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WO2016013557A1 - タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物 - Google Patents

タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物 Download PDF

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WO2016013557A1
WO2016013557A1 PCT/JP2015/070767 JP2015070767W WO2016013557A1 WO 2016013557 A1 WO2016013557 A1 WO 2016013557A1 JP 2015070767 W JP2015070767 W JP 2015070767W WO 2016013557 A1 WO2016013557 A1 WO 2016013557A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tight junction
compound
junction formation
claudin
mlnx1pdz2
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2015/070767
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀一 廣明
剛志 天野
由香子 中倉
翔太 野田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Original Assignee
Nagoya University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Publication of WO2016013557A1 publication Critical patent/WO2016013557A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil

Definitions

  • the present invention relates to a tight junction formation control agent and a pharmaceutical composition containing the control agent, and in particular, a control agent that controls the formation of tight junction by inhibiting the interaction between claudin and LNX1, and the control
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing an agent.
  • Epithelial cells are cells that play a role in separating the outside from the inside, and cell adhesion devices that connect the cells have been developed.
  • the tight junction is present on the outermost side among several cell adhesion devices. Tight junctions are formed by the strong interaction of the membrane protein claudin between epithelial cells, preventing the free permeation of water and ions.
  • the function of such a tight junction is particularly important at the blood-brain barrier that prevents skin moisturization and contamination of foreign matter into the brain. Therefore, substances that control tight junction formation are attracting attention as targets for the development of cosmetics and medical products.
  • a tight junction formation accelerator a tight junction formation accelerator containing a sodium salt and a potassium salt of a compound represented by the following formula (1) is known (see Patent Document 1).
  • the pharmaceutical composition containing the compound represented by following formula (2) is also known (refer patent document 2).
  • L, M and N are a hydrogen atom, hydroxy, halogen atom, lower alkyl, hydroxy (lower) alkyl, lower alkanoyloxy or oxo, wherein at least one of L and M is a group other than hydrogen.
  • a formulation comprising an effective amount of a self-assembling peptide that achieves them when administered at a site, wherein the self-assembling peptide is a sequence of positively charged residues within the same peptide chain And a sequence of negatively charged residues; one or more of a series of positively charged residues and one or more of a series of negatively charged residues; and a combination selected from the group consisting of The thing is also known (refer patent document 3).
  • claudins By the way, various types of claudins are known, and their expression is specific in cells and tissues. Since the specificity causes a difference in the permeability of water and ions, the expression of specific claudin and the formation of tight junction are extremely important in the expression of tissue-specific functions.
  • Patent Documents 1 and 2 increase claudin expression by administration of a compound that activates claudin expression, and as a result, promote the formation of tight junctions. It is not a technique to control tissue-specific / cell-specific claudin expression.
  • the invention described in Patent Document 3 is a technique related to a peptide that forcibly connects damaged cells and is useful in an emergency such as an injury or a surgical operation, but does not control tight junction formation. .
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned conventional problems, and as a result of extensive research, (a) the following formulas (13), (14), (30), (33-3), (3-3), (3-3), (3-3), The compound shown in 34-9) interacts with LNX1, which is a protein that eliminates tight junction by incorporating claudin into cells, and (b) as a result of the interaction, the interaction between LNX1 and claudin
  • LNX1 is a protein that eliminates tight junction by incorporating claudin into cells
  • the present invention was completed by newly finding that the action was inhibited and claudin was not taken up into cells and the tight junction was maintained.
  • an object of the present invention is to provide a tight junction formation control agent and a pharmaceutical composition containing the control agent.
  • the present invention relates to a tight junction formation control agent and a pharmaceutical composition containing the control agent shown below.
  • a tight junction formation control agent comprising at least one compound represented by the following formulas (13), (14), (30), (33-3) and (34-9).
  • the tight junction formation control agent according to (1) wherein the compound is a compound represented by the formula (13) or (14).
  • a pharmaceutical composition comprising the tight junction formation control agent according to any one of (1) to (3) above.
  • the tight junction formation control agent of the present invention inhibits the interaction between LNX1 and claudin by specifically reacting with LNX1, and as a result, the uptake of claudin into cells is inhibited.
  • the tight junction formation state can be controlled. Therefore, it is clear at which stage of the tight junction formation mechanism the control is possible, so that it can be applied to pharmaceuticals, cosmetics and the like.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an outline of a cell adhesion device.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining an outline of control of tight junction formation according to the present invention.
  • FIG. 3 shows the structure of LNX1.
  • FIG. 4 shows the results of 1 H- 15 N HSQC spectra of Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the magnitude of signal change of each residue obtained from Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 6 shows a ribbon model of the structure of mLNX1PDZ2.
  • FIG. 7 shows the results of 1 H- 15 N HSQC spectra of Example 2 and Comparative Example 1.
  • FIG. 8 is a graph showing the magnitude of signal change of each residue obtained from Example 2 and Comparative Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an outline of a cell adhesion device.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining an outline of control of tight junction formation according to the present invention.
  • FIG. 3 shows the structure of LNX1.
  • FIG. 9 shows a ribbon model of the structure of mLNX1PDZ2.
  • FIG. 10 is a photograph substituted for a drawing, (1) is a photograph obtained by [Western blotting] in Example 3, and (2) is a photograph obtained by [immunostaining] without adding a compound.
  • FIG. 11 is a drawing-substituting photograph, (1) is a photograph of immunostaining obtained in Example 3, (2) is a photograph of immunostaining obtained in Example 4, and (3) is obtained in Example 5.
  • (4) is a photograph of the immunostaining obtained in Example 6, (5) is a photograph of the immunostaining obtained in Example 7, and (6) is obtained in Comparative Example 14. It is a photograph of immunostaining.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining an outline of a cell adhesion apparatus.
  • Epithelial cells form a sheet that adheres to neighboring cells to separate the internal and external environments.
  • cell adhesion devices that exist on the cell membrane are important. Playing a role.
  • TJ tight junction
  • AJ adhesive junction
  • desmosome desmosome
  • gap junction from the apical surface to the basal plane.
  • Each cell adhesion device has a different function, and the tight junction functions so that adjacent cells in the epithelial layer are brought into close contact with each other so that molecules do not leak between the cells.
  • AJ connects actin bundles of adjacent cells, and desmosome connects intermediate filaments of adjacent cells, both of which are involved in the binding of epithelial cells.
  • Gap junctions form an intercellular channel and have the function of allowing inorganic ions and water-soluble small molecules to pass through.
  • Tight junctions have a barrier function that selectively controls the size and charge of substances that pass between cells, as well as a fence function that prevents the diffusion of proteins and lipids on the cell membrane and maintains cell polarity. . Therefore, tight junction dysfunction is thought to cause various diseases such as inflammatory bowel disease (IBD), infection, cancer, angioedema, and hematogenous metastasis. Therefore, it can be applied to medical treatment.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • cancer cancer
  • angioedema angioedema
  • hematogenous metastasis hematogenous metastasis
  • FIG. 2 is a diagram for explaining an outline of control of tight junction formation according to the present invention.
  • the main component of tight junction is the quadruple transmembrane protein claudin (CLD).
  • Claudin is a complex with ZO-1, which is a membrane-lined protein, but in the living body both Ligand of Number binding protein X-1 (LNX1) and ZO-1 are proteins that eliminate claudin. It is expressed (FIG. 2 (1)).
  • LNX1 Ligand of Number binding protein X-1
  • ZO-1 Ligand of Number binding protein X-1
  • FIG. 2 (2) When the expression of ZO-1 is superior to that of LNX1, claudin that forms a complex with ZO-1 is larger than claudin that disappears, so that a tight junction is formed (FIG. 2 (2)). .
  • the tight junction formation controlling agent of the present invention controls tight junction formation by inhibiting the interaction between LNX1 and claudin by using a low molecular compound that specifically binds to the cladin recognition site of LNX1.
  • the low molecular weight compound contained in the tight junction formation control agent of the present invention uses a silico screening method to create a candidate list of compounds that inhibit the interaction between LNX1 and claudin by binding to LNX1, and each candidate compound It is obtained by confirming the usefulness of.
  • the candidate list of compounds (1) identifies the region of LNX1 that interacts with claudin, (2) for the region identified in (1) above, determines the steric structure of a single unit by X-ray crystal structure analysis, (3)
  • the interaction surface of the region interacting with the claudin-derived peptide is identified by solution NMR, and (4) a candidate for a low molecular compound (candidate for inhibitor) that can bind to the identified interaction surface, It can be created by searching using known docking software such as DOCK, AutoDock, GOLD, and FlexX.
  • the usefulness of each candidate compound may be confirmed by a known utility confirmation experiment such as NMR, in vitro, or animal experiment.
  • FIG. 3 shows the structure of LNX1.
  • LNX1 is known as a protein that interacts with the protein Numb involved in cell fate determination and endocytosis.
  • LNX1 has two splicing variants, p70 (molecular weight about 70 kDa) and p80 (molecular weight about 80 kDa), and has a Numb binding region NPAY motif as a common structure and four PDZ domains that function as a protein-protein interaction module. .
  • p70 moleukin
  • p80 molecular weight about 80 kDa
  • LNX1p80 and LNX1p70 are also known to bind to claudin, low molecular weight compounds that bind to other domains You may search.
  • the amino acid sequences of LNX1p80 and LNX1p70 are known and can be obtained from UniProt (O70263) and the like.
  • the tight junction formation control agent of the present invention can be used for any of pharmaceutical compositions, quasi-drugs, cosmetics or foods.
  • the dosage form include powders, pills, tablets, injections, suppositories.
  • the tight junction formation control agent of this invention can also be used as a pharmaceutical composition combined with well-known pharmaceuticals, such as an anti-inflammatory agent, an intestinal regulating agent, an antibacterial agent, and antibiotics.
  • an anti-inflammatory agent such as O157
  • E. coli can be killed while suppressing absorption of the produced toxin by strengthening the tight junction.
  • oil component examples include liquid paraffin, petrolatum, microcrystalline wax, squalane, jojoba oil, beeswax, carnauba wax, lanolin, olive oil, coconut oil, higher alcohol, fatty acid, ester of higher alcohol and fatty acid, silicone oil, and the like.
  • emulsifier examples include nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, and polyoxyethylene hydrogenated castor oil.
  • anionic surfactants such as sodium stearoyl lactate, amphoteric surfactants such as soybean phospholipid, and cationic surfactants such as alkyltrimethylammonium chloride.
  • the humectant include glycerin, sorbitol, xylitol, maltitol, propylene glycol, polyethylene glycol, 1,3-butylene glycol and the like.
  • the thickening agent include clay minerals such as carboxyvinyl polymer, xanthan gum, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, gelatin, and bentonite.
  • medicinal ingredients include various vitamins and derivatives thereof, allantoin, glycyrrhizic acid and derivatives thereof, and various animal and plant extracts.
  • the amount of the compound blended in the tight junction formation control agent of the present invention varies depending on the dosage form and the degree of expected effect, but is usually 0.001% by mass or more, preferably about 0.1 to 50% by mass. It is good. If it is less than 0.001% by mass, it is difficult to obtain a sufficient effect, and if it exceeds 50%, an increase in the effect is hardly recognized and it is uneconomical. Moreover, you may use a compound individually or in combination.
  • the ligand file (MOL2 file) was obtained from .ac.jp / ligandbox /).
  • the molecular viewer Hermes attached to the protein-ligand docking software GOLD Suite was launched, GOLD Wizard was selected, the PDB file of the target protein was opened with the Load Protein button, and then the operation was performed according to the manual.
  • the compound to be docked with mLNX1PDZ2 was searched from about 240,000 ZINC-derived compounds randomly extracted from the obtained ligand file and about 240,000 compounds derived from LigandBox.
  • the candidate compound list is described below.
  • Formulas (4) to (32), Formulas (33-1) to (33-11), Formulas (34-1) to (34-14), Formulas (35-1) to (35-2), Compounds represented by the formulas (36-1) to (36-2) can be purchased from Namiki Shoji Co., Ltd.
  • PGEX-6P3-P plasmid prepared from pGEX-6P-3 plasmid purchased from GE Healthcare (Takeshi Amano et al., “Method for constructing high-efficiency and high-speed fusion protein expression vector”, 2006, Experimental Medicine. 24, 1675- 1680), a DNA fragment coding for mLNX1PDZ2 (amino acid number 381-467 of the amino acid sequence obtained from UniProt ID: O70263) (ENA ID linked to UniProt: base number 1338-1598 of AF03745.1) Connected.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the cells were collected by centrifugation (4000 rpm, 15 min, 4 ° C.) using a Beckman Coulter (J6-M1 Centrifuge).
  • a disruption buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.0, about 10 ml per 1 g was added to the cells, suspended, and ultrasonically disrupted with a Bioruptor (on time 30 sec / off time 30 sec, total 10 min ⁇ 4 times). After crushing, the mixture was centrifuged (18000 rpm, 20 min, 4 ° C.) with Hitachi High-Speed Refrigerated Centrifuges (Himac CR22G), and the supernatant was collected.
  • Himac CR22G Hitachi High-Speed Refrigerated Centrifuges
  • the supernatant was passed through a DEAE column (GE Healthcare) and a GST-accept column (nacalai test) to adsorb the GST fusion protein to the resin.
  • 200 ⁇ l of PreScience protease was added onto the column and incubated at 4 ° C. overnight to cleave the GST tag.
  • the target protein was eluted with PreScission cleavage buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.0).
  • the obtained protein solution was concentrated by centrifugation (ROTANTA 460R) using Microsep 1K Centrifugal Devices (PALL), and gel filtration (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7 using AKTAprime plus (GE Healthcare). Went. After dialyzing and concentrating by freeze-drying, it was dialyzed against NMR buffer (20 mM MOPS, 150 mM NaCl, 50 mM MgSO 4 , pH 6.8) to obtain a 15 N-mLNX1PDZ2 sample.
  • NMR buffer (20 mM MOPS, 150 mM NaCl, 50 mM MgSO 4 , pH 6.8
  • HNCA / HN (CO) CA and HN (CA) CO / HNCO spectra were similarly stripped to confirm the assignment. Moreover, the attribution was confirmed using automatic attribution software MARS 1.2. NMR measurement was performed using a Bruker Avance III 600 MHz digital NMR apparatus. Furthermore, when 14 N amino acid was added during expression of mLNX1PDZ2 in 15 N-labeled medium, the assignment was confirmed using the inverse label method based on the phenomenon that the NMR signal of the amino acid residue disappeared. Was confirmed to be almost accurate.
  • FIG. 4 shows the results of 1 H- 15 N HSQC spectra of Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the magnitude of signal change of each residue obtained from Example 1 and Comparative Example 1. Residues whose signal changed by 0.015 ppm or more were identified from the graph.
  • a ribbon model prepared based on the crystal structure of mLNX1PDZ2 determined by a known X-ray crystallographic analysis was colored according to the magnitude of the signal change for residues whose signal changed 0.015 ppm or more.
  • FIG. 6 shows a ribbon model of colored mLNX1PDZ2.
  • Example 2 Spectral analysis was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound of formula (14) (final concentration 1.0 mM, DMSO final concentration 5%) was added instead of the compound of formula (13).
  • FIG. 7 shows the results of 1 H- 15 N HSQC spectra of Example 2 and Comparative Example 1.
  • the compound represented by formula (14) was expressed as mLNX1PDZ2. It was confirmed that they were combined.
  • FIG. 8 is a graph showing the magnitude of signal change of each residue obtained from Example 2 and Comparative Example 1. Residues whose signal changed by 0.04 ppm or more were identified from the graph.
  • the ribbon model of mLNX1PDZ2 was colored according to the magnitude of the signal change.
  • FIG. 9 shows a colored mLNX1PDZ2 ribbon model. Moreover, the position of the ligand recognition site of mLNX1PDZ2 and the residue where the signal was changed were almost the same. From the above results, it was confirmed that the compound represented by the formula (14) was bound to the ligand recognition site of mLNX1PDZ2.
  • Comparative Examples 2 to 13 The spectrum of Comparative Example 1 was analyzed in the same manner as in Example 1 except that the compounds represented by Formulas (4) to (12) and Formulas (15) to (17) were used instead of the compound represented by Formula (13). Contrast with. However, no signal change was observed in any compound.
  • anthranilic acid which is a structure common to formulas (13) and (14), is important for binding to mLNX1PDZ2.
  • the present inventors have previously verified the interaction between a PDZ domain and a low molecular weight compound by NMR titration experiments.
  • DIF diclofenac
  • FLF fluenamic acid
  • FUA fusic acid
  • These compounds include a benzoic acid or phenylacetic acid skeleton as a partial structure. Furthermore, several low molecular weight compounds that inhibit PDZ domain interaction have been reported so far, but most of these compounds contain a benzoic acid skeleton (for example, Fujii, N., et al. ., “Rational design of a nonpeptide general chemical scaffold for reverseable inhibition of PDZ domain interactions”, 2013, Bio .. Med. These results suggest that the benzoic acid skeleton is important for binding to the PDZ domain, and that the anthranilic acid skeleton is important for binding to LNX1PDZ2.
  • the compound preferably has a molecular weight of 1000 or less in view of the three-dimensional structure of LNX1PDZ2. Further, in order to verify the binding with the PDZ domain, the compound is preferably water-soluble, and is preferably CLog P3.5 or less.
  • PBS was sucked out with a P-1000 pipetteman, and 1 ml of PBS was newly added and washed ( ⁇ 2 times).
  • a cover glass was placed on 100 ⁇ l of the secondary antibody solution diluted with skim milk solution so that the fixed cell surface faced down, and incubated at room temperature for 1 h.
  • 1 ml of PBS was added to a 6-well dish, and a cover glass was placed in it to wash it.
  • PBS was sucked out with a P-1000 pipetteman, and 1 ml of PBS was newly added and washed ( ⁇ 2 times). 10 ⁇ l of the mounting medium was dropped on a slide glass, and a cover glass was placed thereon.
  • the sample was shielded from light and examined the following day using a microscope IX71 from OLYMPUS. The exposure time was fixed and photographed (1/5 sec).
  • Rabbit anti-Claudin-2 antibody (51-6100, invitrogen) diluted 250-fold with skim milk solution and Rabbit anti-LNX1 antibody (AV473367, Sigma-Aldrich) with skim milk solution 100 were used. Those diluted twice were used.
  • Secondary antibodies include Anti-Rabbit IgG (whole molecule), F (ab ′) 2 fragment-Cy3 antibody (C2306, Sigma-Aldrich) diluted 500-fold with skim milk solution, and Anti-Rabbit IgG. (Whole Molecule), F (ab ′) 2 fragment-FITC antibody (F1262, Sigma-Aldrich) diluted 200-fold with a skim milk solution was used.
  • the PVDF membrane (AE-6668, ATTO) was immersed in 100% methanol for about 20 seconds, and then allowed to penetrate into the B liquid for 30 minutes or more.
  • the filter paper (CB-06A, ATTO) is liquid A (tris (hydroxymethyl) aminomethane 1.82 g, methanol 2.5 ml, MilliQ, total 50 ml), one liquid B, one liquid C, 6-aminocapric acid 0. 3 pieces were immersed in 26 g, tris (hydroxymethyl) aminomethane 0.15 g, methanol 2.5 ml, MilliQ, total 50 ml).
  • the cathode was set and energized to transfer the protein to the PVDF membrane.
  • the PVDF membrane was immersed in a blocking agent (5% skim milk, 0.1% Tween 20 in PBS) and shaken for 1 h at room temperature.
  • the PVDF membrane was immersed in a primary antibody solution diluted with a blocking agent and incubated at 4 ° C. overnight.
  • the PDVF membrane was immersed in a wash buffer (1 ⁇ TBS, 0.1% Tween 20), washed by shaking for 5 min ( ⁇ 4 times), then immersed in a secondary antibody solution diluted with a blocking agent, and incubated at room temperature for 1 h. .
  • the PDVF membrane was immersed in a wash buffer and washed by shaking for 5 min ( ⁇ 4 times).
  • a Chemi-Lumi One Super (Nacalai tesque) was applied on the PDVF membrane, incubated, and detected with LAS-3000mini.
  • the primary antibody used was Rabbit anti-LNX1 antibody (AV473367, Sigma-Aldrich) diluted 1000 times with a blocking agent.
  • the secondary antibody used was Anti-Rabbit IgG HRP (W401B, Promega) diluted 10,000 times with a blocking agent.
  • FIG. 10 (1) is a photograph obtained by the above [Western blotting].
  • FIG. 10 (2) is a photograph immunostained in the same manner as in [Immunostaining] except that the compound was not added and the culture was not performed for 48 hours after the addition.
  • FIG. 11 (1) is a photograph of immunostaining obtained in Example 3.
  • Examples 4 to 7 In place of the compound represented by formula (13), formula (14) as Example 4, formula (30) as Example 5, formula (33-3) as Example 6, formula (34-9) as Example 7 The immunostaining was performed in the same manner as in Example 3 except that the compound represented by) was used.
  • 11 (2) is a photograph of Example 4
  • FIG. 11 (3) is a photograph of Example 5
  • FIG. 11 (4) is a photograph of Example 6,
  • FIG. 11 (5) is a photograph of the immunostaining obtained in Example 7.
  • FIG. 11 (6) is a photograph of immunostaining obtained in Comparative Example 14.
  • amino acid sequence located on the surface of the human, mouse, and dog LNX1PDZ2 domain claudin interacting was examined.
  • the amino acid sequences examined are all the following parts obtained from UniProt. ⁇ Human> ID: Q8TBB1 amino acid number 377-463 (87 sequences) ⁇ Mouse> ID: O70263 amino acid number 381-467 (87 sequences) ⁇ Canine> ID: E2RBE8 amino acid number 381-467 (87 sequences)
  • the homology of the amino acid sequences of the human, mouse and dog LNX1PDZ2 domains (above 87 sequence) was as high as 95% for humans and mice, 94% for humans and dogs, and 94% for mice and dogs.
  • the compounds represented by the formulas (13), (14), (30), (33-3) and (34-9) of the present invention react specifically with LNX1, whereby LNX1 and claudin are
  • the tight junction formation state can be controlled by inhibiting the interaction and, as a result, inhibiting the incorporation of claudin into cells. Therefore, it is clear at which stage of the tight junction formation mechanism the control is possible, so that it can be applied to pharmaceuticals, cosmetics and the like.

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Abstract

　タイトジャンクション形成メカニズムのどの段階の制御であるのか明らかなタイトジャンクション形成制御剤を提供する。　下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）及び（３４－９）で表される化合物を少なくとも一種含むタイトジャンクション形成制御剤。

Description

タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物
　本発明は、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関するもので、特に、クローディンとＬＮＸ１との相互作用を阻害することで、タイトジャンクションの形成を制御する制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関するものである。
　体内の恒常性を維持するためには、水分、糖分、イオンなどを体内に封じ込めることが重要である。上皮細胞は外界と内部を隔てる役割を担っている細胞であり、細胞同士をつなぐ細胞接着装置が発達している。いくつか存在する細胞接着装置のうち最も外側に存在するのがタイトジャンクションである。タイトジャンクションは上皮細胞間で膜タンパク質クローディンが強固に相互作用することで形成されており、水やイオンの自由な透過を妨げている。このようなタイトジャンクションの機能は、皮膚の保湿や、脳内への異物混入を防いでいる血液脳関門において特に重要である。したがって、タイトジャンクション形成を制御する物質は、化粧品や医療品開発のターゲットとして注目を浴びている。
　タイトジャンクション形成の促進剤としては、下記式（１）で表わされる化合物のナトリウム塩及びカリウム塩を配合したタイトジャンクション形成促進剤が知られている（特許文献１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、下記式（２）で表わされる化合物を含む医薬組成物も知られている（特許文献２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
［式中、Ｌ、ＭおよびＮは、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン原子、低級アルキル、ヒドロキシ(低級)アルキル、低級アルカノイルオキシまたはオキソであり、ここでＬおよびＭの少なくとも１つは水素以外の基であり、５員環は少なくとも１つの二重結合を有していてもよく；Ａは、－ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＯＨまたはそれらの官能性誘導体であり；Ｂは、単結合、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ２－または－ＣＨ２－Ｃ≡Ｃ－であり；Ｚは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 または単結合であり、
　ここでＲ４およびＲ５は、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシまたはヒドロキシ(低級)アルキルであり、Ｒ４およびＲ５が同時にヒドロキシおよび低級アルコキシであることはなく；
　Ｒ１は、非置換、またはハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、オキソ、アリールまたは複素環基により置換された、二価の飽和または不飽和の低または中級の脂肪族炭化水素残基であり、脂肪族炭化水素中の少なくとも１つの炭素原子は所望により酸素、窒素または硫黄により置換されており；そして
　Ｒａは、非置換、またはハロゲン、オキソ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、シクロ(低級)アルキル、シクロ(低級)アルキルオキシ、アリール、アリールオキシ、複素環基または複素環オキシ基により置換された、飽和または不飽和の低または中級の脂肪族炭化水素残基；低級アルコキシ；低級アルカノイルオキシ；シクロ(低級)アルキル；シクロ(低級)アルキルオキシ；アリール；アリールオキシ；複素環基；複素環オキシ基である］。
　更に、漏出性または損傷を受けたタイトジャンクションの処置および細胞外マトリクスの増強をするため、体液の移動を予防もしくは制限するか、組織もしくは細胞を安定化するか、または汚染を予防することが必要な部位に投与されたときに、それらを達成する、有効量の自己組織化ペプチドを含む処方物であって、該自己組織化ペプチドは、同じペプチド鎖内の、正に帯電した残基の配列および負に帯電した残基の配列；正に帯電した残基の一続きの１つ以上および負に帯電した残基の一続きの１つ以上；およびそれらの組み合わせからなる群から選択される処方物、も知られている（特許文献３参照）。
　ところで、クローディンは様々な種類が知られており、その発現は細胞・組織において特異性がある。その特異性は、水やイオンの透過性において差をもたらしているため、特異的なクローディンの発現、タイトジャンクションの形成は組織特異的な機能発現においてきわめて重要である。
特許第４６８４９０６号公報 国際公開第２０１０／１３７７３１号 国際公開第２００８／１１３０３０号
　しかしながら、上記特許文献１及び２に記載されている発明は、クローディンの発現を活性化する化合物の投与によりクローディンの発現量が増加し、その結果、タイトジャンクションの形成を促しているが、組織特異的・細胞特異的なクローディンの発現を制御する技術ではない。また、上記特許文献３に記載されている発明は、損傷を受けた細胞間を強制的に結びつけるペプチドに関する技術で、負傷や外科手術等の緊急時には役立つものの、タイトジャンクション形成を制御するものではない。
　更に、細胞間の接着は、クローディンとその裏打ちタンパク質ＺＯ－１／２が相互作用することで自動的に行われるが、上記特許文献１～３に記載されている発明は、単に現象を確認しているに過ぎず、細胞のどの位置にクローディンが形成されるのか等の具体的なメカニズムに基づいた技術ではないため、医療応用性に限界があるという問題がある。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（ａ）下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）、（３４－９）に示す化合物は、クローディンを細胞内へ取り込ませることでタイトジャンクションを消失させるタンパク質であるＬＮＸ１と相互作用すること、（ｂ）前記相互作用の結果、ＬＮＸ１とクローディンとの相互作用が阻害され、クローディンは細胞内へ取り込まれなくなりタイトジャンクションは維持され続けること、を新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物を提供することである。
　本発明は、以下に示す、タイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物に関する。
（１）下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）及び（３４－９）で表される化合物を少なくとも一種含むタイトジャンクション形成制御剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （２）前記化合物が、式（１３）又は（１４）で表される化合物である上記（１）に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
（３）前記化合物がクローディンの細胞内への取り込みを防ぐことでタイトジャンクションの形成を制御する上記（１）又は（２）に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
（４）上記（１）～（３）の何れか一に記載のタイトジャンクション形成制御剤を含む医薬組成物。
　本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、ＬＮＸ１に特異的に反応することでＬＮＸ１とクローディンとが相互作用することを阻害し、その結果、クローディンの細胞内への取り込みが阻害されることでタイトジャンクション形成状態を制御することができる。したがって、タイトジャンクション形成メカニズムのどの段階での制御であるのか明らかであることから、医薬品、化粧品等への応用が可能である。
図１は、細胞接着装置の概要を説明する図である。 図２は、本発明のタイトジャンクション形成の制御概要を説明する図である。 図３は、ＬＮＸ１の構造を示している。 図４は、実施例１及び比較例１の1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。 図５は、実施例１及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフである。 図６は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の構造のリボンモデルを示す。 図７は、実施例２及び比較例１の1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。 図８は、実施例２及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフである。 図９は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の構造のリボンモデルを示す。 図１０は、図面代用写真で、（１）は実施例３の〔Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ〕により得られた写真、（２）は化合物を添加しなかった〔免疫染色〕により得られた写真である。 図１１は、図面代用写真で、（１）は実施例３で得られた免疫染色の写真、（２）は実施例４で得られた免疫染色の写真、（３）は実施例５で得られた免疫染色の写真、（４）は実施例６で得られた免疫染色の写真、（５）は実施例７で得られた免疫染色の写真、（６）は比較例１４で得られた免疫染色の写真である。
　以下に、本発明のタイトジャンクション形成制御剤及び該制御剤を含む医薬組成物について詳しく説明する。
　図１は、細胞接着装置の概要を説明する図である。上皮細胞は、隣り合う細胞と相互に接着したシートを形成することで、体の内部と外界の環境が分けられているが、細胞間の接着には、細胞膜に存在する細胞接着装置が重要な役割を果たしている。脊椎動物の上皮には、頂端面から基底面に向かって密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ；ＴＪ）、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ；　ＡＪ）、デスモソーム、ギャップ結合と呼ばれる細胞接着装置が存在する。それぞれの細胞接着装置は機能が異なっており、タイトジャンクションは上皮層の隣接する細胞同士を密着させ、分子が細胞の間から漏れないように機能している。ＡＪは隣接する細胞のアクチンの束同士、デスモソームは隣接する細胞の中間径フィラメント同士をつなぎ、どちらも上皮細胞同士の結合に関与している。ギャップ結合は細胞間チャネルを形成し、無機イオンや水溶性小分子を通過させる機能を担っている。
　このうち、最も頂端面に位置するタイトジャンクションは、空間の区画化や恒常性の維持に重要な役割を果たしている。タイトジャンクションは細胞間を通過する物質を大きさや電荷選択的に制御するバリア機能を担っている他、細胞膜上に存在するタンパク質や脂質の拡散を防ぎ、細胞極性を維持するフェンス機能を担っている。このため、タイトジャンクションの機能障害は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）や感染症、がん、血管性浮腫、血行性転移等の様々な疾病を引き起こすと考えられ、タイトジャンクション形成を適切に制御することで、医療に応用することができる。
　図２は、本発明のタイトジャンクション形成の制御概要を説明する図である。タイトジャンクションの主要構成因子は４回膜貫通型タンパク質クローディン（ＣＬＤ）である。クローディンは膜裏打ちタンパク質であるＺＯ－１との複合体であるが、生体中では、クローディンを消失させるタンパク質であるＬｉｇａｎｄ　ｏｆ　Ｎｕｍｂ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｘ－１（ＬＮＸ１）、及びＺＯ－１の両方が発現している（図２（１））。そして、ＬＮＸ１よりＺＯ－１の発現が優位になると、消滅するクローディンよりＺＯ－１と複合体を形成するクローディンの方が多くなるため、タイトジャンクションが形成される（図２（２））。逆に、ＺＯ－１よりＬＮＸ１の発現が優位になると、ＺＯ－１と複合体を形成するクローディンより消滅するクローディンの方が多くなるため、タイトジャンクションは消滅する（図２（３））。本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、ＬＮＸ１のクローディン認識部位に特異的に結合する低分子化合物を用いることでＬＮＸ１とクローディンの相互作用を阻害し、タイトジャンクション形成を制御するものである。
　本発明のタイトジャンクション形成制御剤に含まれる低分子化合物は、ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏスクリーニング法を用い、ＬＮＸ１に結合することでＬＮＸ１とクローディンの相互作用を阻害する化合物の候補リストを作成し、各候補化合物の有用性について確認をすることで得られる。化合物の候補リストは、（１）クローディンと相互作用するＬＮＸ１の領域を同定し、（２）上記（１）で同定した領域について、単体の立体構造をＸ線結晶構造解析にて決定し、（３）クローディン由来ペプチドと相互作用する領域の相互作用面を溶液ＮＭＲ法にて同定し、（４）同定した相互作用面に結合しうる低分子化合物の候補（阻害物質の候補）について、ＤＯＣＫ、ＡｕｔｏＤｏｃｋ、ＧＯＬＤ、ＦｌｅｘＸ等の公知のドッキングソフトウェアを用いて探索する、ことで作成することができる。また、各候補化合物の有用性は、ＮＭＲ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、動物実験等、公知の有用性確認実験により確認をすればよい。
　図３は、ＬＮＸ１の構造を示している。ＬＮＸ１は、細胞運命決定とエンドサイトーシスに関わるタンパク質Ｎｕｍｂと相互作用するタンパク質として知られている。ＬＮＸ１は２つのスプライシング変異体ｐ７０（分子量約７０ｋＤａ）とｐ８０（分子量約８０ｋＤａ）が存在し、共通の構造としてＮｕｍｂ結合領域ＮＰＡＹモチーフと、タンパク質－タンパク質相互作用モジュールとして機能するＰＤＺドメインを４つ有する。また、ＬＮＸ１ｐ８０のみＮ末端側にＲＩＮＧフィンガードメインを持ち、Ｅ３活性を有している。本発明においては、ＬＮＸ１ｐ８０のＰＤＺ２ドメインに結合する化合物を探索したが、ＬＮＸ１ｐ８０及びＬＮＸ１ｐ７０の他のドメインもクローディンと結合することが知られていることから、他のドメインに結合する低分子化合物を探索してもよい。ＬＮＸ１ｐ８０及びＬＮＸ１ｐ７０のアミノ酸配列は公知であり、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｏ７０２６３）等から入手することができる。
　本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、医薬組成物、医薬部外品、化粧品または食品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、座剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、錠菓、飲料等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の化粧品、医薬部外品、医薬組成物等に用いられる各種成分、例えば油性成分、乳化剤、保湿剤、増粘剤、薬効成分、防腐剤、顔料、粉体、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料等を適宜配合することができる。更に、本発明のタイトジャンクション形成制御剤は、抗炎症剤、整腸剤、抗菌剤、抗生物質等の公知の医薬品と組み合わせた医薬組成物として用いることもできる。例えば、Ｏ１５７等の毒素を産出する大腸菌の抗菌剤にタイトジャンクション形成制御剤を添加すると、タイトジャンクションを強化することで産出した毒素の吸収を抑えながら、大腸菌を死滅させることができる。
　油性成分としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ホホバ油、ミツロウ、カルナウバロウ、ラノリン、オリーブ油、ヤシ油、高級アルコール、脂肪酸、高級アルコールと脂肪酸のエステル、シリコーン油等が挙げられる。乳化剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤、ステアロイル乳酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤、大豆リン脂質等の両性界面活性剤、塩化アルキルトリメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤が挙げられる。保湿剤としては、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３－ブチレングリコールなどが挙げられる。増粘剤としては、例えばカルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ベントナイト等の粘土鉱物等が挙げられる。薬効成分としては、例えば各種ビタミンおよびその誘導体、アラントイン、グリチルリチン酸およびその誘導体、各種動植物抽出物等が挙げられる。
　本発明のタイトジャンクション形成制御剤中に配合される化合物の量は、剤型や期待する効果の程度により異なるが、通常０．００１質量％以上、好ましくは０．１～５０質量％程度配合するのがよい。０．００１質量％未満では十分な効果が得られにくく、５０％を超えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。また、化合物は単独又は組み合わせて用いてもよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
［候補化合物リストの作成］
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からｍＬＮＸ１ｐ８０のＰＤＺ２ドメインのＰＤＢファイル（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＶＱＦ）、化合物のデータベースＺＩＮＣ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ）およびＬｉｇａｎｄＢｏｘ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｌｉｇａｎｄｂｏｘ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｓａｋａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｌｉｇａｎｄｂｏｘ／）からリガンドファイル（ＭＯＬ２ファイル）を入手した。タンパク質－リガンド・ドッキングソフトウェアＧＯＬＤ　Ｓｕｉｔｅに付属する分子ビューワーＨｅｒｍｅｓを立ち上げ、ＧＯＬＤのＷｉｚａｒｄを選択し、Ｌｏａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎボタンで目的タンパク質のＰＤＢファイルを開き、その後は、マニュアルにしたがって、操作をした。なお、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２とドッキングする化合物の検索は、入手したリガンドファイルからランダムに抽出したＺＩＮＣ由来の化合物約２４万件、およびＬｉｇａｎｄＢｏｘ由来の化合物約２４万件から行った。以下に、候補化合物リストを記載する。なお、式（４）～（３２）、式（３３－１）～（３３－１１）、式（３４－１）～（３４－１４）、式（３５－１）～（３５－２）、式（３６－１）～（３６－２）で表す化合物はナミキ商事株式会社から購入することができる。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［15Ｎ標識したマウス（ｍ）ＬＮＸ１ＰＤＺ２の培養・精製］
　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入したｐＧＥＸ－６Ｐ－３プラスミドから作製したｐＧＥＸ－６Ｐ３－Ｐプラスミド（天野剛志　他，“高効率かつ高速な融合タンパク質発現ベクターの構築法”、２００６、実験医学．　２４、１６７５－１６８０参照）に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２（ＵｎｉＰｒｏｔ　ＩＤ：Ｏ７０２６３から入手したアミノ酸配列のアミノ酸番号３８１－４６７）をコードしているＤＮＡ断片（ＵｎｉＰｒｏｔからリンクされているＥＮＡ　ＩＤ：ＡＦ０３７４５．１の塩基番号１３３８－１５９８）を接続した。さらに紫外線吸収向上のため、上記ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２断片の１２塩基上流にチロシン残基を挿入するための３塩基（配列：ＴＡＴ）を点変異により組み込んだｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現プラスミド（ｐＧＥＸ－６Ｐ３－Ｐ　ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２＋Ｙ１）を作製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、15Ｎ標識したＭ９培地（１Ｌ：Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ　１７．９１ｇ，　ＫＨ2ＰＯ4　２．９９ｇ、　ＮａＣｌ　０．５ｇ、　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　２０ｍｇ、　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　２０ｍｇ、　ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　２０ｍｇ、　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　２０ｍｇ、　ｔｈｉａｍｉｎｅ　２０ｍｇ、　ｂｉｏｔｉｎ　２０ｍｇ、　１０ｍＭ　ＦｅＣｌ3　３３０μｌ、　１Ｍ　ＭｇＳＯ4　１ｍｌ、　５０ｍＭ　ＭｎＣｌ2　１ｍｌ、　５０ｍＭ　ＣａＣｌ2　２ｍｌ、　８０％　ｇｌｙｓｅｒｏｌ　１．４ｍｌ、　５０ｍｇ／ｍｌ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　１ｍｌ、　ｇｌｕｃｏｓｅ　４ｇ，　15ＮＨ4Ｃｌ　０．５ｇ）中で、１ｍＭ　ＩＰＴＧによる発現誘導後、２０℃で一晩培養した。培養後、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｊ６－Ｍ１　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で遠心し（４０００ｒｐｍ、　１５ｍｉｎ、　４℃）、集菌した。
　菌体に破砕バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７．０、菌体１ｇに対し約１０ｍｌ）を加え、懸濁し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで超音波破砕した（ｏｎ　ｔｉｍｅ　３０ｓｅｃ／ｏｆｆ　ｔｉｍｅ　３０ｓｅｃ、　ｔｏｔａｌ　１０ｍｉｎ×４回）。破砕後、Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｅｄ　Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ（ｈｉｍａｃ　ＣＲ２２Ｇ）で遠心し（１８０００ｒｐｍ、　２０ｍｉｎ、　４℃）、上清を回収した。上清をＤＥＡＥカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＧＳＴ－ａｃｃｅｐｔカラム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）に通し、ＧＳＴ融合タンパク質を樹脂に吸着させた。カラム上にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　２００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートし、ＧＳＴタグを切断した。切断後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｃｌｅａｖａｇｅバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７．０）で目的タンパク質を溶出した。得られたタンパク質溶液は、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ　１Ｋ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＰＡＬＬ）を用いた遠心（ＲＯＴＡＮＴＡ　４６０Ｒ）により濃縮し、ＡＫＴＡｐｒｉｉｍｅ　ｐｌｕｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてゲル濾過（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、　１００ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７．０）を行った。透析を行い、凍結乾燥により濃縮した後、ＮＭＲバッファー（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　５０ｍＭ　ＭｇＳＯ4、ｐＨ６．８）に透析し、15Ｎ－ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２サンプルとした。
［ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の主鎖帰属］
　次に、13Ｃ／15Ｎ標識したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２サンプル（約０．９ｍＭ）を用いて、1Ｈ／15Ｎ－ＨＳＱＣ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＯスペクトルを測定し、Ｓｐａｒｋｙ　３．１１４を用いて連鎖帰属法により主鎖の帰属を行った。1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトル上でｐｅａｋ　ｐｉｃｋを行った後、対応するピークをＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトル上で抽出し、ｓｔｒｉｐを作成した。作成したｓｔｒｉｐを並べ替えることにより帰属を行った。ＨＮＣＡ／ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ／ＨＮＣＯスペクトルも同様にしてｓｔｒｉｐを作成し、帰属を確定させた。また、自動帰属ソフトウェアＭＡＲＳ　１．２を用いて、帰属の確認を行った。ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ社ＡｖａｎｃｅIII　６００　ＭＨｚ　デジタルＮＭＲ装置を用いた。更に、15Ｎ標識した培地でｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の発現中に14Ｎアミノ酸を加えると、そのアミノ酸残基のＮＭＲシグナルが消失する現象に基づくインバースラベル法を用いて帰属の確認を行ったところ、帰属した結果はほぼ正確であると確認できた。
［ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と化合物のＮＭＲ滴定実験］
＜実施例１＞
　15Ｎ標識したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２（約０．１ｍＭ）に、式（１３）の化合物（終濃度０．２ｍＭ、ＤＭＳＯ終濃度５％）を添加し、1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルを測定した。Ｓｐａｒｋｙ　３．１１４を用いて得られたスペクトルを解析した後、シグナルの化学シフト変化から、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と化合物の結合を確認した。なお、測定には、Ｂｒｕｋｅｒ社ＡｖａｎｃｅIII　６００　ＭＨｚ　デジタルＮＭＲ装置を用いた。
＜比較例１＞
　式（１３）の化合物を添加しなかった以外は、実施例１と同様に1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルを測定した。
　図４は、実施例１及び比較例１の1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。式（１３）の化合物を添加しなかった比較例１のｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のシグナルと、添加した実施例１のシグナルでは、一部のシグナルがシフトしていた。シグナルのシフトは、式（１３）の化合物がｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合することでドメインの微小な構造が変化したためで、以上の結果より、式（１３）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合していることが確認できた。
　次に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２における式（１３）に表す化合物の結合部位を次の手順により決定した。図５は、実施例１及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフで、グラフからシグナルが０．０１５ｐｐｍ以上変化した残基を同定した。次に、公知のＸ線結晶解析により決定したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２の結晶構造をもとに作製したリボンモデルに、シグナルが０．０１５ｐｐｍ以上変化した残基についてシグナルの変化の大きさにしたがって色付けした。図６は、色付けしたｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルを示す。また、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に対するクローディンのＮＭＲ滴定実験により予め確認したｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位と、上記のシグナルが変化した残基の位置はほぼ同じであった。以上の結果より、式（１３）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位に結合していることが確認できた。
＜実施例２＞
　式（１３）の化合物に換え、式（１４）の化合物（終濃度１．０ｍＭ、ＤＭＳＯ終濃度５％）を添加した以外は、実施例１と同様にスペクトル解析した。
　図７は、実施例２及び比較例１の1Ｈ－15Ｎ　ＨＳＱＣスペクトルの結果を示す。式（１４）の化合物を添加しなかった比較例１のｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のシグナルと、添加した実施例２のシグナルでは、一部のシグナルがシフトしており、式（１４）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２と結合していることが確認できた。
　次に、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２における式（１４）に表す化合物の結合部位を、次の手順により決定した。図８は、実施例２及び比較例１から得られた各残基のシグナル変化の大きさを示すグラフで、グラフからシグナルが０．０４ｐｐｍ以上変化した残基を同定した。次に、実施例１と同様に、シグナルが０．０４ｐｐｍ以上変化した残基についてシグナルの変化の大きさにしたがってｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルに色付けした。図９は、色付けしたｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリボンモデルを示す。また、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位と、上記のシグナルが変化した残基の位置はほぼ同じであった。以上の結果より、式（１４）に表す化合物は、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２のリガンド認識部位に結合していることが確認できた。
＜比較例２～１３＞
　式（１３）に表す化合物に換え、式（４）～（１２）及び式（１５）～（１７）に表す化合物を用いた以外は、実施例１と同様にスペクトル解析し比較例１のスペクトルと対比した。しかしながら、何れの化合物もスペクトルのシグナル変化は見られなかった。
　以上の結果より、式（１３）及び（１４）に共通する構造であるアントラニル酸が、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２との結合に重要であることが判明した。また、本発明者らは、以前にＰＤＺドメインと低分子化合物との相互作用をＮＭＲ滴定実験により検証しており、複数のＰＤＺドメインに対し群特異的に結合する化合物として、ＤＩＦ（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、ＦＬＦ（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ　ａｃｉｄ）、ＦＵＡ（ｆｕｓｉｄｉｃ　ａｃｉｄ）を同定している（Ｔｅｎｎｏ，Ｔ．，　ｅｔ．ａｌ．，“Ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＰＤＺ　Ｄｏｍａｉｎｓ　ａｎｄ　Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ　Ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ＮＭＲ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｖｉｒｔｕａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”、２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．　１８、９５６７－９５８１参照）。これらの化合物には、部分構造として安息香酸またはフェニル酢酸骨格が含まれる。さらに、これまでにＰＤＺドメインの相互作用を阻害する低分子化合物としていくつか報告されているが、それらの化合物のほとんどに安息香酸骨格が含まれている（例えば、Ｆｕｊｉｉ，　Ｎ．，　ｅｔ．ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆｏｒ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＤＺ　ｄｏｍａｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”、２０１３、　Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．　１７、５４９－５５２、等参照）。以上の結果から、ＰＤＺドメインとの結合には安息香酸骨格が重要であり、さらにＬＮＸ１ＰＤＺ２との結合にはアントラニル酸骨格が重要であることが示唆された。なお、化合物は、ＬＮＸ１ＰＤＺ２の立体構造からみて、分子量が１０００以下であることが望ましい。また、ＰＤＺドメインとの結合を検証するため、化合物は水溶性であることが好ましく、ＣＬｏｇＰ３．５以下であることが望ましい。
［化合物の細胞アッセイ］
＜実施例３＞
　次に、ＮＭＲでｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に結合することが確認された式（１３）で表される化合物について、イヌ腎臓尿細管上皮細胞を用いてタイトジャンクション形成に与える影響についてアッセイを行った。アッセイは、ＭＤＣＫ－II細胞（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ　Ｃａｎｉｎｅ　Ｋｉｄｎｙ　ＳｔｒａｉｎＩＩ；本研究では神戸大学大学院医学研究科細胞生物学の古瀬幹夫教授から入手した細胞を用いたが、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社からも購入可能である。）を用い、下記［免疫染色］に記載されている手順で行った。また、ＭＤＣＫ－II細胞に関して、内在性ＬＮＸ１が発現しているのか否かについても確認を行った。内在性ＬＮＸ１の発現の確認は、下記［Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ］に記載されている手順、及び下記［免疫染色］において、化合物を添加せず、化合物添加後の４８ｈ培養をしなかった以外は［免疫染色］と同様の手順で行った。
［免疫染色］
　カバーガラスを入れた６　ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈに細胞を播種し、ＣＯ2インキュベータで一晩培養した。培地をアスピレーターで吸引した後、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒ）培地１ｍｌと調整した式（１３）で表される化合物１ｍｌを加え（終濃度１００μＭ、ＤＭＳＯ終濃度０．１％）、ＣＯ2インキュベータで４８ｈ培養した。培養後、培地をアスピレーターで吸引し、無血清ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、アスピレーターで吸引した（×２回）。冷メタノールを１ｍｌ加え、－２０℃で２０分静置した。新しい６　ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈにＰＢＳを２ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ－１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。ＰＢＳを吸い出した後、ブロッキング溶液（５％スキムミルク溶液）を１ｍｌ加えて、室温で１ｈインキュベートした。スキムミルク溶液で希釈した１００μｌの一次抗体溶液の上に、固定した細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせ、４℃で一晩インキュベートした。翌日、６　ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈにＰＢＳを１ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ－１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。スキムミルク溶液で希釈した１００μｌの二次抗体溶液の上に、固定した細胞面が下になるようにカバーガラスをかぶせ、室温で１ｈインキュベートした。６　ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈにＰＢＳを１ｍｌ加え、その中にカバーガラスを入れて洗浄した。ＰＢＳをＰ－１０００ピペットマンで吸い出し、新たにＰＢＳを１ｍｌ加えて洗浄した（×２回）。封入剤１０μｌをスライドガラスの上に滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。遮光し、翌日ＯＬＹＭＰＵＳ社の顕微鏡ＩＸ７１を用いて検鏡した。なお、露光時間は固定して撮影した（１／５ｓｅｃ）。
　なお、一次抗体には、Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－Ｃｌａｕｄｉｎ－２　ａｎｔｉｂｏｄｙ（５１－６１００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をスキムミルク溶液で２５０倍に希釈したもの、及びＲａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＬＮＸ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（ＡＶ４７３３６７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で１００倍に希釈したものを用いた。
　また、二次抗体には、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ），Ｆ（ａｂ’）２　ｆｒａｇｍｅｎｔ－Ｃｙ３　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃ２３０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で５００倍に希釈したもの、及びＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ），　Ｆ（ａｂ’）２　ｆｒａｇｍｅｎｔ－ＦＩＴＣ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｆ１２６２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をスキムミルク溶液で２００倍に希釈したものを用いた。
［Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ］
　細胞を６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、ＣＯ2インキュベータで培養した。培地をアスピレーターで吸引し、ＰＢＳ　１ｍｌで洗浄した（×２回）。ＳＤＳ－Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを適量加え、セルスクレーパーでかきとった。Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒで２ｍｉｎ超音波破砕した後、９５℃で３ｍｉｎ加熱し、サンプルとした。
　サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、そのゲルをＢ液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ　０．３０ｇ、　ｍｅｔｈａｎｏｌ　５ｍｌ、　ＭｉｌｌｉＱ、　ｔｏｔａｌ　１００ｍｌ）に浸した。ＰＶＤＦ膜（ＡＥ－６６６８、ＡＴＴＯ）は１００％ｍｅｔｈａｎｏｌに約２０ｓｅｃ浸した後、Ｂ液中に３０ｍｉｎ以上浸透させた。濾紙（ＣＢ－０６Ａ、ＡＴＴＯ）はＡ液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ　１．８２ｇ、　ｍｅｔｈａｎｏｌ　２．５ｍｌ、　ＭｉｌｌｉＱ、　ｔｏｔａｌ　５０ｍｌ）に２枚、Ｂ液に１枚、Ｃ液（６－ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ　０．２６ｇ、　ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ　０．１５ｇ、　ｍｅｔｈａｎｏｌ　２．５ｍｌ、　ＭｉｌｌｉＱ、　ｔｏｔａｌ　５０ｍｌ）に３枚浸した。コンパクトブロットＡＥ－７５００（ＡＴＴＯ）の陽極板に濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲルを重ねた後、陰極をセットし、通電することによりタンパク質をＰＶＤＦ膜に移行させた。ＰＶＤＦ膜をｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ（５％スキムミルク、　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０　ｉｎ　ＰＢＳ）に浸し、室温で１ｈ振とうさせた。ＰＶＤＦ膜をｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔで希釈した一次抗体溶液に浸し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＤＶＦ膜をｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に浸し、５ｍｉｎ振とうさせて（×４回）洗浄した後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔで希釈した二次抗体溶液に浸し、室温で１ｈインキュベートした。ＰＤＶＦ膜をｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒに浸し、５ｍｉｎ振とうさせて（×４回）洗浄した。ＰＤＶＦ膜上にＣｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ　Ｓｕｐｅｒ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）をかけ、インキュベートし、ＬＡＳ－３０００ｍｉｎｉで検出した。
　なお、一次抗体には、Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ＬＮＸ１　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＶ４７３３６７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔで１０００倍に希釈したものを用いた。
　また、二次抗体には、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　ＨＲＰ（Ｗ４０１Ｂ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔで１００００倍に希釈したものを用いた。
［ＭＤＣＫ－II細胞における内在性ＬＮＸ１の発現確認］
　図１０（１）は、上記〔Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ〕により得られた写真である。また、図１０（２）は、上記〔免疫染色〕において、化合物を添加せず、添加後の４８ｈ培養をしなかった以外は同様の手順で免疫染色した写真である。
　図１０（１）に示すように、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇでは、７５ｋＤａ付近にバンドが確認出来たので、ＬＮＸ１の発現が確認できた。また、図１０（２）に示すように、免疫染色では、細胞内に輝点が存在していることからＬＮＸ１の発現が確認できた。以上の結果から、ＭＤＣＫ－II細胞において、ＬＮＸ１が内在的に発現していることを確認した。
［式（１３）で表される化合物のアッセイ］
　図１１（１）は、実施例３で得られた免疫染色の写真である。
＜実施例４～７＞
　式（１３）で表される化合物に換え、実施例４として式（１４）、実施例５として式（３０）、実施例６として式（３３－３）、実施例７として式（３４－９）で表される化合物を用いた以外は実施例３と同様の手順で免疫染色を行った。図１１（２）は実施例４、図１１（３）は実施例５、図１１（４）は実施例６、図１１（５）は実施例７で得られた免疫染色の写真である。
＜比較例１４＞
　式（１３）で表される化合物を添加しなかった以外は実施例３と同様の手順で免疫染色を行った。図１１（６）は、比較例１４で得られた免疫染色の写真である。
　図１１（６）の比較例１４の写真と比べ、実施例３～７の図１１（１）～（５）の写真は、細胞と細胞の間の白色部分が明らかに濃くなっており、クローディンのタイトジャンクションへの増蓄が確認された。この結果、及びＮＭＲ滴定実験の結果から、式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）及び（３４－９）で表される化合物がｍＬＮＸ１ＰＤＺ２に結合し、ｍＬＮＸ１ＰＤＺ２とクローディンの結合を阻害することで、クローディンの細胞内への取り込みを阻害し、結果的にタイトジャンクションを強化したと考えられる。
　また、ヒト、マウス、イヌのＬＮＸ１ＰＤＺ２ドメインのクローディンが相互作用する面に位置するアミノ酸配列について調べた。調べたアミノ酸配列は、何れもＵｎｉＰｒｏｔから入手した次の部分である。
＜ヒト＞　　ＩＤ：Ｑ８ＴＢＢ１のアミノ酸番号３７７－４６３（８７配列）
＜マウス＞　ＩＤ：Ｏ７０２６３のアミノ酸番号３８１－４６７（８７配列）
＜イヌ＞　　ＩＤ：Ｅ２ＲＢＥ８のアミノ酸番号３８１－４６７（８７配列）
　ヒト、マウス、イヌのＬＮＸ１ＰＤＺ２ドメインのアミノ酸配列（上記８７配列）の相同性は、ヒトとマウスは９５％、ヒトとイヌは９４％、マウスとイヌは９４％と非常に高かった。また、クローディンが相互作用する面に位置するアミノ酸の配列（上記８７配列の１８番目のグリシン～２３番目のアルギニン、及び６６番目のプロリン～７４番目のグルタミン）は、ヒト、マウス、イヌで完全に一致していた。したがって、式（１３）及び（１４）で表される化合物は、ヒトのタイトジャンクション形成の制御にも用いることができる。
　本発明の式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）及び（３４－９）で表される化合物は、ＬＮＸ１に特異的に反応することで、ＬＮＸ１とクローディンとが相互作用することを阻害し、その結果、クローディンの細胞内への取り込みが阻害されることでタイトジャンクション形成状態を制御することができる。したがって、タイトジャンクション形成メカニズムのどの段階での制御であるのか明らかであることから、医薬品、化粧品等への応用が可能である。

Claims (4)

  1. 　下記式（１３）、（１４）、（３０）、（３３－３）及び（３４－９）で表される化合物を少なくとも一種含むタイトジャンクション形成制御剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　前記化合物が、式（１３）又は（１４）で表される化合物である請求項１に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
  3. 　前記化合物がクローディンの細胞内への取り込みを防ぐことでタイトジャンクションの形成を制御する請求項１又は２に記載のタイトジャンクション形成制御剤。
  4. 　請求項１～３の何れか一項に記載のタイトジャンクション形成制御剤を含む医薬組成物。
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