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WO2016152812A1 - 標的核酸の高感度検出方法 - Google Patents

標的核酸の高感度検出方法 Download PDF

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WO2016152812A1
WO2016152812A1 PCT/JP2016/058852 JP2016058852W WO2016152812A1 WO 2016152812 A1 WO2016152812 A1 WO 2016152812A1 JP 2016058852 W JP2016058852 W JP 2016058852W WO 2016152812 A1 WO2016152812 A1 WO 2016152812A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
target nucleic
mismatch
oligonucleotide
hybridized
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/058852
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English (en)
French (fr)
Inventor
上森　隆司
武宏 相良
井上　晃一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Inc
Original Assignee
Takara Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US15/558,348 priority patent/US20180163263A1/en
Priority to CN201680028826.6A priority patent/CN107614681A/zh
Priority to JP2017508335A priority patent/JP6914831B2/ja
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]

Definitions

  • the present invention relates to a method for highly sensitive detection of a target nucleic acid in which at least one oligonucleotide that selectively suppresses nucleic acid amplification of a non-target nucleic acid and a polypeptide having mismatched endonuclease activity are combined.
  • Inherited and acquired diseases are known to be associated with genetic mutations such as base substitutions, deletions and insertions. Some of these mutations are directly related to the presence of the disease, while others correlate with disease risk and / or prognosis. Among them, in diseases in which the wild type gene changes to a mutant gene as the disease progresses, or in diseases in which an increase in cells having the mutant gene is observed, the presence of the mutant gene can be examined. It becomes important.
  • Examples of acquired diseases associated with the gene mutation and related gene mutations include lung cancer and EGFR gene mutation or K-ras gene mutation, lung squamous cell cancer and DDR2 gene mutation, colon cancer and K-ras gene mutation, Examples include PIK3CA gene mutation or B-raf gene mutation, gastric cancer and Kit gene mutation, and PDGFRA gene mutation.
  • the reverse case of the above case may be possible.
  • this is the case when monitoring the situation where the mutant gene decreases and the wild type gene increases. Examples include detection of minute residual lesions.
  • the restriction enzyme fragment length polymorphism method has been conventionally used as a method for analyzing these gene mutations.
  • the operation is complicated and requires a long time, and the bases near the single nucleotide polymorphism (SNP) site are used.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the PCR method is a very effective tool for detecting a mutant gene as a target nucleic acid.
  • concentration of the amplification product increases, the competition between the annealing of the amplification products and the annealing of the primer increases, and finally the primer cannot be annealed and the reaction reaches a plateau.
  • amplified fragments of target nucleic acids containing SNPs and short deletions and insertions will anneal with amplified fragments of non-target nucleic acids that are present in large excess, so when the amplification reaction reaches a plateau, The abundance ratio of the amplified fragment is lower than that before the reaction.
  • Non-patent Document 1 Enriched PCR method
  • Non-Patent Documents 2, 3 Restriction Endonuclease-Mediated Selective PCR method
  • Patent Document 1 a restriction enzyme recognition / cleavage site is introduced into the primer containing the base sequence of the mutation site of the target gene, the amplification of the wild-type gene is suppressed, and the mutant gene is selectively amplified.
  • restriction enzymes that recognizes and cleaves the mutation site of the target gene to be analyzed, and the restriction enzyme must recognize and cleave a wild type gene. Also, the restriction enzyme must not be inactivated during the PCR cycle. Restriction enzymes that satisfy these requirements are limited, and there is a problem that applicable wild-type genes and mutant genes are limited.
  • Non-patent Document 4 and Patent Document 2 As a method for amplifying nucleic acids of other wild-type genes and mutant-type genes, the Mutant Enrichment with 3'-modified oligonucleotides (MEMO) method (Non-patent Document 4 and Patent Document 2) has been proposed.
  • a 3 'end blocking primer containing a mutation site of the target gene is used.
  • This 3'-end blocking primer is characterized by 100% matching with the wild type gene but mismatching with the mutant gene.
  • annealing and extension of the amplification primer are inhibited in nucleic acid amplification of the wild type gene.
  • annealing and extension of the amplification primer are not inhibited due to instability due to mismatch occurring with the 3 'end blocking primer.
  • priority is given to nucleic acid amplification of mutant genes. Detection by this method is performed by melting curve analysis or sequencing.
  • it is necessary to hybridize the 3 'end blocking primer so as to inhibit only the primer extension reaction of the wild type gene, and it is necessary to strictly control the temperature during the nucleic acid amplification reaction.
  • the initial amount of wild-type gene present in large quantities in the original sample remains retained, and unexpected amplification of the nucleic acid of the wild-type gene cannot be reduced.
  • Patent Document 3 a mutation detection method using a thermostable mismatch endonuclease (Patent Document 3) has been reported. However, these methods still have problems in suppressing nucleic acid amplification of wild-type genes, selectively amplifying mutant genes, and accurately detecting only the presence of mutant genes.
  • An object of the present invention is to provide a highly sensitive detection method for a small amount of a target nucleic acid with respect to a non-target nucleic acid.
  • the present inventors analyzed the characteristics of a polypeptide having a mismatch endonuclease activity for recognizing and cleaving a mismatch site, particularly the correlation between the type and position of the mismatch and the cleavage activity. As a result, the present inventors have found a method capable of cleaving any one of two types of nucleic acids having different bases in the sequence without being limited to the types of different bases. In addition, by processing a sample containing a large amount of non-target nucleic acid and a rare target nucleic acid by this method, it becomes possible to selectively cleave the non-target nucleic acid and selectively amplify the rare target nucleic acid. The present invention has been completed by finding a method and a highly sensitive detection method for a target nucleic acid using the nucleic acid amplification method.
  • the first invention of the present invention is a method for selectively cleaving a non-target nucleic acid in a sample containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid having a region of a base sequence homologous to the target nucleic acid, (I) at least one mismatch occurs when hybridized with a non-target nucleic acid, and more mismatches than occurs when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid An oligonucleotide; and (ii) a polypeptide having mismatch endonuclease activity; In contact with a sample.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which base substitution has occurred in the base sequence of the target nucleic acid, and at least when the oligonucleotide is hybridized with the non-target nucleic acid. It may be an oligonucleotide that causes one mismatch and that, when hybridized with the target nucleic acid, causes a mismatch corresponding to the mismatch and at least one other mismatch.
  • the oligonucleotide is an oligonucleotide that generates one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid and generates a mismatch corresponding to the mismatch and another mismatch when hybridized with a target nucleic acid. May be.
  • two mismatches produced when the target nucleic acid and the oligonucleotide are hybridized are adjacent to each other or located at intervals of up to 5 bases.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which a base is inserted into the base sequence of the target nucleic acid
  • the oligonucleotide is a non-target nucleic acid Examples include a method of using an oligonucleotide that generates at least one mismatch when hybridized to a region containing the inserted base sequence.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which a base deletion has occurred in the base sequence of the target nucleic acid
  • the oligonucleotide has a site in which the non-target nucleic acid has been deleted.
  • a polypeptide derived from thermostable bacteria or a variant thereof can be used as the polypeptide having mismatch endonuclease activity.
  • the present invention can be carried out in the presence of an acidic polymer substance. Further, it may be performed in combination with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • a second invention of the present invention is a method for selectively amplifying a target nucleic acid in a sample containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid having a region of a base sequence homologous to the target nucleic acid, comprising the following steps: A method characterized by comprising: (1) a step of cleaving a non-target nucleic acid in a sample by the method of the first invention; and (2) a step of amplifying the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid can be amplified by PCR.
  • a third invention of the present invention is a method for selectively detecting a target nucleic acid in a sample containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid having a region of a base sequence homologous to the target nucleic acid, comprising the following steps: A method characterized by comprising: (1) a step of selectively amplifying a target nucleic acid by the method of the second invention; and (2) a step of detecting the target nucleic acid simultaneously with the step (1) or after the step (1).
  • the target nucleic acid can be detected by the cycling probe method or the TaqMan (registered trademark) method.
  • a fourth invention of the present invention is a composition for the second or third invention of the present invention, (A) at least one mismatch occurs when hybridized with a non-target nucleic acid, and more mismatches than occurs when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid Oligonucleotides; (B) at least a pair of oligonucleotide primers; A composition comprising (c) a polypeptide having mismatch endonuclease activity; and (d) a polypeptide having DNA polymerase activity.
  • a fifth invention of the present invention is a kit for the second or third invention of the present invention, (A) at least one mismatch occurs when hybridized with a non-target nucleic acid, and more mismatches than occurs when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid Oligonucleotides; (B) at least a pair of oligonucleotide primers; A kit containing (c) a polypeptide having mismatch endonuclease activity; and (d) a polypeptide having DNA polymerase activity.
  • an acidic polymer substance may further be included.
  • the polypeptide having mismatch endonuclease activity and the polypeptide having DNA polymerase activity may be heat-resistant polypeptides or mutants. Further, it may contain proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • a sixth invention of the present invention selectively selects a non-target nucleic acid in a sample containing a target nucleic acid in the presence of an acidic polymer substance and a non-target nucleic acid having a base sequence that differs from the target nucleic acid by at least one base.
  • a method of cutting (I) acidic polymer substance; (Ii) a polypeptide having mismatch endonuclease activity; and (iii) producing at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid and hybridizing with the non-target nucleic acid when hybridized with the target nucleic acid.
  • a method comprising contacting a sample with an oligonucleotide that produces more mismatches than the mismatches that occur.
  • the polypeptide having mismatched endonuclease activity may be a heat-resistant polypeptide or a mutant. Moreover, you may implement combining a proliferation cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferation cell nuclear antigen
  • the present invention provides a method capable of suppressing nucleic acid amplification of a non-target nucleic acid and selectively amplifying the target nucleic acid for a sample in which a large amount of non-target nucleic acid and a rare target nucleic acid are mixed.
  • a method that enables detection of a rare mutant gene with high sensitivity is provided.
  • FIG. 2 is a real-time detection result of a sample containing a non-target nucleic acid and a target nucleic acid in each abundance ratio prepared in Example 1.
  • FIG. 3 is a result of real-time detection of a sample containing a non-target nucleic acid and a target nucleic acid in each abundance ratio prepared in Example 2.
  • FIG. It is the real-time detection result which showed the effect (in the absence of sodium alginate) of the acidic polymer substance in the cutting method of the present invention of Example 3. It is a real-time detection result which showed the effect (in the presence of 56 ⁇ g / ml sodium alginate) of the acidic polymer substance in the cleavage method of the present invention in Example 3.
  • a mismatch is a base pair different from the Watson-Crick base pair present in a double-stranded nucleic acid, that is, G (guanine base) -C (cytosine base), A (adenine base) -T (thymine).
  • Base or U (uracil base) represents a base bond of a combination other than the base pair bond.
  • the target nucleic acid refers to any nucleic acid desired to be detected (for example, a nucleic acid constituting a natural gene or an artificially produced nucleic acid).
  • the present invention is useful for distinguishing the target nucleic acid from a non-target nucleic acid having a similar base sequence.
  • DNA is suitable for the target nucleic acid and non-target nucleic acid in the present invention.
  • target nucleic acid and non-target nucleic acid include a combination of a nucleic acid derived from a mutant gene and a nucleic acid derived from a wild-type gene corresponding to the mutant gene, a nucleic acid after artificial mutagenesis, and a nucleic acid before mutagenesis.
  • the target nucleic acid and non-target nucleic acid in the combination may be interchanged depending on which of the above exemplified nucleic acids is set as the target nucleic acid.
  • a non-target nucleic acid having a region of a base sequence homologous to a target nucleic acid includes a base sequence homologous to at least a part of the base sequence of the target nucleic acid in the base sequence of the non-target nucleic acid.
  • Non-target nucleic acids having a base sequence non-target nucleic acids having a base sequence in which a deletion of one or more bases has occurred in the base sequence of the target nucleic acid, and the like.
  • the number of base substitutions, insertions or deletions in the homologous sequence is not particularly limited. However, in the present invention, if there is at least one base difference between the base sequence of the target nucleic acid and the non-target nucleic acid, the nucleic acid can be distinguished. Further, as the number of different bases increases, the discrimination accuracy between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid can be improved.
  • a non-target nucleic acid is selectively cleaved in a mixture of a target nucleic acid and a non-target nucleic acid having a base sequence region homologous to the target nucleic acid.
  • the method produces at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid and more mismatches than occurs when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid.
  • a polypeptide having mismatched endonuclease activity are used.
  • the number of at least one mismatch that occurs when the inhibitory oligonucleotide is hybridized with the non-target nucleic acid is not particularly limited as long as selective cleavage of the non-target nucleic acid occurs, and depends on the chain length of the inhibitory oligonucleotide. Is, for example, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3 and the like. Further, when the number of mismatches is expressed as a percentage of the chain length of the inhibitory oligonucleotide, it ranges from 1 to 20%, 3 to 15%, or 4 to 8%, for example. This embodiment will be described by taking as an example a combination of a target nucleic acid and a non-target nucleic acid that differ only in one base in the base sequence.
  • mismatch occurs between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid (hereinafter sometimes referred to as the first mismatch), and another Another mismatch (hereinafter, sometimes referred to as a second mismatch) is generated.
  • the base of the first mismatch is related to a base different between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid, and it does not matter whether the base is recognized or cleaved by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity. .
  • the second mismatch is a mismatch base that is recognized and cleaved by a polypeptide having a coexisting mismatch endonuclease activity.
  • a polypeptide having a mismatch endonuclease activity that recognizes and cleaves guanine base-guanine base, guanine base-thymine base, or thymine base-thymine base, a mismatch selected from these forms. Inhibiting oligonucleotides are designed to do so.
  • the suppression oligonucleotide when the suppression oligonucleotide is hybridized with a non-target nucleic acid, the second mismatch occurs, but the first mismatch does not occur.
  • a suppressor oligonucleotide having the above properties By designing and using a suppressor oligonucleotide having the above properties, it is possible to selectively cleave non-target nucleic acids with a polypeptide having mismatch endonuclease activity.
  • the present invention is not limited to the use of an inhibitory oligonucleotide that can form one or two mismatches as described above, but an inhibitory oligo that produces three or more mismatches within a range where selective cleavage of a desired nucleic acid occurs. Nucleotides may be designed and used.
  • At least one mismatch occurring in the target nucleic acid and the non-target nucleic acid may be the second mismatch, and whether or not other mismatches are recognized and cleaved by the polypeptide having mismatch endonuclease activity is asked. Absent.
  • the three or more mismatches are recognized and cleaved by a polypeptide having mismatch endonuclease activity.
  • the inhibitory oligonucleotide used in the method of the present invention is composed of DNA, but a part thereof may be a nucleotide analog or RNA. That is, it has a structure that forms a double-stranded nucleic acid having at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid, and is further recognized and cleaved by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity in which the mismatch coexists If it is, it will not be specifically limited.
  • the mismatch that the polypeptide having mismatch endonuclease activity originally recognizes is usually On the other hand, an oligonucleotide as formed is used.
  • a mismatch occurs in a region other than the base to be identified on the nucleic acid, and this is combined with the formation / non-formation of the mismatch based on the difference in the base. , Selective cleavage of one of the nucleic acids can occur.
  • the present invention when hybridizing with one of two nucleic acids differing by at least one base in the base sequence, at least one mismatch that is originally recognized by a polypeptide having mismatch endonuclease activity is formed,
  • an oligonucleotide having a base sequence that can form at least one mismatch derived from a different base in the base sequence of two nucleic acids is used.
  • oligonucleotide inhibitory oligonucleotide
  • a polypeptide having mismatch endonuclease activity By combining this oligonucleotide (inhibitory oligonucleotide) with a polypeptide having mismatch endonuclease activity, a double-stranded nucleic acid in which one mismatch has occurred is cleaved by the polypeptide, but two or more mismatches have occurred. Such cleavage does not occur with double stranded nucleic acids.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which base substitution has occurred in the base sequence of the target nucleic acid, and at least 1 when hybridized with the non-target nucleic acid. Characterized in that an oligonucleotide that produces two mismatches and, when hybridized with a target nucleic acid, produces a mismatch corresponding to the mismatch and at least one other mismatch, and a polypeptide having mismatch endonuclease activity are contacted with the sample. The method of doing is mentioned.
  • the oligonucleotide generates one mismatch (second mismatch) when hybridized with a non-target nucleic acid or a complementary strand thereof, and the hybrid when the oligonucleotide is hybridized with a target nucleic acid or a complementary strand thereof. Also included is a mismatch corresponding to a mismatch and another mismatch (first mismatch).
  • the base of the base mutation site (eg, SNP) of a mutant gene cannot form a mismatch that is originally recognized by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity
  • the SNP of the mutant gene used as the target nucleic acid
  • an inhibitory oligonucleotide having a base sequence that forms another mismatch near the SNP site can be prepared.
  • the other mismatch mentioned above is a mismatch that can be recognized and cleaved by a polypeptide that is formed from a base unrelated to SNP, that is, a base common to a mutant type gene and a wild type gene, and has a mismatch endonuclease activity. .
  • the base corresponding to the base of the SNP site of the suppression oligonucleotide is assumed to be correctly paired with the base of the wild type gene.
  • a double-stranded nucleic acid formed by hybridizing a suppressor oligonucleotide to a nucleic acid of a wild type gene is formed with one mismatch that can be cleaved by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity. Is selectively disconnected.
  • the nucleic acid of the mutant gene two mismatches are formed, so that the inhibitory oligonucleotide cannot be stably hybridized, and further, the cleavage by the polypeptide is hindered.
  • the method of the present invention is characterized in that the selective cleavage of the wild-type gene by the polypeptide having mismatch endonuclease activity is performed at a position different from the base mutation site of the coexisting mutant gene.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which a base is inserted into the base sequence of the target nucleic acid, and the oligonucleotide is inserted into the non-target nucleic acid.
  • a method comprising contacting a sample with an oligonucleotide that produces at least one mismatch when hybridized to a region containing a base sequence and a polypeptide having mismatch endonuclease activity.
  • the region to which the oligonucleotide (suppression oligonucleotide) hybridizes is selected from the region that does not exist in the target nucleic acid but exists in the non-target nucleic acid.
  • the hybridizing region may be a region spanning a region that does not exist in the target nucleic acid and a region that exists.
  • Such a suppression oligonucleotide is designed so that, when hybridized with a non-target nucleic acid, at least one mismatch that is recognized and cleaved by a polypeptide having at least a mismatch endonuclease activity is formed. Oligonucleotides designed in this way are destabilized in double-stranded nucleic acids by forming more mismatches with target nucleic acids that do not have base sequences inserted into non-target nucleic acids, or target nucleic acids Cannot hybridize with. Further, in the case of causing a mismatch, there is no limitation on the arrangement of the mismatch.
  • the non-target nucleic acid has a base sequence in which a base deletion has occurred in the base sequence of the target nucleic acid, and the non-target nucleic acid has such a deletion.
  • examples include a method comprising contacting a sample with an oligonucleotide that produces at least one mismatch when hybridized to a region including the generated site and a polypeptide having mismatch endonuclease activity.
  • the region where the oligonucleotide (suppression oligonucleotide) hybridizes is selected from the region including the site where the deletion occurs on the non-target nucleic acid.
  • the inhibitory oligonucleotide is designed so that one or more mismatches that are recognized and cleaved by the polypeptide having mismatch endonuclease activity are formed when hybridized with a non-target nucleic acid. Oligonucleotides designed in this way are destabilizing double-stranded nucleic acids by forming more mismatches with target nucleic acids having base sequences that are lost in non-target nucleic acids, or target nucleic acids Cannot hybridize with. Further, in the case of causing a mismatch, there is no limitation on the arrangement of the mismatch.
  • the chain length of the suppression oligonucleotide used in the method of the present invention is preferably 7 bases or more, and is not particularly limited, but is in the range of 7 to 40 bases, preferably 10 to 30 bases, particularly preferably 11 to 25 bases. It is.
  • the base sequence of the suppression oligonucleotide causes at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid, and a mismatch generated when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid. Designed to produce more mismatches.
  • a mismatch is formed between bases that differ between the target nucleic acid and the non-target nucleic acid, and the position of the base.
  • a base sequence having at least one other mismatch base is preferably selected in the range of 5 bases to 3 ′ side, preferably in the range of 5 bases, particularly preferably in the range of 2 bases, or adjacent. That is, one in which two mismatches are arranged within 5 bases can be preferably used. Further, both mismatches are preferably set in a region close to the central base of the oligonucleotide.
  • a non-target nucleic acid for example, a nucleic acid derived from a wild-type gene
  • mismatches that occur between bases that differ between target nucleic acids and non-target nucleic acids when hybridized to target nucleic acids or their complementary strands are recognized and cleaved by polypeptides having mismatch endonuclease activity. Or not.
  • the method of the present invention can greatly expand the target of mutation detection as compared with the prior art using restriction enzymes and the like.
  • the 3 'end of this oligodeoxynucleotide may be modified to suppress the elongation reaction by DNA polymerase from this oligodeoxynucleotide.
  • modifications such as amination are exemplified.
  • the inhibitory oligonucleotide is used in combination with a polypeptide having a mismatch endonuclease activity optimal for recognition / cleavage of a mismatch base.
  • a polypeptide having a mismatch endonuclease activity optimal for recognition / cleavage of a mismatch base.
  • Pyrococcus furiosus-derived PF0012 polypeptide International Publication No. 2014/142261 pamphlet
  • a variant of the peptide sometimes collectively referred to as NucS protein
  • homologues derived from Pyrococcus abyssi GenBank Accession No.
  • a polypeptide having mismatch endonuclease activity derived from a thermostable bacterium for nucleic acid amplification and detection performed in parallel.
  • a polypeptide having mismatch endonuclease activity derived from a thermostable bacterium for nucleic acid amplification and detection performed in parallel.
  • those that maintain activity stably even during thermal cycles such as PCR are preferable, and polypeptides that do not inactivate at 50 ° C or higher, more preferably 70 ° C or higher, more preferably 90 ° C or higher are used. it can.
  • the method of the present invention can be carried out in the presence of an acidic polymer substance.
  • the acidic polymer substance has been confirmed to have an effect of controlling the mismatch recognition / cleavage activity of the polypeptide when it coexists. This effect is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance is preferably a polyanion.
  • acidic polysaccharides having a sugar skeleton or acidic polysaccharides having a linear carbon chain are preferred.
  • acidic polymer substances include fucose sulfate-containing polysaccharides, dextran sulfate, carrageenan, heparin, rhamnan sulfate, dermatan sulfate (chondroitin sulfate B), heparan sulfate, hyaluronic acid, alginic acid, pectin, polyglutamic acid, polyacrylic acid, polyvinyl sulfate, One or more selected from the group consisting of polystyrene sulfate and salts thereof, or a nucleic acid different from the target nucleic acid and the non-target nucleic acid can be used.
  • the method of the present invention may be further performed in combination with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the method for selectively amplifying a nucleic acid according to the present invention is a method in which two types of nucleic acids (target nucleic acid and non-target nucleic acid) having similar base sequence regions exist.
  • Each of the two steps may be performed stepwise, or both steps may be performed simultaneously. That is, in the latter, it is sufficient that the non-target nucleic acid is cleaved during the nucleic acid amplification reaction.
  • a non-target nucleic acid is selectively cleaved with a polypeptide having mismatch endonuclease activity, and the target nucleic acid is selectively amplified as a result of a decrease in the abundance ratio thereof.
  • a known nucleic acid amplification method can be used for the nucleic acid amplification step, but a nucleic acid amplification method through an environment in which the suppression oligonucleotide can hybridize with a non-target nucleic acid is preferable.
  • the PCR method can be used in the method of the present invention, but is not limited thereto.
  • nucleic acid amplification can be carried out in the presence of an acidic polymer substance.
  • the efficiency of nucleic acid amplification is improved and the non-target nucleic acid is recognized and cleaved by a polypeptide having mismatch endonuclease activity. Efficiency improvements can be achieved at the same time. This effect is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the description of the method for selective cleavage of a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be performed in combination with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the selective detection method of target nucleic acid of the present invention includes (1) a step of amplifying a target nucleic acid by the selective amplification method of target nucleic acid of the present invention, and (2) A step of detecting a target nucleic acid simultaneously with the step (1) or after the step (1).
  • the detection method is applied to a sample containing a large amount of non-target nucleic acid and a small amount of target nucleic acid, the abundance ratio of the non-target nucleic acid and the target nucleic acid in the starting sample and the abundance ratio in the detection step are reversed.
  • the target nucleic acid can be detected with high sensitivity by amplifying the target nucleic acid while suppressing amplification of the non-target nucleic acid.
  • step (2) may be performed after step (1), or both steps may be performed simultaneously.
  • the detection method in the step (2) may be a method for detecting or quantifying the amplified product, or a method for detecting the amplified product in a specific base sequence.
  • a direct sequence method or a high resolution melting curve analysis (HRM) method using an intercalator can be used.
  • HRM high resolution melting curve analysis
  • it can be combined with a cycling probe method using a sequence-specific probe (for example, International Publication No. WO2003 / 074696) or a TaqMan® assay method (for example, International Publication No. WO92 / 02638).
  • a sequence-specific probe for example, International Publication No. WO2003 / 074696
  • TaqMan® assay method for example, International Publication No. WO92 / 0263
  • the primer pair used in the PCR method should be designed so that a region containing a sequence that is different between both nucleic acids in the target nucleic acid and non-target nucleic acid (that is, a region where the suppressor oligonucleotide can hybridize) is amplified. Good. Primer design and synthesis can be carried out by known methods.
  • a polypeptide having ribonuclease H activity is allowed to coexist in the detection system.
  • the polypeptide having the ribonuclease H activity is preferably heat-resistant.
  • derived from Bacillus caldotenax derived from Pyrococcus furiosus, derived from Pyrococcus horikoshii, derived from Archaeoglobus fulgidus, derived from Thermococcus literomas, Thermococcusthermoceticum, Thermococcus.
  • target nucleic acids can be detected separately from non-target nucleic acids.
  • a probe chimeric oligonucleotide probe
  • the chimeric oligonucleotide probe is preferably one in which one is a fluorescent substance and the other is labeled with a substance (quencher) that quenches the fluorescence emitted by the fluorescent substance with the RNA portion interposed therebetween.
  • Examples of the combination of the substances include 6-FAM (6-carbofluorescein) and DABCYL (4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfone), ROX (6-carboxy-X-rhodamine) and DABCYL, 6-FAM and Ecipe ROX and Eclipse, TET (tetrachlorofluorescein) and DABCYL, TET and Eclipse, and the like can be suitably used.
  • the inhibitory oligonucleotide used in the method for selectively detecting a target nucleic acid of the present invention has the characteristics of the inhibitory oligonucleotide described in the method for selectively cleaving a non-target nucleic acid of the present invention, and is further used in the method for detecting a target nucleic acid. It is preferable to design so as not to be recognized and cleaved by a polypeptide having a mismatch endonuclease activity that coexists when hybridized with a probe.
  • the positive control nucleic acid is preferably a nucleic acid (for example, a housekeeping gene) of a gene different from the gene to be detected that is present in the sample from the beginning.
  • a primer pair for amplifying an arbitrary region of the gene and a detection probe are used in combination.
  • an artificial nucleic acid may be prepared and added to a sample in advance, for example, a nucleic acid in the same region as the target nucleic acid and non-target nucleic acid amplification region or a region different from the target nucleic acid and non-target nucleic acid amplification region. Also good.
  • artificial nucleic acid with a known amount added to the sample in advance as a positive control nucleic acid use a common primer pair if it can be amplified with the same primers as the target nucleic acid and non-target nucleic acid amplification regions. If the region is different from the nucleic acid amplification region, a primer pair for amplification of the region is used.
  • the probe for detecting the positive control nucleic acid one that can selectively detect these positive control nucleic acids is used. By detecting these positive control nucleic acids simultaneously with the detection of the target nucleic acid of the present invention, it is confirmed whether there is any abnormality in amplification in the detection system of the present invention, and a half of the initial amount of the target nucleic acid by comparing the amplification curves. Quantitative analysis is possible.
  • the detection method of the present invention can be carried out in the presence of an acidic polymer substance.
  • the effect of the acidic polymer substance is more effective when the amount of nucleic acid in the sample is small.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the description of the method for selective cleavage of a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be further performed in combination with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the detection method of the present invention makes it possible to distinguish and detect a wild-type gene and a mutant gene for a nucleic acid having a specific base sequence, for example, a nucleic acid corresponding to a gene known to have a mutation.
  • a nucleic acid having a base sequence of a mutant gene as a target nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence of a wild type gene as a non-target nucleic acid, a large excess of normal alleles ( That is, it becomes possible to detect a small number of mutant alleles in the presence of a DNA having a base sequence of a wild-type gene.
  • the method of the present invention is useful for detecting circulating tumor DNA in the blood and detecting a small amount of fetal DNA sequence contained in the blood of the mother.
  • the mutation include microdeletion and point mutation.
  • the nucleic acid having the specific base sequence includes a single nucleotide polymorphism mutation used as a tumor marker, and a single nucleotide polymorphism mutation correlated with the therapeutic effect of a cancer therapeutic drug.
  • Some SNPs are frequently observed in tumor cells, and others are known to be correlated with therapeutic effects and carcinogenesis by drugs for cancer treatment. Examples of such acquired gene mutations include K-ras gene, B-raf gene, and epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Somatic cell mutations in the K-ras gene are frequently observed in colorectal cancer, lung adenocarcinoma, thyroid cancer and the like.
  • B-raf gene somatic mutations are frequently observed in colorectal cancer, malignant melanoma, papillary thyroid cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and the like.
  • somatic mutations in the EGFR gene are frequently observed in various solid tumors. It is known that cancer treatment with EGFR inhibitors such as gefitinib and erlotinib is likely to be effective when the EGFR gene in cancer tissue has a specific single nucleotide polymorphism mutation. On the other hand, when the K-ras gene in cancer tissue has a single nucleotide polymorphism mutation, it is known that there is a high possibility of showing resistance to an EGFR inhibitor.
  • the detection method of the present invention can also be used for methylation analysis.
  • methylated DNA extracted from a biological sample may be used as a wild-type gene, and DNA obtained after treating the composition containing the wild-type gene with bisulfite may be used as a mutant gene.
  • a small number of methylated alleles in the presence of a large excess of unmethylated alleles, or a small number of unmethylated alleles in the presence of a large excess of methylated alleles are detected. Detection can be performed.
  • bisulfite method used for detection of methylated DNA.
  • the treatment converts unmethylated cytosine to uracil, but does not change methylated cytosine. Further, when this bisulfite-treated reaction solution is amplified by PCR, uracil is converted to thymine and methylated cytosine becomes cytosine.
  • detecting a small number of methylated alleles in the presence of a large excess of unmethylated alleles at a particular site, or detecting a small number of unmethylated alleles in the presence of a large excess of methylated alleles It is none other than verifying the presence of cytosine-containing nucleic acids in a large excess of thymine-containing nucleic acids, respectively, or the presence of thymine-containing nucleic acids in a large excess of cytosine-containing nucleic acids. If amplification from DNA containing thymine or cytosine present in a large excess can be suppressed, the presence of a small number of methylated alleles or unmethylated alleles can be easily verified.
  • the detection method of the present invention by adding a suppressive oligodeoxynucleotide that causes mismatch between a polypeptide having mismatch endonuclease activity and a wild type gene in a reaction solution, the amplification of the wild type gene is suppressed, and Rare mutant genes can be selectively amplified and easily detected.
  • the mismatch is not limited by the base type of the base mutation site by artificially setting at least one other mismatch at the position different from the original base mutation site and the mutation site.
  • a wide range of inhibitory oligonucleotides that can be recognized and cleaved by polypeptides having endonuclease activity can be designed.
  • composition for the target nucleic acid selective amplification method and / or target nucleic acid selective detection method of the present invention includes (a) when hybridized with a target non-target nucleic acid.
  • the composition may contain an acidic polymer substance.
  • the acidic polymer substance those exemplified in the description of the method for selective cleavage of a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • composition of the present invention may further contain proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • composition used in the method for selectively detecting a target nucleic acid of the present invention for detecting a target nucleic acid by PCR is a polypeptide having a ribonuclease H activity or a variant thereof, a cycling probe that is a chimeric oligonucleotide, Alternatively, a TaqMan probe may be included.
  • the polypeptide having mismatch endonuclease activity, the polypeptide having DNA polymerase activity, and the polypeptide having ribonuclease H activity may be selected from any of wild-type polypeptides and mutant polypeptides.
  • a Pfu-derived NucS protein mutant is preferred as the polypeptide having mismatched endonuclease activity.
  • a primer pair for detecting a positive control nucleic acid and a chimeric oligonucleotide probe or TaqMan probe may be combined.
  • Kit of the present invention The kit for the selective amplification method of the target nucleic acid and / or the selective detection method of the target nucleic acid of the present invention includes (a) at least one when hybridized with a non-target nucleic acid.
  • An oligonucleotide that produces a mismatch and produces more mismatches than the mismatches that occur when hybridized with the non-target nucleic acid when hybridized with the target nucleic acid (b) at least a pair of oligonucleotide primers, (c) Examples include kits containing a polypeptide having mismatch endonuclease activity or a variant thereof, and (d) a polypeptide having DNA polymerase activity or a variant thereof.
  • the kit of the present invention may further contain an acidic polymer substance, and an aqueous solution prepared at an appropriate concentration can be suitably used.
  • an acidic polymer substance those exemplified in the description of the method for selective cleavage of a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the kit of the present invention may further contain proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • the kit used in the method for selectively detecting a target nucleic acid of the present invention for detecting a target nucleic acid by PCR is a polypeptide having a ribonuclease H activity or a variant thereof, a cycling probe that is a chimeric oligonucleotide, or A TaqMan probe may be included.
  • the polypeptide having mismatch endonuclease activity, the polypeptide having DNA polymerase activity, and the polypeptide having ribonuclease H activity may be selected from any of wild-type polypeptides and mutant polypeptides.
  • a Pfu-derived NucS protein mutant is preferred as the polypeptide having mismatched endonuclease activity.
  • a primer pair for detecting a positive control nucleic acid and a chimeric oligonucleotide probe or TaqMan probe may be combined.
  • a method for selectively cleaving a non-target nucleic acid in a sample containing a non-target nucleic acid having a region homologous to the nucleic acid comprising: (i) an acidic polymer substance; (ii) a polypeptide having a mismatch endonuclease activity And (iii) at least one mismatch when hybridized with a non-target nucleic acid and more mismatches than when mismatched with a non-target nucleic acid when hybridized with a target nucleic acid
  • Exemplified is a method comprising the step of contacting an oligonucleotide that yields with a sample.
  • the acidic polymer substance the polypeptide having mismatch endonuclease activity, and the oligonucleotide, those exemplified in the description of the method for selective cleavage of a non-target nucleic acid of the present invention can be preferably used.
  • the method of the present invention may be further performed in combination with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • Example 1 Specific Amplification of Rare Contamination Mutant Gene EGFR T790M with Polypeptide Having Mismatch Endonuclease Activity
  • Detection Template GenBank accession No From the CDS sequence information of the Human EGFR gene published in NC — 000007, a DNA containing a base sequence corresponding to primers EGFR_T790M_F and EGFR_T790M_R described later, and a base sequence of a region sandwiched between both sequences was artificially synthesized. At this time, the base C at the base number 2369 in the EGFR gene was converted to T.
  • the codon corresponding to the 790th amino acid of EGFR in the artificially synthesized DNA is substituted from that of threonine (T) to that of methionine (M).
  • T threonine
  • M methionine
  • the obtained artificial synthetic gene was named EGFR codon 790 DNA and used as a mutant gene. This mutation is referred to as EGFR_T790M.
  • a mismatch base can be set at T790M.
  • genomic DNA was prepared from human cell HL60 as DNA having the base sequence of the wild type gene.
  • the target nucleic acid is EGFR_T790M DNA having a mutation at EGFR codon position 790
  • the non-target nucleic acid is HL60 genomic DNA.
  • This oligonucleotide was named inhibitory oligonucleotide T790M_NucG-1.
  • T790M_NucG-1 When the oligonucleotide hybridizes with the minus strand of the wild type gene of EGFR, a GG mismatch occurs at the G position complementary to C at the base number 2369 (plus strand).
  • a GA mismatch occurs at the position of A complementary to T.
  • a polypeptide having mismatch nucleotide-specific double-strand cleavage activity derived from Pyrococcus furiosus (hereinafter referred to as NucS protein) used as a polypeptide having mismatch endonuclease activity is a preparation example of International Publication No. 2014/142261 pamphlet 1 to 3 and a variant of PF0012 polypeptide into which W77F prepared by the method described in Example 1 is introduced.
  • FIG. 1 shows the result of a highly sensitive detection method for the T790M mutation in the EGFR gene, where the vertical axis indicates the fluorescence height and the horizontal axis indicates the number of PCR cycles.
  • the fluorescence curve shows the copy number (0, 5, 50 and 500 copies) of the mutant gene.
  • FIG. 1 (B) containing no NucS protein no increase in fluorescence value was observed due to cleavage of the chimeric oligonucleotide probe T790M_detect-1. This suggests that amplification of DNA derived from EGFR codon 790 DNA is suppressed by the mixed HL60 genomic DNA.
  • Example 2 Specific Detection of EGFR Gene Having L858R Mutation
  • a DNA containing the nucleotide sequence corresponding to the primers EGFR_L858R_F and EGFR_L858R_R and the nucleotide sequence of the region sandwiched between both sequences was artificially synthesized from the CDS sequence information of Human EGFR published in NC — 000007. At this time, the base T of nucleotide number 2573 in the EGFR gene was converted to G. The sequence was artificially synthesized.
  • the codon corresponding to the 858th amino acid of EGFR in the artificially synthesized DNA is substituted from that of leucine (L) to that of arginine (R).
  • the obtained artificial synthetic gene was named EGFR codon 858 DNA and used as a mutant gene. This mutation is referred to as EGFR_L858R. In this case, a mismatch base cannot be set in the portion of L858R.
  • the wild type gene used was human cell HL60 genomic DNA prepared in Example 1.
  • the target nucleic acid is EGFR_L858R DNA having a mutation at EGFR codon position 858
  • the non-target nucleic acid is HL60 genomic DNA.
  • This oligonucleotide was designated as the suppressor oligonucleotide EGFR_L858R_sup_p3.
  • the base sequence of the EGFR_L858R_sup_p3 is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • EGFR_L858R_P2 completely hybridizes to a mutant EGFR gene in which the base T of nucleotide number 2573 is replaced with G, the RNA portion is cleaved when ribonuclease H coexists here.
  • a mismatch occurs, so that it is not cleaved by ribonuclease H.
  • FIG. 2 shows the result of the method for detecting the EGFR gene L858R mutation
  • the vertical axis indicates the fluorescence height
  • the horizontal axis indicates the number of PCR cycles.
  • the fluorescence curve shows the copy number (0, 5, 50 and 500 copies) of the mutant gene.
  • the reaction solution of FIG. 2 (B) not containing NucS protein no increase in fluorescence value was observed due to cleavage of the chimeric oligonucleotide probe EGFR_L858R_P2. That is, it was shown that amplification of DNA derived from EGFR codon 858 DNA was suppressed due to the mixture of HL60 genomic DNA.
  • the fluorescence value increased even in a sample in which 5 copies of the mutant gene were mixed with 50,000 copies of the wild type gene. That is, cleavage of the chimeric oligonucleotide EGFR_L858R_P2 was confirmed. That is, it was shown that the EGFR_L858R mutant gene can be detected by mixing a large excess of wild type genes.
  • Real-time PCR detection was performed with a thermal cycler TP900 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the PCR reaction conditions were an initial denaturation treatment at 95 ° C. for 10 seconds, followed by a 45-cycle reaction in which 95 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds.
  • the fluorescence intensity was observed over time. .
  • FIG. 3 is a diagram showing the effect of the acidic polymer substance in the mutant gene detection method of the present invention, wherein the vertical axis indicates the fluorescence height, and the horizontal axis indicates the PCR cycle number.
  • the fluorescence curve shows no template DNA (NC) and the mutated gene copy number (5, 50 and 500 copies).
  • 3 (A-1), (B-1), (C-1) and (D-1) are shown in FIGS. 3 (A-2) and (B-2) when HL60 genomic DNA is 50,000 copies.
  • (C-2) and (D-2) show the case where HL60 genomic DNA is 5,000 copies.
  • Example 4 Effect of acidic polymer substance in nucleic acid cleavage reaction of polypeptide having mismatch endonuclease activity
  • the effect of acidic polymer substance was further examined.
  • the reaction solution was prepared as follows. That is, 5 copies (0.16 fg) of EGFR codon 790 DNA, 112 nM of NucS protein, 0.2 ⁇ M of T790M_NucG-1, 0.2 ⁇ M of each of EGFR_T790M primer pair using CyclePCR Reaction Mix (manufactured by Takara Bio Inc.), 0
  • a final volume of 25 ⁇ l of reaction was prepared containing 2 ⁇ M T790M_detect-1 and a final concentration of 140 ⁇ g / ml sodium alginate.
  • reaction solution 4 This reaction solution was named reaction solution 4. Furthermore, a reaction solution 1 obtained by removing NucS protein and sodium alginate from the reaction solution 4, a reaction solution 2 obtained by removing the NucS protein from the reaction solution 4, and a reaction solution 3 obtained by removing sodium alginate from the reaction solution 4 were prepared. Real-time PCR detection was performed under the conditions described in Example 1.
  • the acidic polymer substance has an effect of controlling the mismatch recognition / cleavage activity of the NucS protein by interacting with the NucS protein.
  • Example 5 Specific Detection of EGFR_Exon 19 Deletion Mutant Gene Detection of deletion mutation of EGFR gene exon 19 using the method of the present invention was examined.
  • the target nucleic acid is EGFR_19_delE746-A750 DNA
  • the non-target nucleic acid is Human genomic DNA (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • This oligonucleotide was named inhibitor oligonucleotide EGFR_19_delE746-A750 oligo-7.
  • a GG mismatch occurs at the G position at the base number 2245.
  • it does not hybridize to the plus strand of the deletion mutant gene.
  • EGFR — 2236-2250del completely hybridizes to a mutant EGFR gene from which the nucleotide sequence from 2236th to 2250th bases has been deleted, the RNA portion is cleaved when ribonuclease H coexists here. On the other hand, it does not hybridize to the wild type EGFR gene and is not cleaved by ribonuclease H.
  • FIG. 4 shows the result of the detection method of the deletion mutation of EGFR gene exon 19, the vertical axis indicates the fluorescence height, and the horizontal axis indicates the PCR cycle number.
  • the fluorescence curve shows the copy number (0, 5, 50 and 500 copies) of the mutant gene.
  • the fluorescence value increased even in the sample in which 5 copies of the mutant type gene were mixed with 50,000 copies of the wild type gene, that is, the chimeric oligonucleotide EGFR — 2236-2250del was cleaved.
  • the reaction solution in which NucS protein was added and PCR was performed the fluorescence value increased even in the sample in which 5 copies of the mutant type gene were mixed with 50,000 copies of the wild type gene, that is, the chimeric oligonucleotide EGFR — 2236-2250del was cleaved.
  • the chimeric oligonucleotide EGFR — 2236-2250del was cleaved.
  • Example 6 Mutation analysis of k-ras gene codon 12 and codon 13 Detection of point mutations in k-ras gene codon 12 and codon 13 using the method of the present invention was examined.
  • the target nucleic acid is a point mutant of k-ras gene codon 12, a point mutant of k-ras gene codon 13, and the non-target nucleic acid is HL60 genomic DNA.
  • the k-rasG12_F and k-rasG12_R primers having the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 13 and 14 in the sequence listing were chemically synthesized from the Human K-ras gene information disclosed in NC_000012.12.
  • glycine to valine and glycine to alanine were also artificially synthesized.
  • Each of these artificially synthesized DNAs was inserted into the T-cloning site site of T-Vector pMD20 (Takara Bio Inc.) by a conventional method.
  • the plasmids thus prepared were named k-rasG12S DNA, k-rasG12C DNA, k-rasG12R DNA, k-rasG12D DNA, k-rasG12V DNA, and k-rasG12A DNA, and were used as mutant genes.
  • a DNA having a base sequence in a region sandwiched between base sequences corresponding to the k-rasG12_F and k-rasG12_R primer pairs, wherein the amino acid of the codon is changed from glycine to serine or glycine by point mutation of codon 13 Cysteine, glycine to arginine, glycine to aspartic acid, and glycine to alanine were artificially synthesized. Further, each of the artificially synthesized DNAs thus obtained was inserted into the T-vectoring site of T-Vector pMD20 by a conventional method.
  • the plasmids thus prepared were named k-rasG13S DNA, k-rasG13C DNA, k-rasG13R DNA, k-rasG13D DNA and k-rasG13A DNA, and were used as mutant genes.
  • oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 15 that can hybridize to the region containing codons 12 and 13 of the k-ras gene was prepared.
  • the hydroxyl group at the 3 ′ end is modified with an amino group so that a polymerase extension reaction does not occur from the 3 ′ end.
  • This oligonucleotide was named inhibitory oligonucleotide k-rasG12 / 13_S1.
  • a GG mismatch occurs at the G position of base number 35.
  • a GG mismatch occurs at the G position at the 35th base number, and an AC mismatch occurs at the A position at the 34th base number.
  • Arise When hybridized with the positive strand of k-rasG12C DNA, a GG mismatch occurs at the G position at the 35th base number, and a TC mismatch occurs at the T position at the 34th base number.
  • a GG mismatch occurs at the G position at the 35th base number, and a CC mismatch occurs at the C position at the 37th base number.
  • a GG mismatch occurs at the G position at the 35th base number, and an AC mismatch occurs at the A position at the 38th base number.
  • a GG mismatch occurs at the G position at the 35th base number, and a CC mismatch occurs at the C position at the 38th base number.
  • a reaction solution was prepared. PCR was performed with a thermal cycler TP900. The reaction temperature condition was 95 ° C for 10 seconds after initial denaturation treatment followed by 45 cycles of 95 ° C for 5 seconds, 55 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 20 seconds, and the resulting amplified fragment was subjected to TaKaRA MiniBEST DNA Fragment. Purification Kit ver. After purification with 4.0 (manufactured by Takara Bio Inc.), it was subjected to direct sequencing using an oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • those derived from k-rasG12C DNA from the k-rasG12C DNA sample could be analyzed as the main increase product.
  • those derived from k-rasG13C DNA could be analyzed as the main increase product. Therefore, the amplification of the wild type gene was suppressed by the method of the present invention, and the amplification of the mutant gene was prioritized. It was confirmed that That is, it was shown that selective enrichment of mutant genes is possible.
  • Example 7 Highly Sensitive Detection Method Combining Acidic Polymeric Substances Using the specific detection method for the EGFR gene having the L858R mutation of Example 2 as a model, the effect of acidic polymeric substances was further examined.
  • a salt of chondroitin sulfate B having a sugar chain skeleton and polyacrylic acid not having a sugar chain skeleton were studied as acidic polymer substances.
  • the reaction solution has a composition of the above (1), and has a final volume containing polyacrylic acid 5000 at a final concentration of 1 ⁇ g / ml, 2 ⁇ g / ml, 3 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml and 5 ⁇ g / ml instead of chondroitin sulfate B sodium. 25 ⁇ l of reaction solution was prepared. For comparison, a reaction solution having the same composition and not containing polyacrylic acid 5000 was also prepared.
  • Example 8 Method of the Present Invention Combined with Amplification of Positive Control Nucleic Acid
  • the target nucleic acid was EGFR_L858R.
  • Another region of the EGFR gene was used as a positive control nucleic acid. That is, EGFRL858R_IC2_F and EGFRL858R_IC2_R primer pairs having the base sequences described in SEQ ID NOs: 17 and 18 in the sequence listing were synthesized by a conventional method.
  • a chimeric oligonucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing and having the third base DNA from the 5 ′ end replaced with RNA A probe was synthesized. Further, Eclipse quencher was bound to the 5 ′ end of the oligonucleotide probe, and FAM dye was bound to the 3 ′ end.
  • This chimeric oligonucleotide probe was named EGFRL858R_IC2_P2.
  • the DNA sample prepared in Example 2 was used as the template DNA.
  • the reaction liquid was prepared as follows. That is, using Cycleleave Reaction Mix, each DNA sample, 125 nM NucS protein, 0.2 ⁇ M EGFR_L858R_sup_p3 and 0.2 ⁇ M each EGFR_L858R primer pair, 0.2 ⁇ M EGFR_L858R_sup_ ⁇ g, and final concentration of sodium 56 ml
  • a final reaction volume of 25 ⁇ l was prepared containing each 0.1 ⁇ M EGFRL858R_IC2 primer pair and 0.2 ⁇ M EGFRL858R_IC2_P2. Real-time PCR detection was performed under the same conditions as in Example 3.
  • Example 3 As a result of real-time PCR detection, the same result as in Example 3 was obtained despite the fact that the positive control nucleic acid was amplified in parallel. From this, it was confirmed that the error between the reaction solutions can be corrected using the amplification amount of the positive control nucleic acid as an index. Moreover, it was confirmed that the presence of the target nucleic acid in the sample can be quantified by comparing the amplification amount of the amplification control nucleic acid with the amplification amount of the target nucleic acid in the sample.
  • the mutated gene can also be quantified by efficiently detecting the mutated gene even if the amount of DNA derived from the sample is small by the detection method of the present invention and comparing with the amplification of the positive control nucleic acid.
  • Example 9 Method of the Invention Combining PCNA
  • the effect of PCNA in the method of the invention was examined.
  • the composition of the reaction solution was a chimeric oligonucleotide probe EGFRL858R_IC2_P3 having a base sequence set forth in SEQ ID NO: 20 in the Sequence Listing for detection of a positive control nucleic acid, and a DNA of the third base from the 5 ′ end was replaced with RNA, 100 ⁇ g / ml of chondroitin sulfate B sodium, international publication WO 2007/004654 pamphlet, except for containing 8 ⁇ g / ml of PufPCNA D143R mutant (PCNA13) prepared by the method described in Examples and 375 nM NucS protein. The same was done.
  • Real-time PCR detection was performed under the same conditions as in Example 3.
  • the highly sensitive mutation detection method of the present invention allows amplification of wild-type genes present in large quantities by artificially generating mismatch base pair formation without being constrained by the original mismatch recognition form of a polypeptide having mismatch endonuclease activity. It is possible to eliminate and specifically amplify and detect rare mutant genes. This method is useful in a wide range of fields such as genetic engineering, biology, medicine, and agriculture.
  • SEQ ID NO: 1 EGFR_T790M_F primer
  • SEQ ID NO: 2 EFGR_T790M_R primer
  • SEQ ID NO: 3 T790M_NucG-1. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
  • SEQ ID NO: 4 T790M_detect-1. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM.nucleotide position 4 is RNA.
  • SEQ ID NO: 6 EGFR_L858R_R primer
  • SEQ ID NO: 7 EGFR_L858R_sup_p3.3'-end is modified by amino linker (NH2).
  • SEQ ID NO: 8 EGFR_L858R_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM.nucleotide position 3 is RNA.
  • SEQ ID NO: 9 EGFR_19_delE746-A750_F primer
  • SEQ ID NO: 10 EGFR_19_delE746-A750_R primer
  • SEQ ID NO: 11 EGFR_19_delE746-A750 oligo-7.
  • 3'-end is modified by amino linker (NH2)
  • SEQ ID NO: 13 k-rasG12_F primer
  • SEQ ID NO: 14 k-rasG12_R primer
  • SEQ ID NO: 15 k-rasG12 / 13_s1.3'-end is modified by amino linker (NH2)
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID DNA fragment containing k-ras codon 12 and codon 13 regions
  • SEQ ID NO: 17 EGFRL858R_IC2_F primer
  • SEQ ID NO: 18 EGFRL858R_IC2_R primer
  • SEQ ID NO: 19 EGFRL858R_IC2_P2.
  • 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM.nucleotide position 3 is RNA.

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Abstract

　大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料について、非標的核酸の核酸増幅を抑制し、かつ標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法、当該核酸増幅方法と標的核酸の特異的リアルタイム検出方法を組み合わせた希少な変異型遺伝子を高感度で検出する方法、当該方法のための組成物及びキットを提供する。

Description

標的核酸の高感度検出方法
　本発明は、非標的核酸の核酸増幅を選択的に抑制する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを組み合わせた標的核酸の高感度検出方法に関する。
　遺伝性および後天性の疾患は、塩基置換、欠失および挿入などの遺伝子変異と関連したものがあることが知られている。これらの変異の中には、疾患があることと直接関連するものもあれば、疾患の危険性および／または予後と相関するものもある。その中で、疾患の進行に伴って、野生型遺伝子が変異型遺伝子に変化していく疾患や、変異型遺伝子を有する細胞の増加がみられる疾患においては、当該変異遺伝子の存在を調べることが重要になってくる。当該遺伝子変異を伴う後天的な疾患と関連遺伝子変異の例としては、肺がんとＥＧＦＲ遺伝子変異又はＫ－ｒａｓ遺伝子変異、肺扁平上皮がんとＤＤＲ２遺伝子変異、大腸がんとＫ-ｒａｓ遺伝子変異、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子変異又はＢ-ｒａｆ遺伝子変異、胃がんとＫｉｔ遺伝子変異又はＰＤＧＦＲＡ遺伝子変異が挙げられる。
　また、上記事例の逆の場合もありうる。例えば、遺伝子変異を伴う後天的な疾患を治療している過程において、今度は変異型遺伝子が減少し、野生型遺伝子が増加してくる状況をモニターリングする場合などである。微小残存病変検出などが例示される。
　これらの遺伝子変異を解析する方法として、従来は制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ法）が用いられたが、操作が煩雑で長時間を要する上、一塩基多型（ＳＮＰ）部位近辺の塩基配列によっては適用が不可能な場合が多いなど、臨床検査の現場で使用するには問題の多いことが指摘されてきた。そこで近年では、より簡便で汎用性のある手法としてＩｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｃｙｃｌｉｎｇ　Ａｓｓａｙ法など種々の方法が開発されている。しかしながら通常のＰＣＲ法では、野生型遺伝子に混入する微量の変異型遺伝子が５％未満の場合、変異型遺伝子由来の標的核酸が検出できる量に達する前に増幅反応自体がプラトーに達してしまい、結局のところ標的核酸を十分検出できない。
　このように変異型遺伝子を標的核酸として検出するのにＰＣＲ法は非常に有効なツールである。しかしながらＰＣＲ法では増幅産物の濃度が高くなるに従い、増幅産物同士のアニールとプライマーのアニールとの競合が増加し、ついにはプライマーがアニールできなくなって反応がプラトーに達する。その結果、ＳＮＰや短い欠失や挿入を含む標的核酸の増幅断片は、大過剰に存在する非標的核酸の増幅断片とアニールしてしまうため、増幅反応がプラトーに達した時点では、標的核酸の増幅断片の存在比は反応前の存在比を下回っている。従って、同一領域の微量なＳＮＰや欠失、挿入を検出する場合には、野生型遺伝子由来の核酸の増幅を抑制した変異型遺伝子由来の核酸の特異的な増幅が必要となる。
　野生型遺伝子の核酸増幅を抑制し、変異型遺伝子由来の核酸を選択的に増幅する方法としては、Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ＰＣＲ法（非特許文献１）やＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＰＣＲ法（非特許文献２、３および特許文献１）が報告されている。当該方法では、目的遺伝子の変異部位の塩基配列を含むプライマーの内部に制限酵素の認識・切断サイトを導入し、野生型遺伝子の増幅を抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅させる。しかしながら、これらの方法では、解析したい目的遺伝子の変異部位を認識・切断する制限酵素を選択する必要があり、さらに当該制限酵素が認識・切断するのは、野生型遺伝子でなければならない。また、当該制限酵素は、ＰＣＲ法のサイクルの間に失活してはならない。これらの要件を満たす制限酵素は限られており、適用可能な野生型遺伝子及び変異型遺伝子の対象が限られているという問題がある。
　別の野生型遺伝子及び変異型遺伝子の核酸を増幅する方法として、Ｍｕｔａｎｔ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　３’－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＭＥＭＯ）法（非特許文献４及び特許文献２）が提案された。当該方法では、目的遺伝子の変異部位を含む３’末端ブロッキングプイライマーを使用する。この３’末端ブロッキングプイライマーは、野生型遺伝子に１００％マッチするが変異型遺伝子とはミスマッチする特徴を有している。当該３’末端ブロッキングプライマーにより野生型遺伝子の核酸増幅において増幅用プライマーのアニーリング及び伸長が阻害される。一方、変異型遺伝子に対しては、当該３’末端ブロッキングプイライマーとの間に生じるミスマッチに起因する不安定性により増幅用プライマーのアニーリング及び伸長は阻害されない。その結果、変異型遺伝子の核酸の増幅が優先される。当該方法での検出は、融解曲線解析やシークエンシングにて行う。しかしながら、この方法では、３’末端ブロッキングプイライマーが野生型遺伝子のプライマー伸長反応のみを阻害するようにハイブリダイズさせる必要があり、核酸増幅反応中の温度を厳格にコントロールする必要がある。また、もとの試料中に大量に存在する野生型遺伝子の初期量は保持されたままであり、当該野生型遺伝子の核酸の予期せぬ増幅を減少させることはできない。
　また最近になって、耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた変異検出方法（特許文献３）が報告された。しかしながら、これらの方法でも野生型遺伝子の核酸増幅を抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅し、変異遺伝子の存在のみを正確に検出するにはまだまだ問題があった。
国際公開第１９９６／３２５００号パンフレット 米国第２０１３／０１４９６９５号公開公報 国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット
ロイケミア　（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、第５巻、第２号、１６０～１６１頁（１９９１年） オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第６巻、第６号、１０７９～１０８３頁（１９９１年） アメリカン　ジャーナル　オブ　パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第１５３巻、３７３－３７９頁（１９９８年） ザ　ジャーナル　オブ　モレキュラー　ダイアグノスティクス（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、第１３巻、６５７－６６８頁（２０１１年）
　本発明の目的は、非標的核酸に対して微量な標的核酸の高感度検出方法を提供することにある。
　本発明者らは、ミスマッチ部位を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの特性、特にミスマッチの種類や位置と切断活性との相関を解析した。その結果、配列中の少なくとも１塩基が相違する２種の核酸について、相違する塩基の種類に制限されることなく、そのうちの任意の一方を切断できる方法を見出した。また、当該方法で大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料を処理することで、非標的核酸を選択的に切断することが可能となり、希少な標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法、さらに当該核酸増幅方法を用いた標的核酸の高感度検出方法を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の第一の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
　（ｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；及び
　（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
を試料と接触させる工程を含む方法に関する。
　本発明の第一の発明において、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであってもよい。さらに当該オリゴヌクレオチドにおいては、標的核酸とオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた際に生じる２つのミスマッチが、隣接するか又は５塩基までの間隔で位置しているものが好適に使用できる。
　本発明の第一の発明の別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを使用する方法が挙げられる。
　さらに別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを用いる方法が挙げられる。
　本発明の第一の発明においては、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとして、耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体を使うことができる。また、本発明は、酸性高分子物質存在下で行うことができる。さらに、増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
　本発明の第二の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に増幅する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
　（１）前記第一の発明の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程；及び
　（２）標的核酸を増幅する工程、に関する。
　また、本発明の第二の発明において、標的核酸の増幅はＰＣＲによって行うことができる。
　本発明の第三の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
　（１）前記第二の発明の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程；及び
　（２）上記工程（１）と同時に又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程、に関する。
　また、本発明の第三の発明において、標的核酸の検出はサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ（登録商標）法で行うことができる。
　本発明の第四の発明は、本発明の第二又は第三の発明のための組成物であって、
　（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
　（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
　（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物、に関する。
　本発明の第五の発明は、本発明の第二又は第三の発明のためのキットであって、
　（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
　（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
　（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット、に関する。
　本発明の第四又は第五の発明において、さらに酸性高分子物質を含んでもよい。また、当該発明において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド並びにＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のポリペプチドであってもよく、変異体であってよい。さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
　本発明の第六の発明は、酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と少なくとも１塩基が相違する塩基配列を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
　（ｉ）酸性高分子物質；
　（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
　（ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法、に関する。
　本発明の第六の発明において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のポリペプチドであってもよく、変異体であってもよい。また、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
　本発明により、大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料について、非標的核酸の核酸増幅を抑制し、かつ標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法が提供される。また、当該核酸増幅方法と標的核酸の特異的リアルタイム検出方法を組み合わせることで、希少な変異型遺伝子の高感度での検出を可能とする方法が提供される。
実施例１で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。 実施例２で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。 実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（アルギン酸ナトリウム非存在下）を示したリアルタイム検出結果である。 実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（５６μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。 実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（１４０μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。 実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（１６８μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。 実施例５で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。
　本発明においてミスマッチとは、二本鎖核酸中に存在するワトソン－クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）－Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）－Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対結合以外の組み合わせの塩基結合を示す。
　本発明において、標的核酸とは、検出することが望まれる任意の核酸（例えば天然の遺伝子を構成する核酸、人為的に作製された核酸が挙げられる）を言う。本発明は、当該標的核酸をこれと類似した塩基配列の非標的核酸と区別することに有用である。特に本発明を限定するものではないが、本発明における標的核酸、非標的核酸にはＤＮＡが好適である。
　特に限定はされないが、例えば標的核酸と非標的核酸としては、変異型遺伝子由来の核酸と当該変異型遺伝子に対応する野生型遺伝子由来の核酸の組み合わせ、人為的変異導入後の核酸と変異導入前の核酸の組み合わせ、バイサルファイト処理された核酸と処理前のメチル化された核酸の組み合わせ、あるいは置換、欠失、挿入が生じた後の核酸とこれら変異が生じる前の核酸の組み合わせ、薬剤投与の前及び後に生体、組織、細胞等から採取された核酸の組み合わせ等が挙げられる。なお本発明においては、標的核酸を上記例示のどちらの核酸に設定するかによって、組み合わせ中の標的核酸と非標的核酸が入れ替わることもありうる。
　以下、さらに詳細に説明する。
（１）本発明の非標的核酸の選択的切断方法
　本発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中において、非標的核酸のみを選択的に切断する方法を提供する。ここで、「標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸」とは、非標的核酸の塩基配列中に、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相同性のある塩基配列が含まれていることを意味する。例えば、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基置換を生じた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基の挿入がなされた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基の欠失が生じた塩基配列を有している非標的核酸などが挙げられる。相同な配列における塩基置換、挿入、又は欠失の数は、特に限定されない。しかしながら本発明では標的核酸と非標的核酸の塩基配列で少なくとも１塩基の違いがあれば当該核酸を区別することができる。さらに相違する塩基数が増加するにつれて、標的核酸と非標的核酸の識別精度も向上させることができる。
　本発明の第一の態様では、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有している非標的核酸の混合物中で、非標的核酸が選択的に切断される。前記の方法は、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド（以下、抑制オリゴヌクレオチドと称することがある）とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いる。抑制オリゴヌクレオチドを非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じる少なくとも１つのミスマッチの数は、非標的核酸の選択的切断が起こる範囲であれば特に限定されず、抑制オリゴヌクレオチドの鎖長にもよるが、例えば、１～７個、１～５個、又は１～３個などが挙げられる。また、上記ミスマッチの数を抑制オリゴヌクレオチドの鎖長に占める％で表現すると、例えば、１～２０％、３～１５％、又は４～８％の範囲である。本態様について、塩基配列中の１つの塩基のみが相違する標的核酸、非標的核酸の組合せを例として説明する。当該抑制オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸、非標的核酸の間で相違する塩基との間でミスマッチ（以降、第１のミスマッチと称することがある）を生じるとともに、もう一つの別のミスマッチ（以降、第２のミスマッチと称することがある）を生じる。
　前記第１のミスマッチの塩基は、標的核酸と非標的核酸の間で相違する塩基に関連するものであり、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。
　一方、第２のミスマッチは、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるミスマッチ塩基である。特に限定はされないが例えば、グアニン塩基－グアニン塩基、グアニン塩基－チミン塩基、又はチミン塩基－チミン塩基を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの場合は、これらから選択されるミスマッチが形成されるように抑制オリゴヌクレオチドが設計される。
　また当該抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際には、前記の第２のミスマッチを生じるが、第１のミスマッチは生じない。
　以上のような性質を備えた抑制オリゴヌクレオチドを設計して使用することにより、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の選択的な切断が可能となる。本発明は、前記のような１つもしくは２つのミスマッチを形成できる抑制オリゴヌクレオチドの使用に限定されるものではなく、所望の核酸の選択的切断が起こる範囲で、３以上のミスマッチを生じる抑制オリゴヌクレオチドを設計し、使用してもよい。この場合、標的核酸および非標的核酸において生じる少なくとも１つのミスマッチが前記第２のミスマッチであればよく、その他のミスマッチについて、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。好ましくは、前記３以上のミスマッチは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものである。
　本発明の方法で使用する抑制オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるが、その一部をヌクレオチドアナログやＲＮＡとしてもよい。即ち、非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを有する二本鎖核酸を形成する構造を有し、さらに前記ミスマッチが共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるものであれば特に限定はされない。
　例えば、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを使用して２種の核酸における１塩基の相違を識別する場合には、通常、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識しうるミスマッチが前記核酸の一方で形成されるようなオリゴヌクレオチドを作製して使用される。
　しかしながら、識別しようとする塩基によってはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識するミスマッチを形成させられない場合がある。このような場合は、本発明の方法のように、核酸上の識別しようとする塩基以外の領域でミスマッチを生じさせ、これを前記塩基の違いに基づいたミスマッチの形成／非形成と組み合わせることによって、一方の核酸の選択的な切断を起こすことができる。すなわち本発明では、塩基配列中の少なくとも１塩基相違する２種の核酸のうち、一方とハイブリダイズした場合にはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識する少なくとも１つのミスマッチを形成し、他方とハイブリダイズした場合には前記のミスマッチに加えて、２種の核酸の塩基配列中の相違する塩基に由来する少なくとも１つのミスマッチが形成されるような塩基配列のオリゴヌクレオチドが利用される。このオリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを組み合わせることにより、１つのミスマッチが生じた二本鎖核酸は前記ポリペプチドにより切断されるが、２つ以上のミスマッチが生じた二本鎖核酸ではそのような切断は起こらない。
　従って本発明の方法の別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドと、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様では、前記オリゴヌクレオチドは、非標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチ（第２のミスマッチ）を生じ、かつ標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチ（第１のミスマッチ）を生じるものも含まれる。
　例えば、ある変異型遺伝子の塩基変異部位（例えば、ＳＮＰ）の塩基ではミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識するミスマッチを形成させることができない場合は、標的核酸とする当該変異型遺伝子のＳＮＰ部位でのミスマッチの他に、当該ＳＮＰ部位の近傍にもう一つのミスマッチが形成されるような塩基配列を有する抑制オリゴヌクレオチドを作製することができる。前記の、もう一つのミスマッチは、ＳＮＰと無関係な塩基、すなわち変異型遺伝子と野生型遺伝子に共通する塩基で形成され、かつ、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断可能なミスマッチである。また、この抑制オリゴヌクレオチドの、当該ＳＮＰ部位の塩基に対応する塩基は野生型遺伝子の塩基に正しく対合するものとしておく。野生型遺伝子の核酸に抑制オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸にはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断可能な１つのミスマッチが形成されることから、野生型遺伝子の核酸は選択的に切断される。一方、変異型遺伝子の核酸では２つのミスマッチが形成されるために抑制オリゴヌクレオチドが安定的にハイブリダイズできず、さらに前記ポリペプチドによる切断が妨害される。このように本発明の方法では、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる野生型遺伝子の選択的切断が、共存する変異型遺伝子の塩基変異部位と異なる位置で行われることが特徴である。
　また、本発明の方法の別態様は、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様においては、前記オリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）のハイブリダイズする領域は、標的核酸には存在しないが、非標的核酸には存在する領域から選択することが好適である。あるいは前記ハイブリダイズする領域は、標的核酸には存在しない領域と存在する領域にまたがる領域であってもよい。
　このような抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズした場合に、少なくともミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるミスマッチが１つ以上形成されるように設計する。このように設計したオリゴヌクレオチドは、非標的核酸に挿入された塩基配列を有しない標的核酸との間ではさらに数多くのミスマッチを形成して二本鎖核酸が不安定化されるか、もしくは標的核酸とハイブリダイズできない。さらにミスマッチを生じさせる場合には当該ミスマッチの配置には限定はない。
　さらに本発明の方法の別態様しては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様においては、前記オリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）のハイブリダイズする領域は、非標的核酸上の前記の欠失が生じた部位を含む領域から選択することが好適である。また、抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズした場合にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるミスマッチが１つ以上形成されるように設計する。このように設計したオリゴヌクレオチドは、非標的核酸では失われている塩基配列を有する標的核酸との間ではさらに数多くのミスマッチを形成して二本鎖核酸が不安定化されるか、もしくは標的核酸とハイブリダイズできない。さらにミスマッチを生じさせる場合には当該ミスマッチの配置には限定はない。
　本発明の方法に使用される抑制オリゴヌクレオチドの鎖長は、７塩基以上のものが好ましく、特に限定はされないが７～４０塩基、好ましくは１０～３０塩基、特に好ましくは１１～２５塩基の範囲である。また、抑制オリゴヌクレオチドの塩基配列は、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるように設計される。この際、標的核酸（例えば変異型遺伝子由来の核酸）あるいはその相補鎖とハイブリダイズした場合に、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間でミスマッチを形成するとともに、当該塩基の位置から５’側あるいは３’側に、好ましくは５塩基の範囲、特に好ましくは２塩基の範囲、あるいは隣接して、少なくとももう１つのミスマッチ塩基を有するような塩基配列が選択される。即ち、２つのミスマッチが５塩基以内に配置されるものが好適に使用できる。さらに、両ミスマッチは、当該オリゴヌクレオチドの中心塩基に近い領域に設定することが好ましい。また、この塩基配列のオリゴヌクレオチドは非標的核酸（例えば野生型遺伝子由来の核酸）とハイブリダイズした場合には、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間でミスマッチを形成しない。また、標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズした場合に標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間で生じるミスマッチは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものであっても、されないものであってもよい。さらに、標的核酸または非標的核酸あるいはそれらの相補鎖とハイブリダイズした場合に、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基以外の塩基との間で生じるミスマッチのうち少なくとも１つは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものである。このような抑制オリゴヌクレオチドのデザインにより、本発明の方法は、制限酵素等を用いる従来技術に比べ格段に変異検出のターゲットを広げることができる。さらに、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドの３’端は、このオリゴデオキシヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。例えば、アミノ化などの修飾が例示される。
　本発明の方法において、抑制オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ塩基の認識・切断に最適なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせて使用される。特に限定はされないが例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰＦ００１２ポリペプチド（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット）あるいは当該ペプチドの変異体（総称してＮｕｃＳタンパク質と記載することがある）が好適に使用できる。また、前記ポリペプチドの、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ由来のホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｑ９Ｖ２Ｅ８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のホモログ（ＲｓｆＳｅｑ　ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５）やＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のホモログ（ＲｓｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ　２４７１９４）由来のホモログ、あるいはそれらの変異体も本発明の方法で好適に使用できる。
　本発明の好適な態様においては、並行して行われる核酸増幅や検出のために耐熱性菌由来のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いることが好ましい。特に限定はされないが、例えばＰＣＲのような熱サイクル中でも安定に活性を保持するものが好ましく、５０℃以上、さらに好ましくは、７０℃以上、より好ましくは９０℃以上でも失活しないポリペプチドが使用できる。
　本発明の方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質は、それが共存することによって、当該ポリペプチドのミスマッチ認識・切断活性を制御する効果が確認されている。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、ポリアニオンであるものが好ましい。また糖骨格を有する酸性多糖あるいは直鎖炭素鎖を有する酸性多糖が好ましい。酸性高分子物質としては、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、およびそれらの塩、あるいは標的核酸及び非標的核酸とは異なる核酸からなる群より選択された１種以上を使用することができる。
　本発明の方法は、さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
（２）本発明の標的核酸の選択的増幅方法
　本発明の核酸の選択的な増幅方法は、類似した塩基配列の領域を有する２種の核酸（標的核酸及び非標的核酸）が存在する試料において、前記核酸のうちの一方（標的核酸）を選択的に増幅する方法であって、（１）本発明の非標的核酸の選択的切断方法で試料中の非標的核酸を切断する工程、及び（２）標的核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする。前記の２つの工程は、それぞれを段階的に行っても良いし、両工程を同時に行ってもよい。即ち、後者では核酸増幅反応中に非標的核酸の切断が生じていればよい。
　本発明の標的核酸の選択的増幅方法においては、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで非標的核酸が選択的に切断され、その存在比率が低下した結果、標的核酸が選択的に増幅される。核酸増幅の工程には、公知の核酸増幅方法が利用できるが、前記抑制オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズ可能な環境を経る核酸増幅方法が好ましい。特に好ましくは、ＰＣＲ法を本発明の方法に使用できるが、これに限定はされない。
　本発明では、核酸増幅を酸性高分子物質存在下で実施することができる。前記の（１）、（２）両工程を同時に実施する態様では、当該酸性高分子物質の効果により、核酸増幅の効率向上とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の認識・切断の効率向上を同時に達成することができる。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
　さらに本発明の方法は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
（３）本発明の標的核酸の選択的検出方法
　本発明の標的核酸の選択的検出方法は、（１）本発明の標的核酸の選択的増幅方法で標的核酸を増幅する工程、及び（２）上記工程（１）と同時又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程、を含むことを特徴とする。当該検出方法を多量の非標的核酸と微量の標的核酸とを含有する試料に適用した場合には、出発試料中の非標的核酸と標的核酸の存在比率と検出工程での存在比率は逆転する。言い換えれば、非標的核酸の増幅を抑制しつつ標的核酸を増幅することにより、標的核酸を感度よく検出することが可能となる。本発明の検出方法は、工程（１）の後に工程（２）を実施してもよく、両工程を同時に実施することもできる。工程（２）の検出方法は、増幅物の検出や定量を実施する方法でもよく、増幅物をその塩基配列特異的に検出する方法であってもよい。例えばエンドポイント検出では、ダイレクトシーケンス法やインターカーレーターによる高解像度融解曲線解析（ＨＲＭ：Ｈｉｇｈ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｃｕｒｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）法を用いることができる。またリアルタイム検出では、配列特異的プローブを使用するサイクリング・プローブ法（例えば国際公開第２００３／０７４６９６号）やＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ法（例えば国際公開第９２／０２６３８号）と組み合わせることができる。特に好ましくは、ＰＣＲ法と組み合わせることができるサイクリング・プローブ法による検出である。
　ＰＣＲ法に使用するプライマー対は、標的核酸及び非標的核酸中の、両核酸で相違している配列を含む領域（すなわち抑制オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域）が増幅されるように設計すればよい。プライマーの設計および合成は公知の方法で実施することができる。
　特に限定はされないが上記サイクリング・ブローブ法で検出する場合には、当該検出系にリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを共存させる。当該リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のものが好ましい。特に限定はされないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ由来、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来、又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ由来のリボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。
　サイクリング・プローブ法では標的核酸を非標的核酸と区別して検出することが可能である。このような検出に使用可能なプローブ（キメラオリゴヌクレオチドプローブ）は公知の方法、例えば国際公開第２０１２／０１４９８８号パンフレットに開示された方法により設計することができる。当該キメラオリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質で、もう一方がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されているものが好適である。当該物質の組合せとしては、６－ＦＡＭ（６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ－４’－ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＲＯＸ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－Ｘ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）とＤＡＢＣＹＬ、６－ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ等が好適に使用できる。
　本発明の標的核酸の選択的検出方法において使用する抑制オリゴヌクレオチドは、本発明の非標的核酸の選択的切断方法で説明した抑制オリゴヌクレオチドの特性を備え、さらに標的核酸の検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした場合に共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されないように設計することが好ましい。
　ＰＣＲを利用する本発明の検出方法においては、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に最初から存在する検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子の核酸（例えば、ハウスキーピング遺伝子など）が好ましい。試料中に最初から存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマー対と検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料に予め添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ領域あるいは標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域の核酸であってもよい。予め試料に既知量を添加した人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じプライマーで増幅可能であれば共通のプライマー対を使用し、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域であれば当該領域増幅用のプライマー対を使用する。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
　本発明の検出方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
　本発明の検出方法は、特定の塩基配列を有する核酸、例えば変異の存在が知られている遺伝子に対応する核酸について、野生型遺伝子と変異型遺伝子とを区別して検出することを可能にする。変異型遺伝子の塩基配列を有する核酸を標的核酸に、また野生型遺伝子の塩基配列を有する核酸を非標的核酸に設定して本発明の検出方法を実施することにより、大過剰の正常対立遺伝子（すなわち野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ）の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出が可能となる。例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出に本発明の方法は有用である。当該変異としては、微小欠失及び点突然変異が例示される。
　本発明を特に限定するものではないが、前記の特定の塩基配列を有する核酸としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、及び細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このような後天的遺伝子変異としては、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、Ｂ－ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の変異が例示される。Ｋ－ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。Ｂ－ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のＫ－ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。
　本発明の検出方法は、メチル化解析にも利用することができる。例えば、生物由来試料から抽出したメチル化ＤＮＡを野生型遺伝子とし、当該野生型遺伝子を含む組成物を亜硫酸水素塩処理した後に得られたＤＮＡを変異型遺伝子として実施してもよい。本発明の検出方法によれば、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出を行うことができる。
　前記の亜硫酸水素塩による処理として、メチル化ＤＮＡの検出に用いられる公知の亜硫酸水素塩法（バイサルファイト法）が利用できる。当該処理により非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。さらに、このバイサルファイト処理済みの反応液をＰＣＲ法で増幅すると、ウラシルはチミンに変換され、メチル化シトシンはシトシンとなる。つまり特定の部位での大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出は、それぞれ大過剰のチミン含有核酸の中のシトシン含有核酸の存在、または大過剰のシトシン含有核酸の中のチミン含有核酸の存在を検証することに他ならない。ここで大過剰に存在するチミンあるいはシトシンを含有するＤＮＡからの増幅を抑制できれば、少数のメチル化対立遺伝子あるいは非メチル化対立遺伝子の存在はたやすく検証することができる。
　本発明の検出方法では、反応液中にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと野生型遺伝子との間でミスマッチを生じる抑制オリゴデオキシヌクレオチドを添加することにより、野生型遺伝子の増幅を抑制し、かつ希少な変異型遺伝子を選択的に増幅、簡便に検出することができる。また、後述の実施例で示すように本来の塩基変異部位と当該変異部位と異なる位置に少なくとももう一つミスマッチを人為的に設定することで当該塩基変異部位の塩基の種類にとらわれることなく、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが認識・切断可能な抑制オリゴヌクレオチドを幅広く設計できる。
（４）本発明の組成物
　本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び／又は標的核酸の選択的検出方法のための組成物としては、（ａ）標非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有する組成物が例示される。
　当該組成物は、酸性高分子物質を含んでいてもよい。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
　本発明の組成物は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
　また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用される組成物は、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしてＰｆｕ由来ＮｕｃＳタンパク質の変異体が好適である。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
（５）本発明のキット
　本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び／又は標的核酸の選択的検出方法のためのキットとしては、（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有するキットが例示される。
　本発明のキットは、さらに酸性高分子物質を含んでいてもよく、適当な濃度に調製された水溶液が好適に使用できる。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
　本発明のキットは、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
　また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用されるキットは、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしてＰｆｕ由来ＮｕｃＳタンパク質の変異体が好適である。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
（６）本発明の酸性高分子物質存在下における非標的核酸の選択的切断方法
　本発明の非標的核酸の選択的切断方法の別態様としては、酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と相同な領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、（ｉ）酸性高分子物質、（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法が例示される。
　当該方法において、前記酸性高分子物質、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及びオリゴヌクレオチドは、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる希少混入変異型遺伝子ＥＧＦＲ　Ｔ７９０Ｍの特異的増幅
（１）検出用テンプレートの準備
　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ　ＥＧＦＲ遺伝子のＣＤＳ配列情報から、後述のプライマー　ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この際、ＥＧＦＲ遺伝子における塩基番号２３６９の塩基ＣをＴに変換した。この塩基置換により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの７９０番のアミノ酸に対応するコドンがスレオニン（Ｔ）のものからメチオニン（Ｍ）のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍと称す。当該事例においては、Ｔ７９０Ｍの部分でミスマッチ塩基を設定できる。また野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとして、ヒト細胞ＨＬ６０よりゲノムＤＮＡを調製した。
　本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ　コドン７９０位で変異を有するＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ　ＤＮＡ、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
　配列表の配列番号１及び２に示した塩基配列を有する２種のプライマー　ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の、塩基番号２３６９の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法により調製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド　Ｔ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ－１と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２３６９（プラス鎖）のＣと相補的なＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチを生じる。一方、塩基番号２３６９がＴに置換された変異型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると当該Ｔに相補的なＡの位置でＧ－Ａのミスマッチを生じる。
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
　ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２３６９に相当する塩基から３’側方向に１塩基、５’側方向に８塩基伸ばした領域のマイナス鎖の塩基配列を有し、かつ５’側末端から４塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドの５’末端にＥｃｌｉｐｓ　ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。こうして作製されたキメラオリゴヌクレオチドプローブをＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１と命名した。当該Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
　Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１は、塩基番号２３６９がＴに置換された変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にハイブリダイズするとミスマッチを生じるためリボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
　実施例１-（１）で調製したＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡを５０,０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。また、対照として、ＨＬ６０ゲノムＤＮＡのみのものも調製した。これらのサンプルを鋳型として使用した。
　ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとして使用する、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のミスマッチヌクレオチド特異的二本鎖切断活性を有するポリペプチド（以下、ＮｕｃＳタンパク質と称す）は、国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレットの調製例１～３及び実施例１記載の方法で調製したＷ７７Ｆが導入されたＰＦ００１２ポリペプチドの変異体である。
　野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記サンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ－１及び０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ　プライマー対、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃　１０秒の初期変性処理の後、９５℃　５秒、５５℃　１０秒、７２℃　２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図１に示す。
　即ち、図１はＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ変異の高感度検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を含まない、図１（Ｂ）の反応液ではキメラオリゴヌクレオチドプローブ　Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１の切断による蛍光値の上昇は見られなかった。このことは、混在するＨＬ６０ゲノムＤＮＡによってＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることを示唆している。
　一方、ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した図１（Ａ）の反応液では、５０，０００コピーのＨＬ６０ゲノムＤＮＡに対し５コピーのＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡが混在するサンプルにおいても経時的な蛍光値の上昇が確認された。すなわち、ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡがＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１により特異的に検出された。この結果より、ＮｕｃＳと抑制オリゴヌクレオチドを組み合わせによりＨＬ６０ゲノムＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅が抑制され、ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡの検出が可能となることが確認できた。
実施例２　Ｌ８５８Ｒ変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の特異的検出
（１）検出用テンプレートの準備
　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ　ＥＧＦＲのＣＤＳ配列情報からプライマー　ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この際、ＥＧＦＲ遺伝子における塩基番号２５７３の塩基ＴをＧに変換した。配列を人工合成した。この塩基置換により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸に対応するコドンがロイシン（Ｌ）のものからアルギニン（Ｒ）のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ８５８　ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒと称す。当該事例においては、Ｌ８５８Ｒの部分でミスマッチ塩基を設定できない。また野生型遺伝子は、実施例１で調製したヒト細胞ＨＬ６０ゲノムＤＮＡを用いた。
　本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ　コドン８５８位で変異を有するＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ　ＤＮＡ、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
　配列表の配列番号５及び６に示した塩基配列を有する２種のプライマー　ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２５７３を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号７記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド　ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３と命名した。当該ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３の塩基配列を配列表の配列番号７に示す。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２５７５のＧの位置でＧ－Ｔのミスマッチを生じる。一方、塩基番号２５７３がＧに置換された変異型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズした場合には、当該Ｇの位置でＧ－Ａのミスマッチを生じ、さらにその３’側２塩基目（塩基番号２５７５）のＧの位置でもＧ－Ｔのミスマッチを生じる。
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
　ＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ８５８ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、当該ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２５７３に相当する塩基から３’側方向に１塩基、５’側方向に９塩基伸ばした領域の相補鎖の配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ　ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２と命名した。当該ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。
　ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２は、塩基番号２５７３の塩基ＴがＧに置換された変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にハイブリダイズするとミスマッチを生じるためリボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
　ＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ８５８　ＤＮＡを５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨＬ６０ゲノムＤＮＡのみを使用した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。
　野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ　プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃　１０秒の初期変性処理の後、９５℃　５秒、５５℃　１０秒、７２℃　２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図２に示す。
　即ち、図２はＥＧＦＲ遺伝子　Ｌ８５８Ｒ変異の検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を含まない、図２（Ｂ）の反応液では、キメラオリゴヌクレオチドプローブ　ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の切断による蛍光値の上昇は見られなかった。すなわち、ＨＬ６０ゲノムＤＮＡの混在のためにＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ８５８　ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることが示された。
　一方、ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した図２（Ａ）に示される反応液では、５０,０００コピーの野生型遺伝子に対し５コピーの変異型遺伝子が混在するサンプルにおいても蛍光値の上昇、すなわちキメラオリゴヌクレオチドＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の切断が確認された。すなわち、大過剰の野生型遺伝子の混在化でのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ変異遺伝子の検出が可能であることが示された。
　この結果より、本発明により提供される抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）とを組み合わせることにより、当該ポリペプチドが認識できるミスマッチを形成できないような塩基置換であっても、核酸中の当該塩基置換の有無を区別して、その一方を選択的に切断できる系を構築できることが確認できた。さらに前記組み合わせに核酸増幅反応を組み合わせることにより、存在比率の高い野生型遺伝子由来の核酸の増幅を抑制し、かつ変異型遺伝子由来の核酸を優先的に増幅させることにより、変異型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。
実施例３　酸性高分子物質存在下における標的核酸の検出方法の検討
（１）酸性高分子物質存在下における変異検出方法の検討
　実施例２（４）で調製したものと同じ一連のＤＮＡサンプルを調製した。同様にＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ８５８　ＤＮＡを５，０００コピー：５００コピー（＝１０：１）、５，０００コピー：５０コピー（＝１００：１）および５，０００コピー：５コピー（＝１，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。さらに、対照として、鋳型ＤＮＡを含まないサンプルも調製した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８.５ｎｇになる。
　ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ　プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度５６μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌまたは１６８μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でアルギン酸ナトリウムを含まない反応液も調製した。
　リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃　１０秒の初期変性処理の後、９５℃　５秒、５５℃　１０秒、７２℃　２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。
（２）酸性高分子物質の効果の解析
　リアルタイムＰＣＲ検出の結果を図３に示す。即ち、図３は本発明の変異型遺伝子検出方法における酸性高分子物質の効果を示す図であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、鋳型ＤＮＡなし（Ｎ．Ｃ．）と変異型遺伝子のコピー数（５、５０及び５００コピー）を示す。図３（Ａ－１）、（Ｂ－１）、（Ｃ－１）及び（Ｄ－１）はＨＬ６０ゲノムＤＮＡが５０，０００コピーの場合、図３（Ａ－２）、（Ｂ－２）、（Ｃ－２）及び（Ｄ－２）はＨＬ６０ゲノムＤＮＡが５，０００コピーの場合を示す。図３（Ａ）がアルギン酸ナトリウム非存在下の場合、（Ｂ）は５６μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合、（Ｃ）は１４０μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合及び（Ｄ）は１６８μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合での効果を示す。いずれの濃度においてもアルギン酸非存在下の場合に比べて検出効率が増大していることが確認できた。特に、鋳型ＤＮＡ量が少ない（ＨＬゲノムＤＮＡが５，０００コピー）場合に効果が大きいことが確認できた。このことから、本発明の検出方法で酸性高分子物質を組み合わせることにより、検体由来のＤＮＡ量が少なくても効率よく変異型遺伝子を検出できることが確認できた。
実施例４　ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの核酸切断反応における酸性高分子物質の効果
　酸性高分子物質の効果について、さらに検討した。反応液は以下のようにして調製した。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用して５コピー（０．１６ｆｇ）のＥＧＦＲ　ｃｏｄｏｎ７９０　ＤＮＡ、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ－１、各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ　プライマー対、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ－１並びに最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。本反応液を反応液４とした。さらに、反応液４からＮｕｃＳタンパク質及びアルギン酸ナトリウムを除いた反応液１、反応液４からＮｕｃＳタンパク質を除いた反応液２、反応液４からアルギン酸ナトリウムを除いた反応液３を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例１記載の条件で行った。
　その結果、反応液１、反応液２及び反応液４では微量コピー数でも変異型遺伝子の増幅が確認できた。一方、反応液３は、全く増幅が確認できなかった。
　反応液３では野生型遺伝子が存在しないために、抑制オリゴヌクレオチドが変異遺伝子と予期せぬハイブリダイズを引き起こし、それをＮｕｃＳタンパク質が切断した可能性が示唆された。それとは対照的に反応液４では、酸性高分子物質がＮｕｃＳタンパク質と相互作用することにより、予期せぬ切断を抑えたことが示唆された。
　以上の事から、酸性高分子物質はＮｕｃＳタンパク質と相互作用することによって、当該ＮｕｃＳタンパク質のミスマッチ認識・切断活性を制御する効果があることを確認できた。
実施例５　ＥＧＦＲ＿エキソン１９欠失変異遺伝子の特異的検出
　本発明の方法を用いたＥＧＦＲ遺伝子エキソン１９の欠失変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ＤＮＡ、非標的核酸はＨｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（タカラバイオ社製）になる。
（１）検出用テンプレートの準備
　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ　ＥＧＦＲのＣＤＳ配列情報からプライマー　ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域で塩基番号の２２３６番目～２２５０番目までが欠失した塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この塩基欠失により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの７４６番目～７５０番目までのアミノ酸が欠失していることになる。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。　
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
　配列表の配列番号９及び１０に示した塩基配列を有する２種のプライマー　ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の欠失領域にハイブリダイズ可能な、配列番号１１記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド　ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ｏｌｉｇｏ－７と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２２４５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチを生じる。一方、欠失変異型遺伝子のプラス鎖には、ハイブリダイズしない。
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
　ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、当該ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２２２８番目～２２３５番目並びに２２５１番目～２２５３番目の領域に対する相補鎖を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ　ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌと命名した。当該ＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌの塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。
　ＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌは、塩基番号２２３６番目～２２５０番目の塩基配列が欠失した変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にはハイブリダイズせず、リボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
　Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡならびにＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ＤＮＡを５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡのみを使用した。Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。
　野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘを用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、６８７．５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌ及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ｏｌｉｇｏ－７、最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃　１０秒の初期変性処理の後、９５℃　５秒、５５℃　１０秒、７２℃　２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図４に示す。
　即ち、図４はＥＧＦＲ遺伝子　エキソン１９の欠失変異の検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した反応液では、５０,０００コピーの野生型遺伝子に対し５コピーの変異型遺伝子が混在するサンプルにおいても蛍光値の上昇、すなわちキメラオリゴヌクレオチドＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌの切断が確認された。一方、ＮｕｃＳタンパク質を含まない反応液では、キメラオリゴヌクレオチドプローブ　ＥＧＦＲ＿２２３６－２２５０ｄｅｌの切断による蛍光値の上昇は見られなかった。すなわち、Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡの混在のためにＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６－Ａ７５０　ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることが示された。
　この結果より、本発明により提供される抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）とを組み合わせることにより、欠失型遺伝子変異であっても問題なく大過剰の野生型遺伝子の混在化でも目的の欠失型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。
実施例６　ｋ－ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３の変異解析
　本発明の方法を用いたｋ－ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３の点突然変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はｋ－ｒａｓ遺伝子コドン１２の点突然変異体、及びｋ－ｒａｓ遺伝子コドン１３の点突然変異体、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。
（１）検出用テンプレートの準備
　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＣ＿００００１２．１２で公開されているＨｕｍａｎ　Ｋ－ｒａｓ遺伝子情報から配列表の配列番号１３及び１４記載の塩基配列を有するｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｒプライマーを化学合成した。また、前記プライマーの塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を有するＤＮＡであって、コドン１２の点突然変異により当該コドンのアミノ酸がグリシンからセリン、グリシンからシステイン、グリシンからアルギニン、グリシンからアスパラギン酸、グリシンからバリン並びにグリシンからアラニンになったものも人工合成した。これらの人工合成ＤＮＡは、それぞれＴ－Ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）のＴ－ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｓ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｃ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｒ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｄ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｖ　ＤＮＡ並びにｋ－ｒａｓＧ１２Ａ　ＤＮＡと命名し、それぞれ変異型遺伝子として用いた。
　同様に、ｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｒプライマー対に対応する塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を有するＤＮＡであって、コドン１３の点突然変異により当該コドンのアミノ酸がグリシンからセリン、グリシンからシステイン、グリシンからアルギニン、グリシンからアスパラギン酸並びにグリシンからアラニンになったものを人工合成した。さらに得られた人工合成ＤＮＡをそれぞれＴ－Ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＤ２０のＴ－ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｓ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｃ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｒ　ＤＮＡ、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｄ　ＤＮＡ並びにｋ－ｒａｓＧ１３Ａ　ＤＮＡと命名し、それぞれ変異型遺伝子として用いた。
（２）抑制オリゴヌクレオチドの調製
　ｋ－ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号１５記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド　ｋ－ｒａｓＧ１２/１３＿Ｓ１と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１６記載の塩基配列を有するｋ－ｒａｓ　コドン１２の野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチを生じる。一方、ｋ－ｒａｓＧ１２Ｓ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＡの位置でＡ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１２Ｃ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＴの位置でＴ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１２Ｒ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＣの位置でＣ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１２Ｄ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＡの位置でＡ－Ｇのミスマッチが生じる。ｋ－ｒａｓＧ１２Ｖ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＴの位置でＴ－Ｇのミスマッチが生じる。ｋ－ｒａｓＧ１２Ａ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、ミスマッチが生じない。
　また、抑制オリゴヌクレオチド　ｋ－ｒａｓＧ１２/１３＿Ｓ１は、ｋ－ｒａｓ　コドン１３の野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチを生じる。一方、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｓ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＡの位置でＡ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１３Ｃ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＴの位置でＴ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１３Ｒ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＣの位置でＣ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１３Ｄ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３８番目のＡの位置でＡ－Ｃのミスマッチを生じる。ｋ－ｒａｓＧ１３Ａ　ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ－Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３８番目のＣの位置でＣ－Ｃのミスマッチを生じる。
（３）野生型遺伝子増幅抑制の確認
　Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡならびにｋ－ｒａｓＧ１２Ｃ　ＤＮＡを５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡのみを使用した。Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。
　同様に、Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡならびにｋ－ｒａｓＧ１３Ｃ　ＤＮＡを５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）で混合したＤＮＡサンプルも調製した。
　上記の各ＤＮＡサンプル、１０００ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、各０．２μＭのｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ－ｒａｓＧ１２＿Ｒ　プライマー対、０．２μＭのｋ－ｒａｓＧ１２／１３＿Ｓ１、最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＴＰ９００で行った。反応温度条件は、９５℃　１０秒の初期変性処理の後、９５℃　５秒、５５℃　１０秒、７２℃　２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応し、得られた増幅断片をＴａＫａＲＡ　ＭｉｎｉＢＥＳＴ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．４．０（タカラバイオ社製）で精製後、配列表の配列番号１３記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてダイレクトシークエンスに供した。
　ダイレクトシークエンスの結果から、上記ｋ－ｒａｓＧ１２Ｃ　ＤＮＡサンプルからｋ－ｒａｓＧ１２Ｃ　ＤＮＡ由来のものが主増産物として解析できた。また、ｋ－ｒａｓＧ１３Ｃ　ＤＮＡサンプルからもｋ－ｒａｓＧ１３Ｃ　ＤＮＡ由来のものが主増産物として解析できたこのことから、本発明の方法で野生型遺伝子の増幅が抑制され、かつ変異型遺伝子の増幅が優先されることが確認できた。すなわち、変異型遺伝子の選択的濃縮が可能であることが示された。
実施例７　酸性高分子物質を組み合わせた高感度検出方法
　実施例２のＬ８５８Ｒ変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の特異的検出方法をモデルとして、酸性高分子物質の効果についてさらに検討した。本実施例では、酸性高分子物質として、糖鎖骨格を有するコンドロイチン硫酸Ｂの塩及び糖鎖骨格を有さないポリアクリル酸について検討した。
（１）酸性高分子物質の影響-１
ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘを用いて、実施例３（１）で調製したＤＮＡサンプル、１２５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ　プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ並びに６０μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（シグマ-アルドリッチ社製）を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でコンドロイチン硫酸Ｂナトリウムを含まない反応液も調製した。
　リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３（１）と同条件で行った。その結果、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウムを含まない場合よりも反応液に含む方が、いずれの最終濃度の場合でも明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、糖鎖骨格を有する酸性高分子が本発明の方法に有効であることが確認できた。
（２）酸性高分子物質の影響－２
　次に糖鎖骨格を有さない酸性高分子物質として、ポリアクリル酸５０００（和光純薬社製）を使用した場合について検討した。反応液は、上記（１）の組成で、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウムの代わりに、終濃度１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ/ｍｌ、４μｇ/ｍｌ並びに５μｇ／ｍｌのポリアクリル酸５０００を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でポリアクリル酸５０００を含まない反応液も調製した。
　リアルタイムＰＣＲ検出の結果、ポリアクリル酸を含まない場合よりも反応液に含む方が、いずれの最終濃度の場合でも明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、糖鎖骨格を有さない直鎖炭素鎖の酸性高分子物質であっても本発明の方法に有効であることが確認できた。
実施例８　陽性対照核酸の増幅を組み合わせた本発明の方法
　本発明の方法を用いた標的核酸の定量方法について検討した。標的核酸は、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒとした。ＥＧＦＲ遺伝子の別の領域を陽性対照核酸とした。即ち、配列表の配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｆ及びＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｒプライマー対を常法により合成した。また、当該陽性対照核酸を特異的に検出するためのプローブとして、配列表の配列番号１９記載の塩基配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ　ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ２と命名した。
　鋳型となるＤＮＡは、実施例２で調製したＤＮＡサンプルを用いた。また、反応液は以下のようにして調製した。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘを用いて、各ＤＮＡサンプル、１２５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ　プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度５６μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム、さらに各０．１μＭのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ２を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。また、リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３の条件と同じにした。
　リアルタイムＰＣＲ検出の結果、陽性対照核酸の増幅が並行して行われているにも関わらず、実施例３と同じ結果が得られた。このことから、当該陽性対照核酸の増幅量を指標として、各反応液間の誤差を補正することが可能であることが確認できた。また、増幅対照核酸の増幅量とサンプル中の標的核酸の増幅量を比較することにより、サンプル中の標的核酸の存在を定量できることが確認できた。このことから、本発明の検出方法で検体由来のＤＮＡ量が少なくても効率よく変異型遺伝子を検出し、陽性対照核酸の増幅と比較することにより変異型遺伝子の定量もできることが確認できた。
実施例９　ＰＣＮＡを組み合わせた本発明の方法
　本発明の方法におけるＰＣＮＡの効果について検討した。反応液組成は、陽性対照核酸検出用として配列表の配列番号２０記載の塩基配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ３、１００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｂナトリウム、国際公開ＷＯ２００７／００４６５４号パンフレット　実施例記載の方法で調製した８μｇ/ｍｌのＰｕｆＰＣＮＡ　Ｄ１４３Ｒ変異体（ＰＣＮＡ１３）並びに３７５ｎＭのＮｕｃＳ蛋白質を含む以外は、実施例８記載のものと同様にした。また、リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３の条件と同じにした。
　リアルタイムＰＣＲ検出の結果、陽性対照核酸の増幅が並行して行われているにも関わらず、ＰＣＮＡを反応液に含まない場合よりも含む方が、明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、ＰＣＮＡが本発明の方法をさらに改善することが確認できた。
　本発明の高感度変異検出方法により、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの本来のミスマッチ認識形態にとらわれることなくミスマッチ塩基対形成を人為的に発生させることにより大量に存在する野生型遺伝子の増幅を排除し、希少な変異型遺伝子を特異的に増幅し、検出することができる。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
　SEQ ID NO: 1: EGFR_T790M_F primer
　SEQ ID NO: 2: EFGR_T790M_R primer
　SEQ ID NO: 3: T790M_NucG-1. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
　SEQ ID NO: 4: T790M_detect-1. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 4 is RNA.
　SEQ ID NO: 5: EGFR_L858R_F primer
　SEQ ID NO: 6: EGFR_L858R_R primer
　SEQ ID NO: 7: EGFR_L858R_ sup_p3. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
　SEQ ID NO: 8: EGFR_L858R_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 9: EGFR_19_delE746-A750_F primer
SEQ ID NO: 10: EGFR_19_delE746-A750_R primer
SEQ ID NO: 11: EGFR_19_delE746-A750 oligo-7.  3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 12: EGFR_2236-2250del. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 13: k-rasG12_F primer
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SEQ ID NO: 15: k-rasG12/13_s1. 3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 16: SEQ IDDNA fragment containing k-ras codon 12 and codon 13 regions
SEQ ID NO: 17: EGFRL858R_IC2_F primer
SEQ ID NO: 18: EGFRL858R_IC2_R primer
SEQ ID NO: 19: EGFRL858R_IC2_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 20: EGFRL858R_IC2_P3. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.

Claims (16)

  1. 　標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
    　（ｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；及び
    　（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
    を試料と接触させる工程を含む方法。
  2. 　非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 　非標的核酸とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 　標的核酸とオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた際に生じる２つのミスマッチが、隣接するか又は５塩基までの間隔で位置していることを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 　非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 　非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 　ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体である請求項１～６いずれか１項に記載の方法。
  8. 　酸性高分子物質存在下で行われることを特徴とする請求項１～７いずれか１項に記載の方法。
  9. 　標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に増幅する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
    　（１）請求項１～８いずれか１項に記載の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程；及び
    　（２）標的核酸を増幅する工程。
  10. 　標的核酸の増幅がＰＣＲによって行われることを特徴とする請求項９記載の方法。
  11. 　標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
    　（１）請求項９又は１０記載の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程；及び
    　（２）上記工程（１）と同時に又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程。
  12. 　標的核酸の検出がサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ法で行われることを特徴とする請求項１１記載の方法。
  13. 　請求項９～１２いずれか１項に記載の方法のための組成物であって、
    　（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
    　（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
    　（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
    　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物。
  14. 　請求項９～１２いずれか１項に記載の方法のためのキットであって、
    　（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
    　（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
    　（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
    　（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット。
  15. 　さらに酸性高分子物質を含むことを特徴とする請求項１３記載の組成物又は請求項１４記載のキット。
  16. 　酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と少なくとも１塩基が相違する塩基配列を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
    　（ｉ）酸性高分子物質； 
    　（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
    （ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法。
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