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WO2016157937A1 - ｐＨ感受性蛍光プローブ - Google Patents

ｐＨ感受性蛍光プローブ Download PDF

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Publication number
WO2016157937A1
WO2016157937A1 PCT/JP2016/051119 JP2016051119W WO2016157937A1 WO 2016157937 A1 WO2016157937 A1 WO 2016157937A1 JP 2016051119 W JP2016051119 W JP 2016051119W WO 2016157937 A1 WO2016157937 A1 WO 2016157937A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
carbon atoms
atom
salt
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2016/051119
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健二郎 花岡
優 鏡味
哲雄 長野
泰照 浦野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to US15/561,444 priority Critical patent/US10815379B2/en
Priority to JP2017509316A priority patent/JP6742576B2/ja
Publication of WO2016157937A1 publication Critical patent/WO2016157937A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C09B11/26—Triarylmethane dyes in which at least one of the aromatic nuclei is heterocyclic
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a novel pH-sensitive fluorescent probe and a method for measuring an acidic region in a cell using the same.
  • the cells maintain a vital function by performing various biochemical reactions such as metabolism of incorporated proteins and organic compounds, synthesis and transport of cell components, with high spatiotemporal resolution.
  • biochemical reactions such as metabolism of incorporated proteins and organic compounds, synthesis and transport of cell components, with high spatiotemporal resolution.
  • organelles organelles
  • each organelle maintains a unique pH optimum for various biochemical reactions.
  • the function of the organelle changes greatly if the pH of the organelle changes.
  • the endosomal pH is 6.3 (early endosome) ⁇ 5.5 (late endosome) ⁇ 4.7 (lysosome), which is acidified according to endosomal maturation.
  • the biochemical reaction occurring in the endosome also changes from protein selection (early endosome) to protein degradation (lysosome).
  • the intracellular pH is greatly related to the chemical reaction occurring in the cell, measuring the intracellular pH is important for elucidating the life phenomenon occurring in the cell.
  • a pH sensitive fluorescent probe (hereinafter referred to as a pH probe) based on an organic small molecule fluorescent dye or a fluorescent protein is used.
  • the pH probe has a feature that the fluorescence characteristic changes greatly with the nearby pH change. By detecting this change in fluorescence characteristics with a device such as a fluorescence microscope or a plate reader, it is possible to easily measure the pH in cells that remain alive.
  • the Off / On-type pH probe has an advantage that it can be used even in a relatively simple optical system because excitation and fluorescence detection are each performed with only one wavelength.
  • the increase or decrease of the probe concentration such as cell contraction or probe leakage outside the cell is observed as an increase or decrease in fluorescence intensity, that is, a change in pH
  • the pH inside the cell is adjusted using an Off / On type pH probe. It is difficult to measure quantitatively.
  • the ratio type pH probe performs excitation or fluorescence detection at two wavelengths, calculates the ratio of the fluorescence intensities (ratio), and observes the change in the ratio value as a pH change. Therefore, in order to use the ratio type pH probe, an optical system suitable for the ratio measurement such as an excitation light switching device and a plurality of fluorescence detectors is required. On the other hand, as an excellent feature of the ratio type pH probe, the ratio value does not change even if the probe concentration fluctuates, so that measurement errors due to factors other than pH change can be reduced. Therefore, intracellular pH can be quantitatively measured by using a ratio type pH probe. Therefore, the ratio type pH probe has greatly contributed to the elucidation of the life phenomenon accompanied by the pH change.
  • ratio-type pH probes that are widely used in biological research include semephathorhofluor (SNARF) s shown in FIG. 1 and 2 ′, 7′-Bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6-) carboxyfluorescein.
  • SNARF semephathorhofluor
  • BCECF carboxyfluorescein
  • the problems with SNARF-1 are that the quantum yield of the fluorescence is relatively low (0.03 on the acidic side, 0.09 on the basic side), and that there is temperature and environmental sensitivity (when 25 ° C. ⁇ 37 ° C., the fluorescence is It is said that it decreases by 25%, and the fluorescence decreases even if it interacts with a protein), and is likely to cause photofading (Non-patent Document 2).
  • the pK a to 6.3, a derivative of SNARF with reduced SNARF-4F are also used to acidification of the cytoplasm to visualize.
  • BCECF shows a large absorbance / fluorescence quantum yield on the basic side, but a small absorbance / fluorescence quantum yield on the acidic side, and it is difficult to perform ratio imaging due to a large difference in luminance. Like some fluorescein, it is said to be easy to light fade. Further, BCECF derivatives having different pK a is not commercially available.
  • the ratio-type pH probe has been developed on the basis of a semephathodohydrofluor or a fluorescein skeleton, which has a low fluorescence quantum yield, is dependent on temperature and environment, and easily causes photofading. Therefore, there are problems that imaging for a long time is difficult, and it is difficult to measure an accurate pH due to environmental factors such as a difference in ambient temperature and an organelle environment. Moreover, it is difficult to apply the structural modifications to the probe molecule, pH probe derivatives having various pK a by organic chemical modification was hardly developed.
  • the present invention provides a pH probe having high fluorescence quantum yield, high resistance to photofading, and suitable for visualization of various pH environments in cells such as weakly basic, neutral, and weakly acidic environments.
  • the purpose is to do.
  • the present inventors have used a Si-based rhodamine skeleton having a high fluorescence quantum yield that has been developed by the present inventors in recent years and having high resistance to photofading.
  • a ratio type pH probe we considered that it would be able to solve the problems of existing pH probes, and when various studies were conducted, a piperazine ring was introduced into the skeleton of an asymmetric Si-type rhodamine, and further on the piperazine ring amino group. It was found that the pKa of the pH probe can be easily adjusted by introducing an electron-withdrawing group into the present invention, thereby completing the present invention.
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 3 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring
  • R 2a and R 2b each independently represent hydrogen or a monovalent substituent, provided that both R 2a and R 2b are not hydrogen
  • R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 5 and R 6 if present, each independently represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • R 5 and R 6 when X is an oxygen atom, R 5 and R 6 do not exist, When X is a phosphorus atom, one of —R 5 and —R 6 may be ⁇ O
  • R 7 and R 8 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group
  • alkyl alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or alkyl-substituted alkenyl group having 6 to 10 carbon atoms
  • Y represents a substituted or unsubstituted aryl group or heteroaryl group
  • X represents a silicon atom, an oxygen atom, a carbon atom, a phosphorus atom or a germanium atom
  • m is an integer of 0-6.
  • a salt thereof [2] The compound or salt thereof according to [1], wherein Y is a substituted or unsubstituted phenyl group.
  • At least one of R 1 is a carboxy group, an alkyl group having a carboxy group, an ester group, an alkyl ester group, an amino group, an amide group, an alkylamino group, an isothiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a halo
  • At least one of R 1 is a carboxy group, an alkyl group having a carboxy group, an ester group, an alkyl ester group, an amino group, an amide group, an alkylamino group, an isothiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a halo
  • the compound or a salt thereof according to any one of [10] to [13], which is selected from an acetamide group, an azide group, or an alkynyl group.
  • the compound or salt thereof according to [14], wherein at least one of R 1 is a carboxy group, an alkyl group having a carboxyl group, an amino group, or an amide group.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom
  • R 5 and R 6 if present, each independently represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • X is an oxygen atom
  • R 5 and R 6 do not exist
  • X is a phosphorus atom
  • one of —R 5 and —R 6 may be ⁇ O
  • R 7 and R 8 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 9 or R 10 together with R 3 or R 7 may form a 5- to 7-membered heterocyclyl or heteroaryl containing the nitrogen atom to which R 9 or R 10 is attached, It may contain 1 to 3 further heteroatoms selected
  • Y represents a substituted or unsubstituted aryl group or heteroaryl group
  • X represents a silicon atom, an oxygen atom, a carbon atom, a phosphorus atom or a germanium atom
  • m is an integer from 0 to 6
  • X ′ represents a structure after a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site is bonded to T
  • T represents a bridging group, and the bridging group can be bonded to a functional group, a label site or a target accumulation site capable of introducing a label site or a target accumulation site at one or both ends thereof.
  • R 1 ′ is hydrogen or the same or different monovalent substituent
  • R 2a and R 2b each independently represent hydrogen or a monovalent substituent, provided that both R 2a and R 2b are not hydrogen, or (ii) one of R 2a and R 2b is X′-T and the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent
  • n is an integer of 0 to 2
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom
  • R 5 and R 6 if present, each independently represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • X is an oxygen atom
  • R 5 and R 6 do not exist
  • X is a phosphorus atom
  • one of —R 5 and —R 6 may be ⁇ O
  • R 7 and R 8 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 9 or R 10 together with R 3 or R 7 may form a 5- to 7-membered heterocyclyl or heteroaryl containing the nitrogen atom to which R 9 or R 10 is attached, It may contain 1 to 3 further heteroatoms selected
  • alkyl alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or alkyl-substituted alkenyl group having 6 to 10 carbon atoms
  • Y represents a substituted or unsubstituted aryl group or heteroaryl group
  • X represents a silicon atom, an oxygen atom, a carbon atom, a phosphorus atom or a germanium atom
  • m is an integer from 0 to 6
  • X ′ represents a structure after a functional group capable of introducing a biopolymer labeling site is bonded to T; T ′, if present, is the structure after the bridging group is attached to S; S.
  • R 1 ′ is hydrogen or the same or different monovalent substituent
  • R 2a and R 2b are (I) each independently represents hydrogen or a monovalent substituent, provided that both R 2a and R 2b are not hydrogen, or (ii) one of R 2a and R 2b is X ′-(T ′ ) -S and the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent
  • n is an integer of 0 to 2
  • [26] A method for measuring an acidic region in a cell, (A) introducing the compound or salt thereof according to any one of [1] to [24] into a cell, and (b) measuring fluorescence emitted from the compound or salt thereof in the cell. Including methods. [27] The method according to [26], wherein an acidic region where intracellular acidic organelles are present is measured. Is provided.
  • a pH probe that has a high fluorescence quantum yield, has high resistance to light fading, and is suitable for visualization of the intracellular pH environment in a weakly acidic environment.
  • the pKa can be further lowered or raised. It is possible to provide a group of pH probes suitable for visualization of various pH environments in cells such as weakly basic, neutral, and weakly acidic environments.
  • an “alkyl group” or an alkyl part of a substituent containing an alkyl part (such as an alkoxy group), for example, unless otherwise specified, has, for example, 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, More preferably, it means an alkyl group composed of straight, branched, cyclic, or a combination thereof having about 1 to 3 carbon atoms.
  • alkyl group for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, cyclopropyl
  • methyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group and the like can be mentioned.
  • halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom.
  • One embodiment of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof (hereinafter also referred to as “embodiment 1”).
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 3 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • R 1 is introduced at three positions on the benzene ring other than the positions substituted by R 2a and R 2b .
  • R 1 represents a monovalent substituent present on the benzene ring, it is preferable that about 1 to 2 substituents which are the same or different exist on the benzene ring.
  • R 1 represents one or more monovalent substituents, the substituent can be substituted at any position on the benzene ring.
  • R 1 represents a hydrogen atom (ie, all of R 1 are hydrogen atoms) or when one substituent is present (ie, one of R 1 is a monovalent substituent, otherwise Is a hydrogen atom).
  • the type of monovalent substituent represented by R 1 is not particularly limited, and examples thereof include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carbon It is preferably selected from the group consisting of several to six alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxy groups, sulfonyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, or amino groups. These monovalent substituents may further have one or more arbitrary substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may have one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like.
  • the alkyl group represented by R 1 is a halogen atom.
  • An alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or an aminoalkyl group may be used.
  • the amino group represented by R 1 may be present one or two alkyl groups, an amino group represented by R 1 may be a monoalkylamino group or a dialkylamino group.
  • examples of the case where the alkoxy group represented by R 1 has a substituent include a carboxy-substituted alkoxy group or an alkoxycarbonyl-substituted alkoxy group, and more specifically, a 4-carboxybutoxy group or 4-acetoxymethyloxy group.
  • a carbonyl butoxy group etc. can be mentioned.
  • R 1 is a monovalent substituent such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the substituent is present at the 3-position to 5-position on the benzene ring.
  • R 1 is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site (also referred to as “biopolymer labeling site”).
  • the functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site means a functional group capable of reacting with the label site or the target accumulation site, and examples thereof include a carboxyl group and an alkyl group having a carboxyl group. Ester group, alkyl ester group, amino group, amide group, alkylamino group, isothiocyanate group, sulfonyl chloride group, haloalkyl group, haloacetamide group, azide group, alkynyl group, etc.
  • R 1 is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, the above monovalent substituent (the number of carbon atoms) even if other R 1 is hydrogen
  • At least one of R 1 is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, and the functional group is present at the 3-position to the 5-position on the benzene ring.
  • At least one of R 1 is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site (particularly preferably, a carboxyl group, an alkyl group having a carboxyl group, an amino group, an amide group). And the other R 1 is hydrogen.
  • R 2a and R 2b each independently represent hydrogen or a monovalent substituent. However, both R 2a and R 2b are not hydrogen.
  • the type of the monovalent substituent represented by R 2a and R 2b is not particularly limited, but for example, as in R 1 , for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, It is selected from the group consisting of 1 to 6 alkynyl groups, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, hydroxyl group, carboxy group, sulfonyl group, alkoxycarbonyl group, halogen atom, or amino group.
  • the monovalent substituent in R 2a and R 2b is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • one of R 2a and R 2b is hydrogen and the other is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • both R 2a and R 2b are alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • the monovalent substituent represented by R 2a and R 2b may be a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site.
  • functional groups capable of introducing a label site or a target accumulation site are carboxyl group, alkyl group having carboxyl group, ester group, alkyl ester group, amino group, amide group, alkylamino group, isothiocyanate group, Examples include a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a haloacetamide group, an azide group, an alkynyl group, and a carboxyl group, an alkyl group having a carboxyl group, an amino group, and an amide group are particularly preferable.
  • one of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom).
  • the other is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site.
  • at least one of R 1 may be a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, all R 1 may be hydrogen, or at least one of R 1 One may be a monovalent substituent such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the remaining R 1 may be hydrogen.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the alkyl group may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups,
  • the alkyl group represented by R 3 or R 4 may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • R 3 and R 4 are each independently preferably a hydrogen atom or a halogen atom. When R 3 and R 4 are both hydrogen atoms, or R 3 and R 4 are both fluorine atoms or chlorine atoms. More preferred.
  • R 5 and R 6 each independently represent an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms, but R 5 and R 6 are each independently An alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferred, and R 5 and R 6 are both preferably methyl groups.
  • the alkyl group represented by R 5 and R 6 may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like, for example, R 5 or R 6 represents The alkyl group may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms.
  • a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom may be contained.
  • the aryl group is preferably a phenyl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring. As the substituent, for example, one or two or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • R 5 and R 6 are absent.
  • X is a phosphorus atom
  • one of —R 5 and —R 6 may be ⁇ O.
  • one of —R 5 and —R 6 is ⁇ O, and the other represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom, and are the same as those described for R 3 and R 4. is there. It is preferable that R 7 and R 8 are both hydrogen atoms, both chlorine atoms, or both fluorine atoms.
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 9 or R 10 may be combined with R 3 or R 7 to form a 5- to 7-membered heterocyclyl or heteroaryl containing a nitrogen atom to which R 9 or R 10 is bonded.
  • it may contain 1 to 3 further heteroatoms selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom as a ring member, and the heterocyclyl or heteroaryl has 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms (benzyl group, phenethyl group, etc.), alkyl substitution having 6 to 10 carbon atoms It may be substituted with an alkenyl group.
  • heterocyclyl or heteroaryl thus formed include, but are not limited to, pyrrolidine, piperidine, hexamethyleneimine, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole and the like.
  • Y represents a substituted or unsubstituted aryl group or heteroaryl group.
  • the pKa of the piperazine ring amino group can be changed by introducing an aryl group or heteroaryl group, which is an electron-withdrawing group, onto the piperazine ring amino group, which facilitates the pKa of the pH probe. It becomes possible to adjust to.
  • the aryl group include a phenyl group and a naphthyl group, and a phenyl group is preferable.
  • heteroaryl group examples include pyridyl group, pyrazyl group, pyrimidyl group, pyridazyl group, indolyl group, benzofuranyl group, benzothienyl group, benzothiazolyl group, pyrrolyl group, furanyl group, thienyl group, imidazolyl group, and thiazolyl group.
  • a pyridyl group is preferred.
  • the pKa is further reduced or increased by further introducing an electron withdrawing group or electron donating group into the aryl group or heteroaryl group introduced onto the piperazine ring amino group. It is possible to make adjustments.
  • the substituent introduced into the aryl group or heteroaryl group includes, as an electron withdrawing group, a nitro group, a sulfonyl group, a carbonyl group, a halogen atom (a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom), a carbon number of 1 to 6 alkoxy groups and the like, and a fluorine atom and a sulfonyl group are preferable.
  • the aryl group or heteroaryl group can have two or more of the electron withdrawing groups described above, and these electron withdrawing groups may be the same or different.
  • Examples of the electron donating group include an amino group, a methoxy group, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, including a t-butyl group, a sec-butyl group, an n-butyl group, an iso-propyl group, an n-propyl group, An ethyl group, a methyl group, an amino group, and a methoxy group are preferable.
  • the aryl group or heteroaryl group can have two or more of the above electron donating groups, and these electron donating groups may be the same or different.
  • m is an integer of 0-6.
  • m is preferably 0 or 1 in order to obtain an effective electron withdrawing effect of the aryl group or heteroaryl group introduced as Y.
  • One preferred embodiment of the present invention is when Y is a substituted or unsubstituted phenyl group and m is 1, that is, a substituted or unsubstituted benzyl group is introduced into the piperazine ring amino group.
  • One preferred aspect of the present invention is a compound or a salt thereof in which Y is a phenyl group substituted with a fluorine atom in the general formula (I), and m is 1.
  • One preferable aspect of the present invention is a compound or a salt thereof in which Y is a phenyl group substituted with a sulfonyl group in the general formula (I), and m is 1.
  • One preferable aspect of the present invention is a compound or a salt thereof in which Y is a phenyl group substituted with two sulfonyl groups in the general formula (I), and m is 1.
  • X represents a silicon atom, oxygen atom, carbon atom, phosphorus atom or germanium atom, preferably a silicon atom or germanium atom, and particularly preferably a silicon atom.
  • One aspect of embodiment 1 of the present invention is the following general formula (II): Or a salt thereof.
  • R 1 to R 2b , R 4 to R 8 , R 10 , X, Y and m are as described above for the general formula (I).
  • R 11 to R 14 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom. In one preferred embodiment of the present invention, R 11 to R 14 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (preferably a methyl group or an ethyl group). In one preferred embodiment of the present invention, R 11 to R 14 are all hydrogen atoms.
  • Non-limiting examples of compounds of general formula (I) or (II) of the present invention include the following compounds:
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) of the present invention can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • the acid addition salt include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, or organic acid salts such as methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxalate, citrate, and tartrate.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, and magnesium salt, organic amine salts such as ammonium salt, and triethylamine salt.
  • a salt with an amino acid such as glycine may be formed.
  • the compounds of the present invention or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances are also within the scope of the present invention.
  • the compounds represented by the general formulas (I) and (II) of the present invention may have one or two or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, but one or two or more asymmetric carbons may be present.
  • stereoisomers such as optically active substances based on asymmetric carbons and diastereoisomers based on two or more asymmetric carbons, any mixture of stereoisomers, racemates, etc. are all included in the scope of the present invention. Is done.
  • At least one of R 1 in the general formula (I) or (II) is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, and the functional group is A compound or a salt thereof bonded to a crosslinking group (hereinafter also referred to as “embodiment 2”).
  • a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site a carbonyl group, an alkylcarbonyl group, an ester group, an alkyl ester group, an amino group, an alkylamino group, an amide group, an isothiocyanate group, a chloride group
  • a sulfonyl group, a haloalkyl group, a haloacetamido group, an azide group, an alkynyl group and the like can be mentioned, and a carbonyl group and an alkylcarbonyl group are particularly preferable.
  • the crosslinking group may be any crosslinking group as long as it functions as a spacer for linking the functional group capable of introducing the label site or target accumulation site and the label site or target accumulation site.
  • substituted or unsubstituted hydrocarbon groups alkanes, alkenes, alkynes, cycloalkanes, aromatic hydrocarbons, etc.
  • ethylene glycol groups diethylene glycol groups, triethylene glycol groups, polyethylene glycol groups, alkyl cysteates and heterocyclic rings
  • a group for example, a piperidinyl group and the like, but are not limited thereto.
  • the crosslinking group has a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, a functional group capable of binding to the label site or the target accumulation site at one or both ends thereof. Also good.
  • a functional group include an amino group, a carbonyl group, a carboxyl group, an amide group, a propargyl group, and the like.
  • Embodiment 2 is a compound represented by the following general formula (Ia) or a salt thereof.
  • R 3 to R 10 , X, Y, and m are as defined in the general formula (I).
  • X ′ is a structure after a functional group capable of introducing the above-described label site or target accumulation site is bonded to T, and T is the above-described bridging group.
  • the bridging group may have a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, a functional group capable of binding to the label site or the target accumulation site at one or both ends thereof.
  • Examples of such a functional group include an amino group, a carbonyl group, a carboxyl group, an amide group, a propargyl group, and the like.
  • R 1 ′ is hydrogen or the same or different monovalent substituent defined as R 1 in the general formula (I), and the details thereof are as described for the compound of the general formula (I).
  • R 1 ′ is preferably hydrogen.
  • R 2a and R 2b each independently represent hydrogen or a monovalent substituent, provided that both R 2a and R 2b are not hydrogen. Also, one of R 2a and R 2b may be the X'-T, in this case, the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably, alkyl having 1-6 carbon Group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom).
  • n is an integer of 0 to 2
  • one of R 2a and R 2b is X′-T, and the other is a monovalent substituent (preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, 1 to 6 alkoxy groups or halogen atoms).
  • — (X′-T) can be introduced at any of the 2-6 positions of the benzene ring.
  • n is 1 and p is 2, in which case R 1 ′ may be the same or different.
  • one of R 2a and R 2b may be X′-T, in which case the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably having 1 to 6 carbon atoms).
  • Embodiment 2 is a compound represented by the following general formula (IIa) or a salt thereof.
  • R 4 to R 8 , R 10 , X, Y and m are as defined in the general formula (I), and R 11 to R 14 are each independently a hydrogen atom, carbon X ′, T, R 1 ′, R 2a to R 2b , n and p are as defined in the general formula (Ia).
  • n is 1 and p is 2, in which case R 1 ′ may be the same or different.
  • one of R 2a and R 2b may be X′-T, in which case the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably having 1 to 6 carbon atoms).
  • -X'-T in general formula (Ia) or (IIa) is selected from:
  • At least one of R 1 in the general formula (I) or (II) is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, and the functional group is It is a compound or a salt thereof which is bonded to a crosslinking group, and in which the crosslinking group is further bonded to a label site or a target accumulation site.
  • at least one R 1 in the general formula (I) or (II) is a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, The group is a compound or a salt thereof bound to a label site or a target accumulation site without using a bridging group.
  • the two types of embodiments are collectively referred to as “embodiment 3” hereinafter.
  • the functional group and the crosslinking group capable of introducing the label site or the target accumulation site are as described in the second embodiment.
  • label sites or target accumulation sites include N-hydroxysuccinimide ester, Halo tag ligand (eg, 2- (2-((6-chlorohexyl) oxy) ethoxy) ethaneamino group), weakly basic amine, maleimide, Examples include a thiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a haloacetamide group, an azide group, an alkynyl group, a benzylguanine derivative, or a benzylcytosine derivative.
  • Halo tag ligand eg, 2- (2-((6-chlorohexyl) oxy) ethoxy) ethaneamino group
  • weakly basic amine maleimide
  • Examples include a thiocyanate group, a sulfonyl chloride group, a haloalkyl group, a haloacetamide group, an azide group,
  • the label site or target accumulation site also includes a polyethylene glycol group that may have a modifying group at one or both ends, and examples of the modifying group include an amino group, a carbonyl group, and a carboxyl group.
  • a polyethylene glycol group having a modifying group is 3- (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethoxy) propanoic acid.
  • Embodiment 3 Since the compound included in Embodiment 3 or a salt thereof becomes strongly fluorescent for the first time in an acidic environment, a specific protein or the like can be labeled, and it can be localized in acidic organelle cells. Various phenomena involving intracellular acidic vesicles can be visualized in real time.
  • a compound in which a label site or a target accumulation site is introduced into a part of a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site that is, a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site
  • a compound having both a label site or a substituent introduced with a target accumulation site are also included in Embodiment 3.
  • Embodiment 3 is a compound represented by the following general formula (Ib) or a salt thereof.
  • R 3 to R 10 , X, Y and m are as defined in the general formula (I).
  • X ′ is a structure after a functional group capable of introducing the above-described label site or target accumulation site is bonded to T, and T ′, if present, is a cross-link described above This is the structure after the group is bonded to S, where S is the label site or target accumulation site.
  • R 1 ′ is hydrogen or the same or different monovalent substituent defined as R 1 in the general formula (I), and the details thereof are as described for the compound of the general formula (I).
  • R 1 ′ is preferably hydrogen.
  • R 2a and R 2b each independently represent hydrogen or a monovalent substituent, provided that both R 2a and R 2b are not hydrogen.
  • One of R 2a and R 2b can be X ′-(T ′) — S, and in this case, the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably having a carbon number of 1 To 6 alkyl groups, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms or halogen atoms).
  • n is an integer of 0 to 2
  • one of R 2a and R 2b is X ′-(T ′) — S, and the other is a monovalent substituent (preferably having 1 to 6 carbon atoms).
  • n 1 and p is 2.
  • R 1 ′ may be the same or different.
  • one of R 2a and R 2b may be X ′-(T ′) — S, in which case the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom).
  • T ′ may or may not be present (if not present, S is directly bonded to X ′).
  • the crosslinking group may have a functional group capable of introducing a label site or a target accumulation site, a functional group capable of binding to the label site or the target accumulation site at one or both ends thereof.
  • examples of such a functional group include an amino group, a carbonyl group, a carboxyl group, an amide group, and a propargyl group.
  • Embodiment 3 is a compound represented by the following general formula (IIb) or a salt thereof.
  • R 4 to R 8 , R 10 , X, Y and m are as defined in the general formula (I), and R 11 to R 14 are each independently a hydrogen atom, carbon Represents an alkyl group or a halogen atom having a number of 1 to 6, and X ′, T ′, R 1 ′, S, n and p are as defined in formula (Ib).
  • n is 1 and p is 2, in which case R 1 ′ may be the same or different.
  • one of R 2a and R 2b may be X ′-(T ′) — S, in which case the other of R 2a and R 2b is a monovalent substituent (preferably An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom).
  • —S in general formula (Ib) or (IIb) is selected from:
  • the compounds of general formulas (Ib) and (IIb) can be labeled with a specific protein or the like and can be localized in acidic organelle cells, It becomes possible to visualize various phenomena related to the vesicle in real time.
  • N-hydroxysuccinimide ester or polyethylene glycol having a terminal modified with a carboxyl group or the like is introduced into the molecule as a label site, it is labeled with dextran, which is a sugar polymer, It becomes possible to localize the fluorescent probe of the present invention in intracellular acidic vesicles.
  • the fluorescent probe of the present invention can be accumulated in acidic vesicles.
  • a Halo tag ligand is introduced as a label site, a specific label to the Halo tag becomes possible.
  • a protein in which a Halo tag is fused to VAMP2 which is a synaptic vesicle marker (VAMP2-Halo tag) is expressed in nerve cells, and the fluorescent probe of the present invention into which a Halo tag ligand is introduced is added thereto. This allows specific labeling of fluorescent probes to synaptic vesicles.
  • the compounds of Embodiments 2 and 3 of the present invention can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • the acid addition salt include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, or organic acid salts such as methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxalate, citrate, and tartrate.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, and magnesium salt, organic amine salts such as ammonium salt, and triethylamine salt.
  • a salt with an amino acid such as glycine may be formed.
  • the compounds of the present invention or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances are also within the scope of the present invention.
  • the compounds of Embodiments 2 and 3 of the present invention may have one or two or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, but they are optically active substances based on one or two or more asymmetric carbons.
  • stereoisomers such as diastereoisomers based on two or more asymmetric carbons, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are included in the scope of the present invention.
  • Another aspect of the present invention is a fluorescent probe comprising a compound of the general formula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) or (IIb) or a salt thereof.
  • Another aspect of the present invention is a method for measuring an acidic region in a cell, wherein (a) the general formula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) or (IIb) And a salt thereof, and (b) a step of measuring fluorescence emitted from the compound or salt thereof in the cell.
  • One aspect of the present invention is a method for measuring an acidic region in which intracellular acidic organelles exist.
  • a cell is contacted with a compound of the general formula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) or (IIb) or a salt thereof.
  • Forming a cell (b) incubating the contacted cell for the compound to enter the cell to form a labeled cell, and (c) forming the labeled cell. Irradiating with an appropriate wavelength at which fluorescence is measured, thereby monitoring the pH inside the cell, thereby monitoring the pH inside the living cell.
  • the cells include normal cells, cancer cells, nerve cells and the like. The method according to item.
  • a further aspect of the present invention provides a carrier comprising: (a) a carrier molecule bound to a compound of general formula (I), (II), (Ia), (IIa), (Ib) or (IIb) or a salt thereof; Forming a conjugate; (b) contacting the carrier conjugate with a cell to form a contacted cell; and (c) incubating the contacted cell to form an incubated solution.
  • a carrier in the solution comprising: (d) irradiating the incubated solution to form an irradiated solution; and (e) detecting fluorescence emission from the irradiated solution.
  • Carrier molecules include amino acids, peptides, proteins, polysaccharides, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, haptens, psoralens, drugs, hormones, lipids, lipid aggregates, synthetic polymers, polymer microparticles, biological cells, viruses And combinations thereof.
  • the carrier molecule is an amino acid (including amino acids that are protected or substituted by phosphates, carbohydrates, or C1-C22 carboxylic acids), or polymers of amino acids (such as peptides or proteins). is there.
  • the carrier molecule also comprises at least 5 amino acids, more preferably 5 to 36 amino acids.
  • peptides include, but are not limited to, neuropeptides, cytokines, toxins, protease substrates, and protein kinase substrates.
  • Other exemplary peptides are organelle localization peptides, i.e., peptides that serve to target bound compounds for localization within specific subcellular structures by cellular transport mechanisms. May function.
  • Preferred protein carrier molecules include enzymes, antibodies, lectins, glycoproteins, histones, albumins, lipoproteins, transferrin, avidin, streptavidin, protein A, protein G, phycobiliproteins and other fluorescent proteins, hormones, toxins and Growth factors.
  • the protein carrier molecule is an antibody, antibody fragment, avidin, streptavidin, toxin, lectin, growth factor, bacterial particle or cell receptor binding partner.
  • nucleic acid polymer carrier molecules are single-stranded or multi-stranded, natural or synthetic DNA or RNA oligonucleotides, or DNA / RNA hybrids, or unusual linkers (morpholine derivatized phosphate (AntiVirals, Inc., Oregon) ), Or peptide nucleic acids (such as N- (2-aminoethyl) glycine units) that contain less than 50 nucleotides, more typically less than 25 nucleotides. .
  • the carrier molecule is typically a dextran, FICOLL, heparin, glycogen, amylopectin, mannan, inulin, polysaccharide such as starch, agarose and cellulose, or poly (ethylene glycol) Contains a carbohydrate or polyol that is a polymer.
  • the polysaccharide carrier molecule includes dextran, agarose, or FICOLL.
  • the carrier molecule comprises lipids (typically comprising 6-25 carbons) including glycolipids, phospholipids, and sphingolipids.
  • the carrier molecule comprises a lipid vesicle (such as a liposome) or it is a lipoprotein (see below). Some lipophilic substituents are useful to facilitate transport of bound dye to cells or organelles.
  • Step (a) N-Boc-piperazine (2.41 g, 12.9 mmol) and 2-bromo-4-fluorobenzaldehyde (2.19 g, 10.8 mmol) were dissolved in DMF (30 mL) and K 2 CO 3 (2.24 g, 16.2 mmol) was added and stirred at 100 ° C. for 18 hours. After the solvent was distilled off under reduced pressure, water was added to the residue, and the mixture was extracted with dichloromethane and washed with brine. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step (a) 2,6-diMe PiperaIndoSiR (3.5 mg, 6.03 ⁇ mol) was dissolved in methanol (2 mL), 3-fluorobenzaldehyde (1.3 ⁇ L, 12.06 ⁇ mol) and acetic acid (20 ⁇ L) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. .
  • Sodium cyanoborohydride (1.5 mg, 24 ⁇ mol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Water was added to the mixture and the mixture was extracted with dichloromethane. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • 2,6-diMe PiperaIndoSiR (2.4 mg, 4.16 ⁇ mol) was dissolved in methanol (2 mL) and sodium 2-formylbenzene-1-sulfonate (1.7 mg, 8.32 ⁇ mol) and acetic acid (2.4 ⁇ L, 41.6 ⁇ mol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.
  • Sodium cyanoborohydride (0.5 mg, 8.32 ⁇ mol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 13 hours. Water was added to the mixture and the mixture was extracted with dichloromethane. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step (a) Dehydrated tetrahydrofuran (10 mL) was added to tert-butyl 4-bromo-3,5-dimethylbenzoate (182 mg, 0.638 mmol) in a flask that had been dried and purged with argon, and the reaction solution was cooled to ⁇ 78 ° C. 1M sec-BuLi (0.64 mL, 0.64 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at -78 degrees for 30 minutes. BocPiperaIndoSiXanthone (61 mg, 0.128 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was heated to reflux for 2.5 hours.
  • Step (b) 4-COOH-2,6-diMe PiperaIndoSiR (12.8 mg, 20.5 ⁇ mol) was dissolved in methanol (5 mL), and disodium 4-formylbenzene-1,3-disulfonate (19.1 mg, 61.5 ⁇ mol). Then, acetic acid (250 ⁇ L) was added and stirred at room temperature for 30 minutes. To the reaction solution, 2-picoline borane (4.4 mg, 41 ⁇ mol) was added and stirred at room temperature for 16 hours.
  • Example 5 The spectral characteristics of Compound 1 (2,6-diMe BnPiperaIndoSiR) of the present invention were evaluated. Absorption spectrum, fluorescence spectrum and excitation spectrum were measured using Shimadzu UV-1650PC absorptiometer and Hitachi F-4500 fluorometer. The results are shown in Figures 2a-e.
  • FIG. 2a represents the assumed chemical equilibrium equation for 2,6-diMe BnPiperaIndoSiR.
  • FIGS. 2b, 2c, and 2d show absorption, fluorescence, and excitation spectra of 2,6-diMe BnPiperaIndoSiR in 100 mM sodium phosphate buffer (containing 1% DMSO) with different pHs, respectively.
  • the absorbance at 580 nm decreases and the absorbance at 663 nm increases as the pH of the solvent changes from acidic to basic, indicating that 2,6-diMe BnPiperaIndoSiR functions as a ratio type pH probe.
  • the pK a decreased 0.9 by comparing the aliphatic amino group of the piperazine with 2-Me MePiperaIndoSiR by benzylated (compound obtained by introducing a N-methyl piperazine ring). This is thought to be due to the electron withdrawing effect of the benzyl group.
  • Example 6 The spectral properties of Compound 2 (SiRpH3) of the present invention were evaluated. Absorption spectrum, fluorescence spectrum and excitation spectrum were measured using Shimadzu UV-1650PC absorptiometer and Hitachi F-4500 fluorometer. The results are shown in FIGS. 3a-c.
  • FIG. 3a, 3b, and 3c show absorption, fluorescence, and excitation spectra in 100 mM sodium phosphate buffer (containing 1% DMSO) having different pH values of SiRpH3, respectively.
  • FIG. 3d shows a plot of fluorescence intensity ratio (ratio) versus pH divided by 700 nm fluorescence intensity upon excitation at 580 nm divided by fluorescence intensity upon excitation at 663 nm.
  • the absorption wavelength of Compound 2 of the present invention was increased from about 580 nm to about 660 nm to about 80 nm as the solution pH was changed from acidic to basic.
  • the fluorescence wavelength did not change greatly even when the pH of the solution changed. Therefore, the wavelength of the excitation spectrum also increased greatly as the pH of the solution changed from acidic to basic. Based on this characteristic, it was possible to calculate the pH of the solution in the cuvette by measuring the ratio in the cuvette.
  • SiRpH3 measured in 100 mM sodium phosphate buffer are shown in Table 2.
  • SiRpH3 substituted with a fluorine atom had absorption maximums at about 580 nm and about 660 nm depending on the pH, similar to 2,6-diMe BnPiperaIndoSiR, and showed a sufficient fluorescence quantum yield as a fluorescent probe.
  • Example 7 The spectral characteristics of the compound 3 (SiRpH4) of the present invention were evaluated. Absorption spectrum, fluorescence spectrum and excitation spectrum were measured using Shimadzu UV-1650PC absorptiometer and Hitachi F-4500 fluorometer. The results of the absorption spectrum and excitation spectrum are shown in FIGS. 4a-b.
  • FIG. 4a and 4b show absorption and excitation spectra in a 100 mM sodium phosphate buffer (containing 1% DMSO) having different pH values of SiRpH4, respectively.
  • FIG. 4c shows a plot of fluorescence intensity ratio (ratio) versus pH divided by 700 nm fluorescence intensity upon excitation at 580 nm divided by fluorescence intensity upon excitation at 663 nm.
  • SiRpH4 showed the same optical characteristics as SiRpH3, but due to the ortho-position sulfone group, the pKa of the ratio value change shifted to the basic side compared to SiRpH3.
  • Example 8 The spectral characteristics of the compound 4 (SiR pH 5) of the present invention were evaluated. Absorption spectrum, fluorescence spectrum and excitation spectrum were measured using Shimadzu UV-1650PC absorptiometer and Hitachi F-4500 fluorometer. The results of the absorption spectrum and the excitation spectrum are shown in FIGS. 5b to 5c.
  • FIG. 5a represents the assumed chemical equilibrium equation for SiRpH5.
  • FIGS. 5b and 5c show absorption and excitation spectra in 100 mM sodium phosphate buffer (containing 1% DMSO) having different pH values of SiR pH5, respectively.
  • SiRpH5 showed the same optical characteristics as SiRpH4, but the pKa of the ratio value change was shifted to the acidic side compared to SiRpH4 due to the para-position sulfone group, and showed a value suitable for the measurement of acidic organelle.
  • Table 3 shows the optical properties of SiRpH5 measured in 100 mM sodium phosphate buffer. SiRpH5 had absorption maximums at about 590 nm and about 670 nm, and showed a sufficient fluorescence quantum yield as a fluorescent probe.
  • FIG. 6 shows a plot of ratio value versus pH for each compound.
  • each organelle in the cell has a unique pH
  • by developing and using pH probe having a pK a suitable pH measurement for each by using the pH probe nucleus organelle more precisely the It is thought that the pH of the organelle can be measured.
  • SiRpH5-PEG 6 -SE (Compound 6) having N-hydroxysuccinimidyl ester via a PEG linker and capable of forming a covalent bond with an amino group of a biopolymer was synthesized according to Scheme 6 below.
  • Steps (a) and (b) To the flask were added SiRpH5 (15 mg, 17.2 ⁇ mol), N-hydroxysuccinimide (2.2 mg, 18.9 ⁇ mol), EDC hydrochloride (3.6 mg, 18.9 mmol), DMF (2 mL) followed by DIPEA (6. 6 ⁇ L, 37.8 ⁇ mol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 20 hours.
  • SiRpH5-PEG 6 -BG (Compound 7) having a benzylguanine structure via a PEG linker and capable of forming a covalent bond with a SNAP-Tag protein was synthesized according to the following scheme 7.
  • Step (a) To the flask was added SiRpH5-PEG 6 -SE (1.8 mg, 1.38 ⁇ mol), BG-NH 2 (1.1 mg, 4.14 ⁇ mol), DMF (1 mL), and then DIPEA (1.4 ⁇ L, 8.28 ⁇ mol). Was added and stirred at room temperature for 4 hours.
  • Example 11 PH measurement of intracellular organelles using SiRpH5 (A) pH measurement of lysosomes After adding dextran, a polysaccharide, to the extracellular fluid and incorporating it into the cells, the dextran is selectively lysosomally incubated for several hours. It is known to be accumulated in In order to measure the pH of lysosomes using this probe, SiRpH5-Dex was prepared by labeling SiRpH5 with 10 kDa aminodextran.
  • Tfn recycling endosome Transferrin
  • TfnR transferrin receptor
  • SiRpH5-Tfn was prepared by labeling SiRpH5 on holotransferrin, which is an iron ion-transferrin complex.
  • Fluorescence derived from SiRpH5-Tfn was observed from the site overlapping with the fusion protein of Rab11 which is a marker protein of recycling endosome and green fluorescent protein GFP.
  • Rab11 which is a marker protein of recycling endosome and green fluorescent protein GFP.
  • the pH was calculated from the ratio value of the recycling endosome surrounded by the dotted line using the calibration curve, it was calculated to be 5.8. This value was comparable to the reported value for recycling endosomes. From this, it is considered that the pH of various intracellular organelles can be measured by changing the protein that labels the probe.
  • the fluorophore Si rhodamine used as the mother nucleus of the pH probe is a fluorescent dye exhibiting high fluorescence quantum yield and light fading resistance. Therefore, the present invention can achieve high-accuracy imaging of target molecules labeled with a small amount of molecules and time-lapse imaging that requires long-time excitation light irradiation, which was difficult with conventional pH probes with low fluorescence quantum yield. It becomes. Moreover, since environmental sensitivity is low, it is expected that highly reliable pH measurement will be possible in various organelles in cells.
  • the pH probe of the present invention is expected to be a useful tool for detailed analysis of various life phenomena.

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Abstract

【解決課題】高い蛍光量子収率を有し、光褪色に高い耐性を有し、弱塩基性、中性、弱酸性環境等の細胞内の様々なｐＨ環境の可視化に適したｐＨプローブを提供すること。【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

Description

ｐＨ感受性蛍光プローブ
　本発明は、新規ｐＨ感受性蛍光プローブ及びこれを用いた細胞内の酸性領域の測定方法に関る。
　細胞は取り込んだタンパク質や有機化合物の代謝、細胞構成成分の合成、輸送など、様々な生化学反応を高い時空間分解能で行い、生命機能を維持している。これらの生化学反応を効率よく行うために細胞内には様々な小器官（オルガネラ）が存在し、各オルガネラは種々の生化学反応に最適な固有のｐＨを保持している（非特許文献１）。
　ｐＨは細胞機能の重要な調整因子であるため、オルガネラのｐＨが変化すればオルガネラの機能は大きく変化する。例えば細胞内に取り込んだタンパク質を分解するエンドサイトーシス経路において、エンドソーム内のｐＨは６．３（初期エンドソーム）→５．５（後期エンドソーム）→４．７（リソソーム）とエンドソームの成熟に従って酸性化し、それに応じてエンドソーム内で起こる生化学反応もタンパク質の選別（初期エンドソーム）からタンパク質の分解（リソソーム）へと変化する。このように、細胞内のｐＨは細胞内で起きる化学反応と大きく関わっているため、細胞内ｐＨを測定することは、細胞内で起きている生命現象を解明するために重要である。
　近年、細胞内ｐＨの検出に最も汎用されている手法は、蛍光イメージング法である。蛍光イメージング法では有機小分子蛍光色素や蛍光タンパク質をベースとしたｐＨ感受性蛍光プローブ（以下ｐＨプローブと称す）を用いる。ｐＨプローブは近傍のｐＨ変化に伴い蛍光特性が大きく変化するという特徴を有している。この蛍光特性の変化を蛍光顕微鏡やプレートリーダー等の機器により検出することで、生きたままの細胞内のｐＨを簡便に測定可能となる。
　ｐＨプローブには、ｐＨ変化に応じて蛍光強度が大きく上昇するＯｆｆ／Ｏｎ型のプローブと、ｐＨ変化に応じて吸収波長または蛍光波長が大きく変化するｒａｔｉｏ型プローブがある。
　Ｏｆｆ／Ｏｎ型ｐＨプローブは励起、蛍光検出をそれぞれ１波長のみで行うため、比較的単純な光学系でも利用可能という利点がある。しかしながら、細胞の収縮やプローブの細胞外への漏出等のプローブ濃度の増減を蛍光強度の増減すなわちｐＨの変化として観測してしまうため、Ｏｆｆ／Ｏｎ型のｐＨプローブを用いて細胞内のｐＨを定量的に測定することは難しい。
　ｒａｔｉｏ型のｐＨプローブは励起、または蛍光検出を２波長で行い、それらの蛍光強度の比（ｒａｔｉｏ）を算出し、ｒａｔｉｏ値の変化をｐＨ変化として観測する。そのため、ｒａｔｉｏ型ｐＨプローブを使用するためには、励起光の切り替え装置や複数の蛍光検出器などｒａｔｉｏ測定に適した光学系が必要となる。一方、ｒａｔｉｏ型ｐＨプローブの優れた特徴として、プローブ濃度が変動してもｒａｔｉｏ値は変化しないため、ｐＨ変化以外の要因による測定誤差を低減できることが挙げられる。従って、ｒａｔｉｏ型ｐＨプローブを用いることで、細胞内のｐＨを定量的に測定することが可能である。そのため、ｒａｔｉｏ型のｐＨプローブはｐＨ変化を伴う生命現象の解明に大きく貢献してきた。
　現在、生物学研究に汎用されているｒａｔｉｏ型ｐＨプローブは、図１に示すｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ（ＳＮＡＲＦ）類、及び２′，７′－Ｂｉｓ－（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－５－（ａｎｄ－６－）ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＢＣＥＣＦ）類の２種類である。
　最も汎用されているｐＨプローブ「ＳＮＡＲＦ－１」（図１の（ａ））は１波長励起２波長測光型であり、４８８ｎｍの光で励起し、５８０ｎｍおよび６４０ｎｍで蛍光検出を行うとｒａｔｉｏイメージングが可能となる。ＳＮＡＲＦ－１は主に細胞質に局在し、細胞質のｐＨ変動域に適したｐＫａ（＝７．５）を有するため、主に細胞質のｐＨ測定に用いられている。また、ＳＮＡＲＦの活性エステル体を用いてタンパク質、微生物等の巨大分子に標識し、標的分子のエンドサイトーシス過程の可視化にも用いられている。ＳＮＡＲＦ－１の問題点としては、蛍光量子収率が比較的低いこと（酸性側０．０３、塩基性側０．０９）、温度や環境感受性があること（２５℃→３７℃になると蛍光が２５％減少し、タンパクと相互作用しても蛍光が減少する）、および光褪色を起こしやすいこととされている（非特許文献２）。ｐＫａを６．３まで低下させたＳＮＡＲＦの誘導体であるＳＮＡＲＦ－４Ｆも細胞質の酸性化を可視化するために使われている。
　 次に汎用されている「ＢＣＥＣＦ」（図１の（ｂ））は２波長励起１波長蛍光型であり、等吸収点である４４０ｎｍとピークトップ近傍の４８８ｎｍで励起し、５３５ｎｍで蛍光検出を行うとｒａｔｉｏイメージングが可能となる。ＢＣＥＣＦは細胞質に局在し、細胞質のｐＨ変動域に適したｐＫａ（＝７．０）を有するため、主に細胞質のｐＨ測定に用いられている。ＢＣＥＣＦの問題点としては、塩基性側で大きな吸光度・蛍光量子収率を示す一方で酸性側では吸光度・蛍光量子収率が小さく、輝度の大きな違いからｒａｔｉｏイメージングがしづらいこと、および母骨格であるフルオレセイン同様に光褪色しやすいこととされている。また、異なるｐＫａを有するＢＣＥＣＦ誘導体は市販されていない。
　 以上のように、従来ｒａｔｉｏ型ｐＨプローブは蛍光量子収率が低い、また温度や環境依存性があり光褪色を起こしやすいｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒまたはフルオレセイン骨格に基づいて開発されてきた。そのため、長時間のイメージングが難しい、周囲の温度やオルガネラの環境の違いといった環境要因により正確なｐＨが測定しにくくなるといった問題点があった。また、プローブ分子に構造修飾を施すことが難しいため、有機化学的修飾により様々なｐＫａを有するｐＨプローブ誘導体はほとんど開発されていなかった。
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２０１０，１１，５０－６１ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１０，１１０，２７０９－２７２８
　本発明は、高い蛍光量子収率を有し、光褪色に高い耐性を有し、弱塩基性、中性、弱酸性環境等の細胞内の様々なｐＨ環境の可視化に適したｐＨプローブを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討したところ、近年本発明者らが開発してきた高い蛍光量子収率を有し、光褪色に高い耐性を有するＳｉ系ローダミン骨格を用いてｒａｔｉｏ型ｐＨプローブを開発することにより、既存のｐＨプローブが抱える問題点を解決できるのではないかと考え種々検討したところ、非対称Ｓｉ系ローダミンの骨格にピペラジン環を導入し、更にピペラジン環アミノ基上に電子吸引性基を導入することにより、ｐＨプローブのｐＫａを容易に調整することができることを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し； 
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
ｍは、０～６の整数である。）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｙが置換又は無置換のフェニル基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｙがフェニル基、フッ素原子で置換されたフェニル基、又はスルホニル基で置換されたフェニル基である、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］ｍが０又は１である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、［５］に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｒ２ａ及びＲ２ｂにおける一価の置換基が、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［８］Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は水素であり、他方は炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［７］に記載の化合物又はその塩。
［９］Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基である、［７］に記載の化合物又はその塩。
［１０］以下の一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
（式中、
Ｒ１～Ｒ２ｂ、Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。）
で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［１１］Ｙが置換又は無置換のフェニル基である、［１０］に記載の化合物又はその塩。
［１２］Ｙがフェニル基、フッ素原子で置換されたフェニル基、又はスルホニル基で置換されたフェニル基である、［１１］に記載の化合物又はその塩。
［１３］ｍが０又は１である、［１１］又は［１２］に記載の化合物又はその塩。
［１４］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる、［１０］～［１３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１５］Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、［１４］に記載の化合物又はその塩。
［１６］Ｒ２ａ及びＲ２ｂにおける一価の置換基が、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［１０］～［１５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１７］Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は水素であり、他方は炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、［１６］に記載の化合物又はその塩。
［１８］Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基である、［１６］に記載の化合物又はその塩。
［１９］以下の一般式（Ｉａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
（式中、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
ｍは、０～６の整数であり；
Ｘ’は、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔは、架橋基を示し、該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
（ｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく、又は
（ｉｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであり、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基であり；
ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３であり、ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであり、他方は、一価の置換基である。）
で表される、化合物又はその塩。
［２０］以下の一般式（ＩＩａ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
（式中、
Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉａ）で定義した通りであり；
Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｘ’、Ｔ、Ｒ１’、Ｒ２ａ～Ｒ２ｂ、ｎ及びｐは一般式（Ｉａ）で定義した通りである。）
［１９］に記載の化合物又はその塩。
［２１］－Ｘ’－Ｔは、以下から選択される、［１９］又は［２０］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
［２２］以下の一般式（Ｉｂ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
（式中、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
ｍは、０～６の整数であり；
Ｘ’は、生体高分子標識部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＳと結合した後の構造であり；
Ｓは。ラベル部位又は標的集積部位を示し；
Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、
（ｉ）それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく、又は
（ｉｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであり、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基であり；
ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３であり、ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであり、他方は、一価の置換基である。）
で表される化合物又はその塩。
［２３］以下の一般式（ＩＩｂ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（式中、
Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉｂ）で定義した通りであり；
Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｘ’、Ｔ’、Ｒ１’、Ｓ、Ｒ２ａ～Ｒ２ｂ、ｎ及びｐは一般式（Ｉｂ）で定義した通りである。）
で表される、［２３］に記載の化合物又はその塩。
［２４］－Ｓは、以下から選択される、［２２］又は［２３］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
［２５］［１］～［２４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［２６］細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）［１］～［２４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
［２７］細胞内酸性小器官の存在する酸性領域を測定する［２６］に記載の方法。
を、提供するものである。
　本発明により、高い蛍光量子収率を有し、光褪色に高い耐性を有し、弱酸性環境の細胞内のｐＨ環境の可視化に適したｐＨプローブを提供することが可能である。また、ピペラジン環アミノ基上に導入した電子吸引性基上に更に電子吸引性基や電子供与性基を導入することにより、さらにｐＫａを低下させたり、あるいは上昇させたりといった調整をすることができ、弱塩基性、中性、弱酸性環境等の細胞内の様々なｐＨ環境の可視化に適したｐＨプローブ群を提供することが可能となる。
汎用されているｐＨプローブの構造式 ２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲの想定される化学平衡式 ２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲのｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル ２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲのｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル ２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲのｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル ｐＨが変化した際の６６３ｎｍにおける吸光度変化のプロット ＳｉＲｐＨ３のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル ＳｉＲｐＨ３のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における蛍光スペクトル ＳｉＲｐＨ３のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル ＳｉＲｐＨ３についての５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロット ＳｉＲｐＨ４のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル ＳｉＲｐＨ４のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル ＳｉＲｐＨ４についての５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロット ＳｉＲｐＨ５の想定される化学平衡式 ＳｉＲｐＨ５のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収スペクトル ＳｉＲｐＨ５のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における励起スペクトル ＳｉＲｐＨ５についての５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロット 各種化合物のレシオ値対ｐＨのプロット ＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘを用いたリソソームのｐＨ測定の実験のイメージ図 ＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘを用いて作成した細胞内ｐＨの検量線 共焦点顕微鏡での観察によるリソソームのｐＨ測定結果 ＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎを用いたリサイクリングエンドソームのｐＨの測定の実験のイメージ図 ＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎを用いて作成した細胞内ｐＨの検量線 共焦点顕微鏡での観察によるリサイクリングエンドソームのｐＨ測定結果
　本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
　本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「実施態様１」とも言う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示す。ここで、Ｒ１は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂで置換されている位置以外のベンゼン環上の３つの位置に導入される。Ｒ１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、Ｒ１は水素原子を示す（即ち、Ｒ１の全てが水素原子）か、１個の置換基が存在する場合（即ち、Ｒ１の１つが一価の置換基であり、それ以外は水素原子）である。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
　一つの好ましい側面において、Ｒ１が炭素数１～６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の３位から５位に存在する。
　本発明の１つの態様においては、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位（「生体高分子標識部位」とも言う。）を導入することが可能な官能基である。ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基とは、ラベル部位又は標的集積部位と反応することが可能な官能基を意味し、その例は、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基が好ましい。
　Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基である場合においては、その他のＲ１は水素であっても、上記の一価の置換基（炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基）であってもよい。
　一つの好ましい側面において、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であり、該官能基はベンゼン環上の３位から５位に存在する。
　本発明の好ましい側面において、Ｒ１の少なくとも１つは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基（特に好ましくは、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基）であり、その他のＲ１は水素である。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示す。但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではない。Ｒ２ａ及びＲ２ｂが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれる。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂにおける一価の置換基は、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である。
　また、本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は水素であり、他方は炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である。
　また、本発明の１つの更に好ましい態様においては、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基である。理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基であると、プローブの溶液中における安定性を向上させることができるためである。
　また、Ｒ２ａ及びＲ２ｂが示す一価の置換基は、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であってもよい。ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基の例は、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基が好ましい。
　本発明の１つの実施態様において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、前記した一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）であり、他方は、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基である。この場合、Ｒ１の少なくとも１つはラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であってもよいし、全てのＲ１が水素であってもよく、あるいは、Ｒ１の少なくとも１つは炭素数１～６個のアルキル基などの一価の置換基で、残りのＲ１は水素であってもよい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ５及びＲ６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ５及びＲ６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ５又はＲ６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在しない。
　また、Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい。Ｘがリン原子の場合の好ましい側面においては、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであり、他方は、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示す。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ７及びＲ８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示す。
　また、Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　一般式（Ｉ）において、Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示す。本発明においては、ピペラジン環アミノ基上に電子吸引性基であるアリール基又はヘテロアリール基を導入することにより、ピペラジン環アミノ基のｐＫａを変化させることができ、これによりｐＨプローブのｐＫａを容易に調整することが可能になる。
　アリール基としては、フェニル基、ナフチル基が挙げられるが、フェニル基が好ましい。ヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、ピリダジル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ベンゾチアゾリル基、ピロリル基、フラニル基、チエニル基、イミダゾリル基、チアゾリル基が挙げられるが、ピリジル基が好ましい。
　また、本発明においては、ピペラジン環アミノ基上に導入したアリール基又はヘテロアリール基に更に電子求引性基や、電子供与性基を導入することにより、さらにｐＫａを低下させたり、あるいは上昇させたりといった調整をすることが可能である。
　アリール基又はヘテロアリール基に導入する置換基は、電子求引性基としては、ニトロ基、スルホニル基、カルボニル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）、炭素数１～６のアルコキシ基等が挙げられるが、フッ素原子、スルホニル基が好ましい。アリール基又はヘテロアリール基は、上記の電子求引性基を２以上有することができ、これら電子求引性基は同一又は異なっていてもよい。
　電子供与基としては、アミノ基、メトキシ基、炭素数１～６のアルキル基が挙げられるが、ｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ブチル基、ｉｓｏ－プロピル基、ｎ－プロピル基、エチル基、メチル基、アミノ基、メトキシ基が好ましい。アリール基又はヘテロアリール基は、上記の電子供与基を２以上有することができ、これら電子供与基は同一又は異なっていてもよい。
　一般式（Ｉ）において、ｍは、０～６の整数である。一般式（Ｉ）において、Ｙとして導入したアリール基又はヘテロアリール基の有効な電子求引効果を得るには、ｍは０又は１が好ましい。
　本発明の１つの好ましい態様は、Ｙが置換又は無置換のフェニル基であり、ｍが１であり、即ち、ピペラジン環アミノ基に置換又は無置換のベンジル基が導入された場合である。
　本発明の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）においてＹがフッ素原子で置換されたフェニル基であり、ｍが１である化合物又はその塩である。
　本発明の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）においてＹがスルホニル基で置換されたフェニル基であり、ｍが１である化合物又はその塩である。
　本発明の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）においてＹが２つのスルホニル基で置換されたフェニル基であり、ｍが１である化合物又はその塩である。
　一般式（Ｉ）において、Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示すが、珪素原子又はゲルマニウム原子であることが好ましく、珪素原子であることが特に好ましい。
　本発明の実施態様１の１つの側面は、以下の一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
で表される化合物又はその塩である。
　一般式（ＩＩ）において、Ｒ１～Ｒ２ｂ、Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）について上記で記載した通りである。
　一般式（ＩＩ）において、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
　本発明の１つの好ましい態様において、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基）である。
　本発明の１つの好ましい態様において、Ｒ１１～Ｒ１４はいずれも水素原子である。
　本発明の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物の非限定的な例として以下の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
　本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
　本発明の一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
　本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基が架橋基と結合した化合物又はその塩である（以下「実施態様２」とも言う）。
　ここで、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基としては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アルキルカルボニル基が好ましい。
　また、架橋基としては、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基とラベル部位又は標的集積部位とを連結させるスペーサーとして働くものであればいずれの架橋基であってもよい。例えば、置換又は無置換の炭化水素基（アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族炭化水素など）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基など、システイン酸アルキル及び複素環基（例えば、ピペリジニル基など）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい。このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基などが挙げられる。
　実施態様２の１つの側面は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　一般式（Ｉａ）において、Ｒ３～Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義したとおりである。
　一般式（Ｉａ）において、Ｘ’は、前記したラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造であり、Ｔは、前記した架橋基である。
　該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい。このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基などが挙げられる。
　また、Ｒ１’は、水素、又は一般式（Ｉ）のＲ１として定義した同一又は異なる一価の置換基であり、その詳細は一般式（Ｉ）の化合物について説明した通りである。
　Ｒ１’は、好ましくは、水素である。
　一般式（Ｉａ）において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではない。
　また、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであることができ、この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　一般式（Ｉａ）において、ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３である。
　ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであり、他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　上記の通り、一般式（Ｉａ）において、－（Ｘ’－Ｔ）は、ベンゼン環の２～６位のいずれの位置に導入することができる。
　一般式（Ｉａ）で表される好ましい側面において、ｎは１であり、ｐは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであってもよく、その場合には、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　実施態様２のもう１つの側面は、以下の一般式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　一般式（ＩＩａ）において、Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し、Ｘ’、Ｔ、Ｒ１’、Ｒ２ａ～Ｒ２ｂ、ｎ及びｐは一般式（Ｉａ）で定義した通りである。
　一般式（ＩＩａ）で表される好ましい側面において、ｎは１であり、ｐは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであってもよく、その場合には、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　実施態様２の１つの好ましい側面においては、一般式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）における－Ｘ’－Ｔは、以下から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基は架橋基と結合し、更に架橋基がラベル部位又は標的集積部位と結合した化合物又はその塩である。
　また、本発明のもう一つの実施態様は、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１の少なくとも１つが、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基であって、当該官能基は、架橋基を介さずに、ラベル部位又は標的集積部位と結合した化合物又はその塩である。
　上記２種類の実施態様を総称して以下「実施態様３」とも言う。
　ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、架橋基については、実施態様２で説明した通りである。
　ラベル部位又は標的集積部位の例として、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体などが挙げられる。また、ラベル部位又は標的集積部位には、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基も含まれ、修飾基としてはアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基などが挙げられる。修飾基を有するポリエチレングリコール基の非限定的例として、３－（２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸が挙げられる。
　実施態様３に含まれる化合物又はその塩は、酸性環境においてはじめて強蛍光性となるとともに、特定のタンパク質などをラベルすることができ、また、酸性小器官細胞内に局在させることができることから、細胞内酸性小胞が関わる種々の現象をリアルタイムに可視化することを可能とする。なお、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基の一部にラベル部位又は標的集積部位が導入された化合物、即ち、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基と、ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基の両方を有する化合物も、実施態様３に含まれる。
　実施態様３の１つの側面は、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　一般式（Ｉｂ）において、Ｒ３～Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義したとおりである。
　式（Ｉｂ）において、Ｘ’は、前記したラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造であり、Ｔ’は、存在する場合は、前記した架橋基がＳと結合した後の構造であり、Ｓは、ラベル部位又は標的集積部位である。
　また、Ｒ１’は、水素、又は一般式（Ｉ）のＲ１として定義した同一又は異なる一価の置換基であり、その詳細は一般式（Ｉ）の化合物について説明した通りである。
　Ｒ１’は、好ましくは、水素である。
　一般式（Ｉｂ）において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではない。
　また、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであることができ、この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　一般式（Ｉｂ）において、ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３である。
　ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであり、他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　上記の通り、一般式（Ｉｂ）において、－（Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓ）は、ベンゼン環の２～６位のいずれの位置に導入することができる。
　一般式（Ｉｂ）で表される好ましい側面において、ｎは１であり、ｐは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであってもよく、その場合には、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　一般式（Ｉｂ）において、Ｔ’は存在しても、存在しなくてもよい（存在しない場合は、ＳはＸ’に直接結合する）。ここで、架橋基がない場合は、合成が簡便な一方でタンパク質表面との相互作用により色素分子の特性が変わり得ることから、Ｔ’が存在することが通常は好ましい。
　また、架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよく、このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基、プロパギル基などが挙げられる。
　実施態様３のもう１つの側面は、以下の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　一般式（ＩＩｂ）において、Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し、Ｘ’、Ｔ’、Ｒ１’、Ｓ、ｎ及びｐは一般式（Ｉｂ）で定義した通りである。
　一般式（ＩＩｂ）で表される化合物の好ましい側面において、ｎは１であり、ｐは２であり、この場合、Ｒ１’は同一であっても異なっていてもよい。この場合、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであってもよく、その場合には、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基（好ましくは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子）である。
　実施態様３の１つの好ましい側面においては、一般式（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）における－Ｓは、以下から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　実施態様３の化合物、一般式（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）の化合物は、特定のタンパク質などをラベルすることができ、また、酸性小器官細胞内に局在させることができることから、細胞内酸性小胞が関わる種々の現象をリアルタイムに可視化することを可能となる。その非限定的例としては、ラベル部位としてＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルや末端をカルボキシル基等で修飾したポリエチレングリコールを分子内に導入した場合には、これを糖ポリマーであるデキストランにラベルすることにより、本発明の蛍光プローブを細胞内酸性小胞に局在させることが可能になる。また、標的集積部位として弱塩基性アミンを分子内に導入した場合は、本発明の蛍光プローブを酸性小胞に集積させることが可能になる。また、ラベル部位としてＨａｌｏタグリガンドを導入すると、Ｈａｌｏタグへの特異的なラベルが可能となる。具体的には、シナプス小胞マーカーであるＶＡＭＰ２にＨａｌｏタグを融合させたタンパク質（ＶＡＭＰ２－Ｈａｌｏタグ）を神経細胞に発現させ、そこへＨａｌｏタグリガンドを導入した本発明の蛍光プローブを添加することにより、蛍光プローブのシナプス小胞への特異的なラベリングが可能となる。
　本発明の実施態様２及び３の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
　本発明の実施態様２及び３の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
　本発明の一般式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
　本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
　また、本発明のもう１つの態様は、細胞内の酸性領域の測定方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程を含む方法である。
　また、本発明の１つの側面は、細胞内酸性小器官の存在する酸性領域を測定する方法である。
　本発明の更に１つの態様は、（ａ）細胞を一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）の化合物又はその塩と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、（ｂ）前記接触させた細胞を、前記化合物が前記細胞に侵入するためにインキュベーションし、標識された細胞を形成する段階と、（ｃ）前記標識された細胞を、蛍光が測定される適切な波長を用いて照射し、それによって前記細胞内部のｐＨをモニターする段階とを含む、生細胞内部のｐＨをモニターするための方法である。
　ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
項に記載の方法。
　本発明の更に１つの態様は、（ａ）担体分子を一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）の化合物又はその塩に結合し、担体結合体を形成する段階と、（ｂ）前記担体結合体を細胞と接触させ、接触させた細胞を形成する段階と、（ｃ）前記接触させた細胞をインキュベーションし、インキュベーションされた溶液を形成する段階と、（ｄ）前記インキュベーションされた溶液を照射し、照射された溶液を形成する段階と、（ｅ）前記照射された溶液からの蛍光性発光を検出する段階とを含む、溶液中の担体分子の食作用を検出するための方法であって、蛍光性発光が前記担体分子の食作用を示す方法である。
　担体分子としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微小粒子、生物学的細胞、ウイルスおよびこれらの組合せが含まれる。
　例示的な実施形態では、この担体分子は、アミノ酸（保護されているかまたはホスフェート、炭水化物、もしくはＣ１～Ｃ２２カルボン酸によって置換されたたアミノ酸を含む）、またはアミノ酸のポリマー（ペプチドもしくはタンパク質など）である。また、関連する実施形態では、この担体分子は、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは５～３６個のアミノ酸を含む。ペプチドの例としては、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なペプチドは、細胞小器官局在化ペプチド、すなわち、細胞輸送機構による特定の細胞下部構造内での局在化のために、結合された化合物を標的とする働きをするペプチドとして機能してもよい。好ましいタンパク質担体分子としては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、トランスフェリン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、フィコビリタンパク質および他の蛍光性タンパク質、ホルモン、毒素ならびに成長因子が挙げられる。典型的には、このタンパク質担体分子は、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン、成長因子、細菌粒子または細胞受容体の結合パートナーである。
　核酸ポリマー担体分子の例は、一本鎖もしくは多鎖の、天然もしくは合成のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり、あるいは珍しいリンカー（モルホリン誘導体化ホスフェート（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州、コーバリス）、あるいはペプチド核酸（Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン単位など）を組込んだものであり、上記核酸は５０個未満のヌクレオチド、より典型的には２５個未満のヌクレオチドを含有する。
　別の例示的な実施形態では、この担体分子は、典型的にはデキストラン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロースなどの多糖類、またはポリ（エチレングリコール）などのポリマーである炭水化物またはポリオールを含む。関連する実施形態では、この多糖類担体分子としてはデキストラン、アガロースまたはＦＩＣＯＬＬが挙げられる。
　別の例示的な実施形態では、この担体分子は、糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴ脂質を含めた脂質（典型的には、６－２５個の炭素を含む）を含む。あるいは、この担体分子は脂質小胞（リポソームなど）を含むか、またはそれはリポタンパク質である（下記を参照）。いくつかの親油性置換基は、結合された色素を細胞または細胞小器官に輸送するのを容易にするのに有用である。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
（１）合成中間体１の合成
　以下のスキーム１により合成中間体１（ｔｅｒｔ－ブチル４－（１，１０，１０－トリメチル－５－オキソ－２，３，５，１０－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［５，６］シリノ［３，２－ｆ］インドール－８－イル）ピペラジン－１－カルボキシレート（ＢｏｃＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＸａｎｔｈｏｎｅ）を合成した。
スキーム１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
（１）工程（ａ）
　 Ｎ－Ｂｏｃ－ピペラジン（２．４１ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）および２－ブロモ－４－フルオロベンズアルデヒド（２．１９ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３（２．２４ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で１８時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後に残渣に水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、メタノール（３０ｍＬ）、水素化ホウ素ナトリウム（４９４ｍｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、残差に水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製して２－ブロモ－４－（１－Ｂｏｃピペラジル）－ベンジルアルコール（３．４６ｇ、９．３３ｍｍｏｌ、収率８６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.48 (s, 9H), 2.02 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.13 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.56 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.66 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 6.85 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 28.40, 48.89, 64.77, 80.05, 115.35, 120.09, 123.85, 130.03, 130.87, 151.76, 154.64; HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 371.0970, Found, 371.0922 (－4.8 mmu).
（２）工程（ｂ）
　 ６－ブロモ－１－メチルインドリン（２３ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）、２－ブロモ－４－（１－Ｂｏｃピペラジル）－ベンジルアルコール（４１ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、ＢＦ３ＯＥｔ２（２８μＬ、０．２２０ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間攪拌した。反応溶液に水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、４－（３－ブロモ－４－（（６－ブロモ－１－メチルインドリン－５－イル）メチル）フェニル）Ｂｏｃピペラジン（５３ｍｇ、０．０９３７ｍｍｏｌ、収率８７％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.48 (s, 9H), 2.73 (s, 3H), 2.82 (t, J = 8.1 Hz, 2H,), 3.10 (t, J = 5.1 Hz, 4H,), 3.30 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 3.56 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 4.00 (s, 2H), 6.65 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.77 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 2.1 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 28.31, 28.40, 35.96, 40.38, 49.13, 56.22, 79.95, 110.81, 115.64, 120.25, 123.13, 125.36, 126.09, 127.47, 130.20, 130.77, 131.20, 150.52, 153.13, 154.65; HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 566.0841, Found, 566.0850 (+0.9 mmu).
（３）工程（ｃ）
　乾燥させアルゴン置換したフラスコに４－（３－ブロモ－４－（（６－ブロモ－１－メチルインドリン－５－イル）メチル）フェニル）Ｂｏｃピペラジン（１１５０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を加えた。－７８℃に冷却後、１Ｍｓｅｃ－ブチルリチウム（４．２６ｍＬ、４．２６ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。そのままの温度でジクロロジメチルシラン（２５７μＬ、２．２３ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解してゆっくりと加え、室温に戻して１３時間攪拌した。２Ｎ塩酸で反応を停止してＮａＨＣＯ３で中和した。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で一部の副生成物を除いた。残渣をアセトン（３０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却してＫＭｎＯ４（２３７ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を少量ずつ１時間かけて加え、さらに同じ温度で１時間攪拌した。ジクロロメタンを加え、ろ紙を用いて吸引ろ過した後、水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ－ヘキサン）で精製し、ｔｅｒｔ－ブチル４－（１，１０，１０－トリメチル－５－オキソ－２，３，５，１０－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［５，６］シリノ［３，２－ｆ］インドール－８－イル）ピペラジン－１－カルボキシレート（５２ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ、収率５％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.45 (s, 6H), 1.49 (s, 9H), 2.91 (s, 3H), 3.06 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.49 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 6.49 (s, 1H), 7.01-7.04 (m, 2H), 8.20 (s, 1H), 8.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ -1.19, 27.88, 28.33, 34.36, 47.56, 54.63, 79.97, 107.74, 116.22, 117.61, 126.02, 130.95, 131.37, 132.20, 132.56, 140.21, 140.29, 151.98, 154.48, 154.91, 184.99; HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 478.2526, Found, 478.2483 (－4.3 mmu).
（２）合成中間体１から化合物１の合成
　上記で得た合成中間体１から以下のスキーム２により本発明の化合物１（２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ）を得た。
スキーム２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
（１）工程（ａ）
　乾燥させアルゴン置換したフラスコにｔｅｒｔ－ブチル４－（１，１０，１０－トリメチル－５－オキソ－２，３，５，１０－テトラヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［５，６］シリノ［３，２－ｆ］インドール－８－イル）ピペラジン－１－カルボキシレート（４２ｍｇ、０．０８７９ｍｍｏｌ）、脱水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）、２，６－ジメチルフェニルマグネシウムブロミド（２．６４ｍＬ、２．６４ｍｍｏｌ）を加え３．５時間加熱還流した。反応液を室温に戻した後に２Ｎ塩酸水溶液で反応を停止して飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）、ジクロロメタン（５ｍＬ）を加えて室温で３時間攪拌した。残渣をヘキサンで洗った後にＨＰＬＣ（溶離液、２７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から７２％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（３ｍｇ、５．１７μｍｏｌ、収率６％）を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 466.2679, Found, 466.2653 (－2.6 mmu).
（２）工程（ｂ）
　 ２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（３ｍｇ、５．１７μｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）、メタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ベンズアルデヒド（１μＬ、９．９１μｍｏｌ）および酢酸（２０μＬ）を加え室温で１０分攪拌した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．２６ｍｇ、２０μｍｏｌ）を加えて室温で２３時間攪拌した。混合物に水を加えてジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣にジクロロメタン（１０ｍＬ）、ｐ－クロラニル（２ｍｇ、８．１３μｍｏｌ）を添加して室温で１時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎで精製し、２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（１．５ｍｇ、２．２４μｍｏｌ、収率４３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.49 (s, 6H), 0.60 (s, 3H), 1.90 (s, 6H), 2.51 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 2.91 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.49 (s, 2H), 3.54 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.85 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 6.58 (dd, J = 8.6, 2.8 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.97 (s, 1H), 7.10-7.12 (m,3H), 7.18-7.28 (m, 6H); HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 556.3148, Found, 556.3134 (－1.4 mmu).
［実施例２］
（１）化合物２の合成
　以下のスキーム３により化合物２（ＳｉＲｐＨ３）を合成した。
スキーム３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
工程（ａ）
　２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（３．５ｍｇ、６．０３μｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解させ、３－フルオロベンズアルデヒド（１．３μＬ、１２．０６μｍｏｌ）および酢酸（２０μＬ）を加え室温で１０分攪拌した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．５ｍｇ、２４μｍｏｌ）を加えて室温で１６時間攪拌した。混合物に水を加えてジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣にジクロロメタン（５ｍＬ）、ｐ－クロラニル（３ｍｇ、１２．２μｍｏｌ）を添加して室温で３時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２７％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎで精製し、ＳｉＲｐＨ３（１．５ｍｇ、１．８７μｍｏｌ、収率３１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.60 (s, 6H, a), 1.97 (s, 6H, b), 3.01 (t, J = 6.5 Hz, 2H, c), 3.38 (brs, 4H, d), 3.44 (s, 3H, e), 3.84 (brs, 4H, f), 4.03 (t, J = 6.5 Hz, 2H, g), 4.38 (s, 2H, h), 6.82 (s, 1H, i), 6.90 (dd, J = 9.4, 3.0 Hz, 1H, j), 6.99 (d, J = 9.4 Hz, 1H, k), 7.23-7.38 (m,6H, l), 7.45-7.56 (m, 3H, m); HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 574.3054, Found, 574.3032 (-2.2 mmu) 
［実施例３］
（１）化合物３の合成
　以下のスキーム４により化合物３（ＳｉＲｐＨ４）を合成した。
スキーム４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（２．４ｍｇ、４．１６μｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解させ、２－ホルミルベンゼン－１－スルホン酸ナトリウム（１．７ｍｇ、８．３２μｍｏｌ）および酢酸（２．４μＬ、４１．６μｍｏｌ）を加え室温で１０分攪拌した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．５ｍｇ、８．３２μｍｏｌ）を加えて室温で１３時間攪拌した。混合物に水を加えてジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣にジクロロメタン（２ｍＬ）、ｐ－クロラニル（２ｍｇ、８．１３μｍｏｌ）を添加して室温で３時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎで精製し、ＳｉＲｐＨ４（１．５ｍｇ、１．８７μｍｏｌ、収率３１％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
［実施例４］
（１）化合物４の合成
　以下のスキーム５により化合物４（ＳｉＲｐＨ５）を合成した。
スキーム５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
（１）工程（ａ）
　乾燥させアルゴン置換したフラスコにｔｅｒｔ－ブチル４－ブロモ－３，５－ジメチルベンゾエート（１８２ｍｇ、０．６３８ｍｍｏｌ）に脱水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を加えて反応液を－７８℃に冷却した。反応液に１Ｍ　ｓｅｃ－ＢｕＬｉ（０．６４ｍＬ、０．６４ｍＬ）を加え、－７８度で３０分間攪拌した。反応液にＢｏｃＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＸａｎｔｈｏｎｅ（６１ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を加えて２．５時間加熱還流した。反応液を室温に戻した後に２Ｎ塩酸水溶液で反応を停止した後、混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加えて室温で３０分間攪拌した。残渣をヘキサンで洗った後にＨＰＬＣ（溶離液、２４％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、４－ＣＯＯＨ－２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（５０ｍｇ、８０．２μｍｏｌ、収率６３％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3CN): δ 0.56 (s, 6H, a), 2.00 (s, 6H, b), 2.91 (t, J = 6.1 Hz, 2H, c), 3.30 (t, J = 4.5 Hz, 4H, d), 3.33 (s, 3H, e), 3.81 (t, J =4.5 Hz, 4H, f), 3.94 (t, J = 6.1 Hz, 4H, g), 6.73-6.77 (m, 2H, h), 6.87 (d, J = 9.6 Hz, 1H, i), 7.29 (s, 1H, j), 7.36 (d, J = 2.4 Hz, 1H, k), 7.86 (s, 2H, l); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ -1.39, 19.84, 26.39, 35.08, 43.68, 44.41, 56.88, 116.00, 119.30, 121.79, 129.64, 129.99, 132.04, 133.46, 137.28, 137.43, 137.60, 144.22, 144.64, 152.62, 156.24, 160.24, 164.39, 168.28; HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 510.2577, Found, 510.2557 (-2.0 mmu) 
（２）工程（ｂ）
　４－ＣＯＯＨ－２，６－ｄｉＭｅ　ＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（１２．８ｍｇ、２０．５μｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、４－ホルミルベンゼン－１，３－ジスルホン酸二ナトリウム（１９．１ｍｇ、６１．５μｍｏｌ）および酢酸（２５０μＬ）を加え室温で３０分攪拌した。反応液に２－ピコリンボラン（４．４ｍｇ、４１μｍｏｌ）を加えて室温で１６時間攪拌した。混合物の溶媒を減圧留去し、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎで精製し、ＳｉＲｐＨ５（１１．２ｍｇ、１２．８μｍｏｌ、収率６３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, 20 mM pD 9.7 phosphate buffered D2O): δ 0.48 (s, 6H, a), 1.87 (s, 6H, b), 2.63 (brs, 4H, c), 2.81 (t, J = 7.0 Hz, 2H, d), 3.31 (s, 3H, e), 3.50 (brs, 4H, f), 3.90 (t, J = 7.0 Hz, 4H, g), 4.00 (s, 2H, h), 6.51 (d, J = 9.4 Hz, 1H, i), 6.75 (s, 1H, j), 6.84 (d, J = 9.4 Hz, 1H, k), 7.28 (s, 1H, l), 7.38 (s, 1H, m), 7.65 (s, 2H, n), 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 1H, o), 7.88 (d, J = 8.2 Hz, 1H, p), 8.30 (s, 1H, q); 13C NMR (100 MHz, CD3OD:D2O = 1:3) δ -1.11, 20.10, 26.73, 35.45, 45.53, 52.91, 57.57, 59.77, 117.07, 119.58, 120.19, 122.40, 126.87, 129.41, 130.21, 130.34, 130.81, 131.79, 133.57, 135.96, 137.56, 138.12, 138.47, 144.92, 145.32, 146.11, 147.92, 152.72, 157.61, 160.90, 163.91, 170.85; HRMS (ESI+) Calcd for [M]+, 760.2183, Found, 760.2137 (-4.6 mmu)
［実施例５］
　本発明の化合物１（２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ）のスペクトル特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ－１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ－４５００蛍光光度計を用いて測定した。結果を図２ａ～ｅに示す。
　図２ａは、２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲの想定される化学平衡式を表す。図２ｂ、図２ｃ、図２ｄは、夫々、２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲのｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収、蛍光、励起スペクトルを表す。図２ｅは、ｐＨが変化した際の６６３ｎｍにおける吸光度変化をプロットすることで、プロトン化反応のｐＫａ＝６．４と算出された。
　励起スペクトルを見ると、溶媒のｐＨが酸性から塩基性になるにつれて５８０ｎｍの吸光度が低下し、６６３ｎｍの吸光度が上昇することから、２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲはｒａｔｉｏ型ｐＨプローブとして機能することが分かる。また、そのｐＫａはピペラジンの脂肪族アミノ基をベンジル化することで２－Ｍｅ　ＭｅＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲ（Ｎメチルピペラジン環を導入した化合物）と比較して０．９低下した。これはベンジル基の電子求引効果によると考えられる。
　１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー中で測定した２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲの光学特性を表１に示す。２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲはｐＫａの値より酸性側、塩基性側のどちらでも比較的高い蛍光量子収率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
［実施例６］
　本発明の化合物２（ＳｉＲｐＨ３）のスペクトル特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ－１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ－４５００蛍光光度計を用いて測定した。結果を図３ａ～ｃに示す。
　図３ａ、図３ｂ、図３ｃは、夫々、ＳｉＲｐＨ３のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収、蛍光、励起スペクトルを表す。図３ｄは、５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロットを示す。
　本発明の化合物２の吸収波長は溶液のｐＨが酸性から塩基性になるにつれて、約５８０ｎｍから約６６０ｎｍまで約８０ｎｍと大きく長波長化した。その一方で、蛍光波長は溶液のｐＨが変化しても大きな変化は生じなかった。そのため励起スペクトルも溶液のｐＨが酸性から塩基性になるにつれて大きく長波長化した。この特性により、キュベット内のレシオを測定することでキュベット内の溶液のｐＨを算出することが可能であった。
　１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー中で測定したＳｉＲｐＨ３の光学特性を表２に示す。
　フッ素原子を置換したＳｉＲｐＨ３は、２，６－ｄｉＭｅ　ＢｎＰｉｐｅｒａＩｎｄｏＳｉＲと同様にｐＨに応じて約５８０ｎｍと約６６０ｎｍに吸収極大を有し、蛍光プローブとして十分な蛍光量子収率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
［実施例７］
　本発明の化合物３（ＳｉＲｐＨ４）のスペクトル特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ－１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ－４５００蛍光光度計を用いて測定した。吸収スペクトルと励起スペクトルの結果を図４ａ～ｂに示す。
　図４ａ、図４ｂは、夫々、ＳｉＲｐＨ４のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収、励起スペクトルを表す。図４ｃは、５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロットを示す。
　ＳｉＲｐＨ４はＳｉＲｐＨ３と同様の光学特性を示したが、オルト位スルホン基のためにＳｉＲｐＨ３と比べてレシオ値変化のｐＫａは塩基性側にシフトした。
［実施例８］
　本発明の化合物４（ＳｉＲｐＨ５）のスペクトル特性を評価した。吸収スペクトル、蛍光スペクトル及び励起スペクトルを島津ＵＶ－１６５０ＰＣ吸光光度計、日立Ｆ－４５００蛍光光度計を用いて測定した。吸収スペクトルと励起スペクトルの結果を図５ｂ～ｃに示す。
　図５ａは、ＳｉＲｐＨ５の想定される化学平衡式を表す。図５ｂ、図５ｃは、夫々、ＳｉＲｐＨ５のｐＨの異なる１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー（含１％ＤＭＳＯ）中における吸収、励起スペクトルを表す。図５ｄは、５８０ｎｍで励起した際の７００ｎｍの蛍光強度を６６３ｎｍで励起した際の蛍光強度で割った蛍光強度比（レシオ）のｐＨに対するプロットを示す。このプロットから、プロトン化反応のｐＫａ＝６．１と算出された。
　ＳｉＲｐＨ５はＳｉＲｐＨ４と同様の光学特性を示したが、パラ位スルホン基のためにＳｉＲｐＨ４と比べてレシオ値変化のｐＫａは酸性側にシフトし、酸性オルガネラの測定に適した値を示した。
　１００ｍＭナトリウムリン酸バッファー中で測定したＳｉＲｐＨ５の光学特性を表３に示す。
　ＳｉＲｐＨ５は約５９０ｎｍと約６７０ｎｍに吸収極大を有し、蛍光プローブとして十分な蛍光量子収率を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　図６に、各化合物のレシオ値対ｐＨのプロットを示す。以上のように、ベンジル基上に様々な置換基を導入することで、ｐＨプローブのｐＫａを自由に調整できることが示された。細胞内のオルガネラはそれぞれ固有のｐＨを持っているため、本ｐＨプローブ母核を利用して各オルガネラのｐＨ測定に適したｐＫａを有するｐＨプローブを開発・使用することで、より正確に各オルガネラのｐＨ測定ができると考えられる。
生体高分子標識部位を導入したＳｉＲｐＨ５の合成
［実施例９］
　ＰＥＧリンカーを介してＮ－ヒドロキシスクシニルイミジルエステルを有し、生体高分子のアミノ基と共有結合を形成できるＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＳＥ（化合物６）を以下のスキーム６により合成した。
スキーム６
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
工程（ａ）及び（ｂ）
　フラスコにＳｉＲｐＨ５（１５ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（２．２ｍｇ、１８．９μｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（３．６ｍｇ、１８．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた後にＤＩＰＥＡ（６．６μＬ、３７．８μｍｏｌ）を添加し、室温で２０時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ（溶離液、２８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、溶媒を減圧留去した。残渣にＮＨ２－ＰＥＧ６－ＯＨ（４．９ｍｇ、１３．７μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２５μＬ、０．１４ｍｍｏｌ）、水（５０μＬ）を加えて室温で１５時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ（溶離液、２８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、溶媒を減圧留去した（ＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＯＨ）。残渣にＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４ｍｇ、３５μｍｏｌ）、ＥＤＣ塩酸塩（６．７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３ｍＬ）を加えた後にＤＩＰＥＡ（２０μＬ、３７．８μｍｏｌ）を添加し、室温で１７時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ（溶離液、２４％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から４４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、ＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＳＥ（４．１ｍｇ、３．４４μｍｏｌ、収率２７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
［実施例１０］
ＰＥＧリンカーを介してベンジルグアニン構造を有し、ＳＮＡＰ－Ｔａｇタンパクと共有結合を形成できるＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＢＧ（化合物７）を以下のスキーム７により合成した。
スキーム７
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
工程（ａ）
　フラスコにＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＳＥ（１．８ｍｇ、１．３８μｍｏｌ）、ＢＧ－ＮＨ２（１．１ｍｇ、４．１４μｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）を加えた後にＤＩＰＥＡ（１．４μＬ、８．２８μｍｏｌ）を添加し、室温で４時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ（溶離液、１６％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から４８％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、ＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＢＧ（１．７ｍｇ、１．１６μｍｏｌ、収率８４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
［実施例１１］
ＳｉＲｐＨ５を用いた細胞内オルガネラのｐＨ測定
（Ａ）リソソームのｐＨ測定
　多糖類であるデキストランを細胞外液に添加して細胞内に取り込ませた後に数時間インキュベーションを行うことで、デキストランをリソソーム選択的に集積させられると知られている。本プローブを用いてリソソームのｐＨ測定を行うため、ＳｉＲｐＨ５を１０ｋＤａアミノデキストランに標識したＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘを作成した。
（１）作成方法
　反応容器に１０ｋＤａアミノデキストラン（１．３ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（４６０μＬ）を加えた。その後、ＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＳＥ（０．６４μｇ、０．４９μｍｏｌ）を１６０μＬのＤＭＳＯに溶解させた溶液を添加し、室温で４時間攪拌した。反応液をＰＤ－１０ゲル濾過カラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、凍結乾燥させてＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘを得た。１０ｍｇ／ｍＬのＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘ水溶液を調整し、吸光度を測定することでプローブの平均ラベル化率は２．６ｎｍｏｌプローブ／１ｎｍｏｌ　Ｄｅｘｔｒａｎと決定した。
（２）リソソームのｐＨ測定
（ａ）実験のイメージ図（図７ａ参照）：ＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘをリソソームに集積させ、その後リソソーム塩基性試薬である塩化アンモニウム水溶液を添加することでリソソームのｐＨを塩基性化させる。
（ｂ）ＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘをロードした細胞を１０％ホルマリンで固定化し、細胞外液をｐＨ４．５－７．４のリン酸ナトリウム緩衝液に交換し、撮像を行い作成した細胞内ｐＨの検量線を図７ｂに示す。
（ｃ）２００μｇ／ｍＬのＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘを含む培地でＭＥＦ細胞を２時間インキュベーションし、その後プローブを含まない培地と交換し、３時間インキュベーションを行った。共焦点顕微鏡で観察を行うと、リソソームマーカータンパク質であるＶａｍｐ７と黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの融合タンパクの近傍からＳｉＲｐＨ５－Ｄｅｘ由来の蛍光が観察された（図７ｃ）。点線で囲った部位のレシオ値から検量線を用いてｐＨを計算すると、４．７と算出された。その後、最終濃度３３ｍＭの塩化アンモニウム水溶液を添加したところ、リソソームのｐＨは６．２まで塩基性化したことが分かった。これらの値は報告されているリソソームのｐＨや塩基性化試薬添加後のリソソームのｐＨと同程度であることから、本発明を用いて生細胞内のｐＨ測定が行えることが分かった。
（Ｂ）リサイクリングエンドソームのｐＨの測定
　鉄輸送タンパク質であるトランスフェリン（Ｔｆｎ）はトランスフェリン受容体（ＴｆｎＲ）を介してエンドサイトーシスされて初期エンドソームへ輸送され、その後リサイクリングエンドソームへ輸送されることが知られている。本プローブを用いてリサイクリングエンドソームのｐＨ測定を行うため、鉄イオン－トランスフェリン複合体であるホロトランスフェリンにＳｉＲｐＨ５を標識したＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎを作成した。
（１）作成方法
　反応容器にＨｏｌｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（９．０４ｍｇ、０．１１３μｍｏｌ）、１０００μＬの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えた。その後、ＳｉＲｐＨ５－ＰＥＧ６－ＳＥ（１．１８ｍｇ、０．９１μｍｏｌ）を２００μＬのＤＭＳＯと８００μＬの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解させた溶液を反応容器に添加し、室温で１時間攪拌した。反応液をＰＤ－１０ゲル濾過カラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、凍結乾燥させてＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎを得た。５ｍｇ／ｍＬのＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎ水溶液を調整し、吸光度を測定することでプローブの平均ラベル化率は７．３ｎｍｏｌプローブ／１ｎｍｏｌＴｆｎと決定した。
（２）リサイクリングエンドソームのｐＨ測定
（ａ）実験のイメージ図（図８ａ参照）：ＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎをリサイクリングエンドソーム（ＲＥ）に集積させ、ｐＨ測定を行う。
（ｂ）ＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎをロードした細胞を４％ホルムアルデヒドで固定化し、細胞外液をｐＨ４．０－７．４のＨＥＰＳバッファーに交換し、撮像を行うことで作成した細胞内ｐＨの検量線を図８ｂに示す。
（ｃ）２５μｇ／ｍＬのＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎを含むバッファー中でＣＯＳ－１細胞を５０分間インキュベーションし、その後プローブを含まないバッファーと交換し、１５分間インキュベーションを行い、共焦点顕微鏡で撮像した（図８ｃ）。リサイクリングエンドソームのマーカータンパク質であるＲａｂ１１と緑色蛍光タンパク質ＧＦＰの融合タンパクと重なる部位からＳｉＲｐＨ５－Ｔｆｎ由来の蛍光が観察された。点線で囲ったリサイクリングエンドソームのレシオ値から検量線を用いてｐＨを計算すると、５．８と算出された。この値は報告されているリサイクリングエンドソームの値と同程度であった。
このことから、プローブを標識するタンパク質を変えることで、様々な細胞内小器官のｐＨ測定が行えると考えられる。
　実施例で示したように、ピペラジン環アミノ基上に電子求引性置換基を導入することにより、ｐＨプローブのｐＫａを容易に調整可能であると分かった。例えば、ベンジル基のベンゼン環上に電子求引基や電子供与性基を導入することで、さらにｐＫａを低下させたり、あるいは上昇させたりといった調整が可能と考えられる。
　実施例においてｐＨプローブの母核として用いた蛍光団Ｓｉローダミンは高い蛍光量子収率、光褪色耐性を示す蛍光色素である。そのため、従来の蛍光量子収率の低いｐＨプローブでは困難であった少量の分子で標識した標的分子の精度の高いイメージングや、長時間の励起光照射を必要とするタイムラプスイメージングが本発明によって達成可能となる。また、環境感受性が低いことから、細胞内の様々なオルガネラにおいて信頼性の高いｐＨ測定が可能になると期待される。さらに、ｐＨプローブのｐＫａを任意に調整することが可能であるため、生物学研究者が観察したい細胞内生命現象が生じるｐＨに合わせて、酸性から塩基性まで様々なｐＨ領域の可視化に適したｐＨプローブの開発が可能となる。
　以上のように、本発明のｐＨプローブは、様々な生命現象の詳細な解析に向けて有用なツールとなることが期待される。

Claims (27)

  1. 　以下の一般式（Ｉ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし３個の同一又は異なる一価の置換基を示し； 
    Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく；
    Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
    Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
    Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
    Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
    Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
    ｍは、０～６の整数である。）
    で表される化合物又はその塩。
  2. 　Ｙが置換又は無置換のフェニル基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 　Ｙがフェニル基、フッ素原子で置換されたフェニル基、又はスルホニル基で置換されたフェニル基である、請求項２に記載の化合物又はその塩。
  4. 　ｍが０又は１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  5. 　Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  6. 　Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、請求項５に記載の化合物又はその塩。
  7. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂにおける一価の置換基が、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  8. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は水素であり、他方は炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項７に記載の化合物又はその塩。
  9. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基である、請求項７に記載の化合物又はその塩。
  10. 　以下の一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中、
    Ｒ１～Ｒ２ｂ、Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉ）で定義したとおりであり、Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。）
    で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  11. 　Ｙが置換又は無置換のフェニル基である、請求項１０に記載の化合物又はその塩。
  12. 　Ｙがフェニル基、フッ素原子で置換されたフェニル基、又はスルホニル基で置換されたフェニル基である、請求項１１に記載の化合物又はその塩。
  13. 　ｍが０又は１である、請求項１１又は１２に記載の化合物又はその塩。
  14. 　Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基から選ばれる請求項１０～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  15. 　Ｒ１の少なくとも１つは、カルボキシ基、カルボキシル基を有するアルキル基、アミノ基、アミド基である、請求項１４に記載の化合物又はその塩。
  16. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂにおける一価の置換基が、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  17. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は水素であり、他方は炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルコキシ基又はハロゲン原子である、請求項１６に記載の化合物又はその塩。
  18. 　Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が炭素数１～６個のアルキル基である、請求項１６に記載の化合物又はその塩。
  19. 　以下の一般式（Ｉａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中、
    Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
    Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
    Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
    Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
    Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
    ｍは、０～６の整数であり；
    Ｘ’は、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
    Ｔは、架橋基を示し、該架橋基は、その片方または両方の端部に、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、ラベル部位又は標的集積部位と結合することができる官能基を有してもよい；
    Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
    （ｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく、又は
    （ｉｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであり、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基であり；
    ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３であり、ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－Ｔであり、他方は、一価の置換基である。）
    で表される、化合物又はその塩。
  20. 　以下の一般式（ＩＩａ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    （式中、
    Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉａ）で定義した通りであり；
    Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｘ’、Ｔ、Ｒ１’、Ｒ２ａ～Ｒ２ｂ、ｎ及びｐは一般式（Ｉａ）で定義した通りである。）
    請求項１９に記載の化合物又はその塩。
  21. 　－Ｘ’－Ｔは、以下から選択される、請求項１９又は２０に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
  22. 　以下の一般式（Ｉｂ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （式中、
    Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ５及びＲ６は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は存在せず、
    Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ５及び－Ｒ６の一方は、＝Ｏであってもよい；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
    Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく； 
    Ｙは、置換又は無置換のアリール基又はヘテロアリール基を示し；
    Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示し；
    ｍは、０～６の整数であり；
    Ｘ’は、生体高分子標識部位を導入することが可能な官能基がＴと結合した後の構造を示し；
    Ｔ’は、存在する場合は、架橋基がＳと結合した後の構造であり；
    Ｓは。ラベル部位又は標的集積部位を示し；
    Ｒ１’は、水素、又は同一又は異なる一価の置換基であり；
    Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、
    （ｉ）それぞれ独立に、水素又は一価の置換基を示し、但し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が水素ではなく、又は
    （ｉｉ）Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであり、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの他方は、一価の置換基であり；
    ｎは０～２の整数であり、ｐは１～３の整数であり、但し、ｎ＋ｐ＝３であり、ここで、ｎが０の場合は、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの一方は、Ｘ’－（Ｔ’）－Ｓであり、他方は、一価の置換基である。）
    で表される化合物又はその塩。
  23. 　以下の一般式（ＩＩｂ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （式中、
    Ｒ４～Ｒ８、Ｒ１０、Ｘ、Ｙ及びｍは、一般式（Ｉｂ）で定義した通りであり；
    Ｒ１１～Ｒ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｘ’、Ｔ’、Ｒ１’、Ｓ、Ｒ２ａ～Ｒ２ｂ、ｎ及びｐは一般式（Ｉｂ）で定義した通りである。）
    で表される、請求項２３に記載の化合物又はその塩。
  24. 　－Ｓは、以下から選択される、請求項２２又は２３に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
  25. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
  26. 　細胞内の酸性領域の測定方法であって、
    （ａ）請求項１～２４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
    （ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
    を含む方法。
  27. 　細胞内酸性小器官の存在する酸性領域を測定する請求項２６に記載の方法。
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