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WO2016013725A1 - 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2016013725A1
WO2016013725A1 PCT/KR2014/011269 KR2014011269W WO2016013725A1 WO 2016013725 A1 WO2016013725 A1 WO 2016013725A1 KR 2014011269 W KR2014011269 W KR 2014011269W WO 2016013725 A1 WO2016013725 A1 WO 2016013725A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
csf
expression vector
granulocyte colony
transferrin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2014/011269
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤정혁
장병하
진봉석
배지영
김순남
박경수
박영규
김한조
서영주
정우성
강경태
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EQUISNZAROO Co Ltd
Original Assignee
EQUISNZAROO Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020140137414A external-priority patent/KR101623906B1/ko
Application filed by EQUISNZAROO Co Ltd filed Critical EQUISNZAROO Co Ltd
Priority to US15/327,838 priority Critical patent/US10479822B2/en
Priority to EP14898071.7A priority patent/EP3173422B1/en
Priority to ES14898071T priority patent/ES2735899T3/es
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Priority to US16/575,612 priority patent/US11421009B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • composition comprising granulocyte colony stimulator mutant protein or transferrin fusion protein thereof as an active ingredient
  • the present invention relates to a fusion protein in which transferrin is peptide-bound to the ends of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator (G-CSF) variant proteins.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator protein
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • G-CSF Granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF stimulates neutrophil granulopoiesis, and has been used as an anticancer adjuvant to prevent infectious complications caused by neutropenia. Reducing the incidence of side effects of pyrogenic neutropenia caused by cancer chemotherapy and radiation therapy, thereby reducing the death caused by cancer-chemotherapeutic treatment, has been shown to have clinical benefits that have great benefits for cancer patients.
  • G-CSF increases the number of hematopoietic progenitor cells and thus It is reported to mitigate.
  • G-CSF causes bone marrow stem cells to migrate to the ischemic heart, through blood vessels through myocardial regeneration. It is known to promote differentiation into cells and cardiomyocytes.
  • Recombinant human G-CSF has a pharmacological effect for a short period of time, requiring discomfort to be administered more than once a day during the treatment of ischemic disease or for the duration of leukopenia that occurs after cancer chemotherapy or radiotherapy. There is this.
  • a substance having a hepatic circulatory half-life (Hal fl i fe) will have an effect of reducing the number of administrations necessary for alleviating leukopenia and the like, and consequently preventing infectious complications.
  • PEG Polyethylene glycol
  • pegfilgrastim Pegf i lgrast itn
  • pegfilgrastim Pegf i lgrast itn
  • Cysteine the 17th amino acid of G-CSF
  • G-CSF variants in which cysteine 17 is substituted with serine have been reported to increase protein stability at neutral pH.
  • Transferrin in the third largest amount of plasma protein It exists and serves to transport iron ions in the blood to various tissues. It is shorter than albumin or immunoglobulin G (Immunoglobul in G, IgG) but has a relatively long half-life of 8 days. As a result, it is released outside the cell and circulates.
  • An object of the present invention is granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte It is to provide a fusion protein in which the transferrin is peptide-bound to the terminal of the granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein substituted with the 116 th threonine ° 1 cysteine in the amino acid sequence of the colony stimulator protein.
  • the present invention relates to a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is substituted with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein. Fusion protein peptide-bound to the terminal, and granulocyte colony stimulator (G-CSF) variant protein in which 116 th threonine of granulocyte colony stimulator protein is substituted with cysteine.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • Neutrophils comprising a fusion protein having a peptide-linked transferrin at the terminal or a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein substituted with cysteine at 116 th threonine of granulocyte colony stimulator protein
  • pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of diminished, ischemic disease, and anticancer adjuvant.
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutation in which the 116th threonine is substituted with cysteine in the amino acid sequence of the over-globule colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • the transferrin peptide coupled to ' end of the fusion protein or granulocyte 116th threonine (threonine) a granulocyte colony stimulating substituted with cysteine (cysteine) of the colony stimulating factor protein factor (G-CSF) mutations encoding a protein, wherein said protein
  • An expression vector comprising a gene to be provided, and a method for producing a transformant, wherein the expression vector is introduced into a host cell.
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • a fusion protein having a peptide-linked transferrin at the end of it, or a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116 th threonine of the granulocyte colony stimulator protein is substituted with cysteine, the vector or the transformation Provided is a method for preventing or treating neutropenia or ischemic disease comprising administering a sieve to an individual or an individual suffering from neutropenia or ischemic disease.
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • Fusion protein peptide-linked transferrin at the end of Or neutrophils comprising administering to the subject a granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein, said vector or said transformant, wherein 116 th threonine of the granulocyte colony stimulating protein is substituted with cysteine
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • the present invention is the 116th threonine (Threonine) in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein for the treatment of neutropenia, anticancer adjuvant, ischemic disease Fusion-peptide-fused fusion protein at the end of the substituted granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein, or granulocyte colony stimulator wherein 116 th threonine of granulocyte colony stimulator protein is replaced with cysteine ( G-CSF) variant protein, said vector or said transformant are provided.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator protein
  • G-CSF granulocyte colony stimulator protein
  • G-CSF granulocyte colony stimulator protein for the treatment of neutropenia, anticancer adjuvant, ischemic disease Fusion-peptide-fused fusion protein at the end of the substituted granulocyte colony stimulator (G-CSF)
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein or transferrin fusion protein thereof of the present invention has a markedly increased activity and blood stability and an increased half-life compared to conventional human G-CSF. Since the purification efficiency is higher than PEGylated G-CSF, it can be usefully used for preventing or treating ischemic disease or neutropenia.
  • 1 is a diagram showing a cleavage map of a pcDNA3.1 (+) / preTi vector.
  • Fig. 2 is a diagram showing a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / preTf (B) vector.
  • Fig. 3 shows a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / Tf (B) vector.
  • Fig. 4 shows a cleavage map of the pcDNA3.1 (+) / G 'CSF (T116C) -Tf vector.
  • FIG. 5 Expi293F cell line transformed with G-CSF (T116C) -Tf plasmid It is a figure which shows the expression amount of G-CSF (T116G) -Tf.
  • FIG. 6 is a diagram showing G_CSF (T116C) -Tf protein isolated by DEAE Af f-gel blue chromatography.
  • FIG. 7 is a diagram showing the preparation and concentration separation of the holo (preenzyme) form of G-CSF (T116C) -Tf to which iron (Fe3 +) is bound.
  • FIG. 8 is a diagram showing the transferoline receptor binding capacity of the holo form of G-CSF (T116C) -Ti.
  • FIG. 9 is a diagram showing cell proliferation activity of HL-60 cells treated with G-CSF, G-CSF-Tf, and G-CSF (T116C) -Tf.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison of degradation resistance by protease of G-CSF and G-CSF (T116C) proteins.
  • FIG. 11 shows a comparison of plasma half-life of G-CSF-Tf and G-CSF (T116C) -Tf proteins in vivo.
  • FIG. 12 shows a comparison of the physiological activity of G-CSF, G-CSF (T116C) -Tf proteins in the rats of neutropenia.
  • the invention relates to the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF Mutant Protein Granulocyte Colony Stimulator Protein
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulator Protein
  • G-CSF Mutant Protein Granulocyte Colony Stimulator Protein
  • G-CSF Mutant Protein Granulocyte Colony Stimulator Protein
  • G-CSF Mutant Protein Granulocyte Colony Stimulator Protein with 116th Threonine Substituted with Other Amino Acids Fusion protein peptide-linked to the terminal of and provides a use thereof.
  • G-CSF or transferrin used in the present invention may be derived from animals, plants, microorganisms, preferably human-derived G-CSF or transferrin, but is derived from heterologous cells having the same activity as human-derived G-CSF or transferrin. Protein Can be.
  • the protein may additionally have modifications such as phosphorylation, acetylation, methylation, glycosylation, etc., and may be combined with other proteins, but may be regarded as the same as the protein before modification unless it is changed enough to lose the function of the protein.
  • the other amino acid substituted for the 116 th threonine may be a hydrophobic amino acid, and specifically, may be a cysteine capable of disulfide bond with the 17 th cysteine of the G-CSF sequence, but is not limited thereto.
  • the terminal to which the transferrin is linked may be either an amino terminal (5 'terminal N-terminus) or a carboxy terminal (3' terminal, C-terminus).
  • the granulocyte colony stimulator (G-CSF) protein is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 1>, or has the same activity as the protein or a gene encoding the granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) on a chromosome As long as the position is the same, one or several amino acids of the protein may be added, deleted, or substituted.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) protein has at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, most specifically 95%, 96%, 97%, 98% , But not limited to, sequences having at least 99% or 99.5% homology.
  • the transferrin is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 2>, but at least a gene having the same activity as the protein or the same gene position encoding the transferrin on a chromosome, one or several amino acids of the protein is added, It may be composed of a nucleotide sequence that is deleted, substituted.
  • the transferrin protein has at least 80% homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 2, more specifically at least 90% homology, most specifically at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% It is composed of, but not limited to, sequences having homology.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 3>, or having the same activity as the protein or having the same gene position encoding the transferrin on the chromosome ', One or several amino acids of may be composed of a base sequence that is added, deleted, substituted.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein has more than 80% homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO 3>, more specifically, more than 90% homology, most specifically 95%, 96%, 97%, 98 It consists of, but is not limited to, sequences having homology of at least%, 99% or 99.5%.
  • the fusion protein peptide-linked fusion protein at the end of the granulocyte colony stimulator protein is at least 80% homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 4, more specifically at least 90% homology, most specifically 95%, 96%, It consists of sequences having at least 97%, 98%, 99% or 99.5% homology but is not limited to these.
  • the fusion protein in which the transferrin peptide is coupled to the terminal of the granulocyte colony stimulator mutant protein in which the 116 th threonine is replaced with another amino acid is 80 in the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 5>.
  • More than% homology more specifically more than 90% homology, Most specifically, but not limited to, a sequence composed of at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% homology.
  • the nucleotide sequence of the restriction enzyme recognition site in the gene may be substituted with the same amino acid as the amino acid encoded by the nucleotide sequence, or a nucleotide sequence encoding another amino acid within a range that does not change the activity with the protein.
  • the protein may be a protein obtained by replacing thymine of BamfR restriction enzyme recognition site sequence (GGATCC) in a protein gene with cytosine, but is not limited thereto.
  • restriction enzymes include EcoRi, BamHl., Hind. , kpnl, Not I, Pst I,
  • the present invention is the terminal of the granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is substituted with another amino acid in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein Neutropenia of the neutropenia comprising peptide-bound fusion protein or granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which 116 th threonine of granulocyte colony stimulator protein is substituted with another amino acid as an active ingredient.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • neutropenia refers to an abnormally reduced number of neutrophils, mild neutrophils per ⁇ ⁇ of blood, mild symptoms of less than 1500, moderate symptoms of less than 1000, and severe neutropenia of less than 500. Are classified. Leukopenia (neucopeni a) can be seen as a broad neutropenia.
  • Ischemic disease refers to cell damage caused by bleeding, embolism (embol) and infarct ion to stop blood flow to tissues, trauma, transplant rejection, stroke, cerebral infarction, ischemic Renal disease, ischemic lung disease, ischemic disease caused by infection, ischemic disease of limb, ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, heart failure, and the like.
  • the other amino acid substituted with the 116 th threonine may be a hydrophobic amino acid, and specifically, may be cysteine capable of disulfide bond, but is not limited thereto.
  • the granulocyte colony stimulator (G-CSF) protein is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 1>, or has the same activity as the protein or a gene encoding the granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) on a chromosome As long as the positions are the same, one or several amino acids of the protein may be added, deleted or substituted.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) protein has at least 80% homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 1>, more specifically, at least 90% homology, most Specifically . Consists of, but is not limited to, sequences having at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 99.5% homology.
  • the transferrin is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 2>, or having the same activity as the protein or having the same gene position encoding the transferrin on a chromosome, one or a few amino acids of the protein are added, deleted, It may be composed of a base sequence to be substituted.
  • the transferrin protein has a homology of 8 subtypes to amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 2, more specifically 90% or more homology, most specifically 95%, 96% ,. It consists of, but is not limited to, sequences having at least 97%, 98%, 99% or 99.5% homology.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 3>, or having the same activity as that of the protein or the gene position encoding the transferrin on the chromosome, One or several amino acids may be composed of base sequences that are added, deleted, or substituted.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein has more than 80% homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO 3>, more specifically, more than 90% homology, most specifically 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% or 99.53 ⁇ 4> or more of the sequence having a homology of, but not limited to.
  • the fusion protein in which the transferrin peptide is bound to the terminal of the granulocyte colony stimulator protein is a protein represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 4>, or has the same activity as the protein or encodes the granulocyte colony stimulator protein or transferrin on a chromosome. As long as the gene position is the same, One or several amino acids of the protein may be composed of base sequences that are added, deleted, or substituted.
  • the fusion protein in which the transferrin peptide is coupled to the terminal of the granulocyte colony stimulator protein has at least 8 homology to the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 4>, more specifically, at least 90% homology, most specifically 95%, 96%, 97 It consists of, but is not limited to, sequences having homology of at least%, 98%, 99% or 99.5%.
  • the fusion protein in which the transferrin peptide is coupled to the terminal of the granulocyte colony ⁇ stimulator mutant protein in which the 116 th threonine is replaced with another amino acid is represented by the sequence of ⁇ SEQ ID NO: 5>.
  • the granulocyte colony stimulator protein black is a nucleotide sequence in which one or several amino acids of the protein are added, deleted, or substituted at the same gene position encoding the transferrin. Can be configured.
  • the fusion protein in which the transferrin peptide is coupled to the terminal of the granulocyte colony stimulator mutant protein in which the 116 th threonine is replaced with another amino acid is 80 in the amino acid sequence of ⁇ SEQ ID NO: 5>.
  • G-CSF Granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor mutant protein
  • transferrin wherein 116 th threonine is substituted with another amino acid in amino acid sequence of granulocyte colony stimulating factor protein
  • the recognition site may be inserted.
  • B a! It may be a protein in which thymine of a restriction enzyme recognition site sequence (GGATCC) is replaced with cytosine, but is not limited thereto.
  • restriction enzymes examples include EcoR ⁇ , BamHl, Hincm, kpnl, Notl, Pstl, Smal, Xhol, Fokl, Alw26l, Bbvl, Bsrl, Earl, Hphl, Mbol, SfaNl, Tthlll I, Nael, Nhel, NgoMN, Eco57 ⁇ , Bcgl, Bpl, Bsp241, Bael, Cjel, EcoPl, Hin, StyLTl and the like, and any restriction enzymes used in the art can be used without limitation depending on the gene, expression vector, or genetic engineering environment to be used.
  • 'Expression vector' of the present invention is a means for introducing a nucleic acid sequence encoding a protein of interest into a host cell, and includes various forms such as polamide, cosmid, BAC, viral nucleic acid, and the like.
  • the vector generally includes a selective marker such as an antibiotic resistance gene which can confirm that the target gene has been successfully introduced into the host cell, and a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polya to induce the expression of the target gene.
  • the denylation sequence, enhancer, Kozak sequence, shine-dalgano sequence and the like can be included in various ways.
  • Replicating expression vectors include the origin of replication.
  • the host cell may be any one selected from the group consisting of E.
  • compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations. have. When formulated, it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose in one or more compounds. Or gelatin and the like.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • various excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be included.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous and suspending solvents propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as eurib oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, according to the desired method, and may be administered externally or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrathoracically or cerebrovascularly by injection. It is desirable to choose.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion and severity of the disease of the patient, the scope of the present invention in any way It is not intended to be limiting.
  • Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time.
  • Single dose is 1 to 100 milligrams, preferably 3 to 50 milligrams, more preferably 6 to 50 milligrams based on the amount of protein 30 mg, can be administered once a day or divided into several times, it may be divided into several sites.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological reaction modifiers.
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116th threonine is replaced with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • the protein can be obtained from chemically synthesized, naturally occurring cells, or purified from modified host cells using genetic recombination technology. There may be a modification and may be in a state in which it is combined with another protein, but this may be regarded as the same as the protein before the modification, unless the protein is changed enough to lose its function.
  • Obtaining the protein comprises protein precipitant, centrifugation, ultrasonic crushing, ultrafiltration, dialysis, gel filtration, adsorption chromatography; This can be done using purification techniques known in the art such as exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the restriction enzyme recognition sequence in the transferrin gene is removed, a restriction enzyme site sequence is inserted at the 5 'end, and a plasmid including a gene having a restriction enzyme site and a stop codon inserted at the 3' end.
  • the plasmid in which the tunosperin gene and the G—CSF gene were connected was prepared by inserting a gene from which the restriction enzyme recognition sequence was removed into the plasmid.
  • the restriction enzyme recognition sequence in the gene is removed, and the restriction enzyme site and A Kozak sequence was inserted and a plasmid containing the gene with the restriction enzyme site inserted at the 3 'end was prepared. Thereafter, the transferrin gene was fused with the plasmid to prepare a plasmid linked with the transferan gene and the G-CSF variant gene.
  • the present invention is granulocyte colony stimulating factor protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulating factor protein ""
  • the threonine (Threonine) of the 116th in the amino acid sequence is replaced by a cysteine (Cysteine) granulocyte colony stimulating factor (G-CSF ) Fusion protein peptide-linked to the terminal of the mutant protein, or granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein wherein 116 th threonine of the granulocyte colony stimulator protein is replaced with cysteine.
  • An expression vector comprising a gene encoding the gene, and a transformant in which the expression vector is introduced into a host cell; or an neutropenia or ischemia
  • a method for preventing or treating neutropenia or ischemic disease comprising administering to a subject having a disease.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein or transferrin fusion protein thereof of the present invention has a significantly increased specific activity and blood stability compared to conventional human G-CSF, and has a conventional half-life. Since the purification effect is higher than the increased PEGylated G-CSF, it can be usefully used for preventing or treating ischemic disease or neutropenia.
  • the present invention is a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutation in which the 116th threonine is substituted with cysteine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein A fusion protein having a peptide-linked transferrin at the end of the protein, or a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which the 116 th threonine of the granulocyte colony stimulator protein is substituted with cysteine, the vector or the trait A method for neutrophil reduction comprising administering a convert to a subject.
  • G-CSF granulocyte colony stimulator
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein or transferrin fusion protein thereof of the present invention has a significantly increased specific activity and blood stability compared to conventional human G-CSF, and has a conventional half-life. Since the purification efficiency is higher than the increased PEGylated G-CSF, the protein can be usefully used to reduce neutrophils.
  • 116 th threonine in the amino acid sequence of granulocyte colony stimulator protein (G-CSF) or granulocyte colony stimulator protein for the treatment of neutropenia, anticancer adjuvant, ischemic disease is cysteine.
  • G-CSF Granulocyte colony stimulating factor
  • a fusion protein having a peptide-linked transferrin at the end of the protein, or a granulocyte colony stimulator (G-CSF) mutant protein in which 116 th threonine of the granulocyte colony stimulator protein is replaced with cysteine, the vector or the above Provides the use of the transformant.
  • the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mutant protein or transferrin fusion protein thereof of the present invention has a markedly increased specific activity and hypertension stability compared to conventional human G-CSF, and has a conventional half-life.
  • HepG2 * a human liver cancer cell, was used to obtain total mRNA.
  • HepG2 cells were passaged at 37 ° C and 5% carbon dioxide incubator using DMEM (HyClone) containing 10% fetal bovine serum (WelGNE) and 1% penicillin-straptomycin (Gibco). After passage, the culture medium of HepG2 cells was removed, washed with phosphate buffer (HyClone), and the cell pellets were collected and centrifuged to remove the medium, and then stored at -70 ° C. Cells stored at ⁇ 70 ° C.
  • RNA samples were taken out and thawed and then subjected to the standard conditions given in the guidelines using RnaUs ToTal Tissue Premium RNA Preps (LeGene) to obtain total mRNA.
  • Total mRNA obtained was synthesized using ol igo (dT) by the Premium Express 1 st Strand cDNA synthesi s system (Legene). Polymerase chain reaction (PCR) was performed using DNA polymerase (Phusion) as a template of the prepared cDNA.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • the primers used for reaction were custom-made by Cosmojintech, and the Nhe ⁇ restriction enzyme site, Kozak sequence was placed at the 5 'end of the transferrin gene, and the Xho I restriction enzyme site, Stop codon (TM) at the 3' end. ) To be positioned.
  • Sense primer Nhe ⁇ restriction enzyme site, Kozak sequence was placed at the 5 'end of the transferrin gene, and the Xho I restriction enzyme site, Stop codon (TM) at the 3' end.
  • the amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size, and the DNA was purified using a MEGAquick-sp in TM Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN) by cutting the agarose gel of the desired portion.
  • the transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid (Invitrogen) obtained through purification were treated with Nhel (Enzynomics) and Xhol (Enzynomics) restriction enzymes.
  • E. coli DH10B was transformed and E. coli colonies were selected by applying to agar plate containing ampicillin antibiotic (Agar) and incubated for 16 hours at 37 ° C. • PCR polymerase chain reaction (PCR) was used to confirm the successful insertion of the transferrin gene into the pcDNA3.1 (+) plasmid. E. coli colonies were used as a template by diluting in water and using a sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 9) and an antisense primer (5, -AGACTCGAGTTMGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ ID NO: 10) used for transferrin gene amplification.
  • a sense primer 5'-CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3 ', SEQ ID NO: 9
  • an antisense primer 5, -AGACTCGAGTTMGGTCTACGGAAAGTGCAG-3', SEQ
  • the reaction was repeated for 30 seconds at 98 ° C., the circulation program was repeated 30 times at 10 ° C. for 10 seconds, 30 seconds at 53 ° C., 1 minute at 72 ° C., and finally for 10 minutes at 72 ° C.
  • electrophoresis was performed on 1% agarose gel to confirm the gene, and the confirmed E. coli colonies were inoculated in LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, l% NaCl) for 16 hours. The cells were cultured in a 37 ° C shaker. The cultured E.
  • the nucleic acid was replaced with thymine (T) to cytosine (C) to remove the Ban restriction enzyme site present in the transferrin gene, but the amino acid sequence was maintained with aspartic ac, BawHl restriction Enzyme site, GASC primers (5′-CTATGGGTCAAMGAGGACCCACAGACTrrCTATT— 3 ′, SEQ ID NO: 11) and anticent primer (5′-AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3 ′, SEQ ID NO: 12) to replace nucleic acids with GGATCCC. Used by Cosmojin Tech.
  • the prepared pcDNA3.1 (+) / preTf plasmid was used as a template and the Muta-direct Site Directed Mutagenesis kit (iNtRON) was used as the instructions provided by the manufacturer. After completion of the polymerase chain reaction, the gene was confirmed by electrophoresis on 1% agarose gel. The identified E. coli colonies were inoculated in LB liquid medium containing an empicillin antibiotic and incubated in a 37 ° C shaker for 16 hours. The cultured E.
  • Transferrin is a secreted protein that contains a signal peptide that helps the protein synthesized at the N-terminus to the cell membrane, and the amino acid sequence is MRLAVGALLVCAVLGLCLA (SEQ ID NO: 13).
  • a plasmid was prepared in which the signal peptide present in the transferrin was removed and the restriction enzyme 3 ⁇ 4 //? M was placed at the 5' end.
  • Xho I and Stop codon (TM) were located.
  • Polymerase chain reaction was carried out using DNA polymerase as pcDNA3.K +) / preTf (B). .
  • the primers used for reaction were custom made by Cosmojin Tech.
  • a sense primer (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ', SEQ ID NO: 14) and an antisense primer (5' -AGACTCGAGTTMGGTCTACGGAAAGTGCAG— 3 ', SEQ ID NO: 10) were used as 10 ⁇ ) 1 with template and distilled water in DNA polymerase and buffer solution. was added to bring the total volume to 50 ⁇ . The reaction was repeated for 30 seconds at 98 ° C using a PCR apparatus, and the circulation program was repeated 30 times for 1 minute at 98 ° C 10 seconds, at 53 ° C for 30 seconds, and at 72t; and finally for 10 minutes at 72 ° C. .
  • the amplified transferrin gene was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm its size, and the agarose gel was cut and purified using a MEGAquick-s in TM Total Fragment DNA purification kit iNtRoN.
  • Purified transferrin gene and pcDNA3.1 (+) plasmid were treated. 10 units of restriction enzyme and complete solution 2 (10 mM Tris-HCL H 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2> 1 mM DTT, 100 yg / ml BSA) was added and reacted at 37 ° C for 2-3 hours.
  • E. coli colonies were used as a template by dilution in water and were used as a template for sense amplification (5'-CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ', SEQ ID NO: 14) and antisense primer (5' -AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3 ', SEQ ID NO: 10) the use was and banung 30 seconds at 98 ° C, cycling program was banung 98 ° C 10 seconds, 30 seconds at 53 ° C, repeated for 1 minute 30 cycles at 72 ° C and finally added at 72 ° C 10 minutes.
  • reaction plasmid 45 ng of the reaction plasmid was amplified by PCR method with 10 pmol sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3 ', SEQ ID NO: 15) and antisense primer (5' -CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3 ', SEQ ID NO: 16), 5 G-CSF gene fragment was prepared with Nhe restriction enzyme site and Kozak sequence at the end and Ba / nH restriction site at the 3 'end.
  • sense primer 5'-CATGCTAGCTCCACCA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3 ', SEQ ID NO: 15
  • antisense primer 5' -CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3 ', SEQ ID NO: 16
  • Sense primer (5'-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3 ', SEQ ID NO: 19) and antisense primer (5 '-ATCTGCTGCCAGATGCAGGTGGCAAAGTCGGC-3', SEQ ID NO: 20), respectively, 10 ⁇ and mixed with pET21a (+) / G-CSF, and through a chain polymerization reaction in the same manner as in Example ⁇ 1-1> Regioselective mutations were performed to construct the G-CSF (T116C) gene.
  • the plasmid thus made is referred to herein as pET21a (+) / G-CSF (T116C).
  • pET21a (+) / G-CSF was placed on DNA agarose gel (0.5X TAE, 1% agarose) to check the size, and only the portion of the gel was cut out and purified by a gel extraction kit (CosmoGentech).
  • E. coli DH10B was transformed with purified pET21a (+) / G-CSF (T116C), and empicillin resistant colonies were selected. Selected colonies were inoculated in LB liquid medium (50 mg of tryptone per 5 mL, 50 mg of sodium chloride, 25 mg of yeast extract) incubated for 15 hours using an empicillin (100 ug / mL) and pET21a (plasmid extraction kit). After extracting +) / G-CSF (T116C), it was confirmed that the nucleotide sequence was successfully replaced by the nucleotide sequence method.
  • the sense primer (5'-GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3 ', SEQ ID NO: 19) and the antisense primer
  • each of the primers take each 10 pn l of the G-CSF gene inserted into pcDNA6 by the PCR method and the above Example Regioselective mutations were carried out in the same manner as in ⁇ 1-1> to obtain a G-CSF (T116C) gene.
  • the plasmid thus made is referred to herein as pcDNA6 / G-CSF (T116C).
  • pcDNA6 / G-CSF (T116C) was placed on a DNA agarose gel (0.5X TAE, 1% agarose) to check the size, and only the gel of the portion was cut out and purified by a gel extraction kit (CosmoGentech).
  • E. coli DH10B was transformed with purified PCDNA6 / G—CSF 116C) and empicillin resistant colonies were selected. Selected colonies were inoculated in LB liquid medium (50 mg of tryptone per 5 mL, 50 mg of sodium chloride, 25 mg of yeast extract) containing 15 ml of empicillin (100 / g / ml), and incubated for 15 hours, using pcDNA6 as a plasmid extraction kit.
  • reaction plasmid 45 ng was amplified by PCR using a 10 pm sense primer (5'-CATGCTAGCTCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3 ', SEQ ID NO: 15) and an antisense primer (5' -CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3 ', SEQ ID NO: 16).
  • a G-CSF (T116C) DNA fragment was prepared having an A3 ⁇ 4el restriction enzyme site and a Kozak sequence at the end and a BamHY restriction site at the 3 'end. Prepared G-CSF T116C) DNA fragment 1 and pcDNA3.
  • pET21a (+) / G-CSF (T116C) fulllasmid 1 was inoculated into the expression strain Rosetta2 (DE3) 20 ⁇ and transformed by reaction at 42 ° C for 90 seconds.
  • the transformed expression strains were plated in LB medium poolate containing 50 ug / mL empicillin and incubated at 37 ° C. for 15 hours to obtain colonies. Colonies were inoculated into 100 mL LB medium containing 50 ug / mL empicillin and 25 ug / mL chloramphenicol and incubated at 37 ° C for 15 hours.
  • the proteins used in the present invention were expressed by secreting proteins out of cells using Expi293F TM cells (Gibco), a human embryonic kidney cancer cell line modified for suspension culture. After thawing the Expi293F TM cells contained in the Ex i293F TM Expression System Kit (Gibco), a sterile 125 mL flask (Thermo) containing 30 mL suspension-free media (Serum-free media for animal Cel lture, Gibco) ) was inoculated at 37 ° C, 5 carbon dioxide sections were incubated at a stirring speed of 125 rpm in an incubator.
  • G-CSF-Tf and G-CSF (T116C) -Tf plasmid DNA 22.5 were prepared and diluted with Opt i -MEM (Gibco) to prepare 45 ⁇ L of Exp i Feet amine TM 293 Reagent. Diluted with Opt i -MEM® medium and left for 5 minutes at room temperature. After mixing the plasmid and the Exp i Feet amine TM 293 Reagent mixture well, the mixture was left for 20 minutes in the chamber and evenly added to the prepared cells.
  • the cells were dissolved in crushing buffer (50mMTris-Cl ( ⁇ . ⁇ ), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF), and the cells were crushed using an ultrasonic crusher (breaking time 5 minutes, ultrasonic 30 seconds, air 40 seconds). ). The supernatant was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and then dissolved in a washed supernatant (50mMTris-Cl, pH8.0, 2mMEDTA, 0.3% Triton), and the precipitate was crushed using an ultrasonic grinder (crushing time 5 Minutes, ultrasonic 30 seconds, atmospheric 40 seconds).
  • crushing buffer 50mMTris-Cl ( ⁇ . ⁇ ), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF
  • the supernatant was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and then dissolved in a washed supernatant (50mMTris-Cl, pH8.0, 2mMEDTA, 0.
  • Purified G-CSF (T116C) was quantified using silver staining. After obtaining a standard quantitative curve using G-CSF standard grasine (less than 30 ng / SDS-PAGE well), the protein was quantified by comparing the unknown amount of each sample with the standard quantitative curve.
  • G-CSF-Tf black or black G-CSF (T116C) -Tf contained in potassium phosphate buffer was charged to a DEAE Affi-gel Blue column at a flow rate of 0.5 mL / min.
  • 72 mM potassium phosphate was passed in a step gradient, so that the proteins adsorbed on the resin were separated from the other proteins included in the culture (FIG. 6).
  • Quantification of purified protein was carried out by Western blot using transferrin antibodies.
  • Transferrin binds to the transferrin receptor expressed on the cell surface, enters the endocytosis into the cell, releases iron and moves back to the cell surface in combination with the receptor and is secreted into the blood.
  • the half-life is increased through in vivo recycling metabolism, which avoids the decomposition of intracellular lysosomes while supplying iron to cells.
  • the fusion of a target protein with a short half-life with transferrin allows the transfer of the transfer protein in vivo to be metabolized by following the in vivo recycling metabolism of transferrin.
  • a protein fused with G-CSF to transferrin is a transferrin receptor. It is necessary to maintain the binding capacity to effectively prevent the degradation metabolic process in vivo, so the extracellular surface transferrin receptor of the proteins of the present invention.
  • the human liver cancer cell line HepG2 having a high specific expression of TfR cell membrane was tested.
  • HepG2 cells were inoculated in 96-well poolates at 5xl0 5 cells per well and incubated for 24 hours.
  • HepG2 attached to the plate was washed with phosphate buffer, and then serum-free DMEM medium (HyClone) containing 1 mg / ml of bovine serum albumin (BSA) was added thereto and left for 30 minutes at 37 ° C and 5% carbon dioxide thermostat. By removing the endogenous transferrin existing in the cells.
  • serum-free DMEM medium HyClone
  • BSA bovine serum albumin
  • test substance and fluorescently labeled human transferrin Alexa Fluor ® 647 were added to serum-free DMEM medium containing 1 mg / mL BSA to a concentration of 133 nM and 5 / mL, respectively. After mixing, the mixture was treated with HepG2 cells prepared by the above technique and left for 30 minutes in a 37 ° C, 5% carbon dioxide incubator. Protein samples remaining in the medium were washed with cold phosphate buffer and the amount of fluorescence-transferrin bound to transferrin receptor. was measured using a fluorimeter. Fluorescence was measured by applying a light source at 650 nm and measuring the intensity of fluorescence emitted at 668 nm.
  • the transfero receptor binding capacity of the holo form of G-CSF (T116C) -Tf prepared in Example ⁇ 3-4> is shown in ⁇ Figure 8>.
  • the experimental results showed that the transferrin receptor binding capacity of the G-CSF-Tf and G-CSF (T116C) -Tf fusion proteins was similar to that of the native human hol-transferr in (SIGMA). Indicated.
  • SIGMA native human hol-transferr in
  • Human bone marrow-derived HL-60 cells used in the present invention were used for the experiments obtained from the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC).
  • the cell line was 371, 5% in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum. Incubated under carbon dioxide conditions and replaced with fresh medium every two to three days. Cells are not adhesion dependent. Reagents related to cell culture were purchased from HyClone. ⁇ 5-2> Accumulation of Cell Proliferation Activity of G-CSF Mutant Proteins
  • DMSO dimethyl sulfoxide, culture grade, SIGMA
  • G-CSF Lung-enzymatic human G-CSF (GenScript), native G-CSF (GenScript), test substance G-CSF-Tf, G-CSF (T116C) -Tf ⁇ G-CSF (T116C) proteins used as controls
  • G-CSF G-CSF, PEG.
  • G-CSF, G-CSF (T116C) ⁇ G-CSF-Tf, G-CSF (T116C) -Tf cell proliferation activity is shown in Figure 9.
  • G-CSF T116C Cell proliferation activity was inferior to that of native G-CSF and showed similar cell activity to PEGylated G-CSF.
  • the G-CSF (T116C) -Tf fusion protein, in which the G-CSF 116C) mutant protein is fused to transferrin has significantly increased cell proliferation activity compared to G-CSF0116C), and has much higher cell proliferation activity than PEGylated G-CSF. Increased.
  • G-CSF (T116C) -Tf has a higher cellular activity than commercially available PEGylated G-CSF and is expected to have pharmacological significance when used in the treatment of G—CSF.
  • the amount of G-CSF remaining in the serum at a predetermined time after the reaction of the protein with human serum (Serum) is determined. Measured.
  • G-CSF G-CSF protein content was determined by regression analysis.
  • Rabbit polyclonal anti-G-CSF antibody (K0MA BIOTECH) coated at a concentration of about 2 pg / ml High protein binding microtiter plates (Corning) were prepared.
  • Blocking buffer is prepared by using 1) IX phosphate buffer solution containing Casein sodium salt, and the standard solution and the sample solution are mixed with 10 times diluted buffering buffer.
  • Protein samples and reagents were dispensed at 100 y 1 per well, and each step was treated three times with 300 ⁇ l wash solution (1 ⁇ PBS; 0.05% Tween-20) per well to wash unreacted samples.
  • Protein samples and detection antibodies (rabbit polyclonal anti-G-CSF antibody, K0MA BIOTECH) were sequentially treated at room temperature for about 2 hours and then Streptavidin-horseradi sh peroxidase (Pierce) was reacted at 37 ° C. for about 30 minutes.
  • Substrates ⁇ (3,3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine), Pierce
  • G-CSF, G-CSF T116C time remaining residual G-CSF amount (3 ⁇ 4) is shown in Figure 10.
  • the G-CSF (T116C) protein was 15 hours after the native human G-CSF, and the amount of remaining G-CSF0116C) was about 30% higher than that of the native human G-CSF.
  • the formation of disulfide bonds between Cysll6 and Cysl7 helps to increase the protein's resistance to blood proteases.
  • Example 7 In Vivo Half-Life Measurement of G-CSF Mutant Proteins
  • the G-CSF variant of the present invention and its transferrin fusion protein were administered in vivo, the amount of G-CSF present in serum after administration of the protein in mice was measured to determine the biohalf life of the protein.
  • the "in vivo half-life” described above refers to the "half-life of protein in plasma", ie, the time zone in which G ⁇ CSF protein circulates in the plasma, remaining about 50% of its initial concentration. Pharmacokinetic calculations were performed using PKsoiver v2.0.
  • mice were purchased from 6 weeks old ICR, SPF, male mice from Samtaco. Individual body weights were measured at the end of the quarantine and purifying periods after a minimum of 6 days of woo-woong period. On the basis of the body weight, healthy animals without weight gain and general symptoms were selected and the average weight of each group was Randomly placed (35-45 g per animal) randomly composed 6 animals for each test group.
  • the dose of each individual was converted (5 mL / kg), followed by transferrin fusion protein of 20 G-CSF variant or 100 g G-CSF variant per weight (kg). Taken with a disposable syringe (lmL, 26G needle) and slowly injected into the Intravenous Bolus. Dosing date was defined as Day 1 of testing. Blood was collected from the animals by orbital collection at 0.25, 0.5, 1, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours after injection. After collection, blood flowed for 1-2 minutes at 10, 000-13,000 rpm.
  • Plasma is separated by centrifugation, and the separated plasma is contained in about 1 ⁇ 50 u L / tube each in one tube marked with test classification, animal number, and blood collection time, and stored in ultra-cold storage (about -70 ° C) until the day of analysis. Stored.
  • the amount of active G-CSF in plasma was quantified by ELISA after thawing the sample on ice.
  • the quantification of G-CSF in plasma by ELISA was performed by purchasing Human G-CSF ELISA Kit, pink-ONE ( Koma biotech.), And the experimental method was performed according to the manual of the corresponding reagent.
  • a calibration curve of absorbance according to the protein concentration of the standard solution was prepared, and the content of G-CSF mutant proteins in the sample was determined by regression analysis.
  • Noncompartmental pharmacokinetic analysis from the mean concentration-time profile of each test compound is performed by applying IV Bolus non-compartment analys is input to the PKsolver v2.0 program.
  • Pharmacokinetic parameters assess terminal half-life (t 1/2 ).
  • the half-life of proteins in plasma of proteins is shown below.
  • the G-CSF (T116C) mutant protein showed a blood half-life similar to that of native human G-CSF. This is a result showing that the filtration rate in the kidney is similar because it has a similar protein radius to G-CSF.
  • G-CSF-Tf protein showed improved blood half-life compared to G-CSF.
  • the G-CSF (T116C) -Tf fusion protein in which the G-CSF (T116C) protein was fused to transferrin, had a longer half-life than the G-CSF-Tf protein and showed a half-life similar to that of the PEGylated G-CSF. This is a result of fusion of G-CSF (T116C) mutant protein with increased resistance to blood protease to transferrin, resulting in the reduction of renal filtration rate and improvement of blood stability, thereby maximizing blood half-life in vivo. 11).
  • Example 8 Pharmacodynamics of Leukopenia Rats of G "CSF Mutant Proteins
  • hematology analysis was performed using a leukopenia rat disease model. All processes such as breeding, administration and hematological analysis were commissioned by Cuvest Co., Ltd. Hematological analysis items were WBC, NEU, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, Differential leucocyte count, etc.
  • test substance was converted into individual doses (2 mL / kg) based on the weight measured immediately before administration on the day of administration, and then slowly injected into the Intravenous Bolus using a disposable syringe (l mL, 26G needle). do. Dosing date was defined as Day 1 of testing.
  • G-CSF (T116C) -Tf-treated group was treated with G-CSF and Peptide at 6 and 12 hours. Neutrophils higher than 3 ⁇ 4 G-CSF group To represent the daegap Confirmed.
  • G-CSF the absolute value of neutrophils was slightly higher than that of the control group at 24 hours, but there was no significant difference, whereas pegylated G-CSF and G-CSF (T116C) -Tf were treated in Cyclophosphamide-induced leukopenia rat disease model. The effect of increasing white blood cell (Whi te blood cel l, WBC) and neutrophil levels up to 24 hours was observed.
  • the G-CSF (T116C) -Tf fusion protein was circulated in vivo by transferrinol-mediated activation and showed a longer in vivo retention time than G-CSF and similar to PEGylated G-CSF.
  • the pharmacokinetic parameters (Cmax and AUCO-t) values were measured higher than PEGylated G-CSF, as shown in FIG. 9, to proliferate more neutrophi lic precursor cel l in the same time than PEGylated G-CSF. Judging from the result. ( Figure 12)
  • the substance derived from the present invention has the biological efficacy of G-CSF , which is clinically used, it is used for the treatment of ischemic diseases or stimulates neutrophi granules (neutrophi l granulopoiesis) for cancer chemotherapy and radiation therapy. It can be used as an anticancer adjuvant to prevent infectious complications caused by neutropenia.

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Abstract

본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질(G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인(Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (specific activity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로, 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭】
과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 또는 이와 트랜스페린 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질에 관한 것이다.
【배경기술】
과립구 콜로니자극인자 (Gr anu 1 ocy t e-co 1 ony stimulating factor , G-CSF)는 호중구 (Neutrophil) 및 과립구 (Granulocyte) 프로제니터 (Progenitor) 세포 및 성숙 호중구 (Mature neutrophi Is)의 생존， 증식 , 분화 및 기능을 자극하는 당단백질이다. 임상적으로 사용되고 있는 천연형 G-CSF는 필그라스팀 (Filgrastim)이라고 불리며， 인간 아미노산 서열에서 유래된 175개 아미노산으로 구성된 재조합 단백질이다. 대장균 E. α?//)에서 발현되어， 천연형과는 달리 당화되어 있지 않다.
G-CSF는 호중성 과립구 형성 (neutrophil granulopoiesis)을 자극함으로서， 임상적으로 항암 치료에 따른 호중구 감소증 (neutropenia)에 의한 감염성 합병증 예방을 위해 항암 보조제로 사용되고 았다. 암 화학치료 및 방사선 치료로 인해 발생한 발열성 호중구 감소증의 부작용의 발생을 감소시켜 암 -화학치료로 인한 사망를을 저하시켜, 암 환자들에게 큰 이점을 주는 임상적 효능을 보이고 있다. G-CSF는 조혈 프로제니터 세포 (hematopoietic progenitor cells)의 수를 증가시켜 그와 같은 부작용을 완화시키는 것으로 보고되고 있다. 또한， G-CSF는 골수 줄기 세포를 허혈성 심장으로 이동하도록 하여, 심근 재생을 통해 혈관. 세포 및 심근 세포로의 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF)는 단시간동안 약리학적 효과를 가지고 있어서, 허혈성 질환의 치료시 또는 암 화학요법 혹은 방사선요법 이후 발생하는 백혈구 감소증 지속기간 동안 하루에 한 번 이상 투여해야 하는 불편함이 있다. 생체내에서 간 순환 반감기 (Hal f-l i fe)를 갖는 물질은 백혈구 감소증 등의 완화를 위하여 필요한 투여 횟수를 감소시키고, 결과적으로 감염성 합병증을 예방하는 효과를 갖게 될 것이다.
G-CSF의 N-말단에 생체에서 분해되지 않는 화학 중합체인 Polyethylene glycol (PEG)를 부착시킨 물질은 페그필그라스팀 (Pegf i lgrast itn)이라고 불리며， 임상적으로 백혈구 감소증 치료에 사용되고 있다. 이 물질은 생체내에서 순환 반감기가 늘어나며， 백혈구 감소증 지속기간 동안 1 ~ 2 주에 한 번씩 투여하면서도 임상적 효과를 나타내고 있다. 그러나， 단백질과 화학 중합체를 화학적 반웅 통해 결합시킴으로서, 물질 결합 효율과 정제 방법이 복잡해지는 문제점을 안고 있다. ,
G-CSF의 17번째 아미노산인 시스테인은 비황화 결합 상태로 단백질 표면에 노출되어 있다. 증성 pH에서， 노출된 시스테인은 주변 G-CSF의 시스테인과 상호적으로 황화 결합을 하여 웅집되어 활성이 떨어지게 된다. 17번 시스테인이 세린으로 치환된 G-CSF 변이체는 중성 pH에서 단백질의 안정성이 증가된다고 보고되어 있다. 트랜스페린 (transferr in)은 혈장 단백질 중에서 세 번째로 많은 양으로 존재하며， 혈액에 존재하는 철 이온을 다양한 조직으로 운반하는 역할을 한다. 알부민 (Albumin)이나 면역글로불린 G ( Immunoglobul in G, IgG)보다는 짧지만 8일의 비교적 긴 반감기를 가지며， 세포 표면의 트랜스페린 수용체를 통해 세포 내부에 유입되어 철 이은을 공급한 후, 수용체와 결합한 상태로 세포 외부로 유리되어 순환하는 특징이 있다. 이러한 특징올 이용하여， 종래의 반감기가 짧은 단백질을 결합하여 순환 반감기를 증가시키기 위한 융합 파트너로 사용되고 있다. 본 발명은 인간 Gᅳ CSF의 116번째 아미노산인 트레오인 (Threonine)을 사스테인으로 치환하여， G-CSF의 본래 아미노산 서열상에 있는 17번째 시스테인과 황화 결합을 할 수 있도록 유도하였다. 이러한 황화 결합은 단백질의 구조를 안정화하여 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 하였다. 이러한 변이체의 제작을 통해 혈중 단백질분해효소들에 대한 분해 저항성을 갖도록 사용된 예는 전혀 없으며， 이로 인한 효과 역시 보고된 바 없다. 또한， 인간 G-CSF의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여 인간 G-CSF의 혈중 반감기를 증가시키기 위하여 사용한 예는 전혀 보고된 바 없다. 본 발명자들은 인간 G-CSF의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 변이체를 트랜스페린과 융합하여， 비 융합된 원형 인간 G-CSF에 비해 비활성도 (speci f ic act ivi ty) 및 혈중 안정성이 현저히 증가됨올 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제】
본 발명의 목적은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine) °1 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질을 제공하는 것이다. ί기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여，
본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 및 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 및 아의 용도를 제공한다. 또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증， 허혈증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항암 치료 보조제를 제공한다.
또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현백테 및 상기 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다. 또한 본 발명은 과됩구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 '말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 상기 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현백터， 및 상기 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체의 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 백터 또는 상기 형질전환체를 개체 또는, 호중구 감소증 또는 허혈증 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소증 또는 허혈성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 백터 또는 상기 형질전환체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소 방법을 제공한다. 아울러， 본 발명은 호중구 감소증, 항암 보조제， 허혈성 질환을 치료하기 위한 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 상기 백터 또는 상기 형질전환체의 용도를 제공한다. 【유리한 효과】
본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (speci f ic act ivity) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고, 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로， 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 '
도 1은 pcDNA3.1(+)/preTi 백터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 2는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) 백터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 3은 pcDNA3.1(+)/Tf(B) 백터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 4는 pcDNA3.1(+)/Gᅳ CSF(T116C)-Tf 백터의 개열지도를 나타내는 도이다.
도 5는 G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드로 형질전환된 Expi293F 세포주의 G-CSF(T116G)-Tf 발현양을 나타내는 도이다.
도 6은 디이에이이아피젤블루 (DEAE Af f i-gel blue) 크로마토그래피로 분리한 G_CSF(T116C)-Tf 단백질을 나타내는 도이다.
도 7은 철 (Fe3+)이 결합된 G-CSF(T116C)-Tf의 holo (전효소)형태의 제조 및 농축 분리를 나타내는 도이다.
도 8은 G-CSF(T116C)-Ti의 holo 형태의 트랜스페린 수용체 결합력을 나타내는 도이다.
도 9는 G-CSF, G-CSF-Tf , G-CSF(T116C)-Tf를 처리한 HL-60세포들의 세포 증식 활성도를 나타내는 도이다.
도 10은 G-CSF , G-CSF(T116C) 단백질의 단백질분해효소에 의한 분해 저항성 비교를 나타내는 도이다.
도 11은 G-CSF-Tf , G-CSF(T116C)-Tf 단백질들의 생체 내 혈장 반감기의 비교를 나타내는 도이다.
도 12는 호중구 백혈구 감소증의 렛트에서 G-CSF, G-CSF(T116C)-Tf 단백질들의 생리 활성 비교를 나타내는 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서
116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질) 또는 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질)의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 사용된 G-CSF 또는 트랜스페린은 동물， 식물, 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며， 인간 유래 G-CSF 또는트랜스페린인 것이 바람직하나， 인간 유래 G-CSF 또는 트랜스페린과 동등한 활성을 가지는 이종 유래ᅳ 단백질일 수 있다. 상기 단백질에는 추가적으로 인산화， 아세틸화， 메틸화， 당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며， 다른 단백질과 결합할 수 있으나， 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다. · 상기의 116번째 트레오닌이 치환되는 다른 아미노산은 소수성 아미노산일 수 있으며， 구체적으로 G-CSF서열의 17번째 시스테인 (Cysteine)과 이황화결합이 가능한 시스테인 (Cysteine)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 트랜스페린이 연결되는 말단은 아미노 말단 (5' 말단 N-말단) 또는 카복시 말단 (3' 말단， C-말단) 중 어느 것이라도 가능하다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF)을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%， 96%, 97% , 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 트랜스페린은 <서열번호 2〉의 서열로 표시되는 단백질이나, 상기 단백질과 동일한 활성올 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실， 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 트랜스페린 단꽥질은 <서열번호 2>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성， 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%， 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 '상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 아미노산 서열에 80%이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%， 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이쎄 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 아미노산 서열에 80%이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%， 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질, 또는 트랜스페린은， 유전자 조작을 위하여 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산， 또는 단백질와 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 다른 아미노산을 암호화 하는 염기서열로 치환한 것일 수 있고， 유전자 말단 부위의 일부가 제거， 치환, 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어， 단백질 유전자 내의 BamfR 제한 효소 인식 부위 염기서열 (GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 제한 효소의 종류에는 EcoRi, BamHl., Hind . , kpnl , Not I , Pst I ,
Smal , Xho I , Fokl , Alw26\ , Bbvl , Bsrl , Earl , Hph\ , Mbol , SfaNl， Tthlll I , Nael , Nhel, NgoMN, Nhel, Eco57l , Beg I , Bp I , Bsp241 , Bael , Cjel , EcoPl , Hintm , StyLTl 둥이 있으며， 사용하고자 하는 유전자 , 발현 백터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질을 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증 허혈증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항암 차료 보조제를 제공하고， 상기 단백질을 암호화 하는 유전자를 포함하는 발현백터， 및 상기 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 '호중구 감소증 (neutropeni a) '란， 호중구의 수가 비정상적으로 감소된 것을 말하며 혈액 μ 1당 호중구의 수가 1500이하인 경우 가벼운 증세， 1000 이하인 경우 중간 정도의 증세， 500 이하인 경우 심각한 호중구 감소증으로 분류된다. 백혈구 감소증 (neucopeni a)도 넓은 의미의 호중구 감소증으로 볼 수 있다. 본 발명의 '허혈성 질환'이란 출혈， 색전 (embol i sm) 및 경색 ( infarct ion) 등에 의해 조직으로의 혈류공급이 중단되어 세포손상이 일어나는 것을 말하며， 외상， 이식 거부반응, 뇌졸중， 뇌경색， 허혈성 신질환， 허혈성 폐질환, 감염에 의한 허혈성 질환， 사지의 허혈성 질환， 허혈성 심근증， 심근경색증， 심부전、등이 있다. 상기의 116번째 트레오닌이 치환되는 다른 아미노산은 소수성 아미노산일 수 있으며， 구체적으로 이황화결합이 가능한 시스테인 (Cysteine)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF)을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실， 치환되는 서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 단백질은 <서열번호 1>의 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성， 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성， 가장 구체적으로. 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 트랜스페린은 <서열번호 2>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화 하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실， 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 트랜스페린 단백질은 <서열번호 2>의 아미노산 서열에 8 아상의 상동성， 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%, 96%,. 97%， 98% , 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상, 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질은 <서열번호 3>의 아미노산 서열에 80%이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%, 96%, 97% , 98%, 99%또는 99.5¾> 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 혹은 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실， 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 4>의 아미노산 서열에 8 이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성， 가장 구체적으로 95%， 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로^ 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 서열로 표시되는 단백질이나， 상기 단백질과 동일한 활성을 갖거나 염색체 상의 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질 흑은 트랜스페린을 암호화하는 유전자 위치가 동일한 이상， 상기 단백질의 하나 또는 몇개의 아미노산이 첨가， 결실, 치환되는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질은 <서열번호 5>의 아미노산 서열에 80%이상의 상동성， 보다 구체적으로 90%이상의 상동성 , 가장 구체적으로 95% , 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 서열로 구성되는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) , 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 다른 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 또는 트랜스페린은， 유전자 조작을 위하여 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산， 또는 단백질의 활성을 변화시키지 않는 범위 내에서 다른 아미노산올 암호화하는 염기서열로 치환한 것일 수 있고， 유전자 말단 부위의 일부가 제거， 치환， 또는 첨가되어 제한 효소 인식 부위가 삽입된 것일 수 있다. 예를 들어, 단백질 유전자 내의 Ba! 제한 효소 인식 부위 염기서열 (GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 제한 효소의 종류에는 EcoR\ , BamHl, Hincm , kpnl , Notl , Pstl , Smal ， Xhol , Fokl ， Alw26l ， Bbvl ， Bsrl ， Earl , Hphl ， Mbol , SfaNl ， Tthlll I , Nael , Nhel , NgoMN , Eco57\ , Bcgl , Bpl , Bsp241 , Bael , Cjel , EcoPl , Hin , StyLTl 등이 있으며，사용하고자 하는 유전자， 발현 백터 또는 유전자 조작 환경에 따라 당업계에서 사용되는 모든 제한 효소가 제한 없이 이용될 수 있다. - ' 본 발명의 '발현 백터 '란 목적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 숙주 세포에 도입하기 위한 수단으로서, 폴라스미드， 코스미드, BAC, 바이러스 핵산 등의 여러 형태를 포함한다. 상기 백터에는 목적 유전자가 성공적으로 숙주세포에 도입되었음을 확인할 수 있는 항생제 내성 유전자 등의 선택적 마커를 포함하고 있는 것이 일반적이며， 목적 유전자의 발현을 유도하기 위한 프로모터， 오퍼레이터， 개시코돈, 종결코돈， 폴리아데닐화 서열, 인핸서， 코작 서열， 샤인-달가노 서열 등을 목적에 따라 다양하게 포함할 수 있다. 복제 가능한 발현백터의 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 숙주세포는 대장균， 효모, 곰광이， 식물세포， 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에서 재조합 단백질 생산에 사용되는 모든 숙주세포가 이용 가능하다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 둥이 포함되며， 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트， 수크로오스 (sucrose) , 락토오스 ( lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트 (magnesium stearate) , 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제, 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜, 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라， 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥， 근육， 피하， 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중， 연령， 성별， 건강상태， 식이, 투여시간， 투여방법， 배설를 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며， 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다. 일회 투여량은 단백질의 양을 기준으로 1 내지 100 밀리그램이고， 바람직하게는 3 내지 50 밀리그램이고， 더욱 바람직하게는 6 내지 30밀리그램이며， 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있으며， 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로， 또는 수술， 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터， 및 상기 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체의 제조방법을 제공한다. 상기 단백질은 화학적으로 합성하거나, 자연적으로 존재하는 세포에서 생산되거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 변형된 숙주세포에서 정제하여 얻을 수 있고，수득한 단백질에는 추가적으로 인산화，아세틸화， 메틸화，당쇄화 등의 변형이 있을 수 있으며, 다른 단백질과 결합한 상태에 있을 수 있으나， 이로 인하여 단백질의 기능이 상실될 만큼 변하지 않는 한 변형 전의 단백질과 동일한 것으로 볼 수 있다. 상기 유전자 재조합 기술을 이용한 단백질의 제조방법은
발현하고자 하는 유전자를 발현백터에 삽입하는 단계;
상기 발현백터를 숙주세포에 도입하는 단계;
숙주세포를 배양하여 생산된 단백질을 수득하는 단계로 구성될 수 있으나， 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 모든 방법이 이용 가능하다. 상기 단백질을 수득하는 단계는 단백질 침전제, 원심분리， 초음파 파쇄， 한외여과， 투석법， 겔 여과， 흡착 크로마토그래피; 이은 교환 크로마토그래피， 친화도 크로마토그래피 등의 당업계에 공지된 정제 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서， 트랜스페린 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 제거하고， 5' 말단에 제한효소 부위 서열을 삽입하고, 3' 말단에 제한효소 부위와 stop 코돈을 삽입한 유전자를 포함한 플라스미드를 제조하였고, 상기 플라스미드에 G-CSF 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 제거한 유전자를 삽입하여 트괜스페린 유전자와 G— CSF 유전자가 연결된 플라스미드를 제조하였다. 또한 본 발명의 일 실시예에서， G-CSF 유전자의 116번째 아미노산을 시스테인으로 치환한 G-CSF 변이체를 제조한 후, 유전자 내부의 제한효소 인식서열을 쎄거하고, 5' 말단에 제한효소 부위와 코작 서열을 삽입하고, 3' 말단에 제한효소 부위 삽입한 유전자를 포함한 플라스미드를 제조하였다. 이후 트랜스페린 유전자를 상기 플라스미드와 융합하여 트랜스페란 유전자와 G-CSF 변이체 유전자가 연결된 플라스미드를 제조하였다. 또한， 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 ""아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터， 및 상기 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 개체 또는， 호중구 감소증 또는 허혈증 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소증 또는 허혈성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (speci f ic act ivi ty) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고， 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효을이 높으므로, 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질, 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 백터 또는 상기 형질전환체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소 방법을 제공한다. 본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (speci f ic act ivi ty) 및 혈중 안정성이 현저히 증가되고， 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G-CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로, 상기 단백질은 호중구를 감소시키데 유용하게 사용될 수 있다. 아을러， 본 발명은 호중구 감소증, 항암 보조제， 허혈성 질환을 치료하기 위한 과립구 콜로니 자극인자 단백잘 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 아미노산 서열에서 116번째의 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질의 말단에 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질， 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 과립구 콜로나 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질， 상기 백터 또는 상기 형질전환체의 용도를 제공한다.
본 발명의 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF) 변이 단백질 또는 이의 트랜스페린 융합단백질은 기존의 인간 G-CSF에 비하여 비활성도 (speci f ic act ivi ty) 및 혈증 안정성이 현저히 증가되고， 기존의 반감기가 늘어난 페길화 G— CSF에 비하여 정제 효율이 높으므로， 항암보조제， 허혈성 질환 또는 호중구 감소증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>플라스미드 제작
<1-1>트랜스페린 발현 플라스미드제작
총 mRNA를 얻기 위해 인간 간암 세포인 HepG2*을 이용하였다. HepG2 세포를 10% 소태아 혈청 ( fetal bovine serum, WelGNE)과 1% 페니실린-스트랩토마이신 (Gibco)이 포함된 DMEM (HyClone)를 이용하여 37°C， 5% 이산화탄소 항온기에서 계대배양하였다. 계대배양 후 이를간 배양한 HepG2 세포의 배지를 제거하고 인산완충액 (HyClone)올 이용하여 세척 후， 세포 펠렛을 수거하여 원심분리하여 배지를 제거 후 -70°C에 보관하여 사용하였다. -70°C에 보관되어 있던 세포를 꺼내 해동한 후 RnaUs ToTal Tissue Premium RNA Preps (LeGene)을 사용하여 지침서에서 제시한 표준 조건으로 수행하여 총 mRNA를 얻었다. 얻어진 총 mRNA를 Premium Express 1st Strand cDNA synthesi s system (Legene)으로 ol igo(dT)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 만들어진 cDNA를 주형으로 DNA 증합효소 (Phusion)를 사용하여 중합효소 연쇄반웅 (PCR)을 실시하였다. 반웅에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였으며 트랜스페린 유전자의 5' 말단에 Nhe\ 제한효소 부위, 코작 (Kozak) 서열을 위치시키고 3' 말단에 Xho I 제한 효소 부위， Stop 코돈 (TM)이 위치하도록 제작하였다. 센스 프라이머
(5' -CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3' ， 서열번호 9) 및 안티센스 프라이머 (5' -AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3 ' ， 서열번호 10)를 10 pit l로사용하였고 cDNA주형과 함깨 DNA중합효소와 완충액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μ ΐ로 하였다. PCR기기를 이용하여 98°C에서 30초간 반웅시키고, 순환 프로그램은 98°C에서 10초， 53°C에서 30초， 72°C에서 1분간을 30회 반복하고， 마지막으로 72°C에서 10분간 추가 반웅시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 원하는 부분의 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-sp in™ Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제를 통해 얻어진 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 플라스미드 (Invitrogen)를 Nhel (Enzynomics)과 Xhol (Enzynomics) 제한효소를 처리하였다. 제한 효소 10 unit과 완충용액 2 (10mMTris-HCLpH7.9, 50mMNaCl, 10mMMgCl2, I mMDTT, 100 Ug/ml BSA)를 넣고 37°C에서 2 ~ 3시간 반웅시켰다. 반웅이 끝난 후 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-sp in™ Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1( + ) 백터를 T4 DNA 접합효소 (Takara)와 함께 16°C에서 16시간 반웅시켰다. 반웅이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린 항생제가 포함된 한천 (Agar) 플레이트에 도포한 후 37°C에서 16시간 배양하여 대장균 콜로니를 선별하였다. • pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위해서 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반웅 (PCR)을 통해 확인하였다. 대장균 콜로니를 물에 회석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페린 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머 (5' -CATGCTAGCTCCACCATGAGGCTCGCCGTGGGAGCC-3' ， 서열번호 9) 및 안티센스 프라이머 (5， -AGACTCGAGTTMGGTCTACGGAAAGTGCAG-3' ， 서열번호 10)를 이용하였으며 98°C에서 30초간 반웅시키고， 순환 프로그램은 98 °C 10초， 53°C에서 30초, 72°C에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분간 추가 반웅시켰다. 중합효소 연쇄반웅 (PCR)이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 LB 액체 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, l%NaCl)에 접종하여 16시간 37 °C진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 Exprep™ Plasmid SV.mini (GeneAU)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제한 플라스미드의 염기서열 분석은 코스모진텍사에서 진행되었다. 이렇게 만들어진 트랜스페린 발현 플라스미드를 본 명세서에서는 pGDNA3.1(+)/preTf (서열번호 6)로 명명한다 (도 1). 플라스미드 제작시 제한효소 Ban 부위를 이용하기 위해 트랜스페린 유전자에 존재는 BamH 부위를 위치선택적 돌연변이 (site-direct mutagenesis)를 실시하여 BamH 제한 효소 부위를 제거하는 작업을 하였다. 트랜스페린 유전자에 존재하는 Ban 제한 효소 부위를 제거하기 위해 핵산을 타이민 (Thymine, T)에서 사이토신 (cytosine, C)로 치환하였으나 아미노산 서열은 아스파트산 (Aspartic ac l)으로 유지된다, BawHl 제한 효소 부위， GGATCC를 GGACCC로 핵산을 치환하기 위해 센스프라이머 (5' -CTATGGGTCAAMGAGGACCCACAGACTrrCTATT— 3' ， 서열번호 11) 및 안티센트 프라이머 (5' -AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCTTTTGACCCATAG-3 ' ， 서열번호 12)를. 코스모진텍사에서 주문제작하여 사용하였다. 기 제작된 pcDNA3.1(+)/preTf 플라스미드를 주형으로 사용하였으며 Muta-direct Site Directed Mutagenesis kit (iNtRON)을 이용하여 제조사에서 제공하는 지침서대로 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자를 확인하였으며 확인된 대장균 콜로니를 엠피실린 항생제가 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 16시간 동안 37°C 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상층액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 플라스미드 추출 키트 (GeneAU)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하였고, 염기서열 분석을 통해 트랜스페린 유전자에 존재하는 ¾ I 제한효소 부위의 핵산이 치환된 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를ᅳ 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/preTf(B) (서열번호 7)로 명명한다 (도 2). 트랜스페린은 분비 단백질로서 N-말단에 합성된 단백질이 세포막으로 전달되도록 도와주는 신호 펩타이드 (Signal peptide)를 포함하고 있으며, 아미노산 서열은 MRLAVGALLVCAVLGLCLA (서열번호 13) 이다. 인간 백혈구 생성 촉진인자의 유전자를 트랜스페린 유전자의 5' 말단에 삽입하기 위하여 트랜스페린에 존재하는 신호 펩타이드를 제거하고 5' 말단에 제한효소 ¾//?M을 위치시킨 플라스미드를 제조하였다. 3' 말단에는 Xho I과 Stop 코돈 (TM)을 위치시켰다. pcDNA3.K+)/preTf(B)를 주형으로 DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. . 반웅에 사용하는 프라이머들은 코스모진텍에서 주문 제작하여 사용하였다. 센스프라이머 (5' -CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3 ' , 서열번호 14) 및 안티센스 프라이머 (5' -AGACTCGAGTTMGGTCTACGGAAAGTGCAG— 3' ， 서열번호 10)를 10 ρπκ)1로 사용하였고 주형과 함께 DNA 중합효소와 완충용액에 증류수를 가하여 총 부피를 50 μ ΐ로 하였다. PCR기기를 이용하여 98°C에서 30초간 반웅시키고, 순환 프로그램은 98°C 10초， 53°C에서 30초， 72t；에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분간 추가 반웅시켰다. 증폭된 트랜스페린 유전자를 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-s in™ Total Fragment DNA purification kit iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1( + )플라스미드를 각각 BamHl (Enzynomics)와 // l (Enzynomics)제한 효소를 처리하였다.제한 효소 10 unit과 완층용액 2 (10 mM Tris-HCL H 7.9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2> 1 mM DTT, 100 yg/ml BSA)를 넣고 37°C에서 2 ~ 3 시간 반웅시켰다. 반응이 끝난 후 1¾ 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 크기를 확인하고 아가로즈 겔을 잘라 MEGAquick-s in™. Total Fragment DNA purification kit (iNtRoN)을 사용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1(+) 백터를 다시 \ 아가로즈 겔에 걸어 전기영동 한 후 DNA를 정량하였고 트랜스페린 유전자와 pcDNA3.1( + ) 플라스미드를 T4 DNA 접합효소 (Takara)를 첨가하여 16°C에서 16 시간 반웅시켰다. 반웅이 끝난 후 대장균 DH10B에 형질전환하였고 엠피실린이 포함된 한천 플레이트에 도.포한 후 37°C에서 16시간 배양하며 대장균 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+) 플라스미드에 트랜스페린 유전자가 성공적으로 삽입되었는지는 중합효소 연쇄반웅을 통해 실행하였다. 대장균 콜로니를 물에 회석하여 주형으로 사용하였고 트랜스페된 유전자 증폭에 사용된 센스프라이머 (5' -CTCGGATCCGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG-3' ， 서열번호 14) 및 안티센스 프라이머 (5' -AGACTCGAGTTAAGGTCTACGGAAAGTGCAG-3 ' ， 서열번호 10)를 이용하였으며 98°C에서 30초간 반웅시키고， 순환 프로그램은 98°C 10초， 53°C에서 30초， 72°C에서 1분씩 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분간 추가 반웅시켰다. 중합효소 연쇄 반웅이 끝난 후 1% 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였고 유전자 삽입이 확인된 대장균 콜로니를 LB액체 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract, l% NaCl)에 접종하여 16시간 37°C 진탕배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균을 원심분리하여 상충액과 세포펠렛으로 분리한 후 세포펠렛을 Exprep™ Plasmid SV,mini (GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 정제한 풀라스미드는 염기서열분석을 통해 signal peptide가 제거된 트랜스페린 유전자가 성공적으로 pcDNA3.1(+)에 삽입되었는지를 확인하였다. 이렇게 만들어진 폴라스미드를 본 명세서에서는 pcDNA3.1(+)/Tf(B) (서열번호 8)로 명명하였다 (도 3). <l-2> G-CSF-Tf 발현 플라스미드제조
pcDNA6/G-CSF의 BainH 제한효소 부위를 제거하기 위해, pcDNA6/Gᅳ CSF 플라스미드에 BamfA (Enzynomics) 제한효소 20 units를 처리하여 37°C에서 3시간 반용시켰다. 반웅된 플라스미드 45 ng을 10 pmol의 센스 프라이머 (5' -CATGCTAGCTCCACCA TGGCTGGACCTGCCACCCAG-3 ' , 서열번호 15)와 안티센스 프라이머 (5' -CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3 ' , 서열번호 16)로 PCR 방법을 통해 증폭시켜， 5' 말단에는 Nhe \제한효소 부위와 코작 (Kozak)서열을， 그리고 3' 말단에는 Ba/nH 제한효소 부위를 갖는 G-CSF 유전자 절편을 .제조하였다. 제조된 G-CSF유전자 절편 1 과 pcDNA3.lO)/Tf(B) 플라스미드 365 ng을 각각 Nhel 제한효소 10 units과 BamH 제한효소 20 units로 37°C에서 4시간 반웅시킨 후， DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 전기영동을 걸어 겔을 추출하였다. pcDNA3.1(+) /G-CSF-Tf 제조를 위해, 정제된 pcDNA3. l(+)/Tf (B) 플라스미드와 G-CSF 유전자 절편을 1대 3의 몰 비율로 섞고 T4 DNA 접합효소 350U와 25°C에서 1시간 반웅시킨 후, 대장균 0Η5α에 형질전환시켰고 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pcDNA3.1(+)/G-CSF-Ti 플라스미드가 성공적으로 제조되었는지는 콜로니 중합효소 연쇄반웅 (Colony PCR)로 확인하였다ᅳ 대장균 DH5a에 형질전환되어 선별된 콜로니는 10 pnral의 센스 프라이머 (5' -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' ， 서열번호 17)와 안티센스 프라이머 (5' -AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCnTGACCCATAG-3' ， 서열번호 18)로 콜로니 PCR 방법을 통해 증폭시킨 후， 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1¾)아가로즈)에 걸어 크기를 확인하였다.확인된 콜로니는 엠피실린 (lOO^g/ml)이 들어있는 LB액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 효모추출물 25 mg, 염화나트륨 50 mg)에 접종하여 15시간 배양하고， 풀라스미드 추출 키트로 pcDNA3.1(+)/G-CSF-Tf를 추출한 후, 염기서열분석을 통해 pcDNA3.1(+) /G-CSF-Tf이 성공적으로 제조된 것을 확인하였다.
<1-3> G-CSFCT116C) 및 G"CSF(T116C)-Tf 발현 플라스미드 제작
센스 프라이머 (5' -GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3' ， 서열번호 19)와 안티센스 프라이머 (5' -ATCTGCTGCCAGATGCAGGTGGCAAAGTCGGC-3 ' ， 서열번호 20) 각각 10 ρηωΐ를 pET21a(+)/G-CSF와 흔합 후 연쇄중합반웅을 통해 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 위치선택적 돌연변이를 실시하여 G-CSF(T116C) 유전자를 제작하였고. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서 pET21a(+)/G-CSF(T116C)라 명한다.
pET21a(+)/G-CSF(T116C)를 DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인한 후， 그 부분의 겔만 잘라내어 겔 추출 키트 (코스모진텍)로 정제하였다. 정제된 pET21a(+)/G-CSF(T116C)로 대장균 DH10B에 형질전환 시켰고， 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 엠피실린 (100 ug/mL) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 염화나트륨 50 mg, 효모추출물 25 mg)에 접종하여 15시간 배양하고， 플라스미드 추출 키트로 pET21a(+)/G-CSF(T116C)를 추출한 후， 염기서열법으로 염기서열이 성공적으로 치환된 것을 확안하였다.
먼저， 센스 프라이머 (5' -GCCGACTTTGCCACCTGCATCTGGCAGCAGAT-3' , 서열번호 19)와 안티센스 프라이머
(5' -ATCTGCTGCCAGATGCAGGTGGCAAAGTCGGC-3 ' ， 서열번호 20)를 각각 10 pmolA 가 되도록 녹이고, 각 각의 프라이머를 10 pn l씩 취하여 pcDNA6에 삽입된 G-CSF 유전자 100 ng과 PCR 방법으로 반웅시켜 상기 실시예 <1-1>과 같은 방법으로 위치선택적 돌연변이를 실시하여 G-CSF(T116C) 유전자를 얻었다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 본 명세서에서 pcDNA6/G-CSF(T116C)라 명한다. pcDNA6/G-CSF(T116C)를 DNA아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1%아가로즈)에 걸어 크기를 확인한 후, 그 부분의 겔만 잘라내어 겔 추출 키트 (코스모진텍)로 정제하였다. 정제된 PCDNA6/G— CSF 116C)로 대장균 DH10B에 형질전환 시켰고， 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 엠피실린 (100 /g/ml) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 염화나트륨 50 mg, 효모추출물 25 mg)에 접종하여 15시간 배양하고， 플라스미드 추출 키트로 pcDNA6/G-CSF(T116C)를 추출한 후, 염기서열법으로 염기서열이 성공적으로 치환된 것을 확인하였다. pcDNA6/G-CSF(T116C)의 Ban 제한효소 부위를 제거하기 위해, pcDNA6/G-CSF(T116C) 플라스미드 1 에 BamH (Enzynomics) 제한효소 20 units를 처리하여 37°C에서 3시간 반웅시켰다. 반웅된 플라스미드 45 ng을 10 pm 의 센스 프라이머 (5' -CATGCTAGCTCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3' ， 서열번호 15)와 안티센스 프라이머 (5' -CATGGATCCGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3 ' ， 서열번호 16)로 PCR 방법을 통해 증폭시켸 5' 말단에는 A¾el제한효소 부위와 코작 (Kozak)서열을， 그리고 3' 말단에는 BamHY 제한효소 부위를 갖는 G-CSF(T116C) DNA절편을 제조하였다. 제조된 G-CSF T116C) DNA절편 1 과 pcDNA3. l(+)/Tf (B) 플라스미드 365 ng을 각각 Nhe\ 제한효소 10 units과 BamHY 제한효소 20 units로 37°C에서 4시간 반웅시킨 후， DNA 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 전기영동을 걸어 겔 추출 키트로 정제하였다. pcDNA3.1( + )/G-CSF(T116C)-Tf를 제조를 위해, 정제된 pcDNA3.1(+)/Tf(B)플라스미드와 G-CSF T116C) DNA절편을 1대 3의 몰비율로 섞고 T4 DNA 중합효소 350U와 25°C에서 1시간 반웅시킨 후， 대장균 DH5a에 형질전환시켰고 엠피실린 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다. pcDNA3. l(+)/G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드가 성공적으로 제조되었는지를 콜로니 증합효소 연쇄반웅으로 확인하였다. 대장균 DH5a에 형질전환되어 선별된 콜로니는 10 PTOI의 센스 프라이머 (5' -TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' ， 서열번호 17)와 안티센스 프라이머 (5' -AATAGAAAGTCTGTGGGTCCTCCTTTGACCCATAG-3' ， 서열번호 18)로 콜로니 PCR 방법을 통해 증폭시킨 후， 아가로즈 겔 (0.5X TAE, 1% 아가로즈)에 걸어 크기를 확인하였다. 확인된 콜로니는 엠피실린 (100 Ug/ml) 이 들어있는 LB 액체배지 (5 mL당 트립톤 50 mg, 효모추출물 25 mg, 염화나트륨 50 mg)에 접종하여 15시간 배양하고， 플라스미드 추출 키트로 pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf를 추출한 후， 염기서열분석법으로 pcDNA3.1(+)/G-CSF(T116C)-Tf (서열번호 21)이 성공적으로 제조된 것을 , 확인하였다 (도 4).
<실시예 2> 일시적 형질 전환을 통한단백질 발현 . <2-l> G-CSF(T116C) 발현
pET21a(+)/G-CSF(T116C)풀라스미드 1 를 발현균주인 Rosetta2 (DE3) 20 ^에 접종하여 42°C에서 90초 반웅하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 발현균주를 50 u g/mL 엠피실린이 포함된 LB 배지 풀레이트에 도말하고 37°C에서 15시간 배양하여 콜로니를 얻었다. 50 u g/mL 엠피실린과 25 u g/mL 클로람페니콜이 포함된 100 mL LB 배지에 콜로니를 접종하여 37°C에서 15시간 배양하였다. 배양된 균주 20 mL은 50 u g/mL 엠피실린과 25 u g/mL 클로람페니콜이 포함된 1L LB 배지에 접종하여 OD600 = 0.8에 도달 할 때까지 37°C에서 4시간 교반배양 하였다. ImM IPTG를 첨가하여 37°C에서 4시간 교반배양 하였다. 6000rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액과 침잔물을 분리한 후, SDS-PAGE를 통해 단백질이 inclusion body로 발현되는 것을 확인하였다.
<2-2 G-CSF(T116C)-Tf 발현
본 발명에 사용되는 단백질들은 부유배양을 위해 변형된 인간 배아 신장암 세포주인 Expi293F™세포 (Gibco)를 이용하여 세포 밖으로 단백질들을 분비하여 발현하였다. Ex i293F™ Expression system Ki t (Gibco)에 포함되어 있는 Expi293F™ 세포를 해동 후, 30 mL 현탁 배양용 무혈 배지 (Serum-free media for animal cel l cul ture , Gibco)가 담긴 멸균 125 mL플라스크 (Thermo)에 접종하여 37°C , 5 이산화탄소 항은 배양기에서 125 rpm의 교반 속도로 진탕배양하였다.
Ex i293F™ 세포주를 3 ~ 5xl06 cel ls/ml^] 세포 말도로 유지하며 3 - 4일마다 계대 배'양하여 세포를 안정화시킨 후 형질전환을 위해 2xl06 cel ls/mL의 세포 밀도로 무혈청 배지에 접종하여 24시간 진탕배양하였다. 형질 전환 직전에 세포의 밀도를.다시 2xlQ6 cel ls/mL로 맞추고 세포의 생존능력이 90% 이상 인지 확인하고 실험에 사용하였다.
G-CSF-Tf , G-CSF(T116C)-Tf 플라스미드 DNA 22.5 을 준비하여 Opt i -MEM (Gibco)으로 희석하여 준비하고 Exp i Feet amine™ 293 Reagent 45 u L 역시 Opt i -MEM® 배지로 희석하여 실온에서 5분간 방치하였다. 플라스미드와 Exp i Feet amine™ 293 Reagent 흔합물을 잘 섞어준 후 실은에서 20분간 방치하고 준비된 세포에 골고루 넣어 주었다. 형질전환 후 16 ~ 18시간 사이에 단백질 발현을 증가시키기 위해， 첨가물 Exp i Feet amine™ 293 Trans feet ion Enhancers 1, 2 (Gibco)를 넣고 다시 32시간을 상기 진탕배양 조건에서 추가 배양한 후， 얻어진 세포 배양액을 2,000 xg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질 발현을 확인하기 위해，상층액을 5x loading dye (Biosesang)와혼합하여 95°C에서 20분간 끊이고 10% SDS— PAGE에 점적하여 160 V에서 1시간동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 PVDF 재질의 Immobilon-P-Transfer Membrane (Mi 11 ipore)으로 단백질을 이동시켰다. 5% Skim milk 용엑상에서 상은에서 1시간 반웅시키고 인산완충세척액 (0.05% Tween 20를 포함하는 인산완충액)으로 세척한 후 트랜스페린 항체 (Santa Cruz)를 2ᅳ 000배로 회석하여 상온에서 두시간 반웅시키고 인산완충세척액으로 세척한 후 Horseradish perixidase가 결합된 항체 (Santa Cruz)를 10,000배로 회석하여 상은에서 1시간 반웅시킨다. 항체 결합 반웅이 끝난 후 인산완층세척액으로 세척하고 SuperSignal® West Pico Chemi luminescent Substrate (Thermo)를 이용하여 발색시켰다. G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf의 분자량은 105.7 kDa으로 단백질이 정상적으로 발현되었음을 확인하였다 (도 5). <실시예 3>단백질 정제
<3-1> G-CSF(T116C) 단백질 정제
Inclusion body를 정제하기 위하여 파쇄 완충액 (50mMTris-Cl (ρΗδ.Ο), 2 mM EDTA, 1 mM PMSF)에 녹인 후 초음파분쇄기를 이용해 세포를 파쇄하였다 (파쇄시간 5분， 초음파 30초， 대기 40초). 4°C에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리하여 상층액을 제거한 후，세척완층액 (50mMTris-Cl, pH8.0, 2mMEDTA, 0.3% Triton)에 녹여 초음파분쇄기를 이용해 침전물을 파쇄하였다 (파쇄시간 5분， 초음파 30초， 대기 40초). 4°C에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리로 상층액을 제거 후， 세척완층액 (50mM Tris-Cl, pH8.0, 2 mM EDTA, l MNaCl)으로 녹여 초음파분쇄기를 이용해 침전물을 파쇄하였다 (파쇄시간 5분， 초음파 30초， 대기 40초). 4°C에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리로 상층액을 제거 후， 가용화 완충액 (8 M Urea, 50 mM Tris-Cl, pH8.0)에 세척된 Inclusion body를 용해하였다. 용해된 단백질 시료 10 mL를 투석 (dialysis) 류브에 넣어 2 L의 투석 완충액 (50 mM Tris-Cl pH 8.0， 0.1% Tween20)에서 4°C에서 16시간 동안 단백질 방치하면서 refolding을 진행하였다. 반웅 시료에 2 M Acetic acid를 점적하여 pH를 4.5로 조정한 후， 4°C에서 10,000 rpm으로 30 분 원심분리를 하였다. AKTA prime plus FPLC에 Hiprep 26/10에 연결된 Desalting column (1그 5087-05)를 Desalting buffer (25 mM Na-Acetate pH 4.5, 5% Sucrose, 0.004% Tween20)로 충전하고 원심분리된 상층액을 투과시켜 완충액 교환을 수행하였다.
<3-2> G-CSF(T116C) 단백질 정량
정제된 G-CSF(T116C)는 은염색법 (silver staining)을 이용해 정량하였다. G-CSF표준물질인 그라신 (30 ng이하의 양 /SDS-PAGE웰)을 이용해 표준 정량 곡선을 확보한 후， 각 시료의 미지의 양을 표준 정량 곡선과 비교하여 단백질을 정량하였다.
<3-3> G-CSF(T116C)-Tf 단백질 정제
G-CSF-Tf 혹은 G-CSF(T116C)-Tf가 포함되어있는 상등액 30 mL을 20 mM 인산칼륨 완충용액 (pH 7.5)의 4 L에 투석 (dialysis)하여 완층용액을 교환하였다. 인산칼륨 완충용액에 포함된 G-CSF-Tf 흑은 G-CSF(T116C)-Tf는 디이에이이 아피젤불루 크로마토그래피 (DEAE Affi-gel Blue) 컬럼에 0.5 mL/min의 유속으로 충전한 후, 72 mM 인산칼륨을 계단구배 (step gradient)로 홀려주어 레진에 흡착된 단백질들을 배양액에 포함된 다른 단백질들로부터 분리하였다 (도 6).
<3-4> 철 (Fe3+)이 결합된 형태 제조 본 발명의 G-CSF(T116C)-Tf의 holo 형태 제조는 문헌 [Zhang et al . BMC Biotechnology 2012 , 12 : 92]에 기초하였다. 정제된 G-CSF-Tf 흑은 G-CSF(T116C)-Tf에 단백질과 동일한 양의 구연산 철 암모늄을 처리하여 37°C에서 2시간 반웅시키고 인산 완충 식염수 2L로 4°C에서 15시간 투석 (di alysi s)하여 완충용액을 교환하였으며， 농축기 (Mi l l ipore)를 이용하여 시료를 10배 농축하였다 (도 7) .
<3-5>단백질 정량
정제된 단백질의 정량은 트랜스페린 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 진행하였다. 10% SDS-PAGE에 정량'된 트랜스페린을 각각 웰당 15 ng , 20 ng, 25 ng, 30 ng 씩을 점적하였고， 농도가 미결정된 정제된 단백질을 다른 웰에 함께 점적하여 전기영동하였으며, 웨스턴 블롯을 하여 정량된 트랜스페린의 표준곡선에 정제된 단백질을 비교하여 단백질 시료를 정량화 하였다. <실시예 4>트랜스페린 수용체와의 결합력 측정
트랜스페린은 세포 표면에 발현된 트랜스페린 수용체와 결합 후, 세포 내부로 엔도시토시스로 들어와 철을 유리하고 수용체와 결합한 상태로 다시 세포 표면으로 이동하여 혈액으로 분비된다. 이러한 과정을 반복하여 세포 내부께 철을 공급하면서 세포내 리소좀에서 분해되는 과정을 회피하게 되는 생체내 재활용 대사 과정을 통해 반감기가 증가되게 된다. 반감기가 짧은 목적 단백질을 트랜스페린과 융합하면 트랜스페린의 생체내 재활용 대사 과정을 동행함으로서 목적 단백질이 생체에서 분해 대시" 과정을 회피할 수 있게 된다. 따라세 G-CSF를 트랜스페린에 융합시킨 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 결합력을 유지해야만 효율적으로 생체에서 분해 대사 과정을 회피 할 수 있다. 따라서 본 발명의 단백질들의 세포외 표면 트랜스페린 수용체
(Transferr in receptor ; TfR)와의 결합력을 확인하기 위해 TfR의 세포 막 발현 비중이 높은 인간 간암 세포주 HepG2를 이용하여 실험하였다. HepG2 세포를 웰당 5xl05 세포수로 96-웰 풀레이트에 접종하여 24시간 배양하였다. 플레이트에 부착된 HepG2를 인산 완충액으로 세척한 후, 우혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin; BSA)을 1 mg/ml 포함한 무혈청 DMEM 배지 (HyClone)를 넣고 37°C , 5% 이산화탄소 항온기에서 30분간 방치하여 세포에 기 존재하는 내인성 트랜스페린을 제거 하였다. 인산완충액으로 다시 세척한 후， 시험물질 및 형광이 표지된 인간 트랜스페린 Alexa Fluor ® 647 (Li fe Technologies)를 각각 133 nM 및 5 /mL 농도가 되도록 1 mg/mL BSA를 포함하는 무혈청 DMEM 배지에 흔합한 후， 이 흔합액을 상기 기술에 의하여 준비된 HepG2 세포에 처리한 후 37°C , 5% 이산화탄소 항온기에서 30분간 방치하였다. 차가운 인산완충액으로 배지 속에 남아있는 단백질 시료를 세척하고 형광 측정기를 이용하여 트랜스페린 수용체.에 결합된 형광-트랜스페린의 양을 측정하였다. 형광 측정은 650 nm에서 광원을 주고 668 nm에서 나오는 형광의 세기를 측정하였다.
상기 실시예 <3-4>에서 제조된 G-CSF(T116C)-Tf의 holo 형태의 트랜스페린 수용체 결합력을 <도 8>에 나타내었다. <도 8>에서 보는 바와 같이， 실험 결과 G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질의 트랜스페린 수용체 결합력은 천연형 인간 홀로 -트랜스페린 (Holo-transferr in, SIGMA)과 유사한 결합력을 나타내었다. 이러한 결과는 G-CSF-Tf와 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 인간 트랜스페린 처럼， 트랜스페린 수용체와 결합으로 생체에서 재활용되는 과정을 통해 생체 반감기가 증대됨을 반영한다.
<실시예 5> G-CSF 변이 단백질들의 생물학적 활성 측정
정제된 G-CSF-Tf 변이체 단백질들의 생물학적 활성도 측정은 1.25% DMS0에 의해 분화 유도된 HL-60 세포의 증식 정도를 측정하여 비교하였다. <5-1> 인간 골수 기원 세포주인 HL-60의 준비 및 처리
본 발명에 사용된 인간 골수 기원의 세포주인 HL-60 세포는 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (KCTC)로부터 분양받아 실험에 이용하였다. 상기 세포주를 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI-1640 배지에서 371， 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였으며, 2일 -3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다. 세포는 부착 의존성이지 않다. 세포 배양과 관련된 시약은 하이클론 (HyClone) 사에서 구입하였다. <5-2> G-CSF 변이 단백질들의 세포 증식 활성 축정
세포의 수를 계수하여 약 2 X 105 cells/mL 이 되도록 조정한 후， 분화 유도 물질인 DMSO (dimethyl sulfoxide, culture grade, SIGMA)를 최종 1.25% (v/v)가 되도록 첨가하며 3일 동안 배양하여 과립구 계열로 분화하도록 유도하였다. 시험 물질을 첨가하기 전에, 상기 세포주를 원심 분리하여 수확하고 인산완충용액 (D-PBS)으로 세척한 다음， 96-웰 플레이트 (CORNING)의 긱; 웰에 100 nL씩 넣어 웰 당 약 4 xlO4 세포가 되도록 분주하였다.
대조군으로 사용되는 폐길화 인간 G-CSF (GenScript)와 천연형 G-CSF (GenScript), 시험물질인 G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tfᅳ G-CSF (T116C) 단백질들을 각각 탈염 버퍼 (5mM Sodium Phosphate, 5% Sucrose, 0.004% Tween-20) 중에 희석하여 분화된 세포주 HLᅳ 60이 들어있는 각 웰에 농도별로 첨가한 후 72시간 동안 37°C, 5%이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 최종 농도는 300, 200, 100， 30, 15， 3, 0.3, 0.03 ng/mL 이 되도록 하였다. 시험물질 투여에 의한 세포의 증식 정도를 알아보기 위해 CellTiter96™ (Pr omega) 용액 15 yL를 각 웰 (well)에 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 이후， solublizat ion/Stop solution ΙΟΟμί를 각 웰에 참가하여 반웅을 정지하였다. ELISA흡광기 (TECAN)를 이용하여 발색된 각 웰의 흡광도를 570 nm 파장에서 측정하여 증가한 세포주의 숫자를 측정하고 분석하였다. 시험물질들의 세포. 증식 활성도는 G— CSF에 동량으로 농도를 환산하여 나타내었다. 一
G-CSF, PEG. G-CSF, G-CSF(T116C)ᅳ G-CSF-Tf, G-CSF(T116C)-Tf의 세포 증식 활성도를 <도 9>에 나타내었다. <도 9>에서 보는 바와 같이， G-CSF T116C)는 천연형 G-CSF에 비하여 세포 증식 활성도가 떨어졌으며， 페길화 G-CSF와 유사한 세포 활성도를 보였다. 그러나, G-CSF 116C) 변이 단백질을 트랜스페린에 융합한 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 G-CSF0116C)에 비하여 세포 증식 활성도가 크게 증대되었으며， 페길화 G-CSF보다 훨씬 세포 증식 활성도가 증대되었다. 따라서， G-CSF(T116C)-Tf는 현재 시판되고 있는 페길화 G-CSF보다 높은 세포 활성도를 가짐으로써， G— CSF가 적용되는 치료에 사용시 약물학적 의미를 갖을 것으로 기대된다.
<실시예 6> 혈액 내 단백질분해효소들에 대한분해 저항성 측정
본 발명의 G-CSF T116C) 변이 단백질의 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성 정도를 측정하기 위하여， 단백질을 인간 혈청 (Serum)과 반웅 후， 정해진 시간에 혈청 내에 잔존하는 G-CSF의 양을 측정하였다.
<6-1> 인간 혈청과 (H^F 단백질과의 반웅
본 발명의 G-CSF 변이 단백질의 안정성이 혈액 내 단백질분해효소에 대한 분해 저항성과 밀접한 관련성이 있는지를 측정하였다. 인간 혈청 (SIGMA)을 56°C에서 약 30분간 불활성화시킨 후 2.8 u g/ml 의 단백질 시료를 24： 1 (v/v)비율로 37°C조건에서 반웅시켰다. 반웅시간 조건은 0， 3， 6 , 9， 12， 15， 18 시간이며， 각 시간대마다 시료에 각각 Complete protease inhibi tor cocktai l (Roche)을 처리한 후 -70°C 에 보관하여 반웅을 종료시켰다.
<6-2>잔존 G"CSF단백질의 양측정
인간 혈청과 반웅시킨 후， 남아있는 G-CSF의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 Sandwi ch EL ISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 통해 수치화하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따론 흡광도의 검량선올 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 G-CSF 단백질 함량을 결정하였다. 토끼 다클론 항 G-CSF항체 (K0MA BIOTECH)가 약 2 p g/ml 농도로 코팅된 High protein binding microt i ter plate (Corning)를 준비하였다. Blocking buffer 는 1 ) Casein sodium sal t 이 포함된 IX 인산완충액을 이용하고， 표준액 및 검액은 Blocking buffer를 10배로 희석시킨 완충액에 섞어 준비한다. 단백질 시료 및 시약은 웰당 100 y 1씩 분주하고，각 단계마다 웰당 300 μ ΐ 의 세척액 (1X PBS; 0.05% Tween-20)를 3회씩 처리하여 반웅하지 않은 시료를 세척하였다. 단백질 시료 및 검출 항체 (토끼 다클론 항 -G-CSF 항체， K0MA BIOTECH)를 차례로 상온에서 약 2시간 처리한 후 Streptavidin-horseradi sh peroxidase (Pierce)를 37°C에서 약 30분간 반웅시켰다. 기질 (ΤΜΒ(3 ,3' , 5, 5' -tetramethylbenzidine) , Pierce)를 처리하고 상은에서 약 7 ~ 10 분간 기다린 후 2 M 황산으로 발색반웅을 종료시켰다. 마이크로플레이트 흡광계 (TECAN)를 이용하여 450 nm의 파장.에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도에 따른 농도환산은 표준액에 대한 단백질 농도-흡광도의 검량선에 기준하여 계산하였다. 표준곡선은 엑셀 프로그램을 이용하여 작성하였다. 각 G-CSF표준액에 해당하는 흡광도의 평균값과 완충액만을 처리한 웰의 흡광도의 차이값을 이용하여 작성하였다. 검액 농도의 결정은 각 시료의 흡광도 수치가 표준액의 검량선 범위 내에 포함될 때에만 유효하며， 상관계수 (R2)을 루트 ( V )로 계산한 절대값 ( | R | )기준은 0.98 이상으로 지정하였다. 잔존 G-CSF단백질 양 (% G-CSF) 은 반웅시간이 0 h일 때의 G-CSF 단백질 농도 (pg/ml ) 를 100% 로 기준하여 표기한다.
G-CSF, G-CSF T116C)의 시간대별 잔존 G-CSF 양 (¾)을 <도 10>에 나타내었다. G-CSF(T116C) 단백질은 천연형 인간 G-CSF보다 15시간 이후부터, 잔존 G-CSF0116C)의 양이 천연형 인간 G-CSF 대비 약 30% 이상 높았다. Cysll6와 Cysl7 간의 이황화 결합 형성이 단백질의 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성 증대에 도움을 주는 것을 알 수 있다.
<실시예 7 G~CSF 변이 단백질들의 생체 내 반감기 측정 본 발명의 G-CSF 변이체 및 이의 트랜스페린 융합 단백질이 생체에 투여되었을 때， 단백질의 생체 반감기를 결정하기 위하여 생쥐에서 단백질을 투여 후 혈청내에 존재하는 G-CSF의 양을 측정하였다. 상기 기술된 "생체 내 반감기 "는 "혈장 내 단백질의 반감기 " 즉， Gᅳ CSF 단백질이 혈장 내에서 순환하면서 초기 농도에서 약 50% 남아있는 시간대를 수치화하여 나타낸다. 약물동역학적 계산은 PKsoiver v2.0을 사용하여 수행하였다.
<7-1> G-CSF 변이 단백질들의 동물 투여 시험
본 발명의 G-CSF 변이 단백질 및 이의 트랜스페린 융합 단백질이 체내에 남아있는 기간을 측정하기 위해 동물실험을 실시하였다.실험동물의 구입,사육， 투여 및 혈액 채취 등의 전 과정을 (주) 큐베스트컨설팅에 의뢰하여 수행하였다. 실험동물은 6 주령의 ICR, 특정병원체 부재동물 (SPF) 수컷 생쥐 (mouse)를 (주)샘타코로부터 구입하여 사용하였다. 최소 6일 간의 순웅기간을 거쳐 검역 및 순화기간 종료일에 개체 별 체중을 측정하였으며， 이때의 체중을 기초로 하여 체중증가 및 일반증상에 이상이 없는 건강한 동물을 선발하여 각 군의 평균 체중이 가능한 한 균등하도록 (동물당 35 - 45 g)무작위로 배치하여 각 시험군당 6마리씩 구성하였다. 시험물질 투여 당일에 투여직전 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산 (5 mL/kg)한 후， 체중 (kg) 당 20 G-CSF변이체 또는 100 g G-CSF 변이체의 트랜스페린 융합 단백질을 1회용 주사기 (lmL, 26G needle)로 취하여 미정맥 ( Intravenous Bolus)에 천천히 주입하였다. 투여일을 시험 1일차 (Day 1)로 정의하였다. 주사 후 0.25， 0.5, 1， 3， 6， 12， 24, 48 및 72시간에서 동물에서 혈액을 안와채혈로써 채취되었다. 채혈 후 혈액은 10, 000 - 13 ,000 rpm에서 1 ~ 2분간 원심 분리하여 혈장을 분리한 후 분리된 혈장을 시험구분 , 동물번호 및 채혈시간이 표시된 1개의 tube에 각각 약 ~ 50 u L/tube 씩 담아 분석일까지 초저온 넁장고 (약 -70°C )에 보관하였다. <7-2> G-CSF변이 단백질들의 마우스 약물동태학
혈장 내 활성 G-CSF의 양은 얼음에서 시료를 해동시킨 후 ELISA를 통해 수치화하였다. ELISA를 통한 혈장 내 G-CSF 의 정량은 Human G-CSF ELISA Ki t , pink-ONE (Koma biotech . )을 구입하여 수행하였으며， 실험방법은 해당 시약의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 표준액에 대한 단백질 농도에 따른 흡광도의 검량선을 작성하여 회귀분석을 통해 검액 중의 G-CSF 변이 단백질들의 함량을 결정하였다.
각 시험 화합물의 평균 농도 -시간 프로파일로부터 비구획 약동학 분석을 PKsolver v2.0프로그램에 IV Bolus non-compartment analys i s input을 적용하여 수행한다. 약동학 파라미터는 말단 반감기 ( t 1/2)를 평가한다. 단백질들의 혈장내 단백질의 반감기를 하기 <도 11>에 나타내었다. <도 11>에서 보는 바와 같이 G-CSF(T116C) 변이 단백질은 천연형 인간 G-CSF와 유사한 혈중 반감기를 보였다. 이는 G-CSF와 유사한 단백질 반경을 갖고 있기 때문에， 신장에서의 여과 속도가 유사함을 보여 주는 결과이다. G-CSF-Tf 단백질은 G-CSF에 비하여 개선된 혈중 반감기를 나타내었다. 이는 G-CSF 단백질에 트랜스페린를 융합함으로서 단백질의 반경이 커짐으로서 신장 여과 속도가 현저히 낮아진 결과이다. G-CSF(T116C) 단백질을 트랜스페린에 융합한 G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 G-CSF-Tf 단백질보다 반감기가 더욱 증대되었으며， 페길화 G-CSF와 유사한 반감기를 보였다. 이는 혈중 단백질분해효소에 대한 저항성이 증대된 G-CSF(T116C) 변이 단백질을 트랜스페린에 융합시킴으로서， 신장 여과 속도의 감소와 혈중 안정성이 모두 개선됨으로서 생체에서의 혈중 반감기가 극대화되어 나타난 결과이다 (도 11) . <실시예 8> G"CSF 변이 단백질들의 백혈구 감소증 렛트에서의 약력학 본 발명의 단백질들의 약동학적 지표를 구하기 위하여 백혈구 감소증 렛트 (Neutropenic Rat ) 질환모델을 이용해 혈액학 분석을 실시하였다. 실험동물의 구입 , 사육, 투여 및 혈액학적 분석 등의 전 과정을 (주) 큐베스트에 의뢰하여 수행하였다. 혈액학적 분석항목은 WBC, NEU, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, Di ffent ial leucocyte count 등을 포함한다.
5주령의 SPF Sprague Daw ley 수컷 랫트 (샘타코)는 최소 5일 간의 순웅기간을 거쳐 무작위적으로 4그룹으로 배당된다. 개체별 체중 범위는 350 - 400 g이다. 시험물질 투여 1일 전에 Cyclophosphamide (90 mg/kg) 를 복강으로 1회 투여하여 백혈구 감소증 (Neutropenic)을 유발한 SD Rat 에게 과립구 콜로니 자극 인자 G-CSF를 미정맥으로 1회 투여한 후 5일간의 혈액학 검사를 실시하였다ᅳ 시험 화합물은 부형제 (Phosphate Buf fered Sal ine)에서 0.004 mg/mL의 최종 농도로 회석한다. 시험물질은 투여 당일 투여직전에 측정한 체중에 근거하여 개체 별 투여액량을 환산 (2 mL/kg)한 후， 1회용 주사기 (l mL, 26G needle)로 취하여 미정맥 ( Intravenous Bolus)에 천천히 주입한다. 투여일을 시험 1일차 (Day 1)로 정의하였다.
투여 전 및 투여 후 6， 12, 24, 48및 72시간에서 1회용 주사기 ( l mL, 26G needle)를 이용하여 경정맥에서 채혈 (약 200 을 실시한다. 채혈 후 즉 시 혈액이 굳지 않도록 항웅고제 (5% sodium EDTA)가 처리된 튜브에 보관하고， 3시간 이내에 넁장상태에서 자동혈액분석기를 이용하여 혈액 내 성분을 분석하였다. 측정 결과는 평균치와 표준편차로 나타내며， 일원배치 등분산분석 (One-way AN0VA) 검정 및 Dunnett 검정을 이용하여 대조군과 각각의 투여군간 차이를 GraphPad Pr i sm을 사용하여 통계적으로 비교하였다. G-CSF-Tf 및 이의 변이 단백질들의 투여 후 시간에 따론 호증구 수치의 변화를 <도 12> 에 나타내었다. <도 12> 에서 시험물질 간의 투여 후 호중구 (Neutrophi l ) 수치를 비교한 결과， 6 , 12시간차에서 G-CSF(T116C)-Tf 투여군이 G-CSF 와 페¾화 G-CSF 투여군보다 더 높은 호중구 절대값을 나타냄을 확인하였다 . G-CSF의 경우 24시간차에 호중구 절대값은 대조군에 비하여 다소 높았으나 유의적 차이는 없던 반면， 페길화 G-CSF와 G-CSF(T116C)-Tf은 Cyclophosphamide 유발 백혈구 감소증 렛트 질환모델에서 투여 후 24 시간까지 백혈구 (Whi te blood cel l , WBC) 및 호증구 (neutrophi l ) 수치를 증가시키는 효과를 관찰하였다. G-CSF(T116C)-Tf 융합 단백질은 트랜스페린올 매개로 생체에서 순환하면서 G-CSF보다 생체 내 활성유지기간이 증대되었고 페길화 G-CSF와 유사함을 보였다. 반면 약동학적 파라미터 (Cmax 및 AUCO-t ) 값이 페길화 G-CSF 보다 높게 측정된 것은 <도 9>에서 보는 바와 같이 페길화 G-CSF 보다 동일 시간 내 더 많은 neutrophi l ic precursor cel l을 증식시킨 결과로 판단된다. (도 12)
【산업상 이용가능성】
본 발명으로 유도된 · 물질은 임상적으로 사용되고 있는 G-CSF의 생물학적 효능을 가지고 있으므로， 허혈성 질환의 치료에 사용되거나， 호중성 과립구 형성 (neutrophi l granulopoiesis)을 자극하여, 암 화학치료 및 방사선 치료로 발생한 호중구 감소증 (neutropenia)에 의한 감염성 합병증 예방을 위한 항암 보조제로 사용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
과립구 콜로니 자극인자 단백질의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 소수성 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질) . 【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 소수성 아미노산은 G-CSF의 17번째 시스테인과 황화 결합을 할 수 있는 아미노산인 변이 단백질.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 G-CSF 변이 단백질은 116번째 트레오닌이 시스테인 (Cysteine)으로 치환된 것인 변이 단백질. 【청구항 4】 .
과립구 콜로니, 자극인자 단백질 (G-CSF) 또는 과립구 콜로니 자극인자 단백질 의 116번째 트레오닌 (Threonine)이 소수성 아미노산으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자 변이 단백질 (G-CSF 변이 단백질)의 말단에， 트랜스페린이 펩타이드 결합된 융합 단백질.
[청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 트랜스페린은 아미노말단 부위의 신호 펩타이드가 제거된 것인 융합 단백질. [청구항 6】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 호중구 감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물. 【청구항 7】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 치료 보조제 . 【청구항 .8】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 9]
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터.
【청구항 10】
제 9항에 있어세 상기 단백질을 암호화 하는 유전자는 유전자 내 제한 효소 인식 부위의 염기서열을 상기 염기서열이 암호화 하는 아미노산과 동일한 아미노산을 암호화 하는 다른 염기서열로 치환한 것인 발현백터.
[청구항 11】
제 9항에 있어서， 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 내의 BamHI 제한 효소 인식 부위 염기서열 (GGATCC)의 타이민 (Thymine)을 사이토신 (Cytosine)으로 치환한 것인 발현백터.
【청구항 12】
제 9항에 있어서， 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 유전자 말단에 제한효소 인식부위를 추가적으로 포함하는 것인 발현백터.
[청구항 13】.
제 9항에 있어서, 상기 발현백터는 도 1, 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 개열지도로 표시되는 백터로부터 제조된 것인 발현백터.
【청구항 14]
제 9항의 발현백터가숙주세포에 도입된 형질전환체 . .
[청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균， 효모, 곰광이， 식물세포, 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 형질전환체.
[청구항 16】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터를 숙주세포에 도입한 형질전환체로부터 상기 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 단백질 제조 방법.
【청구항 17】
제 1항내지 제 5항 증 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 호증구 감소증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소증 예방 또는 치료방법 .
[청구항 18】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 호중구 감소 억제 방법.
【청구항 19】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 허혈성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료방법.
【청구항 20】
호중구 감소증 예방 또는 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체의 용도.
【청구항 21】
항암 보조제로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질올 암호화하는 유전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가숙주세포에 도입된 형질전환체의 용도.
【청구항 22】
허혈성 질환 치료를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 단백질， 상기 단백질을 암호화하는 융전자를 포함하는 발현백터 또는 상기 발현백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체의 용도.
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