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WO2016005099A1 - Composition aqueuse hypotonique comprenant des nanoparticules d'arnm, kit et procédé de préparation - Google Patents

Composition aqueuse hypotonique comprenant des nanoparticules d'arnm, kit et procédé de préparation Download PDF

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WO2016005099A1
WO2016005099A1 PCT/EP2015/061858 EP2015061858W WO2016005099A1 WO 2016005099 A1 WO2016005099 A1 WO 2016005099A1 EP 2015061858 W EP2015061858 W EP 2015061858W WO 2016005099 A1 WO2016005099 A1 WO 2016005099A1
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WO
WIPO (PCT)
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mrna
hypotonic
nanoparticles
aqueous composition
concentration
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PCT/EP2015/061858
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Jérôme Lemoine
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Individual
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions

Definitions

  • Hypotonic aqueous composition comprising nanoparticles of A Nm, kit and method of preparation
  • the expression of therapeutic proteins in pathological tissue can currently be obtained by the administration of recombinant gene or protein vectors produced in vitro.
  • transgene vectors have three major defects.
  • the transgene can integrate randomly into the genome of a cell. This increases the risk of cellular transformation, causing the occurrence of cancer.
  • the maximum level of expression of the protein encoded by the transgene is reached 72 hours after the injection of the vector. Treatment of some conditions would require that the peak of expression be reached within the first 24 hours after administration of the drug product.
  • the transgene is expressed durably, which is not appropriate for the treatment of acute diseases, which requires transient expression of a therapeutic protein.
  • mRNA messenger RNA
  • Transfer of mRNA into a cell results in transient expression of the protein of interest. Indeed, mRNA and the protein encoded by it are fully degraded into nucleotides and amino acids within a few days. The reversibility of protein expression is a guarantee of safety for the patient. This transient expression of therapeutic proteins would avoid the deleterious effects, which can result from a lasting and uncontrolled expression.
  • An mRNA can not integrate into the genome, unlike a DNA molecule.
  • the total absence of genotoxicity of the mRNA vectors represents a weight advantage over the gene vectors. This also contributes to the high safety of this type of vector for the patient.
  • the mRNA is introduced into the cytosol of the target cell, while the DNA of a gene vector has to be transferred to the nucleus.
  • the mRNA is readily accessible to ribosomes to be translated into protein.
  • the expression of the protein of interest is earlier in the case of an mRNA vector. This represents an advantage for the treatment of an acute pathology, which requires that the therapeutic protein appear as early as possible in the target tissue.
  • a plasmid In a first step, a plasmid must be constructed using standard molecular biology techniques.
  • the gene coding for the protein of interest is inserted into the plasmid downstream of the phage T7 RNA polymerase promoter.
  • the plasmid is amplified, purified and linearized downstream of the gene of interest by a restriction enzyme.
  • the linearized plasmid is then incubated with recombinant T7 RNA polymerase, the four ribonucleotide triphosphates and a capping analog.
  • the enzyme binds to its promoter and transcribes the gene to the end of the DNA.
  • the mRNA thus produced is then purified by affinity chromatography and by precipitation with lithium chloride.
  • the concentration of purified mRNA is determined by measuring its absorbance at 260 nm.
  • the mRNA must be protected and condensed in the form of nanometric particles, constituting a vector, in order to be out of reach of the extracellular and lysosomal nucleases.
  • the nanoparticle must also advantageously expose on its surface a molecule capable of interacting with one or more components of the plasma membrane of the target cells. This ligand thus allows the adsorption of the nanoparticle on the cell surface, in order to promote its internalization by endocytosis.
  • the invention relates to an aqueous composition
  • aqueous composition comprising messenger RNA nanoparticles (mRNA) encoding a therapeutic protein.
  • mRNA messenger RNA nanoparticles
  • a hypotonic solution is a solution whose tonicity, i.e. the effective osmolarity, is much lower than that of the intracellular medium of the target cell.
  • the subject of the invention is an aqueous composition comprising messenger RNA nanoparticles (mRNAs) encoding a therapeutic protein, characterized in that
  • mRNAs messenger RNA nanoparticles
  • composition is hypotonic and has an osmolarity of less than 300 mosM
  • the mRNA nanoparticles comprise mRNA condensed in an aqueous medium under hypotonic conditions with cationic compounds of the type
  • a synergistic effect between the composition and the nanoparticles is observed: significant improvement in mRNA transfer when the nanoparticles are administered in a hypotonic composition.
  • the nanoparticles are suspended in the aqueous composition, advantageously without they precipitate.
  • the composition advantageously comprises said mRNA nanoparticles in a concentration such that the concentration of mRNA is greater than 50 ⁇ g / ml, more preferably greater than 100 ⁇ g / ml, and still more advantageously greater than 200 ⁇ g / ml.
  • the volume of the hypotonic solution can be adjusted so that the final concentration of mRNA is 250 ⁇ g RNA / ml.
  • the maximum concentration depends on the solubility of the nanoparticles in the hypotonic solution. This relatively high concentration of vector makes it possible not to inject a too high volume of aqueous solution into an animal or human tissue.
  • the volume to be injected can vary from 10 ⁇ to 5 ml.
  • the invention also relates to the use of a hypo-osmotic solution capable of inducing a hypotonic shock.
  • the hypotonic aqueous composition advantageously has an osmolarity of less than 300 mosM, advantageously less than 200 mosM, for example between 0 mosM and 200 mosM.
  • the cation concentration is advantageously less than 150 mM, more advantageously less than 100 mM.
  • the composition advantageously comprises potassium chloride and / or sodium chloride in a concentration ranging from 5 mM to 100 mM, more preferably from 20 mM to 60 mM. Potassium chloride is preferred, preferably at a concentration of 40 mM.
  • the composition advantageously comprises Hepes buffer making it possible to adjust the pH of the aqueous composition to between 4 and 7; the terminals being included. An essential feature of the buffer is that it does not contain divalent or multivalent ions. Depending on the target pH and the desired osmolarity, the Hepes buffer will be used in its acid form and / or in its basic form.
  • the composition advantageously comprises Hepes buffer in a concentration ranging from 1 mM to 80 mM, more preferably from 5 mM to 50 mM, still more preferably from 8 mM to 40 mM, still more preferably from 10 mM to 30 mM.
  • a concentration of 20 mM is particularly preferred, especially when the Hepes buffer is used in its acid form.
  • Hepes pH X will be used to designate a Hepes buffer that makes it possible to adjust the pH of the aqueous composition to X.
  • trifluoroacetic acid composition makes it possible to significantly increase the efficiency of the transfer of mRNA with respect to the same vector prepared with a cationic peptide batch that is devoid of acid. trifluoroacetic.
  • the composition advantageously comprises trifluoroacetic acid in a concentration ranging from 1 ⁇ to 1000 ⁇ , more preferably 3 ⁇ to 300 ⁇ .
  • Trifluoroacetic acid is advantageously used in its salt form, advantageously sodium trifluoroacetate.
  • a most preferred composition is a hypotonic aqueous composition comprising 40 mM KCl, 20 mM Hepes pH 5.5 and 100 ⁇ l trifluoroacetate.
  • the composition does not include other source compounds of sodium or potassium cations; and more preferably no other cation source compounds.
  • the composition does not comprise other compounds substantially affecting its osmolarity, that is to say an order of magnitude greater than 10 mOsM.
  • This composition may also comprise one or more unloaded molecule (s), such as glucose, mannitol or sucrose. These molecules may be present as soon as the nanoparticles are assembled in the first variant of the preparation process, which will be described below.
  • the efficiency of introducing mRNA into cells depends on the degree of hypotonicity of the nanoparticle solution. In vivo, a slightly hypotonic solution provides moderate benefit, while a very low osmolarity solution greatly improves the entry of the nanoparticle into the cells. In vitro, it has been shown that the optimal concentration of sodium chloride, in terms of the efficiency of mRNA transfer in cells in culture, is 40 mM. Substituting sodium chloride with potassium chloride further enhances the efficiency of mRNA transfer. It was then shown that the optimal concentration of potassium chloride (KCl) is also 40 mM.
  • a mammalian cell When a mammalian cell is incubated in a hypoosmotic medium, it undergoes hypotonic shock. Indeed, the water enters the cell, which stretches its plasma membrane. This traction opens calcium channels, which allow the fusion of intracellular vesicles with the plasma membrane, by exocytosis. This increases the area of the plasma membrane and prevents the cell from bursting.
  • ATP is released into the extracellular medium. ATP binds and activates P2Y purinergic receptors.
  • a signal transduction path leads to the opening of potassium and chloride channels. Decreased intracellular osmolarity and increased extracellular osmolarity drain water out of the cell. The volume of the latter decreases, which allows the internalization of the excess plasma membrane resulting from the fusion of intracellular vesicles. This massive endocytosis can be exploited by the mRNA vector to enter the cell.
  • the vector reaches intracellular compartments, such as endosomes. It appears that the hypotonic shock transiently permeabilizes the membranes of these intracellular compartments, allowing the vector to escape and reach the cytosol.
  • the vector progressively releases messenger RNA through reducing agents, such as glutathione.
  • glutathione the positive charges of the compounds A and A '(advantageously cationic peptide) are not sufficient to maintain the integrity of the nanoparticle.
  • the mRNA is thus progressively stripped. It becomes accessible to translation factors and ribosomes.
  • the protein of interest is then produced by the transfected cell.
  • the invention is based on two complementary elements, which act synergistically: the mRNA nanoparticle and the hypotonic buffer in which it is in suspension.
  • the nanoparticle is composed of peptides
  • these molecules are degraded by the amino acid cells, which can then be recycled by them for the synthesis of cellular proteins.
  • potassium ions During hypotonic shock, potassium ions must exit the cell through a potassium channel. It has been shown that at low pH, the opening of this potassium channel is inhibited. This could inhibit mRNA transfer. It has also been demonstrated that trifluoroacetate activates the opening of this potassium channel (Trifluoroacetic acid activates ATP-sensitive K (+) channels in rabbit ventricular myocytes, Han J et al., Biochem Biophys Res Commun 2001, 285 (5): 1136-1142). Sodium trifluoroacetate would suppress potassium channel inhibition and prevent hypotonic shock inhibition at low pH.
  • Hepes at pH 5.5 is internalized by endocytosis by the cells at the same time as the peptide / mRNA nanoparticles. Hepes would buffer the endosomal pH at 5.5 thereby inhibiting the pH drop necessary for the mRNA vector to be transferred to the lysosomes. However, these contain enzymes capable of degrading RNA. Hepes would thus increase the residence time of the mRNA vector in the endosomes, allowing it to escape to the cytosol, where the translation into protein takes place.
  • the subject of the invention is compositions comprising nanoparticles of messenger RNA
  • MRNA encoding a therapeutic protein by the use of a cationic compound, such as a cationic peptide.
  • a cationic compound such as a cationic peptide.
  • the latter has two functions: to condense the mRNA into nanoparticles to promote its entry into mammalian cells by endocytosis and to protect the mRNA against RNases, enzymes capable of digesting RNA. These two functions participate in the transfer of mRNA in cells, so that it is translated into protein by ribosomes.
  • the nanoparticles advantageously also comprise compounds of the type A'-E-
  • a ' is a cationic compound, which also allows the condensation of mRNA, by non-covalent bonds with mRNA reversible in the cytoplasm of mammalian cells
  • E is an unloaded spacer and soluble in water
  • L is a neutral or near-neutral ligand peptide
  • Neutral or near neutral means that the ligand is not charged or that it contains positive charges and negative charges that balance or almost balance.
  • the cationic compounds of type A or type A ' have positive charges, which can interact with the negative charges carried by the RNA, which results in the condensation of the latter in nanoparticles.
  • a vector is a nanoparticle containing messenger RNA.
  • mRNA is fused and protected against nucleases.
  • the nanoparticle may also exhibit a ligand peptide on its surface.
  • the assembly of the nanoparticles therefore implies that interactions are established between the mRNA molecule and the condensation molecule (s) of the RNA.
  • Peptides are particularly described hereinafter because they are biodegradable and easily synthesized chemically. The most frequently used interactions for binding RNA to the condensation molecule of the latter are electrostatic interactions. Indeed, RNA is a long polyanion.
  • a molecule carrying a plurality of positive charges or an assembly of molecules bearing a single positive charge can interact with RNA and form a particle. Other non-covalent interactions can complement these electrostatic interactions, among which the hydrogen, Van der Walls and hydrophobic interactions.
  • the stability of the nanoparticles can also be increased by multimerization of the cationic compounds with each other, the bonds formed being however reversible in the cytoplasm of mammalian cells.
  • disulfide bridges are broken by reducing compounds, such as glutathione.
  • This multimerization may follow an oxidation, for example the thiol groups present at the ends may be oxidized in the presence of oxygen dissolved in the medium to form disulfide bridges.
  • the cationic compound of type A, and / or, where appropriate, the cationic compound of type A ' comprises groups capable of forming reversible intermolecular bonds in the cytoplasm of mammalian cells.
  • the intermolecular bonds are advantageously reversible covalent bonds, in particular disulfide bridges.
  • a cationic compound of type A and optionally a cationic compound of type A ', soluble in water.
  • the cationic compound of type A or A ' is advantageously chosen from the group consisting of cationic peptides, cationic lipids in the form of liposomes, cationic polymers, and cationic surfactants in the form of micelles.
  • the cationic compound of type A or A ' is a cationic peptide of formula X m - (Y) n -X'p in which
  • X and X ' are the same or different and each represents a molecule bearing a thiol group
  • n 0 or 1
  • p 0 or 1
  • Y is an amino acid or an amino acid derivative whose side chain is positively charged
  • n is an integer ranging from 4 to 20.
  • X and X 'each represent an amino acid or an amino acid derivative or homologous amino acid bearing a thiol group, advantageously cysteine or homocysteine.
  • Y advantageously represents an amino acid or an amino acid derivative of formula NH 2 -alk-COOH
  • alk represents a linear alkyl chain comprising from 3 to 8 carbon atoms, one of these carbon atoms possibly being substituted by a nitrogen atom
  • alk is substituted with a radical, where R represents a positively charged radical at the pH of the medium, advantageously an NH 2 radical;
  • Y is advantageously chosen from arginine, lysine and ornithine, preferably arginine, positively charged to the pH of the medium.
  • the cationic peptide is chosen from the peptides of the following sequences:
  • X represents an organic acid carrying a thiol function, advantageously thioglycolic acid, and X 'represents an aminothiol, advantageously cysteamine.
  • X represents an organic acid carrying a thiol function, advantageously thioglycolic acid
  • Cationic peptides with terminal cysteines have been described by Kevin Rice's team (Low Molecular Weight Disulfide Cross-linking Peptides as Nonviral Gene Delivery Carriers, McKenzie DL et al., Bioconjugate Chem., 2000, 11, 901-909). for the transfer of nucleic acids into mammalian cells.
  • E is a spacer (or English spacer) not loaded and soluble in water. By unloaded, it is meant that the molecule does not include electric charges. It is preferred to use biodegradable molecules whose degradation products are non-toxic metabolites for mammalian cells.
  • the spacer is a water-soluble polymer, linear or crosslinked, having a size ranging from 0.5 kDa to 50 kDa, advantageously from 0.5 to 20 kDa, more advantageously from 2 kDa to 5 kDa.
  • a water-soluble polymer is advantageously used. Polymers considered to be non-toxic are preferred.
  • the spacer is chosen from polyethylene glycol (PEG), poly (hydroxyalkyl) -L-glutamine and poly (hydroxyalkyl) -L-asparagine; where the alkyl groups are advantageously C 1 -C 4 alkyls, more preferably the ethyl radical.
  • the degradation products of these last two compounds are ethanolamine and glutamate or aspartate. It is also particularly possible to use the PEG of 2 to 5 kDa, more particularly 3.5 kDa.
  • the compounds A'-E-L comprise at their end a ligand peptide, L.
  • L binds to molecules present in the plasma membrane, which allows the nanoparticle to adsorb on the cell surface.
  • the messenger RNA nanoparticle and the hypotonic shock serve to promote the introduction of the mRNA into the target cells.
  • the presence of a ligand peptide allows the nanoparticle to attach to the plasma membrane, in order to be subsequently endocytinated. This improves the efficiency of the entry of the mRNA into the cells.
  • the choice of ligand peptide was focused on a peptide penetrating the cells (CPP).
  • the first characteristic of a CPP is to attach to the plasma membrane and be internalized by a cell.
  • the ligand peptide is advantageously chosen from peptides of cellular penetration or CPP, in particular from mammalian cells, RGD ligands, transferrin, folate, antibodies, ligands of a receptor (for example: cytokines, hormones, growth), small molecules (e.g. carbohydrates such as mannose or galactose or synthetic ligands), small molecule agonists, receptor inhibitors or antagonists (e.g. RGD peptidomimetic analogues).
  • the ligand peptide is of formula PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID No. 25).
  • PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA SEQ ID No. 25.
  • this peptide it has been shown that it is able to bind to the plasma membrane and be internalized by a cell. This has been demonstrated by conjugating a marker compound to CPP, incubating cells in culture with labeled CPP and following the entry of CPP into these cells (Screening of cell-penetrating peptides using mRNA display, Jae-Hun Lee et al. Biotechnol, J 2012, 7, 387-396).
  • the demonstration was made with a CPP conjugated to a large molecule or particle, in order to prove that the CPP possesses this characteristic of penetration into the cells in the context of a macromolecular assembly. Indeed, it is not necessary that the CPP is effective in isolation and inefficient when it is present on the surface of a nanoparticle mRNA.
  • the mRNA nanoparticle After injection into a tissue, the mRNA nanoparticle must attach to the cells, not only to penetrate, but also so that the nanoparticle diffuses as little as possible outside of this tissue. This retention of the nanoparticle by the tissue into which it has been injected is important because the mRNA must not be introduced into the cells of other organs. There should be the least possible ectopic expression of the protein encoded by the messenger RNA.
  • the CPP must not be significantly positively or negatively charged. Indeed, only the cationic peptides of type A and A 'must interact with the phosphodiester groups of the mRNA. The presence of a large number of electrical charges on the CPP would allow it to interact with either the RNA or the cationic compound. This would profoundly alter the formation of mRNA nanoparticles.
  • the CPP chooses, PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA, has three positive charges for a negative charge scattered throughout the sequence. It has all the necessary characteristics.
  • Cationic CPP would also interact in vivo with the extracellular matrix present in the injected tissue.
  • the mRNA vector would thus be retained on the extracellular matrix instead of entering the cells.
  • the efficiency of introducing mRNA into the target cells would therefore be very low.
  • the lyophilized A'-EL compound should readily dissolve in deionized water. This implies that the CPP portion of this compound should advantageously be soluble in water, too. This is the case of the CPP chooses.
  • hydrophobic CPP containing too much phenylalanine, leucine, isoleucine, alanine, valine, cysteine and methionine, and too few hydrophilic amino acids, such as arginine, lysine, histidine, glutamic acid , aspartic acid, proline, asparagine and glutamine.
  • the cationic compound of type A is the Cys (Arg 8 ) Cys cationic peptide (SEQ ID No. 1).
  • the A'-EL type compound is the cationic Cys (Arg 8 ) Cys peptide (SEQ ID No. 1) extended at its N-terminus by polyethylene glycol conjugated to a ligand peptide.
  • PEG is preferred from 2 to 5 kDa, more preferably 3.5 kDa.
  • the ligand peptide is advantageously of formula PQ DTVGG TTPPSWGPAKA (SEQ ID No. 25).
  • the nanoparticle is very stable outside the cells, where the environment is oxidizing.
  • the nanoparticle does not dissociate and does not aggregate outside the cells.
  • the ligand is found preferentially on the surface of the nanoparticle.
  • the ligand can thus be effectively exposed to interact with the plasma membrane of the target cells.
  • the groups L are predominantly on the outer surface.
  • the nanoparticles advantageously have a size of less than 200 nm, more advantageously less than 100 nm.
  • the size of nanoparticles can be measured by electron microscopy. It can also be measured by diffraction of the light of a laser
  • the mRNA vector be of small size (advantageously ⁇ 200 nm), in order to effectively penetrate the target cells by endocytosis.
  • the nanoparticles are obtained by condensation and possibly multimerization.
  • the multimers of peptides comprise tens or even hundreds of radicals Y (advantageously arginines).
  • the presence of the compound AEL is optional.
  • the assembly of the mRNA vector can be obtained by mixing an RNA solution and a solution containing either the only X- (Y) nX cationic peptide, or the cationic peptide and the A'-EL compound. .
  • the amount of peptide complexed to the mRNA has been precisely fixed. There must be an excess of negative charges on the surface of the nanoparticle, from the mRNA, in order to avoid the immobilization of the vector on the extracellular matrix present in the tissues. Indeed, if the nanoparticle were positively charged, it would attach to the glycosaminoglycans of the extracellular matrix at the injection site. The vector could not penetrate abundantly into the cells.
  • the amount of cationic peptide is sufficient to form a nanoparticle with the mRNA, but is not too high, the mRNA is released more rapidly into the cytosol of the cells, in order to be translated early into protein.
  • the amount of A compound and optionally A'-E-L compound mixed with the mRNA depends on the ratio of positive / negative charges that one wishes to achieve.
  • this ratio varies from 1 to 3, more preferably from 1.5 to 2.5.
  • the +/- charge ratio is the ratio between the total number of positive charges carried by all the peptides and the total number of negative charges carried by all the RNA molecules. It has been found that the +/- charge ratio of the mRNA / cationic peptide vector giving the best results, in terms of mRNA transfer, varies from 1.4 to 2.2, more preferably from 1.6 to 2, 2, still more preferably 1.6 to 2.0.
  • the compound molar ratio of type A / compound A'-E-L advantageously varies from 99% / 1% to 96% / 4%.
  • the assembly of the vector can be obtained in different ways.
  • the invention particularly relates to a method for preparing messenger RNA nanoparticles (mRNA) encoding a therapeutic protein, comprising the condensation of mRNA with cationic compounds of type A in an aqueous medium under hypotonic conditions, leading to the formation non-covalent linkages with mRNA, reversible in the cytoplasm of mammalian cells.
  • mRNA messenger RNA nanoparticles
  • stable is meant that the mRNA assembled with the cationic compounds of type A, otherwise called here nanoparticle or vector, does not dissociate in the extracellular medium.
  • the medium in which the mRNA is assembled with the cationic compounds of type A is a hypotonic aqueous medium.
  • the pH of the medium is between 6.5 and 8.5 inclusive, advantageously between 7 and 7.5 inclusive.
  • the medium advantageously comprises a hypotonic buffer preferably consisting of one or monovalent cation (s).
  • the buffer is sodium hepes.
  • a medium free of multivalent cations is preferably used.
  • the vast majority of the cations in the medium is provided by the buffer.
  • the concentration of cations in the medium is advantageously less than 150 mM, more preferably less than 100 mM.
  • the medium advantageously has an osmolarity of less than 300 mosM, advantageously between 0 and 200 mosM.
  • the assembly, also called condensation, of the A Nm under these conditions makes it possible to obtain mRNA nanoparticles having a size of less than or equal to 200 nm, advantageously less than or equal to 100 nm.
  • the two media of steps a) and b) are hypotonic.
  • the medium of step a) has a cation concentration of less than 150 mM, advantageously less than 100 mM
  • the medium of step b) has a cation concentration of less than 150 mM, advantageously less than 100 mM. mM.
  • the buffers are monovalent buffers, such as sodium hepes.
  • other buffers can be used, excluding those containing divalent or multivalent ions.
  • the phosphate buffer can not be used because the phosphate is present in a divalent form (PO 4 2- ).
  • This divalent anion interacts, in competition with the mRNA, with the positive charges of the compounds of type A or A '(in particular arginines of the cationic peptides). This also results in the formation of large mRNA particles.
  • Any buffer adjusted to pH 7-7.5, consisting of monovalent ions, can replace sodium hepes.
  • step a): medium of step b) advantageously varies from
  • the mRNA nanoparticles are assembled by mixing the media of steps a) and b).
  • the medium of step b) is introduced into that of step a).
  • the reverse order is possible. After adding, mix as quickly as possible (from 1 to 10 seconds according to the scale of production), in order to obtain a homogeneous mixture. This homogeneity is important because it allows each RNA molecule to complex with a similar number of copies of the A-type compounds and A'-EL compounds and to form a population of nanoparticles having a similar diameter.
  • the assembly of the nanoparticles takes place at ambient temperature (ie 20-25 ° C.) for a sufficient time, most often a few hours.
  • the assembly of the nanoparticles takes place in a solution with a very low salt concentration, that is to say hypoosmotic or hypotonic.
  • a very low salt concentration that is to say hypoosmotic or hypotonic.
  • the cations and anions dissolved in an aqueous solution are in competition with the positively charged radicals of the compounds A and A '(for example arginines of the cationic peptide) and the phosphodiester groups of the RNA.
  • the peptide / RNA particles are significantly larger than at low osmolarity and tend to aggregate with time.
  • the medium of step b) can easily be prepared by adding the cationic compound of type A, and optionally the compound A'-E-L, in freeze-dried form in the buffered aqueous solution.
  • the assembly of the vector is obtained by mixing a solution of mRNA dissolved in demineralized water and a solution of cationic compound, advantageously peptide, dissolved in demineralized water. The mixture is incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the mixture of RNA and peptide solutions must be as fast as possible in order to be homogeneous. This homogeneity is important because it allows each RNA molecule to complex with a similar number of peptide copies and to form a population of nanoparticles having a similar diameter.
  • aqueous demineralized medium comprising the cationic compound of type A, and optionally the compound A'-E-L, as defined previously, c. Mix for a short time the aqueous medium prepared in step b) and the aqueous medium of step a);
  • RNA is advantageously less than or equal to 100 ⁇ g RNA / ml, at the end of the mixture.
  • RNA / peptide mixture is frozen by the use of liquid nitrogen (or any other means allowing rapid freezing) and freeze-dried.
  • Aqueous solutions must be demineralized for two reasons. The higher the ionic strength, the more the cationic peptide / mRNA particles are bulky. However, they must be small, in order to effectively enter mammalian cells by endocytosis. Lyophilization makes it possible to preserve the vector, in the long term, in the form of a lyophilizate, at -20 ° C. Lyophilization does not eliminate ions. If the aqueous solution contained ions, the osmolarity of the vector solution would be higher after lyophilization, when the vector is dissolved in a smaller volume of water than that used during assembly.
  • Lyophilization also allows extemporaneous reconstitution of the vector suspension.
  • the nanoparticles may be nanoparticles obtained by the first variant of the process.
  • the composition may be identical or different from that used for the preparation of the nanoparticles.
  • the composition is obtained by reconstitution of the lyophilizate of nanoparticles (second variant of the process).
  • the subject of the invention is also a kit comprising:
  • a hypotonic aqueous solution of osmolarity lower than 300 mosM, of concentration in cations lower than 150 mM,
  • mRNA messenger RNA nanoparticles
  • This hypotonic aqueous solution may be called a reconstitution solution.
  • the hypotonic solution of step i) is as previously described.
  • it comprises:
  • Potassium chloride and / or sodium chloride in a concentration ranging from 5 mM to 100 mM - Hepes buffer, to adjust the pH of the aqueous composition between 4 and 7, the terminals being included
  • the hypotonic solution of step i) does not include other compounds source of sodium or potassium cations; and more preferably no other cation source compounds.
  • the hypotonic solution of step i) does not comprise other compounds substantially affecting its osmolarity, that is to say of an order of magnitude greater than 10 mOsM.
  • This hypotonic solution of step i) may also comprise one or more unloaded molecule (s), such as glucose, mannitol or sucrose.
  • s unloaded molecule
  • the nanoparticles are advantageously in a lyophilized form.
  • the lyophilizate is prepared as described above.
  • freeze-dried aqueous solutions do not include ions.
  • the invention finally relates to a composition according to the invention for its use as a medicament.
  • the therapeutic indication will of course depend on the protein that will be encoded by the mRNA.
  • the invention has the great advantage that, unlike gene therapy, mRNA transfer forces a tissue to produce a therapeutic protein only for a few days.
  • the composition may be used for treating or preventing diseases, disorders or pathological conditions chosen from cardiac pathologies such as myocardial infarction, angina pectoris, respiratory pathologies such as asthma, disorders caused by a viral infection (especially by the respiratory route or by nebulization), disorders due to an inflammatory reaction (local injection instead of inflammation), disorders due to a bacterial infection, for the healing of diabetic wounds, bedsores.
  • cardiac pathologies such as myocardial infarction, angina pectoris, respiratory pathologies such as asthma, disorders caused by a viral infection (especially by the respiratory route or by nebulization), disorders due to an inflammatory reaction (local injection instead of inflammation), disorders due to a bacterial infection, for the healing of diabetic wounds, bedsores.
  • composition according to the invention can also be used for the manufacture of mRNA vaccines, for the treatment of genetic diseases, autoimmune diseases and cancer.
  • composition according to the invention may very particularly be used for the treatment of myocardial infarction.
  • MI Myocardial infarction
  • myocardial cells mainly cardiomyocytes and endothelial cells.
  • the part of the myocardium affected by this ischemic episode is called the infarcted area.
  • the destruction of the blood clot by thrombolysis or crushing by primary angioplasty causes reperfusion of the infarcted zone of the myocardium.
  • the cardiomyocytes can thus return to a normal metabolism and function, after a period of stunning during which they have only a limited mechanical activity.
  • IDM Intra- coronary angioplasty
  • Limiting the size of the infarcted area can be achieved by inhibiting apoptotic cell death and stimulating the formation of new blood vessels, neoangiogenesis.
  • the increase in vascularization leads to an improvement in the oxygen and nutrients supply.
  • the viability of the cells, having survived ischemia and reperfusion, is thus maintained.
  • no anti-apoptotic and angiogenic treatment is used in clinical routine.
  • the biotechnology of A Nm transfer in the myocardium is particularly well adapted. Inhibition of apoptosis and formation of new blood vessels can be achieved by transient expression of a protein of the family of growth factors. Unlike gene therapy, mRNA transfer technology indeed forces a tissue to produce a therapeutic protein for only a few days.
  • composition according to the invention can also be used to improve the well-being of a patient, and in particular to fight against pain (especially postoperatively), for the healing of the skin.
  • the invention therefore also relates to the use of the composition according to the invention for combating pain or for promoting skin healing, especially in non-pathological conditions.
  • the invention also relates to a method of therapeutic treatment of one of these diseases or conditions comprising administering an effective amount of the composition to a patient in need thereof.
  • the invention finally relates to the use of a hypotonic composition comprising mRNA nanoparticles as defined above for improving the transfer efficiency of said mRNA in mammalian cells.
  • hypotonic composition is of osmolarity lower than 300 mosM, with a cation concentration of less than 150 mM.
  • it comprises:
  • potassium chloride and / or sodium chloride in a concentration ranging from 5 mM to 100 mM
  • Hepes buffer for adjusting the pH of the aqueous composition between 4 and 7 - trifluoroacetate in a concentration ranging from 1 ⁇ to 1000 ⁇
  • FIG. 1 Transfection of H9c2 cells with mRNA nanoparticles in the presence or absence of hypotonic shock. Measurement of luciferase activity (RLU / mg protein). From left to right: mRNA / pepMB1, isotonicity; MRNA / pepMB1 / pepMB2, isotonicity; Naked mRNA, hypotonic shock; MRNA / pepMB1, hypotonic shock; MRNA / pepMB1 / pepMB2, hypotonic shock
  • FIG. 2 Transfection of H9c2 cells with naked mRNA or mRNA nanoparticles by hypotonic shock. Measurement of luciferase activity (RLU / mg protein). Left: naked mRNA; Then, mRNA / pepMB1 / pepMB2 nanoparticles with a molar percentage of pepMB2 of 0 or 1.25 or 2.5 or 3.75
  • FIG. 3 Transfection of H9c2 cells with naked mRNA or mRNA nanoparticles into a solution containing 0 mM Hepes, pH5.5 and sodium chloride at a concentration of up to 145 mM.
  • FIG. 5 Transfection of H9c2 cells with mRNA nanoparticles in a solution containing 30, 40 and 50 mM KCl and 20 mM Hepes, pH 5.5. From left to right: NaCl salt at 40 mM; KCI salt at 30 mM; KCl salt at 40 mM; 50mM KCl salt
  • Figure 6 Transfection of H9c2 cells with mRNA nanoparticles into a solution containing 20 mM Hepes and 40 mM KCI, at a pH ranging from 5.5 to 8.5 without or with TFA.
  • Figure 8 Transfection of healthy rat myocardium with luciferase mRNA nanoparticles dissolved in solutions of variable tonicity. Measurement of luciferase activity (RLU / mg protein). The last histogram on the right corresponds to an isotonic solution. The others correspond to hypotonic solutions.
  • Figure 9 Rat model of myocardial infarction.
  • A representative section of a rat heart with a heart attack and placebo.
  • B a representative section of a rat heart having undergone infarction and received the mRNA vector encoding a growth factor. The asterisk indicates the position of the infarct.
  • the amount of mRNA introduced into cultured cells or cells of a tissue can be accurately estimated using the mRNA encoding a protein-label.
  • Luciferase is the most used protein-marker. It is detected by a specialized spectrophotometer, the luminometer.
  • the mixture was cooled to -20 ° C for one hour, before being centrifuged at maximum speed, for thirty minutes.
  • the DNA pellet was then resuspended in 50 ⁇ TE pH 8.0.
  • the concentration of the DNA solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm using a spectrophotometer.
  • the in vitro transcription of the linearized plasmid was carried out using the mMessage mMachine kit (Ambion). 4.65 ⁇ l of pure water were mixed with 10 ⁇ l of NTP / CAP 2 ⁇ , 2 ⁇ l of 10 ⁇ reaction buffer, 1.35 ⁇ l of linearized plasmid (1 ⁇ g of DNA) and 2 ⁇ l of enzyme mix. RNA synthesis was performed at 37 ° C for two hours in a dry bath. T7 RNA polymerase transcribed the luciferase gene through the T7 promoter located upstream of the gene. After transcription of the luciferase gene, a ⁇ of TURBO DNase was added, in order to degrade the plasmid and thus facilitate the subsequent purification of the mRNA.
  • a second purification step was carried out by lithium chloride precipitation.
  • LiCI Precipitation Solution Sixty ⁇ of LiCI Precipitation Solution was added to the 100 ⁇ eluate. The mixture was cooled to -20 ° C for 45 minutes, before being centrifuged at maximum speed at 4 ° C for 15 minutes. The pellet was washed with 500 ⁇ l of 70% ethanol and a last centrifugation was carried out at maximum speed at 4 ° C. for 5 minutes. The messenger RNA pellet, dried during a few minutes in the air, was resuspended in Hepes 20 mM pH 7.5. The concentration of the mRNA solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm, using a spectrophotometer.
  • the two peptides capable of interacting with the mRNA were synthesized by Proteogenix.
  • the amino acid sequence of A is: CRRRRRRRRC (pepMB1).
  • the lyophilizate was resuspended in 20 mM Hepes pH 7.5 at 1 mg / ml.
  • L-E-A The sequence of L-E-A 'is as follows: PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA-PEG (3.5 kDa) - CRRRRRRRRC (pepMB2). PEG (3.5 kDa) is 3.5 kilodaltons polyethylene glycol.
  • the lyophilizate of L-E-A ' was resuspended in 20 mM Hepes pH 7.5 at 100 ⁇ g / ml.
  • the concentrated solution of messenger RNA luciferase was diluted in 20 mM Hepes pH 7.5 to reach 100 ⁇ g / ml.
  • the solutions of pepMB1 and pepMB2 were successively mixed with 20 mM Hepes pH 7.5, in order to reach the necessary amount of peptides to condense the luciferase messenger RNA.
  • a volume of the peptide solution was then rapidly mixed by pipetting to one volume of the diluted RNA solution.
  • the assembly of the nanoparticles took place at room temperature for four hours.
  • the binding of the peptides to the RNA is very fast, whereas the oxidation of the cysteines at the ends of the peptides by the oxygen dissolved in the buffer is much slower.
  • the amount of peptides mixed with the luciferase messenger RNA depends on the +/- charge ratio that one wishes to achieve. At a + / - charge ratio of 2, enough peptides must be added so that there are two arginines on the peptides, for a phosphodiester bond at the level of the mRNA.
  • the H9c2 cell line derived from rat cardiomyoblasts was cultured in DMEM Glutamax (Gibco) supplemented with a mixture of penicillin and streptomycin and fetal calf serum (10% final). The culture was carried out at 37 ° C in flasks of 75 cm 2 (Corning). When the number of cells required for inoculation of a 48-well plate (Corning) was reached, the cells were detached from the bottom of the flask using 2.5 ml of TryPLE Select (Gibco) to 37 ° C, for 5 to 10 minutes. 7.5 ml of DMEM was added to neutralize the TryPLE Select.
  • the cells were centrifuged at 100 g for 10 minutes at room temperature. The cell pellet was then resuspended in DMEM. 250 ⁇ l of this cell suspension was added to each well of a 48-well plate and the latter was placed in an incubator at 37 ° C., containing 5% CO 2. About 16 hours later, the culture medium was replaced with 250 ⁇ l of DMEM, preheated to 37 ° C.
  • luciferase mRNA 16 ⁇ g
  • the mRNA solution was diluted with 160 ⁇ l of 20 mM Hepes pH7.5 in order to compare the naked RNA with the nanoparticles.
  • DMEM IX DMEM IX containing neither serum nor antibiotics were added to the solutions of naked RNA or nanoparticles, in order to constitute the hypotonic solutions of mRNA (the concentration in cations is approximately 55 mM).
  • the isotonic solutions (the cation concentration is approximately 160 mM) were obtained by mixing 320 ⁇ of nanoparticles in 20 mM Hepes pH 7.5 to 160 ⁇ l of DMEM 3X.
  • the DMEM (IX) culture medium is isotonic with respect to the interior of the cells.
  • the DMEM 3X medium is three times more concentrated: approximately 480 mM of cations.
  • the wells were emptied of the culture medium that they contained, in order to introduce 150 ⁇ of hypotonic or isotonic solution of nanoparticles or bare RNA (5 ⁇ g of mRNA per well). Cells were incubated for one hour at 37 ° C in an incubator. The solution of nanoparticles or naked mRNA was then aspirated and replaced with 250 ⁇ of DMEM. The cells were then incubated for 16 hours at 37 ° C in an incubator.
  • the culture medium was aspirated and replaced with 500 ⁇ l of Dulbecco's PBS IX.
  • the H9c2 cells were then lysed by the addition of 250 ⁇ l of lysis buffer (Luciferase Assay System, Promega).
  • the lysate of each well was centrifuged at maximum speed at 20 ° C for five minutes to clarify.
  • 20 ⁇ l of each cell lysate were introduced into a tube adapted to the luminometer (Berthold Technologies).
  • 100 ⁇ l of luciferase substrate (Promega) were added to the cell lysate by the luminometer. The latter then measured the amount of light emitted by the enzymatic reaction catalyzed by luciferase.
  • the results are expressed in relative light units (RLU).
  • RLU relative light units
  • the mRNA vector consisting of the single pepMB1 peptide transferred an extremely small amount of RNA into H9c2 cells (Fig.l).
  • the addition of peptide pepMB2 to the vector significantly improved luciferase mRNA transfer.
  • the efficiency of transfection remained very low ( ⁇ 10 5 RLU / mg protein).
  • the same vector consisting of pepMB1 and pepMB2 very efficiently transfected H9c2 cells (> 10 8 RLU / mg protein), when the vector solution was hypotonic (Fig.l).
  • RNA pellets and pepMB1 peptide were dissolved in demineralized water. One volume of the peptide solution was then rapidly mixed by pipetting to one volume of the RNA solution. The charge ratio ranged from 1.8 to 2.2. The assembly took place at room temperature for 15 minutes. Then, the RNA / pepMB1 complex solution was frozen with liquid nitrogen, in order to be lyophilized. The lyophilizate was stored at -20 ° C until use.
  • This lyophilizate was resuspended in various aqueous solutions optionally containing Hepes, NaCl, KCl and sodium trifluoroacetate.
  • the culture medium was aspirated and 150 ⁇ l of a solution of nanoparticles mRNA / pepMB1 were introduced into each well. Cells were incubated for 30 minutes at 37 ° C in an incubator. The solution Nanoparticles were then aspirated and replaced with 250 ⁇ DMEM. The cells were then incubated for 17 hours, at 37 ° C., in an incubator,
  • the luciferase / pepMB1 mRNA complex lyophilizate and a purified mRNA pellet were dissolved in a solution containing 20 mM Hepes, pH 5.5 and sodium chloride at a concentration of up to 145 mM.
  • the concentration of mRNA is 1 ⁇ g for 150 ⁇ of aqueous solution, that is to say that the concentration of nanoparticles is 13.3 ⁇ g / ml.
  • peptide pepMB1 increased the efficiency of transfection more than 100-fold (Fig. 3, last two histograms).
  • luciferase activity was 210 times higher than 145 mM (Fig.3).
  • RNA / pepMB1 nanoparticles The lyophilizate of RNA / pepMB1 nanoparticles was dissolved in a solution containing 40 mM NaCl and Hepes at a concentration of up to 100 mM.
  • concentration of mRNA is 1 ⁇ g for 150 ⁇ of aqueous solution, that is to say that the concentration of nanoparticles is 13.3 ⁇ g / ml.
  • the transfection efficiency was found to be maximal at 20 mM Hepes (Fig.4).
  • the luciferase mRNA vector lyophilizate was then dissolved in a solution containing 30, 40 and 50 mM KCl and 20 mM Hepes, pH 5.5.
  • the concentration of mRNA is 1 ⁇ g for 150 ⁇ l of aqueous solution, that is to say that the concentration of nanoparticles is 13.3 ng / ml.
  • the lyophilizate of nanoparticles was dissolved in a solution containing 20 mM Hepes and 40 mM KCl, at pH 5.5 to 8.5.
  • the concentration of mRNA is 1 ⁇ g for 150 ⁇ of aqueous solution, that is to say that the concentration of nanoparticles is 13.3 ⁇ g / ml.
  • the optimum pH was found to be 6.5 (Fig.6).
  • the mRNA vector was prepared at a charge ratio of 1.8 to 2.2.
  • the RNA / peptide complex lyophilizates were dissolved in a solution containing 20 mM Hepes, 40 mM KCl and 100 ⁇ l sodium trifluoroacetate at a final RNA concentration of 6.6 ⁇ g / ml or 250 ⁇ g / ml.
  • the 37.5-fold increase in A Nm vector concentration outside H9c2 cells resulted in an increase in transfection efficiency of 436 fold ( Fig.7).
  • the charge ratio for obtaining the best mRNA transfer efficiency was found to be 1.8 (Fig.7).
  • MRNA, pepMB1 and pepMB2 solutions were alternatively diluted in aqueous solutions containing sodium chloride, to obtain 24 mM, 68 mM, 112 mM and 160 mM sodium mRNA nanoparticle solutions. .
  • Sprague-Dawley rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (100 mg / kg body weight) and xylazine (10 mg / kg body weight). The animals then underwent intratracheal intubation. The tube was then connected to an artificial respirator.
  • An insulin syringe was filled with 60 ⁇ l of hypotonic solution of luciferase mRNA nanoparticles, corresponding to 3 ⁇ g of RNA per rat.
  • the solution was injected at a rate of 20 ⁇ per second into the wall of the left ventricle.
  • the thoracotomy was closed with staples.
  • the rats were placed in a cage filled with pure oxygen and watched until they woke up.
  • ketamine 500 mg / kg body weight
  • Their heart was explanted and a fragment of the wall of the ventricle left, corresponding to the region injected the day before, was removed and freed from the blood of the animal, using saline. This biopsy was cut into small pieces using a pair of scissors.
  • the various transfected myocardial biopsies were thawed at room temperature and refrozen at -80 ° C for 10 minutes. Three freeze / thaw cycles were performed to lyse the myocardial cells and release the luciferase protein encoded by the mRNA.
  • the tissue lysates were centrifuged at 13000 g at 20 ° C for five minutes.
  • the luciferase being present in the supernatant, 20 ⁇ of the latter were introduced into a tube for the determination of luciferase activity, using a luminometer. 10 ⁇ l of the supernatant were diluted in 90 ⁇ l of water for the determination of the total proteins, using the 660 nm Protein Assay kit (Pierce).
  • Infarction was caused on the ventral side of the left ventricle of Sprague-Dawley rats by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery via a thoracotomy. 60 ⁇ l of a placebo solution (hypotonic buffer) or 60 ⁇ l of a hypotonic solution of mRNA nanoparticles, as described in Example 4, coding for a growth factor, was then injected into the lateral face of the left ventricle. . The thoracotomy was closed and the animals sacrificed one week after the operation. The hearts were explanted and histological sections were taken in the area at risk of infarction. Six rats were included in each group. Control animals receiving placebo did experience significant myocardial destruction of their left ventricle. This is evidenced by the thinning of the ventricle wall at the level of the infarcted zone, as well as fibrosis characterized by collagen deposition (Fig. 9A).
  • the treatment with messenger RNA coding for a growth factor thus protected the myocardial zone at risk of infarction, in this animal model.

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Abstract

L'invention a pour objet une composition aqueuse comprenant des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, caractérisée en ce que - la composition est hypotonique et a une osmolarité inférieure à 300 mosM, - les nanoparticules d'ARNm comprennent de l'ARNm condensé en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques avec des composés cationiques de type A par formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. L'invention a également pour objet un kit comprenant des nanoparticules d'ARNm et une solution aqueuse hypotonique de reconstitution. L'invention concerne enfin l'utilisation thérapeutique de ces compositions hypotoniques.

Description

Composition aqueuse hypotonique comprenant des nanoparticules d'A Nm, kit et procédé de préparation
L'expression de protéines thérapeutiques dans un tissu pathologique peut actuellement être obtenue par l'administration de vecteurs de gène ou de protéines recombinantes produites in vitro.
Les vecteurs de gène ont trois grands défauts. Tout d'abord, le transgène peut s'intégrer de manière aléatoire dans le génome d'une cellule. Cela accroît le risque de transformation cellulaire, à l'origine de la survenue d'un cancer. Le niveau maximal d'expression de la protéine codée par le transgène est atteint 72 heures après l'injection du vecteur. Le traitement de certaines affections nécessiterait que le pic d'expression soit atteint dans les 24 premières heures suivant l'administration du produit pharmaceutique. De plus, le transgène s'exprime durablement, ce qui n'est pas approprié pour le traitement de pathologies aiguës, qui requiert une expression transitoire d'une protéine thérapeutique.
La production de protéines recombinantes est en plein essor. Cependant, ces protéines s'accumulent difficilement dans un tissu pathologique à partir de la circulation sanguine et le temps de résidence d'une protéine thérapeutique dans un tissu est de courte durée. Or, le traitement d'affections aiguës nécessite l'expression locale d'une protéine pendant plusieurs jours, afin d'obtenir un bénéfice clinique.
Ainsi, il existe une demande pour un système d'expression transitoire de protéines thérapeutiques extracellulaires, membranaires ou intracellulaires. La stratégie alternative à la protéine recombinante et à la thérapie génique est le transfert d'ARN messager (ARNm) codant pour une protéine thérapeutique.
Les avantages de l'ARN messager :
Le transfert d'un ARNm dans une cellule aboutit à l'expression transitoire de la protéine d'intérêt. En effet, l'ARNm et la protéine codée par celui-ci sont entièrement dégradés en nucléotides et acides aminés en l'espace de quelques jours. La réversibilité de l'expression protéique est un gage de sécurité pour le patient. Cette expression transitoire de protéines thérapeutiques permettrait d'éviter les effets délétères, qui peuvent résulter d'une expression durable et incontrôlée.
Un ARNm ne peut pas s'intégrer dans le génome, contrairement à une molécule d'ADN. L'absence totale de génotoxicité des vecteurs d'ARNm représente un avantage de poids par rapport aux vecteurs de gène. Cela contribue aussi à la grande sécurité de ce type de vecteur pour le patient. L'ARNm est introduit dans le cytosol de la cellule-cible, tandis que l'ADN d'un vecteur de gène doit être transféré dans le noyau. De plus, l'ARNm est d'emblée accessible aux ribosomes pour être traduit en protéine. Ainsi, l'expression de la protéine d'intérêt est plus précoce dans le cas d'un vecteur d'ARNm. Cela représente un avantage pour le traitement d'une pathologie aiguë, qui nécessite que la protéine thérapeutique apparaisse le plus tôt possible dans le tissu-cible.
Production d'ARN messager in vitro :
Dans un premier temps, un plasmide doit être construit par les techniques classiques de biologie moléculaire. Le gène codant pour la protéine d'intérêt est inséré dans le plasmide en aval du promoteur de l'ARN polymérase du phage T7. Le plasmide est amplifié, purifié et linéarisé en aval du gène d'intérêt par une enzyme de restriction.
Le plasmide linéarisé est ensuite incubé avec l'ARN polymérase T7 recombinante, les quatre ribonucléotides triphosphates et un analogue de coiffe. L'enzyme se fixe sur son promoteur et transcrit le gène jusqu'à l'extrémité de l'ADN.
L'ARNm ainsi produit est ensuite purifié par chromatographie d'affinité et par précipitation au chlorure de lithium. La concentration d'ARNm purifié est déterminée par mesure de son absorbance à 260 nm.
Caractéristiques générales d'un vecteur d'ARN messager :
Tout d'abord, l'ARNm doit être protégé et condensé sous la forme de particules nanométriques, constituant un vecteur, afin d'être hors d'atteinte des nucléases extracellulaires et lysosomales.
La nanoparticule doit aussi avantageusement exposer à sa surface une molécule susceptible d'interagir avec un ou des composants de la membrane plasmique des cellules-cible. Ce ligand permet ainsi l'adsorption de la nanoparticule sur la surface cellulaire, afin de favoriser son internalisation par endocytose.
L'invention a pour objet une composition aqueuse comprenant des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique.
Il a été démontré qu'il est possible d'obtenir des nanoparticules d'ARNm comprenant de l'ARNm condensé avec des composés cationiques dans des conditions hypotoniques. Ces nanoparticules comprenant de l'ARNm condensé vont pouvoir pénétrer dans les cellules de mammifères où ils vont libérer l'ARNm.
Il a été découvert, de manière surprenante, un effet synergique entre une solution aqueuse hypotonique, avantageusement contenant 40 mM de KCI, 20 mM d'Hepes pH 5,5 et de 100 μΜ de trifluoroacétate, et la formation de nanoparticules ARNm / peptide cationique dissoutes à une concentration élevée dans cette solution aqueuse, pour le transfert d'A Nm dans des cellules de mammifères.
Une solution hypotonique est une solution dont la tonicité, c'est-à-dire l'osmolarité efficace, est très inférieure à celle du milieu intracellulaire de la cellule cible.
L'invention a pour objet une composition aqueuse comprenant des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, caractérisée en ce que
- la composition est hypotonique et a une osmolarité inférieure à 300 mosM,
- les nanoparticules d'ARNm comprennent de l'ARNm condensé en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques avec des composés cationiques de type
A par formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères.
Un effet de synergie entre la composition et les nanoparticules est observé : amélioration significative du transfert d'ARNm lorsque les nanoparticules sont administrées dans une composition hypotonique.
Les nanoparticules sont en suspension dans la composition aqueuse, avantageusement sans qu'elles ne précipitent. La composition comprend avantageusement lesdites nanoparticules d'ARNm en une concentration telle que la concentration en ARNm soit supérieure à 50 μg/ml, plus avantageusement supérieure à 100 μg/ml, encore plus avantageusement supérieure à 200 μg/ml. Par exemple, le volume de la solution hypotonique peut être ajusté de sorte que la concentration finale en ARNm soit de 250 μg d'ARN / ml. La concentration maximale dépend de la solubilité des nanoparticules dans la solution hypotonique. Cette concentration relativement élevée de vecteur permet de ne pas injecter un volume de solution aqueuse trop élevé, dans un tissu animal ou humain. Le volume à injecter peut varier de 10 μΙ à 5 ml.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une solution hypo-osmotique capable d'induire un choc hypotonique. La composition aqueuse hypotonique a avantageusement une osmolarité inférieure à 300 mosM, avantageusement inférieure à 200 mosM, par exemple compris entre 0 mosM et 200 mosM.
On utilise de préférence une composition dépourvue de cations multivalents. Dans la composition selon l'invention, la concentration en cations est avantageusement inférieure à 150 mM, plus avantageusement inférieure à 100 mM.
La composition comprend avantageusement du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM, plus avantageusement de 20 mM à 60 mM. On préfère le chlorure de potassium, avantageusement à une concentration de 40 mM. La composition comprend avantageusement du tampon Hepes permettant d'ajuster le pH de la composition aqueuse entre 4 et 7 ; les bornes étant incluses. Une caractéristique essentielle du tampon est qu'il ne contient pas d'ions divalents ou multivalents. En fonction du pH visé et de l'osmolarité visée, on utilisera le tampon Hepes sous sa forme acide et/ou sous sa forme basique.
La composition comprend avantageusement du tampon Hepes en une concentration allant de 1 mM à 80 mM, plus avantageusement de 5 mM à 50 mM, encore plus avantageusement de 8 mM à 40 mM, encore plus avantageusement de 10 mM à 30 mM. On préfère tout particulièrement une concentration de 20 mM, en particulier lorsque le tampon Hepes est utilisé sous sa forme acide.
En particulier, pour une solution hypotonique contenant 40 mM de chlorure de potassium tamponnée avec de l'Hepes, sous sa forme acide, il a été démontré que l'efficacité maximale du transfert d'ARNm est obtenue à la concentration d'Hepes de 20 mM. A cette concentration en Hepes, le pH de la solution est de 5,5. On désignera par l'expression « Hepes pH X » un tampon Hepes qui permet d'ajuster le pH de la composition aqueuse à X.
II a été démontré que le pH optimum en termes d'efficacité du transfert d'ARNm est de 6,5 pour une composition comprenant du KCI et le tampon Hepes.
Il a été découvert, de manière surprenante, que l'ajout dans la composition d'acide trifluoroacétique, permet d'augmenter notablement l'efficacité du transfert d'ARNm par rapport au même vecteur préparé avec un lot de peptide cationique dépourvu d'acide trifluoroacétique.
La composition comprend avantageusement de l'acide trifluoroacétique en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ, plus avantageusement 3 μΜ à 300 μΜ.
L'acide trifluoroacétique est avantageusement utilisé sous sa forme sel, avantageusement le trifluoroacétate de sodium.
Ainsi, par l'ajout de trifluoroacétate de sodium, l'efficacité du transfert d'ARNm a été augmentée à pH 6,5 et plus encore si le pH est ramené à 5,5. Il a été démontré que la concentration efficace et non toxique du trifluoroacétate de sodium est de 100 μΜ.
Une composition tout particulièrement préférée est une composition aqueuse hypotonique comprenant 40 mM de KCI, 20 mM d'Hepes pH 5,5 et 100 μΜ de trifluoroacétate. Avantageusement, la composition ne comprend pas d'autres composés source de cations sodium ou potassium ; et plus avantageusement pas d'autres composés source de cations. De même, avantageusement, la composition ne comprend pas d'autres composés affectant sensiblement son osmolarité, c'est-à-dire d'un ordre de grandeur supérieur à 10 mOsM. Cette composition peut également comprendre une ou plusieurs molécule(s) non chargée(s), telle(s) que le glucose, le mannitol, le saccharose. Ces molécules peuvent être présentes dès l'assemblage des nanoparticules dans la première variante du procédé de préparation, qui sera décrit ci-après.
L'efficacité de l'introduction de l'ARNm dans les cellules dépend du degré d'hypotonicité de la solution de nanoparticules. In vivo, une solution légèrement hypotonique apporte un bénéfice modéré, tandis qu'une solution à très faible osmolarité améliore grandement l'entrée de la nanoparticule dans les cellules. In vitro, il a été démontré que la concentration optimale de chlorure de sodium, en termes d'efficacité du transfert d'ARNm dans des cellules en culture, est de 40 mM. La substitution du chlorure de sodium par du chlorure de potassium améliore davantage l'efficacité du transfert d'ARNm. Il a ensuite été démontré que la concentration optimale de chlorure de potassium (KCI) est aussi de 40 mM.
Lorsqu'une cellule de mammifère est incubée dans un milieu hypo-osmotique, elle subit un choc hypotonique. En effet, l'eau rentre dans la cellule, ce qui étire sa membrane plasmique. Cette traction ouvre des canaux calciques, qui permettent la fusion de vésicules intracellulaires avec la membrane plasmique, par exocytose. Cela augmente la superficie de la membrane plasmique et prévient l'éclatement de la cellule.
Par la suite, de l'ATP est libéré dans le milieu extracellulaire. L'ATP se fixe et active des récepteurs purinergiques P2Y. Une voie de transduction du signal entraîne l'ouverture de canaux potassique et chlorure. La baisse de l'osmolarité intracellulaire et l'augmentation de l'osmolarité extracellulaire draine l'eau à l'extérieur de la cellule. Le volume de cette dernière diminue, ce qui autorise l'internalisation de l'excès de membrane plasmique issu de la fusion de vésicules intracellulaires. Cette endocytose massive peut être exploitée par le vecteur d'ARNm pour pénétrer dans la cellule.
A l'intérieur de la cellule, le vecteur atteint des compartiments intracellulaires, tels que des endosomes. Il semble que le choc hypotonique perméabilise transitoirement les membranes de ces compartiments intracellulaires, ce qui permet au vecteur de s'en échapper et d'atteindre le cytosol. Dans le cytosol, le vecteur libère progressivement l'ARN messager grâce à des agents réducteurs, tel que le glutathion. A la force ionique prévalent dans le cytosol, les charges positives des composés A et A' (avantageusement du peptide cationique) ne suffisent pas pour maintenir l'intégrité de la nanoparticule. L'ARNm est ainsi progressivement dénudé. Il devient alors accessible aux facteurs de traduction et aux ribosomes. La protéine d'intérêt est alors produite par la cellule transfectée. L'invention repose sur deux éléments complémentaires, qui agissent de manière synergique : la nanoparticule d'ARNm et le tampon hypotonique dans lequel elle est en suspension. Lorsque la nanoparticule est constituée de peptides, ces molécules sont dégradées par les cellules en acides aminés, qui peuvent ensuite être recyclés par celles-ci pour la synthèse de protéines cellulaires.
Lors du choc hypotonique, des ions potassium doivent sortir de la cellule en passant à travers un canal potassique. Il a été démontré qu'à faible pH, l'ouverture de ce canal potassique est inhibé. Cela pourrait inhiber le transfert d'ARNm. Il a été également démontré que le trifluoroacétate active l'ouverture de ce canal potassique (Trifluoroacetic acid activâtes ATP- sensitive K(+) channels in rabbit ventricular myocytes, Han J et al., Biochem Biophys Res Commun 2001, 285(5) : 1136-42). Le trifluoroacétate de sodium lèverait l'inhibition du canal potassique et préviendrait l'inhibition du choc hypotonique ayant lieu à faible pH.
L'Hepes à pH 5,5 serait internalisé par endocytose par les cellules en même temps que les nanoparticules peptide/ ARNm. L'Hepes tamponnerait le pH endosomal à 5,5 inhibant ainsi la baisse de pH nécessaire pour que le vecteur d'ARNm soit transféré dans les lysosomes. Or, ces derniers contiennent des enzymes capables de dégrader l'ARN. L'Hepes augmenterait ainsi le temps de résidence du vecteur d'ARNm dans les endosomes, lui permettant ainsi de s'en échapper pour passer dans le cytosol, où a lieu la traduction en protéine. L'invention a pour objet des compositions comprenant des nanoparticules d'ARN messager
(ARNm) codant pour une protéine thérapeutique par l'utilisation d'un composé cationique, tel qu'un peptide cationique. Ce dernier possède deux fonctions : condenser l'ARNm en nanoparticules pour favoriser son entrée dans les cellules de mammifères par endocytose et protéger l'ARNm vis-à-vis de RNases, enzymes capables de digérer l'ARN. Ces deux fonctions participent au transfert de l'ARNm dans les cellules, afin qu'il soit traduit en protéine par les ribosomes.
Les nanoparticules comprennent avantageusement également des composés de type A'-E-
L, où
A' est un composé cationique, permettant lui aussi la condensation de l'ARNm, par liaisons non covalentes avec l'ARNm réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères
E est un espaceur non chargé et soluble dans l'eau
L est un peptide ligand neutre ou quasi-neutre Neutre ou quasi neutre signifie que le ligand n'est pas chargé ou qu'il comprend des charges positives et des charges négatives qui s'équilibrent ou s'équilibrent presque.
Les composés cationiques de type A ou de type A' répondent à la même définition générique. Ils peuvent être identiques ou différents, ils sont avantageusement identiques.
Les composés cationiques de type A ou de type A' possèdent des charges positives, qui peuvent interagir avec les charges négatives portées par l'ARN, ce qui aboutit à la condensation de ce dernier en nanoparticule.
Un vecteur est une nanoparticule contenant de l'ARN messager. Au sein de la nanoparticule, l'ARNm est condensé et protégé vis-à-vis des nucléases. De plus, la nanoparticule peut aussi exhiber un peptide ligand à sa surface. L'assemblage des nanoparticules implique donc que des interactions s'établissent entre la molécule d'ARNm et la ou les molécules de condensation de l'ARN. On décrit ci-après particulièrement des peptides, car ces derniers sont biodégradables et aisément synthétisés chimiquement. Les interactions les plus fréquemment utilisées pour fixer l'ARN à la molécule de condensation de ce dernier, sont les interactions électrostatiques. En effet, l'ARN est un long polyanion. Une molécule portant plusieurs charges positives ou un assemblage de molécules portant une seule charge positive peuvent interagir avec de l'ARN et former une particule. D'autres interactions non covalentes peuvent compléter ces interactions électrostatiques, parmi lesquelles les interactions hydrogène, Van der Walls et hydrophobes.
La stabilité des nanoparticules peut également être augmentée par multimérisation des composés cationiques entre eux, les liaisons formées étant toutefois réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. Ainsi, par exemple, des ponts disulfure sont rompus par des composés réducteurs, tel que le glutathion. Cette multimérisation peut faire suite à une oxydation, par exemple les groupements thiols présents aux extrémités peuvent s'oxyder en présence de l'oxygène dissout dans le milieu pour former des ponts disulfure. Ainsi, avantageusement, le composé cationique de type A, et/ou le cas échéant le composé cationique de type A', comprend des groupements capables de former des liaisons intermoléculaires réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères. Les liaisons intermoléculaires sont avantageusement des liaisons covalentes réversibles, en particulier des ponts disulfures.
Bien entendu, on préfère utiliser un composé cationique de type A , et le cas échéant un composé cationique de type A', soluble dans l'eau. Le composé cationique de type A ou A' est avantageusement choisi dans le groupe constitué des peptides cationiques, des lipides cationiques sous forme de liposomes, des polymères cationiques, et des tensioactifs cationiques sous forme de micelles.
En particulier, le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule Xm-(Y)n-X'p dans laquelle
X et X' sont identiques ou différents et représentent chacun une molécule portant un groupement thiol
m vaut 0 ou 1
p vaut 0 ou 1
- Y est un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé dont la chaîne latérale est chargée positivement, et
n est un nombre entier allant de 4 à 20.
Avantageusement, X et X' représentent chacun un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé ou homologue d'acide aminé portant un groupement thiol, avantageusement la cystéine ou l'homocystéine.
Y représente avantageusement un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule NH2- alk-COOH où
alk représente une chaîne alkyle linéaire, comprenant de 3 à 8 atomes de carbones, un de ces atomes de carbones pouvant être substitué par un atome d'azote
- alk est substituée par un radical , où R représente un radical chargé positivement au pH du milieu, avantageusement un radical NH2 ;
alk peut également être substituée, en particulier par une fonction =Het, où Het représente O ou NH.
Y est avantageusement choisi parmi l'arginine, la lysine et l'ornithine, de préférence l'arginine, chargés positivement au pH du milieu. En particulier, le peptide cationique est choisi parmi les peptides de séquences suivantes :
(SEQ ID N°: 1 à 24)
Cys(Arg8)Cys, Cys(Arg9)Cys, Cys(Arg10)Cys, Cys(Argu)Cys, Cys(Arg12)Cys, Cys(Arg13)Cys, Cys(Arg14)Cys, Cys(Arg15)Cys; Cys(Lys8)Cys, Cys(Lys9)Cys, Cys(Lys10)Cys, Cys(Lysu)Cys, Cys(Lys12)Cys, Cys(Lys13)Cys, Cys(Lys14)Cys, Cys(Lys15)Cys; Cys(Orn8)Cys, Cys(Orn9)Cys, Cys(Orn10)Cys, Cys(Ornn)Cys, Cys(Orni2)Cys, Cys(Orni3)Cys, Cys(Orni4)Cys, et Cys(Orni5)Cys.
Dans une autre variante, X représente un acide organique portant une fonction thiol, avantageusement l'acide thioglycolique, et X' représente un aminothiol, avantageusement la cystéamine. Lors de l'assemblage des nanoparticules, un processus d'oxydation s'opère entre les groupements thiols créant de nouvelles liaisons covalentes (ponts disulfure). Le plus souvent, l'oxygène dissout présent dans le milieu est suffisant pour que les réactions d'oxydation aient lieu. Cette multimérisation du peptide cationique au contact de l'A Nm, apporte une grande stabilité à l'assemblage d'ARNm et de peptides, ce qui permet d'augmenter la stabilité des nanoparticules qui ne se dissocient pas dans le milieu extracellulaire, après leur injection dans un tissu.
tto Des peptides cationiques dotés de cystéines terminales ont été décris par l'équipe de Kevin Rice (Low Molecular Weight Disulfide Cross-linking Peptides as Nonviral Gene Delivery Carriers, McKenzie DL et al., Bioconjugate Chem. 2000, 11, 901-909) pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules de mammifères.
E est un espaceur (ou en anglais spacer) non chargé et soluble dans l'eau. Par non chargé, on entend que la molécule ne comprend pas de charges électriques. On préfère utiliser des molécules biodégradables, dont les produits de dégradation sont des métabolites non toxiques pour les cellules de mammifères.
Avantageusement, l'espaceur est un polymère hydrosoluble, linéaire ou réticulé, ayant une taille variant de 0,5 kDa à 50 kDa, avantageusement de 0,5 à 20 kDa, plus avantageusement de 2 kDa à 5 kDa. Pour permettre de dissoudre aisément le composé A'-E-L, sous forme lyophilisée, dans le milieu aqueux, on utilise avantageusement un polymère solu ble dans l'eau. On préfère les polymères considérés comme étant non toxiques. Plus particulièrement, l'espaceur est choisi parmi le polyéthylène glycol (PEG), les poly(hydroxyalkyl)-L-glutamine et les poly(hydroxyalkyl)-L- asparagine ; où les groupements alkyles sont avantageusement des alkyles en Ci-C4, plus avantageusement le radical éthyle. Les produits de dégradation de ces deux derniers composés sont l'éthanolamine et le glutamate ou l'aspartate. On peut aussi tout particulièrement utiliser le PEG de 2 à 5 kDa, encore plus particulièrement de 3,5 kDa.
Les composés A'-E-L comprennent à leur extrémité un peptide ligand, L. Ce dernier se fixe à des molécules présentes dans la membrane plasmique, ce qui permet à la nanoparticule de s'adsorber sur la surface cellulaire.
La nanoparticule d'ARN messager et le choc hypotonique servent à favoriser l'introduction de l'ARNm dans les cellules-cibles. La présence d'un peptide ligand permet à la nanoparticule de se fixer sur la membrane plasmique, afin d'être ultérieurement endocytée. Cela améliore l'efficacité de l'entrée de l'ARNm dans les cellules. Le choix du peptide ligand s'est porté sur un peptide pénétrant les cellules (CPP). La première caractéristique d'un CPP est de se fixer à la membrane plasmique et d'être internalisé par une cellule.
Le peptide ligand est avantageusement choisi parmi les peptides de pénétration cellulaire ou CPP, notamment de cellules de mammifères, les ligands RGD, la transferrine, le folate, les anticorps, les ligands d'un récepteur (par exemple : cytokines, hormones, facteurs de croissance), les petites molécules (par exemple : carbohydrates tels que mannose or galactose ou ligands synthétiques), les agonistes de petites molécules, les inhibiteurs ou antagonistes de récepteurs (par exemple : RGD peptidomimétiques analogues).
Avantageusement, le peptide ligand est de formule PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25). Pour ce peptide, il a été démontré qu'il est capable de se fixer à la membrane plasmique et d'être internalisé par une cellule. Cela a été démontré en conjuguant un composé marqueur au CPP, en incubant des cellules en culture avec le CPP marqué et en suivant l'entrée du CPP dans ces cellules (Screening of cell-penetrating peptides using mRNA display, Jae-Hun Lee et al., Biotechnol. J 2012, 7, 387-396). De plus, la démonstration a été faite avec un CPP conjugué à une grande molécule ou une particule, afin de prouver que le CPP possède cette caractéristique de pénétration dans les cellules dans le contexte d'un assemblage macromoléculaire. En effet, il ne faut pas que le CPP soit efficace isolément et inefficace lorsqu'il est présent à la surface d'une nanoparticule d'ARNm.
Après son injection dans un tissu, la nanoparticule d'ARNm doit se fixer sur les cellules, non seulement pour y pénétrer, mais aussi pour que la nanoparticule diffuse le moins possible en dehors de ce tissu. Cette rétention de la nanoparticule par le tissu dans lequel il a été injecté, est importante, car l'ARNm ne doit pas être introduit dans les cellules d'autres organes. Il doit y avoir le moins possible d'expression ectopique de la protéine codée par l'ARN messager.
Le CPP ne doit pas être notablement chargé positivement ou négativement. En effet, seuls les peptides cationiques de type A et A' doivent interagir avec les groupements phosphodiester de l'ARNm. La présence d'un nombre important de charges électriques sur le CPP, lui permettrait d'interagir soit avec l'ARN soit avec le composé cationique. Cela altérerait profondément la formation des nanoparticules d'ARNm. Le CPP choisit, PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA, possède trois charges positives pour une charge négative dispersées dans l'ensemble de la séquence. Il possède donc toutes les caractéristiques nécessaires.
Un CPP cationique interagirait également in vivo avec la matrice extracellulaire présente dans le tissu injecté. Le vecteur d'ARNm serait ainsi retenu sur la matrice extracellulaire au lieu de pénétrer dans les cellules. L'efficacité de l'introduction de l'ARNm dans les cellules-cibles serait donc très faible. Le composé A'-E-L lyophilisé doit facilement se dissoudre dans de l'eau déminéralisée. Cela implique que la portion CPP de ce composé doit avantageusement être soluble dans l'eau, elle aussi. Cela est le cas du CPP choisit. Il faut éviter tout CPP hydrophobe, comportant trop de phénylalanine, leucine, isoleucine, alanine, valine, cystéine et méthionine, et trop peu d'acides aminés hydrophiles, tels que l'arginine, la lysine, l'histidine, l'acide glutamique, l'acide aspartique, la proline, l'asparagine et la glutamine.
Dans une variante préférée de l'invention, le composé cationique de type A est le peptide cationique Cys(Arg8)Cys (SEQ ID n°l).
Dans une variante préférée de l'invention, le composé de type A'-E-L est le peptide cationique Cys(Arg8)Cys (SEQ ID n°l) prolongé à son extrémité N-terminale par du polyéthylène glycol conjugué à un peptide ligand. On préfère le PEG de 2 à 5 kDa, plus particulièrement de 3,5 kDa. Le peptide ligand est avantageusement de formule PQ DTVGG TTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25).
La nanoparticule est très stable à l'extérieur des cellules, où l'environnement est oxydant.
La nanoparticule ne se dissocie pas et ne s'agrège pas à l'extérieur des cellules.
En présence des composés A'-E-L, l'espaceur n'étant pas chargé, au cours de l'assemblage de la nanoparticule, le ligand se retrouve préférentiellement à la surface de la nanoparticule. L ligand peut ainsi être efficacement exposé, afin d'interagir avec la membrane plasmique des cellules-cibles. Ainsi, les groupements L sont majoritairement en surface externe.
Les nanoparticules ont avantageusement une taille inférieure à 200 nm, plus avantageusement inférieure à 100 nm. La taille de nanoparticules peut être mesurée par microscopie électronique. Elle peut aussi être mesurée par diffraction de la lumière d'un laser
(dynamic light scattering) émise par un « particle sizer ».
A concentration saline supérieure, les particules sont significativement plus grosses qu'à faible osmolarité et ont tendance à s'agréger avec le temps. Or, il est indispensable que le vecteur d'ARNm soit de petite taille (avantageusement < 200 nm), afin de pénétrer efficacement dans les cellules-cibles par endocytose.
Comme exposé ci-avant, les nanoparticules sont obtenues par condensation et éventuellement multimérisation. Les multimères de peptides comportent des dizaines, voire des centaines de radical Y (avantageusement des arginines).
La présence du composé A-E-L est facultative. L'assemblage du vecteur d'ARNm peut être obtenu par le mélange d'une solution d'ARN et d'une solution contenant soit le seul peptide cationique X-(Y)n-X, soit le peptide cationique et le composé A'-E-L. La quantité de peptide complexé à l'ARNm a été précisément fixée. Il doit y avoir un excès de charges négatives à la surface de la nanoparticule, provenant de l'ARNm, afin d'éviter l'immobilisation du vecteur sur la matrice extracellulaire présente dans les tissus. En effet, si la nanoparticule était chargée positivement, elle se fixerait aux glycosaminoglycanes de la matrice extracellulaire au site d'injection. Le vecteur ne pourrait donc pas pénétrer abondamment dans les cellules.
De plus, si la quantité de peptide cationique est suffisante pour former une nanoparticule avec l'ARNm, mais n'est pas trop élevée, l'ARNm est plus rapidement libéré dans le cytosol des cellules, afin d'être traduit précocement en protéine.
La quantité de composé de type A et le cas échéant de composé A'-E-L, mélangé à l'ARNm dépend du ratio de charges positives / négatives que l'on souhaite atteindre. Avantageusement, ce ratio varie de 1 à 3, plus avantageusement de 1,5 à 2,5. Le ratio de charge +/- est le rapport entre le nombre total de charges positives portées par l'ensemble des peptides et le nombre total de charges négatives portées par l'ensemble des molécules d'ARN. Il a été découvert que le ratio de charge +/- du vecteur ARNm / peptide cationique donnant les meilleurs résultats, en termes de transfert d'ARNm, varie de 1,4 à 2,2, plus avantageusement de 1,6 à 2,2, encore plus avantageusement de 1,6 à 2,0.
Le ratio molaire composé de type A / composé A'-E-L varie avantageusement de 99 % / 1 % à 96 % / 4 %.
L'assemblage du vecteur peut être obtenu de différentes manières.
L'invention a notamment pour objet un procédé de préparation de nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, comprenant la condensation d'ARNm avec des composés cationiques de type A en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques, conduisant à la formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères.
Il a été découvert qu'en condensant l'ARNm, avec les composés cationiques de type A, dans des conditions hypotoniques on obtient des nanoparticules, stables ne précipitant pas dans le milieu. Par stable, on entend que l'ARNm assemblé avec les composés cationiques de type A, autrement appelé ici nanoparticule ou vecteur, ne se dissocie pas dans le milieu extracellulaire.
Le milieu dans lequel l'ARNm est assemblé avec les composés cationiques de type A est un milieu aqueux hypotonique. Avantageusement, le pH du milieu est compris entre 6,5 et 8,5 inclus, avantageusement entre 7 et 7,5 inclus. Le milieu comprend avantageusement un tampon hypotonique préférentiellement constitué d'un ou de cation(s) monovalent(s). En particulier, le tampon est l'Hepes de sodium. On utilise de préférence un milieu dépourvu de cations multivalents. Avantageusement, la grande majorité des cations dans le milieu est apportée par le tampon. La concentration en cations du milieu est avantageusement inférieure à 150 mM, plus avantageusement inférieure à 100 mM.
Le milieu a avantageusement une osmolarité inférieure à 300 mosM, avantageusement comprise entre 0 et 200 mosM.
L'assemblage, encore appelé condensation, de l'A Nm dans ces conditions permet d'obtenir des nanoparticules d'ARNm ayant une taille inférieure ou égale à 200 nm, avantageusement inférieure ou égale à 100 nm.
Le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a. Préparer un milieu aqueux tamponné comprenant l'ARNm,
b. Préparer un milieu aqueux tamponné comprenant le composé cationique de type A, et le cas échéant le composé A'-E-L, tel(s) que défini(s) précédemment,
c. Mélanger pendant un court laps de temps le milieu aqueux préparé à l'étape b) et le milieu aqueux de l'étape a).
Les deux milieux des étapes a) et b) sont hypotoniques. En particulier, le milieu de l'étape a) a une concentration en cations inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 100 mM, et le milieu de l'étape b) a une concentration en cations inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 100 mM.
A l'étape a) et à l'étape b), les tampons sont des tampons monovalents, tels que l'Hepes de sodium. Le choix s'est porté sur l'Hepes, car ce dernier peut être utilisé dans les produits de santé administrés aux patients. Cependant, d'autres tampons peuvent être utilisés, à l'exclusion de ceux qui contiennent des ions divalents ou multivalents. Par exemple, le tampon phosphate ne peut pas être utilisé, car le phosphate est présent sous une forme divalente (P04 2~). Cet anion divalent interagit, en compétition avec l'ARNm, avec les charges positives des composés de type A ou A' (en particulier des arginines des peptides cationiques). Cela aboutit également à la formation de grosses particules ARNm. Tout tampon ajusté à pH 7-7,5, constitué d'ions monovalents, peut remplacer l'Hepes de sodium.
Le ratio volumique milieu de l'étape a) : milieu de l'étape b) varie avantageusement de
1:100 à 100:1, plus avantageusement il est de 1:1.
Les nanoparticules d'ARNm sont assemblées en mélangeant les milieux des étapes a) et b). Avantageusement on introduit le milieu de l'étape b) dans celui de l'étape a). Cependant, l'ordre inverse est possible. Après ajout, on mélange le plus rapidement possible (de 1 à 10 secondes selon l'échelle de production), afin d'obtenir un mélange homogène. Cette homogénéité est importante, car elle permet à chaque molécule d'ARN de se complexer à un nombre similaire d'exemplaires des composés de type A et des composés A'-E-L et de former une population de nanoparticules ayant un diamètre semblable.
Avantageusement, l'assemblage des nanoparticules a lieu à température ambiante (soit 20- 25°C), pendant un temps suffisant, le plus souvent quelques heures.
L'assemblage des nanoparticules a lieu dans une solution à très faible concentration saline, c'est-à-dire hypo-osmotique ou hypotonique. En effet, les cations et les anions dissous dans une solution aqueuse sont en compétition avec les radicaux chargés positivement des composés A et A' (par exemple arginines du peptide cationique) et les groupements phosphodiester de l'ARN. A concentration saline supérieure ou égale à 150 mM (NaCI par exemple), les particules peptides / ARN sont significativement plus grosses qu'à faible osmolarité et ont tendance à s'agréger avec le temps.
Le milieu de l'étape b) peut facilement être préparé par ajout du composé cationique de type A, et le cas échéant le composé A'-E-L, sous forme lyophilisée dans la solution aqueuse tamponnée.
Dans une autre variante, l'assemblage du vecteur est obtenu en mélangeant une solution d'ARNm dissout dans de l'eau déminéralisée et une solution de composé cationique, avantageusement de peptide, dissout dans de l'eau déminéralisée. Le mélange est incubé pendant 15 minutes, à température ambiante. Le mélange des solutions d'ARN et de peptide doit être le plus rapide possible, afin d'être homogène. Cette homogénéité est importante, car elle permet à chaque molécule d'ARN de se complexer à un nombre similaire d'exemplaires de peptides et de former une population de nanoparticules ayant un diamètre semblable.
Le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes :
a. Préparer un milieu aqueux déminéralisé comprenant l'ARNm,
b. Préparer un milieu aqueux déminéralisé comprenant le composé cationique de type A, et le cas échéant le composé A'-E-L, tel(s) que défini(s) précédemment, c. Mélanger pendant un court laps de temps le milieu aqueux préparé à l'étape b) et le milieu aqueux de l'étape a) ;
d. Incubation du mélange à température ambiante, avantageusement pendant 15 mm.
e. Lyophilisation du mélange obtenu suite à l'étape précédente Le ratio volumique entre les deux solutions aqueuses est plus avantageusement 1 : 1. Pour favoriser la formation de complexes de petite taille (< 100 nm), la concentration de TARN est avantageusement inférieure ou égale à 100 μg ARN / ml, à l'issu du mélange.
La lyophilisation est conduite selon les modes opératoires connus de l'homme de l'art. Avantageusement, le mélange ARN / peptide est congelé par l'utilisation d'azote liquide (ou tout autre moyen permettant une congélation rapide) et lyophilisé.
Les solutions aqueuses doivent être déminéralisées pour deux raisons. Plus la force ionique est élevée, plus les particules peptide cationique / ARNm sont volumineuses. Or, elles doivent être de petite taille, afin de pénétrer efficacement dans les cellules de mammifères par endocytose. La lyophilisation permet de conserver le vecteur, sur le long terme, sous la forme d'un lyophilisât, à -20°C. La lyophilisation n'élimine pas les ions. Si la solution aqueuse contenait des ions, l'osmolarité de la solution de vecteur serait plus élevée après la lyophilisation, lors de la dissolution du vecteur dans un plus faible volume d'eau que celui utilisé lors de l'assemblage.
La lyophilisation permet également la reconstitution extemporanée de la suspension de vecteur.
Ainsi, dans la composition telle que décrite précédemment, les nanoparticules peuvent être des nanoparticules obtenues par la première variante du procédé. La composition peut être identique ou différente de celle utilisée pour la préparation des nanoparticules. Dans une autre variante, la composition est obtenue par reconstitution du lyophilisât de nanoparticules (deuxième variante du procédé).
L'invention a également pour objet un kit comprenant :
i. Une solution aqueuse hypotonique, d'osmolarité inférieure à 300 mosM, de concentration en cations inférieure à 150 mM,
ii. Des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, telles que définies précédemment.
Cette solution aqueuse hypotonique peut être dénommée solution de reconstitution. En particulier, la solution hypotonique de l'étape i) est telle que décrit précédemment. Avantageusement, elle comprend :
- Du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM - Du tampon Hepes, permettant d'ajuster le pH de la composition aqueuse entre 4 et 7, les bornes étant incluses
- Du trifluoroacétate en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ Avantageusement, la solution hypotonique de l'étape i) ne comprend pas d'autres composés source de cations sodium ou potassium ; et plus avantageusement pas d'autres composés source de cations. De même, avantageusement, la solution hypotonique de l'étape i) ne comprend pas d'autres composés affectant sensiblement son osmolarité, c'est-à-dire d'un ordre de grandeur supérieur à 10 mOsM.
Cette solution hypotonique de l'étape i) peut également comprendre une ou plusieurs molécule(s) non chargée(s), telle(s) que le glucose, le mannitol, le saccharose.
Les nanoparticules sont avantageusement sous une forme lyophilisée. Le lyophilisât est préparé tel que décrit précédemment. En particulier, les solutions aqueuses lyophilisées ne comprennent pas d'ions. L'invention a enfin pour objet une composition selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament. L'indication thérapeutique va bien entendu dépendre de la protéine qui va pouvoir être codée par l'ARNm.
L'invention présente le grand avantage que, contrairement à la thérapie génique, le transfert d'ARNm oblige un tissu à ne produire une protéine thérapeutique que pendant quelques jours.
En particulier, la composition peut être utilisée pour traiter ou prévenir des maladies, des troubles ou des états pathologiques, choisis parmi les pathologies cardiaques telles que l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine, les pathologies respiratoires telles que l'asthme, les troubles dues à une infection virale (notamment par voie respiratoire ou par nébulisation), les troubles dues à une réaction inflammatoire (injection locale au lieu de l'inflammation), les troubles dues à une infection bactérienne, pour la cicatrisation des plaies diabétiques, des escarres.
La composition selon l'invention peut aussi être utilisée pour la confection de vaccins à ARNm, pour le traitement de maladies génétiques, de maladies auto-immunes et du cancer.
La composition selon l'invention peut tout particulièrement être utilisée pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
L'infarctus du myocarde (IDM) est une destruction du muscle cardiaque due à une thrombose occlusive d'une artère coronaire. Cette pathologie coronaire aiguë survient le plus souvent sur une plaque d'athérome devenue instable à la suite d'une érosion ou d'une fissuration. La rupture d'une plaque d'athérome ou l'érosion de l'endothélium vasculaire entraîne l'adhésion de plaquettes et l'initiation de la cascade de coagulation, aboutissant à la formation d'agrégats de plaquettes et de fibrine, capables de réduire la lumière du vaisseau sanguin ou de l'obstruer complètement. Cette embolie provoque une forte baisse de l'approvisionnement en oxygène et en nutriments des cellules du myocarde, principalement les cardiomyocytes et les cellules endothéliales. La partie du myocarde atteinte par cet épisode ischémique est appelée la zone infarcie. La destruction du caillot sanguin par thrombolyse ou son écrasement par angioplastie primaire provoque la reperfusion de la zone infarcie du myocarde. Les cardiomyocytes peuvent ainsi retrouver un métabolisme et une fonction normaux, après une période de sidération au cours de laquelle ils n'ont qu'une activité mécanique restreinte.
La prise en charge de l'IDM commence par l'hospitalisation en urgence des patients présentant les symptômes de la maladie dans une unité de soins intensifs cardiologiques. La reperfusion de la coronaire obstruée est la priorité. En effet, il s'agit de rétablir le plus tôt possible la circulation sanguine dans l'artère responsable de l'IDM. Pour cela, la technique privilégiée est l'angioplastie coronaire primaire.
La limitation de la taille de la zone infarcie peut être obtenue par l'inhibition de la mort cellulaire par apoptose et par la stimulation de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, la néoangiogenèse. En effet, l'augmentation de la vascularisation entraîne une amélioration des apports en oxygène et en nutriments. La viabilité des cellules, ayant survécu à l'ischémie et à la reperfusion, est ainsi maintenue. A l'heure actuelle, aucun traitement anti-apoptotique et angiogénique n'est utilisé en routine clinique.
La biotechnologie de transfert d'A Nm dans le myocarde est particulièrement bien adaptée. L'inhibition de l'apoptose et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins peuvent être obtenues par l'expression transitoire d'une protéine de la famille des facteurs de croissance. Contrairement à la thérapie génique, la technologie de transfert d'ARNm oblige en effet un tissu à ne produire une protéine thérapeutique que pendant quelques jours.
La composition selon l'invention peut également être utilisée pour améliorer le bien-être d'un patient, et notamment pour lutter contre la douleur (notamment postopératoire), pour la cicatrisation de la peau. L'invention a donc également pour objet l'utilisation de la composition selon l'invention pour lutter contre la douleur ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, notamment dans des conditions non pathologiques.
L'invention porte également sur une méthode de traitement thérapeutique d'une de ces maladies ou conditions comprenant l'administration d'une quantité efficace de la composition à un patient en ayant besoin. L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'une composition hypotonique comprenant des nanoparticules d'ARNm telles que définies précédemment pour améliorer l'efficacité due transfert dudit ARNm dans des cellules de mammifères.
En particulier, la composition hypotonique est d'osmolarité inférieure à 300 mosM, de concentration en cations inférieure à 150 mM. Avantageusement, elle comprend :
-du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM
- Du tampon Hepes permettant d'ajuster le pH de la composition aqueuse entre 4 et 7 - Du trifluoroacétate en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ
L'invention va maintenant être illustrée par les exemples ci-dessous, non limitatifs. Description des figures :
Figure 1 : Transfection de cellules H9c2 avec les nanoparticules d'ARNm en présence ou en l'absence d'un choc hypotonique. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine). De gauche à droite : ARNm/pepMBl, isotonicité ; ARNm/pepMBl/pepMB2, isotonicité ; ARNm nu, choc hypotonique ; ARNm/pepMBl, choc hypotonique ; ARNm/pepMBl/pepMB2, choc hypotonique
Figure 2 : Transfection de cellules H9c2 avec de l'ARNm nu ou des nanoparticules d'ARNm grâce à un choc hypotonique. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine). A gauche : ARNm nu ; Puis, nanoparticules ARNm/pepMBl/pepMB2 avec un pourcentage molaire de pepMB2 de 0 ou 1,25 ou 2,5 ou 3,75
Figure 3 : Transfection de cellules H9c2 avec de l'ARNm nu ou des nanoparticules d'ARNm dans une solution contenant 0 mM d'Hepes, pH5,5 et du chlorure de sodium à une concentration allant jusqu'à 145 mM. De gauche à droite : [NaCI] = 0 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 20 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 40 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 55 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 100 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 145 mM - nanoparticules d'ARNm ; [NaCI] = 145 mM - ARNm nu
Figure 4 : Transfection de cellules H9c2 avec des nanoparticules d'ARNm dans une solution contenant 40 mM de NaCI et de l'Hepes à une concentration allant jusqu'à 100 mM. De gauche à droite : [Hepes] = 0 mM ; [Hepes] = 10 mM ; [Hepes] = 20 mM ; [Hepes] = 30 mM ; [Hepes] = 100 mM
Figure 5 : Transfection de cellules H9c2 avec des nanoparticules d'ARNm dans une solution contenant 30, 40 et 50 mM de KCI et 20 mM d'Hepes, pH 5,5. De gauche à droite : Sel de NaCI à 40 mM ; Sel de KCI à 30 mM ; Sel de KCI à 40 mM ; Sel de KCI à 50 mM Figure 6 : Transfection de cellules H9c2 avec des nanoparticules d'ARNm dans une solution contenant 20 mM d'Hepes et 40 mM de KCI, à un pH allant de 5,5 à 8,5 sans ou avec TFA. De gauche à droite : Pas de TFA, pH 5,5 ; ΙΟμΜ TFA, pH 5,5; ΙΟΟμΜ TFA, pH 5,5; 1 mM TFA, pH 5,5 ; Pas de TFA, pH 6,5 ; ΙΟμΜ TFA, pH 6,5; ΙΟΟμΜ TFA, pH 6,5; 1 mM TFA, pH 6,5 ; Pas de TFA, pH 7,5 ; Pas de TFA, pH 8,5
Figure 7 : Transfection de cellules H9c2 avec des nanoparticules d'ARNm dans une solution contenant 20 mM d'Hepes, 40 mM de KCI et 100 μΜ de trifluoroacétate de sodium à une concentration finale en ARN de 6,6 μg/ml ou 250 μg/ml. De gauche à droite : ratio de charge 2, [ARNm] = 6,6 μg/ml ; ratio de charge 2,2, [ARNm] = 250 μg/ml ; ratio de charge 2, [ARNm] = 250 μg/ml ; ratio de charge 1,8, [ARNm] = 250 μg/ml.
Figure 8 : Transfection du myocarde sain de rat avec les nanoparticules d'ARNm luciférase dissoutes dans des solutions de tonicité variable. Mesure de l'activité luciférase (RLU/mg protéine). Le dernier histogramme à droite correspond à une solution isotonique. Les autres correspondent à des solutions hypotoniques.
Figure 9 : Modèle de rat d'infarctus du myocarde. En A, coupe représentative d'un cœur de rat ayant subi un infarctus et reçu le placebo. En B, coupe représentative d'un cœur de rat ayant subi un infarctus et reçu le vecteur d'ARNm codant pour un facteur de croissance. L'astérisque indique la position de l'infarctus.
Efficacité du transfert d'ARN messager :
La quantité d'ARNm, introduit dans des cellules en culture ou les cellules d'un tissu, peut être précisément estimée en utilisant l'ARNm codant pour une protéine-marqueur. La luciférase est la protéine-marqueur la plus utilisée. Elle est détectée par un spectrophotomètre spécialisé, le luminomètre.
Il y a une relation directe entre la quantité d'ARNm luciférase transféré dans une cellule et la quantité de protéine luciférase produite par cette cellule. Les peptides cationiques A et A'-E-L, où A et A' représentent chacun le peptide de SEQ ID n°l, E est les PEG de 3,5 kDa et L est le peptide de SEQ ID n°25, ont été mélangées à l'ARNm luciférase, afin de former des nanoparticules. Ces dernières se sont avérées très efficaces pour transférer l'ARNm dans les cellules de la lignée H9c2 in vitro.
Le transfert de l'ARNm luciférase dans le myocarde sain de rats Sprague-Dawley a nécessité de mettre au point les différents paramètres de l'administration du vecteur. En effet, ce dernier est injecté dans la paroi du ventricule gauche grâce à une thoracotomie. Le volume d'injection, la dose d'ARN, la concentration saline et la vitesse d'injection ont été optimisés, ce qui a permis d'introduire une grande quantité d'ARNm luciférase dans les cellules du myocarde. Exemple 1 : PREPARATION DU VECTEUR D'ARN MESSAGER
a) Linéarisation du plasmide
Cinquante microgrammes d'un plasmide, comportant le gène de la luciférase (Firefly) sous le contrôle du promoteur du phage T7, ont été digérés par cent unités de l'enzyme de restriction Sspl-HF (New England Biolabs) dans le tampon NEBuffer 4 (50 mM acétate de potassium, 20 mM Tris acétate, 10 mM acétate de magnésium, 1 mM DTT, pH 7,9 à 25 °C), pendant quatre heures, à 37°C. Un site de restriction Sspl se situe en aval du gène luciférase. L'ADN linéarisé a ensuite été précipité avec 5 μΙ d'EDTA 0,5 M, 10 μΙ d'acétate de sodium 3 M et 235 μΙ d'éthanol 100%. Le mélange a été refroidi à -20°C pendant une heure, avant d'être centrifugé à vitesse maximale, pendant trente minutes. Le culot d'ADN a ensuite été resuspendu dans 50 μΙ de TE pH 8,0. La concentration de la solution d'ADN a été déterminée par la mesure de l'absorbance à 260 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre.
b) Transcription in vitro
La transcription in vitro du plasmide linéarisé a été réalisée à l'aide du kit mMessage mMachine (Ambion). 4,65 μΙ d'eau pure ont été mélangés à 10 μΙ de NTP/CAP 2X, 2 μΙ de tampon de réaction 10X, 1,35 μΙ de plasmide linéarisé (1 μg d'ADN) et 2 μΙ d'enzyme mix. La synthèse d'ARN s'est effectuée à 37°C, pendant deux heures, dans un bain à sec. L'ARN polymérase T7 a transcrit le gène luciférase grâce au promoteur T7 situé en amont du gène. Après la transcription du gène luciférase, un μΙ de TURBO DNase a été ajouté, afin de dégrader le plasmide et ainsi faciliter la purification ultérieure de l'ARNm.
c) Purification de l'ARN messager
La purification de l'ARN messager luciférase a été réalisée à l'aide du kit MegaClear (Ambion). Soixante dix neuf μΙ d'Elution Solution, 350 μΙ de Binding Solution Concentrate et 250 μΙ d'éthanol 100% ont été ajoutés aux 21 μΙ du mélange précédent. Ces 700 μΙ ont été déposés sur un Filter Cartridge et centrifugés à 10000 g, pendant une minute. Le filtre a retenu l'ARN messager. Deux lavages ont été effectués avec 500 μΙ de Wash Solution, en centrifugeant à 10000 g, pendant une minute. L'ARN a ensuite été élué du filtre en ajoutant, à deux reprises, 50 μΙ d'Elution Solution et en chauffant à 70°C, pendant dix minutes, dans un bain à sec. L'élution a été obtenue par centrifugation à 10000 g, pendant une minute.
Une seconde étape de purification a été effectuée par précipitation au chlorure de lithium.
Soixante μΙ de LiCI Précipitation Solution ont été ajoutés aux 100 μΙ de l'éluât. Le mélange a été refroidi à -20°C pendant 45 minutes, avant d'être centrifugé à vitesse maximale à 4°C, pendant 15 minutes. Le culot a été lavé avec 500 μΙ d'éthanol 70% et une dernière centrifugation a été effectuée à vitesse maximale à 4°C, pendant 5 minutes. Le culot d'ARN messager, séché pendant quelques minutes à l'air, a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5. La concentration de la solution d'ARNm a été déterminée par la mesure de l'absorbance à 260 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre.
d) Peptides A et A'-E-L : pepMBl et pepMB2
Les deux peptides capables d'interagir avec l'ARNm ont été synthétisés par Proteogenix. La séquence en acides aminés de A est la suivante : CRRRRRRRRC (pepMBl). Le lyophilisât a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 1 mg/ml.
La séquence de L-E-A' est la suivante : PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA-PEG(3,5 kDa)- CRRRRRRRRC (pepMB2). PEG(3,5 kDa) est du polyéthylène glycol de 3,5 kilodaltons. Le lyophilisât de L-E-A' a été resuspendu dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 100 μg/ml.
e) Assemblage des nanoparticules d'ARN messager
La solution concentrée d'ARN messager luciférase a été diluée dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 pour atteindre 100 μg/ml. Les solutions de pepMBl et pepMB2 ont été successivement mélangées à de l'Hepes 20 mM pH 7,5, afin d'atteindre la quantité nécessaire de peptides pour condenser l'ARN messager luciférase. Un volume de la solution de peptides a ensuite été rapidement mélangé par pipetage à un volume de la solution diluée d'ARN. L'assemblage des nanoparticules a eu lieu à température ambiante, pendant quatre heures. La fixation des peptides à l'ARN est très rapide, tandis que l'oxydation des cystéines aux extrémités des peptides, par le dioxygène dissout dans le tampon, est beaucoup plus lente. Cette oxydation entraîne la formation de ponts disulfure entre les peptides, ce qui aboutit à leur multimérisation au contact de l'ARN. La nanoparticule constituée d'ARNm, piégé dans une gangue de peptides multimérisés, est très stable dans le milieu extracellulaire.
La quantité de peptides mélangée à l'ARN messager luciférase dépend du ratio de charge +/- que l'on souhaite atteindre. A un ratio de charge + /- de 2, il faut ajouter suffisamment de peptides pour qu'il y ait deux arginines sur les peptides, pour une liaison phosphodiester au niveau de l'ARNm.
Exemple 2 : TRANSFECTION IN VITRO (protocole 1)
a) Culture et plating de la lignée H9c2
Toutes les manipulations de cellules ont été réalisées sous une hotte à flux laminaire. La lignée cellulaire H9c2 issue de cardiomyoblastes de rat (ECACC) a été cultivée dans du DMEM Glutamax (Gibco) additionné d'un mélange de pénicilline et de streptomycine et de sérum de veau fœtal (10% final). La culture a été effectuée à 37°C dans des flasques de 75 cm2 (Corning). Lorsque le nombre de cellules nécessaire à l'ensemencement d'une plaque de 48 puits (Corning) a été atteint, les cellules ont été détachées du fond de la flasque à l'aide de 2,5 ml de TryPLE Select (Gibco) à 37°C, pendant 5 à 10 minutes. 7,5 ml de DMEM ont été ajoutés, afin de neutraliser le TryPLE Select. Les cellules ont été centrifugées à 100 g, pendant 10 minutes, à température ambiante. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans du DMEM. 250 μΙ de cette suspension cellulaire ont été introduits dans chaque puits d'une plaque de 48 puits et cette dernière a été placée dans un incubateur à 37°C, contenant 5% de C02. Environ 16 heures plus tard, le milieu de culture a été remplacé par 250 μΙ de DMEM, préchauffé à 37°C.
b) Transfection des cellules H9c2
Chaque transfection a été réalisée dans trois puits différents. 160 μΙ d'ARNm luciférase (16 μg) ont été mélangés à 160 μΙ de pepMBl seul ou à 160 μΙ d'un mélange pepMBl/pepMB2 (pepMBl et pepMB2 sont tels que définis à l'exemple 1). L'assemblage des complexes a eu lieu à température ambiante, pendant quatre heures. Alternativement, la solution d'ARNm a été diluée avec 160 μΙ d'Hepes 20 mM pH7,5, afin de comparer l'ARN nu aux nanoparticules. 160 μΙ de DMEM IX ne contenant ni sérum ni antibiotiques ont été ajoutés aux solutions d'ARN nu ou de nanoparticules, afin de constituer les solutions hypotoniques d'ARNm (la concentration en cations est d'environ 55 mM). Les solutions isotoniques (la concentration en cations est d'environ 160 mM)ont été obtenues en mélangeant 320 μΙ de nanoparticules dans de l'Hepes 20 mM pH 7,5 à 160 μΙ de DMEM 3X. Le milieu de culture DMEM (IX) est isotonique par rapport à l'intérieur des cellules. Le milieu DMEM 3X est trois fois plus concentré : environ 480 mM de cations.
Les puits ont été vidés du milieu de culture qu'ils contenaient, afin d'introduire 150 μΙ de solution hypotonique ou isotonique de nanoparticules ou d'ARN nu (5 μg d'ARNm par puits). Les cellules ont été incubées pendant une heure, à 37°C, dans un incubateur. La solution de nanoparticules ou d'ARNm nu a ensuite été aspirée et remplacée par 250 μΙ de DMEM. Les cellules ont alors été incubées, pendant 16 heures, à 37°C, dans un incubateur.
c) Lyse des cellules H9c2 et mesure de l'activité luciférase
Le milieu de culture a été aspiré et remplacé par 500 μΙ de Dulbecco's PBS IX. Les cellules H9c2 ont ensuite été lysées par l'ajout de 250 μΙ de tampon de lyse (Luciférase Assay System, Promega). Le lysat de chaque puits a été centrifugé à vitesse maximale, à 20°C, pendant cinq minutes, afin de le clarifier. 20 μΙ de chaque lysat cellulaire ont été introduits dans un tube adapté au luminomètre (Berthold Technologies). 100 μΙ de substrat de la luciférase (Promega) ont été ajoutés au lysat cellulaire par le luminomètre. Ce dernier a ensuite mesuré la quantité de lumière émise par la réaction enzymatique catalysée par la luciférase. Les résultats s'expriment en unités relatives de lumière (RLU). La quantité de protéine luciférase, produite par les cellules H9c2, grâce à l'ARNm luciférase, a été normalisée en dosant les protéines cellulaires totales avec le kit 660 nm Protein Assay (Pierce). Pour cela, 100 μΙ de lysat cellulaire ont été mélangés à 1,5 ml de réactif et l'absorbance a été mesurée à 660 nm. Une gamme d'étalonnage a été réalisée à l'aide de solutions de sérum albumine bovine. L'activité luciférase s'exprime donc en RLU par milligramme de protéines. Chaque expérience a été effectuée en triplicata
d) Résultats
Dans une solution isotonique, le vecteur d'ARNm constitué avec le seul peptide pepMBl a transféré une quantité extrêmement faible d'ARN dans les cellules H9c2 (Fig.l). L'ajout du peptide pepMB2 au vecteur a significativement amélioré le transfert d'ARNm luciférase. Cependant, l'efficacité de la transfection est restée très faible (< 105 RLU/mg protéine). Le même vecteur constitué de pepMBl et pepMB2 a très efficacement transfecté les cellules H9c2 (> 108 RLU/mg protéine), lorsque la solution de vecteur était hypotonique (Fig.l).
Dans une solution hypotonique, l'ARNm nu a transfecté les cellules H9c2 plus de 100 fois moins efficacement que le même ARNm luciférase complexé au peptide pepMBl (Fig.2). L'ajout de peptide pepMB2 au vecteur a amélioré l'efficacité de la transfection. L'augmentation la plus forte de l'activité luciférase a été obtenue avec 2,5 mol% de pepMB2 (Fig.2).
D'après ces résultats, la formation d'un vecteur d'ARNm, constitué des peptides pepMBl et pepMB2, et l'utilisation d'une solution hypotonique ont eu un effet synergique sur l'efficacité de la transfection des cellules H9c2 par l'ARNm luciférase.
Exemple 3 : TRANSFECTION IN VITRO (PROTOCOLE 2)
a) Assemblage des nanoparticules d'ARNm luciférase
Les culots d'ARN messager luciférase et de peptide pepMBl ont été dissous dans de l'eau déminéralisée. Un volume de la solution de peptide a ensuite été rapidement mélangé par pipetage à un volume de la solution d'ARN. Le ratio de charge a varié de 1,8 à 2,2. L'assemblage a eu lieu à température ambiante pendant 15 minutes. Puis, la solution de complexe ARN/pepMBl a été congelée avec de l'azote liquide, afin d'être lyophilisée. Le lyophilisât a été conservé à -20°C jusqu'à utilisation.
Ce lyophilisât a été resuspendu dans diverses solutions aqueuses contenant éventuellement de l'Hepes, du NaCI, du KCI et du trifluoroacétate de sodium.
b) Transfection des cellules H9c2
Chaque transfection a été réalisée dans trois puits différents. Le milieu de culture a été aspiré et 150 μΙ d'une solution de nanoparticules ARNm/pepMBl ont été introduits dans chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes, à 37°C, dans un incubateur. La solution de nanoparticules a ensuite été aspirée et remplacée par 250 μΙ de DMEM. Les cellules ont alors été incubées pendant 17 heures, à 37°C, dans un incubateur,
c) Résultats
Le lyophilisât de complexe ARNm luciférase/pepMBl et un culot d'ARNm purifié ont été dissous dans une solution contenant 20 mM d'Hepes, pH 5,5 et du chlorure de sodium à une concentration allant jusqu'à 145 mM. La concentration en ARNm est de 1 μg pour 150 μΙ de solution aqueuse, c'est-à-dire que la concentration en nanoparticules est de 13,3 μg/ml.
L'ajout du peptide pepMBl a augmenté l'efficacité de la transfection de plus de 100 fois (Fig.3, deux derniers histogrammes).
A la concentration optimale de chlorure de sodium, 40 mM, l'activité luciférase était 210 fois plus élevée qu'à 145 mM (Fig.3).
Le lyophilisât de nanoparticules ARN/pepMBl a été dissout dans une solution contenant 40 mM de NaCI et de l'Hepes à une concentration allant jusqu'à 100 mM. La concentration en ARNm est de 1 μg pour 150 μΙ de solution aqueuse, c'est-à-dire que la concentration en nanoparticules est de 13,3 μg/ml.
L'efficacité de la transfection s'est avérée être maximale à 20 mM d'Hepes (Fig.4).
Le lyophilisât de vecteur d'ARNm luciférase a ensuite été dissout dans une solution contenant 30, 40 et 50 mM de KCI et 20 mM d'Hepes, pH 5,5. La concentration en ARNm est de 1 μg pour 150 μΙ de solution aqueuse, c'est-à-dire que la concentration en nanoparticules est de 13,3 ng/m\.
Par rapport à 40 mM de NaCI, la concentration optimale de KCI, 40 mM, a modérément amélioré l'activité luciférase (Fig.5).
Le lyophilisât de nanoparticules a été dissout dans une solution contenant 20 mM d'Hepes et 40 mM de KCI, à un pH allant de 5,5 à 8,5. La concentration en ARNm est de 1 μg pour 150 μΙ de solution aqueuse, c'est-à-dire que la concentration en nanoparticules est de 13,3 μg/ml. Le pH optimal s'est avéré être de 6,5 (Fig.6).
A ce pH, l'ajout de trifluoroacétate de sodium a modérément amélioré l'efficacité de la transfection. Par contre, le trifluoroacétate de sodium à 100 μΜ a significativement augmenté l'activité luciférase à pH 5,5 (Fig.6).
Le vecteur d'ARNm a été préparé à un ratio de charge de 1,8 à 2,2. Les lyophilisats de complexe ARN/peptide ont été dissous dans une solution contenant 20 mM d'Hepes, 40 mM de KCI et 100 μΜ de trifluoroacétate de sodium à une concentration finale en ARN de 6,6 μg/ml ou 250 μg/ml. A un ratio de charge de 2, l'augmentation de la concentration en vecteur d'A Nm de 37,5 fois, à l'extérieur des cellules H9c2, a abouti à une augmentation de l'efficacité de la transfection de 436 fois (Fig.7).
Le ratio de charge permettant d'obtenir la meilleure efficacité de transfert d'ARNm s'est avéré être de 1,8 (Fig.7).
Exemple 4 : TRANSFECTION IN VIVO
a) Préparation des nanoparticules d'ARNm luciférase
Des solutions d'ARNm, de pepMBl et de pepMB2, dissoutes dans de l'Hepes 20 mM, ont été diluées avec de l'eau pure, avant d'être mélangées, afin d'assembler les nanoparticules (pepMBl et pepMB2 sont tels que définis à l'exemple 1). La solution résultante contenait 8 mM de sodium. Le ratio de charge +/- était de 1,75 et le ratio molaire pepMBl / pepMB2 était de 39.
Des solutions d'ARNm, de pepMBl et de pepMB2 ont alternativement été diluées dans des solutions aqueuses contenant du chlorure de sodium, afin d'obtenir des solutions de nanoparticules d'ARNm à 24 mM, 68 mM, 112 mM et 160 mM de sodium.
Chaque expérience a été réalisée sur trois rats différents.
b) Anesthésie, thoracotomie, injection transépicardique et réveil
Des rats de la souche Sprague-Dawley ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel). Les animaux ont alors subi une intubation intratrachéale. Le tube a ensuite été connecté à un respirateur artificiel.
Une incision de la peau et des muscles intercostaux a été pratiquée sur le côté gauche du thorax, afin d'accéder au cœur. Des écarteurs ont été utilisés pour élargir la thoracotomie. Le péricarde a été disséqué, afin de pouvoir pratiquer l'injection transépicardique.
Une seringue à insuline a été remplie avec 60 μΙ de solution hypotonique de nanoparticules d'ARNm luciférase, correspondant à 3 μg d'ARN par rat. La solution a été injectée à un débit de 20 μΙ par seconde, dans la paroi du ventricule gauche.
La thoracotomie a été refermée à l'aide d'agrafes. Les rats ont été placés dans une cage remplie d'oxygène pur et surveillés jusqu'à leur réveil.
c) Stabulation, euthanasie, biopsie du myocarde et mesure de l'activité luciférase
Après leur réveil, les rats ont été replacés dans leur cage. La stabulation a duré environ 17 heures.
Les animaux ont ensuite reçu une dose massive de kétamine (500 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale. Leur cœur a été explanté et un fragment de la paroi du ventricule gauche, correspondant à la région injectée la veille, a été prélevé et débarrassé du sang de l'animal, à l'aide de sérum physiologique. Cette biopsie a été découpée en petits morceaux, à l'aide d'une paire de ciseaux.
Ces morceaux de biopsie ont été introduits dans un tube contenant 250 μΙ de tampon de lyse IX (Luciferase Assay System, Promega). Ce tube a été immédiatement plongé dans de l'azote liquide, afin de conserver la biopsie.
Les différentes biopsies de myocarde transfecté ont été décongelées à température ambiante et recongelées à -80°C, pendant 10 minutes. Trois cycles de congélation / décongélation ont été accomplis, afin de lyser les cellules du myocarde et de libérer la protéine luciférase, codée par l'ARNm. Les lysats tissulaires ont été centrifugés à 13000 g, à 20°C, pendant cinq minutes. La luciférase étant présente dans le surnageant, 20 μΙ de ce dernier ont été introduits dans un tube pour la détermination de l'activité luciférase, à l'aide d'un luminomètre. 10 μΙ du surnageant ont été dilués dans 90 μΙ d'eau pour le dosage des protéines totales, à l'aide du kit 660 nm Protein Assay (Pierce).
d) Résultats
Le vecteur d'ARNm luciférase dissout dans une solution isotonique, contenant 160 mM de sodium, a donné lieu à une très faible efficacité de transfert d'ARN, dans les cellules du myocarde de rats Sprague-Dawley (Fig.8). Plus la concentration en sodium a été diminuée, plus la solution de vecteur d'ARNm a été hypotonique, plus l'efficacité de la transfection a été augmentée (Fig.8).
Les résultats obtenus in vivo confirment ainsi les résultats obtenus sur la lignée H9c2, selon lesquels une solution hypo-osmotique induit un choc hypotonique, qui agit de concert avec la vectorisation de l'ARNm, par les peptides pepMBl et pepMB2, pour transférer une grande quantité d'ARN dans les cellules de mammifère. Exemple 5 : Thérapie par ARN messager de l'infarctus du myocarde chez l'animal
Un infarctus a été provoqué sur la face ventrale du ventricule gauche de rats Sprague- Dawley par la ligature permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche, via une thoracotomie. 60 μί d'une solution placebo (tampon hypotonique) ou 60μί d'une solution hypotonique de nanoparticules d'ARNm, telle que décrite à l'exemple 4, codant pour un facteur de croissance a ensuite été injectée dans la face latérale du ventricule gauche. La thoracotomie a été refermée et les animaux ont été sacrifiés une semaine après l'opération. Les cœurs ont été explantés et des coupes histologiques ont été réalisées dans la zone à risque d'infarctus. Six rats ont été inclus dans chaque groupe. Les animaux témoins ayant reçus le placebo ont effectivement subi une destruction notable du myocarde de leur ventricule gauche. Cela est mis en évidence par l'amincissement de la paroi du ventricule, au niveau de la zone infarcie, ainsi que la fibrose caractérisée par un dépôt de collagène (Fig.9A).
Par contre, la zone à risque d'infarctus des rats ayant bénéficiés du vecteur d'A Nm a été préservée de la destruction. En effet, la paroi du ventricule au niveau de cette région n'est pas amincie et aucun signe de fibrose n'est visible (Fig.9B).
Le traitement par ARN messager codant pour un facteur de croissance a ainsi protégé la zone du myocarde à risque d'infarctus, dans ce modèle animal.

Claims

Revendications
1. Composition aqueuse comprenant des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, caractérisée en ce que
- la composition est hypotonique et a une osmolarité inférieure à 300 mosM,
- les nanoparticules d'ARNm comprennent de l'ARNm condensé en milieu aqueux dans des conditions hypotoniques avec des composés cationiques de type A par formation de liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères.
2. Composition aqueuse hypotonique selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa concentration en cations est inférieure à 150 mM, avantageusement inférieure à 100 mM.
3. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM.
4. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend du tampon Hepes permettant d'ajuster le pH de la composition aqueuse entre 4 et 7.
5. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend du trifluoroacétate en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ.
6. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les nanoparticules comprennent également des composés de type A'-E-L, où
A' est un composé cationique, permettant lui aussi la condensation de l'ARNm, par liaisons non covalentes avec l'ARNm, réversibles dans le cytoplasme de cellules de mammifères
E est un espaceur non chargé et soluble dans l'eau
L est un peptide ligand neutre ou quasi-neutre.
7. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé cationique de type A ou A' est un peptide cationique de formule Xm-(Y)n-X'P dans laquelle
X et X' sont identiques ou différents et représentent chacun un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé ou homologue d'acide aminé portant un groupement thiol
m vaut 0 ou 1
p vaut 0 ou 1
Y est un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé dont la chaîne latérale est chargée positivement, et
n est un nombre entier allant de 4 à 20.
8. Composition aqueuse hypotonique selon la revendication 7, caractérisée en ce que Y est choisi parmi l'arginine, la lysine et l'ornithine, de préférence l'arginine.
9. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'espaceur est un polymère hydrosoluble, linéaire ou réticulé, ayant une taille variant de 0,5 kDa à 50 kDa, et le peptide ligand est de formule PQRDTVGGRTTPPSWGPAKA (SEQ ID n°25).
10. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les nanoparticules d'ARNm ont une taille inférieure ou égale à 200 nm, plus avantageusement inférieure ou égale à 100 nm.
11. Composition aqueuse hypotonique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend lesdites nanoparticules d'ARNm en une concentration en ARN supérieure à 50 μg/ml.
12. Kit comprenant :
a. Une solution aqueuse hypotonique, d'osmolarité inférieure à 300 mosM, de concentration en cations inférieure à 150 mM et comprenant avantageusement - Du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM - Du tampon Hepes permettant d'ajusterle pH de la composition aqueuse entre 4 et 7
- Du trifluoroacétate en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ
Des nanoparticules d'ARN messager (ARNm) codant une protéine thérapeutique, telles que définies à l'une quelconque des revendications précédentes.
13. Composition ou kit selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour son utilisation en tant que médicament.
14. Composition selon la revendication 13 pour son utilisation pour traiter ou prévenir des maladies, des troubles ou des états pathologiques, choisis parmi les pathologies cardiaques telles que l'infarctus du myocarde, l'angine de poitrine, les pathologies respiratoires telles que l'asthme, les troubles dues à une infection virale, respiratoire ou autre, les troubles dus à une réaction inflammatoire, les troubles dus à une infection bactérienne, pour la cicatrisation des plaies diabétiques, des escarres ; pour la confection de vaccins à ARNm, pour le traitement de maladies génétiques, de maladies auto-immunes et du cancer.
15. Utilisation d'une composition hypotonique d'osmolarité inférieure à 300 mosM, de concentration en cations inférieure à 150 mM et comprenant avantageusement
- Du chlorure de potassium et/ou du chlorure de sodium en une concentration allant de 5 mM à 100 mM
- Du tampon Hepes, permettant d'ajusterle pH de la composition aqueuse entre 4 et 7
- Du trifluoroacétate en une concentration allant de 1 μΜ à 1000 μΜ et des nanoparticules d'ARNm telles que définies à l'une quelconque des revendications précédentes pour améliorer l'efficacité du transfert dudit ARNm dans des cellules de mammifères.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023192163A1 (fr) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Systèmes et procédés de séquençage de polynucléotides
CN118184538A (zh) * 2024-05-14 2024-06-14 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种肺部高表达的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4353257A3 (fr) 2015-04-13 2024-08-07 CureVac Manufacturing GmbH Procédé de production de compositions d'arn

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012013326A1 (fr) * 2010-07-30 2012-02-02 Curevac Gmbh Complexation d'acides nucléiques avec des composants cationiques réticulés par un pont disulfure pour une transfection et une immunostimulation
US20130156849A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2623121A1 (fr) * 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Composition pharmaceutique comportant un complexe de chargement de porteur polymérique et un antigène
WO2013174409A1 (fr) * 2012-05-25 2013-11-28 Curevac Gmbh Immobilisation réversible et/ou libération contrôlée de nanoparticules contenant des acides nucléiques par le biais de revêtements de polymère (biodégradable)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012013326A1 (fr) * 2010-07-30 2012-02-02 Curevac Gmbh Complexation d'acides nucléiques avec des composants cationiques réticulés par un pont disulfure pour une transfection et une immunostimulation
US20130156849A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2623121A1 (fr) * 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Composition pharmaceutique comportant un complexe de chargement de porteur polymérique et un antigène
WO2013174409A1 (fr) * 2012-05-25 2013-11-28 Curevac Gmbh Immobilisation réversible et/ou libération contrôlée de nanoparticules contenant des acides nucléiques par le biais de revêtements de polymère (biodégradable)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J L LEMOINE ET AL: "Mechanism of efficient transfection of the nasal airway epithelium by hypotonic shock", GENE THERAPY, vol. 12, no. 16, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 1275 - 1282, XP055065981, ISSN: 0969-7128, DOI: 10.1038/sj.gt.3302548 *
LIOR ZANGI ET AL: "Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 31, no. 10, 1 October 2013 (2013-10-01), pages 898 - 907, XP055145576, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/nbt.2682 *
N GUICHARD: "UDA: Accord de principe pour le projet "ARN messager"", 12 December 2011 (2011-12-12), XP055166780, Retrieved from the Internet <URL:http://www.clermontcommunaute.net/fichier/deliberations/eco/eco_12122011_005.pdf> [retrieved on 20150203] *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023192163A1 (fr) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Systèmes et procédés de séquençage de polynucléotides
CN118184538A (zh) * 2024-05-14 2024-06-14 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种肺部高表达的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途

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