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WO2016190654A1 - 상보적 염기서열과 미스-매치된 염기서열 그리고 reporter와 quencher를 포함하는 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭 및 측정 방법 - Google Patents

상보적 염기서열과 미스-매치된 염기서열 그리고 reporter와 quencher를 포함하는 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭 및 측정 방법 Download PDF

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WO2016190654A1
WO2016190654A1 PCT/KR2016/005517 KR2016005517W WO2016190654A1 WO 2016190654 A1 WO2016190654 A1 WO 2016190654A1 KR 2016005517 W KR2016005517 W KR 2016005517W WO 2016190654 A1 WO2016190654 A1 WO 2016190654A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
sequence
seq
amplification
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2016/005517
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
원유덕
박해준
성효진
이선영
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SD Biosensor Inc
Original Assignee
SD Biosensor Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SD Biosensor Inc filed Critical SD Biosensor Inc
Priority to US15/577,242 priority Critical patent/US20180187240A1/en
Publication of WO2016190654A1 publication Critical patent/WO2016190654A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/354,730 priority patent/US20210381029A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is an oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence by connecting an Inosine linker to the 5 'position of a primer for a specific region of the target gene, and two or more bubble structures including mis-matched nucleotide sequences within the complementary nucleotide sequence.
  • Real-time polymerase chain reaction is an experimental method that can amplify a specific sequence in a DNA molecule to detect and measure in real time.
  • buffers such as DNA polymerase, primer sets, dNTPs, and MgCl2, which are necessary for polymerase chain reaction (PCR), are basically required.
  • a real-time gene amplification device and a probe containing fluorescent and quencher, which can confirm amplification of nucleic acid, or an intercalating dye such as SYBR GreenI bound to amplified nucleic acid DNA is essential. Therefore, fluorescent materials for real-time polymerase chain reaction and the structure and experimental methods of probes containing the same have been reported.
  • SYBR GreenI is a fluorescent dye that binds to double-stranded DNA. It is a method for monitoring nucleic acid amplification by measuring fluorescence after an extension step during PCR. Real-time polymerase chain reaction can be monitored with primer set without fluorescent substance, but it is impossible to use for simultaneous multiplexing and high specificity because fluorescence is detected even in case of dimer or non-specific gene amplification. Primers should be used and anti-Taq antibodies should be used to reduce nonspecific products (Morrison, TB et al., BioTechniques, 1998, 24: 954-962). In order to overcome the disadvantages of such intercalating dyes, a number of methods using probes with fluorescent or quencher materials are used.
  • the most commonly used method for real-time PCR is the Taqman assay with a hydrolysis probe.
  • the distance between the 5 '3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase and the fluorescent reporter and quencher are attached inside the primer set. When the light is far away, the light is emitted, and when it is close, it is used to extinction.
  • the probe bound to a specific gene site becomes 5 '3' according to the polymerization reaction of Taq DNA polymerase.
  • the exonuclease action releases the reporter dye attached to the 5 'end of the probe, which causes the quencher to move away and emits fluorescence in the reporter (Livak, KJ, PCR Methods and Applications, 1998, 4: 357-362). .
  • the fluorescence sensitivity is determined according to the distance between the reporter and the quencher and affects the sensitivity.
  • the length of the gene amplification product is short 63bp, long length within 400bp has a disadvantage that the PCR efficiency is reduced (Bustin, S.A. Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25: 169-193).
  • nucleic acid amplification monitoring can be achieved by detecting fluorescence of the acceptor dye (Wong, ML, BioTechniques, 2005, 39: 75-85). .
  • This method requires the high homology of the target gene to use two probes, and has the disadvantage of high cost by using two probes.
  • Hairpin probes include stem-loop molecular beacons, scorpion primers, and sunrise primers.
  • Molecular beacons have a stem-loop structure, and the loop portion contains complementary sequences for specific regions of the gene, and the stem portion contains complementary sequences to bind the 5 'and 3' ends of the probe. Fluorescent and quencher are attached at each end (Tyagi, S. and Kramer, R., Nature Biotechnology, 1996, 14: 303-308).
  • Molecular beacons are linked to specific parts of genes, and the stem parts are separated by conformation transitions. If the stem is designed too strongly in this process, the stem is not separated and no luminescence can occur (Bustin, S.A. Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25: 169-193).
  • Scorpion primer has the function of primer and probe, and when the complementary part of scorpion primer is combined with a specific position of the gene and undergoes an extended reaction, when it is single-stranded by denaturation, the specific sequence of the target gene of Scorpion primer is extended. It is bound to and the distance between the fluorescent material and the quencher is emitted.
  • Scorpion primers are designed to have a probe function without adding probes individually to Taqman assays, and have high specificity because they include complementary parts and specific sequences of target genes (Whitcombe, D., et. Al., Natur Biotechnology, 1999, 17: 804-807). As such, three parts of the specific sequence of the target gene are required, which makes it difficult to design a target gene with low homology.
  • Sunrise primer is similar to Scorpion primer and forms hairpin loop at 5 'end and has complementary sequence to specific sequence of target gene at 3' end. As the PCR process proceeds, light is emitted as the hairpin loop structure expands by the opposite primer (Wong, M.L., BioTechniques, 2005, 39: 75-85). As described above, the Scorpion primer and the sunrise primer forming the hairpin loop at the 5 'end have a problem in that the fluorescent signal does not occur if the single strand is not denatured by the temperature of the annealing and extension stages, so that the design of the hairpin loop is complicated and complicated. In addition, the low homology with the target gene sequence of several sites used to increase the specificity has restriction of primer position selection.
  • intercalating dyes are detected even when non-specific amplification is performed, and hydrolysis probes have limitations in the amplification size of the target gene, and in addition, to detect fluorescent dyes such as hybridization probes and hairpin probes.
  • the design of primers or probes is complex and difficult.
  • the present invention has been made to solve the above problems and the object of the present invention is that the complementary sequence of the primer for the target gene at the 5 'end is linked through a linker, mis-matching to the complementary sequence There is a sequence, and the unwinding temperature can be adjusted according to the number of the sequences so that the single-stranded oligonucleotides exist in the form of double-stranded inactivation at a certain temperature or less depending on the processing temperature of the annealing and extension stages, and the single strand at a certain temperature or higher.
  • oligonucleotides activated by oligonucleotides fluorescent materials (reporter dyes) and quencher (quencher molecules) can be attached and applied as primers or probes.They can be designed only by sequences for two positions of the target gene of the forward and reverse primers. Two because they are either active or inactive depending on the specific temperature Oligonucleotide specificity of the high gene amplification and real-time fluorescence signal measured with only the nucleotides oligo possible to provide an oligonucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for real-time measurement of oligonucleotides and fluorescence signals in which the amplification size of a specific gene can be simultaneously amplified and detected from 50bp to 1000bp.
  • the present invention connects an inosine linker to the 5 'end of the primer for the sequence in order to amplify a specific gene sequence and connects a sequence complementary to the primer and at least one at this site.
  • Oligos having a double-stranded structure comprising a pair of reporter dyes and a quencher molecule for nucleic acid detection for specific gene amplification with a bubble-shaped complementary double-stranded oligonucleotide containing mis-matching nucleotides
  • nucleotides oligonucleotides having the characteristic of denatured to single strands above a certain temperature are provided.
  • an oligonucleotide having a double-stranded structure below a specific temperature is preferable because a strand of oligonucleotide connects an inosine linker with a primer region of a corresponding sequence of a specific gene and a sequence complementary thereto. Oligonucleotides having a strand structure are preferred, but not limited thereto.
  • the mis-matching nucleotide sequence may be any one of adenine, guanine, cytosine, thymine, and uridine, and the number of nucleotides forms a bubble structure with two or more nucleotides. It is preferred to be located within the complementary sequence.
  • oligonucleotide of the present invention it is preferable that two or more bubble structures exist as linker sites and mis-matching sites by linking a sequence complementary to the sequence of the target gene with a linker.
  • the inosine linker is preferably composed of 0 to 9 nucleotides, but is not limited thereto.
  • the oligonucleotide of the present invention attaches the reporter dye or quencher molecule to the 5 'end, and attaches the reporter dye or quencher molecule from the second position in the 5' end direction from the 3 'end to the distance between the reporter dye and the quencher molecule in the single-stranded structure. It is more than 15mer apart, in the double-stranded structure, the distance between the reporter dye and the quencher molecule is preferably located within 14mer, but is not limited thereto.
  • oligonucleotide and conventional primer of the present invention as a set or a pair of oligonucleotides of the present invention as a set, and 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity (+) or 5 ' ⁇ 3' exonuclease inactivity (-). It provides a DNA polymerase having, and provides a composition for real-time polymerase chain reaction using dNTPs, reaction buffer and the oligonucleotide set.
  • reaction buffer solution a conventional PCR or real time polymerase chain reaction buffer including Tris-HCl, KCl, (NH 4) 2 SO 4, MgCl 2, MgSO 4, etc. may be appropriately modified.
  • the dNTPs mean that dATP, dTTP, dUTP, dGTP, and dCTP are included, and a composition including thio-dNTP, borano-dNTP, and methyl-dNTP may be used.
  • the oligonucleotide can be used in a concentration range of 0.1 ⁇ 1uM, the appropriate concentration for use can be easily determined by those skilled in the art.
  • oligonucleotides of the present invention can design oligonucleotides for a target sequence amplification size of 50 ⁇ 1000bp, amplification and real-time detection of the amplification size is not limited to a specific size and can be designed oligonucleotide site Provide a way to design candidate oligonucleotides of various sizes by selecting them. Since the oligonucleotide has dual functionality of primer and probe, it provides oligonucleotide and design method capable of confirming real-time amplification by attaching a reporter dye and a quantizer molecule to only two target gene amplification sites.
  • oligonucleotides of the present invention can be used in forward or reverse positions respectively and also provide diversity in both positions.
  • Oligonucleotide of the present invention provides a method that can be analyzed separately or simultaneously by attaching the reporter dye differently with Fam, Texas Red, Cy5, Hex, Rox, Joe, Tamra, Tet, etc. according to the target gene.
  • oligonucleotides of the present invention there is provided a method for measuring and measuring a process for real-time polymerase chain reaction.
  • the method is performed by repeating the denaturation, annealing and extension steps, and further provides a method of confirming the detection status of a specific gene in real time by performing the fluorescence arrangement step after the annealing and extension steps and then measuring the fluorescence.
  • the fluorescence array step is carried out at a temperature condition of 25 ⁇ 45 °C and the time is preferably performed for 1 to 30 seconds, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit for amplifying individual or simultaneous multiplexing of specific genes for DNA and RNA of an infectious disease, hereditary disease, drug resistance, drug resistance or susceptible sample comprising the oligonucleotide of the present invention as an active ingredient. .
  • the oligonucleotide is an oligonucleotide comprising a complementary nucleotide sequence by connecting an Inosine linker to a 5 'position and has two or more bubble structures including mis-matched nucleotide sequences in the complementary nucleotide sequence.
  • Real-Time Polymerase Real-Time Polymerase
  • It is an oligonucleotide that is reactive according to the annealing temperature of Chain Reaction. It is a bifunctional oligonucleotide that has both the function of primer and probe. It is a method using this.
  • oligonucleotide (DFO) structure of the present invention shows sequentially the oligonucleotide (DFO) structure of the present invention and a method of performing real-time polymerase chain reaction using the same.
  • Figure 2 is a result of the fluorescence is measured by the denaturation of the reporter dye and the quencher molecules in a single strand at 65, 55, 45 °C according to the number of mer (distance) in the double strand structure of the oligonucleotide (DFO) of the present invention.
  • Figure 3 is a result of performing a real-time polymerase chain reaction by attaching the quencher molecules in the ninth base in the direction of the 'end' and 'end 3' end of the oligonucleotide (DFO) of the present invention 5 'end.
  • DFO oligonucleotide
  • Figure 4 is a result of performing a real-time polymerase chain reaction by attaching the quencher molecules in the second, fourth base in the 3 'end of the oligonucleotide (DFO) of the present invention 5' end.
  • DFO oligonucleotide
  • Figure 5 is a result showing the real-time polymerase chain reaction results according to the mis-matching sequence number (4, 6, 9) located in the bubble region of the oligonucleotide (DFO) of the present invention.
  • Figure 6 shows the results of real-time polymerase chain reaction according to the cycle time conditions using the oligonucleotide (DFO) of the present invention.
  • a fluorescence measurement time (Scanning time) by adding a fluorescence measurement process to the denaturation process, annealing and extension process cycle conditions in real time polymerase chain reaction using the oligonucleotide (DFO) of the present invention, 5 seconds, This is the result of adding 10 seconds.
  • Figure 8 relates to the results of real-time polymerase chain reaction according to the temperature for the annealing and extension process using 65, 55, 45 °C using the oligonucleotide (DFO) of the present invention.
  • Figure 11 shows the size of the amplification product for the real-time polymerase chain reaction 50, 216, 300, 450, 800, 1000bp real-time polymerase applying the method of the present invention using the oligonucleotide (DFO) and conventional primer of the present invention
  • DFO oligonucleotide
  • oligonucleotide (DFO) of the present invention forward or reverse, respectively and two oligonucleotides (DFO) as oligonucleotide (DFO) of the present invention.
  • Example 1 reporter dye and quencher of oligonucleotide (DFO) of the present invention Glow analysis of the interatomic distance minutes
  • Oligonucleotides of the present invention may be prepared by conventional methods (Alexandre, V., et. Al., Nucleic Acid Research, 2008, 36:20, Ailenberg, M. and SilverMan, M., BioTechniques, 2000, 29: 1018-1024).
  • the complementary sequence was located at the 5 'end of the HIV tat gene, the forward primer for the human beta-actin gene, and the reverse primer for the rat GAPD gene, and the complementary sequence was mismatched to the complementary sequence.
  • Fam relative fluorescence unit
  • SEQ ID NO: 2 (Fam01) at the 3 'end and SEQ ID NO: 7 (Fam02) at the 2mer at the 3' end, SEQ ID NO: 8 (Fam04) at the 4mer at the 3 'end, for the DFO oligonucleotide of Upper to 5mer Molar SEQ ID NO: 11 (Fam05), SEQ ID NO: 9 (Fam07) at 7mer at the 3 'end, SEQ ID NO: 10 (Fam08) at 8mer at the 3' end, SEQ ID NO: 3 (Fam09) at 9mer at the 3 'end, Oligonucleotides were designed for SEQ ID NO: 4 (Fam15) located at 15mer at the 3 'end, SEQ ID NO: 5 (Fam17) located at 17mer at the 3' end, and SEQ ID NO: 6 (Fam21) located at 21mer at the 3 'end.
  • SEQ ID NO: 1 (Control) for the TaqMan method was used.
  • the reaction mixture of the DFO oligonucleotides 0.5uM, 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2 in order to determine the RFU value between the reporter dye and the quencher molecular distance through the denaturation of the DFO of the present invention from the double-stranded oligonucleotide to the single-stranded oligonucleotide
  • the overall RFU value was 53,000 ⁇ 65,000, and after 55 °C RFU value 10,000 ⁇ 30,000 except Fam 15, Fam 17, Fam 21 At 25 °C, the RFU value was reduced to 10,000 ⁇ 20,000. Therefore, at a temperature of about 65 ° C., the DFO oligonucleotide is separated from the reporter dye and the quencher molecule in the form of a single strand to emit fluorescence, and the temperature is reduced to 45 ° C. and 25 ° C., thereby transforming into a double stranded reporter dye. As the distance between the molecules and the quencher molecules decreased, the emission amount decreased. In the case of Fam 15, Fam 17, and Fam 21, the reporter dye and the quencher molecule appeared to emit light due to the distance between the reporter dye and the quencher molecule.
  • the reporter dye was attached to the 5 'end to verify whether the reporter dye or the quencher molecule near the 3' end of the DFO of the present invention reacts, and the quencher molecule was positioned at the 3 'end.
  • the second base "T" of SEQ ID NO: 2 and 3 'end is changed to innerdT, and the sequence No. 7 to which BHQ1 is attached to the quencher molecule is changed, and the fourth base "T" of 3' end is changed to innerdT.
  • sequence number 3 attached to the quencher molecule BHQ1 was designed.
  • SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3, which is a DFO oligonucleotide was used as a forward primer of the HIV tat gene, and SEQ ID NO: 23 was used as a reverse primer.
  • SEQ ID NO. 24 was used as a forward primer for the rat GAPD gene, and SEQ ID NO. 7 and SEQ ID NO. 8, which are DFO oligonucleotides, were used for the reverse primer.
  • Each of the above oligonucleotide sets was added to a 0.5 uM real time polymerase chain reaction, and a reaction mixture of 0.2 mM dNTPs, 1 ⁇ reaction buffer, 0.5 U Taq DNA polymerase was prepared.
  • Real-time polymerase chain reaction of HIV tat gene produced HIV tat plasmid DNA through gene synthesis of HIV-1 isolate 10BR_PE064 (GI: 672918720, 5281-5700bp), which was 6.9, 0.69 ng / ul, 69, 6.9, 5 cycles of 0.69 fg / ul were added to the reaction mixture at 40 ° C. for 5 minutes at 95 ° C.
  • the rat GAPD gene was rat genomic DNA (Clontech, Cat.No. 636404). ), 2, 0.2, 0.02ng / ul was added to the reaction mixture by 5ul each, 95 °C 5 minutes, (95 °C 30 seconds, 60 °C 30 seconds) was performed 40 cycles.
  • Figure 3 is a correlation between the template concentration and the RFU signal for the real-time polymerase chain reaction using SEQ ID No. 2 attached the quencher molecule at the 9th base of the DFO 3 'end and 3' end of the oligonucleotide set for HIV tat gene detection It was confirmed that the same goes up diagonally without, the DFO for SEQ ID NO: 3 confirmed that the Ct appears late as the template concentration decreases, the delta Rn for the RFU signal is SEQ ID NO: 3 8,000 RFU compared to SEQ ID NO: 2 High.
  • Figure 4 shows the RFU as a result of the real-time polymerase chain reaction using SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 attached to the quencher molecules in the 2nd and 4th base of the DFO 3 'end of the oligonucleotide set for rat GAPD gene detection
  • the delta Rn of the signal was detected as 12,500 and 10,000, respectively, and the DFO for the second and fourth quencher molecules was 22.43 Ct and 22.68 Ct at 10ng / rxn and 26.22 Ct and 26.46, 0.1ng / at 10ng / rxn.
  • the rxn was 29.73 Ct and 30.08 Ct, and similar Ct was confirmed for each concentration.
  • the DFO of the present invention is formed in a double strand when the temperature is below a certain temperature in a single strand is controlled according to the number of mis-matching sequence.
  • cDNA synthesis was performed using 5U human total RNA (100ng /) in a reaction mixture of 200U MMLV RTase, 1uM SEQ ID NO: 14 primer, 1x reaction buffer, and 1mM dNTPs. ul) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes and 95 ° C. for 5 minutes.
  • the set was prepared with a reaction mixture of 0.3 uM, 0.2 mM dNTPs, 1 ⁇ reaction buffer, 0.5 U Taq DNA polymerase. 5 ul of cDNA (total RNA 25ng / ul) was added to the control group at 95 ° C. for 5 minutes (95 ° C. 30 seconds, 60 ° C. 30 seconds) for 40 cycles, and the DFO oligonucleotide set was 95 ° C. 5 minutes, (95 ° C. 30 seconds). , 45 ° C. 60 sec) was performed for 40 cycles.
  • Taqman control of the control group showed an RFU value of 12,500 delta Rn, and a fluorescent signal was not detected in the DFO oligonucleotide set of SEQ ID NO: 11 near the release temperature of 65 ° C of B-actin 65 F, and B
  • the set of DFO oligonucleotides of SEQ ID NO: 11 near the release temperature of 55 ° C. of the -actin 55 F and SEQ ID NO: 13 near the release temperature of 45 ° C. of the B-actin 45 F showed a higher RFU signal value than Taqman cotrol with a delta Rn of 20,000. .
  • Annealing and extension temperature were solved with a set of human mRNA beta-actin oligonucleotides having a DFO oligonucleotide of SEQ ID NO: 11 having a temperature of 55 ° C. and a reverse primer of SEQ ID NO: 14 with a mis-matching sequence number of six DFOs of the present invention.
  • the efficiency of real time polymerase chain reaction was analyzed by applying temperature ⁇ 10 °C.
  • cDNA synthesis was performed using 5U human total RNA (100ng /) in a reaction mixture of 200U MMLV RTase, 1uM SEQ ID NO: 14 primer, 1x reaction buffer, and 1mM dNTPs. ul) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes and 95 ° C. for 5 minutes.
  • a reaction mixture of 0.3 uM oligonucleotide, 0.2 mM dNTPs, 1 ⁇ reaction buffer, 0.5 U Taq DNA polymerase was prepared under the conditions of the oligonucleotide set. 5 cycles of cDNA (total RNA 25 ng / ul) were performed for 40 cycles at 95 ° C. for 5 minutes (95 ° C. 30 seconds, 65 ° C. or 55 ° C. or 45 ° C. 30 seconds, 45 ° C. 30 seconds).
  • Oligonucleotide set for human genomic DNA (Promega, G3041) to set DFO cycle conditions of the present invention, DFO of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 15 0.3uM, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA polymerization
  • a reaction mixture of enzymes was prepared.
  • Human genomic DNA concentration was 54.8 min at 24.8, 2.48, 0.248 ng / ul for initial denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation (95 ° C) / annealing and extension (55 ° C) / fluorescence measurement (45 ° C) time ( Scanning time) was performed by 40 cycles of 5 seconds / 5 seconds / 5 seconds, 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds, 30 seconds / 30 seconds / 30 seconds, respectively.
  • the RFU value was 7,000 at 5 seconds / 5 seconds / 5 seconds, 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds, and the RFU value at 30 seconds / 30 seconds / 30 seconds was similar to 8,000.
  • the results of Ct values that were proportional to concentration were not obtained, and the results of Ct values that were proportional to 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds and 30 seconds / 30 seconds / 30 seconds were confirmed.
  • the RFU of delta Rn value of 30 seconds / 30 seconds / 30 seconds was 4,000 higher than that of 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds, but the Ct value showed similar results, compared to 5 seconds / 5 seconds / 5 seconds.
  • the RFU of delta Rn of 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds was 9,000 higher.
  • the same background and delta Rn values of the same background and delta Rn were obtained from the result of FIG. 7, which was measured by reducing the fluorescence measurement time by 5 seconds under 40 cycle conditions of 10 seconds / 10 seconds / 10 seconds showing a similar Ct condition and showing a stable RFU value.
  • the Ct values showed similar results, and the decrease in fluorescence measurement time did not affect the real time polymerase chain reaction using DFO.
  • the RFU of the delta Rn value was 8,000 higher in the result of including the fluorescence measurement time at 30 seconds / 30 seconds / 30 seconds compared to 30 seconds / 30 seconds.
  • the background showed a low RFU 3,000.
  • the background had a lower RFU 8,000. Ct values with and without fluorescence measurement time were similar.
  • the fluorescence measurement time was included to block the detection of fluorescence values for the residual DFO of the single strand, and the fluorescence value could be measured only for the product amplified by binding to the target gene.
  • Example 6 of the present invention DFO Effect of DNA Polymerase Type on Use
  • the Taqman system of real-time polymerase chain reaction uses DNA polymerase having 5'3 'exonuclease activity (+), and the reaction using intercalating dye such as SYBR green is 5'3' exonuclease activity (+) or 5'3.
  • the use of DNA polymerase with exonuclease inactivation is possible.
  • 5ul of cDNA (RNA concentration 2.5, 0.25, 0.025 ng / ul) synthesized with human total RNA was used to confirm reactivity according to 5'3 'exonuclease activity (+) or inactivity (-) using DFO of the present invention.
  • FIG. 10 shows the same background as a result of real-time polymerase chain reaction through each DNA polymerase having 5'3 'exonuclease activity (+) or inactive (-), and delta Rn is 5'3' exonuclease activity (+).
  • DNA polymerase having a high RFU 5,000 Ct was detected by pulling about 1.65 Ct of DNA polymerase having 5'3 'exonuclease inactivation (-).
  • the DFO of the present invention confirmed the reactivity in the DNA polymerase having 5'3 'exonuclease activity (+) or inactive (-), respectively, and showed high sensitivity in DNA polymerase having 5'3' exonuclease activity (-). . Therefore, real-time polymerase chain reaction can be performed using reporter dye and quencher molecule like Taqman system and DNA polymerase of 5'3 'exonuclease inactivation (-) such as SYBR green.
  • DFO is used as forward (SEQ ID NO: 11) and reverse 50 (SEQ ID NO: 16), 216 (SEQ ID NO: 14), and 300 (SEQ ID NO: 17), 0.3 uM oligonucleotide, 0.2 mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5 U Taq to confirm reactivity according to amplification size for 450 (SEQ ID NO: 18), 800 (SEQ ID NO: 19), 1000 bp (SEQ ID NO: 20)
  • a reaction mixture of DNA polymerase was prepared and 40 cycles were performed at 95 ° C. for 5 minutes (95 ° C. 20 seconds, 55 ° C. 20 seconds, 45 ° C. 10 seconds).
  • the same DFO was used as the forward and the reverse was designed according to the size, and the result of comparing the Ct value of the different size compared to the Ct result of 50bp resulted in a difference of 0.74 Ct to 4.4 Ct according to the reactivity difference of the reverse. According to the size, the phenomenon of Ct pushing did not appear, and the reactivity was confirmed for the 50 ⁇ 1000bp amplification size.
  • Example 8 Effect Analysis According to the Case of Applying Each or a Pair of DFOs of the Invention in Forward and Reverse Positions
  • the DFO of the present invention includes SEQ ID NO: 11 designed as the forward primer position and SEQ ID NO: 22 designed as the same sequence as SEQ ID NO: 14 as the reverse primer position, respectively, or in pairs in real time polymerase chain reaction. Confirmed.
  • cDNA synthesis was performed using 5U human total RNA (100ng /) in a reaction mixture of 200U MMLV RTase, 1uM SEQ ID NO: 14 primer, 1x reaction buffer, and 1mM dNTPs. ul) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes and 95 ° C. for 5 minutes.
  • the set using the oligonucleotide is SEQ ID NO: 11 which is a forward DFO and SEQ ID NO: 14 which is a reverse, SEQ ID NO: 21 which is a forward, SEQ ID NO: 22 which is a reverse DFO, SEQ ID NO: 11 which is a forward DFO, and SEQ ID NO: a reverse DFO
  • a reaction mixture of 0.2 mM dNTPs, 1 ⁇ reaction buffer, and 0.5 U Taq DNA polymerase was prepared using 0.3 uM of three oligonucleotide sets for No. 22, 95 ° C. for 5 minutes, (95 ° C. 30 sec, 55 ° C. 30 sec. , 45 °C 30 seconds) 40 cycles were performed.
  • the delta Rn value was 12,500 higher than that of the Taqman control as the DFO, and the RFU was 15,000 higher than that of the DFO.
  • the Ct value was confirmed to be similar to the Taqman control.
  • DFO of the present invention was placed in a forward primer, and a conventional primer was used as a reverse primer.
  • SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 14 containing the reporter dye Fam and the quencher molecule BHQ1 as a DFO oligo set were set to SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 28 containing the human beta-actin mRNA, reporter dye Hex and the quencher molecule BHQ1.
  • the HIV tat gene, and SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 31 including the reporter dye Cy5 and the quencher molecule BHQ2 were used for simultaneous detection for M13 bacteriophage.
  • the oligo set was prepared using a reaction mixture of 0.2 mM dNTPs, 1 ⁇ reaction buffer, and 0.5 U Taq DNA polymerase using 0.3 ⁇ M, respectively.
  • the reaction conditions for the DFO oligo set were 95 5 minutes, (95 30 seconds, 65 30 seconds, 25 5 seconds) 40 cycles, the reaction conditions for TaqMan oligo set was performed for 95 5 minutes, (95 30 seconds, 65 30 seconds) 40 cycles.
  • HIV tat plasmid DNA was prepared by synthesizing HIV-1 isolate 10BR_PE064 (GI: 672918720, 5281-5700 bp) into plasmid DNA.
  • DNA was extracted from M13 bacteriophage (ATCC 15669-B1).
  • the template cDNA for human total RNA: HIV tat plasmid DNA: M13 bacteriophage DNA

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Abstract

본 발명은 특정 유전자 서열 증폭을 위해 해당서열에 대한 프라이머의 5' 말단에 이노신(inosine) 링커(linker)를 연결하고 프라이머와 상보적인 서열을 연결하고 이 부위에 하나 이상의 미스-매칭(mis-matching) 뉴클레오타이드를 포함하여 버블 구조를 이루는 상보적인 이중가닥 올리고로 처리 온도에 따라 단일가닥 올리고가 일정온도 이하에서 이중가닥 형태로 불활성화 형태로 존재하고 일정온도 이상에서 단일가닥 올리고로 활성화하는 올리고로 형광물질(리포터 염료)과 소광물질(퀀처 분자)을 부착시켜 primer 또는 probe로써도 적용 가능하여 두 개의 올리고만으로도 특이도가 높은 유전자 증폭 및 형광 시그널 실시간 측정이 가능한 올리고이며 이를 이용한 형광 배열 단계를 추가하여 이후 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특정 유전자의 증폭 크기를 50bp부터 1000bp까지 증폭 및 검출이 동시에 수행될 수 있는 올리고를 이용하여 두 부위의 target 유전자 증폭 부위만으로 리포터 염료와 퀀저 분자가 부착되어 실시간 증폭 여부를 확인 가능한 올리고 및 설계 방법에 장점이 있다.

Description

상보적 염기서열과 미스-매치된 염기서열 그리고 REPORTER와 QUENCHER를 포함하는 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭 및 측정 방법 {A DUAL-FUNCTIONAL OLIGONUCLEOTIDE INCLUDING COMPLEMENTARY SEQUENCES, MIS-MATCHED SEQUENCES, REPORTER DYE, AND QUENCHER DYE LINKED WITH PRIMER FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND MEASUREMENT METHODS USING THE SAME}
본 발명은 target 유전자 특정부위에 대한 primer의 5‘ 위치에 Inosine linker를 연결하여 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 상보적인 염기서열 내에는 mis-matched 염기서열을 포함하는 2개 이상의 bubble 구조를 가지고 있으며, 이 primer의 5’ 말단과 상보적인 염기서열, mis-matched 서열 그리고 target 유전자의 특정서열에 형광물질인 reporter와 소광물질인 quencher를 한 쌍으로 위치시켜 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 annealing 온도에 따라 반응성을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 primer 및 probe의 기능을 모두 갖는 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드(Dual-Functional Oligo, 이하 “DFO”라 함)의 용도와 이를 이용한 핵산 증폭 방법 및 측정 방법에 관한 것이다.
실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 분자에서 특정 서열을 증폭하여 실시간으로 검출하고 양을 측정할 수 있게 하는 실험방법이다. 증폭된 핵산이 실시간으로 측정되기 위해서는 기본적으로 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 필요한 DNA polymerase, primer sets, dNTPs, MgCl2 등의 buffer류들이 필요하며, 이 외에 실시간으로 형광물질을 모니터링 할 수 있는 실시간 유전자 증폭 장치와 핵산증폭 여부를 확인할 수 있는 형광물질과 소광물질이 포함되어 있는 probe 또는 증폭된 핵산 DNA에 결합되는 SYBR GreenI과 같은 intercalating 염료 등이 필수적이다. 따라서 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 형광물질 및 이를 포함하는 probe의 구조와 실험방법들이 보고되었다.
SYBR GreenI은 이중가닥 DNA에 결합하는 형광염료로 PCR 과정 중 연장단계 이후에 형광을 측정하여 핵산 증폭에 대한 모니터링을 할 수 있는 방법이다. 실시간 중합효소연쇄반응의 재료로 형광물질이 부착되지 않은 primer set으로도 모니터링이 가능하지만, 동시 다중 검사에는 사용이 불가능하고, dimer나 비특이 유전자 증폭이 일어날 경우에도 형광검출이 되므로 높은 특이도를 갖는 primer를 사용해야 하며 anti-Taq antibody를 사용하여 비특이산물을 줄여야 한다(Morrison,T.B. et al., BioTechniques, 1998, 24:954-962). 이와 같은 intercalating 염료의 단점을 극복하기 위해 형광물질 또는 소광물질이 부착된 probe를 이용하는 방법들이 많이 사용되고 있다.
Real-Time PCR에 주로 사용되는 방법으로는 hydrolysis probe를 적용한 Taqman assay가 있으며, Taq DNA polymerase의 5‘ 3’ exonuclease 활성과 primer set 내부에 형광물질인 reporter와 소광물질인 quencher가 부착되어 둘 간 거리가 멀어지면 발광이 나타나고, 가까우면 소광이 되는 probe를 이용한 것으로 실시간 중합효소연쇄반응 시에 핵산 증폭반응이 늘어남에 따라 특정 유전자 부위에 결합된 probe가 Taq DNA polymerase의 중합반응에 따른 5‘ 3’ exonuclease 작용에 의해 probe의 5‘ 말단에 부착되어있는 reporter dye가 방출되면서 quencher의 거리가 멀어져 reporter에서 발광되어 형광 검출이 일어나게 된다(Livak,K.J., PCR Methods and Applications, 1998, 4:357-362). 이와 같이 reporter와 quencher의 거리에 따라 형광 감도가 결정되며 민감도에 영향을 준다. 또한 유전자 증폭 산물 길이가 짧게는 63bp, 길게는 400bp 이내로 길이가 길면 PCR 효율이 감소하는 단점을 가지고 있다(Bustin,S.A. Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25:169-193).
Hybridization probe의 PCR 반응을 위해서는 두 개의 primer와 두 개의 probe가 필요하며 두 개의 probe 중 핵산 증폭 산물의 5‘ 말단에 가까운 probe는 3‘ 말단에 acceptor 염료를 3’ 말단에 가까운 probe는 5‘ 말단에 donor 염료를 부착하여 설계되고 두 개의 probe가 target 유전자의 특정 부위에 나란히 위치하게 되면 acceptor 염료를 형광을 검출하여 핵산 증폭 모니터링이 이뤄질 수 있다(Wong, M.L, BioTechniques, 2005, 39:75-85). 이 방법은 두 개의 probe 사용을 위해 target 유전자의 homology가 높은 부위가 전제되어야하고 2종의 probe 사용에 따른 고비용의 단점을 가지고 있다.
Hairpin probe로 stem-loop 형태인 Molecular beacon, Scorpion primer, Sunrise primer 등이 있다. Molecular beacon은 stem-loop 형태의 구조를 가지고 있으며, loop 부분에는 유전자의 특정부위에 대한 상보적인 서열을 포함하고 stem 부분은 probe의 5‘ 말단과 3’ 말단이 결합되도록 상보적인 서열을 포함하고 있으며 각 말단에 형광물질과 소광물질이 부착되어 있다(Tyagi,S. and Kramer,R., Nature Biotechnology, 1996, 14:303-308). Molecular beacon은 유전자의 특정부분에 loop 부분이 결합되어 입체 구조 전이(Conformation transition)에 의해 stem 부분이 분리되어 형광물질과 소광물질의 거리가 멀어져 발광이 일어나게 된다. 이 과정에서 stem 부분이 너무 강하게 설계가 된다면 stem 부분이 분리되지 않고 발광도 나타날 수 없다(Bustin,S.A. Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25:169-193). Scorpion primer는 primer와 probe의 기능을 가지고 있으며 유전자의 특정 위치에 scorpion primer의 상보적인 부분이 결합되어 연장반응을 거친 후 변성에 의해 단일가닥일 때, Scorpion primer의 target 유전자의 특정서열이 연장된 서열에 결합되며 형광물질과 소광물질의 거리가 멀어져 발광이 나타난다. Taqman assay에 probe가 개별적으로 첨가없이 primer가 probe 기능을 갖도록 Scorpion primer를 설계한 것으로 상보적인 부분과 target 유전자의 특정서열이 포함되어 있어 특이도가 높다(Whitcombe,D., et. al., Natur Biotechnology, 1999, 17:804-807). 이와 같이 target 유전자의 특정서열의 3부분이 필요하므로 homology가 낮은 target 유전자에 대한 설계의 어려움을 가지고 있다. Sunrise primer는 Scorpion primer와 유사하며 5‘ 말단에 hairpin loop을 형성하며 3’ 말단에 target 유전자의 특정서열에 상보적인 서열을 가지고 있다. PCR 과정이 진행되면서 반대쪽 primer에 의해 연장되면서 hairpin loop 구조가 펼쳐지면서 발광이 이루어진다(Wong, M.L., BioTechniques, 2005, 39:75-85). 위와 같이 5‘말단에 hairpin loop를 형성하는 Scorpion primer와 sunrise primer는 어닐링 및 연장단계의 온도에 의해 단일가닥으로 변성되지 못하면 형광 시그널이 발생하지 못하는 문제가 생기므로 hairpin loop에 대한 설계가 까다롭고 복잡하며 특이도를 높이기 위해 사용되는 여러 부위의 target 유전자 서열에 따라 homology가 낮은 서열부위는 primer 위치 선별의 제약이 있다.
실시간 중합효소연쇄반응을 위한 제한조건으로 intercalating 염료는 비특이 증폭이 이뤄져도 검출이 되고, hydrolysis probe는 target 유전자의 증폭 크기의 제한점이 있으며, 이 밖에 hybridisation probe, hairpin probe와 같이 형광 염료 검출을 위해 primer 또는 probe의 설계가 복잡하고 어려운 단점들을 가지고 있다.
[선행특허 문헌]
대한민국특허 공개번호 제2003-0055343호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 5'말단에 target 유전자에 대한 primer의 상보적인 서열이 링커를 통해 연결이 되고, 상보적인 서열에 mis-matching 서열이 존재하고 이 서열의 개수에 따라 풀림온도를 조절 가능하여 어닐링 및 연장단계의 처리 온도에 따라 단일가닥 올리고뉴클레오타이드가 일정온도 이하에서는 이중가닥 형태로 불활성화 형태로 존재하고 일정온도 이상에서 단일가닥 올리고뉴클레오타이드로 활성화하는 올리고뉴클레오타이드로 형광물질(리포터 염료)과 소광물질(퀀처 분자)을 부착시켜 primer 또는 probe로써도 적용 가능하여 forward와 reverse primer의 target 유전자의 두 위치에 대한 서열만으로 설계가 가능하며, 특정온도에 따라 활성화 또는 비활성화 상태로 존재하므로 두 개의 올리고뉴클레오타이드만으로도 특이도가 높은 유전자 증폭 및 형광 시그널 실시간 측정이 가능한 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 유전자의 증폭 크기를 50bp부터 1000bp까지 증폭 및 검출이 동시에 수행될 수 있는 올리고뉴클레오타이드와 형광 시그널 실시간 측정 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 유전자 서열 증폭을 위해 해당서열에 대한 프라이머의 5‘ 말단에 이노신(inosine) 링커(linker)를 연결하고 프라이머와 상보적인 서열을 연결하고 이 부위에 하나 이상의 미스-매칭(mis-matching) 뉴클레오타이드를 포함하여 버블 구조를 이루는 상보적인 이중가닥 올리고뉴클레오타이드로 특정 유전자 증폭에 대한 핵산 검출을 위해 리포터 염료와 퀀처분자 한 쌍을 포함하는 이중가닥의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드로 일정 온도이상에서는 단일가닥으로 변성하는 특징을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 한 가닥의 올리고뉴클레오타이드가 특정 유전자의 해당서열의 프라이머 부위와 이에 상보적인 서열이 이노신 링커를 연결하여 특정 온도 이하에서는 이중가닥 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 바람직하고 특정온도 이상에서는 단일가닥 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 mis-matching 염기서열은 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 유리딘 중 어느 것이어도 상관 없으며, 뉴클레오타이드 수는 2개 이상으로 버블구조를 형성하며, target 유전자의 서열에 대한 primer의 상보적인 서열 내에 위치하는 것이 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 target 유전자의 서열과 상보적인 서열을 링커로 연결하여 버블구조를 링커 부위와 mis-matching 부위로 2개 이상 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 이노신(inosine) 링커(linker)는 0에서 9개의 뉴클레오타이드로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5‘말단에 리포터 염료 또는 퀀처 분자를 부착시키며, 3’말단에서 5‘말단 방향으로 두 번째 위치부터 리포터 염료 또는 퀀처 분자를 부착시켜 단일가닥 구조에서 리포터 염료와 퀀처 분자간 거리는 15mer 이상 떨어져 있으며, 이중가닥 구조에서는 리포터 염료와 퀀처 분자간 거리는 14mer 이내에 위치하는 것이 바람직하나 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드와 conventional primer를 세트로 또는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 세트로 사용하는 것이 바람직하며, 5‘→3’ exonuclease 활성(+) 또는 5‘→3’ exonuclease 비활성(-)을 갖는 DNA 중합효소 사용하는 것을 제공하며, dNTPs, 반응용 완충용액 및 상기 올리고뉴클레오타이드 세트를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응용 조성물을 제공한다.
상기 반응용 완충용액으로는 Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2, MgSO4 등을 포함하는 통상의 PCR 또는 실시간 중합효소연쇄반응 완충용액을 적절히 변형하여 사용할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dTTP, dUTP, dGTP 및 dCTP가 포함되는 것을 의미하며 또한 thio-dNTP, borano-dNTP, methyl-dNTP가 포함하는 조성물을 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 0.1 ~ 1uM 범위의 농도로 사용 가능하며, 사용하기 위한 적정농도는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 target 서열 증폭 크기를 50 ~ 1000bp에 대한 올리고뉴클레오타이드를 설계 할 수 있으며, 상기 증폭 크기에 대한 증폭 및 실시간 검출이 가능하여 특정 크기에 한정되지 아니하고 올리고뉴클레오타이드 설계가 가능한 부위를 선택하여 다양한 크기의 후보 올리고뉴클레오타이드를 설계 할 수 방법을 제공한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 primer와 probe의 기능성을 이중으로 가지고 있으므로 두 부위의 target 유전자 증폭 부위만으로 리포터 염료와 퀀저 분자가 부착되어 실시간 증폭 여부를 확인 가능한 올리고뉴클레오타이드 및 설계 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 forward 또는 reverse 위치에 각각 사용가능하며 또한 두 위치 모두 사용가능한 다양성을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 target 유전자에 따라 리포터 염료를 Fam, Texas Red, Cy5, Hex, Rox, Joe, Tamra, Tet 등으로 다르게 부착시켜 개별적으로 또는 동시에 분석 가능한 방법을 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 과정에 대한 방법과 측정에 대한 방법을 제공한다.
상기 방법은 변성, 어닐링 및 연장 단계를 반복하여 수행되며, 이에 추가로 형광 배열 단계를 어닐링 및 연장 단계 다음에 수행하고 이후 형광을 측정하여 실시간 특정 유전자의 검출상황을 확인할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 형광 배열 단계는 25 ~ 45℃의 온도 조건으로 수행되고 시간은 1초 내지 30초간 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정하지는 않는다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 또는 감수성 검체의 DNA 및 RNA에 대한 특정 유전자를 개별 또는 동시 다중으로 증폭하는 키트를 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오타이드는 5‘ 위치에 Inosine linker를 연결하여 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로 상보적인 염기서열 내에는 mis-matched 염기서열을 포함하는 2개 이상의 bubble 구조를 가지고 있으며, 이 primer의 5’ 말단과 상보적인 염기서열, mis-matched 서열 그리고 target 유전자의 특정서열에 형광물질인 reporter와 소광물질인 quencher를 한 쌍으로 위치시켜 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 annealing 온도에 따라 반응성을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 primer 및 probe의 기능을 모두 갖는 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드로 이를 이용한 방법으로 두 개의 올리고뉴클레오타이드만으로도 3개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 Taqman system과 동일 이상의 특이도를 갖을 수 있으며, 증폭크기가 1000bp까지 큰 산물에 대해서도 실시간 검출할 수 있다. 이러한 효과는 5‘3’ exonuclease 활성(+) 또는 5‘3’ exonuclease 비활성(-)을 갖는 DNA 중합효소에서 작용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO) 구조 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응이 수행되는 방법을 순차적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)의 이중가닥 구조에서 리포터 염료와 퀀처 분자가 mer 수(거리)에 따라 65, 55, 45℃에서 단일가닥으로 변성이 이루어져 형광이 측정되는 결과이다.
도 3은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)의 3‘말단과 3’말단에서 5‘말단 방향으로 9번째 base에 퀀처 분자를 부착하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 4는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)의 3’말단에서 5‘말단 방향으로 2번째, 4번째 base에 퀀처 분자를 부착하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)의 버블부위에 위치한 mis-matching 서열개수(4, 6, 9)에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응 결과를 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 사용하여 cycle 시간을 조건에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응에 cycle 조건인 변성과정, 어닐링 및 연장과정에 형광측정과정을 추가시킨 방법으로 형광 측정 시간(Scanning time)을 5초, 10초 추가한 방법에 대한 결과이다.
도 8은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 사용하여 어닐링 및 연장과정에 대한 온도를 65, 55, 45℃에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응 결과에 관한 것이다.
도 9는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 사용하여 형광 측정 과정을 포함시킨 cycle 조건과 포함시키지 않은 cycle 조건에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응 결과이다.
도 10은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 사용하여 5‘3’ exonuclease 활성(+) 또는 5‘3’ exonuclease 비활성(-)에 대한 DNA 중합효소를 각각 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응에 대한 결과이다.
도 11은 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 증폭산물의 크기를 50, 216, 300, 450, 800, 1000bp로 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)와 conventional primer를 사용하여 본 발명의 방법을 적용한 실시간 중합효소 연쇄반응에 대한 결과이다.
도 12는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 forward 또는 reverse로 각각 이용한 반응과 두 개의 올리고뉴클레오타이드(DFO)를 모두 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)로 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응에 대한 결과이다.
도 13 내지 도 14는 본 발명의 올리고(DFO)에 human beta-actin은 Fam, HIV tat은 Hex, M13은 CY5의 리포터 염료를 부착하여 TaqMan system과 비교하여 동시 다중으로 각 target을 검출한 multiplex 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과이다.
이하, 실시 예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명의 올리고뉴클레오타이드(DFO)의 리포터 염료와 퀀처 분자간 거리에 따른 발광 효과분석
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 종래방법(Alexandre, V., et. al., Nucleic Acid Research, 2008, 36:20, Ailenberg, M. and SilverMan, M., BioTechniques, 2000, 29:1018-1024)의 HIV tat 유전자, human beta-actin 유전자에 대한 forward primer와 Rat GAPD 유전자에 대한 reverse primer를 target 유전자의 특정서열로 하여 이에 상보적인 서열을 5‘말단에 위치시켰으며, 상보적인 서열에 mis-matched 서열을 포함시켰으며 DFO 올리고뉴클레오타이드의 리포터 염료와 퀀처 분자간 거리에 따른 RFU(relative fluorescence unit)값의 차이를 분석하기 위하여 5‘말단에 리포터 염료인 Fam을 부착시키고, 이를 기준으로 퀀처 분자 위치를 이중가닥의 DFO 올리고뉴클레오타이드에 대해 3’ 말단에 위치한 서열번호 2(Fam01)과 3‘말단에서 2mer에 위치한 서열번호 7(Fam02), 3'말단에서 4mer에 위치한 서열번호 8(Fam04), 3'말단에서 5mer에 위치한 서열번호 11(Fam05), 3'말단에서 7mer에 위치한 서열번호 9(Fam07), 3'말단에서 8mer에 위치한 서열번호 10(Fam08), 3'말단에서 9mer에 위치한 서열번호 3(Fam09), 3'말단에서 15mer에 위치한 서열번호 4(Fam15), 3'말단에서 17mer에 위치한 서열번호 5(Fam17), 3'말단에서 21mer에 위치한 서열번호 6(Fam21)에 대한 올리고뉴클레오타이드를 설계하였으며, 대조군으로는 TaqMan 방법에 대한 서열번호 1(Control)을 사용하였다.
본 발명의 DFO가 이중가닥 올리고뉴클레오타이드에서 단일가닥 올리고뉴클레오타이드로 변성과정을 거쳐 리포터 염료와 퀀처 분자 거리 간 RFU 값을 확인하기위하여 상기 DFO 올리고뉴클레오타이드를 0.5uM, 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2의 반응 혼합물을 제조하여 95℃ 30초, 65℃ 또는 45℃ 또는 25℃ 30초 후 형광을 측정하여 이를 10반복 cycle을 수행하였다.
그 결과, 도 2와 같이 65℃ 이후 형광을 측정한 결과에서 전체적으로 RFU값이 53,000 ~ 65,000의 수치를 나타냈으며, 55℃ 이후에는 Fam 15, Fam 17, Fam 21을 제외하고 RFU 값이 10,000 ~ 30,000으로 감소하였으며, 25℃에서는 RFU 값이 10,000 ~ 20,000으로 감소하였다. 따라서, 온도가 65℃ 부근에서 DFO 올리고뉴클레오타이드가 단일가닥의 형태로 리포터 염료와 퀀처분자간 거리가 멀어져 형광을 발광하고 온도가 45℃, 25℃로 낮아짐에 따라 이중가닥의 형태로 변형되어 리포터 염료와 퀀처분자간 거리가 가까워짐에 따라 발광량이 감소하였으며, Fam 15, Fam 17, Fam 21의 경우는 이중가닥으로 변형이 되어도 리포터 염료와 퀀처분자간 거리가 멀어 리포터 염료의 발광이 계속해서 나타나는 것이다.
실시예 2 : 본 발명의 DFO의 3‘ 말단 부근의 퀀처 분자 위치에 따른 실시간 중합효소연쇄반응 효과분석
본 발명의 DFO의 3‘말단 부근의 리포터 염료 또는 퀀처 분자가 위치함에 따른 실시간 중합효소연쇄반응의 반응 여부를 검증하기 위하여 5’말단에 리포터 염료를 부착시키고, 퀀처 분자는 3’ 말단에 위치시킨 서열번호 2번과 3‘말단의 2번째 base인 "T"를 innerdT로 변경시켜 퀀처 분자인 BHQ1을 부착시킨 서열번호 7번, 그리고, 3’말단의 4번째 base인 "T"를 innerdT로 변경시켜 퀀처 분자인 BHQ1을 부착시킨 서열번호 8번, 3'말단의 9번째 base인 "T"를 innerdT로 변경시켜 퀀처 분자인 BHQ1을 부착시킨 서열번호 3번을 설계하였다.
상기 DFO 올리고뉴클레오타이드에 대한 실시간 중합효소연쇄반응 여부 확인을 위해 HIV tat 유전자의 forward primer로 DFO 올리고뉴클레오타이드인 서열번호 2번 또는 서열번호 3번을 사용하였으며, reverse primer는 서열번호 23번을 사용하였다. Rat GAPD 유전자에 대해서는 forward primer는 서열번호 24번을 사용하였으며, reverse primer는 DFO 올리고뉴클레오타이드인 서열번호 7번과 서열번호 8번을 사용하였다. 상기 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트를 0.5uM 실시간 중합효소연쇄반응에 첨가하였으며, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하였다. HIV tat 유전자에 대한 실시간 중합효소연쇄반응은 HIV-1 isolate 10BR_PE064(GI:672918720, 5281-5700bp)를 유전자합성을 통해 HIV tat plasmid DNA를 제작하였으며, 이를 6.9, 0.69 ng/ul, 69, 6.9, 0.69 fg/ul를 각각 5ul씩 반응 혼합물에 첨가하여 95℃ 5분, (95℃ 30초, 55℃ 30초) 40cycle을 수행하였으며, Rat GAPD 유전자에 대하여는 Rat genomic DNA(Clontech, Cat.No. 636404)를 2, 0.2, 0.02ng/ul를 각각 5ul씩 반응혼합물에 첨가하여 95℃ 5분, (95℃ 30초, 60℃ 30초) 40cycle을 수행하였다.
도 3은 HIV tat 유전자 검출용 올리고뉴클레오타이드 세트의 DFO 3‘말단과 3'말단의 9번째 base에 퀀처 분자를 부착시킨 서열번호 2번을 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 RFU 시그널이 template 농도에 상관없이 동일하게 사선으로 올라가는 것을 확인하였으며, 서열번호 3번에 대한 DFO는 template 농도가 감소함에 따라 Ct가 늦게 나타남을 확인하였으며, RFU 시그널에 대한 delta Rn이 서열번호 2에 비해 서열번호 3이 8,000 RFU 높게 나타났다.
도 4는 Rat GAPD 유전자 검출용 올리고뉴클레오타이드 세트의 DFO 3‘말단의 2번째와 4번째 base에 퀀처 분자를 부착시킨 서열번호 7번 또는 서열번호 8번을 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과로 RFU 시그널의 delta Rn 이 각각 12,500과 10,000 으로 검출되었으며, 퀀처 분자가 3’말단 2번째와 4번째에 대한 DFO가 10ng/rxn에서 22.43 Ct과 22.68 Ct, 1ng/rxn은 26.22 Ct와 26.46, 0.1ng/rxn은 29.73 Ct과 30.08 Ct로 각 농도별 유사 Ct를 확인하였다.
상기 도 3과 도 4의 결과로 DFO 올리고뉴클레오타이드의 3‘말단에는 퀀처 분자 또는 리포터 염료를 부착시키면 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 시그널 검출이 부적절하며, 최소 3’말단의 2번째 base부터 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 적합성을 확인하였다.
실시예 3 : 본 발명의 DFO의 mis-matching 서열개수에 따른 단일가닥 풀림 온도에 따른 실시간 중합효소연쇄반응 효과
본 발명의 DFO는 단일가닥에서 일정온도 이하의 경우 이중가닥으로 형성되어지는데 이를 조절하는 것이 mis-matching 서열개수에 따른 것이다. Human mRNA에서 beta-actin 유전자를 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 세트의 forward primer를 mis-matching 서열개수를 4, 6, 9개 포함시켜 65℃, 55℃, 45℃ 부근에서 이중가닥이 단일가닥으로 풀리도록 서열번호 12, 서열번호 11, 서열번호 13의 DFO를 설계하였다.
Human total RNA(stratagene, Cat.No. 750500)에서 beta-actin 유전자 검출을 위해 cDNA합성은 200U MMLV RTase, 1uM 서열번호 14 primer, 1x reaction buffer, 1mM dNTPs의 반응혼합물에 5ul human total RNA (100ng/ul)를 첨가하여 37℃ 60분, 95℃ 5분 반응하였다.
*상기 DFO를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응의 cycle 온도에서 이중가닥이 단일가닥으로 풀림 온도에 따른 반응 효과를 확인하기 Taqman system을 대조군으로 하기위해 서열번호 21을 forward primer로, 서열번호 14를 reverse primer로, 서열번호 25를 taqman probe로 사용하였으며, 시험군으로 서열번호 14를 reverse primer로 사용하여 각 온도에 따른 서열번호 12, 서열번호 11, 서열번호 13의 DFO를 각각 forward로 하여 각 올리고뉴클레오타이드 세트를 0.3uM, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하였다. cDNA(total RNA 25ng/ul)를 5ul 첨가하여 대조군은 95℃ 5분, (95℃ 30초, 60℃ 30초) 40cycle을 수행하였고, DFO 올리고뉴클레오타이드 세트는 95℃ 5분, (95℃ 30초, 45℃ 60초) 40cycle을 수행하였다.
도 5의 결과 대조군인 Taqman control은 delta Rn이 12,500의 RFU값을 보였으며, B-actin 65 F의 풀림온도 65℃ 부근인 서열번호 11의 DFO 올리고뉴클레오타이드 세트에서는 형광 시그널이 검출되지 않았으며, B-actin 55 F의 풀림온도 55℃ 부근인 서열번호 11과 B-actin 45 F의 풀림온도 45℃ 부근인 서열번호 13의 DFO 올리고뉴클레오타이드 세트는 delta Rn이 20,000으로 Taqman cotrol 대비 높은 RFU 시그널 값을 보였다. 이 결과는 DFO 올리고뉴클레오타이드의 mis-matching 서열개수가 4개로 풀림온도가 65℃로 높을 경우 변성온도에서 단일가닥으로 풀려있던 DFO가 어닐링과 연장온도로 낮아지면서 target 유전자에 어닐링이 되지 못하고 이중가닥으로 형성되기 때문에 실시간 중합효소 연쇄반응이 나타나지 않은 것이며, 이에 비해 mis-matching 서열개수가 6개, 9개로 포함되어 풀림 온도가 55℃, 45℃로 낮을 경우 이중가닥으로 변형되는 시간이 풀림 온도 65℃ DFO에 비해 짧기 때문에 target 유전자에 어닐링이 이루어져 연장단계가 수행되어 지속적으로 단일가닥을 형성하면서 형광 시그널이 검출되는 것이다.
실시예 4 : 본 발명의 DFO의 mis-matching 서열개수 고정하여 어닐링과 연장온도 변화에 따른 영향
본 발명의 DFO의 mis-matching 서열개수를 6개로 풀림온도 55℃인 서열번호 11의 DFO 올리고뉴클레오타이드와 reverse primer를 서열번호 14로 설계한 human mRNA beta-actin 올리고뉴클레오타이드 세트로 어닐링과 연장온도를 풀림온도 ±10℃ 적용하여 실시간 중합효소연쇄반응의 효율을 분석하였다.
Human total RNA(stratagene, Cat.No. 750500)에서 beta-actin 유전자 검출을 위해 cDNA합성은 200U MMLV RTase, 1uM 서열번호 14 primer, 1x reaction buffer, 1mM dNTPs의 반응혼합물에 5ul human total RNA (100ng/ul)를 첨가하여 37℃ 60분, 95℃ 5분 반응하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드 세트와 조건으로 0.3uM 올리고뉴클레오타이드, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하였다. cDNA(total RNA 25ng/ul)를 5ul 첨가하여 95℃ 5분, (95℃ 30초, 65℃ 또는 55℃ 또는 45℃ 30초, 45℃ 30초) 40cycle을 수행하였다.
도 8의 결과, 45℃의 어닐링과 연장온도 대비 온도가 높아질수록 delta Rn이 10℃ 상승에 따라 RFU 3,000 씩 증가하였다. 또한, Ct 값도 어닐링과 연장온도 상승에 따라 0.125 ng/rxn의 낮은 농도에서 1 Ct 내외의 당겨짐이 확인되었다. 이에 따라 일정온도 이상이 되면 단일가닥의 DFO로 변형되어 반응성이 나타나고 일정온도 이하가 되면 반응성 감소 및 중단되게 된다.
실시예 5 : 본 발명의 DFO의 cycle 조건에 형광 측정단계 추가 및 시간 설정에 따른 효과
본 발명의 DFO cycle 조건 설정을 위해 Human genomic DNA(Promega, G3041)에 대한 올리고뉴클레오타이드 세트로 서열번호 11번의 DFO와 서열번호 15번을 0.3uM, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하였다. Human genomic DNA 농도는 24.8, 2.48, 0.248 ng/ul를 5ul 사용하여 초기변성 95℃ 5분을 수행한 수, 변성(95℃)/어닐링과 연장(55℃)/형광측정(45℃) 시간(scanning time)을 각각 5초/5초/5초, 10초/10초/10초, 30초/30초/30초로 40cycle씩 수행하였다.
도 6의 결과 background는 5초/5초/5초, 10초/10초/10초는 RFU 값이 7,000이며, 30초/30초/30초는 RFU 값이 8,000으로 유사하였다. 5초/5초/5초의 경우는 농도 비례한 Ct값의 결과를 얻을 수 없었으며, 10초/10초/10초, 30초/30초/30초는 농도 비례한 Ct값의 결과를 확인하였으며, 10초/10초/10초에 비해 30초/30초/30초의 delta Rn값의 RFU가 4,000 높게 나타났으나 Ct 값은 유사한 결과를 보였으며, 5초/5초/5초에 비해 10초/10초/10초의 delta Rn의 RFU가 9,000 높게 나타났다.
상기 결과로 유사 Ct 조건을 보이고 안정적인 RFU 값을 나타낸 10초/10초/10초의 40cycle 조건에서 형광 측정 시간을 5초를 줄여 시험한 도 7의 결과에서 둘 간 동일한 background 및 delta Rn의 RFU 값을 확인하였으며, Ct 값 또한 유사한 결과를 나타내어, 형광 측정 시간 감소는 DFO를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응에 영향이 없었다.
도 9의 결과 형광 측정 시간을 제외한 조건과 포함시킨 조건 비교 결과, 30초/30초 대비 30초/30초/30초로 형광 측정 시간을 포함시킨 결과에서 delta Rn 값의 RFU가 8,000 높게 나타났으며 background는 RFU 3,000 낮게 나타났다. 10초/10초 대비 10초/10초/10초는 background가 RFU 8,000 낮게 나타났다. 형광 측정 시간 포함과 미포함의 Ct값은 유사하였다.
상기 결과들을 토대로 형광 측정 시간을 포함시켜 단일가닥의 잔여 DFO에 대한 형광값 검출 우려를 차단하고, target 유전자와 결합되어 증폭된 산물에 대해서만 형광값을 측정할 수 있으며, background를 낮추는 효과가 나타났다.
실시예 6 : 본 발명의 DFO 사용시 DNA 중합효소 종류에 따른 효과
실시간 중합효소연쇄반응의 Taqman system은 5'3' exonuclease 활성(+)을 갖는 DNA 중합효소를 사용하며, SYBR green과 같은 intercalating dye를 이용한 반응은 5'3' exonuclease 활성(+) 또는 5'3' exonuclease 비활성(-)을 갖는 DNA 중합효소의 사용이 가능하다. 본 발명의 DFO를 사용하여 5'3' exonuclease 활성(+) 또는 비활성(-)에 따른 반응성을 확인하기 위하여 human total RNA로 합성한 cDNA(RNA 농도 2.5, 0.25, 0.025 ng/ul)를 5ul 사용하고, 서열번호 11번과 서열번호 14번을 0.3uM 사용하여 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U DNA 중합효소(5'3' exonuclease 활성(+) 또는 비활성(-))의 반응 혼합물을 제조하였으며, 95℃ 5분, (95℃ 10초, 55℃ 10초, 45℃ 5초) 40cycle을 수행하였다.
도 10은 5'3' exonuclease 활성(+) 또는 비활성(-)을 갖는 각각의 DNA 중합효소를 통한 실시간 중합효소연쇄반응 결과로 background는 동일하며, delta Rn은 5'3' exonuclease 활성(+)을 갖는 DNA 중합효소가 RFU 5,000이 높지만, Ct는 5'3' exonuclease 비활성(-)을 갖는 DNA 중합효소가 약 1.65 Ct 당겨져 검출되었다. 본 발명의 DFO는 5'3' exonuclease 활성(+) 또는 비활성(-)를 각각 갖는 DNA 중합효소에서의 반응성을 확인하였으며 5'3' exonuclease 비활성(-)를 갖는 DNA 중합효소에서 민감도가 높게 나타났다. 따라서 Taqman system과 같이 리포터 염료와 퀀처 분자를 사용하고, SYBR green과 같이 5'3' exonuclease 비활성(-)의 DNA 중합효소를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행할 수 있다.
실시예 7 : 실시간 검출을 원하는 특정 유전자의 증폭서열 크기에 따른 본 발명의 DFO의 효과
Taqman system의 경우 증폭하고자하는 서열의 크기가 400bp를 초과하게 되면 실시간 중합효소연쇄반응의 반응성에 영향을 미치고 forward와 reverse, 그리고 probe의 3종에 대한 서열을 증폭하고자하는 특정 유전자의 서열에서 확보해야하며 probe의 경우는 forward와 reverse에 비해 온도 설계를 약 10℃ 높게 해야 하는 제약이 있다. 따라서, 본 발명의 DFO를 사용하여 증폭서열 크기에 따른 반응성을 확인하기 위하여 DFO를 forward(서열번호 11)로 사용하고 reverse를 50(서열번호 16), 216(서열번호 14), 300(서열번호 17), 450(서열번호 18), 800(서열번호 19), 1000bp(서열번호 20)에 대한 증폭 크기에 따른 반응성을 확인하기 위하여 0.3uM 올리고뉴클레오타이드, 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하여 95℃ 5분, (95℃ 20초, 55℃ 20초, 45℃ 10초) 40cycle을 수행하였다.
도 11에서 동일한 DFO를 forward로 사용하여 reverse를 크기에 따라 설계하여 반응한 결과 50bp의 Ct 결과 대비 다른 크기의 Ct 값을 비교한 결과 0.74 Ct 부터 4.4 Ct의 차이가 발생하여 reverse의 반응성 차이에 따른 것으로 크기에 따라 Ct가 밀리는 현상은 나타나지 않았으며 50~1000bp 증폭크기에 대한 반응성을 확인하였다.
*실시예 8 : 본 발명의 DFO를 forward, reverse 위치에 각각 또는 한 쌍을 적용한 경우에 따른 효과 분석
본 발명의 DFO를 forward primer 위치로 설계한 서열번호 11번과 reverse primer 위치로 서열번호 14번과 동일한 서열로 설계한 서열번호 22번을 각각 또는 한 쌍으로 실시간 중합효소연쇄반응에 포함시켜 반응성을 확인하였다.
Human total RNA(stratagene, Cat.No. 750500)에서 beta-actin 유전자 검출을 위해 cDNA합성은 200U MMLV RTase, 1uM 서열번호 14 primer, 1x reaction buffer, 1mM dNTPs의 반응혼합물에 5ul human total RNA (100ng/ul)를 첨가하여 37℃ 60분, 95℃ 5분 반응하였다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 사용한 세트는 forward DFO인 서열번호 11번과 reverse인 서열번호 14번, forward인 서열번호 21번과 reverse DFO인 서열번호 22번, forward DFO인 서열번호 11번과 reverse DFO인 서열번호 22번에 대한 3가지 올리고뉴클레오타이드 세트를 각각 0.3uM 사용하여 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하여 95℃ 5분, (95℃ 30초, 55℃ 30초, 45℃ 30초) 40cycle을 수행하였다.
도 12의 결과 Taqman control 대비 forward, reverse를 DFO로 각각 수행한 결과에서 delta Rn 값이 12,500 높게 나타났으며, forward와 reverse DFO를 함께 사용한 결과에서는 각각 사용한 DFO에 비해 RFU가 15,000 높게 나타났다. Ct 값은 Taqman control과 유사한 결과를 확인하였다.
실시예 9 : 본 발명의 DFO를 이용한 multiplex 실시간 중합효소연쇄반응에 따른 효과 분석
Human beta-actin mRNA와 HIV tat gene 그리고, M13 bacteriophage에 대한 multiplex 실시간 중합효소연쇄반응을 위해 본 발명의 DFO를 forward primer에 위치시키고, conventional primer를 reverse primer로 하였다. DFO oligo set으로 리포터 염료 Fam과 퀀처 분자 BHQ1이 포함된 서열번호 11번과 서열번호 14번을 human beta-actin mRNA, 리포터 염료 Hex와 퀀처 분자 BHQ1이 포함된 서열번호 26번과 서열번호 28번을 HIV tat gene, 그리고, 리포터 염료 Cy5와 퀀처 분자 BHQ2가 포함된 서열번호 33번과 서열번호 31번을 M13 bacteriophage에 대해 동시 검출을 위해 사용하였다. 대조군으로 Taqman system을 적용하는 oligo set으로 서열번호 21번과 서열번호 14번, 그리고, 리포터 염료 Fam과 퀀처 분자 BHQ1이 포함된 서열번호 25번을 human beta-actin mRNA, 서열번호 27번과 서열번호 28번, 그리고, 리포터 염료 Hex와 퀀처 분자 BHQ1이 포함된 서열번호 29번을 HIV tat gene, 그리고, 서열번호 30번과 서열번호 31번, 그리고, 리포터 염료 Cy5와 퀀처 분자 BHQ2가 포함된 서열번호 32번을 M13 bacteriophage에 대한 동시 검출을 위해 사용하였다.
상기 올리고를 사용한 세트는 각각 0.3uM 사용하여 0.2mM dNTPs, 1x reaction buffer, 0.5U Taq DNA 중합효소의 반응 혼합물을 제조하였으며, DFO oligo set에 대한 반응 조건은 95 5분, (95 30초, 65 30초, 25 5초) 40cycle이며, TaqMan oligo set에 대한 반응 조건은 95 5분, (95 30초, 65 30초) 40cycle을 수행하였다.
Human total RNA(stratagene, Cat.No. 750500)에서 beta-actin 유전자 검출을 위해 cDNA합성은 200U MMLV RTase, 1uM 서열번호 14 primer, 1x reaction buffer, 1mM dNTPs의 반응혼합물에 5ul human total RNA (100ng/ul)를 첨가하여 37 60분, 95 5분 반응하여 cDNA를 합성하였다. HIV tat gene 증폭을 위한 주형 DNA는 HIV-1 isolate 10BR_PE064(GI:672918720, 5281-5700 bp)를 plasmid DNA 에 유전자합성을 통해 HIV tat plasmid DNA를 제작하였다. M13 bacteriophage(ATCC 15669-B1)에서 DNA를 추출하였다. 위 3개 target 검출을 위해 template(human total RNA에 대한 cDNA : HIV tat plasmid DNA : M13 bacteriophage DNA)는 (12.5ng : 5x10^5 copies : 50pg / test) 와 (1.25ng : 5x10^4 copies : 5pg) / test 을 각각 농도로 하여 multiplex 실시간 중합효소연쇄반응에 사용하였다.
도 13 내지 도 14와 같이 DFO system에서 TaqMan system과 같이 3가지 target에 대한 리포터 염료가 모두 검출되었으며, Ct도 유사하게 확인되었다. Delta Rn의 경우, DFO system이 TaqMan system에 비해 약 1.5배 높게 나타나는 결과를 보였다.
[서열 목록]
1
Tat P
5'-Fam-GCCCTGGAAGCAT(innerdT-BHQ1)CCAGGAAGTCAGCC-3'
2
Tat55 F-Ix0_Fam01
5'-Fam-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCGAATTGGGTGTCAACATAGCAGAAT-BHQ1-3'
3
Tat55 F-Ix0_Fam09
5'-Fam-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCGAATTGGGTGTCAACAT(innerdT-BHQ1)AGCAGAAT-3'
4
Tat55 F-Ix0_Fam15
5'-Fam-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCGAATTGGGTGT(innerdT-BHQ1)CAACATAGCAGAAT-3'
5
Tat55 F-Ix0_Fam17
5'-Fam-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCGAATTGGGT(innerdT-BHQ1)GTCAACATAGCAGAAT-3'
6
Tat55 F-Ix0_Fam21
5'-Fam-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCGAATT(innerdT-BHQ1)GGGTGTCAACATAGCAGAAT-3'
7
GAPD55 R-Ix1_Fam02
5'-Fam-TACAGCATGTCCCACGTGGGAITCCCACCACCCTGTTGCTGT(innerdT-BHQ1)A-3'
8
GAPD55 R-Ix1_Fam04
5'-Fam-TACAGCATGTCCCACGTGGGAITCCCACCACCCTGTTGCT(innerdT-BHQ1)GTA-3'
9
GAPD55 R-Ix1_Fam07
5'-Fam-TACAGCATGTCCCACGTGGGAITCCCACCACCCTGTT(innerdT-BHQ1)GCTGTA-3'
10
GAPD55 R-Ix1_Fam08
5'-Fam-TACAGCATGTCCCACGTGGGAITCCCACCACCCTGT(innerdT-BHQ1)TGCTGTA-3'
11
B-actin55 F-Ix1_Fam05
5'-Fam-AAGCAGCGCACCGCATCTCTIAGAGATGGCCACGGCT(innerdT-BHQ1)GCTT-3'
12
B-actin65 F-Ix1_Fam05
5'-Fam-AAGCAGCCCACCCCATCTCTIAGAGATGGCCACGGCT(innerdT-BHQ1)GCTT-3'
13
B-actin45 F-Ix1_Fam05
5'-Fam-AAGCACGGCACCGGATCTCTIAGAGATGGCCACGGCT(innerdT-BHQ1)GCTT-3'
14
B-actin R_B
CGGATGTCCACGTCACACT
15
B-actin_R-gDNA-3
GGAAATGAGGGCAGGACTTAG
16
actin_R-gDNA-50-2
GCTCGTAGCTCTTCTCCAGG
17
actin_R-gDNA-300-3
GTCTTTGCGGATGTCCACG
18
actin_R-gDNA-450-3
GACCCTGGATGTGACAGC
19
actin_R-gDNA-800-3
ACCGACTGCTGTCACCTT
20
actin_R-gDNA-1000-1
TGGACTTGGGAGAGGACTG
21
B-actin_F
AGAGATGGCCACGGCTGCTT
22
actin55R_B-Ix1Fam05
5’-AGTGT(innerdT Fam)GACCACCACATCCGICGGATGTCCACGT(innerdT-BHQ1)CACACT-3'
23
Tat R-2
GCAATAGCAAGTGGTACAAGCA
24
GAPD N_F-2
AGGACCAGGTTGTCTCCTGT
25
B-actin_P
5'-Fam-AGCGGTTCCGCTGCCCTGAGGC-BHQ1-3'
26
Tat55 F-Ix1_Hex09
5'-Hex-ATTCTGCTTACAACTGACCCAATTCIGAATTGGGTGTCAACAT(innerdT-BHQ1)AGCAGAAT-3'
27
Tat F
GAATTGGGTGTCAACATAGCAGAAT
28
Tat R-4
ACTTGGCAATGAAAGCAACATC
29
Tat P_Hex
5'-Hex-GCCCTGGAAGCAT(innerdT-BHQ1)CCAGGAAGTCAGCC-3'
30
M13_F-3
GCTACCCTCGTTCCGATG
31
M13_R-3
CGCCGACAATGACAACAAC
32
M13_P-2
5'-Cy5-CCTGCAAGCCTCAGCGACCGAA-BHQ2-3'
33
M13_F-3_Fam
5’-Cy5-CATCGGTTGCTGGGTAGCIGCTACCCTCGTTCCGAT(innerdT-BHQ2)G-3’

Claims (19)

  1. 특정 유전자 서열 증폭을 위해 해당서열에 대한 프라이머의 5 말단에 이노신(inosine) 링커(linker)를 연결하고 그 링커의 5'쪽에 상기 프라이머와 상보적인 서열을 연결하고 이 상보적인 서열 부위에 하나 이상의 미스-매칭(mis-matching) 뉴클레오타이드를 포함하여 버블 구조를 이루는 상보적인 이중가닥 올리고뉴클레오타이드, 여기서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 특정 유전자 증폭에 대한 핵산 검출을 위해 리포터 염료와 퀀처분자 한 쌍을 포함하는 이중가닥의 구조를 가지며, 일정 온도이상에서는 단일가닥으로 변성하는 특징을 갖는 올리고뉴클레오타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 한 가닥의 올리고뉴클레오타이드가 특정 유전자의 해당서열의 프라이머 부위와 이에 상보적인 서열이 이노신 링커를 연결하고, 상보적인 서열에 미스-매칭 염기서열이 2개 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 이중가닥에서 단일가닥으로 분리되는 멜팅(melting) 온도는 40~65℃인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하나에서 네 개의 버블 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥 구조에서 리포터 염료와 퀀처 분자가 한 쌍을 이루며 둘 간의 거리는 15mer 이상 떨어져 있는 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 이중가닥 형성시 리포터 염료와 퀀처 분자간 거리가 14 mer 이내에 위치한 올리고뉴클레오타이드.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 리포터 염료의 위치가 5‘ 말단부터 상보적인 서열과 미스-매칭 서열 또는 3‘ 말단의 두 번째부터 특정유전자의 해당서열 내에 위치하는 올리고뉴클레오타이드.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 퀀처 분자의 위치가 5‘ 말단부터 상보적인 서열과 미스-매칭 서열 또는 3‘ 말단의 두 번째부터 특정유전자의 해당서열 내에 위치하는 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 이노신 링커는 0 내지 9 개의 이노신 뉴클레오타이드로 구성된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 유전자 증폭과 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한 포워드(forward), 리버스(reverse) 위치에 각각 사용되거나 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2 내지 13, 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 29, 또는 서열번호 33인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드.
  12. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 특정 유전자 부위를 50bp부터 1000bp까지 유전자 증폭하고, 형광 시그널을 실시간 측정을 하는 방법.
  13. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 DNA 또는 RNA에서 특정 유전자의 서열을 증폭하고 형광 시그널을 실시간 또는 증폭 완료 후 형광 시그널을 측정하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 특정 유전자 증폭을 위한 온도는 변성(denatureation), 결합 (annealing), 연장 (extension), 형광 배열 (fluorescein arrangement)의 4가지 온도 또는 변성, 결합과 연장, 형광 배열의 3가지 온도 처리 후 형광 량을 측정하여 이를 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 변성 온도는 90~95℃, 결합과 연장 온도는 45~65℃, 형광 배열 온도는 25~45℃로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 RNA로부터 특정 유전자 서열을 증폭하는 과정은 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 역전사 중합효소로 cDNA를 합성하고, 변성(denatureation), 결합 (annealing), 연장 (extension), 형광 배열 (fluorescein arrangement)의 4가지 온도 또는 변성, 결합과 연장, 형광 배열의 3가지 온도 처리 후 형광량을 측정하여 이를 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 핵산 증폭 및 형광량 측정용 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 조성물은 5‘→ 3’ 엑소뉴클레이즈(+) 또는 (-), 3‘ → 5’ 엑소뉴클레이즈(-) 활성을 갖는 DNA 중합효소와 Hotstart DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 중합효소를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 제 1항의 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환, 유전성 질환, 약제내성, 약물저항성 또는 감수성 검체의 DNA 및 RNA에 대한 특정 유전자를 개별 또는 동시 다중으로 증폭하는 키트.
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