WO2016166282A1

WO2016166282A1 - Substrat zum kultivieren von zellen

Info

Publication number: WO2016166282A1
Application number: PCT/EP2016/058342
Authority: WO
Inventors: Thomas Knott
Original assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Current assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2016-10-20
Anticipated expiration: 2017-10-15

Abstract

Ein Substrat ist zur Kultivierung mindestens einer Zelle, insbesondere zur Kultivierung einer Ansammlung oder eines Aggregats von Zellen für die Bestimmung von biologisch relevanten Messgrößen an diesen Zellen oder Zellmembranen vorgesehen. Dabei weist das Substrat min- destens eine Oberfläche auf, die an bestimmten Positionen, vorzugsweise an bestimmten adressierbaren Positionen, eine Affinität zum Anhaften der Zellen besitzt. Offenbart ist auch ein Verfahren zur Kultivierung mindestens einer Zelle, insbesondere zur Kul- tivierung einer Ansammlung oder eines Aggregats von Zellen, bei denen das beschriebene Substrat in eine zellabweisende, hydrophobe Kultivierungsvorrichtung eingebracht wird, und Zellen auf diesem Substrat kultiviert werden. Das beschriebene Substrat und das beschriebene Verfahren sind insbesondere für analytische Verfahren, die sich die Patch-Clamp-Technik zunutze machen, geeignet.

Description

Beschreibung

Substrat zum Kultivieren von Zellen

Die Erfindung betrifft u.a. ein Substrat zur Kultivierung von Zellen gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 . Dieses erfindungsgemäße Substrat ist insbesondere zur Kultivierung einer Ansammlung oder eines Aggregats von Zellen für die Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an diesen Zellen oder deren Zellmembranen vorgesehen. Dabei kann die Ansammlung oder das Aggregat von Zellen auch als Gewebe bezeichnet werden. Insbesondere dient das Substrat zur Kultivierung von sogenannten adhärenten Zellen, wie Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen, Muskelzellen u.a., die auf Oberflächen wachsen, im Gegensatz zu Zellen, die frei im Nährmedium schwimmend wachsen.

Erfindungsgemäß ist das Substrat dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Oberfläche aufweist, die an bestimmten Positionen, vorzugsweise an bestimmten adressierbaren Positionen eine Affinität, insbesondere eine verbesserte Affinität, zum Anhaften der Zellen an der Substratoberfläche besitzt.

Unter dem Begriff „adressierbar" soll dabei nach der Erfindung verstanden werden, dass die entsprechende Position auf der Oberfläche des Substrats (wieder) auffindbar ist, und so beispielsweise bei einem sich anschließenden Messverfahren angesteuert werden kann, um eine an dieser Stelle/Position anhaftende Zelle gezielt der entsprechenden Messung oder Untersu- chung zuzuführen.

Mit Vorteil ist das erfindungsgemäße Substrat in mindestens einem Lösungsmittel oder mindestens einem Lösungsmittelgemisch suspendierbar, d.h. die entsprechenden Substrate können in eine Suspension überführt werden. Insbesondere handelt es sich in diesen Fällen um ein gepuffertes Lösungsmittel oder um ein gepuffertes Lösungsmittelgemisch, d.h. ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelsystem, das innerhalb gewisser Grenzen bei Zugabe einer Säure oder einer Base seinen pH-Wert nicht (stark) ändert.

In Weiterbildung ist das erfindungsgemäße Substrat vorzugsweise flächig oder planar ausgebildet. Dies soll im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeuten, dass das Substrat in einer Raumrichtung eine geringere, insbesondere deutlich geringere Abmessung, besitzt als in den beiden anderen Raumrichtungen. In diesen Fällen handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Substrat insbesondere um ein scheibenförmiges oder ringförmiges Substrat, wobei vorzugsweise das Substrat aus mindestens zwei miteinander verbundenen Scheiben oder Ringen aufgebaut sein kann. Diese Ausführungsformen werden im Zusammenhang mit den Figuren noch näher erläutert.

Die bereits genannten Merkmale des erfindungsgemäßen Substrats und weitere bevorzugte Merkmale sind in den von Anspruch 1 abhängigen Unteransprüchen genannt. Der Wortlaut aller dieser Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme ausdrücklich zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. Gleiches gilt auch für die in den unabhängigen Verfahrensansprüchen 12 und 14 beanspruchten Verfahren, mit ihren jeweiligen Unteransprüchen, und für den in Anspruch 20 beanspruchten Kit mit seinen Unteransprüchen.

Bei der Erfindung werden einzelne Zellen oder Ansammlungen und Aggregate von 2, 3 oder bis hin zu einigen 100 Zellen, vorzugsweise bis zu ca. 200 Zellen auf dem erfindungsgemäßen Substrat, auch „floating substrat" oder miniaturisierte mikrostrukturierte Substrate (MMS) genannt, räumlich organisiert anwachsen. Die Dichte der MMS steuert dabei Absinken, Schweben oder Aufsteigen in einer Suspension der Substrate in einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise in Pufferlösung. Die relative Dichte der MMS im Vergleich zu Kulturmedium, Wasch- und Meßpuffern und im Vergleich zu den jeweiligen Zellen ist ein einstellbarer Parameter zur Optimierung der Zellkulturprozesse (Absinken oder Schweben oder Aufsteigen) und der Messprozesse, insbesondere der Patch-Clamp-Prozesse (MMS wirkt als eine Art Senkblei oder Fallschirm oder Heißluftballon für die Zellen) aus Sicht der vorliegenden Erfindung.

Durch das gezielte Anwachsen der Zellen und somit der genauen Positionsbestimmung der Zellen, und durch die Möglichkeit der temporären Suspendierung der MMS durch Krafteinwirkung zu Überwindung von Schwerkraft, Auftrieb und Viskosität (Krafteinwirkung durch Strömung, Magnetkraft, Elektrostatik, Ultraschall, Wärme, Licht, etc.), um die Gewebe relativ zur Messeinrichtung, insbesondere relativ zur Patchposition bzw. in den Patch Chip zu transportieren, ist es möglich, insbesondere die Patch-Clamp-Technik, erstmals auch an Gewebe automa- tisiert durchzuführen.

Bei der Patch-Clamp-Technik handelt es sich um eine elektrophysiologische Messmethode, mit der sich der Strom, der durch einzelne lonenkanäle in der Zellmembran einer Zelle fließt, dar- stellen lässt. Die Bezeichnung„Patch" bezieht sich dabei auf den kleinen Membranausschnitt unter der sogenannten Patch-Pipette, die zugleich als Messelektrode dient. So ist es mit diesem Verfahren möglich, die Funktion von Zellen in ihrer natürlichen Umgebung im lebenden Organismus zu messen. Bei der Patch-Clamp-Technik nach dem sogenannten Cytocentering-Verfahren (EP 1 31 1 655) wird Zell-Suspension auf einen Chip pipettiert, der mikrostrukturierte Öffnungen aufweist. Durch Unterdruck wird eine Zelle der Zell-Suspension gezielt auf der Öffnung des Chips positioniert und eine elektrisch dichte Verbindung zwischen Zelle und Glas ausgebildet (Gigaseal). Das Verfahren bietet, verglichen mit dem herkömmlichen manuellen Patch-Clamp-Verfahren, einige Vorteile. Neben der wesentlich höheren Durchsatzrate erlaubt beispielsweise die Integration von mikrofluidischen Kanälen eine automatisierte Wirkstoffzugabe, wie sie in der Pharmafor- schung benötigt wird. Auch ist die Perfusion der Intrazellulärseite sehr viel einfacher möglich, wodurch Wirkstoffe besser untersucht werden können, die intrazellulär wirken.

Die Offenbarung der EP 131 1655 wird hiermit, soweit sie in Kombination mit den Merkmalen der vorliegenden Erfindung relevant ist, ausdrücklich durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.

Da beim automatisierten Patch Clamping die Zellen jedoch vereinzelt werden müssen, um sie zur Patchposition zu transportieren, sind bisher keine Messungen an Gewebeschnitten möglich.

Nach der vorliegenden Erfindung wird zur Kultivierung räumlich organisierter Zellen auf be- stimmten, insbesondere adressierbaren Positionen das erfindungsgemäße „floating substrat" zur Kultivierung in eine zellabweisende und hydrophobe Kulturschale oder eine Vorrichtung vergleichbarer Funktionalität eingebracht, insbesondere gelegt. So ist ein Anwachsen der Zellen auf dem Boden der Kulturschale ausgeschlossen.

Eine konkave Kulturschale ist bevorzugt, um die Substrate und die zu kultivierenden Zellen möglichst am tiefsten Punkt der Schale zu sammeln. Eine Schale mit vielen konkaven (Mikro-) Vertiefungen ist weiter bevorzugt.

Auch ist es denkbar, mehrere Substrate in eine Kulturschale zu legen, wobei sich diese möglichst nicht berühren sollten, um ein Zusammenwachsen der Zellen zu vermeiden. Das erfindungsgemäße Substrat kann in seiner Größe, Form sowie auch in der Beschichtung variieren. Zudem sind diese Parameter (Größe, Form und Beschichtung) ausschlaggebend für das Wachstum bzw. die Menge der anwachsenden Zellen auf dem Substrat. So kann insbesondere durch eine entsprechende Beschichtung an bestimmten Stellen der Oberfläche des Substrats die Affinität zum Anhaften der zu kultivierenden Zellen bereitgestellt und/oder verbessert sein. Des Weiteren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Substrate alternativ oder zusätzlich zu einer Beschichtung mit einer Mikrostrukturierung zu versehen. Die Mikrostrukturierung kann mittels geometrischer Form (Bereitstellung von Vertiefungen, Erhebungen und dgl. in der Oberfläche, ggf. auch in regelmäßigen Strukturen) und/oder strukturierter Beschichtung (ggf. ebenfalls als regelmäßig sich wiederholende Strukturen) erfolgen. Die Beschichtung kann durch physikalische, chemische, biochemische, molekularbiologische oder biologische Verfahren erfolgen. Die Zusammensetzung der Beschichtung kann chemisch oder biochemisch definiert sein. Dies ermöglicht eine weitere Steuerung des Zellwachstums. Mikrostrostrukturierte Oberflächen wurden in den letzten Jahren bereits mit Zellen eingesetzt. Besonders für die Besiedlung von Implantaten eröffnet diese Technologie neue Möglichkeiten in der gezielten Steuerung von Zellwachstum. Dies kann beispielsweise für die Behandlung peripherer Nervenläsionen genutzt werden, indem das künstliche Nervenimplantat mikrostrukturierte Oberflächen aufweist, die ein aufeinander hin gerichtetes Wachstum der zertrennten Nervenenden ermöglichen. Eine weitere Anwendung besteht in der gezielten Differenzierung von Endothel- und glatten Muskelzellen für den Einsatz in Gefäßimplantaten. Auch hier wird durch die mikrostrukturierte Oberfläche ein extrazelluläres Milieu geschaffen, was die Bildung künstlicher Gefäße begünstigen soll. Die vorliegende Erfindung wendet solche mikrostrukturierte Oberflächen in neuer Art und Weise auf die Züchtung von suspendierbaren Mikrogeweben für analytische Zwecke an.

Weiterhin ist das Anwachsen der Zellen möglich, ohne das Substrat in Suspension geben zu müssen. Damit wird u.a. der nachteilige Einfluss von Scherkräften, der bei einer Kultivierung von Zellen in einer bewegten Suspension auftritt, vermieden. Lediglich zur Messung wird das Substrat in Suspension überführt. Zur Kultivierung jedoch wird das Substrat lediglich mit dem entsprechenden Nährmedium vorsichtig gespült. Dabei werden Zellen, die sich in der Kulturschale oder auf dem Substrat an falscher Position„verirrt" haben, abgespült, so dass eine optimale und gezielte Kultivierung möglich ist. Die Oberfläche des Substrates ist derart beschaffen, dass die Zellen nur an den dafür festgelegten Positionen fest anwachsen, ein Abspülen der bereits angewachsenen Zellen ist nicht möglich. Durch optional integrierte Gestelle, durch Ebenen oder generell durch dreidimensionale architektonische Struktur erlauben die MMS einen Bewuchs auf allen Raumseiten. Bei der Kultivierung von Zellen in Suspension besteht oft das Problem, dass diese sehr dicht und übereinander bzw. miteinander verwachsen. Dies ist mit dem erfindungsgemäßen Substrat und dem erfindungsgemäßen Verfahren verhindert. Vielmehr ist ein räumlich organisiertes Wachstum der Zellen an bestimmten, insbesondere an adressier- baren Positionen möglich. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung weist das erfindungsgemäße MMS bzw. „floating substrat" eine Dichte auf, die kleiner ist als die Dichte der zu kultivierenden Zellen. Dann können sich die Zellen ohne Probleme auf dem erfindungsgemäßen Substrat absetzen. Beispielsweise liegt die typische Dichte von Zellen bei 1 .1 g/mL, so dass in diesen Fällen eine Dichte des„floating Substrats" von 1 ,05 g/mL bevorzugt ist. Als besonders vorteilhaft hat sich auch erwiesen, wenn die Dichte des„floating subtrats", eine Dichte aufweist, die größer ist als die Dichte von Puffer. Dann kann sich das erfindungsgemäße Substrat in diesem Lösungsmittel/Lösungsmittelgemisch absetzen.

Das erfindungsgemäße Substrat ist vorzugsweise „weich", aber stabil gegen zelluläre Kräfte und/oder nicht scharfkantig. Idealerweise ist die Shore Härte des Substrates einstellbar, da die Substrathärte ein mechanischer Parameter ist, der die Differenzierung von Stammzellen beein- flusst.

Als Material ist sowohl resorbierbares, biokompatibles, biosynthetisches Material als auch nicht resorbierbares Material einsetzbar, wie es aus dem Stand der Technik für sogenannte Mikrocar- rier für adhärente Zellen bekannt ist. Bekannte Materialien sind DEAE (Diethylaminoethyl)- Dextran, Glas, Polystyrolkunststoffe, Acrylamidkunststoffe, Kollagene, Alginate u.a.. Auch Materialkombinationen sind eingeschlossen. Weiter können auch Gase oder Vakuum ins Material dicht mit eingeschlossen sein, insbesondere um die Dichte des Substrats zu variieren. Gewicht des Substrates geteilt durch Gesamtvolumen (inkl. Einschlußvolumen) wird als resultierende Dichte des Substrates bezeichnet.

Zudem kann die Strukturierung bzw. Beschichtung der erfindungsgemäßen Substrate derart erfolgen, dass sowohl ein 2-dimensionales als auch ein 3-dimensionales Zellwachstum möglich ist.

Die Größe der Mikrosubstrate liegt innerhalb der in den Ansprüchen genannten Größenberei- che, vorteilhafterweise zwischen 1 μηη bis wenige 100 μηη.

Durch die gezielte Positionierung der Zellen auf dem erfindungsgemäßen Substrat ist es möglich, entsprechend adäquate„Patch-Chips" für das planare Patch-Clamping zu fertigen, welche an den Stellen, an welchen die Zellen auf dem erfindungsgemäßen Substrat angewachsen sind, die für das Patch Clamping erforderlichen mikrostrukturierten Öffnungen aufweisen, so dass gezielt mehrere Zellen bzw. Gewebe zeitgleich vermessen werden können. Da die Zellen auf dem erfindungsgemäßen „floating substrat" bereits separiert sind, können sie gezielt zur Messung angedockt werden. Auf Seiten der MMS und auf Seiten der Patch-Chips können An- kerstrukturen ineinander greifen um ein exakte Positionierung von Zellen zu Patch-Positionen zu vermitteln. Diese Ankerstrukturen können mechanische, magnetische und/oder optische Mittel umfassen.

Die genannten und weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich auch aus der nachfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den Figuren, und zwar zusätzlich in Verbindung mit den Ansprüchen. Dabei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich alleine oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1 die schematische Darstellung einer Kulturschale mit verschiedenen erfindungs- gemäßen Substraten, auf denen teilweise bereits Zellen kultiviert sind, und

Fig. 2 die schematische Darstellung einer Anordnung für eine Patch-Clamp-Messung, bei der zu untersuchende Zellen auf einem erfindungsgemäßen Substrat kultiviert, und einem Patch-Clamp-Chip zugeordnet sind.

Figur 1 zeigt in schematischer Draufsicht eine Kulturschale 6, in die verschiedene erfindungs- gemäße Substrate 1 , 2, 3 und 4 eingebracht sind. An diesen Substraten sind teilweise bereits Zellen 5 kultiviert, d.h. diese Zellen 5 sind an den entsprechenden Substraten 2, 3 und 4 adhäsiv verankert.

Gemäß Figur 1 handelt es sich bei dem Substrat 1 um ein scheibenförmiges Substrat, das (noch) nicht mit einer Zelle belegt ist. Das Substrat 2 ist ebenfalls scheibenförmig ausgebildet und besitzt einen etwas größeren Durchmesser als das Substrat 1 . Auf der Oberfläche dieses Substrats 2 ist eine Zelle 5 festgelegt.

Beim Substrat 3 gemäß Figur 1 handelt es sich um ein ringförmiges Substrat, an dem ebenfalls eine Zelle 5 kultiviert ist.

Das erfindungsgemäße Substrat 4 gemäß Figur 1 ist aus ringförmigen Elementen aufgebaut, und zwar aus fünf ringförmigen Elementen nach Art der olympischen Ringe. An diesem Substrat 4 sind bereits drei Zellen 5 kultiviert, die an der entsprechenden Stelle des Substrats 4 zu einer Zellansammlung bzw. einem Zellverbund zusammengefügt sind. Die entsprechenden Oberflächen der Substrate 1 , 2, 3 und 4 sind durch Beschichtungen und/oder Mikrostrukturierungen modifiziert, so dass das Substrat eine ausreichende Affinität besitzt, um eine gute Anhaftung der Zellen 5 zu ermöglichen. Wie aus Figur 1 zu entnehmen ist, reichen bereits entsprechende Beschichtungen und/oder Mikrostrukturierungen an ringförmigen Substraten aus, um eine Kultivierung der Zellen auf den erfindungsgemäßen Substraten zu erlauben.

Wie bereits in der Beschreibung erläutert, ist die innere Oberfläche der Kulturschale 6 zellabweisend und hydrophob ausgestaltet, so dass das Anwachsen der Zellen auf den Substraten erfolgt und nicht auf der inneren Oberfläche der Kulturschale 6. Bei der Kultivierung der Zellen 5 in der Kulturschale 6 auf den Substraten 1 , 2, 3 und 4 ist es nicht erforderlich, die Substrate in einer Suspension zu halten. Die Kultivierung der Zellen erfolgt im entsprechenden Kulturmedium, und erst nach erfolgter Kultivierung der Zellen 5 auf den entsprechenden Substraten 1 , 2, 3 und 4 werden die mit den Zellen kultivierten Substrate in Suspension überführt, um sie in geeigneter Weise für die nachfolgende Analytik bereitzustellen. Die entsprechenden Verfahren erfolgen in der Regel so, dass die erfindungsgemäßen Substrate in die (Zell-)Kulturschale 6 eingebracht, insbesondere eingestreut werden, bevor das Einsäen der Zellen erfolgt. Überschüssige Zellen werden im Rahmen des Mediumwechsels vorsichtig abpipettiert, während die mit Zellen 5 belegten Substrate 1 , 2, 3 und 4 am Boden der Kulturschale 6 liegen bleiben. Ggf. können die Substrate zu diesem Zweck magnetisch ausgerüstet sein, um die Festlegung am Boden der Kulturschale 6 entsprechend zu optimieren. Für das nachfolgende Messverfahren, beispielsweise mit Hilfe einer automatisierten Patch-Clamp- Einrichtung werden die mit den Zellen belegten erfindungsgemäßen Substrate in Suspension überführt, beispielsweise durch Aufwirbeln, und beispielsweise in den entsprechenden Patch- Clamp-Chip, zum Beispiel den CytoPatch™-Chip der Anmelderin, überführt. Figur 2 zeigt in einer schematischen Schnittansicht, wie Zellen 5, die an einem ringförmigen erfindungsgemäßen Substrat 2 kultiviert sind, einer Patch-Clamp-Messung zugeführt werden können.

Im oberen Teil der Figur 2 ist das ringförmige Substrat 2 mit zwei an diesem Substrat 2 kultivierten Zellen 5 dargestellt. Dabei sind die beiden Zellen 5 im Substrat 2 miteinander zu einer aus zwei Zellen bestehenden Zellansammlung kultiviert. Das nachfolgend geschilderte Verfahren ist in gleicher weise erfindungsgemäß mit einzelnen Zellen durchführbar, wie sie beispielsweise in Figur 1 dargestellt sind. Im oberen Teil der Figur 2 ist auch schematisch ein Verankerungselement 7 dargestellt, mit dessen Hilfe das Substrat 2 handhabbar ist, und in gewünschter Weise in die Patch-Clamp- Einrichtung überführt und am oder im Patch-Clamp-Chip positioniert werden kann. Diese Überführung und Positionierung ist durch die beiden Pfeile in Figur 2 graphisch angedeutet. Ein solcher Patch-Clamp-Chip 8 ist im unteren Teil der Figur 2 schematisch in Schnittansicht dargestellt. Wie bereits in der Beschreibungseinleitung erläutert, besitzt dieser Patch-Clamp- Chip neben den eigentlichen Patch-Clamp-Öffnungen 9, 9' Ansaugöffnungen 10, 10' mit ihren schematisch angedeuteten Ansaugkanälen 1 1 , 1 1 ' zum Heransaugen der zu untersuchenden Zellen und Zellmembranen an die Patch-Clamp-Öffnungen 9, 9'. Auch die mit den Patch- Clamp-Öffnungen 9, 9' verbundenen Kanäle 12, 12' sind zeichnerisch angedeutet. Über diese Kanäle 12, 12' erfolgt der für die Messung notwendige Kontakt der Zellmembranen mit den Messeinrichtungen. In Figur 2 nicht dargestellt sind optische Fenster an der Unterseite des Patch-Clamp-Chips 8, mit deren Hilfe das Andocken der Zellen 5 an die Öffnungen 9, 9' überwacht, und ggf. dokumentiert und ggf. optisch analysiert werden kann. Ggf. besitzt der Patch-Clamp-Chip 8 Einrichtungen, die mit Ankerelementen 7 des Substrats 2 zusammenwirken, um eine exakte Positionierung des Substrats 2 im oder am Patch-Clamp- Chip 8 zu gewährleisten.

Wie Figur 1 und Figur 2 zeigen, ist es durch die Erfindung möglich, sowohl Einzelzellen als auch Ansammlungen oder Aggregate von Zellen, d.h. Gewebe an einem Substrat/Träger zu kultivieren, auf diesem Träger in Suspension zu überführen und dann zu analysieren, insbesondere mit Hilfe des Patch-Clamp-Verfahrens.

Claims

Patentansprüche

1 . Substrat (1 , 2, 3, 4) zur Kultivierung mindestens einer Zelle (5), insbesondere zur Kultivierung einer Ansammlung oder eines Aggregats von Zellen für die Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an diesen Zellen oder deren Zellmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mindestens eine Oberfläche aufweist, die an bestimmten Positionen, vorzugsweise an bestimmten adressierbaren Positionen eine Affinität zum Anhaften der Zellen besitzt.

2. Substrat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat in mindestens einem Lösungsmittel oder mindestens einem Lösungsmittelgemisch suspendierbar ist, wobei es sich vorzugsweise um ein gepuffertes Lösungsmittel oder um ein gepuffertes Lösungsmittelgemisch handelt.

3. Substrat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es flächig ausgebildet ist.

4. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es scheibenförmig (1 ,2) oder ringförmig (3, 4) ausgebildet ist, wobei vorzugsweise das Substrat (4) aus mindestens zwei miteinander verbundenen Scheiben oder Ringen aufgebaut ist.

5. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessungen des Substrats zwischen 0,1 μηη und 10 mm betragen, insbesondere zwischen 1 μηη und 500 μηη.

6. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mindestens eine mikrostrukturierte Oberfläche aufweist.

7. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte des Substrats kleiner ist als die Dichte der zu kultivierenden Zellen.

8. Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte des Substrats größer ist als die Dichte des Lösungsmittels oder des Lösungsmittelge- mischs.

9. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats für ein zweidimensionales Zellwachstum bei der Kultivierung ausgebildet ist.

10. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats für ein dreidimensionales Zellwachstum ausgebildet ist.

1 1 . Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (7) zur räumlichen Ausrichtung des Substrats (2), nach Art von Ankervorrichtungen (7), vorgesehen sind, die insbesondere eine Ausrichtung des Substrats in allen drei Raumkoordinaten und in allen drei Raumwinkeln ermöglichen.

12. Verfahren zur Kultivierung mindestens einer Zelle, insbesondere zur Kultivierung einer Ansammlung oder eines Aggregats von Zellen für die Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Zellen oder deren Zellmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Substrat (1 , 2, 3, 4) nach einem der vorhergehenden Ansprüche in eine zellabweisende, hydrophobe Kultivierungsvorrichtung, vorzugsweise Kulturschale (6) eingebracht wird, und Zellen (5) auf diesem Substrat kultiviert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Substrate (1 , 2, 3, 4) im räumlichen Abstand voneinander in die Kulturschale (6) eingebracht werden.

14. Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, insbesondere Zellmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , auf dem Zellen kultiviert wurden, insbesondere nach einem Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, in mindestens einem Lösungsmittel oder mindestens einem Lösungsmittelgemisch suspendiert werden, und dann mit Hilfe dieser Suspension die Bestimmung der Messgrößen an einzelnen Zellen oder an einer Ansammlung oder an einem Aggregat von Zellen vorbereitet und insbesondere auch durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (2) mit den kultivierten Zellen (5) mit Hilfe vorhandener Ausrichtmittel, insbesondere mit Hilfe von Ankervorrichtungen (7), zur Bestimmung der Messgrößen in gewünschter Weise positioniert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Messgrößen mit Hilfe einer elektrophysiologischen Messmethode, insbesondere mit Hilfe der sogenannten Patch-Clamp-Technik bestimmt werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Messgrößen an einem planaren Patch-Clamp-Substrat, insbesondere einem sogenannten Patch-Clamp-Chip (8) durchgeführt wird, wobei die auf dem Substrat (2) kultivierten Zellen (5) über der entsprechenden Patch-Clamp-Öffnung (9, 9') im Patch-Clamp-Substrat (8) positioniert werden, insbesondere mit Hilfe von Ausrichtmitteln (7).

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Messgrößen an einem Patch-Clamp-Chip gemäß EP 131 1655 durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Patch-Clamp-Substrat, insbesondere der Patch-Clamp-Chip, an seiner der Patch- Clamp-Öffnung abgewandten Seite mindestens ein optisches Fenster besitzt, mit dessen Hilfe die Positionierung der kultivierten Zellen überwacht, dokumentiert und optisch analysiert werden kann.

20. Kit zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, insbesondere an Zellmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 umfasst.

21 . Kit nach Anspruch20, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, insbesondere mindestens eine Kulturschale umfasst.

22. Kit nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich mindestens eine Vorrichtung, an der eine Patch-Clamp-Messung durchführbar ist, umfasst, insbesondere mindestens einen Patch-Clamp-Chip.