diferença estatística do grupo PBS + Abeta dos grupos: PBS+ veículo; Abeta LFQM-56 (50uM e lOOuM) e LFQM- 67 lOOuM. # Diferença estatística do grupo PBS + veículo do grupo Abeta LFQM-67 50uM. N grupos = 10, 7, 9, 8, 11, 11, respectivamente .
[0133] A figura 83 mostra os dados da avaliação da substância LFQM-88 no modelo de reconhecimento do objeto novo após administração da proteína β-amilóide no hipocampo. Dados estatísticos: One way ANOVA F(3,16) = 4.08, P< 0.05. Post-hoc Duncan amiloid beta diferente do controle e LFQM- 88 50 e ΙΟΟμΜ
[0134] A figura 84 mostra os dados da avaliação das substâncias LFQM-57 e LFQM-75 no modelo de reconhecimento do objeto novo após administração da proteína β-amiloide no hipocampo. Dados estatísticos: One way ANOVA F(3,25)= 5.3, P< 0.01. Post-hoc Duncan amiloid beta LFQM-57 e LFQM-75 diferente do controle.
[0135] A figura 85 mostra os dados da avaliação das substâncias LFQM-56 e LFQM-67 e do donepezil, administrados v.o, no modelo de reconhecimento do objeto novo após administração da proteína β-amiloide no hipocampo. Diferença estatística do grupo PBS+ vehicle. N experimental: 5, 8, 8, 8, 8, 6, 8, 8, 6, 6, 6 respectivamente.
[0136] A figura 86 mostra o efeito das substâncias
LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73 e LFQM-74 no ensaio de campo aberto na dose de 100 uM.
[0137] A figura 87 mostra células HepG2 que foram tratadas com os diferentes compostos (50 uM) por 3h. Houve redução do IDN nas condições experimentais testadas indicando que os compostos exerceram atividade citostática sobre as células da linhagem HepG2. DMSO: controle negativo. Doxorrubicina (DXR) : controle positivo. *Diferença significativa (p < 0,05) em relação ao controle.
[0138] A figura 88 mostra células HepG2 que foram tratadas com os diferentes compostos (20 uM) por 3h. Não houve diferença significativa no IDN. DMSO: controle negativo. Doxorrubicina (DXR) : controle positivo.
[0139] A figura 89 mostra a frequência de micronúcleos avaliada em culturas de células HepG2 tratadas com os diferentes compostos a 20 μΜ por 3h de acordo com os critérios proposto por Fenech, 2000. Houve aumento significativo (p<0.05) na frequência de MNs em culturas tratadas com os compostos LFQM-57, LFQM-67 e LFQM-75. DMSO: controle negativo. Doxorrubicina (DXR) : controle positivo. Descrição Detalhada da Invenção
[0140] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um composto de acordo com a formula I :
Figure imgf000037_0001
em que
RI é escolhido do grupo que consiste de: OH, CH3CHOO, oxialquila, oxiarila e carbamoila; e
R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, NO2, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolinil , 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc, triazolila, aminoalquila, aminoarila, 0- alquila, arila, carbamoila, NHCO-alquila, e NHCO-arila.
[0141] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula I, em que RI é escolhido do grupo que consiste de: OH ou AcO; e R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolil, 4- piperidinil, imidazol, SMe, OAc.
[0142] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula II:
Figure imgf000037_0002
em que
RI é escolhido do grupo que consiste de: OH, CH3CHOO, oxialquila, oxiarila e carbamoila; e
R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, NO2, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolinil , 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc, triazolila, aminoalquila, aminoarila, 0- alquila, arila, carbamoila, NHCO-alquila, e NHCO-arila.
[0143] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula II, em que RI é escolhido do grupo que consiste de: OH ou AcO; e R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolil, 4- piperidinil, imidazol, SMe, OAc.
[0144] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VI, fórmula VII, fórmula IV, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000038_0001
I (LFQM 57) IV, (LFQM 75)
Figure imgf000038_0002
V, (LFQM 88) VI, (LFQM 73)
Figure imgf000039_0001
VII, (LFQM 74) VIII, (LFQM 56)
Figure imgf000039_0002
IX. (LFQM 67)
[0145] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um processo de síntese de composto conforme definido acima, que compreende as etapas:
a) reação de esterificação do ácido 4-formil-benzóico
(ou 4-carboxibenzaldeído ) em solvente clorado ou em solvente não clorado, na presença de composto transferidor de grupo halogênio e de dimetilformamida (DMF) ;
b) adição de álcool primário, secundário ou terciário;
c) reação de aminação redutiva entre o produto obtido em b) e 3-hidroxipiperidina, na presença de NaBHsCN, ácido de Lewis, MeOH e N2;
d) reação do produto obtido em c) com monoidrato de hidrazina; e e) reação do produto obtido em d) com benzaldeido R2- substituido .
[0146] Em uma concretização, o processo compreende adicionalmente a etapa f) reação de acetilação com anidrido acético e 4- (N, N-dimetilamino ) piridina (4-DMAP) .
[0147] Em uma concretização, a etapa a) ocorre em refluxo, durante um intervalo de tempo que varia entre 20 minutos e 60 minutos.
[0148] Em uma concretização, a etapa a) ocorre durante um intervalo de tempo de 40 minutos.
[0149] Em uma concretização, a etapa b) ocorre num intervalo de tempo que varia entre 5 minutos e 20 minutos.
[0150] Em uma concretização, a etapa b) ocorre durante um intervalo de tempo de 10 minutos.
[0151] Em uma concretização, a etapa d) ocorre na presença de álcool, em refluxo, num intervalo de tempo que varia entre 1 hora e 5 horas.
[0152] Em uma concretização, o álcool é etanol.
[0153] Em uma concretização, o intervalo de tempo é 3 horas .
[0154] Em uma concretização, o benzaldeido R2- substituido da etapa e) é um benzaldeido R2-substituido em que R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil , F, Ν¾, 4-morfolil, 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc .
[0155] Em uma concretização, a etapa e) ocorre num intervalo de tempo que varia entre 1 hora e 24 horas.
[0156] Em outro objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e o composto conforme definido anteriormente.
[0157] Em uma concretização, o referido composto está presente na composição em uma proporção entre 0,01% m/m e 95% m/m.
[0158] Em outro objeto, a presente invenção apresenta o uso de composto definido acima para fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa, que pode ser: doença de Alzheimer, doença de Huntington, amnésia, depressão nervosa, transtorno obsessivo compulsivo e/ou esclerose lateral amiotrófica .
[0159] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VI, fórmula VII, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000041_0001
I (LFQM 57) IV, (LFQM 75)
Figure imgf000041_0002
V, (LFQM 88) VI, (LFQM 73)
Figure imgf000042_0001
VII, (LFQM 74 VIII, (LFQM 56)
Figure imgf000042_0002
IX. (LFQM 67)
[0160] Em outro objeto, a presente invenção apresenta o uso de composto definido acima para fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de inflamações.
[0161] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula IV, fórmula VI, fórmula VII, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000042_0003
IV, (LFQM 75) VI, (LFQM 73)
Figure imgf000043_0001
VII, (LFQM 74) VIII, (LFQM 56)
Figure imgf000043_0002
IX. (LFQM 67)
[0162] Em outro objeto, a presente invenção apresenta o uso de composto conforme definido anteriormente para fabricação de uma composição anti-inflamatória e anti- colinesterásica.
[0163] Em uma concretização, a composição anti- inflamatória e anticolinesterásica é útil para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa, escolhida do grupo que consiste de: doença de Alzheimer, doença de Huntington, amnésia, depressão nervosa, transtorno obsessivo compulsivo e/ou esclerose lateral amiotrófica.
[0164] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VI, fórmula VII, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000044_0001
I (LFQM 57) IV, (LFQM 75)
Figure imgf000044_0002
V (LFQM 88) VI, (LFQM 73)
Figure imgf000044_0003
VII, (LFQM 74 VIII, (LFQM 56)
Figure imgf000044_0004
IX. (LFQM 67)
[0165] Em outro objeto, a presente invenção apresenta uma forma de dosagem oral que compreende pelo menos um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido composto conforme definido no presente pedido de patente e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
[0166] Em uma concretização, o composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável está presente em uma quantidade que varia de 0,0001% em peso a 99% em peso.
[0167] Em uma concretização, o composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável está presente em uma quantidade que varia de 0,001% em peso a 99% em peso.
[0168] Em uma concretização, o composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável está presente em uma quantidade que varia de 0,01% em peso a 50% em peso.
[0169] Em uma concretização, o composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável está presente em uma quantidade que varia de 0, 1% em peso a 20% em peso.
[0170] Em uma concretização, o composto está em uma dosagem que varia entre 1 ng e 5 g.
[0171] Em uma concretização, o composto está em uma dosagem que varia entre 1 μg e lg.
[0172] Em uma concretização, a forma de dosagem oral é sólida ou liquida.
[0173] Em uma concretização, a forma de dosagem oral é sólida.
[0174] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de doença neurodegenerativa que compreende administração de composto definido anteriormente a um individuo propenso a ou portador de doença neurodegenerativa, em um regime de dose que varia entre 1 pmol/kg de massa corpórea do individuo e 1 mol/kg de massa corpórea do individuo. [0175] Em uma concretização, o regime de dose varia entre 1 pmol/kg de massa corpórea do individuo e 1 mmol/kg de massa corpórea do individuo.
[0176] Em uma concretização, o regime de dose varia entre 1 nmol/kg de massa corpórea do individuo e 900 μπιοΐ/kg de massa corpórea do individuo.
[0177] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 nmol/kg do individuo e 900 nmol/kg do individuo .
[0178] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 nmol/kg do individuo e 600 nmol/kg do individuo .
[0179] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 nmol/kg do individuo e 300 nmol/kg do individuo.
[0180] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 nmol/kg do individuo e 100 nmol/kg do individuo .
[0181] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 nmol/kg do individuo e 20 nmol/kg do individuo.
[0182] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 μπιοΐ/kg do individuo e 900 μπιοΐ/kg do individuo .
[0183] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 μπιοΐ/kg do individuo e 600 μπιοΐ/kg do individuo .
[0184] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 μπιοΐ/kg do individuo e 300 μπιοΐ/kg do individuo . [0185] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 μπιοΐ/kg do individuo e 100 μπιοΐ/kg do individuo .
[0186] Em uma concretização, o regime de dose que varia entre 1 μπιοΐ/kg do individuo e 20 μπιοΐ/kg do individuo.
[0187] Em uma concretização, a dose administrada é
ΙΟΟμπιοΙ/kg do individuo.
[0188] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000047_0003
IX. (LFQM 67)
[0189] Em outro obj eto, a presente invenção apresenta um método de tratamento de inflamações que compreende administração de composto conforme definido anteriormente a um individuo propenso a ou acometido de inflamação, em um regime de dose que varia entre Ιμπιοΐ/kg do individuo e 30C^mol/kg do individuo.
[0190] Em uma concretização, a dose administrada é
ΙΟΟμπιοΙ/kg do individuo.
[0191] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VI, fórmula VII, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000048_0001
III, (LFQM 57)
Figure imgf000048_0002
VI, (LFQM 73)
V, (LFQM 88)
Figure imgf000049_0001
VIII, (LFQM 56)
VII, (LFQM 74
Figure imgf000049_0002
IX. (LFQM 67)
[0192] Em uma concretização o composto é de acordo com a fórmula VI ou fórmula VII:
Figure imgf000049_0003
VI, (LFQM 73) VII, (LFQM 74)
[0193] Em outro objeto, a presente invenção apresenta um método de inibição da enzima acetilcolinesterase que compreende contatar composto conforme definido anteriormente com a enzima acetilcolinesterase. [0194] Em uma concretização, o composto é de acordo com a fórmula III, fórmula IV, fórmula V, fórmula VIII ou fórmula IX:
Figure imgf000050_0001
I, (LFQM 57) IV (LFQM 75)
Figure imgf000050_0002
V, (LFQM 88) VIII, (LFQM 56)
Figure imgf000050_0003
IX. (LFQM 67)
[0195] Na presente descrição, algumas definições serão utilizadas, sendo a seguir melhor definidas.
Solvente clorado
[0196] No contexto do presente pedido de patente, solvente clorado deve ser entendido como qualquer tipo de solvente adequado para reações orgânicas como, por exemplo, tetracloreto de carbono, clorofórmio, diclorometano, dentre outros .
Solvente não clorado
[0197] No contexto do presente pedido de patente, solvente não clorado deve ser entendido como solventes que compreendem acetonitrila, éteres e toluenos, dimetilformamida, dentre outros.
Composto transferidor de grupo halogênio
[0198] No contexto do presente pedido de patente, composto transferidor de grupo halogênio deve ser entendido como qualquer reagente que possua a função de realizar transferência de grupo halogênio. Exemplos não limitantes de compostos transferidores de grupo halogênio incluem cloreto de oxalila, cloreto de tionila, PCls, PCI3, PBrs, PBr3, dentre outros.
Álcool primário, secundário ou terciário
[0199] No contexto do presente pedido de patente, álcool primário, secundário ou terciário compreendem álcoois como metanol, etanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol, pentanol, isopentanol, dentre outros.
Ácido de Lewis
[0200] No contexto do presente pedido de patente, ácidos de Lewis compreendem ácidos como cloreto de zinco (Z11CI2), cloreto de alumínio (AICI3) , cloreto de ferro (III), dentre outros.
[0201] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar algumas das inúmeras maneiras de se concretizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma .
Exemplo 1: Processo de síntese e caracterização dos compostos obtidos
[0202] Foi sintetizada uma nova série de derivados análogos ao donepezil, planejados por hibridação molecular com o protótipo LASSBio- 767 e com derivados alcaloidicos arilidrazônicos com atividade anti-inflamatória, contemplando a subunidade W-benzil-piperidinica do donepezil e uma subunidade espaçadora W-acilidrazona, descrita como um importante bióforo anti-inflamatório . Além disso, a variação dos subs ti tuintes do núcleo benzilico, visava fornecer importantes informações de relação estrutura-atividade, num provável perfil duplo ou simbiótico das novas moléculas, que poderiam atuar como anticolinesterásicos e como anti-inflamatórios , sendo tanto o mecanismo de ação, como o padrão estrutural, inéditos na literatura (Figura 1) .
1.1) Processo de síntese
[0203] Foram sintetizadas 18 substâncias novas com base na rota sintética apresentada na Figura 2, a partir do 4-carbóxi-benzaldeído e da 3-hidroxipiperidina (Figura 2), Numa etapa inicial, uma reação de esterificação do ácido (15) em diclorometano na presença de cloreto de tionila (SOCI2) e de dimetilfomamida (DMF) originaria o cloreto de ácido (14) que, ao ser reagido com metanol, poderia ser transformado no éster (13) . Na segunda etapa sintética, uma reação de aminação redutiva entre (12) e (13), na presença de NaBH3CN/ZnCl2/MeOH poderia fornecer o éster N- benzilpiperidínico (11) , que submetido à reação com monoidrato de hidrazina originaria a hidrazida (10) , intermediário-chave na rota sintética proposta. A hidrazida (10) , ao reagir com uma série de benzaldeídos substituídos (9) deveria gerar a série de N-acilidrazonas-alvo, com diferentes subs tituintes no anel aromático da subunidade N- acilidrazonil-benzí lica . Para a obtenção das acilidrazonas acetiladas (LFQM-58, LFQM-68, LFQM-73, LFQM-84 e LFQM-87), uma etapa adicional com uma reação de acetilação com anidrido acético e 4- (N, N-dimetilamino ) piridina (4-DMAP) e completaria a sequência sintética desejada. Os compostos obtidos foram caracterizados por espectrometria no IV, MS e RMN .
[0204] O 4-carboxibenzaldeído (15), eleito como material de partida para a síntese das moléculas-alvo, foi convertido no cloreto de acila (14) por reação com SOCI2, catalisada por DMF, seguida de uma etapa de metanólise (Esquema 1) .99 O produto bruto da reação foi purificado em coluna cromatográfica, fornecendo o éster 4- formilbenzoato de metila (13) em 87% de rendimento.
[0205] Esquema 1. Reação de conversão do 4- carboxibenzaldeído (13) em cloreto de acila (14), seguida de metanólise para a obtenção do éster 4-formilbenzoato de metila (12) .
Figure imgf000053_0001
[0206] O espectro de infravermelho (IV) do éster (13) (Figura 3) não apresenta a banda de us OH, entre 3300 e 2500 cnr1, característica do 4-carboxibenzaldeido, o que indica que ocorreu a conversão do material de partida. É possível observar duas bandas características us de C-H de aldeídos em 2835 e em 2735 cnr1; bandas de us de C-H de metila em 2997 e 2954 cnr1; em 1724 e 1707 cnr1 aparecem duas bandas sobrepostas de us C=0 referente às carbonilas das funções éster e aldeído, respectivamente. Em 1280 e 1111 cnr1 podem ser observadas as bandas características do us C- 0 da função éster
[0207] O éster (13) mostrou-se, aparentemente, pouco estável em temperatura ambiente, apresentando sinais de degradação quando observado em placa cromatográfica, pelo surgimento de outra substância não identificada, porém sem alterações no aspecto visual do produto puro. A análise por espectrometria de RMN de 1H e 13C e de massas de alta resolução, confirmou a instabilidade observada. No espectro de RMN de 1H (Figura 4), aparece um singleto em δ 3,88, que foi atribuído a um grupo metila do produto de decomposição, assim como alguns sinais na região de aromáticos (δ 120,0- 140, 0 ppm) do espectro de RMN de 13C (Figura 5), de menor intensidade que os atribuídos ao éster (13) . As evidências de contaminação por degradação foram corroboradas pelo espectro de massas (Figura 6), que apresentou grande número de sinais relativos, provavelmente a fragmentações do éster (13) e de seu produto de degradação.
[0208] No espectro de RMN de 1H (Figura 4), foram observados os sinais referentes à estrutura do éster (13) , porém, com outros sinais indicativos da presença de impureza como, por exemplo, em δ 5,55; δ 1,26 e δ 7,58, o que foi atribuído a um produto estruturalmente análogo de degradação. O sinal em δ 4,87 se refere à presença de água no MeOH 100 e, em δ 3,30 é o sinal referente ao solvente utilizado no experimento.
[0209] No espectro de RMN de 13C (Figura 5), foram observados o sinal em δ 191,6 referente ao C carbonilico do grupamento aldeidico e o sinal em δ 166,4 do C carbonilico da função éster. O sinal referente ao C metílico da metoxila pode ser observado em δ 51,7, assim como os sinais de CH aromáticos na região de δ 120-140,0 Assim como no espectro de RMN de 1H, existem sinais que não correspondem ao produto de interesse, sendo assim, pode-se atribuí-los ao produto de degradação.
Tabela 1. Dados de RMN de 1 H e 13C do 4-formilbenzoato de metila (13).
Posição δ 1H (ppm) m J (Hz) õ 13C (ppm)
1 — 139,0
2 7,97 d 10,00 128,4
3 8,16 d 8,00 129,2
4 — 134,6
5 8,16 d 8,00 128,7
6 7,97 d 10,00 128,5
7 10,06 s — 191 ,6
8 — 166,4
9 3,93 s — 51 ,7
[0210] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 6), pode-se observar o pico referente ao [dímero (13)-1]+ com m/z = 327.2270, o que confirma a obtenção do éster desejado, porém impuro conforme discutido anteriormente . [0211] Numa etapa subsequente, o éster (13) foi convertido na N-benzilpiperidina (11), com rendimento de 86%, por reação de aminação redutiva entre a 3- hidroxipiperidina comercial (12) e o formil-éster (13) (Esquema 2 ) .
[0212] Esquema 2. Reação de aminação redutiva entre a 3-hidroxipiperidina (12) e o formil-éster 13
Figure imgf000056_0001
[0213] A técnica de aminação redutiva utilizada consistiu na preparação de uma solução metanólica do éster (13) com a amina (12) . Em outro balão, foram agitados NaBHsCN e ZnCl2 anidro em MeOH. As duas soluções foram mantidas sob agitação em atmosfera de N2. Após lh, as duas soluções foram transferidas para um único balão reacional, mantendo-se as condições de temperatura, agitação e atmosfera, até conversão completa do éster de partida.
[0214] O produto 4- ( ( 3-hidroxipiperid-l- ila) metil) benzoato de metila (11), foi purificado em coluna cromatográfica e caracterizado por IV, RMN de 1H, 13C e espectrometria de massas.
[0215] Ao analisar o espectro de IV (Figura 7) é possível comprovar a conversão do éster (13) no produto (11) através da presença da banda de us O-H em 3346 cnr1 e da ausência da banda de us C-H em 2735 cnr1 característica de aldeído. Observam-se as bandas em 2933 e 2791 cnr1 características de us C-H de metila e metileno; a banda us C=0 em 1716 cnr1 e duas bandas de us C-0 em 1282 (larga) e 1111 cnr1 característica de ésteres. Em 1282 cnr1 está uma banda alargada provavelmente pela sobreposição das bandas de us C-0 e us C-N.
[0216] A estrutura do produto desejado foi confirmada no espectro de RMN de 1H (Figura 8) , pela presença do singleto em δ 3,55, relativo aos hidrogênios metilênicos H-7, além dos sinais referentes à subunidade piperidínica em õ 1,00-4,0 do grupo metila de éster em δ 3,87 e do conjunto de dupletos relativos aos grupos metínicos aromáticos em δ 7,44 e 7,92. No espectro de RMN de 13C também foi possível atribuir todos os sinais relativos aos carbonos da estrutura da N- benzilpiperidina (11) (Figura 9, Tabela 2) .
Tabela 2. Dados de RMN1 H e 13C do 4[(3-hidroxipiperididin-1 - il)metil]benzoato de metila (1 1 ).
Posição õ 1H (ppm) m J (Hz) õ 13C (ppm)
1 - -- - 144,8
2 7,94 d 8,00 130,6
3 7,42 d 8,00 130,6
4 - -- - 130,6
5 7,42 d 8,00 130,6
6 7,94 d 8,00 130,6
7 3,55 s - 63,5
8 - -- - 168,3
9 3,87 s - 52,7 2 2,00 m 61 ,9 3 3,64 m 67,6 4 1 ,54 m 33,9 5 1 ,84 m 24,2 6 2,84 m 54,5
[0217] No espectro de massas (Figura 10) , foi identificado o pico-ion- molecular [M+l ]+ do composto em m/z = 250.1454. Também foi possível identificar os seguintes picos: [M + Na]+ em m/z = 272.1267; [M - OH] + em m/z = 232.1340 e [dímero + Na]+ em m/z = 521.2626.
[0218] Uma vez obtida, a N-benzilpiperidina (11) foi, então, convertida na hidrazida (10) , intermediário- chave na rota sintética proposta para a série-alvo, via reação de hidrazinólise, com monoidrato de hidrazina (NH2NH2.H2O) em etanol e sob refluxo.
[0219] Esquema 3. Obtenção da hidrazida (10) , a partir da reação do éster (11) com monoidrato de hidrazina.
Figure imgf000058_0001
[0220] Foram feitos os espectros IV, de RMN ¾ e RMN
13C, porém, os espectros de RMN ¾ e de RMN 13C foram pouco conclusivos visto que os Hs da função hidrazida não apareceram. Mas, a estrutura foi confirmada pelo IV (Figura 11) e pela espectrometria de massas de alta resolução ( Figura 14 ) . [0221] Ao comparar o espectro de IV da hidrazida
(10) com o do éster precursor (11) , nota-se o deslocamento da banda usC=0 de 1716 para 1651 cnr1 e não há a banda intensa em 1111 cnr1 referente ao us C-0 característica de ésteres. No espectro abaixo é possível verificar também uma banda de 5 fora do plano de N-H em 1600 cnr1, o que confirma a obtenção da hidrazida (10) .
Tabela 3: Dados de RMN1 H e 13C da 4[(3-hidroxipiperididin-1 - il)metil]benzoilidrazida (10).
Posição δ 1 H (ppm) M J (Hz) δ 13C (ppm)
1 133,4
2 7,75 d 8,00 128,3
3 7,42 d 8,00 130,8
4 142,8
5 7,42 d 8,00 130,6
6 7,75 d 8,00 128,3
7 3,59 s 61 ,9
8 169,5
9
10
2' 2,86, 2,68 m 63,6
3' 3,66 67,8
4' 1 ,90 m 33,8
5' 1 ,70 m 24,0
6' 2,00 m 54,5
[0222] Foi possível confirmar a obtenção hidrazida 10 por espectrometria de massas, cujo espectro (Figura 14) apresenta pico referente ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 250.1556. Também é possível verificar a presença dos picos referentes ao [M+Na]+ em m/z = 272.1373; [M-OH]+ em m/z = 232.1446; [dímero+Na]+ em m/z = 521.2843 e o sinal do fragmento relativo à perda do anel piperidínico em [M- 100]+ em m/z = 149.0713.
[0223] Numa etapa final, a hidrazida (10) foi submetida ao acoplamento com uma série de benzaldeídos funcionali zados comerciais (9), em etanol, sob catálise de HC1103, para gerar as respectivas 3-hidroxi- (W-benzil ) - piperidinilacilidrazonas-alvo em rendimentos de 15-96 %
(Esquema 4, Tabela 4) .
[0224] Esquema 4. Esquema da reação de acoplamento entre ahidrazida (10) e aldeídos funcionali zados .
Figure imgf000060_0001
Tabela 4. Dados experimentais da preparação da série de acilidrazonas-alvo 8a-l (LFQM54-57, LFQM-65-67, LFQM-72, LFQM-75, LFQM-76 e LFQM-88).
Figure imgf000061_0001
Rendimento Intervalo de Fusão
Substância R
(%) (°C)
8b (LFQM-54) H 32 194-200
8a (LFQM-55) Br 52 198-203
8c (LFQM-56) Cl 62 210-215
8f (LFQM-57) N02 95 210-214
8e (LFQM-65) OCH3 96 193-195
8i (LFQM-66) Pirrolidinil 94 172-180
8d (LFQM-67) F 68 225-232
8k (LFQM-72) NH2 15 125-132
8j (LFQM-75) Piperidinil 31 178-186
8h (LFQM-76) Imidazolil 29 152-decomposição
8g (LFQM-88) SCH3 59 195-205
[0225] Visando avaliar a contribuição farmacofórica do grupo hidroxila em C-3 da subunidade piperidinica da série de 3-hidroxi- (W-benzil ) -piperidinil- acilidrazonas 8 e, ainda, avaliar a influência do grupo acetila presente na estrutura de LASSBio-767, substância inibidora de AChE utilizada como protótipo na génese da série-alvo deste projeto, algumas hidroxi-acilidrazonas da série 8 foram convertidas nos respectivos derivados acetilados, por reação com AC20/4-DMAP em CHCI3104 (Esquema 5, Tabela 5) .
[0226] Esquema 5 . Preparação da série de acilidrazonas acetiladas 7 (a-f ) , por reação de acetilação com Ac20, 4-DMAP e CH2CI2 .
Figure imgf000062_0001
Tabela 5. Dados experimentais da preparação da série de acilidrazonas- acetiladas-alvo 7a-f (LFQM- 58, LFQM-68, LFQM-73, LFQM-84 e LFQM-87).
Figure imgf000062_0002
[0227] As análises por ressonância magnética nuclear (RMN) ainda estão sendo realizados em instituições colaboradoras externas (UFRRJ e UFMG) e, nem todos os espectros estão disponíveis. Por outro lado, todas as substâncias das séries 7 e 8 foram caracterizadas por infravermelho e espectrometria de massas de alta resolução.
1.2) Caracterização estrutural das
benzilpiperidinilacilidrazonas das séries- alvo 7 e
8.1.2.1) N-benzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin-l- ila)metil) benzoidrazida: 8b (LFQM- 54)
[0228] O espectro no IV (Figura 15) da substância
LFQM-54 apresenta bandas de u O-H em 3410 cnr1, u N-H em 3172 cm-1, u C-H sp2 em 3034 cm-1, us C-H sp3 em 2827 cm-1, uas
C-H sp3 em 2941 cm-1, u C=0 em 1645 cnr1 e, dentre outras, apresenta também a banda referente ao u C=N em 1604 cm-1.
[0229] A estrutura da LFQM-54 foi confirmada no espectro de RMN 1H (Figura 16), pela presença do singleto em õ 8,42 relativo ao hidrogénio 10', além dos sinais referentes aos hidrogênios aromáticos e piperidínicos .
[0230] No espectro de RMN13C (Figura 17), pode-se observar os sinais em õ 164,6 referente ao C=0, õ 145,6 referente ao C-10 hidrazônico e em õ 56,4 referente ao C-7 mais característicos da estrutura da LFQM-54 além dos sinais referentes aos carbonos aromáticos e piperidínicos.
[0231] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 18) está apresentado o pico referente ao íon molecular [M+l ]+ em m/z = 338,1965. Também é possível verificar os picos referentes ao [M+Na+1]+ em m/z = 360,1652 e ao [dímero+Na]+ em m/z = 697,3453.
1.2.2 ) N- ( 4-bromobenzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin-l- ila ) metil ) benzoidrazida : 8a (LFQM-55)
[0232] Ao se comparar o espectro no IV da hidrazida (Figura 19) com o espectro de IV da substância LFQM-55 (Figura 19), nota-se o aparecimento de uma banda em 3232 cnr1 referente ao usN-H e o deslocamento de 1651 para 1641cnr 1 da banda de usC=0 que pode estar relacionado com o aclopamento da hidrazida com o aldeído.
[0233] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 20) estão apresentados os picos referentes ao íon molecular [M+l]+ em m/z = 416,0967 e ao [dímero+Na]+ em m/z = 855,1603.
1.2.3) N- ( 4-clorobenzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin- 1- ila)metil) benzoidrazida: 8c (LFQM-56)
[0234] O espectro no IV (Figura 21) da substância
LFQM-56 apresenta bandas de u O-H em 3408 cnr1, u N-H em 3232 cnr1, us C-H sp3 em 2854 cnr1, uas C-H sp3 em 2927 cnr1, u C=0 em 1658 cm-1, u C=N em 1558 cm-1, u C-0 em 1089 cm-1 e dentre outras, apresenta a banda referente ao u C-Cl em 756 cm-1.
[0235] No espectro de RMN de ¾ (Figura 22), estão presentes, entre outros, o singleto referente aos H-7 em 5 3,37 e, em 5 8,45 está o singleto referente ao H-10', sinal que comprova a formação do produto desejado.
[0236] No espectro de RMN de 13C (Figura 23), estão presentes, entre outros, os sinais referente ao C-7 em 5 61,0 e, o sinal referente ao C-10' em 5 146,3 ppm.
Tabela 7. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-56.
Posição õ 1 H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 2,74 - 2,79 m -- 62,0
3 - - -- 66,3
4 1 ,58 - 1 ,72 m -- 33,5
5 1 ,39 - 1 ,44 m -- 23,3 6 1 ,76 - 1 ,87 m -- 53,0
7 3,37 s -- 61 ,0 1 ' - - -- 135,0 2' 7,87 d 6,00 127,6 3' 7,43 d 8,00 131 ,0 4' - - -- 134,5 5' 7,43 d 8,00 131 ,0 6' 7,87 d 6,00 127,6 Τ - - - 163,3 10' 8,45 s -- 146,3 1 " - - -- 132,0 2" 7,75 d 8,00 127,6 3" 7,52 d 8,00 130,9 4" - - -- 133,4 5" 7,52 d 8,00 130,9 6" 7,75 d 8,00 127,6
[0237] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 24) está presente o pico referente ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 372,1473. Também é possível verificar os picos referentes ao [M+Na]+ em m/z = 394,1292, ao [dímero+ 1]+ em m/z = 743, 2888 e ao [dímero + Na]+ em m/z = 765, 2701. 1.2.4) N- ( 4-nitrobenzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin- 1- ila)metil) benzoidrazida: 8f (LFQM-57) .
[0238] O espectro no IV (Figura 25) da substância
LFQM-57 apresenta bandas de u O-H em 3311 cnr1, u N-H em 3232 cm-1, uas C-H sp3 em 2941 cm-1, u C=0 em 1655 cm-1, u C=N em 1546 cnr1, u C-0 em 1053 cnr1 e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u N=0 em 1516 e 1346 cnr1. [0239] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 26) estão presentes os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 383,1716 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 787,3127.
1.2.5) N- ( 4-metoxibenzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin- 1 - ila ) metil ) benzoidrazida : 8e (LFQM-65) .
[0240] O espectro no IV (Figura 27) da substância
LFQM- 65 apresenta bandas de u O-H em 3425 cnr1, u N-H em 3209 cnr1, u C-H sp2 em 3039 cnr1, us C-H sp3 em 2827 cnr1, uas C-H sp3 em 2931 cm-1, u C=0 em 1643 cm-1, u C=N em 1604 cnr1, u C-0 em 1056 cnr1 e dentre outras, apresenta as bandas referentes ao 5 C-H sp3 da metila em 1421 e 1371 cm-1.
[0241] A estrutura da LFQM- 65 foi confirmada no espectro de RMN1H (Figura 28), pelos singletos em õ 8,36 relativo ao hidrogénio 10' e õ 3,87 relativo à metila 8" , além dos sinais referentes ao hidrogênios aromáticos e piperidinicos .
[0242] No espectro de RMN13C (Figura 29), pode-se observar o sinal em õ 164,9 referente ao carbono carbonilico, o sinal em õ 54,5 referente ao carbono da metila 8", em õ 149,6 observa-se o sinal referente ao C-10' além dos sinais referentes ao carbonos aromáticos.
Tabela 8. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-65
Posição õ 1H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 3,07 m -- 54,6
3 4,10 m
4 1 ,50 - 2,0 m
5 1 ,50 - 2,00 m
6 1 ,50 - 2,00 m -- 53,0 7 -- -- -- 60,9
1 ' -- -- -- 129,2
2" 8,00 d 10,00 129,2
3" 7,62 d 5,00 130,4
4" -- - -- 129,2
5" 7,62 d 5,00 130,4
6" 8,00 d 10,00 129,2
T - - - 165,0
8
10' 8,36 s -- 149,6
1 " -- -- -- 126,6
2" 7,81 d 10,00 130,4
3" 7,01 d 10,00 1 13,9
4" -- -- -- 162,0
5" 7,01 d 10,00 1 13,9
6" 7,81 d 10,00 130,4
7"
8 3,87 s -- 54,5
[0243] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 30) foi identificado o pico referente ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 368,1967. Também é possível verificar a presença do pico referente a perda da subunidade piperidínica [M-100J+ em m/z = 267,1130 e do pico referente ao [M+Na]+ em m/z = 390,1779.
1.2.6) N- ( 4- (pirrolidin-l-ila ) benzilideno-4- ( ( 3- hidroxipiperidin- 1-ila ) metil ) benzoidrazida : 8i (LFQM-66) .
[0244] O espectro no IV (Figura 31) da substância LFQM- 66 apresenta bandas de u O-H em 3427 cm-1, uas C-H sp3 em 2922 cm-1, us C-H sp3 em 2850 cnrl, u C=0 em 1651 cm-1 e entre outras a banda referente ao u C=N em 1593 cm-1.
[0245] No espectro de massas de alta resolução (Figura 32) estão identificados os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 407,2442, ao [M+Na]+ em m/z = 429,2276 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 813,4803.
1.2.7) N- ( 4-fluorbenzilideno-4- ( ( 3-hidroxipiperidin- 1- ila ) metil ) benzoidrazida : 8d (LFQM-67) .
[0246] O espectro no IV (Figura 33) da substância
LFQM- 67 apresenta bandas de u O-H em 3408 cnr1, u N-H em 3213 cnr1, u C-H sp2 em 3043 cnr1, uas C-H sp3 em 2941 cnr1, u C=0 em 1649 cnr1 e dentre outras apresenta a banda referentes ao u C=N em 1604 cnr1.
[0247] No espectro de RMN de ¾ (Figura 34) observa- se entre outros sinais, o singleto referente ao H-10' em 5 8,60 e o singleto referente ao H-7 em 5 3,39 ppm.
[0248] No espectro de RMN de 13C (Figura 35) observa- se entre outros sinais, o sinal referente ao C-10' em 5 143, 8, o sinal referente ao C-7 em 5 59, 5 e o sinal referente à carbonila C-7' em 5 162,4 ppm.
Tabela 9. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-67.
Posição õ 1H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 3,04 m -- 62,2
3 3,84 m -- 72,0
4 1 ,77 - 1 ,91 m -- 33,2
5 1 ,77 - 1 ,91 m -- 21 ,4
6 1 ,77- 1 ,91 m -- 52,9
7 3,39 s -- 59,5 1 ' -- -- -- 131 ,3
2" 8,02 d 8,00 123,3
3" 7,77 m -- 128,2
4" -- - -- 138,7
5" 7,77 m -- 128,2
6' 8,02 d 8,00 123,4
T - - - 162,4
10' 8,60 s -- 143,8
1 " -- -- -- 129,5
2" 7,77 m -- 130,5
3" 7,33 d 8,00 1 15,1
4" -- -- -- 165,0
5" 7,33 d 8,00 1 15,1
6" 7,77 m -- 130,5
[0249] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 36) está apresentado o pico referente ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 356,1769.
1.2.8) N- ( 4-aminobenzilideno-4- (( 3-hidroxipiperidin- 1- ila)metil) benzoidrazida: 8k (LFQM-72)
[0250] O espectro no IV (Figura 37) da substância
LFQM-72 apresenta a duas bandas características de aminas primárias u N-H em 3348 cnr1 e 3228 cm-1, u C-H sp3 em 2852 cm-1, Uas C-H sp3 em 2922 cm-1, u C=0 em 1651 cm-1, u C=N em 1597 cnr1 e entre outras, u C-0 em 1056 cnrl .
[0251] A estrutura da LFQM-72 foi confirmada no espectro de RMN ¾ (Figura 38), pelo singleto em õ 8,17 e em õ 3.62 relativos aos hidrogênios 10' e 7, respectivamente, além dos sinais referentes ao hidrogênios aromáticos e piperidinicos .
[0252] No espectro de RMN13C (Figura 39), pode-se observar o sinal em õ 164,9 referente ao carbono carbonilico, em õ 60,4 está o sinal referente ao C-7 e, entre outros, é possível observar em õ 141,4 referente ao C-10.
Tabela 10. Dados de RMN1H e 13C da substância LFQM-72
Posição õ1H(ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 2,67-2,68 m - 61,9
3 3,25 s - 66,1
4 1,26-2,13 m - 32,1
5 1,26-2,13 m - 22,3
6 1,26-2,13 m - 52,9
7 3,62 S - 60,4 1' - - - 132,0
2' 7,86 d 8,00 129,1 3' 7,48 m - 129,4 4' - - - 140,0 5' 7,48 m - 129,4 6' 7,86 d 8,00 129,1 T - - - 164,9 8
10' 8,17 s - 141,4
1" - - - 122,4
2" 7,48 m - 129,4
3" 6,67 d 8,00 114,0 6,67
7,48
[0253] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 40) estão presentes os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 353,1971, ao pico [M+Na]+ em m/z = 375, 1751, ao [dimero + 2 Na]+ em m/z = 727, 3665 e ao [dimero + Na + 1]+ em m/z = 705,3840.
1.2.9) N- ( (4-piperidi-l -ila) benzilideno) -4- ( (3- hidroxipiperidin- 1 - ila ) metil ) benzoidrazida : 8h (LFQM-75)
[0254] O espectro no IV (Figura 41) da substância LFQM- 75 apresenta bandas de u O-H em 3446 cnr1, us C-H sp3 em 2852 cnr1, uas C-H sp3 em 2924 cnr1, u C=0 em 1651 cnr1, u
C=N em 1604 cnr1 e, dentre outras, apresenta a banda referente ao 5 C-H sp3 dos carbonos metilênicos em 1460 cnr i _
[0255] No espectro de RMN de ¾ (Figura 42) é possível observar entre outros sinais, o singleto em 5 3,58 referente ao H-7 e o singleto referente ao H-10'.
[0256] No espectro de RMN de 13C (Figura 43) é possível observar entre outros sinais, o sinal em 5 61,0 referente ao C-7, o sinal referente ao C-10' em 5 145,1 e o sinal do carbono carbonílico em 5 163,1 ppm.
Tabela 11. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-75
Posição õ 1 H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 3,22 - -- 64,0
3 2,90 - -- 69,4 4 1,76 ~ ~ 31,9
5 1,17 ~ ~ 21,5
6 1,90 ~ ~ 54,5
7 3,58 s ~ 61,0 r ~ ~ ~ 131,1
2" 7,97 d 10,00 124,1
3" 7,57 d 8,00 128,5
4" ~ - ~ 139,2
5" 7,57 d 8,00 128,5
6" 7,97 d 10,00 124,1
7" ~ ~ ~ 163,1
10' 8,44 s ~ 145,1
1" ~ ~ ~ 123,8
2" 7,83 d 8,00 131,1
3" 6,91 d 8,00 115,00
4" ~ ~ ~ 154,2
5" 6,91 d 8,00 115,0
6" 7,83 d 8,00 131,1
2"' 2,13 ~ ~ 50,3
3'" 1,55 s ~ 25,3
4'" 1,55 s ~ 25,3
5'" 1,55 s ~ 25,3
6'" 2,13 - ~ 50,3
[0257] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 44) estão presentes os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 421,2596, ao pico [M+Na]+ em m/z = 443,2388, ao [dimero + 1]+ em m/z = 841,5092 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 853,4907.
1.2.10) N- (JJL -H-imidazol-4-ila) metileno) -4- ( (3- hidróxipiperidin- 1 -ila) metil ) benzoidrazida : 8h (LFQM-76)
[0258] O espectro no IV (figura 45) da substância LFQM- 76 apresenta bandas de u O-H em 3431 cnr1, us C-H sp3 em 2899 cm-1, uas C-H sp3 em 2933 cm-1, u C=0 em 1647 cm-1 e, entre outras, apresenta u C=N em 1610 cm-1.
[0259] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 46) estão apresentados os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 328,1765 e ao pico [M+Na]+ em m/z = 350,1590.
1.2.11) N- (4- (metiltio) benzilideno) -4- ( (3- hidróxipiperidin-l-ila) metil) benzohidrazida : 8g (LFQM-88)
[0260] O espectro no IV (Figura 47) da substância LFQM- 88 apresenta bandas de u O-H em 3406 cnr1, u N-H em 3250 cm-1, Uas C-H sp3 em 2939 cm-1, u C-S em 2694 cnrl, u C=0 em 1643 cnr1, u C=N em 1608 cnr1, u C-0 em 1056 cnr1 e dentre outras, apresenta as banda referente ao 5 C-H sp3 da metila em 1400 e 1371 cm"1.
[0261] A estrutura da LFQM-88 foi confirmada no espectro de RMN1H (Figura 48), pelos singletos em õ 8,31 relativo ao hidrogénio 10', em õ 3,26 relativo ao hidrogénio H-7 e, em õ 2,48 referente à metila 8" característica da estrutura desejada.
[0262] No espectro de RMN13C (Figura 49), pode-se observar o sinal em õ 165,0 referente ao carbono carbonílico, em õ 143,0 está o sinal referente ao C-10' e, entre outros, em õ 59,8 está o sinal referente ao C-7.
Tabela 12. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-88
Posição õ 1 H (ppm) M Λ (Ηζ) õ 13C (ppm) 2 2,01 m 59,9 3 2,8 m 69,5 4 1 ,72 m 30,5
5 1 ,65 m 24,6
6 53,0
7 3,26 59,8
1 ' 130,9
2" 7,98 12,00 128,0
3" 7,65 m 130,3
4" 137,3
5" 7,65 m 130,3
6" 7,98 d 12,00 128,0
7" 165,0
10' 8,31 143,0
1 " 128,0
2" 7,25 6,00 130,3
3" 7,65 m 125,3
4" 143,0
5" 7,65 m 125,3
6" 7,25 d 6,00 130,3
8" 2,48 14,5
[0263] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 50) estão presentes os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 354,1756, ao [dimero + 1]+ em m/z = 767,3388 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 789,3199.
1.3) Caracterização estrutural das N- benzi lpiperidinilacilidrazonas o-acetiladas
1.3.1) W- ( 4-nitrobenzilideno ) -4- [ ( 3-0-acetilpiperidin-1 il ) metil ) benzoidrazida : 7a (LFQM-58)
[0264] O espectro no IV (Figura 51) da substância LFQM-58 não apresenta a banda de u O-H o que confirma a conversão do grupo -OH em -Oacetilado. É possível verificar a presença das seguintes bandas: u N-H em 3425 cnr1, u C-H sp2 em 3035 cnr1, uas C-H sp3 em 2941 cnr1, us C-H sp3 em 2802 cnr1, u C=0 de éster em 1735 cnr1, u C=0 em 1670 cnr1, e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u N=0 em 1543 e 1387 cm-1.
[0265] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 52) estão presentes os picos referentes ao íon molecular [M+l]+ em m/z = 425,1813 e ao [M+ Na]+ em m/z = 447,1607.
1.3.2) W- (4-bromobenzilideno) -4- [ ( 3-0-acetilpiperidin-l- il) metil) benzoidrazida : 7b (LFQM-68)
[0266] No espectro no IV (Figura 53) da substância
LFQM-68 é possível verificar a presença das seguintes bandas: u N-H em 3232 cnr1, u C-H sp2 em 3053 cnr1, uas C- H sp3 em 2943 cnr1, us C-H sp3 em 2798 cnr1. É possível confirmar a obtenção do produto desejado pela presença de duas bandas distintas de carbonila: u C=0 em 1734 cnr1 e em 1649 cnr1, e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u C-0 em 1204 e 1244 cm-1.
[0267] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 54) estão presentes os picos referentes ao íon molecular [M+2]+ em m/z = 460,1058, ao [M+ Na +1]+ em m/z = 482,0868 e ao [dímero + 1]+ em m/z = 917,2051.
1.3.3) W- ( 4-aminobenzilideno ) -4- [ ( 3-0-acetilpiperidin-l- il ) metil ) benzoidrazida : 7c (LFQM-73)
[0268] No espectro no IV (Figura 55) da substância
LFQM-73 é possível verificar a presença das seguintes bandas: u N-H de amina primária em 3446 e 3350 cnr1, u N- H de amina secundária em 3217 cnr1, u C-H sp2 em 3032 cnr1, uas C-H sp3 em 2943 cnr1, us C-H sp3 em 2802 cm-1. É possível confirmar a obtenção do produto desejado pela presença de duas bandas distintas de carbonila: u C=0 em 1722 cnr1 e em 1649 cnr1, e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u C=0 em 1264 e 1248 cm-1.
[0269] A estrutura da LFQM-73 foi confirmada no espectro de RMN1!! (Figura 56), pelos singletos em õ 8,20 relativo ao hidrogénio 10' e em õ 2,04 referente a metila 10, além dos sinais referentes aos hidrogênios aromáticos e piperidínicos .
[0270] No espectro de RMN13C dept Q (Figura 57), pode-se observar o sinal em õ 170,9 referente ao carbono carbonílico C-9 do grupamento acetila, sinal em õ 165,8 referente ao carbono carbonílico C-7', o sinal em õ 62,0 referente ao carbono C-7 e, entre outros, apresenta o sinal em õ 19,7 referente ao carbono da metila C-10.
Tabela 13. Dados de RMN1 H e 13C dept Q da substância LFQM-73.
Posição õ 1H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 2,84; 2,67 m 56,4
3 4,83 m 69,4
4 1 ,91 ; 1 ,82 m 29,0
5 1 ,49; 1 ,31 m 22,1
6 2,30 m 52,9
7 3,67 s 62,0 9 -- - -- 170,9
10 2,04 s -- 19,7 V - - - 123,0 2' 7,90 d 5,00 127,3 3' 7,51 d 10,00 129,2 4' -- - -- 141 ,5 5' 7,51 d 10,00 129,2 6' 7,90 d 5,00 127,3 Τ - - - 165,8 10' 8,20 s -- 150,5 1 " -- - -- 1 14,1 2" 7,60 d 5,00 129,2 3" 6,72 d 5,00 1 13,4 4" -- - -- 151 ,1 5" 6,72 d 5,00 1 13,4 6" 7,6 d 5,00 129,2
[0271] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 58) estão apresentados os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 395,2077 e ao pico referente a perda do grupamento piperidinilacetila (m/z =143) [M+ 143 + Na]+ em m/z = 274,2746.
1.3.4) W- ( 4-clorobenzilideno ) -4- [ ( 3-0-acetilpiperidin-1 il) metil) benzoidrazida : 7e (LFQM-84)
[0272] No espectro no IV (Figura 59) da substância
LFQM-84 é possível verificar a presença das seguintes bandas: u N-H em 3226 cnr1, u C-H sp2 em 3047 cnr1, uas C- H sp3 em 2949 cnr1. É possível confirmar a obtenção do produto desejado pela presença de duas bandas distintas de carbonila: u C=0 em 1735 cm 1 e em 1653 cm 1, e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u C=0 em 1284 e 1246 cm-1.
[0273] No espectro de RMN de ¾ (Figura 60) da substância LFQM-84 observam-se entre outros sinais, o singleto referente à metila da subunidade acetato em 5 1,22 e o singleto referente ao H-10' em 5 8,73 ppm.
[0274] No espectro de RMN de 13C da substância LFQM-
84 (Figura 61) observam-se entre outros sinais, o sinal referente à metila da subunidade acetato em 5 22,5, o sinal em referente ao C-10' em 5 143,4, os sinais referentes aos carbonos carbonilicos C-7' em 5 162,3 e C-9 em 5 172,4 ppm.
Tabela 14. Dados de RMN1 H e 13C da substância LFQM-84.
Posição õ 1 H (ppm) m - (Hz) õ 13C (ppm)
2 2,19 m 56,4
3 3,84 m 67,7
4 1 ,90 - 1 ,98 29,7
5 1 ,90- 1 ,98 16,4
6 1 ,90 - 1 ,98 54,8
7 3,35 s 60,8
9 172,4
10 1 ,22 s 22,5 r 132,0
2' 7,91 d 8,00 127,5
3' 7,57 m 131 ,0
4' 139,0
5' 7,57 m 131 ,0 6" 7,91 d 8,00 127,5
T - - - 162,3
1 0' 8,73 s -- 143,4
1 " - - -- 1 32,0
2" 7,91 d 8,00 1 33,7
3" 7,69 d 8,00 128,6
4" - - -- 1 36,6
5" 7,69 d 8,00 128,6
6" 7,91 d 8,00 1 33,7
[0275] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 62) estão apresentados os picos referentes ao ion molecular [M+l]+ em m/z = 414,1575, ao [M+ Na]+ em m/z = 436,1361 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 849,2846.
1.3.5) W- (4-Q-acetilbenzilideno) -4- [ (3-0-acetilpiperidin- 1-il) metil) benzoidrazida : 7f (LFQM-87)
[0276] No espectro no IV (Figura 63) da substância
LFQM-87 é possível verificar a ausência da banda de u O-H e a presença das seguintes bandas: u N-H em 3248 cnr1, u C- H sp2 em 3070 cm-1, uas C-H sp3 em 2947 cm-1, us C-H sp3 em 2798 cm-1 É possível confirmar a obtenção do produto desejado pela presença de três bandas distintas de carbonila: u C=0 em 1762, 1732 e, em 1656 cnr1, e dentre outras, apresenta as bandas referente ao u C=0 em 1282, 1251, 1222 e 1197 cnr i.
[0277] No espectro de massas de alta resolução
(Figura 64) estão apresentados os picos referentes ao íon molecular [M+l]+ em m/z = 438,2023, ao [M+ Na]+ em m/z = 460,1814, ao [dimero + 1]+ em m/z = 875,3948 e ao [dimero + Na]+ em m/z = 897,3774. Exemplo 2: Avaliação farmacológica
2.2.1 Avaliação da atividade anticolinesterásica, seletividade e mecanismo de ação
[0278] Todas as 18 novas acilidrazonas obtidas LFQM- 54-58, LFQM-65-68, LFQM-72- 76, LFQM-83, LFQM-84, LFQM-87 e LFQM-88 com substituintes -OH ou -OAC na posição 3 da subunidade piperidinica foram avaliadas, in vitro quanto à capacidade inibitória de AChE, inicialmente na concentração 100 μΜ, utilizando o protocolo de Ellman modificado e a AChE comercial purificada de Electrophorus electricus. Os resultados revelaram que os derivados acilidrazônicos hidroxilados na subunidade piperidinica apresentaram maior potência anticolinesterásica, com atividade inibitória da AChE entre 65-91 % na dose de teste (Tabela 1) .
[0279] As 13 substâncias que apresentaram inibição acima de 60% foram selecionadas para determinação das curvas dose-resposta, potência inibitória e afinidade pela AChE. A determinação da curva dose-resposta revelou as substâncias mais potentes da série frente à inibição da AChE, sendo LFQM-57 a mais potente (IC50= 2,71 uM) , seguida de LFQM-67 (IC50= 8,65 uM) , LFQM-88 (IC50= 10,39 μΜ) , LFQM- 75 (IC50= 10, 89 uM) , LFQM-55 (IC50= 11, 89 uM) , LFQM-65 (IC50= 13,19 uM) e LFQM-66 (IC50= 14,73 uM, Tabela 1) .
[0280] A determinação dos valores de Ki para as moléculas mais ativas confirmou LFQM-57, LFQM-88 e LFQM-75 como os ligantes de maior afinidade pela AChE (Tabela 1) . Tabela 1 : Efeito in vitro da série de acilidrazonas análogas ao donepezil (100 μΜ) no ensaio de inibição daA ChE
Figure imgf000081_0001
[0281] As substâncias LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65,
LFQM-67, LFQM-75, LFQM-76 e LFQM-88 foram, então, submetidas a um estudo de seletividade AChE x BUChE e do mecanismo de ação, cujos resultados são mostrados nas Figuras 65 e 66.
[0282] O ensaio de seletividade in vitro mostrou que, de forma geral, as substâncias testadas são seletivas para a acetilcolinesterase com exceção da LFQM-67 que demonstrou inibir ambas as enzimas de modo semelhante. Merecem destaque as substâncias LFQM-57, LFQM-75 e LFQM-88 que apresentaram os maiores índices de seletividade neste ensaio .
[0283] Na avaliação do modo de inibição da AChE, o perfil dos gráficos obtidos para todas as substâncias avaliadas foi o mesmo e indicou que a inibição da enzima ocorre por um mecanismo não-competitivo simples. Neste tipo de mecanismo, a velocidade é diminuída em função da queda da concentração da enzima ativa causada pela ação do inibidor, que não apresenta semelhança estrutural com o substrato e pode se ligar tanto ao complexo enzima- substrato, quanto à enzima livre, em um sítio de ligação diferente do sítio de ligação do substrato (Figura 66) . 2.2.2. Avaliação in vivo da atividade sobre a amnésia colinérgica no modelo de reconhecimento de objeto novo
[0284] Nestes ensaios foram utilizados camundongos suíços, tratados com volume igual a 1 mL/100 g de massa corporal pelas vias de administração intraperitoneal (i.p) e oral (v.o) . A escopolamina e o donepezil, utilizados nos experimentos foram dissolvidos diretamente em solução salina (NaCl 0,9%) e as substâncias-teste foram dissolvidas em polissorbato 80 na concentração de 5%.
2.2.2.1. Reconhecimento de Objeto Novo
[0285] A tarefa de reconhecimento de objeto novo foi conduzida em uma arena circular (40 cm diâmetro x 30 cm altura) com o fundo e as paredes pretas e em ambiente de penumbra. Durante 3 dias consecutivos foi realizada a ambientação dos animais às condições experimentais, colocando-os na arena para livre exploração do ambiente por um período de 10 min a cada dia. No quarto dia, foram realizadas a sessão treino e a sessão teste. Na sessão treino, os animais foram novamente colocados na arena por um período de 10 min na presença de dois objetos idênticos.
[0286] 0 comportamento exploratório foi definido como o ato de cheirar ou tocar o objeto com o focinho ou as patas dianteiras e o tempo de exploração foi registrado. A sessão teste foi realizada com os animais colocados em contato com um objeto familiar e um objeto novo e, novamente, o tempo de exploração dos objetos foi registrado durante um período de 5 minutos. Os objetos eram feitos do mesmo material, possuíam a mesma textura, tamanhos similares, porém formas e cores distintas. Tanto a identidade do objeto novo quanto a sua posição na arena foram randomizadas . Os mesmos foram devidamente higienizados com etanol 10% entre uma sessão e outra, para evitar a influência de pistas olfatórias. Foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) tempo total de exploração dos objetos nas sessões treino e teste (s); 2) distância percorrida pelos animais no interior da arena nas sessões treino e teste (cm); 3) tempo percentual de exploração do objeto familiar e do objeto novo na sessão teste.
[0287] Para garantir a formação da memória foi estabelecido como tempo de corte um mínimo de 10 s na exploração total dos objetos na sessão treino. No teste, considerou- se um tempo mínimo de 5 s de exploração. Todas as sessões foram filmadas. A distância total percorrida (cm) pelos animais no interior da arena foi determinada com o auxílio do programa MouseGlob (Castro & Castro) .
[0288] As diferentes substâncias foram administradas por gavagem, no quarto dia de experimento, em solução salina (NaCl 0,9%) das substâncias LFQM-56 (100 μπιοΐ/kg ou 37 mg/kg), LFQM-57 (100 μπιοΐ/kg ou 38 mg/kg), LFQM-67 (100 μπιοΐ/kg ou 36 mg/kg), LFQM-75 (100 μπιοΐ/kg ou 42 mg/kg), LFQM-88 (100 μπιοΐ/kg ou 38 mg/kg) . Trinta minutos após, foi realizada a indução da amnésia colinérgica pela administração de escopolamina i.p. (0,99 μπιοΐ/kg) , os grupos controle receberam salina pela mesma via. A sessão treino teve inicio 30 min após a administração do segundo tratamento (Figura 68) .
[0289] Os dados experimentais do ensaio de reconhecimento de objeto novo estão mostrados na tabela 2, mostrando o tempo total de exploração dos objetos pelos animais nas sessões treino e teste. Podemos observar que não houve uma diferença significativa entre os diferentes grupos experimentais, descartando assim a influência deste parâmetro nos demais resultados.
Tabela 2: Efeito das substâncias LFQM-56, LFQM-57, LFQM-67, LFQM-75 e LFQM-88 (100 pmol/kg v.o.) sobre o tempo total de exploração dos objetos nas sessões treino e teste (n = 05 - 19).
Tempo Total de Exploração dos Objetos
Tratamentos
Treino3 Teste b
SAL + SAL 87,01 ±9,23 25.91 ± 2,34
LFQM5G + SAL 53,20 ± 8,04 17.92 + 3,78 LFQM57 + SAL 56,35 ±13,99 29,63 ± 8,04 LFQM67 + SAL 84,25 ±19,76 19,48 + 8,49 LFQM75 + SAL 56,80 ±16,86 18,82 ±5,92 LFQM88 + SAL 69,17 ±10,46 38,88 + 10,48
SAL + SCP 74,43 ±10,60 28,37 ± 4,36 LFQM56 + SCP 82,54 ±13,38 23,98 ± 3,79 LFQM57 + SCP 78,59 ±16,52 29,99 + 7,14
LFQM67 + SCP 84,01 ± 17,04 30,88 ± 9,60
LFQM75 + SCP 81 ,91 ±23,13 20,56 + 7,45
LFQM88 + SCP 64,56 ±10,15 37,40 ± 7,91 aANOVA: Fn,i26 = 0,854; P = 0,587 bANOVA: Fi
Figure imgf000085_0001
1 ,140; P=0,337
[0290] Na figura 69A são apresentados os resultados do teste de reconhecimento de objeto para os animais tratados apenas com as substâncias-teste e salina. Podemos observar que o grupo controle (tratamento apenas com solução salina) reconhece o objeto familiar e, desta forma, passa significativamente mais tempo explorando o objeto novo (Teste t pareado: t = 4,405; P < 0,001) . O tratamento com LFQM-67 não interfere na formação de memória, o que pode ser observado por um tempo significativamente maior de exploração do objeto novo (Teste t pareado: t = 4,040, P = 0, 007) . O tratamento com LFQM-75 e LFQM- 88 também não afetam a memória dos animais, sendo apenas necessário o aumento do número de animais nestes grupos para que a significância possa ser demonstrada (Teste t pareado: t = -1, 258; P = 0, 249; n = 08 / t = 2,221; P = 0, 090, n = 05; respectivamente) . Já os animais tratados com LFQM-56 e LFQM- 57 tiveram a memória de reconhecimento prejudicada pelas substâncias, o que pode ser evidenciado pela ausência de diferença no tempo de exploração entre o objeto familiar e novo (Teste t pareado: t = 0,233; P = 0,819 / t = 0,601; P = 0,570; respectivamente) .
[0291] A figura 69B demonstra o efeito das substâncias-teste sobre a amnésia induzida por escopolamina nos animais. Como esperado, o grupo de animais tratados apenas com escopolamina não mostra preferência pelos objetos, demonstrando que os animais não possuem memória do objeto familiar e, portanto, exploram os dois pelo mesmo período de tempo (Teste t pareado: t = 1,435; P = 0,168) . LFQM-57 (Teste t pareado: t = 0,128; P = 0,902), LFQM-67 (Teste t pareado: t = 0,064; P = 0,951) e LFQM-88 (Teste t pareado: t = 0,029; P = 0,978) não foram capazes de reverter a amnésia colinérgica.
[0292] Anteriormente, havíamos encontrado um efeito de reversão da amnésia colinérgica com o uso da substância LFQM-56. Porém, com o aumento do número de animais tratados, a variabilidade dos dados resultou em perda da significância estatística anteriormente encontrada para este grupo experimental (Teste t pareado: t = 1,843; P = 0,090; n = 13) (figura 2) . Este dado, associado ao efeito amnésico demonstrado para esta substância (figura 1) faz com que LFQM-56 não seja mais considerado um bom candidato para a continuação dos estudos farmacológicos.
[0293] Por outro lado, o tratamento com LFQM-75 que demonstrou a capacidade de reverter a amnésia colinérgica em nosso ensaio (Teste t pareado: t = 3,471; P = 0, 008) (figura 69), sendo interessante continuar a explorar o seu perfil farmacológico em outros modelos de memória relevantes para a Doença de Alzheimer.
[0294] Além da exploração dos diferentes objetos pelos animais, durante a realização dos experimentos, também foi avaliada a locomoção espontânea dos mesmos. A figura 70 mostra a distância total percorrida (em cm) pelos animais no interior da arena nas sessões treino e teste. Podemos observar que as substâncias teste não alteram a locomoção dos animais em nenhuma das sessões (nem no treino, nem no teste) . Esses dados corroboram dados anteriormente relatados pelo grupo para LFQM-56 e LFQM-67 no modelo de campo aberto. Porém, detectou-se um aumento significativo da locomoção nos animais tratados com escopolamina . Este efeito já é relatado na literatura para este fármaco e pode estar relacionado ao bloqueio de receptores muscarinicos na região do estriado.
[0295] O efeito hiperlocomotor da escopolamina não é inibido pelo pré-tratamento com LFQM-56 e LFQM-88. Já LFQM-57 e LFQM-67 causam uma inibição parcial do efeito hiperlocomotor da escopolamina, por não haver diferença significativa no deslocamento comparado com o controle negativo (SAL+SAL) nem com o controle positivo (SAL + escopolamina) . A substância LFQM-75 apresenta um perfil mais complexo, revertendo parcialmente a hiperlocomoção apenas na sessão treino, e não na sessão teste.
[0296] Como parte das orientações da última reunião de avaliação do INCT-INOFAR (2013) todos os experimentos deveriam, na medida do possível, utilizar o donepezil como referência, uma vez que a série-alvo foi inspirada estruturalmente em tal fármaco. Na tentativa de seleção da dose de donepezil, apesar de utilizar o fármaco de fornecedores distintos, foram encontradas várias dificuldades experimentais. Foram testadas três doses diferentes (2, 5 e 10 mg/kg v.o), e conhecendo-se o efeito hipolocomotor deste fármaco na dose de 20 mg/kg v.o. e, ainda, considerando a escassez de dados com a administração desta substância a camundongos por via oral, consideramos mudar a via de administração para i.p. (Figura 73) .
2.2.3 Avaliação da atividade anti-inflamatória [0297] Toda a série-alvo das concretizações aqui reveladas foi submetida a uma triagem in vivo para avaliação da atividade anti-inflamatória periférica, utilizando-se o teste de aloidinia mecânica ou de pressão em pata de camundongos (Von Frey eletrônico) .
[0298] Neste modelo experimental, a hipernocicepção é induzida pela injeção intraplantar de carragenina e a tensão medida pelo transdutor é registrada quando o animal retira a pata. A tensão aplicada na pata foi repetida até que se conseguissem duas medidas similares. Os camundongos foram colocados em uma caixa de acrílico (12x10x17 cm de altura) por 30 minutos antes do teste para que eles fossem ambientados. Durante esse período de adaptação, as patas dos animais foram tocadas 2-3 vezes com a ponta do transdutor e, após esse período, a leitura basal foi realizada. Após uma hora dos tratamentos, os animais receberam uma injeção intraplantar de carragenina 100 pg/pata e registrou-se a sensibilidade nociceptiva de cada animal, depois de três horas da aplicação da carragenina (Figuras 74 e 75) .
[0299] Este modelo experimental revelou as substâncias LFQM-56, LFQM-65, LFQM-66, LFQM-67, LFQM-68, LFQM-73, LFQM-74, LFQM-75, LFQM-76, LFQM-83 e LFQM-84 com o melhor perfil anti-inflamatório, sendo capazes de diminuir a intensidade de hipernocicepção dos camundongos de modo comparável ou melhor que a indometacina . As substâncias que apresentaram melhor perfil de atividade foram então submetidas ao ensaio de hiperalgesia induzida por formalina, visando avaliar as propriedades analgésicas associadas ao efeito anti-inflamatório . [0300] Neste ensaio, os animais receberam a administração intraplantar de uma solução de formalina e exibem comportamento nociceptivo espontâneo reconhecido e quantificado pela observação da quantidade de lambidas na pata lesada. Este ensaio é caracterizado por duas fases distintas de avaliação: uma primeira fase, chamada neurogênica ou fase inicial, que compreende os primeiros 5 minutos e, está associada à excitação de nociceptores periféricos, antes de iniciada a resposta inflamatória. Numa segunda fase, durante 10-15 minutos, é avaliada a resposta de sensibilização central dos animais à sensação dolorosa, mediada por citocinas e quimiocinas oriundas do processo inflamatório tecidual, sendo, portanto, a fase que melhor representa a avaliação anti-inflamatória de substâncias de interesse.
[0301] Os resultados do ensaio de formalina, na dose única de 100 μπιοΐ/kg por substância-teste , indicaram que as substâncias LFQM-54, LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-75, LFQM-76 e LFQM-84 apresentaram na primeira fase, atividade antinociceptiva significativa comparada ao veiculo. Na fase inflamatória, as substâncias LFQM-54, LFQM-55, LFQM-56, LFQM-65, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-74 e LFQM-76 apresentaram atividade anti-inflamatória significativa (Figura 77) .
[0302] Inicialmente, uma análise comparativa dos resultados obtidos da avaliação anticolinesterásica in vitro e anti-inflamatória levou a evidências de que as substâncias LFQM-65 e LFQM-67 poderiam ser potentes candidatas a protótipos de fármacos de ação dupla enquanto que as substâncias LFQM-73 e LFQM-74 parecem ser promissoras como candidatas a protótipos de fármacos anti- inflamatórios . Dessa forma, essas 5 substâncias foram selecionadas para ensaios mais aprofundados de avaliação anti-inflamatória .
[0303] Como consequência dos primeiros resultados obtidos, as substâncias mais ativas nos ensaios de Von Frey e formalina foram submetidas ao teste de edema de pata induzido por carragenina, do qual foram obtidos os dados de potência anti-inflamatória (ID50) .
[0304] Neste experimento, foi feita a administração intraplantar de carragenina em uma das patas dos camundongos, provocando uma reação inflamatória reprodutível. O processo inflamatório induzido por carragenina se instala imediatamente após sua administração, resultante da ação combinada da liberação de prostaglandinas , bradicinina, histamina, taquicininas e espécies reativas de oxigénio. Nesta condição, os neutrófilos facilmente migram para os locais de inflamação e a resposta inflamatória é quantificada pelo aumento no tamanho da pata (edema) dos animais que é modulado por inibidores de moléculas específicas dentro da cascata inflamatória .
[0305] A medida do volume da pata do animal foi realizada após três horas da administração de carragenina, utilizando pletismógrafo , e o edema foi calculado pela diferença entre o volume final (após carragenina) e o volume inicial (sem carragenina) . Os dados obtidos neste ensaio demonstraram que as substâncias-teste foram capazes de reduzir significativamente o edema induzido por carragenina e que, de forma geral, as substâncias atuaram de modo comparável ao observado no grupo tratado com indometacina ( Figura 78) .
[0306] Os resultados obtidos neste ensaio, com medidas do volume da pata evidenciaram que as substâncias- teste foram capazes de reduzir significativamente o edema induzido por carragenina. De forma geral, as substâncias atuaram de modo comparável ao observado no grupo tratado com indometacina. A curva dose resposta para determinação da ID50 foi obtida deste mesmo experimento, por administração das moléculas-teste e da indometacina, como fármaco padrão, nas doses de 1, 3, 10, 30 e 100 pmol/Kg (Figura 79) na 3a hora (180 minutos) após a ad ministração da carragenina.
[0307] Os resultados obtidos neste ensaio evidenciaram que as substâncias-teste foram capazes de inibir 50% do edema em concentrações que variam de 2,67 μΜ para LFQM-74 que foi o derivado mais potente da série a 68,3 pM para LFQM-65, o menos potente. Porém, os resultados mais recentes da avaliação colinérgica in vivo, revelaram que LFQM-75 parece ser o melhor candidato a molécula-lider da série, a despeito de seu perfil anti-inflamatório ser inferior a outras substâncias da série. Este dado revelou a necessidade de determinação de sua DE50 em modelos de inflamação o que está sendo providenciado.
2.2.4 Avaliação do mecanismo de ação anti-inflamatória
[0308] Sabe-se que a inflamação é a consequência da resposta do organismo a danos físicos, infecções ou estimulação antigênica, no qual ocorre, geralmente, acúmulo local de fluido, proteínas plasmáticas e células do sistema imune. Apesar de complexa, a resposta inflamatória é desencadeada, principalmente, pela ação de citocinas pró- inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral-a (TNF- a) , interleucina- 6 e interleucina-ip . O macrófago é a principal célula responsável pela síntese destas citocinas em muitos tecidos, o que ocorre após o reconhecimento de substâncias imunogênicas por receptores intra ou extracelulares . Muitos tipos de substâncias endógenas ou oriundas de micro-organismos podem ativar estes receptores, conhecidos como receptor de reconhecimento de padrões, desencadeando a ativação de um serie de cascatas intracelulares, que fatalmente levam a ativação de fatores de transcrição. Quando ativados os fatores de transcrição translocam para o núcleo e se ligam a pontos específicos do DNA, permitindo a expressão de genes associados ao processo inflamatório. Dentre os fatores de transcrição mais envolvidos na indução da expressão de genes associados ao processo inflamatório, podemos destacar o fator de transcrição nuclear-kB (NF-kB) . O NF-kB pode ser formado por homo ou heterodímeros , de uma família de 5 membros: c- Rei (REL) , RelA/p65 (RELA), RelB (RELB) , p50/pl05 (NFKB1) e p52/pl00 (NFKB2) . O mais prevalente na maioria das células, assim como em macrófagos, é o heterodímero p65-p50 que, homeostaticamente, é inibido, sobretudo, pela interação de molécula inibitória kB-a (IkB-a) com a subunidade p65. Com a degradação da molécula inibitória, o NF-kB entra no núcleo e promove a expressão de vários genes, incluindo as citocinas pró- inflamatórias, ciclooxigenase e selectinas.
[0309] Como previamente demonstrado, os compostos LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65 e LFQM-67 demonstraram atividade anti-inflamatória em modelos in vivo de inflamação induzida por carragenina. Visto a importância do NF-kB na indução e manutenção do processo inflamatório, o efeito dos compostos sobre a ativação do NF-kB foi investigado em macrofagos RAW 264.7 in vi tro .
[0310] Para estes experimentos foram utilizados macrofagos RAW 264.7 estavelmente trans fectadas com o gene NF-KB-pLUC, para expressarem luciferase especificamente através do fator de transcrição NF-kB, como descrito por Cooper et al . (2010) . Os macrofagos foram cultivados em placas de 24 poços (3. IO5 células/poço), encubadas em estufa a 37° C, a tensão constante de 5% de C02, overnight. Antes da realização do experimento, os sobrenadantes foram substituídos, e as células foram pré-tratadas com concentrações de 0,1-100 pM para cada uma das substâncias- teste: LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65 e LFQM-67. Após 30 minutos, foi adicionado o lipopolissacarídeo (LPS; 1 pg/mL) para indução da ativação do NF-kB. Após 4 horas de encubação, os sobrenadantes foram removidos e as células foram lisadas, sendo uma alíquota (10 pL) retirada de cada poço e transferida para placa branca opaca junto a 25 pL de luciferina, reagente para ensaio de luciferase. A quantificação da luminescência gerada pela oxidação da luciferina, catalisada pela luciferase, foi realizada no FlexStation 3 Microplate Reader (Molecular Devices), com tempo de integração de 1000 ps.
[0311] Na tentativa de se identificar o mecanismo molecular pelo as substâncias-alvo reduzem a resposta inflamatória, foram utilizados macrofagos RAW 264.7-Luc, geneticamente modificados para expressar a enzima luciferase como indicador da atividade de NF-kB. Como o observado na Figura 80, o LPS induz o aumento das unidades de luminescência (o que pode ser interpretado como atividade do NF-kB) , porém nenhum dos compostos analisados mostrou-se capaz de inibir este efeito.
[0312] Diante destes resultados, conclui-se que, apesar dos compostos LFQM-56, LFQM-57, LFQM-65 e LFQM-67 apresentarem atividade anti-inflamatória em modelo experimental de inflamação induzida por carragenina, como previamente descrito, eles não regulam negativamente a ativação de NF-kB mediada por TLR4 in vitro.
[0313] No momento estamos iniciando ensaios específicos para avaliação do efeito destas substâncias sobre a COX-1, COX-2 e 5-LOX visando tentar elucidar o mecanismo de ação anti-inflamatório .
2.2.5 Avaliação do mecanismo de ação anti-neuroinflamatória e neuroprotetora utilizando modelo in vivo de malária cerebral
[0314] A malária cerebral é a principal complicação da infecção pelo Plasmodium falciparum. A fisiopatologia da doença está associada à adesão de hemácias parasitadas ao endotélio cerebral, levando a sua ativação. Como consequência, eventos celulares (como ativação e migração de leucócitos para o local, produção de citocinas pró- inflamatórias, tais como TNF-a, IL-lp, INF-y, IL-6, IL-12 bem como quimiocinas como MCP-1, RANTES, IL-8) e vasculares (aumento de expressão de moléculas de adesão e na permeabilidade vascular) são deflagrados. Como consequência da ativação da resposta imune, além da produção de citocinas, célula fagocíticas produzem espécies reativas de oxigénio e nitrogénio (ROS/NOS) para o controle da infecção. Porém, o desequilíbrio desta resposta pode levar a obstrução do vaso sanguíneo, hipoxia e hemorragia, característicos da malária cerebral. Concomitante a este fato, as células da glia são ativadas, corroborando com produção de citocinas pró-inflamatórias e ROS/NOS, gerando um processo neuro- inflamatório análogo a muitas doenças neurodegenerativas com a doença de Alzheimer.
[0315] O desequilíbrio na fisiologia cerebral, isto é, diminuição da receptação de glutamato e produção de ácido quinolínico, levam ao fenómeno de excitotoxicidade neuronal, via superativação de receptores NMDA, o que pode levar a morte neuronal.
[0316] Em modelos experimentais da doença (infecção de camundongos C57BL/6 com Plasmodium berghei ANKA) o estresse oxidativo pode ser considerado um marcador de disfunção cerebral associada à malária cerebral, podendo ser avaliado pela Peroxidação de lipídeos (como a formação de subprodutos como o malondialdeído ) , proteínas ou DNA. De forma a não exacerbar a produção de ROS, que é danoso também para células e tecidos, o organismo lança mão do sistema de glutationas que são capazes de detoxificar radicais livres. Todavia, quando estes últimos estão em excesso, ocorre o consumo do sistema, que experimentalmente, pode ser detectado em reação colorimétrica pelo uso do reagente de Ellman (DTNB) . Além disso, a ativação de granulócitos tem como marcador a enzima mieloperoxidase, presente nos grânulos de neutrófilos.
[0317] Desta forma, o uso de técnicas capazes de detectar a presença de estresse oxidativo bem como da atividade enzimática da mieloperoxidase podem ser utilizada como marcadores de neuro-inflamação no modelo de malária murina .
[0318] Neste presente trabalho, podemos observar que a substância LFQM-67 apresentou uma forte tendência a reduzir os níveis de malondialdeído, porém com consumo de tióis, e de mieloperoxidase, sugerindo um possível efeito anti-inflamatório e neuroprotetor .
Análises bioquímicas do tecido cerebral
[0319] Camundongos C57BL/6 machos com 6-8 semanas de idade (CEUA-L033/09) foram inoculados intraperitonealmente com 0.2 mL de uma suspensão de IO6 hemácias infectadas com parasita da malária Plasmodium berghei ANKA (PbA. O grupo controle foi inoculado com hemácias não infectadas. A formação de malondialdeído (MDA) foi realizada pela reação ao ácido tiobarbi túrico (TBARS), pela adição ao homogenato de cérebro do mesmo volume de ácido tiobarbitúrico a 0,67%. As amostras foram então levadas a aquecimento a 96°C, por 30 min. A quantidade de malondialdeído (MDA) foi determinada pela absorvância a 535 nm.
[0320] Avaliação dos níveis de tióis totais foi realizada no homogenato, que foi transferido para a solução 10% TCA. Após centrifugação 3000 rpm por 15 minutos a 4°C, foi adicionado um igual volume do sobrenadante de uma solução de TRIS-HC1 (0,4 M) contendo 20 mM de ácido 5,5'- dit ioni trobenzóico (DTNB) . A amostra foi lida a 412 nm.
[0321] Avaliação dos níveis de mieloperoxidase foi feita no tecido cerebral homogeneizado com 500 L de tampão PBS-HTAB, posteriormente centrifugado a 4000 rpm por 15 min a 4°C. O sobrenadante foi coletado e centrifugado novamente a 1200 rpm por 15 min. 50 μΐ de solução de homogeneização foram então adicionados a 50 do sobrenadante e 50 de o- dionisidina (duplicata), incubado a 37°C na leitora de placa por 15 min e foi adicionado 50 μΐ de solução de peróxido de hidrogénio (0, 006%) . O material foi incubado por mais 10 min a 37°C analisado em leitor de microplaca a 460 nm.
[0322] Foram avaliadas nesta concretização as substâncias LFQM-56, LFQM-57 e LFQM- 67, nas doses de 1, 5 e 10 μΜ, com tratamento realizado entre os dias 3 e 6 após a infecção por via oral.
[0323] A análise dos resultados não revelou diferenças significativas em relação ao nível de lipídeos peroxidados (MDA - Figura 82), ou quantidade de tióis livres (Figura 83) entre os animais infectados. O mesmo foi observado para análise de MPO (marcador de infiltração neutrofíica - Figura 84), porém a ausência de diferença estatística pode estar associada ao n experimental (n= 5/ grupo), sendo necessário repetir os experimentos.
[0324] As substâncias LFQM-56 e LFQM- 67 se mostraram as mais promissoras, pois tendem tanto a diminuir os níveis de MDA (mas com consumo de tiol), quanto da mieloperoxidase . 2.2.6 Avaliação da atividade antiamilóide in vivo
[0325] Este modelo animal foi realizado sob condições semelhantes ao descrito para o modelo de reversão de amnésia induzida por escopolamina quanto ao tratamento e ambientação dos animais. A proteína Abeta foi dissolvida conforme especificação do fabricante em uma concentração de 6mg/mL em água deionizada. Posteriormente, esta foi dissolvida em PBS estéril a uma concentração de 3mg/mL e colocada por 48h em estufa a 37°C para a ativação da proteína. No dia do experimento, a proteína já ativada foi dissolvida novamente em PBS estéril para a concentração de 400pmol .
[0326] Trinta minutos antes do procedimento de estereotaxia (cirurgia para a injeção intra-hipocampal da proteína Beta amilóide ou PBS) . Os animais receberam uma única injeção intra-peritoneal dos compostos testados, sendo que 10 minutos antes do procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados ( ketamina/xylasina) . Uma vez anestesiados os animais foram submetidos à tricotomia, para a retirada do pelo no entorno do campo cirúrgico. Os animais foram fixados através do dueto auditivo no estereotáxico (Insight) . Uma incisão foi feita para a exposição do crânio. Sendo feita a assepsia do local com álcool 70% e iodo. Com auxílio das coordenadas obtidas do atlas Paxino e Franklin 2007, foi identificada a região CAI do hipocampo e com o auxilio de uma broca foi realizada a perfuração da calota craniana e posterior inserção da agulha na posição correta para a injeção da proteína Abeta ou PBS (coordenadas a partir do bregma) . Após a injeção de 500 nL da Abeta ou PBS o local da cirurgia foi suturado e os animais voltaram para suas caixas onde permaneceram em aquecimento artificial até o final do efeito anestésico. Para evitar desidratação, os animais receberam um suporte de soro fisiológico.
[0327] Procedimento comportamental: Cinco dias após a cirurgia, a habituação dos animais foi feita por exposição durante 5 minutos à caixa teste, sem a presença dos objetos de teste. Esta é a chamada habituação para anular o efeito de novidade da caixa. Após a exposição, os animais retornaram às suas caixas .
[0328] Pré-Teste: No sexto dia, os animais foram novamente expostos à caixa por 10 minutos; porém, desta vez na presença de dois objetos exatamente iguais. Após a exposição, os animais retornaram às suas caixas. Este é o chamado pré-teste onde os animais têm contato com os objetos e adquirem a memória dos objetos que no 7° dia (teste) serão antigos e não representarão novidade em condições comportamentais em que o processo mnemónico esteja intacto.
[0329] Teste: 24 horas após o pré-teste, os animais são novamente expostos à caixa. Entretanto desta vez um dos objetos antigos (expostos aos animais no pré-teste) foi substituído por um objeto completamente novo para o animal. Este procedimento avalia a memória de longo prazo dos animais muito relacionada com a função hipocampal, local da injeção da proteína Abeta. Os animais são deixados na caixa por 5 minutos para interagir com os a objetos (novo e antigo) ( Figura 86) .
[0330] O índice de reconhecimento é calculado pela seguinte fórmula:
(Tempo de interação com o objeto novo) / (Tempo de interação com o objeto novo + Tempo de interação com o objeto velho) * 100
[0331] Animais com déficits mnemónicos possuem índice de reconhecimento inferior a 65%.
[0332] Como pode ser visto na Figura 87, ambas as substâncias LFQM-56 e LFQM-67 foram capazes de reverter significativamente a amnésia induzida pela administração de Ap, uma vez que o tempo de exploração do objeto novo em relação ao objeto antigo foi bastante superior ao grupo controle .
[0333] O experimento controle serviu para demonstrar que a preferência pelos objetos não reflete um comprometimento motor, ou seja, o animal é capaz de se locomover e interagir com o objeto novo. Os animais que receberam a proteína PA intra-hipocampal , não lembram que já haviam interagido com o objeto anteriormente.
[0334] Nas Figuras 88 e 89 são mostrados os dados da avaliação no mesmo modelo das substâncias LFQM-88 (nas doses de 50 e 100 pM) , LFQM-75 (100 pM) e LFQM- 57 (100 pM) . Novamente, todas demonstraram o mesmo perfil antiamiloide observado anteriormente para LFQM-56 e LFQM-67, aparentemente sem comprometimento do padrão locomotor.
[0335] O conjunto de resultados obtidos neste ensaio, sugerem que a injeção prévia dos compostos, previnem os déficits mnemónicos de longo prazo promovidos pela injeção intra-hipocampal da proteína βΑ.
[0336] Como comentado anteriormente, todos os experimentos deveriam utilizar o donepezil como referência. Portanto, os experimentos de avaliação das substâncias-alvo sobre o déficit mnemónico foi refeito, para comparação com o donepezil, fármaco de referência no tratamento atual da DA e utilizado como modelo estrutural no planejamento das moléculas em estudo. Na Figura 85 são mostrados os resultados preliminares desta avaliação, onde as substâncias LFQM-56 e LFQM-67 foram testadas nas doses de 25, 50, 100 e 200 uM, em comparação ao donepezil (5 mg/Kg) .
[0337] Importante salientar que neste novo protocolo, foram encontradas muitas dificuldades experimentais, com carência dos animais necessários (espécie e quantidade) , mas principalmente a alta taxa de mortalidade observada: Donepezil (60%), LFQM-56 (200uM, 60%), LFQM-56 (lOOuM, 45%), LFQM-56 (50uM, 20%), LFQM-67 (200uM, 70%), LFQM-67 (100 uM, 50%), LFQM-67 (50uM, 27%) . Este contratempo atrasou sobremaneira a condução os experimentos. A hipótese mais provável para mortalidade elevada parece ser o aumento da biodisponibilidade do donepezil e das substâncias-teste por v.o., com um consequente sinergismo com o anestésico, fazendo com que os animais não sobrevivessem à cirurgia, efeito este não observado nos experimentos cu a administração foi i.p.
[0338] Como forma de solucionar este obstáculo experimental, o protocolo foi modificado, com a administração das substâncias-teste por v.o. 1 dia após a cirurgia de injeção da proteína PA. Os experimentos seguindo este novo protocolo estão em andamento.
[0339] Na Figura 85 são mostrados os resultados obtidos com os animais que sobreviveram à cirurgia estereotáxica, seguindo o protocolo inicial, com administração das sustâncias-teste antes do procedimento cirúrgico .
[0340] Como pode ser observado, mesmo nas doses menores, novamente as substâncias lfqm-56 e lfqm-67 mostraram-se capazes de reverter o deficit mnemónico induzido pela proteína PA, de modo análogo ao observado para o fármaco donepezil.
[0341] Como meta adicional à reavaliação de todas as substâncias-líder da série utilizando o novo protocolo proposto, serão realizados estudos imunohistoquímicos para tentar-se identificar om mecanismo de ação anti-amiloide observado .
2.2.7 Avaliação da atividade locomotora em modelo de campo aberto e rota rod.
[0342] Visando avaliar o efeito das substâncias- teste na função motora e no comportamento dos animais submetidos a um ambiente restrito, possivelmente indicando um efeito central e adverso, as substâncias-lider da série foram submetidas à avaliação no ensaio de campo aberto. Neste experimento, após 1 hora do tratamento oral com as substâncias-teste na dose de 100 pM, cada camundongo foi colocado individualmente em uma arena circular de acrílico dividido em quadrantes, dos quais 8 junto às paredes do aparato foram considerados periferia e os 4 demais, os centrais. Cada camundongo foi colocado no centro da arena e filmado por 5 minutos para posterior análise. Foi registrado o número de cruzamentos com as quatro patas no centro, na periferia, o número total de entradas e o número de "rearings" (exploração vertical) . Os resultados são apresentados na figura 86 e revelaram claramente que nenhuma das substâncias alterou o comportamento ou a locomoção dos animais na dose de teste, corroborando os resultados obtidos anteriormente no modelo de amnésia colinérgica induzida por escopolamina e no modelo de déficit mnemónico induzido por PA.
Avaliação da citotoxicidade e Genotoxicidade
[0343] A citotoxicidade foi avaliada pela viabilidade celular no teste de MTT que é um teste usado para avaliar a viabilidade celular, de execução rápida e objetiva, baseado em uma reação colorimétrica . O sal MTT (brometo de 3- (4, 5-dimetilazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazólio) entra na mitocôndria da célula viável e é clivado pela enzima succinato desidrogenase, produzindo cristais formazan, de coloração azul escuro. A quantidade de cristais formada é diretamente proporcional ao número de células viáveis. Assim, quanto mais escura a coloração ao final da reação, maior é a viabilidade celular.
[0344] A suspensão celular de monócitos normais, obtidos de sangue humano, na concentração de 2,4x106 células/mL foi distribuída em uma placa de 96 poços, 90 pL por poço, e incubadas a 37 °C em incubadora a 5% de C02, juntamente com mais 10 pL da amostra teste. Neste estudo foram utilizadas diferentes concentrações (100; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8; 3,9; 1,95; 0,48; 0,24; 0,06 pg/mL) dos compostos testados e placa foi incubada por 48 h.
[0345] Após o período de incubação adicionou-se mais
10 pL do corante MTT (5 mg/mL) e as células foram novamente incubadas por mais 4 h. Em seguida, o meio foi retirado cuidadosamente e adicionaram-se 100 pL de DMSO para solubilização dos cristais de formazana. As placas foram agitadas durante 5 minutos e a absorvância correspondente a cada amostra foi medida no leitor de ELISA a 560 nm. A absorbância obtida das células controle, não-tratadas , foi considerada como 100% de viabilidade celular.
[0346] Os dados foram avaliados utilizando regressão linear para se obter os valores de CC50 e CC90 (concentração citotóxica para 50% e 90% das células, respectivamente) .
[0347] Na tabela 4 são apresentados os dados obtidos no ensaio de viabilidade celular, que indicou que as substâncias mais ativas da série, aparentemente, são pouco citotóxicas. A substância LFQM-56 é a mais citotóxica com uma CC50 (concentração citotóxica para 50% das células) de 197,4 pmol/L. Porém, vale ressaltar que a IC50 da LFQM-56 para a inibição da AChE é de 25,9 pM ou seja, aproximadamente 8 vezes menor que sua dose citotóxica.
Tabela 4: Dados da avaliação de citotoxicidade frente a monócitos de sangue humano para as substâncias LFQM-56, LFQM-57, LFQM-67, LFQM-73, LFQM-
75, LFQM-88
Figure imgf000104_0001
[0348] A genotoxicidade foi avaliada pelo Ensaio de
Micronúcleo com bloqueio de citocinese usando células derivadas de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) . Esse modelo tem sido amplamente estudado para avaliar a atividade genotóxica de diferentes compostos incluindo os protótipos a fármacos. As células da linhagem HepG2 mantêm a atividade das enzimas relacionadas à biotrans formação , as quais desempenham importante papel na ativação de carcinógenos e de agentes genotóxicos.
[0349] Os micronúcleos (MNs) surgem ao término do processo de divisão celular e são constituídos por fragmentos cromossômicos acêntricos (efeito clastrogênico ) ou por cromossomos inteiros (efeito aneugênico) que foram excluídos do núcleo principal devido, respectivamente, a quebras cromossômicas ou alterações no aparelho mitótico. Assim sendo, o teste de micronúcleo representa uma das abordagens metodológicas comumente empregadas nos estudos de genotoxicidade. [0350] As células HepG2 foram semeadas em placas de
12 poços (inoculo de 2 x IO5 células/mL) contendo meio de cultura (Dulbecco's Modified Eagle's Médium - DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) . Após 24h, as culturas foram tratadas com os diferentes compostos na concentração de 50 pM por 3h. Ao término do tratamento, as culturas foram lavadas com PBSA e tratadas por mais 26h com citocalasina (3 pgqmL) , um inibidor de polimerização dos filamentos de actina, que determina o bloqueio da citocinese. Dessa forma, as células que estão em intensa atividade proliferativa concluem a divisão nuclear, mas não concluem a divisão do citoplasma. Esse método permite o enriquecimento de células binucleadas na cultura, as quais são utilizadas para a determinação na frequência de MNs. As células foram coletadas por digestão enzimática ( tripsina/EDTA) , centrifugadas a 800 rpm, imersas em solução hipotônica (1% de citrato de sódio a 4°C) e fixadas em metanol/acido acético (3:1) . As preparações citológicas foram feitas utilizando-se lâminas previamente limpas, as quais ficaram imersas em água destilada a 4 °C . Após secas, as lâminas foram coradas com Giemsa (1:20 em tampão fosfato) por 10 minutos. A análise foi realizada em microscópio de luz (aumento 400x) e os dados apresentados representam a média de 3 amostras por tratamento.
[0351] Considerando que danos causados ao DNA por exposição a agentes mutagênicos são expressos em Micronúcleos (MNs) após um ciclo de divisão celular, é importante determinar o índice de divisão nuclear (IDN), antes de analisar a frequência de MNs, para detectar se as condições experimentais testadas não afetam a taxa de proliferação da linhagem HepG2. O cálculo do IDN foi realizado segundo a equação: IDN = (Ml + 2.M2 + 3.M3 + 4.M4)/N, onde M1-M4 representam as populações celulares com um, dois, três ou quatro núcleos e N representa o número total de células contadas por amostra. Para a determinação do índice de divisão nuclear (IDN) 500 células foram contadas por amostra e para a determinação na frequência de micronúcleos 1000 células binucleadas foram contadas por amostra, cujos critérios para a identificação de células binucleadas e micronúcleos foram descritos por Fenech (2000) .
[0352] Os resultados mostraram que os compostos testados (LFQM-56, LFQM-57, LFQM-67, LFQM-75 e LFQM-88) exercem atividade citostática sobre células HepG2 quando utilizados na concentração de 50 pM por 3h (Figura 87) .
[0353] Diante dos resultados obtidos, uma nova série experimental foi realizada de modo que a concentração testada foi reduzida para 20 pM. A determinação do IDN mostrou que nesta concentração nenhum dos compostos exerceu atividade cistostática significativa (Figura 88) . Dessa forma, a frequência de MNs foi determinada, segundo os critérios estabelecidos por Fenech (2000) . A figura 89 mostra os resultados relacionados à determinação do potencial genotóxico dos compostos testados, considerando a frequência de MNs em células binucleadas. Os compostos LFQM-57, LFQM-67 e LFQM-75 induziram aumento significativo (p<0.05) na frequência de micronúcleos indicando que os referidos compostos apresentam atividade genotóxica sobre a linhagem HepG2 quando utilizados na concentração de 20 pM. Novas séries experimentais estão em andamento para avaliar se esse resultado se mantém quando as culturas são tratadas com 10 pM e 5 pM.
[0354] Em paralelo ao teste de micronúcleo estão sendo realizados ensaios para verificar o potencial dos compostos em induzir quebras (fita simples e dupla) na molécula de DNA. Essa abordagem está sendo investigada por meio do ensaio de cometa que permite identificar quebras na molécula de DNA em células isoladas. Em conjunto, os dados obtidos no teste de micronúcleo e no ensaio do cometa permitirão alcançar resultados conclusivos quanto à atividade genotóxica dos compostos testados.
3. Estimativas in silico de parâmetros químicos, físico- químicos e ADME
[0355] Os parâmetros ADME, além de alguns dados químicos e fí sico-químicos foram previstos in silico, utilizando o Programa QikProp v. 3.5, desenvolvido pela Empresa Schrodinger.
[0356] Os dados mais relevantes são apresentados na tabela 3 e indicam que as substâncias-líder estão perfeitamente dentro dos parâmetros de referência que o programa gera, segundo o fabricante, a partir de 95% dos fármacos disponíveis aprovados. Além de parâmetros ADME, são apresentados ainda valores de volume molecular, previsão de sítios de metabolização, solubilidade em água (log S) e da qualidade de absorção humana.
[0357] Considerando este estudo, em comparação com os dados experimentais obtidos, percebe-se uma convergência entre, por exemplo, as substâncias que tiveram atividade dupla e os parâmetros previstos para atividade no sistema nervoso central; resultado semelhante foi observado para, aquelas cu a previsão indicou fraca ou ausência de atividade no SNC e que, de fato, demonstraram um melhor perfil anti- inflamatório .
Tabela 3. Estimativas in silico de parâmetros químicos, físico-químicos e ADME das substâncias-líder da série-alvo e do donepezil
LFQM-56 LFQM- LFQM-67 LFQM- LFQM- LFQM-75 LFQM-88 dpz
Perfil de ADa lAChE AD Alc Al lAChE lAChE lAChE
Descritor/
VR*
Darâmtetro
Massa 371 ,866 384,434 355,411 394,472 422,526 420,553 383,507 379,498 130-725
Metabólito Desalq. Desalq. Desalq. Desalq. Desalq. Desalq. de Desalq. H-benzílico s primários amina; amina; amina; amina; H- de amina; amina; amina; ->RO ; a,P- ou grupos ROH 2° ROH ROH benzílico ROH ROH 2°-> ROH desidrogen funcionais ^RCOR; 2°→RCO 2°→RCOR →ROH; 2°→RCO RCOR; H- 2°→RCOR ação na reativos H-benzílico R; H- ; H- NH tipo R; H- tipo ;H- C=0;
Volume 1210,396 1245,471 1182,380 1315,137 1392, 1429,326 1284,767 1266,695 500
Log P 3,330 1 ,785 3,076 2,559 3,043 3,939 3,451 4,368 -2,0-6,5
Log S -
-4,636 -3,559 -4,272 -4,543 -5,730 -4,846 -4,477 -6,5-0,5
Log K HSA 0,350 0,017 0,280 0,314 0,313 0,726 0,403 0,569 -1 ,5-1 ,5
Log BB
-0,641 -2,152 -0,685 -1 ,784 -0,914 -0,810 0,189 -3,0-1 ,2
(cérebro/sa 0,867
Atividade
+ - + - +/- +/- +/- +
Bloqueio - < -5
-7,055 -7,004 -7,023 -7,214 -7,157 -7,139 -6,608
% <25%
86 59 84 68 84 89 87 100
absorção baixa
Qualidade alta média alta Média Alta alta alta alta >80%
*VR = intervalo ou valor recomendado para 95% dos fármacos conhecidos (fonte: QikProp 3.2 Manual User - Schrodinger Software)
**definido após avaliação farmacológica in vitro e in vivo da série-alvo aAD= atividade dupla: inibitória de AChE e anti-inflamatória bIAChE = atividade inibitória de AChE CAI = atividade anti-inflamatória
[0358] Os valores de clog P, capacidade de ligação à albumina sérica, absorção humana foram adequados quanto aos valores de referência e em comparação com o donepezil, e são preditivos importantes para antecipar parâmetros de biodisponibilidade . Esclarecemos ainda que as substâncias LFQM-75 e LFQM-88 são membros da série-alvo original, mas inicialmente foram observadas somente atividade anti- colinesterásica relevante e estão sendo tratadas com interesse meramente académico, fora do escopo do INCT- INOFAR. Todavia, o conjunto de dados mais completos disponíveis no momento revelou que LFQM-75 pode ser um importante candidato a fármaco multi-alvo, o que ficou evidenciado nos modelos in vivo de avaliação colinérgica e de déficit mnemónico. O único dado preocupante parece ser relativo a um possível bloqueio de canais de herg K+, o que seria um indicativo de toxicidade cardíaca, merecendo, portanto, confirmação experimental.
4. Conclusões e perspectivas
[0359] Os resultados obtidos no desenvolvimento do projeto levaram à seleção de 5 substâncias com perfil de atividade dupla ou anti-inflamatória, ambas de interesse farmacêutico. Em decorrência das últimas avaliações, foram delineadas várias etapas adicionais para avaliação farmacológica que incluíram a avaliação in vivo nos modelos de formalina, edema de pata para determinação das propriedades e da potência anti-inflamatórias . Além disso, as substâncias também foram avaliadas no modelo de campo aberto, revelando que nenhuma apresenta efeitos de sedação, alteração comportamental e na locomoção dos animais. Alguns parâmetros ADME foram avaliados computacionalmente, indicando que as substâncias devem apresentar biodisponibilidade adequada.
[0360] Do conjunto de dados obtidos, são propostos
3 grupos de substâncias com perfis de atividade distintos. As substâncias LFQM-57, LFQM-75 e LFQM-88 foram as mais potentes inibidoras seletivas da AChE, inibindo a 100 μΜ cerca de 91,7%, 81,8% e 81,3% da atividade enzimática, com IC50 = 2.71, 10.89 e 10.39 μΜ, respectivamente, sem, contudo apresentarem atividades anti-inflamatórias significativas. As substâncias LFQM-73 (ID50 edema = 4.20 μπιοΐ/kg) e LFQM- 74 (ID50 edema = 2.67 μπιοΐ/kg) apresentaram os melhores perfis de atividade anti-inflamatória, porém, não apresentaram atividade anticolinesterásica . Já as substâncias LFQM-56 (IC50 AChE = 25.39 μΜ; ID50 edema = 8.76 μπιοΐ/kg) e LFQM-67 (IC50 AChE = 8.65 μΜ; ID50 edema = 4.66 μπιοΐ/kg) demonstraram os melhores perfis de ação dupla da série.
[0361] Os resultados mais recentes revelaram que as substâncias mais promissoras com perfil de ação múltiplo são LFQM-67 e LFQM-75, capazes de exercer efeitos significativos em modelos in vivo de reversão de amnésia induzida por escopolamina e de déficit mnemónico induzido pela proteína PA, além de efeito neuroprotetor, evidenciado no modelo de malária cerebral. Por outro lado, as substâncias LFQM-73 e LFQM-74, que demonstraram perfis de ação anti-inflamatórios relevantes, continuam a ser estudados para elucidação do mecanismo de ação. Nos ensaios de citotoxicidade e genotoxicidade, aparentemente, estas substâncias-lider em cada perfil são pouco tóxicas, porém ensaios adicionais estão em andamento para conclusão sobre a efetiva toxicidade in vitro e indicar a necessidade de avaliação de embriotoxicidade .
[0362] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

Reivindicações
1. Composto caracterizado por ser representado pela fórmula I :
Figure imgf000112_0001
em que
RI é escolhido do grupo que consiste de: OH, CH3CHOO , oxialquila, oxiarila e carbamoila; e
R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, NO2, OMe, 3-pirrolidinil , F, NH2, 4-morfolinil , 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc, triazolila, aminoalquila, aminoarila, 0- alquila, arila, carbamoila, NHCO-alquila, e NHCO-arila.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por RI ser escolhido do grupo que consiste de: OH e CH3CHOO ; e R2 ser escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolil, 4- piperidinil, imidazol, SMe e OAc.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser representado pela fórmula II:
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
Figure imgf000113_0001
em que
RI é escolhido do grupo que consiste de: OH, CH3CHOO , oxialquila, oxiarila e carbamoila; e
R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, NO2, OMe, 3-pirrolidinil , F, NH2, 4-morfolinil , 4-piperidinil , imidazol, SMe, OAc, triazolila, aminoalquila, aminoarila, 0- alquila, arila, carbamoila, NHCO-alquila, e NHCO-arila.
4. Composto de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por RI ser escolhido do grupo que consiste de: OH e CH3CHOO ; e R2 ser escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil, F, NH2, 4-morfolil, 4- piperidinil, imidazol, SMe e OAc.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por ser escolhido do grupo que consiste dos compostos representados pelas fórmulas III a
Figure imgf000113_0002
I, (LFQM 57) IV, (LFQM 75)
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000114_0002
VI, (LFQM 73) VII, (LFQM 74)
Figure imgf000114_0003
IX. (LFQM 67).
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
6. Processo de síntese de composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por compreender as etapas de:
a) reação de esterificação do ácido 4-formil-benzóico (ou 4-carboxibenzaldeido ) em solvente clorado ou em solvente não clorado, na presença de composto transferidor de grupo halogênio e de dimetilformamida (DMF) ;
b) adição de álcool primário, secundário ou terciário ;
c) reação de aminação redutiva entre o produto obtido em b) e 3-hidroxipiperidina, na presença de NaBHsCN, ácido de Lewis, MeOH e N2;
d) reação do produto obtido em c) com monoidrato de hidrazina; e
e) reação do produto obtido em d) com benzaldeído R2- substituído em que R2 é escolhido do grupo que consiste de: H, Br, Cl, N02, OMe, 3-pirrolidinil , F, NH2, 4-morfolil, 4- piperidinil, imidazol, SMe, OAc .
7. Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por compreender adicionalmente a etapa f) reação de acetilação com anidrido acético e 4-(N,N- dimetilamino ) piridina (4-DMAP) .
8. Composição farmacêutica anti-inflamatória, anti- colinesterásica e/ou para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável pelo menos um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
9. Composição de acordo com a reivindicação 8 caracterizada pelo referido composto estar numa proporção entre 0,01% m/m e 95% m/m.
10. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por ser para fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa .
11. Uso de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por ser para a fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de: doença de Alzheimer; doença de Huntington; amnésia; depressão nervosa; transtorno obsessivo compulsivo; e/ou esclerose lateral amiotrófica.
12. Uso de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por ser para fabricação de uma composição anti-inflamatória e/ou anti- colinesterásica.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por ser para a fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doença neurodegenerativa escolhida do grupo que consiste de: doença de Alzheimer, doença de Huntington, amnésia, depressão nervosa, transtorno obsessivo compulsivo, esclerose lateral amiotrófica.
14. Forma de dosagem oral caracterizada por compreender pelo menos um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido composto e um veiculo farmaceuticamente aceitável .
15. Forma de dosagem oral caracterizada pela dosagem variar entre 1 ng e 5 g.
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
16. Método de tratamento de doença neurodegenerativa caracterizado por compreender administração de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 a um individuo portador de ou propenso a doença neurodegenerativa, em um regime de dose que varia entre Ιμπιοΐ/kg do individuo e 30C^mol/kg do individuo.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por compreender administração de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 a um individuo propenso a ou portador de: doença de Alzheimer; doença de Huntington; amnésia; depressão nervosa; transtorno obsessivo compulsivo; e/ou esclerose lateral amiotrófica .
18. Método de acordo a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pela dose administrada ser ΙΟΟμπιοΙ/kg do individuo .
19. Método de tratamento de inflamações caracterizado por compreender administração de um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 a um individuo acometido por ou propenso a inflamação, em um regime de dose que varia entre Ιμπιοΐ/kg do individuo e 30C^mol/kg do individuo.
20. Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizado pela dose administrada ser ΙΟΟμπιοΙ/kg do individuo .
21. Método de inibição da enzima acetilcolinesterase caracterizado por compreender contatar composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 com a enzima acetilcolinesterase.
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) Resumo
COMPOSTO, PROCESSO DE SÍNTESE DO COMPOSTO, USO, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE INFLAMAÇÕES OU DE DOENÇA NEURODEGENERATIVA, FORMA DE DOSAGEM ORAL E MÉTODO DE
INIBIÇÃO DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE
A presente invenção descreve um novo composto, seu processo de síntese e os usos deste composto, bem como uma composição farmacêutica contendo o referido composto. Especificamente, a presente invenção revela um composto de acordo com a fórmula I:
Figure imgf000118_0001
seu processo de síntese e composições compreendendo o referido composto. Adicionalmente, a presente invenção também descreve o uso do composto para fabricação de uma composição para o tratamento curativo ou profilático de doenças neurodegenerativas , de inflamações, além de composições anticolinesterásicas . Ainda, a presente invenção descreve métodos de tratamento envolvendo a administração do referido composto.
FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)
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