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WO2016034714A1 - Capsules à membrane conductrice - Google Patents

Capsules à membrane conductrice Download PDF

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Publication number
WO2016034714A1
WO2016034714A1 PCT/EP2015/070266 EP2015070266W WO2016034714A1 WO 2016034714 A1 WO2016034714 A1 WO 2016034714A1 EP 2015070266 W EP2015070266 W EP 2015070266W WO 2016034714 A1 WO2016034714 A1 WO 2016034714A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
capsule
liquid
gelled
envelope
electrically conductive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2015/070266
Other languages
English (en)
Inventor
Léopold MOTTET
Jérôme Bibette
Nicolas Bremond
Philippe Poulin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ESPCI Innov SAS
Original Assignee
ESPCI Innov SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ESPCI Innov SAS filed Critical ESPCI Innov SAS
Publication of WO2016034714A1 publication Critical patent/WO2016034714A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B01J13/046—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying combined with gelification or coagulation
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01M—PROCESSES OR MEANS, e.g. BATTERIES, FOR THE DIRECT CONVERSION OF CHEMICAL ENERGY INTO ELECTRICAL ENERGY
    • H01M8/00—Fuel cells; Manufacture thereof
    • H01M8/16—Biochemical fuel cells, i.e. cells in which microorganisms function as catalysts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
    • A61K2035/128—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers capsules, e.g. microcapsules
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01M—PROCESSES OR MEANS, e.g. BATTERIES, FOR THE DIRECT CONVERSION OF CHEMICAL ENERGY INTO ELECTRICAL ENERGY
    • H01M4/00—Electrodes
    • H01M4/86—Inert electrodes with catalytic activity, e.g. for fuel cells
    • H01M4/8647—Inert electrodes with catalytic activity, e.g. for fuel cells consisting of more than one material, e.g. consisting of composites
    • H01M4/8657—Inert electrodes with catalytic activity, e.g. for fuel cells consisting of more than one material, e.g. consisting of composites layered
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to a capsule formed of a liquid core and at least one gelled envelope completely encapsulating the liquid core at its periphery, said gelled envelope comprising an electrically conductive material; the use of such a capsule for the production of bioreactors, the screening of microorganisms or the production of an anode and / or cathode of a bacterial cell and a method for screening electroactive bacteria using said capsule and a device comprising such a capsule.
  • Household, industrial or animal waste thus represents a potential energy output of 17 GW and an energy of 5.10 11 kWh.
  • Microbial cells also known as bacteria cells, are remarkable green energy devices that exploit microorganisms to produce electricity from organic compounds such as waste.
  • the bacterium feeds on waste and at the same time releases electrons.
  • the inventors of the present invention have developed a capsule that can encapsulate an electro-active object that has many advantages over the prior art techniques for selecting electroactive microorganisms.
  • the capsule according to the invention makes it possible to compartmentalize the culture and therefore to decorrelate the bioreactor from the reading system of the electrochemical activity of the microorganisms. It also allows a culture over a longer time because the membrane of the capsule protects the culture from contaminations.
  • the culture in capsule allows the renewal of the medium without complex manipulations such as centrifugations or multiple pipetting. The easy renewal of the environment eliminates the problems related to evaporation.
  • the capsule according to the invention makes it possible to connect the culture to a reading system to know the electrochemical performances of the encapsulated organism.
  • the capsule according to the invention provides a new tool to the culture of microorganisms in liquid heart capsules by allowing to act electrically on the encapsulated organism.
  • the present invention therefore relates to a capsule comprising a liquid core, a gelled envelope completely encapsulating the liquid core at its periphery, the gelled envelope being adapted to retain the liquid heart when the capsule is immersed in a gas, an aqueous solution or an oil, the gelled envelope comprising at least one gelled polyelectrolyte and at least one surfactant, characterized in that the gelled envelope further comprises an electrically conductive material.
  • electrically conductive material is meant a material capable of passing an electric current, that is to say electrons, and convey the current, so electrons, from one point to another, through a solid medium. It is understood in the context of the present invention that the electrical conductivity covers all types of electrical conductivities, with the exception of the ionic conductivity, defined by the displacement of ions in a liquid. Thus, in the context of the present invention, the electrically conductive material is not an ionically conductive material.
  • the electrically conductive material consists of electrically conductive solid particles, more particularly of carbon nanotubes, carbon black or graphene.
  • said electrically conductive material is biocompatible.
  • biocompatible material is meant a material that does not degrade the biological medium in which it is used.
  • a biocompatible compound according to the invention is for example a polyelectrolyte of natural origin such as chitosan or sodium alginate.
  • the liquid heart of the capsule according to the invention consists of an aqueous or oily liquid that may contain molecules, microorganisms, or other objects larger than the maximum pore size of the membrane (about 20 nm).
  • the liquid core comprises at least one electro-active object.
  • electro-active object an electrically active or reactive object capable of exchanging, generating or capturing electrons or generating or sensing another electro-active object.
  • the electro-active object is chosen from microorganisms, cells, macromolecules and electroactive solid particles.
  • Macromolecules are molecules with at least several tens of atoms.
  • macromolecule is meant for example a protein, a lipid, a sugar or a polymer.
  • electroactive solid particles means particles onto which electroactive objects such as microorganisms, cells or macromolecules defined within the scope of the present invention are grafted or adsorbed.
  • the particles on which electroactive objects are grafted or adsorbed are, for example, particles of gold, polystyrene or silica.
  • the electro-active object is selected from bacteria of the genus Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.
  • the liquid heart of the capsule may comprise at the time of encapsulation variable amounts of molecules, microorganisms, macromolecules and cells that will be adapted depending on the type of encapsulated object.
  • the liquid heart of the capsule may comprise at the time of encapsulation an amount of cells greater than or equal to 1 cell / capsule.
  • It may also comprise at the time of encapsulation an amount of microorganisms greater than or equal to 1 microorganisms / capsule, preferably greater than the minimum inoculum.
  • an amount of microorganisms greater than or equal to 1 microorganisms / capsule, preferably greater than the minimum inoculum.
  • the minimum inoculum For each bacterium, there is indeed a minimal inoculum that corresponds to the minimum concentration of bacteria that allows the crop to grow.
  • the liquid contained in the liquid heart is physiologically acceptable. It may in particular comprise a saline solution, macromolecules or molecules, a physiologically acceptable viscosifier and / or a culture medium for the growth and / or culture of microorganisms or cells.
  • culture medium any medium, in particular any liquid medium, capable of supporting the growth of cells or microorganisms.
  • a core composed of 15% of PEG3500 and 0.45% of NaCl.
  • this saline solution for maintaining an acceptable osmolarity for the microorganism during encapsulation, this osmolarity being similar to that of the culture medium of the bacterium.
  • the liquid heart may also include physiologically acceptable excipients, such as thickeners, or rheology modifiers.
  • physiologically acceptable excipients such as thickeners, or rheology modifiers.
  • thickeners are, for example, polymers, cross-polymers, microgels, gums or proteins, including polysaccharides, celluloses, polysaccharides, silicone-based polymers and co-polymers, colloidal particles (silica, clays). , latex, biocompatible carbon nanotubes .
  • the gelled envelope of the capsules according to the invention comprises a gel containing water, at least one polyelectrolyte reactive with multivalent ions and the electrically conductive material.
  • the envelope further contains a surfactant resulting from its manufacturing process, as described below.
  • the envelope contains at least one surfactant, preferably two.
  • the present invention also relates to a capsule as mentioned above, comprising two surfactants.
  • the first of the two surfactants allows the formation of the capsule. It may for example be chosen from sodium dodecyl sulfate or sodium stearoyl-2-lactylate.
  • the second of the two surfactants makes it possible to stabilize the dispersion of the electrically conductive material.
  • It may for example be chosen from sodium dodecyl sulfate, polyoxyethylene (23) lauryl ether or polyoxyethylene (20) cetyl ether. More particularly, its dialysis then allows the destabilization of the dispersion and the creation of a conductive network.
  • the capsule according to the invention is obtained from a process comprising the following steps of:
  • the second solution containing at least one surfactant prior to contact with the first solution and therefore before contact with the gelling solution.
  • said second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte suitable for gelling and the conductive material mentioned in step a) of the process is formed by contacting the electrically conductive material in dispersed form and the polyelectrolyte suitable for gelling.
  • the gelled envelope is formed by a divalent ion gelled polysaccharide hydrogel comprising electrically conductive solid particles in dispersed and connected form thereby forming an electrically conductive network.
  • the ratio of the flow rate of the first solution to the flow rate of the second solution at the outlet of the double jacket is between 0.1 and 20, advantageously between 1 and 5, the gelled envelope having a thickness of between 1 .6% and 55%, advantageously between 6% and 20% of the diameter of the capsule, after recovery of the capsules formed.
  • the drops formed by coextrusion in the jacket fall by gravity through a volume of air into the gelling solution.
  • surfactant means an amphiphilic molecule having two parts of different polarity, one lipophilic and apolar, the other hydrophilic and polar.
  • a surfactant may be of ionic type (cationic or anionic), zwitterionic or nonionic.
  • the surfactant is preferably an anionic surfactant, a nonionic surfactant, a cationic surfactant, or a mixture thereof.
  • the molecular weight of the surfactant is between 150 g / mol and 10,000 g / mol, advantageously between 250 g / mol and 1500 g / mol.
  • the surfactant is an anionic surfactant, it is for example chosen from an alkyl sulphate, an alkyl sulphonate, an alkyl aryl sulphonate, an alkaline alkyl phosphate, a dialkyl sulphosuccinate, an alkaline earth salt of saturated or unsaturated fatty acids.
  • surfactants advantageously have at least one hydrophobic hydrocarbon chain having a number of carbons greater than 5 or even 10 and at least one hydrophilic anionic group, such as a sulphate, a sulphonate or a carboxylate linked to one end of the hydrophobic chain.
  • the surfactant is a cationic surfactant
  • it is for example chosen from an alkylpyridium or alkylammonium halide salt such as n-ethyldodecylammonium chloride or bromide, cetylammonium chloride or bromide (CTAB) .
  • CTLAB cetylammonium chloride or bromide
  • These surfactants advantageously have at least one hydrophobic hydrocarbon chain having a number of carbons greater than 5 or even 10 and at least one hydrophilic cationic group, such as a quaternary ammonium cation.
  • the surfactant is a nonionic surfactant
  • it is for example chosen from polyoxyethylenated and / or polyoxypropylenated derivatives of fatty alcohols, fatty acids, or alkylphenols, arylphenols, or from alkyl glucosides, polysorbates, cocamides.
  • the surfactant will be chosen from the following list: an alkyl sulphate, an alkyl sulphonate, an alkyl aryl sulphonate, an alkaline alkyl phosphate, a dialkyl sulphosuccinate, an alkaline earth salt of saturated or unsaturated fatty acids, a salt of alkylpyridium or alkylammonium halides such as n-ethyldodecylammonium chloride or bromide, cetylammonium chloride or bromide, polyoxyethylenated and / or polyoxypropylenated derivatives of fatty alcohols, fatty acids or alkylphenols, or from arylphenols, alkyl glucosides, polysorbates, cocamides or mixtures thereof.
  • the total weight percent of surfactant in the second solution will be greater than 0.01% and is advantageously between 0.01% and 0.5% by weight.
  • polyelectrolyte reactive with polyvalent ions means a polyelectrolyte capable of passing from a liquid state in an aqueous solution to a gelled state under the effect of contact with a gelling solution containing multivalent ions such as ions of an alkaline earth metal chosen for example from calcium ions, barium ions, magnesium ions.
  • aqueous solution of 2% by weight of polyelectrolyte then has a purely viscous behavior with shear gradients characteristic of the shaping process.
  • the viscosity of this zero shear solution is between 50 mPa.s and 10,000 mPa.s, advantageously between 1000 mPa.s and 7000 mPa.s.
  • the individual polyelectrolyte chains in the liquid state advantageously have a molar mass greater than 65000 g / mol.
  • the individual polyelectrolyte chains form, with the multivalent ions, a cohesive three-dimensional network that retains the liquid core and prevents its flow.
  • the individual chains are held together and can not flow freely relative to each other.
  • the viscosity of the formed gel is infinite.
  • the gel has a threshold of stress to the flow. This stress threshold is greater than 0.05 Pa.
  • the gel also has a modulus of elasticity that is non-zero and greater than 35 kPa.
  • the three-dimensional gel of polyelectrolyte contained in the envelope traps water and the surfactant.
  • the polyelectrolyte is preferably a biocompatible polymer that is harmless to the human body. It is for example produced biologically.
  • polysaccharides synthetic polyelectrolytes based on acrylates (sodium, lithium, potassium or ammonium polyacrylate, or polyacrylamide), synthetic polyelectrolytes based on sulfonates (poly (styrene sulfonate)). sodium, for example). More particularly, the polyelectrolyte is selected from an alkaline earth alginate, such as sodium alginate or potassium alginate, gellan or pectin.
  • Alginates are produced from brown algae called “laminar”, referred to as “sea weed”.
  • Such alginates advantageously have a content of ⁇ -L-guluronate greater than about 50%, preferably greater than 55%, or even greater than 60%.
  • the or each polyelectrolyte will be a polyelectrolyte reactive with multivalent ions, in particular a polysaccharide reactive with multivalent ions such as an alkali alginate, a gelane or a pectin, preferably an alkaline alginate advantageously having a bulk content ⁇ -L-guluronate greater than 50%, especially greater than 55%.
  • a polysaccharide reactive with multivalent ions such as an alkali alginate, a gelane or a pectin, preferably an alkaline alginate advantageously having a bulk content ⁇ -L-guluronate greater than 50%, especially greater than 55%.
  • the mass content of polyelectrolyte in the second solution may be less than 5% by weight and is advantageously between 0.5 and 3% by weight.
  • the capsule may further comprise an intermediate envelope encapsulating completely at its periphery the liquid heart, said intermediate envelope itself being completely encapsulated at its periphery by the gelled envelope.
  • This liquid intermediate envelope will be formed of an intermediate composition comprising a buffer or a culture medium, and / or a viscosifier.
  • the viscosifier will be a water-soluble polymer, such as polyethylene glycol (PEG), dextran, alginate in solution more diluted than in the outer casing or even more diluted alginate than in the outer casing mixed with an electrically conductive material.
  • the intermediate envelope is in contact with the heart and the outer envelope and keeps the heart out of contact with the outer envelope.
  • the intermediate phase is useful for stabilizing the capsule during its formation, for example in the case where the liquid core contains calcium that can induce gelation of the external phase too early. Indeed, depending on their composition, the culture media can interfere with the polymerization. It thus makes it possible to separate the liquid heart from the external phase to be gelated. It also protects the liquid heart during the formation of drops, the alginate of the outer layer which is not yet polymerized.
  • liquid core and the intermediate phase being both liquid, they are eventually mixed to form the liquid heart of the capsule.
  • the production of the drops according to the method according to the invention mentioned above is carried out by separate conveying in a double jacket of a first liquid solution containing the aqueous or oily solution in which is preferably included one or more microorganisms, cells, macromolecules or molecules and a second liquid solution containing a liquid polyelectrolyte suitable for gelling, the electrically conductive material and at least one surfactant, the conveying being as described in WO2010 / 063937.
  • the separated conveying takes place in a triple envelope, with a third solution comprising the intermediate solution.
  • the different flows come into contact and then form a multi-component drop, according to a hydrodynamic mode called “dripping” (drop-by-drop, described in particular in WO 2010 / 063937) or a mode called “jetting” (with jet instability, described in particular in FR 2012/2964017), depending on the size of the capsules desired.
  • dripping drop-by-drop, described in particular in WO 2010 / 063937
  • jetting with jet instability, described in particular in FR 2012/2964017
  • the first flow constitutes the liquid heart and the second flow constitutes the liquid outer envelope.
  • the second flux constitutes the liquid intermediate envelope and the third flux the external liquid envelope.
  • each multi-component drop is detached from the double (or triple) envelope and falls into a volume of air, before being immersed in a gelling solution containing a reagent capable of gelling the polyelectrolyte of the outer liquid envelope, to form the outer gelled envelope of the capsules according to the invention.
  • the multi-component drops may comprise additional layers between the outer shell and the liquid core, other than the intermediate shell.
  • This type of drop may be prepared by separate conveying of multiple compositions into multi-envelope devices.
  • the reagent capable of gelling the polyelectrolyte present in the gelling solution then forms bonds between the various polyelectrolyte chains present in the liquid outer envelope, then passing to the state gelled, thus causing gelation of the liquid outer shell.
  • the individual polyelectrolyte chains present in the liquid outer envelope are connected to each other to form a crosslinked network, also called hydrogel.
  • the polyelectrolyte present in the gelled outer shell is in the gelled state and is also called gelled polyelectrolyte or gelled polyelectrolyte.
  • a gelled outer envelope adapted to retain the assembly constituted by the heart or the heart and the intermediate envelope, is thus formed.
  • This gelled outer shell has a clean mechanical strength, that is to say that it is able to retain the liquid core and, in case of presence of an intermediate envelope, to completely surround the intermediate envelope. This has the effect of maintaining the internal structure of the liquid core and, if appropriate, the intermediate envelope.
  • the capsules according to the invention remain in the gelling solution until the outer shell is completely gelled, preferably without exceeding 60 minutes, even more preferably without exceeding 10 minutes.
  • the gelling solution can then optionally be removed and the gelled capsules can then optionally be collected and immersed in an aqueous rinsing solution, generally consisting essentially of water, in particular of physiological saline, in order to rinse off the gelled capsules formed.
  • an aqueous rinsing solution generally consisting essentially of water, in particular of physiological saline, in order to rinse off the gelled capsules formed.
  • This rinsing step makes it possible to extract from the gelled external envelope any excess of the reagent suitable for gelling the gelling solution, and all or part of the surfactant (or other species) initially contained in the second liquid solution.
  • the capsule is spherical in shape and has an outside diameter of less than 5 mm and in particular between 0.3 mm and 4 mm.
  • the gelled outer shell of the capsules according to the invention has a thickness ranging from 32 ⁇ to 1000 ⁇ , preferably from 120 ⁇ to 400 ⁇ , and advantageously from 100 ⁇ to 350 ⁇ .
  • the capsules according to the invention generally have a volume ratio between the core and all the intermediate and outer shells greater than 1, and preferably less than 5.
  • the capsules according to the invention generally have a volume ratio between the core and all of the intermediate and outer shells of between 1 and 5.
  • the capsules according to the present invention are useful in many sectors of activity such as for example bioenergy, bacterial, enzymatic cells or in the manufacture of electrodes.
  • a capsule according to the invention allows:
  • the present invention therefore also relates to the use of at least one capsule according to the invention, for the production of bioreactors.
  • the present invention therefore also relates to a method for producing bioreactors, comprising the implementation of at least one capsule according to the invention.
  • At least one capsule according to the invention for the screening of microorganisms, in particular electroactive microorganisms, more particularly those selected from: Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum and Enterobacter.
  • the capsule according to the invention can therefore be a tool for selecting electroactive organisms via the encapsulation of a single cell.
  • the conductivity of its membrane allows the passage of an electrode from the inside to the outside of the capsule and vice versa.
  • the membrane thus allows the recovery of electrons released into the external environment by the organisms in culture.
  • the present invention also relates to the use of at least one capsule according to the invention, for the recovery of electrons produced by microorganisms, in particular those chosen from: Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum and Enterobacter.
  • the present invention also relates to a method for recovering electrons produced by microorganisms, in particular those chosen from: Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum and Enterobacter, comprising the use of at least one capsule according to the invention. invention.
  • the present invention also relates to the use of a capsule according to the invention for the production of an anode and / or a bacterial cell cathode.
  • the capsule is electrically connected to another tank.
  • the two components are electrically connected and separated by an ion exchange membrane.
  • reservoir is meant a volume containing a redox species and an electrode. This reservoir completes the capsule, playing the role of anode or cathode so that the assembly constitutes a bacterial cell that is to say an anode and cathode electrically connected. If the chemical potential of the capsule is lower than that of the reservoir, the capsule is the anode of the battery. In the opposite case it constitutes the cathode of the stack.
  • the present invention also relates to a method for producing an anode and / or a bacterial cell cathode, comprising the implementation of a capsule according to the invention.
  • the present invention also relates to an anode and / or a bacterial cell cathode comprising a capsule according to the invention.
  • said anode and / or cathode further comprises a reservoir as mentioned above, the capsule and the reservoir being electrically connected and separated by an ion exchange membrane.
  • the present invention also relates to a method for screening electroactive bacteria comprising culturing bacteria contained in capsules according to the invention as defined above.
  • the screening consists of varying a parameter and selecting a value of this parameter that satisfies a predefined criterion.
  • the selection of the value of the parameter is generally done by a measurement corresponding to the criterion defined.
  • the parameter "electroactive bacteria” varies according to the criterion: "electrical performance”.
  • a method for screening electroactive bacteria according to the invention comprises:
  • each capsule comprising an electroactive bacterium
  • the monoclonal colonies of electroactive bacteria of step b. result from the division of said electroactive bacteria in each capsule.
  • the capsules are placed at a potential of 0.4 V relative to an Ag (s) / AgCl (s) electrode in the presence of a counter electrode.
  • the screening method according to the invention comprises an additional step e. in which the best performing monoclonal colony in electrical production is selected.
  • the culture conditions of the electroactive bacteria are determined by those skilled in the art according to each bacterium on the basis of his general knowledge.
  • the bacteria are cultured in a culture medium comprising a basic culture medium, the latter having the characteristic of being able to support the growth and development of said bacteria, in particular for the obtaining a monoclonal line.
  • a basic culture medium is well known to those skilled in the art. There may be mentioned, for example, LB Broth medium or 822 medium of DMSZ.
  • - P (k) is the probability that there are k bacteria in a capsule knowing the value of ⁇ .
  • ⁇ D 3 xr q xC / 6.
  • the present invention also relates to a device comprising at least one capsule according to the invention and at least one electrode, said at least one electrode being in contact with the gelled envelope of said at least one capsule.
  • a device comprising at least one capsule according to the invention and at least one electrode, said at least one electrode being in contact with the gelled envelope of said at least one capsule.
  • Figure 1 Left: Formation of formation of the bead composed of A in the heart and B around. Right: Extremity of the injector allowing the formation of the bead drop.
  • A Exit for the mixture A constituting the heart of the capsule
  • B outlet for the mixture B constituting the membrane of the future capsule.
  • Figure 3 Liquid heart and conductive membrane capsules
  • Figure 7 Mounting of the connection device of the conductive membrane capsule and the electrode system for measuring the current extracted from the capsule
  • Figure 8 Temporal evolution of the current from a conductive membrane capsule containing Geobacter sulfurreducens
  • the alginate powder LF200FTS, 1% by weight, is then added to the dispersion and then the whole is stirred magnetically for 12 hours in order to obtain the gelling solution.
  • the mixture 25 mL of milliQ water, 5.1 g of polyethylene glycol of average molecular weight 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) and 135 mg of NaCl are mixed with magnetic stirring for 3 h.
  • a two-drop is created with the device shown in Figures 1 and 2 according to the method described in WO2010 / 063937.
  • the mixture to be encapsulated is placed in the syringe A, it will leave the center of the injector (A) to form the heart of the future capsule.
  • the gélifiable mixture is placed in the syringe B, it will leave the edge of the injector (B) to form the membrane of the future capsule.
  • the creation of the dual-dropper and its parameters are controlled by controlling the flow rates of the two solutions (heart and exterior) via syringe shoots.
  • the flow rate of the syringe A is 5 ml / h
  • the flow rate of the syringe B is 5 ml / h.
  • the bead drop is then gelled by dropping it into the gelling bath.
  • the outer solution gels (alginate gels) and encloses the liquid heart of the bead.
  • the capsule is created as shown in Figure 3. The capsule is left in the gel bath for 1 h.
  • the flow rates for capsule formation are 5 ml / h for the outer solution (membrane) and 5 ml / h for the inner solution (core).
  • the injector has a diameter of 3mm (D), it is placed at 5cm above the gelation bath (H).
  • the final capsule has a diameter of 1, 7mm (R), with a membrane of 350 ⁇ average thickness (h).
  • the heart of the capsule has a volume of 1 1 ⁇ .
  • the evolution of the conductivity of the gélifiable mixture is measured using an impedance meter (Materials Mate 7260) on solid gel beads at 10 kHz, as a function of the mass percentage of nanotubes.
  • the protocol for creating mixtures with different mass percentages of carbon nanotubes is the same as that of the protocol for creating the gelling mixture of the creation of the capsules. Only the mass of nanotubes changes. 5 different mixtures are made with the following masses of nanotubes: 0; 50; 100; 150; 200 mg corresponding respectively to the following percentages: 0; 0.5; 1; 1, 5; 2% by mass.
  • the gelling mixtures are dripped from a height of 5 cm into the gelling bath (identical to that described above).
  • the beads are allowed to gel for 24 hours in the bath.
  • the marbles are then equilibrated in a solution of CaCl 2 at 1 mM for 48 hours to dialyze the SDS present in the gélifiable mixture.
  • a ball is placed between two screws of 3mm diameter 2.7mm apart, connected to the impedance meter. The conductivity at 10 kHz is measured.
  • the results show an increase in the conductivity of the gel with the addition of the nanotubes.
  • the addition of carbon nanotubes makes it possible to increase the conductivity of the hydrogel up to 100 times.
  • Protocol for manufacturing capsules comprising bacteria for monoclonal cultures.
  • the encapsulation device is thermally sterilized at 121 ° C. for 20 minutes by an autoclave (JSM table top sterilizer).
  • Monoclonal Encapsulation Determination of the monoclonal concentration allowing to have one (or less) bacterium per capsule.
  • - P (k) is the probability that there are k bacteria in a capsule knowing the value of ⁇
  • the volume of the heart of a capsule is 1 1 ⁇ .
  • This protocol thus makes it possible to obtain monoclonal capsules with a low risk of having capsules containing bacteria resulting from a non-monoclonal encapsulation (5% of the capsules containing bacteria).
  • the mixture 8.3 ml of milliQ water, 1.7 g of polyethylene glycol of average molecular weight 3500 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) and 45 mg of NaCl are mixed with magnetic stirring for 3 h. Then 1 ml of bacterial solution consisting of the bacteria is added to the concentration of 84 bacteria per milliliter in its culture medium (see below).
  • a two-drop is created with the device shown in Figures 1 and 5 according to the method described in WO2010 / 063937.
  • the bacterial mixture to be encapsulated (prepared with E. coli or Geobacter bacteria as indicated in the previous paragraph) is placed in the syringe A, it will leave the center of the injector (A) to form the heart of the future capsule .
  • the gélifiable mixture is placed in the syringe B, it will leave the edge of the injector (B) to form the membrane of the future capsule.
  • the creation of the dual-dropper and its parameters are controlled by controlling the flow rates of the two solutions (heart and exterior) via syringe shoots.
  • the flow rate of the syringe A is 5 ml / h
  • the flow rate of the syringe B is 5 ml / h.
  • the bead drop is then gelled by dropping it into the gelling bath.
  • the outer solution gels (alginate gels) and encloses the liquid heart of the bead.
  • the capsule is created.
  • the capsule is left in the gel bath for 15min.
  • the capsules are then cultured in the culture medium of the encapsulated bacterium (cf previous paragraph) supplemented with 5 mM of Cacl2, and under the culture conditions applicable to the encapsulated bacterium. After the incubation, capsules filled with bacteria are obtained.
  • the alginate powder LF200FTS, 1.5% by weight, is then added to the dispersion and then everything is stirred magnetically for 12 hours. 1 mM SDS is added with magnetic stirring to obtain the gelling solution.
  • the following mixture is prepared: 25 ml of milliQ water, 5.1 g of polyethylene glycol of average molar mass 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) and 135 mg of NaCl are mixed with magnetic stirring during 3h.
  • a bacterial solution comprising Geobacter bacteria is prepared as follows:
  • a drip is created with the device shown in Figures 1 and 2.
  • the mixture to be encapsulated is placed in the syringe A, it will leave the center of the injector (A) to form the heart of the future capsule.
  • the gélifiable mixture is placed in the syringe B, it will leave the edge of the injector (B) to form the membrane of the future capsule.
  • the creation of the dual-dropper and its parameters are controlled by controlling the flow rates of the two solutions (heart and exterior) via syringe shoots.
  • the flow rate of the syringe A is 5 ml / h
  • the flow rate of the syringe B is 4 ml / h.
  • the bead drop is then gelled by dropping it into the gelling bath.
  • the outer solution gels (alginate gels) and encloses the liquid heart of the bead.
  • the capsule is created as shown in Figure 2. The capsule is left in the gel bath for 3 minutes.
  • the capsule is then transferred to the specific medium of Geobacter.
  • the culture is kept for 4 days under anaerobic at 25 degrees Celsius.
  • the medium is not buffered with surfactants used in the formulation of the gelling mixture.
  • the surfactant is desorbed from the surface of the nanotubes. Unstabilized, the nanotubes connect to each other and create a conductive network within the hydrogel membrane.
  • the device consists of three electrodes: a reference electrode silver chloride (Ag (s) / AgCl (s)), a counter electrode composed of a platinum grid and a measuring electrode composed of a wire of platinum. These three electrodes are connected to a potentiostat which allows them to be put under potential.
  • the measuring electrode allows the connection of a capsule by a slight physical compression as illustrated in Figure 5 and Figure 6.
  • the three electrodes are immersed in 826 DMSZ medium without sodium fumarate.
  • FIG. 7 shows the evolution of the current as a function of time without capsule (approximately 4 * 10-8 A), then after the addition of a conductive membrane capsule containing Geobacter in the connection device.
  • the current reaches a value of 1, 7 * 10 "5 A.
  • the capsule is destroyed in Geobacter specific medium (826 DMSZ medium).
  • the encapsulated bacteria are thus recovered.
  • the concentration of bacteria is estimated by an optical density measurement.
  • the concentration of bacteria inside the capsule is of the order of 6.10 9 bac / mL.
  • the capsule according to the invention has many advantages:

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Abstract

La présente invention concerne une capsule étant formée d'un cœur liquide et d'au moins une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, ladite enveloppe gélifiée comprenant un matériau conducteur électrique; l'utilisation d'une telle capsule pour la production de bioréacteurs, le criblage de micro-organismes ou la réalisation d'une anode et/ou cathode de piles à bactéries ainsi qu'une méthode de criblage de bactéries électro-actives utilisant ladite capsule et un dispositif comprenant une telle capsule.

Description

Capsules à membrane conductrice
La présente invention concerne une capsule formée d'un cœur liquide et d'au moins une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, ladite enveloppe gélifiée comprenant un matériau conducteur électrique ; l'utilisation d'une telle capsule pour la production de bioréacteurs, le criblage de micro-organismes ou la réalisation d'une anode et/ou cathode de pile à bactéries ainsi qu'une méthode de criblage de bactéries électro-actives utilisant ladite capsule et un dispositif comprenant une telle capsule.
La limitation de la production de déchets ainsi que la question de leur valorisation, et plus particulièrement celle de la valorisation de leur énergie, est aujourd'hui une préoccupation majeure.
A l'heure actuelle, l'Union Européenne investit beaucoup dans le traitement des déchets.
Par ailleurs, le traitement des eaux usées aux États-Unis permet de générer 15 GW d'énergie (25 milliards de dollars) ce qui représente 3% de la puissance électrique des États-Unis.
Les déchets domestiques, industriels, ou d'origine animale représentent ainsi une puissance énergétique potentielle de 17 GW et une énergie de 1 , 5.1011 kWh.
Les piles microbiennes encore appelées piles à bactéries sont des dispositifs d'énergie verte remarquables qui exploitent les microorganismes afin de produire de l'électricité à partir de composés organiques comme les déchets. La bactérie se nourrit de déchets et en même temps, relargue des électrons.
Cependant, les piles à bactéries actuelles présentent certains inconvénients, et il existe un besoin d'amélioration de la production d'énergie par les piles bactériennes existantes, notamment par la recherche de micro-organismes plus électrochimiquement actifs.
La sélection d'organismes électro-actifs se fait actuellement en parallélisant des cultures dans des micro-puits muni d'une électrode (Hou, Han, & al PlosOne August 2009). Dans un domaine proche, la sélection à haut débit d'enzymes est faite grâce à des plaques de 96 puits (Song, O'Donohue Bioresource Technology 2010).
Les inventeurs de la présente invention ont mis au point une capsule pouvant encapsuler un objet électro-actif qui présente de nombreux avantages par rapport aux techniques de l'art antérieur de sélection de micro-organismes électro-actifs. La capsule selon l'invention permet de compartimenter la culture donc de décorréler le bioréacteur du système de lecture de l'activité électrochimique des microorganismes. Elle permet également une culture sur un temps plus long car la membrane de la capsule protège la culture des contaminations. De plus, et contrairement à ce qu'il est observé avec les cultures en micro-puit, la culture en capsule permet le renouvellement du milieu sans manipulations complexes telles que des centrifugations ou des pipetages multiples. Le renouvellement facilité du milieu élimine les problèmes liés à l'évaporation.
Par ailleurs, la capsule selon l'invention permet de connecter la culture à un système de lecture pour connaître les performances électrochimiques de l'organisme encapsulé.
Ainsi, la capsule selon l'invention apporte un outil nouveau à la culture de microorganismes dans des capsules à cœur liquide en permettant d'agir de manière électrique sur l'organisme encapsulé.
La présente invention a donc pour objet une capsule comprenant un cœur liquide, une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, l'enveloppe gélifiée étant propre à retenir le cœur liquide lorsque la capsule est plongée dans un gaz, une solution aqueuse ou une huile, l'enveloppe gélifiée comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif, caractérisée en ce que l'enveloppe gélifiée comprend en outre un matériau conducteur électrique.
Par « matériau conducteur électrique », on entend un matériau capable de laisser passer un courant électrique, c'est-à-dire des électrons, et de véhiculer le courant, donc des électrons, d'un point à un autre, à travers un milieu solide. Il est entendu dans le cadre de la présente invention que la conductivité électrique recouvre tous les types de conductivités électriques, à l'exception de la conductivité de type ionique, définie par le déplacement d'ions dans un liquide. Ainsi, dans le cadre la présente invention, le matériau conducteur électrique n'est pas un matériau conducteur ionique.
En particulier, le matériau conducteur électrique consiste en des particules solides électriquement conductrices, plus particulièrement en des nanotubes de carbone, du noir de carbone ou du graphène.
Encore plus particulièrement, ledit matériau conducteur électrique est biocompatible.
Par « matériau biocompatible », on entend un matériau qui ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il est utilisé. Un composé biocompatible selon l'invention est par exemple un polyélectrolyte d'origine naturel comme le chitosan ou l'alginate de sodium.
Le cœur liquide de la capsule selon l'invention est constitué d'un liquide aqueux ou huileux pouvant contenir des molécules, microorganismes, ou autres objets de taille supérieure à la taille maximale des pores de la membrane (environ 20 nm).
Selon un aspect de la présente invention, le cœur liquide comprend au moins un objet électro-actif.
Par « objet électro-actif », on entend un objet électriquement actif ou réactif, capable d'échanger, de générer ou de capter des électrons ou encore de générer ou de capter un autre objet électro-actif.
En particulier, l'objet électro-actif est choisi parmi les micro-organismes, les cellules, les macromolécules et les particules solides électroactives. Les macromolécules sont des molécules possédant au moins plusieurs dizaines d'atomes. Par « macromolécule », on entend par exemple une protéine, un lipide, un sucre ou un polymère. Par « particules solides électro-actives », on entend des particules sur lesquelles sont greffées ou adsorbées des objets électro-actifs tels que les microorganismes, cellules ou macromolécules définis dans le cadre de la présente invention. Les particules sur lesquelles sont greffées ou adsorbées des objets électro-actifs sont par exemple des particules d'or, de polystyrène ou de silice.
Encore plus particulièrement, l'objet électro-actif est choisi parmi les bactéries du genre Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.
Dans le cadre de la présente invention, le cœur liquide de la capsule peut comprendre au moment de l'encapsulation des quantités variables de molécules, microorganismes, macromolécules et cellules qui seront adaptées en fonction de type d'objet encapsulé.
Par exemple, le cœur liquide de la capsule peut comprendre au moment de l'encapsulation une quantité de cellules supérieure ou égale à 1 cellule/capsule.
Il peut également comprendre au moment de l'encapsulation une quantité de microorganismes supérieure ou égale à 1 microorganismes/capsule, de préférence supérieure à l'inoculum minimal. Pour chaque bactérie, il existe en effet un inoculum minimal qui correspond à la concentration minimale en bactérie qui permet à la culture de croître.
De préférence, le liquide contenu dans le cœur liquide est physiologiquement acceptable. Il peut notamment comprendre une solution saline, des macromolécules ou molécules, un viscosifiant physiologiquement acceptable et/ou un milieu de culture destiné à la croissance et/ou à la culture des micro-organismes ou des cellules.
Par « milieu de culture », on entend tout milieu, en particulier tout milieu liquide, susceptible de soutenir la croissance des cellules ou microorganismes. Pour l'encapsulation de bactéries, on utilise par exemple un cœur composé de 15% de PEG3500 et de 0.45% de NaCI. cette solution saline permettant de maintenir une osmolarité acceptable pour le microorganisme durant l'encapsulation, cette osmolarité étant similaire à celle du milieu de culture de la bactérie.
Le cœur liquide peut aussi comprendre des excipients physiologiquement acceptables, tels que des épaississants, ou des modificateurs de rhéologie. Ces épaississants sont par exemple des polymères, des cross-polymères, des microgels, des gommes ou des protéines, dont des polysaccharides, des celluloses, des polyosides, des polymères et co-polymères à base de silicone, des particules colloïdales (silice, argiles, latex, nanotubes de carbones biocompatibles ...).
L'enveloppe gélifiée des capsules selon l'invention comprend un gel contenant de l'eau, au moins un polyélectrolyte réactif aux ions multivalents et le matériau conducteur électrique. Selon l'invention, l'enveloppe contient en outre un agent tensioactif résultant de son procédé de fabrication, comme décrit par la suite.
En particulier, l'enveloppe contient au moins un tensio-actif, préférentiellement deux.
Ainsi la présente invention concerne également une capsule telle que mentionnée précédemment, comprenant deux agents tensioactifs.
En particulier, le premier des deux agents tensioactifs permet la formation de la capsule. Il peut par exemple être choisi parmi le sodium dodecyle sulfate ou le Stéaroyl-2- lactylate de sodium.
En particulier, le second des deux agents tensioactifs permet la stabilisation de la dispersion du matériau conducteur électrique. Il peut par exemple être choisi parmi le sodium dodecyle sulfate, le Polyoxyethylene (23) lauryl ether ou le Polyoxyethylene (20) cetyl ether. Plus particulièrement, sa dialyse permet ensuite la déstabilisation de la dispersion et la création d'un réseau conducteur.
Tout particulièrement, la capsule selon l'invention est obtenue à partir d'un procédé comprenant les étapes suivantes de :
a) convoyage séparé dans une double enveloppe d'une première solution liquide aqueuse ou huileuse et d'une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur électrique; b) formation, à la sortie de la double enveloppe, d'une série de gouttes, chaque goutte comprenant un noyau central formé de ladite première solution et une pellicule périphérique formée de ladite deuxième solution et recouvrant totalement le noyau central;
c) immersion de chaque goutte dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à réagir avec le polyélectrolyte de la pellicule pour le faire passer d'un état liquide à un état gélifié et former l'enveloppe gélifiée comprenant le matériau conducteur électrique, le noyau central formant le cœur liquide;
d) récupération des capsules formées;
la deuxième solution contenant au moins un agent tensioactif avant son contact avec la première solution et donc avant son contact avec la solution gélifiante.
Plus particulièrement, ladite deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur mentionnée à l'étape a) du procédé est formée par la mise en contact du matériau conducteur électrique sous forme dispersée et du polyélectrolyte propre à gélifier.
Encore plus particulièrement, l'enveloppe gélifiée est formée par un hydrogel de polysaccharide gélifié par ions divalents comprenant des particules solides électriquement conductrices sous forme dispersées et connectées formant ainsi un réseau électriquement conducteur.
Selon un des aspects de ce procédé, le rapport du débit de la première solution au débit de la deuxième solution à la sortie de la double enveloppe est compris entre 0.1 et 20, avantageusement entre 1 et 5, l'enveloppe gélifiée présentant une épaisseur comprise entre 1 .6% et 55%, avantageusement entre 6% et 20% du diamètre de la capsule, après récupération des capsules formées.
Selon un autre aspect du procédé, les gouttes formées par coextrusion dans la double enveloppe tombent par gravité à travers un volume d'air dans la solution gélifiante.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « tensioactif » une molécule amphiphile présentant deux parties de polarité différente, l'une lipophile et apolaire, l'autre hydrophile et polaire. Un tensioactif peut être de type ionique (cationique ou anionique), zwitterionique ou non ionique.
L'agent tensioactif est avantageusement un tensioactif anionique, un tensioactif non ionique, un tensioactif cationique ou un mélange de ceux-ci. La masse moléculaire de l'agent tensioactif est comprise entre 150 g/mol et 10000 g/mol, avantageusement entre 250 g/mol et 1500 g/mol. Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif anionique, il est par exemple choisi parmi un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d'alcalino-terreux d'acides gras saturés ou non. Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement anionique hydrophile, tel qu'un sulfate, un sulfonate ou un carboxylate lié à une extrémité de la chaîne hydrophobe.
Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif cationique, il est par exemple choisi parmi un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylammonium (CTAB). Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre de carbones supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement cationique hydrophile, tel qu'un cation d'ammonium quaternaire.
Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif non ionique, il est par exemple choisi parmi des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras, ou des alkylphénols, des arylphénols, ou parmi des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides.
En particulier, l'agent tensioactif sera choisi dans la liste suivante : un alkylsulfate, un alkyle sulfonate, un alkylarylsulfonate, un alkylphosphate alcalin, un dialkylsulfosuccinate, un sel d'alcalino-terreux d'acides gras saturés ou non, un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n- éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylamonium, des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras ou des alkylphénols, ou parmi des arylphénols, des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides ou leurs mélanges.
Plus particulièrement, le pourcentage massique total en agent tensioactif dans la deuxième solution sera supérieur à 0,01 % et est avantageusement compris entre 0,01 % et 0,5% en masse.
Par « polyélectrolyte réactif aux ions polyvalents », on entend, au sens de la présente invention, un polyélectrolyte susceptible de passer d'un état liquide dans une solution aqueuse à un état gélifié sous l'effet d'un contact avec une solution gélifiante contenant des ions multivalents tels que des ions d'un métal alcalino-terreux choisis par exemple parmi les ions calcium, les ions baryum, les ions magnésium.
Dans l'état liquide, les chaînes individuelles de polyélectrolyte sont sensiblement libres de s'écouler les unes par rapport aux autres. Une solution aqueuse de 2% en masse de polyélectrolyte présente alors un comportement purement visqueux aux gradients de cisaillement caractéristiques du procédé de mise en forme. La viscosité de cette solution à cisaillement nul est entre 50 mPa.s et 10000 mPa.s, avantageusement entre 1000 mPa.s et 7000 mPa.s.
Les chaînes individuelles de polyélectrolyte dans l'état liquide présentent avantageusement une masse molaire supérieure à 65000 g/mole.
Dans l'état gélifié, les chaînes individuelles de polyélectrolyte forment, avec les ions multivalents, un réseau tridimensionnel cohésif qui retient le cœur liquide et empêche son écoulement. Les chaînes individuelles sont retenues les unes par rapport aux autres et ne peuvent pas s'écouler librement les unes par rapport aux autres. Dans cet état, la viscosité du gel formé est infinie. De plus, le gel a un seuil de contrainte à l'écoulement. Ce seuil de contrainte est supérieur à 0,05 Pa. Le gel possède également un module d'élasticité non nul et supérieur à 35 kPa.
Le gel tridimensionnel de polyélectrolyte contenu dans l'enveloppe emprisonne de l'eau et l'agent tensioactif.
Le polyélectrolyte est de préférence un polymère biocompatible inoffensif pour le corps humain. Il est par exemple produit biologiquement.
Avantageusement, il est choisi parmi les polysaccharides, polyélectrolytes de synthèse à base d'acrylates (polyacrylate de sodium, de lithium, de potassium ou d'ammonium, ou polyacrylamide), de polyélectrolytes de synthèse à base de sulfonates (poly(styrène sulfonate) de sodium, par exemple). Plus particulièrement, le polyélectrolyte est choisi parmi un alginate d'alcalino-terreux, tel qu'un alginate de sodium ou un alginate de potassium, une gellane ou une pectine.
Les alginates sont produits à partir d'algues brunes appelées «laminaires», désignées par le terme anglais « sea weed ».
De tels alginates présentent avantageusement une teneur en a-L-guluronate supérieure à environ 50%, de préférence supérieure à 55%, voire supérieure à 60%.
En particulier, le ou chaque poyélectrolyte sera un polyélectrolyte réactif aux ions multivalents, notamment un polysaccharide réactif aux ions multivalents tel qu'un alginate d'alcalin, une géllane ou une pectine, de préférence un alginate d'alcalin ayant avantageusement une teneur en bloc α-L-guluronate supérieure à 50%, notamment supérieure à 55%.
Plus particulièrement, la teneur massique en polyélectrolyte dans la deuxième solution peut être inférieure à 5% en masse et est avantageusement comprise entre 0,5 et 3% en masse.
Selon un aspect de la présente invention, la capsule pourra comprendre en outre une enveloppe intermédiaire encapsulant totalement à sa périphérie le cœur liquide, ladite enveloppe intermédiaire étant elle-même encapsulée totalement à sa périphérie par l'enveloppe gélifiée.
Cette enveloppe intermédiaire liquide sera formée d'une composition intermédiaire comprenant un tampon ou un milieu de culture, et/ou un viscosifiant. En particulier, le viscosifiant sera un polymère hydrosoluble, tel que du Polyéthylène glycol (PEG), du dextran, de l'alginate en solution plus dilué que dans l'enveloppe extérieure ou encore de l'alginate plus dilué que dans l'enveloppe extérieure mélangé à un matériau conducteur électrique.
L'enveloppe intermédiaire est au contact du cœur et de l'enveloppe externe et maintient le cœur hors de contact de l'enveloppe externe.
La phase intermédiaire est utile pour stabiliser la capsule lors de sa formation, par exemple dans le cas où le cœur liquide contient du calcium susceptible d'induire trop tôt la gélification de la phase externe. En effet, selon leur composition, les milieux de culture peuvent interférer avec la polymérisation. Elle permet ainsi de séparer le cœur liquide de la phase externe à gélifier. Elle permet aussi de protéger le cœur liquide pendant la formation des gouttes, de l'alginate de la couche externe qui n'est pas encore polymérisé.
En particulier, le cœur liquide et la phase intermédiaire étant toutes deux liquides, celles-ci se mélangent à terme pour former le cœur liquide de la capsule.
La présence d'une telle enveloppe intermédiaire est notamment décrite dans l'article scientifique « Formation of liquid-core capsules having a thin hydrogel membrane : liquid pearls », Bremond et al, Soft Matter, 2010, 2484-2488.
Production des gouttes
La production des gouttes selon le procédé selon l'invention mentionné précédemment est effectuée par convoyage séparé dans une double enveloppe d'une première solution liquide contenant la solution aqueuse ou huileuse dans laquelle est préférentiellement comprise un ou plusieurs micro-organismes, cellules, macromolécules ou molécules et d'une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier, le matériau conducteur électrique et au moins un agent tensioactif, le convoyage étant tel que décrit dans WO2010/063937.
Dans le cas de la présence supplémentaire d'une enveloppe intermédiaire, le convoyage séparé s'effectue dans une triple enveloppe, avec une troisième solution comprenant la solution intermédiaire.
A la sortie de la double (ou triple) enveloppe, les différents flux entrent en contact et se forme alors une goutte multi-composante, selon un mode hydrodynamique dit de « dripping » (goutte-à-goutte, décrit notamment dans WO 2010/063937) ou un mode dit de « jetting » (avec une instabilité de jet, décrit notamment dans FR 2012/2964017), selon la taille des capsules souhaitées.
Le premier flux constitue le cœur liquide et le deuxième flux constitue l'enveloppe externe liquide. Dans le cas de la présence de l'enveloppe intermédiaire, le deuxième flux constitue l'enveloppe intermédiaire liquide et le troisième flux l'enveloppe externe liquide.
Selon le mode de production, chaque goutte multi-composante se détache de la double (ou triple) enveloppe et chute dans un volume d'air, avant d'être immergée dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à gélifier le polyélectrolyte de l'enveloppe externe liquide, pour former l'enveloppe externe gélifiée des capsules selon l'invention.
Selon certaines variantes, les gouttes multi-composantes peuvent comprendre des couches supplémentaires entre l'enveloppe externe et le cœur liquide, autre que l'enveloppe intermédiaire. Ce type de goutte peut être préparé par convoyage séparé de multiples compositions dans des dispositifs à multiples enveloppes.
Etape de qélification
Lorsque la goutte multi-composante entre en contact de la solution gélifiante, le réactif propre à gélifier le polyélectrolyte présent dans la solution gélifiante forme alors des liaisons entre les différentes chaînes de polyélectrolyte présentes dans l'enveloppe externe liquide, passant alors à l'état gélifié, provoquant ainsi la gélification de l'enveloppe externe liquide.
Sans vouloir être lié à une théorie particulière, lors du passage à l'état gélifié du polyélectrolyte, les chaînes individuelles de polyélectrolyte présentes dans l'enveloppe externe liquide se raccordent les unes aux autres pour former un réseau réticulé, aussi appelé hydrogel.
Dans le cadre de la présente description, le polyélectrolyte présent dans l'enveloppe externe gélifiée est à l'état gélifié et est également appelé polyélectrolyte à l'état gélifié ou encore polyélectrolyte gélifié.
Une enveloppe externe gélifiée, propre à retenir l'ensemble constitué par le cœur ou le cœur et l'enveloppe intermédiaire, est ainsi formée. Cette enveloppe externe gélifiée présente une tenue mécanique propre, c'est-à-dire qu'elle est capable retenir le cœur liquide et, en cas de présence d'une enveloppe intermédiaire, d'entourer totalement l'enveloppe intermédiaire. Ceci a pour effet de maintenir la structure interne du cœur liquide et le cas échéant, de l'enveloppe intermédiaire.
Les capsules selon l'invention séjournent dans la solution gélifiante le temps que l'enveloppe externe soit complètement gélifiée, de préférence sans excéder 60 minutes, encore plus préférentiellement sans excéder 10 minutes. On peut ensuite éventuellement éliminer la solution gélifiante et les capsules gélifiées peuvent ensuite éventuellement être collectées et plongées dans une solution aqueuse de rinçage, généralement essentiellement constituée d'eau, en particulier de l'eau physiologique, afin de rincer les capsules gélifiées formées. Cette étape de rinçage permet d'extraire de l'enveloppe externe gélifiée un éventuel excès du réactif propre à gélifier de la solution gélifiante, et tout ou partie du tensioactif (ou d'autres espèces) contenu initialement dans la deuxième solution liquide.
La présence d'un tensioactif dans la deuxième solution liquide permet d'améliorer la formation et la gélification des gouttes multi-composantes selon le procédé tel que décrit précédemment.
Caractéristiques des capsules gélifiées
Avantageusement, la capsule est de forme sphérique et présente un diamètre extérieur inférieur à 5 mm et compris notamment entre 0.3 mm et 4 mm.
De préférence, l'enveloppe externe gélifiée des capsules selon l'invention possède une épaisseur comprise de 32 μηι à 1000 μηι, de préférence de 120 μηι à 400 μηι, et avantageusement de 100 μηι à 350 μηι.
Les capsules selon l'invention présentent généralement un rapport volumique entre le cœur et l'ensemble des enveloppes intermédiaire et externe supérieur à 1 , et de préférence inférieur à 5.
Selon un mode de réalisation particulier, les capsules selon l'invention présentent généralement un rapport volumique entre le cœur et l'ensemble des enveloppes intermédiaire et externe compris entre 1 et 5.
Ainsi, les capsules selon la présente invention sont utiles dans de nombreux secteurs d'activités comme par exemple celui des bioénergies, des piles bactériennes, enzymatiques ou encore dans celui de la fabrication d'électrodes.
Elles trouvent de nombreuses applications telles que la sélection de microorganismes électro-actifs ou la création d'énergie électrique à partir de déchets.
Ainsi, une capsule selon l'invention permet:
- la production à grande cadence de bio-réacteurs (1 bio-réacteur/seconde) ;
- le criblage de micro-organismes en permettant l'encapsulation d'une seule cellule qui donnera une colonie mono-clonale, les réservoirs et donc les cellules d'intérêts pouvant être ensuite choisis selon l'électro-activité ;
- la digitalisation, parallélisation et miniaturisation de la culture ;
- la récupération d'électrons et donc de l'énergie produite par une population de micro-organismes ; - l'encapsulation d'espèces électrochimiques et le déclenchement de réactions internes à la capsule via le contact d'une électrode avec la membrane.
- la polarisation du réacteur pour permettre la croissance de micro-organismes sous un potentiel donné et ajustable
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne donc également l'utilisation d'au moins une capsule selon l'invention, pour la production de bioréacteurs.
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne donc également une méthode pour produire des bioréacteurs, comprenant la mise en œuvre d'au moins une capsule selon l'invention.
Elle concerne également l'utilisation d'au moins une capsule selon l'invention, pour le criblage de micro-organismes, en particulier de microorganismes électro-actifs, encore plus particulièrement de ceux choisi parmi : Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum et Enterobacter.
La capsule selon l'invention peut donc constituer un outil de sélection d'organismes électro-actifs via l'encapsulation d'une cellule unique.
Par ailleurs, la conductivité de sa membrane permet le passage d'une électrode de l'intérieur vers l'extérieur de la capsule et inversement. La membrane permet donc la récupération d'électrons relargués dans le milieu extérieur par les organismes en culture.
Ainsi, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins une capsule selon l'invention, pour la récupération d'électrons produits par des microorganismes, en particulier ceux choisi parmi : Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum et Enterobacter.
La présente invention concerne également une méthode de récupération d'électrons produits par des micro-organismes, en particulier ceux choisi parmi : Escherichia Coli, Geobacter, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum et Enterobacter, comprenant la mise en œuvre d'au moins une capsule selon l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une capsule selon l'invention, pour la réalisation d'une anode et/ou d'une cathode de pile à bactéries.
En particulier, dans le cadre de cette utilisation, la capsule est connectée électriquement à un autre réservoir.
Plus particulièrement, les deux constituants (capsule et réservoir) sont connectés électriquement et séparés par une membrane échangeuse d'ion.
Par « réservoir », on entend un volume contenant une espèce oxydoréductrice et une électrode. Ce réservoir complète la capsule, en jouant le rôle d'anode ou de cathode afin que l'ensemble constitue une pile à bactérie c'est-à-dire une anode et une cathode connectées électriquement. Si le potentiel chimique de la capsule est inférieur à celui du réservoir, la capsule constitue l'anode de la pile. Dans le cas contraire elle constitue la cathode de la pile.
La présente invention concerne également une méthode de réalisation d'une anode et/ou d'une cathode de pile à bactéries, comprenant la mise en œuvre d'une capsule selon l'invention.
La présente invention concerne également une anode et/ou une cathode de pile à bactéries comprenant une capsule selon l'invention.
Plus particulièrement, ladite anode et/ou cathode comprend en outre un réservoir tel que susmentionné, la capsule et le réservoir étant connectés électriquement et séparés par une membrane échangeuse d'ion.
Selon un de ces aspects, la présente invention concerne également une méthode de criblage de bactéries électro-actives comprenant la culture de bactéries contenues dans des capsules selon l'invention telles que définies précédemment.
Comme démontré dans la partie expérimentale, il est possible d'encapsuler une bactérie par capsule pour créer des cultures monoclonales encapsulées. Il est également possible de mesurer la production de courant électrique généré par une population de bactéries encapsulées dans une capsule à membrane conductrice. La méthode d'encapsulation permet la création de capsules en série.
Le criblage consiste à faire varier un paramètre et à sélectionner une valeur de ce paramètre répondant à un critère prédéfini. La sélection de la valeur du paramètre se fait généralement par une mesure correspondant au critère défini.
Dans le cadre de la présente invention, le paramètre : « bactéries électro-actives » varie suivant le critère : « performance électrique ».
Selon un de ces aspects, une méthode de criblage de bactéries électro-actives selon l'invention comprend:
a. l'encapsulation de bactéries électro-actives dans les capsules selon l'invention, chaque capsule comprenant une bactérie électro-active;
b. l'obtention de colonies monoclonales de bactéries électro-actives;
c. la connexion électrique desdites capsules à un potentiostat; et
d. la mesure de la production de courant pour chaque capsule.
En particulier, les colonies monoclonales de bactéries électro-actives de l'étape b. résultent de la division desdites bactéries électro-actives dans chaque capsule.
En particulier, lors de la connexion électrique de l'étape c, les capsules sont placées au potentiel 0,4V par rapport à une électrode Ag(s)/AgCI(s) en présence d'une contre électrode. En particulier, la méthode de criblage selon l'invention comporte une étape additionnelle e. dans laquelle la colonie monoclonale la plus performante en production électrique est sélectionnée.
Les conditions de culture des bactéries électro-actives sont déterminées par l'homme du métier en fonction de chaque bactérie sur la base de ses connaissances générales.
Dans le cadre de la présente invention, les bactéries sont cultivées dans un milieu de culture comprenant un milieu de culture de base, celui-ci ayant pour caractéristique d'être capable de soutenir la croissance et le développement desdites bactéries, en particulier pour l'obtention d'une lignée monoclonale. Ce type de milieu de culture de base est bien connu de l'homme du métier. On peut citer par exemple le milieu LB Broth ou le milieu 826 de DMSZ.
Dans le cadre de la présente invention, lorsque la capsule doit comprendre une population monoclonale de bactéries, l'homme du métier pourra utiliser la loi de Poisson pour déterminer la concentration de bactéries à encapsuler pour obtenir une bactérie par capsule: p(k) = P(X = k) =
, dans laquelle :
- λ est le nombre moyen de bactérie par volume de capsule ; et
- P(k) est la probabilité qu'il y ait k bactéries dans une capsule connaissant la valeur de λ.
La valeur de λ dépend de la concentration C de cellules de la première solution exprimée en nombre de cellules par unité de volume, du diamètre D de la capsule et du rapport rq des débits de la façon suivante : λ = D3xrqxC/6.
Selon un autre de ces aspects, la présente invention concerne également un dispositif comprenant au moins une capsule selon l'invention et au moins une électrode, ladite au moins une électrode étant en contact avec l'enveloppe gélifiée de ladite au moins une capsule. La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci-dessous qui n'en limitent pas la portée.
FIGURES
Figure 1 : Gauche : Montage de formation de la bi-goutte composée de A au cœur et de B autour. Droite : Extrémité de l'injecteur permettant la formation de la bi-goutte. (A) Sortie pour le mélange A constituant le cœur de la capsule, (B) sortie pour le mélange B constituant la membrane de la future capsule.
Figure 2 : Schéma du montage de fabrication des capsules à cœur liquide et à membrane conductrice (D=3mm, η=350μηι, R=1 ,7mm, H=5cm)
Figure 3 : Capsules à cœur liquide et à membrane conductrice
Figure 4 : Evolution de la conductivité d'une capsule selon l'invention en fonction du pourcentage massique en nanotubes
Figure 5 : Schéma du montage d'encapsulation de bactéries avec une concentration de la solution de cœur réglée pour avoir une bactérie par capsule (D=3mm, ή=350μηι, R=1 ,7mm, H=5cm)
Figure 6 : Montage du dispositif de connexion de la capsule à membrane conductrice et du système d'électrode permettant la mesure du courant extrait de la capsule avec A=PDMS (polydiméthylesiloxane) permettant la compression mécanique de la capsule, B= capsule à membrane conductrice connectée, C=électrode de mesure : fil de platine, D=contre électrode : grille de platine, E=électrode de référence : Fil Ag(S)/AgCI(S)
Figure 7 : Montage du dispositif de connexion de la capsule à membrane conductrice et du système d'électrode permettant la mesure du courant extrait de la capsule
Figure 8 : Evolution temporelle du courant issu d'une capsule à membrane conductrice contenant Geobacter sulfurreducens
EXEMPLES
Protocole de fabrication des capsules à cœur liquide et à membrane conductrice semi-perméable
Création du mélange qélifiable :
Le mélange : 10 mL d'eau milliQ, 150 mg de nanotubes de carbone et 200 mg de SDS est dispersé sous ultrasons pendant 1 h15 avec un sonicateur Vibracell 75042 Bioblock Scientific selon les paramètres suivant : Puissance = 35%Pmax ; Puise : 3s on, 1 s off. La poudre d'alginate LF200FTS, 1 % en masse, est ensuite ajoutée à la dispersion puis le tout est mis sous agitation magnétique pendant 12h afin d'obtenir la solution gélifiable.
Création du mélange à encapsuler :
Le mélange : 25 mL d'eau milliQ, 5,1 g de polyéthylène glycol de masse molaire moyenne 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) et 135mg de NaCI sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h.
Création du bain de gélification :
1 L d'eau milliQ, 10g de CaCI2, 50μ\- de tween20 à 10% en masse sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h. Création de la capsule :
Une bi-goutte est créée avec le dispositif présenté en figures 1 et 2 selon la méthode décrite dans WO2010/063937.
Le mélange à encapsuler est placé dans la seringue A, il sortira du centre de l'injecteur (A) pour constituer le cœur de la future capsule.
Le mélange gélifiable est placé dans la seringue B, il sortira du bord de l'injecteur (B) pour constituer la membrane de la future capsule.
La création de la bi-goutte et ses paramètres sont contrôlés en contrôlant les débits des deux solutions (cœur et extérieur) via des pousses-seringues. Le débit de la seringue A est de 5ml_/h, le débit de la seringue B est 5mL/h.
La bi-goutte est ensuite gélifiée en la faisant tomber dans le bain de gélification. La solution extérieure gélifie (l'alginate gélifie) et enferme le cœur liquide de la bi-goutte. La capsule est créée telle qu'illustrée en figure 3. La capsule est laissée dans le bain de gélification pendant 1 h.
Description de la capsule :
Les débits pour la formation de la capsule sont de 5ml_/h pour la solution extérieure (membrane) et de 5mL/h pour la solution intérieure (cœur).
L'injecteur a un diamètre de 3mm (D), il est placé à 5cm au-dessus du bain de gélification (H).
Pour ces débits, la capsule finale à un diamètre de 1 ,7mm (R), avec une membrane de 350μηι d'épaisseur moyenne (h). Le cœur de la capsule a un volume de 1 1 μ .
Caractérisation de la conductivité du mélange gélifiable
L'évolution de la conductivité du mélange gélifiable est mesurée à l'aide d'un impédancemètre (Materials Mate 7260) sur des billes de gels pleines à 10kHz, en fonction du pourcentage massique en nanotubes.
Création des mélanges gélifiable :
Le protocole de création des mélanges à différents pourcentages massique en nanotubes de carbone est le même que celui du protocole de création du mélange gélifiable de la création des capsules. Seule la masse de nanotubes change. 5 mélanges différents sont réalisés avec les masses de nanotubes suivantes : 0 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 mg correspondant respectivement aux pourcentages suivants : 0 ; 0,5 ;1 ; 1 ,5 ; 2% en masse.
Création des billes de gels :
A l'aide d'une pipette pasteur plastique VWR de 7mL, les mélanges gélifiables sont faits goutter d'une hauteur de 5 cm dans le bain de gélification (identique à celui décrit précédemment). Les billes sont laissées à gélifier pendant 24h dans le bain. Les billes sont ensuite équilibrées dans une solution de CaCI2 à 1 mM pendant 48h pour dialyser le SDS présent dans le mélange gélifiable.
Des billes pleines de 3 mm de diamètre composées de 1 % en masse d'alginate et de pourcentages massique de nanotubes de carbones variables sont ainsi obtenues.
Protocole de mesure :
Pour mesurer la conductivité, une bille est placée entre deux vis de 3mm de diamètres distantes de 2,7mm, connectée à l'impédancemètre. La conductivité à 10 kHz est mesurée.
Les résultats sont présentés en figure 4.
Les résultats montrent une augmentation de la conductivité du gel avec l'ajout des nanotubes. L'ajout de nanotubes de carbones permet d'augmenter jusqu'à 100 fois la conductivité de l'hydrogel.
Protocole de fabrication de capsules comprenant des bactéries pour cultures monoclonales.
Pour l'encapsulation des bactéries, l'ensemble des solutions utilisées sont stérilisés par filtration à 0,2μηι. Le dispositif d'encapsulation est stérilisé thermiquement à 121 °C pendant 20 minutes par une autoclave (JSM table top sterilizer).
Création du mélange gélifiable :
1 .7% en masse d'alginate LF200FTS et 5mM de SDS sont dissous dans 10 mL d'eau milliQ puis mis sous agitation magnétique pendant 12h pour obtenir le mélange gélifiable.
Création du bain de gélification :
1 L d'eau milliQ, 10g de CaCI2, 50μ\- de tween20 à 10% en masse sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h.
Encapsulation monoclonale : Détermination de la concentration monoclonale permettant d'avoir une (ou moins) bactérie par capsule.
Pour préparer la solution de bactéries à la concentration monoclonale, la loi de Poisson est utilisée: p(k) P(x k) fc! e |aqUelle :
- λ est le nombre moyen de bactérie par volume de capsule ;
- P(k) est la probabilité qu'il y ait k bactéries dans une capsule connaissant la valeur de λ ; et
- le volume du cœur d'une capsule est de 1 1 μ .
Ainsi, en appliquant cette loi avec 0,1 bactérie par capsule (9 bactéries/m L), 90% des capsules sont sans bactérie (p(0)), 9% des capsules obtenues sont monoclonales, c'est à dire avec une bactérie (p(1 )), moins de 0.5% des capsules obtenues sont avec deux bactéries (p(2)) et moins 0.02% des capsules obtenues sont avec 3 bactéries, etc.
Ce protocole permet ainsi d'obtenir des capsules monoclonales avec un risque faible d'avoir des capsules contenant des bactéries issues d'une encapsulation non monoclonale (5% des capsules contenant des bactéries).
Création du mélange bactérien à encapsuler :
Le mélange : 8,3mL d'eau milliQ, 1 ,7g de polyéthylène glycol de masse molaire moyenne 3500 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) et 45mg de NaCI sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h. On y ajoute ensuite 1 mL de solution bactérienne composée de la bactérie à la concentration de 84 bactéries par millilitre dans son milieu de culture (voir ci-dessous).
Ainsi, une solution bactérienne comprenant des bactéries E.coli est préparée de la façon suivante : 2\xL d'une souche de bactéries E.coli MC4100 YFP conservé à -80°C est ajouté à 10mL de LB Broth (Sigma). Le mélange est mis en culture sous agitation circulaire pendant 12h à 37°C. A 12h, la concentration en bactérie est évaluée par une mesure d'absorbance à 600nm. La différence de densité optique observée à 600nm entre le milieu LB Broth et la culture bactérienne (Delta.D.O en unité de densité optique) permet d'obtenir la concentration en bactérie par millilitre via la formule : Concentration= Delta.D.O * 4.108 bactéries/mL. Cette culture est ensuite diluée par dilutions successives dans du LB Broth pour atteindre la concentration de 84 bactéries/mL.
Ainsi, une solution bactérienne comprenant des bactéries Geobacter est préparée de la façon suivante : 1 mL d'une souche de bactéries Geobacter Sulfurreducens fournie par DMSZ est ajouté à 9mL de son milieu spécifique (milieu 826 DMSZ) dans un tube hungate de 12 mL sous anaérobie à 30°C pendant 4 jours. A 4 jours, la concentration en bactérie est évaluée par une mesure d'absorbance à 600nm. La différence de densité optique observée à 600nm entre le milieu de culture 826 et la culture bactérienne (Delta.D.O en unité de densité optique) permet d'obtenir la concentration en bactérie par millilitre via la formule : Concentration = Delta.D.O * 4.108 bactéries/mL. Cette culture est ensuite diluée par dilutions successives dans du milieu 826 pour atteindre la concentration de 84 bactéries/mL.
Création de la capsule de culture monoclonale :
Une bi-goutte est créée avec le dispositif présenté dans les figures 1 et 5 selon la méthode décrite dans WO2010/063937.
Le mélange bactérien à encapsuler (préparé au choix avec des bactéries E.Coli ou Geobacter comme indiqué dans le paragraphe précédent) est placé dans la seringue A, il sortira du centre de l'injecteur (A) pour constituer le cœur de la future capsule. Le mélange gélifiable est placé dans la seringue B, il sortira du bord de l'injecteur (B) pour constituer la membrane de la future capsule.
La création de la bi-goutte et ses paramètres sont contrôlés en contrôlant les débits des deux solutions (cœur et extérieur) via des pousses-seringues. Le débit de la seringue A est de 5ml_/h, le débit de la seringue B est 5mL/h.
La bi-goutte est ensuite gélifiée en la faisant tomber dans le bain de gélification. La solution extérieure gélifie (l'alginate gélifie) et enferme le cœur liquide de la bi-goutte. La capsule est créée. La capsule est laissée dans le bain de gélification pendant 15min. Les capsules sont ensuite mises en culture dans le milieu de culture de la bactérie encapsulée (cf paragraphe précédent) additionné de 5mM de Cacl2, et dans les conditions de culture applicables à la bactérie encapsulée. Après l'incubation, on obtient des capsules remplies de bactéries.
Les résultats de l'encapsulation monoclonale sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous.
Tableau 1 :
Figure imgf000019_0001
Protocole de fabrication des capsules à cœur liquide et à membrane conductrice semi-perméable enfermant Geobacter et dispositif de connexion pour la récupération d'électrons produits par les bactéries encapsulées
Création du mélange gélifiable
Le mélange : 10 mL d'eau milliQ, 200 mg de nanotubes de carbone et 150 mg de Brij35 est dispersé sous ultrasons pendant 1 h15 avec un sonicateur Vibracell 75042 Bioblock Scientific selon les paramètres suivant : Puissance = 35%Pmax ; Puise : 3s on, 1 s off. La poudre d'alginate LF200FTS, 1 ,5% en masse, est ensuite ajoutée à la dispersion puis le tout est mis sous agitation magnétique pendant 12h. 1 mM de SDS est ajouté sous agitation magnétique afin d'obtenir la solution gélifiable.
Création du mélange à encapsuler contenant Geobacter Sulfurreducens
D'une part le mélange suivant est préparé : 25 ml_ d'eau milliQ, 5.1 g de Polyéthylène glycol de masse molaire moyenne 3350 (PEG 3350 CAS 25322-68-3 Sigma Aldrich) et 135 mg de NaCI sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h.
D'autre part, une solution bactérienne comprenant des bactéries Geobacter est préparée de la façon suivante :
1 ml_ d'une souche de bactéries Geobacter Sulfurreducens fournie par DMSZ est ajouté à 9 ml_ de son milieu spécifique (milieu 826 DMSZ) dans un tube hungate de 12 mL sous anaérobie à 30°C pendant 4 jours. A 4 jours, la concentration en bactérie est évaluée par une mesure d'absorbance à 600nm. La différence de densité optique observée à 600nm entre le milieu 826 et la culture bactérienne (Delta.D.O en unité de densité optique) donne la concentration en bactérie par millilitre via la formule : Concentration = Delta.D.O * 4.108 Bac/mL. Cette culture de Geobacter est diluée au 20eme dans cette solution. Le mélange bactérien à encapsuler est alors obtenu.
Création du bain de qélification
1 L d'eau milliQ, 10 g de CaCI2, 50 μ\- de tween20 à 10% en masse sont mélangés sous agitation magnétique pendant 3h. Création de la capsule
Une bi-goutte est créée avec le dispositif présenté dans les figures 1 et 2.
Le mélange à encapsuler est placé dans la seringue A, il sortira du centre de l'injecteur (A) pour constituer le cœur de la future capsule.
Le mélange gélifiable est placé dans la seringue B, il sortira du bord de l'injecteur (B) pour constituer la membrane de la future capsule.
La création de la bi-goutte et ses paramètres sont contrôlés en contrôlant les débits des deux solutions (cœur et extérieur) via des pousses-seringues. Le débit de la seringue A est de 5ml_/h, le débit de la seringue B est 4mL/h.
La bi-goutte est ensuite gélifiée en la faisant tomber dans le bain de gélification. La solution extérieure gélifie (l'alginate gélifie) et enferme le cœur liquide de la bi-goutte. La capsule est créée telle qu'illustrée en figure 2. La capsule est laissée dans le bain de gélification pendant 3 minutes.
La capsule est ensuite transférée dans le milieu spécifique de Geobacter. La culture est conservée pendant 4 jours sous anaérobie à 25 degrés Celsius. Le milieu n'est pas tamponné en surfactants utilisés dans la formulation du mélange gélifiable. Par dialyse, le surfactant se désorbe de la surface des nanotubes. Non stabilisés, les nanotubes se connectent entre eux et créent un réseau conducteur au sein de la membrane d'hydrogel.
Dispositif de connexion électrique de la capsule
Le dispositif est constitué de trois électrodes : une électrode de référence en chlorure d'argent (Ag(s)/AgCI(s)), une contre électrode composée d'une grille de platine et une électrode de mesure composée d'un fil de platine. Ces trois électrodes sont connectées à un potentiostat qui permet leur mise sous potentiel. L'électrode de mesure permet la connexion d'une capsule par une légère compression physique comme illustré par la figure 5 et la figure 6. Les trois électrodes sont immergées dans un milieu 826 DMSZ sans fumarate de sodium.
Connexion de la capsule et récupération du courant
Après 4 jours, la capsule est positionnée dans le dispositif de connexion décrit ci-dessus, dans un environnement sous anaérobie. La capsule est mise sous potentiel à 0,4V. Le courant est suivi par chronoampérométrie. La figure 7 montre l'évolution du courant en fonction du temps sans capsule (environ 4*10-8 A), puis après l'ajout d'une capsule à membrane conductrice contenant Geobacter dans le dispositif de connexion.
Le courant atteint une valeur de 1 ,7*10"5 A.
A la fin de l'expérience, la capsule est détruite dans du milieu spécifique à Geobacter (milieu 826 DMSZ). Les bactéries encapsulées sont ainsi récupérées. La concentration en bactérie est estimée par une mesure de densité optique.
La concentration en bactérie à l'intérieur de la capsule est de l'ordre de 6.109 bac/mL.
Ainsi, la capsule selon l'invention présente de nombreux avantages :
Parallélisation possible et non limitée ;
- Croissance au temps long ; Récupération simplifiée de la totalité de la population cultivée (pas de centrifugation) ;
Encapsulation possible d'un seul micro-organisme ;
Possibilité d'actions de type électrique sur l'organisme encapsulé ;
- Manipulation simplifiée de la culture ; et
- bioréacteur dissocié du système de mesure courant.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Capsule comprenant un cœur liquide, une enveloppe gélifiée encapsulant totalement le cœur liquide à sa périphérie, l'enveloppe gélifiée étant propre à retenir le cœur liquide lorsque la capsule est plongée dans un gaz, une solution aqueuse ou une huile, l'enveloppe gélifiée comprenant au moins un polyélectrolyte gélifié et au moins un agent tensioactif, caractérisée en ce que l'enveloppe gélifiée comprend en outre un matériau conducteur électrique.
2. Capsule selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est obtenue par la mise en œuvre d'un procédé comprenant les étapes suivantes de :
e) convoyage séparé dans une double enveloppe d'une première solution liquide aqueuse ou huileuse et d'une deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur électrique ;
f) formation, à la sortie de la double enveloppe, d'une série de gouttes, chaque goutte comprenant un noyau central formé de ladite première solution et une pellicule périphérique formée de ladite deuxième solution et recouvrant totalement le noyau central ;
g) immersion de chaque goutte dans une solution gélifiante contenant un réactif propre à réagir avec le polyélectrolyte de la pellicule pour le faire passer d'un état liquide à un état gélifié et former l'enveloppe gélifiée comprenant le matériau conducteur électrique, le noyau central formant le cœur liquide ;
h) récupération des capsules formées ;
la deuxième solution contenant au moins un agent tensioactif avant son contact avec la première solution et donc avant son contact avec la solution gélifiante.
3. Capsule selon la revendication 2, dans laquelle ladite deuxième solution liquide contenant un polyélectrolyte liquide propre à gélifier et le matériau conducteur mentionnée à l'étape a) du procédé est formée par la mise en contact du matériau conducteur électrique sous forme dispersée et du polyélectrolyte propre à gélifier.
4. Capsule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une enveloppe intermédiaire encapsulant totalement à sa périphérie le cœur liquide, ladite enveloppe intermédiaire étant elle-même encapsulée totalement à sa périphérie par l'enveloppe gélifiée.
5. Capsule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le cœur liquide comprend au moins un objet électro-actif.
6. Capsule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le matériau conducteur électrique consiste en des particules solides électriquement conductrices.
7. Capsule selon la revendication 6, dans laquelle lesdites particules solides électriquement conductrices sont choisies parmi les nanotubes de carbone, le noir de carbone, le graphène.
8. Capsule selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans laquelle l'enveloppe gélifiée est formée par un hydrogel de polysaccharide gélifié par ions divalents comprenant lesdites particules solides électriquement conductrices sous forme dispersées et connectées formant ainsi un réseau électriquement conducteur.
9. Capsule selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit matériau conducteur électrique est biocompatible.
10. Capsule selon la revendication 5, dans laquelle ledit objet électroactif est choisi parmi les micro-organismes, les cellules, les macromolécules et les particules solides électroactives.
1 1 . Capsule selon la revendication 10, dans laquelle ledit micro-organisme est choisi parmi les bactéries du genre Escherichia Coli, Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Ochrobactrum, Enterobacter.
12. Utilisation d'au moins une capsule selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , pour la production de bioréacteurs.
13. Utilisation d'au moins une capsule selon l'une quelconque des revendications 10 à 1 1 , pour le criblage de micro-organismes, en particulier de microorganismes électro-actifs.
14. Utilisation d'au moins une capsule selon l'une quelconque des revendications 10 à 1 1 , pour la récupération d'électrons produits par des micro-organismes.
15. Utilisation d'au moins une capsule selon l'une quelconque des revendications 10 à 1 1 , pour la réalisation d'une anode et/ou d'une cathode de pile à bactéries.
16. Méthode de criblage de bactéries électro-actives comprenant la culture de bactéries contenues dans des capsules telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 par :
a. l'encapsulation de bactéries électro-actives dans les capsules selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , chaque capsule comprenant une bactérie électro-active ;
b. l'obtention de colonies monoclonales de bactéries électro-actives ;
c. la connexion électrique desdites capsules à un potentiostat ; et
d. la mesure de la production de courant pour chaque capsule.
17. Dispositif comprenant au moins une capsule selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 et au moins une électrode, ladite au moins une électrode étant en contact avec l'enveloppe gélifiée de ladite au moins une capsule.
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