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WO2016001963A1 - 核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法 - Google Patents

核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法 Download PDF

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WO2016001963A1
WO2016001963A1 PCT/JP2014/067344 JP2014067344W WO2016001963A1 WO 2016001963 A1 WO2016001963 A1 WO 2016001963A1 JP 2014067344 W JP2014067344 W JP 2014067344W WO 2016001963 A1 WO2016001963 A1 WO 2016001963A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid analysis
array device
region
analysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/067344
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English (en)
French (fr)
Inventor
白井　正敬
崇秀 横井
神原　秀記
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Ltd filed Critical Hitachi Ltd
Priority to PCT/JP2014/067344 priority Critical patent/WO2016001963A1/ja
Publication of WO2016001963A1 publication Critical patent/WO2016001963A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to an array device for nucleic acid analysis having a plurality of nucleic acid capture regions for capturing nucleic acid molecules, a nucleic acid analysis apparatus and a nucleic acid analysis method using the array device for nucleic acid analysis.
  • a solution containing a nucleic acid molecule to be analyzed is allowed to act on a probe nucleic acid having a specific base sequence (for example, a poly-T sequence) to capture the nucleic acid molecule contained in the solution with the probe nucleic acid.
  • a probe nucleic acid having a specific base sequence for example, a poly-T sequence
  • Various nucleic acid analysis processes such as sequencing are performed. In such nucleic acid analysis processing, a bulk analysis in which nucleic acids extracted from biological tissue or cultured cells composed of a large number of cells are analyzed, and nucleic acids extracted from individual cells constituting the biological tissue are analyzed. And single cell analysis.
  • Examples of the bulk analysis and single cell analysis include genome analysis such as base sequence analysis, such as Whole Genome Analysis that analyzes all genomes and Whole Exsome Analysis that analyzes only exon regions.
  • genome analysis such as base sequence analysis, such as Whole Genome Analysis that analyzes all genomes and Whole Exsome Analysis that analyzes only exon regions.
  • epigenetics analysis that analyzes transcriptional control of the genome
  • a method for analyzing the methylated position of a nucleic acid molecule is known, and a method for analyzing chromatin modification positions such as modification of histone proteins. Is also known as the Chip-Seq method.
  • a method for analyzing the amount of mRNA transcribed from the genome is known as gene expression analysis.
  • a cDNA library sheet corresponding to each cell or cell site in a two-dimensionally expanded tissue is prepared.
  • Devices have been developed that can be fabricated and used to obtain a two-dimensional distribution of gene expression to achieve gene expression analysis in a large number of cells.
  • gene expression analysis in a single cell is performed using the device disclosed in Patent Document 1, it is not necessary to isolate the cell, and mRNA is directly extracted from cells in a section of living tissue, and gene expression analysis is performed. You can also.
  • an amplification reaction called a template walking reaction described in Non-Patent Document 1 and a DNA quantification method described in Non-Patent Document 2 can be performed.
  • reagents are individually supplied to a plurality of individualized regions, and the analysis process is merely executed individually, and a plurality of samples are not analyzed simultaneously using a single device. .
  • the present invention has a plurality of nucleic acid capture regions for capturing nucleic acid molecules, and an array device for nucleic acid analysis that can simultaneously analyze a plurality of samples using the plurality of nucleic acid capture regions.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid analyzer and a nucleic acid analysis method.
  • sample contamination can be achieved even when a plurality of nucleic acid capture regions are used by appropriately controlling communication and individualization of the upper space portions of the plurality of nucleic acid capture regions.
  • the inventors have found that a plurality of nucleic acid analysis processes can be carried out by preventing nation, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following.
  • An array device for nucleic acid analysis comprising:
  • control means sets the nucleic acid capture region to a highly hydrophilic surface when comparing the nucleic acid capture region with a region surrounding the nucleic acid capture region.
  • Array device
  • nucleic acid analysis array device wherein the nucleic acid capturing region has a cell capturing means for capturing one or a plurality of cells.
  • nucleic acid analysis array device (4) The nucleic acid analysis array device according to (3), wherein the nucleic acid capture region is a through-hole having a smaller diameter than the cells formed in the nucleic acid capture region.
  • the nucleic acid capture region is an inner surface of a recess formed on one main surface of the base or a region surrounding the inner surface of the recess and the outer periphery of the recess, and the nucleic acid capture means is on the bottom surface of the recess.
  • the array device for nucleic acid analysis according to (1) which is fixed.
  • the array device for nucleic acid analysis according to (1) further comprising a water supply / drainage mechanism for supplying liquid to the space formed by the base and discharging the liquid in the space.
  • the base is a pair of substrates disposed at a predetermined interval, and the plurality of nucleic acid capture regions are formed in opposing regions on the opposing surfaces of the pair of substrates ( 1) The array device for nucleic acid analysis according to 1).
  • the water supply / drainage control unit supplies a nonpolar solvent to the array device for nucleic acid analysis placed on the device placement unit and then supplies a nonpolar solvent to the array device for nucleic acid analysis.
  • a nucleic acid analysis method comprising: a step of supplying a nucleic acid; and a step of performing a nucleic acid analysis in a state where a plurality of nucleic acid capture regions in the nucleic acid analysis array device are individualized.
  • the array device for nucleic acid analysis the nucleic acid analysis apparatus, and the nucleic acid analysis method according to the present invention, it is possible to prevent sample contamination and simultaneously execute a plurality of nucleic acid analysis processes using a plurality of nucleic acid capture regions. Therefore, by applying the nucleic acid analysis array device, the nucleic acid analysis apparatus, and the nucleic acid analysis method according to the present invention, the efficiency of the analysis processing relating to the nucleic acid molecule to be analyzed can be greatly improved.
  • the array device for nucleic acid analysis has a plurality of nucleic acid capture regions arranged on at least one main surface of the base.
  • the base means a support that forms a plurality of nucleic acid capture regions.
  • a flat plate member can be exemplified, but it is not necessarily a flat plate member, and any shape member such as a sheet, a membrane, a gel thin film, a capillary plate, a bead, or a film is used. be able to.
  • the base material is not particularly limited, and examples thereof include metals such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum, chromium, platinum, titanium and nickel; alloys such as stainless steel, hastelloy, inconel, monel and duralumin; silicon Glass materials such as glass, quartz glass, fused silica, synthetic quartz, alumina, sapphire, ceramics, forsterite and photosensitive glass; polyester resin, polystyrene, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon , Plastics such as acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin and vinyl chloride resin; agarose, dextran, cellulose, polyvinyl Alcohol, nitrocellulose, chitin, chitosan.
  • metals such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, molybdenum,
  • the sheet when a sheet is used as the substrate, the sheet can be produced from alumina, glass, or the like.
  • a gel thin film when a gel thin film is used as the substrate, the gel thin film can be produced using, for example, acrylamide gel, gelatin, modified polyethylene glycol, modified polyvinyl pyrrolidone, hydrogel, or the like.
  • a membrane When a membrane is used as the substrate, for example, cellulose acetate, nitrocellulose or a mixed membrane thereof, nylon membrane or the like can be used.
  • the beads when beads are used as the substrate, the beads can be produced from a resin material (such as polystyrene), an oxide (such as glass), a metal (such as iron), sepharose, and combinations thereof.
  • a flat plate member is used as a base will be described. In this case, the base is referred to as a “substrate”.
  • the nucleic acid capturing region means a region having a nucleic acid capturing means capable of capturing the nucleic acid molecule when a solution containing the nucleic acid molecule to be captured comes into contact.
  • the nucleic acid capture means may be provided over the entire nucleic acid capture region or may be provided in a part of the nucleic acid capture region.
  • a plurality of nucleic acid capture regions means that at least two nucleic acid capture regions are arranged adjacent to each other with a predetermined interval.
  • the nucleic acid capturing means is not particularly limited, and examples thereof include a nucleic acid probe having a predetermined base sequence. More specifically, the nucleic acid probe can be appropriately designed according to the nucleic acid molecule to be captured. Examples of the nucleic acid molecule to be captured include messenger RNA (mRNA), non-coding RNA (ncRNA), DNA (including genomic DNA and mitochondrial DNA), and fragments thereof.
  • the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it can hybridize and capture with these nucleic acid molecules, and is known to those skilled in the art. For example, when the nucleic acid molecule to be captured is mRNA, it is preferable to use a DNA probe containing a poly T sequence as the nucleic acid probe.
  • a DNA probe containing a poly-T sequence, that is, oligo (dT) can be synthesized by a conventional method, and the degree of polymerization of oligo (dT) is hybridized with the poly-A sequence of mRNA, and mRNA is oligo- (dT) Any degree of polymerization that can be captured by a fixed substrate.
  • the nucleic acid molecule to be captured can be extracted from the cell by a method known in the art. For example, using a proteolytic enzyme such as Proteinase K, chaotropic salts such as guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride, surfactants such as Tween and SDS, or commercially available reagents for cell lysis, nucleic acids contained therein, That is, DNA and RNA can be eluted.
  • a proteolytic enzyme such as Proteinase K
  • chaotropic salts such as guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride
  • surfactants such as Tween and SDS
  • the array device for nucleic acid analysis has a control means for communicating or individualizing the upper space portions of the plurality of nucleic acid capture regions.
  • the upper space means a space located above the main surface of the substrate on which the nucleic acid capturing region is formed, that is, the main surface on which the nucleic acid capturing means is provided.
  • the communication of the upper space portions of the plurality of nucleic acid capture regions with each other means, for example, that when the liquid is supplied to the main surface of the substrate, the liquid flows between the plurality of upper space portions corresponding to the plurality of nucleic acid capture regions. It means that it is possible.
  • individualizing the upper space portions of the plurality of nucleic acid capture regions means that the liquid cannot flow between the plurality of upper space portions corresponding to the plurality of nucleic acid capture regions, and each upper space portion is independent. It means to put in a state.
  • the nucleic acid capture region has a high hydrophilic surface (hereinafter referred to as the first embodiment). .
  • the nucleic acid capture region having a high hydrophilic surface means that the surface of the nucleic acid capture region is compared with the surface of the region surrounding the nucleic acid capture region. It has a sex.
  • a water droplet contact angle WCA
  • WCA water droplet contact angle
  • the upper spaces of the plurality of nucleic acid capture regions can be communicated with each other by the solution.
  • a nonpolar solvent is supplied to the main surface of the substrate on which a plurality of nucleic acid capture regions are arranged from this state, an aqueous solution remains only in the upper space part of the nucleic acid capture region, and the upper space of the region other than the nucleic acid capture region Part of the aqueous solution replaces the nonpolar solvent.
  • the non-polar solvent after supplying the aqueous solution to the main surface of the substrate on which the plurality of nucleic acid capture regions are arranged, the upper spaces of the plurality of nucleic acid capture regions can be individualized.
  • the array device for nucleic acid analysis includes a pair of transparent substrates 5 and 6, a cell-capturing partition wall 7 disposed between the transparent substrates 5 and 6, and a side wall 10 as shown in FIG.
  • a space 2 is formed in the interior formed by the transparent substrates 5 and 6, the cell capturing partition wall 7 and the side wall 10.
  • This array device for nucleic acid analysis captures floating cells in the cell-capturing partition wall 7, and mRNA liberated from the captured cells in the transparent substrates 5 and 6 and the plurality of nucleic acid-capturing regions 4 formed in the cell-capturing partition wall 7.
  • the captured mRNA is subjected to analysis processing (cDNA synthesis, sequence analysis). That is, gene expression analysis at the single cell level can be performed by using the array device for nucleic acid analysis.
  • the pair of transparent substrates 5 and 6 and the cell-capturing partition wall 7 have a plurality of nucleic acid-capturing regions 4 to which DNA probes (poly T probes) are fixed as nucleic acid-capturing means. Each is formed.
  • the plurality of nucleic acid capture regions 4 formed on the transparent substrate 5, the plurality of nucleic acid capture regions 4 formed on the cell capture partition 7, and the plurality of nucleic acid capture regions 4 formed on the transparent substrate 6 are , Facing each other.
  • the size of the nucleic acid capture region 4 can be appropriately set as long as adjacent nucleic acid capture regions 4 do not contact each other.
  • the nucleic acid capturing region 4 has a circular shape with a diameter of 200 ⁇ m, but can have any shape within a range from about 5 ⁇ m to several mm.
  • the plurality of nucleic acid capture regions 4 have a higher hydrophilic surface than the surrounding region.
  • a plurality of nucleic acid trapping regions 4 are formed on one main surface of a quartz substrate having a thickness of 0.2 mm, for example, which is a material for the transparent substrates 5 and 6 and the cell trapping partition 7.
  • a resist film is formed in the region using a general lithography technique. Next, plasma fluorine treatment (plasma ashing (300 W) in a CHF 3 , C 2 F 6 atmosphere) is performed for 5 minutes, and water repellent treatment is performed on the region not covered with the resist film.
  • the water-repellent treatment may be performed by coating a fluororesin (for example, trade name: Cytop (Asahi Glass Co., Ltd.)). Then, by removing the resist film, the region where the resist film is formed is not subjected to water repellent processing, and the region other than the region where the resist film is formed is subjected to water repellent processing. . Next, a resist film is formed in the water-repellent processed region to expose only the regions that become the plurality of nucleic acid capturing regions 4, and in this state, a 172 nm deep ultraviolet treatment is performed for 3 minutes on one main surface of the substrate. Thereby, the process which provides hydrophilicity to the area
  • a fluororesin for example, trade name: Cytop (Asahi Glass Co., Ltd.
  • a hydrophilic surface is applied to the regions corresponding to the plurality of nucleic acid capturing regions 4 on each of the transparent substrates 5 and 6 and the cell capturing partition walls 7 by performing a water repellent process and a treatment for imparting hydrophilicity. Can be formed. Note that either the water repellent treatment or the treatment for imparting hydrophilicity may be performed first.
  • the plurality of nucleic acid capture regions 4 only need to have high hydrophilicity when compared with the region surrounding the plurality of nucleic acid capture regions 4, the above-described water-repellent treatment and the treatment for imparting hydrophilicity Do only one of them.
  • a DNA probe (poly T probe: SEQ ID NO: 1) is immobilized on the hydrophilic surface.
  • a method for immobilizing the DNA probe will be described later.
  • one DNA probe can be fixed at an average ratio of 30 to 100 nm 2 , 1.2 to 1.2 ⁇ 10 7 DNA probes are fixed to one nucleic acid capture region 4. Copy number of the mRNA in a single cell, it is possible to fix a sufficient number of DNA probes to capture all of the mRNA for is 10 6 or less.
  • a through-hole 1 is formed as a cell trapping means in the approximate center of the cell trapping partition 7.
  • the through-hole 1 captures floating cells and is not particularly limited, but has a diameter (for example, 3 to 30 ⁇ m, specifically 8 ⁇ m) according to the size of the cell to be captured. It is preferable to do.
  • the through-hole 1 has a shape having a small diameter in the thickness direction from both main surfaces of the cell-capturing partition wall 7.
  • the number of through-holes 1 is not limited at all, and can be, for example, several tens to several millions on one main surface of the cell-capturing partition wall 7. In the example shown in FIG.
  • the through holes 1 are one-dimensionally arranged on one main surface of the cell trapping partition 7.
  • the interval between the through holes 1 is 300 ⁇ m, but it can be set freely from several tens of ⁇ m to several millimeters.
  • the distance between the transparent substrates 5 and 6 and the cell-capturing partition wall 7 is 200 ⁇ m, but it can be set freely from several tens of ⁇ m to several millimeters.
  • the through hole 1 is not particularly limited, but a laser processing method can be applied. Laser processing can be performed from both surfaces of the cell-capturing partition wall 7 to form a shape (hourglass type) having a smaller diameter in the thickness direction from both main surfaces.
  • the through hole 1 may be formed by applying a dry or wet etching method.
  • an inlet 11 and an outlet 13 are formed on the transparent substrate 5, and an inlet 12 and an outlet 14 are formed on the transparent substrate 6.
  • These inlets 11 and 12 are connected to a liquid supply mechanism (not shown).
  • the outlets 13 and 14 are connected to a drainage mechanism (not shown).
  • a single cell is captured in the through-hole 1.
  • a cell solution suspended in a culture solution, physiological saline or serum is allowed to flow from the inlet 11 toward the outlet 14.
  • the cell solution flows from the inlet 11 to the outlet 14 through the through-hole 1 serving as a cell trapping means. Since the diameter of the through-hole 1 is set to 3 to 30 ⁇ m, the cells 3 larger than the diameter of the cell solution pass through the through-hole 1. Cannot pass through and is captured.
  • the cell solution is filled in the entire space 2 including the upper space portion of the nucleic acid capturing region 4, and the upper space portions of the plurality of nucleic acid capturing regions are communicated with each other by the cell solution.
  • a single cell is captured by each through-hole 1 and no cell exists in other regions.
  • the diameter of the through hole 1 is smaller than the diameter of the cell to be captured, and when one cell is captured, the flow through the cell capturing portion of the solution is inhibited. Therefore, if the flow of the cell solution from the inlet 11 to the outlet 14 is continued, a single cell is trapped in almost all the through holes 1. Excess cells can be removed from the outlet 13.
  • the cell disrupting solution is allowed to flow from the inlet 11 toward the outlet 14 while maintaining a constant pressure in the direction from the inlet 11 to the outlet 14.
  • the solution for cell disruption is filled in the entire space 2 including the upper space part of the nucleic acid capture region 4 in the same manner as when the cell solution is supplied. It will be in the state which mutually connected the upper space part of the area
  • a buffer solution containing a surfactant can be used. More specifically, a Tris-HCl (pH 8.0) solution containing 0.5% Tween 20 and 1M NaCl can be used as the cell disrupting solution. Note that the cell disruption solution having the composition can be used as a solvent for the cell solution used for capturing cells since the surfactant has a weak cell disruption effect at room temperature.
  • FIG. 3 shows the procedure from capturing mRNA in individual cells to a nucleic acid capture region 4 with a DNA probe (poly T probe) 31 immobilized via streptavidin 33 and synthesizing cDNA (ie, until reverse transcription). Show.
  • FIG. 3 shows a partial cross-sectional view of the cell-capturing partition wall 7, and enlarged views of the surface are shown in (a) to (c).
  • a washing buffer (10 mM Tris-HCl containing 0.1% Tween-20, pH 8.0) is introduced from inlets 11 and 12 in an amount 20 times the internal volume of space 2, and discharged from outlets 13 and 14. Thereby, the mineral oil which is a nonpolar solvent in the upper space 9 is discharged.
  • RNaseOUT Invitrogen
  • Superscript III reverse transcriptase, Invitrogen mixed in 58.5: 4: 22.5: 4: 4
  • a cDNA chain 34 is synthesized using the mRNA 32 captured by the DNA probe 31 as a template.
  • the reaction solution is slowly heated to 50 ° C. and a complementary strand synthesis reaction is carried out for about 50 minutes (FIG. 3 (b)).
  • the mixture is kept at 85 ° C. for 1.5 minutes to inactivate the reverse transcriptase and cooled to 4 ° C.
  • excess polyprobe is decomposed by introducing an enzyme solution that selectively decomposes single-stranded DNA in an amount equal to the internal volume of the space 2.
  • a cDNA library sheet can be constructed simultaneously in a plurality of nucleic acid capture regions 4.
  • FIG. 4 shows a sample preparation method for performing single-molecule sequencing that does not require amplification.
  • the example shown here shows the sequencing method of 5 'end of mRNA (3' end of cDNA).
  • a solution containing terminal transferase is uniformly introduced into the space 2
  • the poly A sequence 35 is added to the 3 'end of the cDNA.
  • a solution containing the poly-T probe 36 as a sequencing primer is introduced into the space 2.
  • sequencing becomes possible as shown in FIG. 4 (d-2).
  • dATP dATP
  • dCTP dCTP
  • dGTP dGTP
  • dTTP dTTP
  • the base sequence is determined by measuring each molecule to determine whether or not the As soon as the extension of one kind of base is completed, the phosphor is decomposed and desorbed so that the next base can be introduced. By repeating such a reaction, the base sequence of cDNA 34 can be determined in the direction of the arrow in FIG. 4 (d-3).
  • an enzyme solution necessary for cDNA fragmentation and poly A addition reaction is introduced into the space 2 in a state where the activity of these enzymes is low (eg, 4 ° C.). Then, the fragmented cDNA is captured by the DNA probe 31 in the same manner as the mRNA in FIG. 3 (a), the complementary strand is synthesized in the same manner as in FIG. 3 (b), and then alkali-denatured or heat-denatured. By flowing the washing solution, the state shown in FIG. 3 (c) can be produced for the fragmented cDNA. By making the base length of the fragmented cDNA shorter than the base length that can be sequenced, it becomes possible to analyze the sequence of the entire cDNA region.
  • the upper space 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 is individualized, Prevents contamination of mRNA derived from cells. Thereafter, in a state where the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 are in communication with each other, the cDNA library can be adjusted using the captured mRNA and the base sequence of the cDNA can be determined. That is, after the nucleic acid molecules are captured in the plurality of nucleic acid capture regions 4, the nucleic acid analysis process can be simultaneously performed in all the nucleic acid capture regions 4. Therefore, even if a plurality of nucleic acid capture regions 4 are used, the reagents can be used in common and the supply and discharge operations of the reagents can be shared. Can be improved.
  • FIG. 5 shows a sample preparation method for performing gene expression analysis by selectively sequencing only such specific genes.
  • 20 types (ATP5B, GAPDH, GUSB, HMBS, HPRT1, RPL4, RPLP1, RPS18, RPL13A, RPS20, ALDOA, B2M, EEF1G, SDHA, TBP, VIM, RPLP0, RPLP2, RPLP27 and OAZ1 20 ⁇ 5 bases upstream of 109 ⁇ 8 bases from the polyA tail of the target gene can be used for the gene-specific sequence of () (SEQ ID NOs: 3 to 22).
  • the nucleic acid molecule to be captured is mRNA, but the capture target may be genomic DNA or microRNA.
  • genomic DNA when genomic DNA is targeted, a restriction enzyme that cleaves DNA is mixed in a solution for cell disruption, and the solution is introduced together with cells at a sufficiently low temperature for restriction enzyme and cell disruption activity, and then raised to a suitable temperature. That's fine.
  • a random 6-base mixed probe may be used in place of the poly-T probe in order to capture the genome sequence, or a mixed probe having a specific sequence of restriction enzyme may be used as the nucleic acid capturing means.
  • the measurement target is microRNA
  • the cell disruption solution is the same as that of mRNA, and a mixed probe having a complementary sequence may be fixed to a part of the microRNA to be measured instead of the poly T probe.
  • the array device for nucleic acid analysis has an excellent effect when immobilizing a DNA probe.
  • a region to be a plurality of nucleic acid capture regions 4 is made hydrophilic as described above, and then 0.3 mg / ml silanized pulling agent GTMSi (GTMSi: 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)
  • GTMSi silanized pulling agent
  • An aqueous solution containing 0.02% acetic acid (Shin-Etsu Chemical) and acid catalyst is introduced into space 2, and a nonpolar solvent such as mineral oil is immediately introduced.
  • the DNA probe can be fixed to a plurality of regions having a hydrophilic surface, and a plurality of nucleic acid capturing regions 4 can be formed on the transparent substrates 5 and 6 and the cell capturing partition wall 7.
  • a state where the upper spaces of the plurality of hydrophilic surfaces are in communication with each other and an individualized state are created so that the DNA probe is not fixed to a region other than the hydrophilic surface. Can be.
  • FIG. 6 shows the flow of the entire analysis
  • FIGS. 7 and 8 show the configuration of the entire system.
  • a cell suspension solution is introduced into the reaction device, and the cells are captured by the through-hole 1 that is a cell capturing means.
  • a microscopic image of the captured cells is acquired.
  • the microscopic image is preferably an optical image that can be obtained without significantly destroying the cell shape, such as a fluorescent image, a bright field image, or a non-linear microscopic image.
  • reaction solution is separated for each single cell by introducing a nonpolar solvent such as mineral oil into the array device for nucleic acid analysis.
  • a nonpolar solvent such as mineral oil
  • This is synonymous with individualizing the upper spaces 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 by introducing a nonpolar solvent such as mineral oil into the array device for nucleic acid analysis.
  • a sample that can be sequenced In the case of this example, cDNA is synthesized by reverse transcription, then mRNA is degraded, and sequencing primers are hybridized. Thereafter, sequencing of the sample is simultaneously performed in a plurality of nucleic acid capture regions 4. By associating the sequencing data with the microscopic image, it is possible to take correspondence between imaging and gene analysis.
  • the nucleic acid analysis apparatus includes a device mounting unit 20 on which the above-described nucleic acid analysis array device is mounted, and liquid supply to the nucleic acid analysis array device mounted on the device mounting unit 20. And the result of nucleic acid analysis performed using the array device for nucleic acid analysis placed on the device placement unit 20 and the water supply / drainage control unit 30 for controlling the discharge of the liquid supplied to the array device for nucleic acid analysis.
  • the detection part 40 to be provided.
  • the device mounting unit 20 is not particularly limited as long as the device mounting unit 20 is equipped with an array device for nucleic acid analysis to enable predetermined nucleic acid analysis processing.
  • the device placement unit 20 includes a Peltier element 74 that adjusts the temperature of the array device for nucleic acid analysis placed on the upper surface, and a rotating stage 75 that rotates the array device for nucleic acid analysis in-plane together with the Peltier element 74. And an XYZ stage 76.
  • the rotation stage 75 and the XYZ stage 76 are controlled by a control system 77.
  • the water supply / drainage control unit 30 may supply and discharge liquid to and from the nucleic acid analysis array device mounted on the device mounting unit 20 according to a predetermined nucleic acid analysis process, and the configuration thereof is not particularly limited.
  • the water supply / drainage control unit 30 supplies the reagent reservoir 83 in which a plurality of reagent tubes 81 are arranged, the reagents in the reagent tube 81 into the array device for nucleic acid analysis, and the solution in the array device for nucleic acid analysis.
  • a syringe 85 for discharging and a waste liquid bottle 86 for storing the solution are provided.
  • the reagent reservoir 83, the syringe 85, the nucleic acid analysis array device, and the waste liquid bottle 86 are connected to each other via a pipe, and the pipes are connected by a plurality of pinch valves 87 to 93 arranged on the pipe. Communication and blockage can be controlled.
  • a sipper 82 for aspirating reagents from a plurality of reagent tubes 81 is connected to the syringe 85.
  • the reagent reservoir 83 is attached to the XYZ stage 84 so as to be accurately positioned with respect to the shipper 82.
  • the detection unit 40 is not particularly limited as long as it can detect an analysis result corresponding to a predetermined nucleic acid analysis process.
  • the detection unit 40 includes an excitation light irradiation optical system including a mercury lamp 71, an irradiation lens 72, an excitation filter 73, a dichroic mirror 78, and an objective lens 74, and a fluorescence detection optical system including an imaging lens 79 and an image sensor 80. It consists of.
  • a cell to be measured is excited and irradiated through the lens 74.
  • Annexin V FITC and Hoechst Dye are used as the fluorescent dyes of cells, the former shows 535 nm emission with 488 nm excitation, and the latter shows 465 nm emission with 355 nm excitation.
  • the former fluorescence can stain the cell membrane in the apoptotic process, and the latter can stain the nucleus.
  • the dichroic mirror 78 suitable for such imaging has an edge wavelength of 505 nm when FITC fluorescence is imaged, and has an edge wavelength of 385 nm when Hoechst fluorescence is imaged.
  • An imaging lens 79 arranged so as to form an image at a magnification of 40 on the image sensor 80 was arranged. Since only one cell image fits on the imaging area of the imaging device 80, the cell is handled by moving the array device for nucleic acid analysis using the XYZ stage 76 in order to capture a large number of cells.
  • a reaction system for sample preparation will be described with reference to FIG.
  • a method for introducing a cell solution and various reagents into the two inlets 11 and 12 of the array device for nucleic acid analysis will be described.
  • the cell solution and the various reagents are respectively dispensed into the reagent tube 81, and the temperature is adjusted to be an appropriate temperature by the reagent reservoir 83 (for example, 4 ° C., 37 ° C., and 60 ° C. for each reagent type). Setting).
  • This reagent reservoir 83 is mounted on the XYZ stage 84, and after adjusting the XY position so that a necessary reagent or sample can be selected and sucked from the sipper 82, the reagent reservoir 83 is moved in the Z direction in the figure to Allow the tip to sink into the solution.
  • the pinch valve 87 is opened, the pinch valves 88 and 89 are closed, and the syringe 85 is pulled.
  • pinch valves 89, 90, 91, 92, and 93 are opened, pinch valves 87 and 88 are closed, and syringe 85 is pushed.
  • the solution discharged from the nucleic acid analysis array device is stored in the waste liquid bottle 86. Further, the excessively aspirated reagent is discharged to the waste liquid bottle 86 by opening the pinch valve 88, closing the pinch valves 87 and 89, and pushing the syringe 85. In this way, it is possible to automatically execute the various reactions shown in FIGS. 3, 4, and 5 under the control of the control system 77 for supplying and discharging reagents to and from the array device for nucleic acid analysis.
  • single molecule sequencing refers to fluorescence measurement of the base extension process for each molecule of cDNA immobilized on the nucleic acid capture region 4, as shown in FIGS. 4 (d-3) and 5 (e-2). To determine the sequence of full length or part 34 thereof.
  • a laser 97 is incident from the transparent substrates 5 and 6 and the side surface of the cell-capturing partition wall 7 through the coupling lens 96 to obtain multiple reflected light.
  • the phosphor on the DNA immobilized on the surface is excited in TIR (Total Internal Reflection) mode.
  • An image of a firefly spot for each molecule on the nucleic acid capture region 4 is taken by the image sensor 80, and which of the four types of bases (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP) is introduced by the control system 77. Sequencing is performed for each spot in light of the above information.
  • the TIR excitation rotates the rotary stage 75 by 90 degrees, and the fluorescence images at the time of excitation from two directions of 0 degrees and 90 degrees are divided into two images.
  • the reason for doing this is that it is difficult to determine the base sequence that exists on the same straight line as the through-hole 1 because it is the through-hole 1 that is a cell trapping means. Of course, this is not the case when the cell trapping means is not a through-hole 1 but a chemical action by surface treatment as will be shown later.
  • reagents are injected from inlets 11 and 12 and discharged from outlets 13 and 14. Thereby, the reagents supplied to the space 2 can be kept at a uniform concentration.
  • a PCR product 63 having a cell recognition sequence for each cell is synthesized. May be. Specifically, as shown in FIG. 9, first, a cell recognition sequence having a different sequence for each position of the nucleic acid capture region 4 and a PCR amplification common sequence (Forward direction) are sequentially connected to the 5 ′ end of the poly-T sequence. A DNA probe having an oligonucleotide having a base sequence thus prepared is immobilized according to the method described above.
  • a PCR product 63 having a cell recognition sequence for each cell can be obtained as a result of the process shown in FIGS. 9 and 10, and cell identification information can be obtained even when sequencing is performed outside the array device for nucleic acid analysis. You can avoid losing.
  • FIGS. 9 and 10 The reaction of FIGS. 9 and 10 will be described below.
  • the process up to the synthesis of the cDNA of FIG. 9 is the same as that shown in FIG.
  • a solution containing the fragmenting enzyme and the poly-A-added enzyme is introduced into the space 2 from the inlets 11 and 12 at a low temperature (4 ° C.), and mineral oil is immediately introduced in the same manner.
  • region 4 can be individualized similarly to the state shown in FIG.
  • fragmentation of the synthesized cDNA at a predetermined reaction temperature and addition of poly A to the fragment are simultaneously performed, and a fragment obtained by adding poly A51 to the fragmented cDNA 34 as shown in FIG.
  • the PCR solution 63 is obtained by substituting the inner solution and mineral oil and adding 20 thermal cycles of 96 ° C. (30 seconds) and 55 ° C. (1 minute 30 seconds). This is discharged from the outlets 13 and 14 to the outside of the device, collected, and then processed for sequencing. Since the sequence information obtained as a result includes cell recognition sequence information, it is possible to know which nucleic acid capture region 4 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 belongs to the cDNA.
  • the above-described array device for nucleic acid analysis includes transparent substrates 5 and 6 and a cell-capturing partition wall 7 as shown in FIG. Although the region 4 is formed, the array device for nucleic acid analysis according to the present invention is not limited to this configuration.
  • the array device for nucleic acid analysis may be one in which a plurality of nucleic acid capture regions 4 are formed only in the cell capture partition wall 7.
  • the transparent substrates 5 and 6 do not need to be subjected to a treatment for imparting hydrophilicity or a water repellent treatment, and can have a simpler configuration.
  • a nonpolar solvent such as mineral oil is introduced so that droplets of the aqueous solution cover a plurality of nucleic acid capture regions 4.
  • the upper space 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 can be individualized.
  • the cell capturing partition wall 7 sandwiched between the transparent substrates 5 and 6 is flat as shown in FIG.
  • the configuration is not limited.
  • the array device for nucleic acid analysis may include a rib 1801 and a cell capturing partition wall 7 in which a nucleic acid capturing region 4 is formed in a recess surrounded by the rib 1801. . That is, in the array device for nucleic acid analysis shown in FIG. 12, the inner surface (that is, the side surface and the bottom surface) constituting the recess and the outer edge region surrounding the recess are high hydrophilic surfaces, and the DNA probe is immobilized on the bottom surface in the recess. Yes.
  • the nonpolar solvent such as mineral oil
  • the nonpolar solvent is held in the space formed by the upper surface of the rib 1801 and the transparent substrates 5 and 6, and The upper space part 8 of the nucleic acid capture region 4 will be individualized.
  • the thickness of the portion where the nonpolar solvent such as mineral oil is accumulated is reduced, and the individualized state can be formed more stably.
  • the array device for nucleic acid analysis described above has a configuration including a cell-capturing partition wall 7 sandwiched between transparent substrates 5 and 6, as shown in FIG.
  • the configuration is not limited.
  • a space 2 is constituted by a pair of transparent substrates 5 and 6, and a single cell is captured by any one of these transparent substrates 5 and 6.
  • the array device for nucleic acid analysis has a cell capture processing unit 1301 at substantially the center of the plurality of nucleic acid capture regions 4 formed on the transparent substrate 6.
  • the size of the cell capture processing unit 1301 can be appropriately set according to the diameter of the cell to be captured. More specifically, the cell capture processing unit 1301 can be obtained by fixing fibronectin at a high density over a diameter of 1 ⁇ m.
  • the array device for nucleic acid analysis can supply and discharge the liquid to and from the space 2 by the inlet 11 and the outlet 14, and the configuration can be simplified.
  • the reaction procedure using these inlet 11 and outlet 14 is as follows.
  • a cell solution suspended in a culture solution, physiological saline or serum is allowed to flow from the inlet 11 to the outlet 14.
  • the cells come into random contact with the cell capture region by Brownian motion, and the cells are captured by selective binding between the cell membrane and the substance fixed to the cell capture processing unit 1301.
  • the size of the cell is larger than the size of the cell capture processing unit 1301, the possibility that two or more cells are captured by the same cell capture processing unit 1301 is small.
  • a cell disrupting solution is flowed from the inlet 11 toward the outlet 14. It is common to use a buffer solution containing a surfactant.
  • Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.5% Tween 20 and 1M NaCl can be used.
  • a nonpolar solvent such as mineral oil is allowed to flow from the inlet 11 to the outlet 14.
  • the solution containing the surfactant is left only in the upper space 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 subjected to the hydrophilic treatment.
  • the upper space portion 9 in the region is filled with mineral oil.
  • the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 can be individualized.
  • single cells can be crushed in an individualized state.
  • the aqueous solution is allowed to flow from the inlet 11 toward the outlet 14, whereby mineral oil (nonpolar solvent) is discharged, separation of the solution is eliminated, and the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4. Can be communicated with the aqueous solution.
  • the array device for nucleic acid analysis shown in FIG. 13 has a configuration in which a plurality of nucleic acid capture regions 4 are formed on each of the transparent substrates 5 and 6, but the array device for nucleic acid analysis according to the present invention has this configuration. It is not limited.
  • the array device for nucleic acid analysis may have a configuration in which a plurality of nucleic acid capture regions 4 are formed only on the transparent substrates 5 and 6 that have cell capture means. That is, the array device for nucleic acid analysis includes a transparent substrate 6 having a plurality of nucleic acid capture regions 4 and a cell capture processing unit 1301 formed substantially at the center of the nucleic acid capture region 4 as shown in FIG.
  • the nucleic acid analysis array device configured as described above can reduce the costs associated with the water-repellent process and the process of imparting hydrophilicity.
  • the nucleic acid analysis array device configured in this way makes it easier to introduce and discharge mineral oil without the aqueous solution droplets coming into contact with the transparent substrate 5.
  • the transparent substrate 6 on which the plurality of nucleic acid capture regions 4 having the cell capture processing unit 1201 is formed is flat, but the array for nucleic acid analysis according to the present invention.
  • the device is not limited to this configuration.
  • the array device for nucleic acid analysis may have a plurality of nucleic acid capture regions 4 each having a cell capture processing unit 1201 formed in a recess.
  • the inner surface (that is, the side surface and the bottom surface) constituting the recess is a highly hydrophilic surface, and the DNA probe is immobilized on the bottom surface in the recess.
  • the nucleic acid analysis array device configured in this way makes it easier to introduce and discharge mineral oil without the aqueous solution droplets coming into contact with the transparent substrate 5.
  • the reaction in the array device for nucleic acid analysis is not limited to the single molecule sequence reaction as shown in FIG. 3 or FIGS. That is, the reaction in the array device for nucleic acid analysis, as shown in FIG. 16, performs amplification using one molecule as a seed, and performs gene expression analysis at the single cell level by sequence analysis (sequencing) of this amplification product. It may be a thing. That is, in this example, instead of using a single molecule sequence, after amplification using a single molecule as a seed, sequencing is performed on the cluster of amplified products.
  • the nucleic acid analysis array device used in this example may be the same as that described above.
  • the reaction procedure shown in this example is the same up to (d-1) in FIG. 3 and FIG.
  • the DNA probe has a higher density, for example, a fixed surface density of 1 molecule or more in a 5 nm square.
  • a fixed surface density for example, a fixed surface density of 1 molecule or more in a 5 nm square.
  • immobilization surface density by immobilizing a gel or polymer such as acrylamide on the surface of the plurality of nucleic acid capturing regions 4 and immobilizing a DNA probe on the polymer.
  • one molecule of DNA probe can be fixed to 1 nm square.
  • FIG. 16 (f-1) is the same as FIG. 4 (d-2), and the poly T probe 36 hybridizes to the poly A probe 35 added to the end (the base length of poly T is 30 bases and the 3 ′ end is VN).
  • Bst polymerase with strand displacement activity and substrate (dNTP) are introduced in an amount equal to the internal volume of space 2 of the array device for nucleic acid analysis, and the temperature is set to 42 degrees (temperature near the melting temperature of poly T hybrid). Hold for 2 hours to react.
  • amplification reaction called template wakening reaction (see PNAS, vol. 110, No. 35, (2013) p. 14320-14323), that is, Fig.
  • the materials that can be used as the transparent substrates 5 and 6 and the cell capturing partition 7 are also resin. A variety of materials can be selected. That is. In this example, a transparent cyclic polyolefin used as a resin material with low background fluorescence can be used, but a transparent polycarbonate may be used.
  • the whole cDNA was amplified. As shown in FIGS. 9 and 10, the full-length cDNA was fragmented and then complementary strand synthesis was performed. Needless to say, the amplification step may be performed by synthesizing the sample in the state of f-1).
  • bridge amplification described in Nucleic Acids Res. Vol. 34, 22e (2006) may be used as an amplification method from one molecule.
  • the DNA sequencing method different from the single molecule sequencing reaction as shown in FIG. 3 or FIGS. 9 and 10 has been described.
  • the array device for nucleic acid analysis according to the present invention The nucleic acid analysis apparatus and the nucleic acid analysis method are not limited to the DNA sequencing method.
  • the array device for nucleic acid analysis, the nucleic acid analysis apparatus, and the nucleic acid analysis method according to the present invention include other quantification methods for quantifying DNA sequences, as shown in Nature biotechnology vol. 26, (3), p. 317 (2008), for example. It goes without saying that the method may be used.
  • the control means for communicating or individualizing the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 compares the nucleic acid capture region with the region surrounding the nucleic acid capture region, the nucleic acid The capture region was to have a high hydrophilic surface.
  • the control means for communicating or individualizing the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 at a high level is not limited to such a form.
  • the second embodiment has a first substrate on which a plurality of nucleic acid capture regions 4 are formed, and a second substrate disposed at a position facing the first substrate, and the first substrate and the second substrate. Are in contact with or separated from each other, the upper space portions 8 of the plurality of nucleic acid capture regions 4 are communicated with each other or individualized.
  • the array device for nucleic acid analysis includes a first substrate 1701 in which a plurality of nucleic acid capture regions 4 are formed in a recess, and a first substrate 1701 that can be contacted and separated. And a second substrate 1702 provided.
  • a cell capture processing unit 1703 is formed at substantially the center.
  • the cell capture processing unit 1703 is a substantially circular shape having a diameter of 1 ⁇ m, and fibronectin is fixed at a high density.
  • the second substrate 1702 includes an inlet 11 that supplies a liquid to the space 2 and an elastic member 1704.
  • the elastic member 1704 is formed from a rubber material having waterproofness and elasticity. When the movable stage 1705 pushes down the second substrate 1702 inside the elastic member 1704, the second substrate 1702 can come into contact with the first substrate 1701.
  • the upper space of the plurality of nucleic acid capture regions 4 Will be in communication with the solution.
  • the movable stage 1705 pushes down the second substrate 1702 and the second substrate 1702 comes into contact with the first substrate 1701, the upper space portions of the plurality of nucleic acid capture regions 4 are individualized. At this time, excess liquid is discharged from the outlet 14 to the outside.

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Abstract

核酸分子を捕捉する複数の核酸捕捉領域を有し、これら複数の核酸捕捉領域を用いて複数のサンプルを同時に解析する。本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは、基盤と、当該基盤の少なくとも一主面に配置され、核酸を捕捉する核酸捕捉手段を有する複数の核酸捕捉領域と、当該複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化する制御手段とを備える。

Description

核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法
　本発明は、核酸分子を捕捉する複数の核酸捕捉領域を有する核酸解析用アレイデバイス、当該核酸解析用アレイデバイスを用いた核酸解析装置及び核酸解析方法に関する。
　解析対象の核酸分子を含む溶液を、特定の塩基配列（例えばポリT配列）のプローブ核酸に作用させることで、上記溶液に含まれる核酸分子をプローブ核酸で捕捉し、その後、核酸増幅反応や塩基配列決定といった各種の核酸解析処理が行われる。このような核酸解析処理には、多数の細胞から構成される生体組織や培養細胞から抽出した核酸を解析対象とするバルク解析と、生体組織を構成する個々の細胞から抽出した核酸を解析対象とする単一細胞解析とがある。
　バルク解析及び単一細胞解析としては、例えば塩基配列解析といったゲノム解析を挙げることができるゲノム解析には、すべてのゲノムを解析するWhole Genome Analysisやエクソン領域のみを解析するWhole Exsome Analysisなどがある。また、ゲノムの転写制御を解析するエピジェネティクス解析では、核酸分子のメチル化されている位置を解析する方法が知られており、さらに、ヒストンタンパクの修飾などクロマチン修飾位置を解析するための方法もChip-Seq法として知られている。ゲノムから転写されたmRNAの量を解析する方法は遺伝子発現解析として知られている。
　例えば、単一細胞解析方法としては、特許文献１に示すように、多孔質メンブレンなどを利用して、２次元的に広がった組織内の各細胞又は細胞の部位に対応したcDNAライブラリーシートを作製し、これを用いて遺伝子発現の２次元分布を得て、多数の細胞中の遺伝子発現解析を実現できるデバイスが開発されている。特許文献１に開示されたデバイスを用いて単一細胞中の遺伝子発現解析するときには、細胞を単離する必要がなく、生体組織の切片中の細胞から、直接mRNAを取り出し、遺伝子発現解析することもできる。
　このようなデバイスを利用する場合、例えば非特許文献１に記載されるテンプレートウォーキング反応とよばれる増幅反応や、非特許文献２に記載されるようなDNA定量方法を実施することができる。
PNAS, vol. 110, No. 35, (2013) p. 14320-14323 Nature biotechnology vol. 26, (3), p. 317 (2008)
ＷＯ２０１１／０６８０８８
　ところが、上述したバルク解析及び単一細胞解析のいずれにおいても、複数のサンプルを同時に解析する場合、サンプルの数に応じたデバイスが必要であり、単一のデバイスを用いて複数のサンプルを処理することはできない。これは、サンプル間のコンタミネーションにより、正確な解析結果が得られないためである。すなわち、複数のサンプルを同時に解析する場合、解析対象の核酸分子を捕捉して解析を行う複数の領域が互いに連通しないよう、予め個別化したデバイスを使用することとなる。
　この場合、個別化された複数の領域に対して試薬類を個別に供給し、個別に解析処理を実行するに過ぎず、複数のサンプルを同時に単一のデバイスを用いて解析するものではなかった。
　そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、核酸分子を捕捉する複数の核酸捕捉領域を有し、これら複数の核酸捕捉領域を用いて複数のサンプルを同時に解析することができる核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、複数の核酸捕捉領域の上方空間部の連通及び個別化を適宜制御することで、複数の核酸捕捉領域を用いてもサンプルのコンタミネーションを防止し、複数の核酸解析処理を実行できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
　（１）基盤と、当該基盤の少なくとも一主面に配置され、核酸を捕捉する核酸捕捉手段を有する複数の核酸捕捉領域と、当該複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化する制御手段と、を備える核酸解析用アレイデバイス。
　（２）上記制御手段は、上記核酸捕捉領域と当該核酸捕捉領域を囲う領域とを比較したときに上記核酸捕捉領域が高い親水性表面とすることを特徴とする（１）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（３）上記核酸捕捉領域は、１又は複数の細胞を捕捉する細胞捕捉手段を有していることを特徴とする（１）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（４）上記核酸捕捉領域は、上記核酸捕捉領域に形成された細胞より小径の貫通孔であることを特徴とする（３）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（５）上記核酸捕捉領域は、上記基盤の一主面に形成された凹部の内面、又は当該凹部の内面と当該凹部の外周を囲う領域とであり、上記核酸捕捉手段が上記凹部の底面に固定されていることを特徴とする（１）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（６）上記基盤で形成される空間に液体を供給する及び当該空間内の液体を排出するための給排水機構を更に有することを特徴とする（１）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（７）上記基盤は所定の間隔をもって配設された一対の基板であり、上記複数の核酸捕捉領域は当該一対の基板の互いに対向する面における対向する領域に形成されたことを特徴とする（１）記載の核酸解析用アレイデバイス。
　（８）上記（１）乃至（７）いずれかに記載の核酸解析用アレイデバイスを搭載するデバイス載置部と、上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスに対する液体の供給及び当該核酸解析用アレイデバイスに供給された液体の排出を制御する給排水制御部と、上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスを用いて実行された核酸解析の結果を検出する検出部とを備える核酸解析装置。
　（９）上記給排水制御部により上記核酸解析用アレイデバイスに対して供給する液体として、少なくとも、核酸解析試薬と非極性溶媒とを備えることを特徴とする（８）記載の核酸解析装置。
　（１０）上記給排水制御部により上記核酸解析用アレイデバイスに対して供給する液体として、細胞懸濁液を備えることを特徴とする（８）記載の核酸解析装置。
　（１１）上記給排水制御部は、上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスに対して、核酸解析試薬を供給した後に非極性溶媒を供給し、上記核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域上の空間に核酸解析試薬を滞留させるとともに非極性溶媒により各核酸捕捉領域を個別化することを特徴とする（８）記載の核酸解析装置。
　（１２）上記（１）乃至（７）いずれかに記載の核酸解析用アレイデバイスに対して、当該核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通した状態で核酸解析試薬を供給する工程と、その後、当該核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域を個別化した状態で核酸解析を実行する工程とを含む核酸解析方法。
　本発明に係る核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法によれば、サンプルのコンタミネーションを防止し、複数の核酸捕捉領域を用いて複数の核酸解析処理を同時に実行することができる。よって、本発明に係る核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法を適用することによって、解析対象の核酸分子に関する解析処理の効率を大幅に向上させることができる。
本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスにおいて複数の核酸捕捉領域を個別化した状態を示す要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスを用いたcDNA作製方法を示す概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスにおける単分子シーケンス段階を示す概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスにおける単分子シーケンス段階を示す概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析装置における解析処理のフローチャートである。 本発明を適用した核酸解析装置の概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析装置の概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスを用いた他のcDNA作製方法を示す概略構成図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスを用いた他のcDNA作製方法を示す概略構成図である。 本発明を適用した他の核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した更に他の核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した更に他の核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した更に他の核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した更に他の核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。 本発明を適用した核酸解析用アレイデバイスを用いた他のcDNA作製方法を示す概略構成図である。 本発明を適用した他の実施形態に係る核酸解析用アレイデバイスの要部断面図及び平面図である。
　以下、本発明に係る核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法を、図面を参照して詳細に説明する。
　核酸解析用アレイデバイスは、基盤の少なくとも一主面に配置された複数の核酸捕捉領域を備えている。ここで基盤とは、複数の核酸捕捉領域を形成する支持体を意味している。基盤としては、例えば平板状の板部材を挙げることができるが、必ずしも平板状である必要はなく、如何なる形状の部材、例えばシート、メンブレン、ゲル薄膜、キャピラリープレート、ビーズ、フィルムといった部材を使用することができる。
　基盤の材料としては、特に限定されず、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。
　例えば基盤としてシートを用いる場合には、例えばアルミナ、ガラスなどからシートを作製することができる。また基盤としてゲル薄膜を用いる場合には、例えばアクリルアミドゲル、ゼラチン、修飾ポリエチレングリコール、修飾ポリビニルピロリドン、ハイドロゲルなどを用いてゲル薄膜を作製することができる。基盤としてメンブレンを用いる場合には、例えばセルロースアセテート、ニトロセルロース又はこれらの混合メンブレン、ナイロンメンブレンなどを用いることができる。基盤としてビーズを用いる場合には、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。なお、以下の説明においては、平板状の板部材を基盤として使用する例を説明し、この場合、基盤を「基板」と表記する。
　また、核酸捕捉領域とは、捕捉対象の核酸分子を含む溶液が接触したときに当該核酸分子を捕捉することができる核酸捕捉手段を備える領域を意味する。ここで、核酸捕捉手段は、核酸捕捉領域の全体に亘って備わっていても良いし、核酸捕捉領域の一部に備わっていても良い。複数の核酸捕捉領域とは、少なくとも２つの核酸捕捉領域が所定の間隔を持って隣り合うように配置されていることを意味する。
　核酸捕捉手段とは、特に限定されないが、所定の塩基配列を有する核酸プローブを挙げることができる。より具体的に、核酸プローブとしては、捕捉対象となる核酸分子に応じて適宜設計することができる。捕捉対象の核酸分子としてメッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、及びDNA（ゲノムDNA及びミトコンドリアDNAを含む）、並びにそれらの断片を挙げることができる。核酸プローブは、これらの核酸分子とハイブリダイズして捕捉することができるものであれば特に限定されるものではなく、当業者には公知である。例えば捕捉対象の核酸分子がmRNAの場合には、核酸プローブとしてポリT配列を含むDNAプローブを用いることが好ましい。ポリT配列を含むDNAプローブ、すなわちオリゴ（dT）は、常法により合成することができ、オリゴ(dT)の重合度は、mRNAのポリA配列とハイブリダイズして、mRNAをオリゴ(dT)が固定された基板に捕捉しうる重合度であればよい。
　なお、捕捉対象の核酸分子は、例えば、当技術分野で公知の方法により細胞より抽出することができる。例えば、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。捕捉対象の核酸分子としてmRNAを用いる場合には、上記の細胞溶解により溶出された核酸のうち、DNAをDNA分解酵素（DNase）により分解し、核酸としてRNAのみを含む試料が得られる。
　核酸解析用アレイデバイスは、複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化する制御手段を有している。ここで、上方空間部とは、核酸捕捉領域が形成された基板の主面、すなわち核酸捕捉手段が配設された主面に対して上方に位置する空間を意味する。複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通するとは、例えば、基板の上記主面に液体を供給したときに、複数の核酸捕捉領域に対応する複数の上方空間部の間で液体の流動が可能であることを意味する。一方、複数の核酸捕捉領域の上方空間部を個別化するとは、複数の核酸捕捉領域に対応する複数の上方空間部の間で上記液体の流動が不可能であり、各上方空間部を独立した状態にすることを意味する。
　制御手段としては、一例として、核酸捕捉領域と当該核酸捕捉領域を囲う領域とを比較したときに核酸捕捉領域が高い親水性表面とすることを挙げることができる（以下、第１の実施形態）。言い換えると、核酸捕捉領域と当該核酸捕捉領域を囲う領域とを比較したときに核酸捕捉領域が高い親水性表面とすると、複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化することができる。ここで、核酸捕捉領域が高い親水性表面であるとは、核酸捕捉領域の表面と核酸捕捉領域を囲う領域の表面との親水性を比較して、核酸捕捉領域の表面が相対的に高い親水性を有しているということである。なお表面の親水性を定量的に評価するには、例えば水滴接触角（WCA）を使用することができる。つまり、核酸捕捉領域の表面の水滴接触角と核酸捕捉領域を囲う領域の表面の水滴接触角を比較して、核酸捕捉領域の表面の水滴接触角が小さければ、核酸捕捉領域がより高い親水性表面となり、複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化することができる。
　すなわち、第１の実施形態では、複数の核酸捕捉領域を配設した基板の主面に水溶液を供給すると、当該溶液により複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通させることができる。一方、この状態から、複数の核酸捕捉領域を配設した基板の主面に非極性溶媒を供給すると、核酸捕捉領域の上方空間部のみに水溶液が残存し、核酸捕捉領域以外の領域の上方空間部の水溶液が非極性溶媒に置き換わる。このように、複数の核酸捕捉領域を配設した基板の主面に水溶液を供給した後に非極性溶媒を供給することで、複数の核酸捕捉領域の上方空間部を個別化することができる。
＜第１の実施形態＞
　　＜核酸解析用アレイデバイス＞
　以下、上述で概要を説明した第１の実施形態についてより詳細に説明する。一例として、核酸解析用アレイデバイスは、図１に示すように、一対の透明基板５及び６と、透明基板５及び６の間に配設された細胞捕捉用隔壁７と、側壁１０とから構成され、透明基板５及び６、細胞捕捉用隔壁７及び側壁１０により形成される内部に空間２を有している。この核酸解析用アレイデバイスは、浮遊細胞を細胞捕捉用隔壁７に捕捉し、捕捉した細胞から遊離したmRNAを透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７に形成された複数の核酸捕捉領域４で捕捉し、捕捉したmRNAを解析処理（cDNAの合成、配列解析）するものである。すなわち、核酸解析用アレイデバイスを利用することで、単一細胞レベルでの遺伝子発現解析を行うことができる。
　図１に示した核酸解析用アレイデバイスにおいて、一対の透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７には、核酸捕捉手段としてDNAプローブ（ポリTプローブ）が固定された複数の核酸捕捉領域４がそれぞれ形成されている。ここで、透明基板５に形成された複数の核酸捕捉領域４と、細胞捕捉用隔壁７に形成された複数の核酸捕捉領域４と、透明基板６に形成された複数の核酸捕捉領域４とは、互いに対向している。ここで、核酸捕捉領域４の大きさは、隣り合う核酸捕捉領域４が接しない限度で、適宜設定することができる。本例では、核酸捕捉領域４は、直径２００μｍの円形としたが、５μｍ程度から数ｍｍまでの範囲で任意の形状とすることができる。
　複数の核酸捕捉領域４は、その周囲の領域と比較して高い親水性表面を有している。このような親水性表面を形成するには、透明基板５及び６や細胞捕捉用隔壁７の材料となる、例えば厚さ0.2mmの石英基板の一主面において複数の核酸捕捉領域４を形成する領域に、一般的なリソグラフィー技術を用いてレジスト膜を形成する。次に、プラズマフッ素処理（CHF3、C2F6雰囲気中でプラズマアッシング（３００Ｗ））を５分間実行し、レジスト膜で覆われていない領域に対して撥水処理を行う。プラズマフッ素処理の代わりに、フッ素樹脂（例えば、商品名：サイトップ（旭硝子社製））をコーティングすることで撥水処理を行っても良い。そして、レジスト膜を除去することで、レジスト膜が形成されていた領域には撥水加工が施されず、レジスト膜が形成されていた領域以外の領域に撥水加工が施されることとなる。次に、撥水加工を行った領域にレジスト膜を形成して複数の核酸捕捉領域４となる領域のみを露出させる、この状態で基板の一主面に172nmの遠紫外線処理を３分行う。これにより、外方に露出した領域に親水性を付与する処理を施すことができる。
　以上のように、撥水加工と親水性を付与する処理を行うことで、透明基板５及び６や細胞捕捉用隔壁７のそれぞれに、複数の核酸捕捉領域４に対応する領域に親水性表面を形成することができる。なお、撥水加工と親水性を付与する処理とはどちらを先に行っても良い。また、複数の核酸捕捉領域４は、当該複数の核酸捕捉領域４を囲う領域と比較したときに高い親水性を有していれば良いため、上述した撥水加工と親水性を付与する処理とはいずれか一方のみを行えば良い。
　次に、親水性表面にDNAプローブ（ポリTプローブ：配列番号１）を固定するが、DNAプローブの固定化方法については後述する。ここで、DNAプローブは、平均30～100nm2に一個の割合で固定できるので、１つの核酸捕捉領域４には1.2～1.2x107個のDNAプローブが固定されることとなる。単一の細胞中のmRNAのコピー数は、106個以下であるためすべてのmRNAを捕捉するのに十分な数のDNAプローブを固定することが可能となる。
　この例では単一細胞中のすべてのmRNAの5’末端のシーケンシングを実行することによって細胞ごとの網羅的遺伝子発現解析を実行することが可能となる。しかし、シーケンシング対象の遺伝子を特定の遺伝子に数十～数百に絞ることによって、DNAプローブの数を減らすことができる。この場合、核酸捕捉領域４の面積を小とすることができる。
　また、図１に示した核酸解析用アレイデバイスにおいて、細胞捕捉用隔壁７の略中心には、細胞捕捉手段として貫通孔１が穿設されている。貫通孔１は、詳細を後述するように、浮遊細胞を捕捉するものであり、特に限定されないが、捕捉対象の細胞の大きさに応じた径（例えば３～３０μｍ、具体的には８μｍ）とすることが好ましい。また、貫通孔１は、細胞捕捉用隔壁７の両主面から厚み方向に向かって小径となる形状となっている。貫通孔１の数は、なんら限定されず、例えば、細胞捕捉用隔壁７の一主面に数十個～数百万個とすることができる。なお、図１に示した例では、貫通孔１が細胞捕捉用隔壁７の一主面に１次元配列している例である。本例では貫通孔１の間隔は３００μｍとしたが、数十μｍ～数ミリまで自由に設定することができる。なお、本例では、透明基板５及び６と、細胞捕捉用隔壁７との間隔は２００μｍとしたが、数十μｍ～数ミリまで自由に設定することができる。
　なお、貫通孔１を形成するには、特に限定されないが、レーザ加工法を適用することができる。レーザ加工は、細胞捕捉用隔壁７の両面から行うことで両主面から厚み方向に向かって小径となる形状（砂時計型）とすることができる。なお、貫通孔１は、ドライ又はウエットエッチング法を適用して形成しても良い。
　さらに、図１に示した核酸解析用アレイデバイスにおいて、透明基板５にはインレット１１及びアウトレット１３が形成されており、透明基板６にはインレット１２及びアウトレット１４が形成されている。これらインレット１１及び１２は、図示しない液体供給機構と接続されている。また、アウトレット１３及び１４は図示しない排液機構と接続されている。
　　＜核酸解析用アレイデバイスを用いた核酸解析方法＞
　以上のように構成された核酸解析用アレイデバイスを用いた単一細胞レベルでの遺伝子発現解析を行う手順について以下説明する。
　先ず、単一の細胞を貫通孔１に捕捉する。細胞を捕捉するためには、培養液や生理食塩水または血清中に縣濁した細胞溶液をインレット１１からアウトレット１４に向かって流す。細胞溶液は細胞捕捉手段である貫通孔１を通ってインレット１１からアウトレット１４に流れるが、貫通孔１の直径を３～３０μｍに設定してあるため、当該直径よりも大きな細胞３は貫通孔１を通過できず捕捉される。このとき、細胞溶液は、核酸捕捉領域４の上方空間部を含む空間２の全体に充填されることとなり、当該細胞溶液により複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通させた状態となる。
　なお、各貫通孔１で単一の細胞を捕捉し、それ以外の領域には細胞が存在しないようにすることが好ましい。貫通孔１の直径は捕捉する細胞の直径よりも小さくなっており、１つの細胞が捕捉されると溶液の細胞捕捉部分を通過する流れは阻害される。したがって、インレット１１からアウトレット１４への細胞溶液の流れをつくり続けると、ほぼすべての貫通孔１に単一の細胞が捕捉される。なお、過剰な細胞はアウトレット１３から取り除くことができる。
　次に、インレット１１からアウトレット１４の方向に一定の圧力を維持しながら、細胞破砕用溶液をインレット１１からアウトレット１４に向かって流す。このとき、細胞破砕用溶液は、細胞溶液を供給したときと同様に、核酸捕捉領域４の上方空間部を含む空間２の全体に充填されることとなり、当該細胞破砕用溶液により複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通させた状態となる。
　細胞破砕用溶液としては、界面活性剤を含むバッファ溶液を用いることができる。より具体的に、細胞破砕用溶液としては、0.5％のTween 20と1MのNaClを含むTris-HCl(pH8.0)溶液を使用することができる。なお、当該組成の細胞破砕用溶液は、界面活性剤の室温における細胞破砕効果が弱いため、細胞捕捉するときに用いた細胞溶液の溶媒として用いることもできる。
　以上のようにして各貫通孔１に単一の細胞を捕捉した状態で、次に、ミネラルオイル等の非極性溶媒をインレット１１からアウトレット１３および、インレット１２からアウトレット１４に流す。これにより、図２に示すように、細胞破砕用溶液が核酸捕捉領域４の上方空間部８に残留し、核酸捕捉領域４を囲う領域１５の上方空間部９はミネラルオイルで満たされることとなる。このように、細胞破砕用溶液等により連通していた複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８は、核酸捕捉領域４を囲う領域１５の上方空間部９の溶液がミネラルオイルで置き換わることで個別化されることとなる。
　このように、核酸捕捉領域４の上方空間部８に細胞破砕用溶液が残存して、複数の核酸捕捉領域４を個別化した状態で、図示しない温度調整手段により熱処理（例えば、９０℃、５分間）を行い、細胞を破砕する。図３に個々の細胞中のmRNAを核酸捕捉領域４にストレプトアビジン３３を介して固定したDNAプローブ（ポリＴプローブ）３１で捕捉し、cDNAを合成するまで（すなわち、逆転写まで）の手順を示している。破砕された細胞から拡散したmRNAは、個別化された溶液８内にとどまるため、透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７の核酸捕捉領域４に固定化されたDNAプローブ（ポリＴプローブ）３１に捕捉される。図３では細胞捕捉用隔壁７の一部の断面図を示し、その表面の拡大図を(a)～(c)に示した。mRNAを効率よくDNAプローブ３１で捕捉するために空間２内の温度を４０℃から２０℃に１５分程度かけてゆっくりと冷却することが好ましい。
　次に、インレット１１及び１２から洗浄用のバッファ（0.1% Tween 20を含む10mM Tris-HCl、pH8.0）を空間２の内容量の２０倍量導入し、アウトレット１３及び１４から排出する。これによって、上方空間部９にある非極性溶媒であるミネラルオイルを排出する。次に、cDNAの合成に必要な逆転写酵素及び合成基質を含む反応溶液（0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH=8.0) と10mM dNTPと5xRT Buffer (SuperScript III, Invitrogen社)と0.1M DTTとRNaseOUT (Invitrogen社)とSuperscript III(逆転写酵素, Invitrogen社)を５８．５：４：２２．５：４：４で混和した溶液）を空間２の内容積と等量だけ均一に導入する。これによって、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８の個別化状態が解消され、導入した反応溶液により複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８が互いに連通することとなる。
　そして、図３(a)に示すように、DNAプローブ３１により捕捉したmRNA３２を鋳型にしてcDNA鎖３４を合成する。このとき、反応溶液は５０℃にゆっくり昇温して５０分ほど相補鎖合成反応を行う（図３(b)）。その後、８５℃にて１．５分保持し、逆転写酵素を失活させ、４℃に冷却する。その後、反応溶液をアウトレット１３及び１４から排出した後、空間２の内容積と等量の一本鎖ＤＮＡを選択的に分解する酵素溶液を導入することによって過剰なポリプローブを分解する。さらに、内容積と等量のRNase及び0.1%Tween20を含む10mM Tris Buffer (pH = 8.0)を空間２に導入することによって、RNAを分解し、２０倍量の0.1%Tween20を含むTrisHClバッファで空間２内の溶液を置換してmRNAを分解除去する。次いでアルカリ変性剤を含む液及び洗浄液を同様に空間２に順次供給し、残存物および分解物を除去する。以上のプロセスにより、複数の核酸捕捉領域４においてcDNAライブラリーシートを同時に構築することができる。
　次に、増幅の必要のない１分子シーケンシングを行うためのサンプル調製法について図４に示す。ここで示した例はmRNAの5’末端（cDNAの3’末端）のシーケンシング法を示す。上述のようにcDNAライブラリーシートを作製した後、ターミナルトランスフェラーゼを含む溶液を空間２中に均一に導入し、ポリＡ配列３５をcDNAの3’末端に付加する。シーケンシング用プライマーとしてポリＴプローブ３６を含む溶液を空間２に導入する。これによって、図４(d-2)のようにシーケンシングが可能な状態となる。その後、４種類の塩基dATP、dCTP、dGTP及びdTTPにそれぞれ異なる蛍光体が付加されたものを順次空間２に導入し、図４(d-3)に示すように塩基伸長時に対応する色の蛍光が発するかどうかを１分子ごとに計測することによって塩基配列を決定する。１種類の塩基の伸長が完了し次第、蛍光体を分解脱離し、次の塩基の導入を可能なようにする。このような反応を繰り返して、cDNA３４の塩基配列を図４(d-3)の矢印の方向に決定していくことができる。
　なお、図３(c)の状態とした後、図示しないが、cDNAの断片化とポリＡ付加反応に必要な酵素溶液をこれらの酵素の活性が低い状態（例えば４℃）で空間２に導入し、断片化したcDNAに対して図3(a)でのmRNAと同様にDNAプローブ３１で捕捉して、図３(b)と同様に相補鎖を合成後、アルカリ変性または熱変性させて、洗浄溶液を流すことによって断片化したcDNAについて図３(c)の状態を作製することが可能となる。この断片化したcDNAの塩基長をシーケンシング可能な塩基長よりも短い塩基長にすることによって、cDNAのすべての領域の配列解析が可能となる。
　以上で説明したように、複数の核酸捕捉領域４のそれぞれにおいて、単一の細胞に由来するmRNAを捕捉する段階では、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化しておき、他の細胞に由来するmRNAがコンタミネーションすることを防止している。その後、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を互いに連通した状態で、捕捉したmRNAを用いたcDNAライブラリーの調整及びcDNAの塩基配列決定を行うことができる。すなわち、複数の核酸捕捉領域４に核酸分子を捕捉した後は、全ての核酸捕捉領域４において同時に核酸解析処理を行うことができる。したがって、複数の核酸捕捉領域４を用いたとしても、試薬類を共通に利用でき、試薬類の供給や排出作業を共通化することができるため、解析対象の核酸分子に関する解析処理の効率を大幅に向上させることができる。
　なお、上述の例では、単一細胞中のすべてのmRNAの5’末端のシーケンシングを実行することによって１細胞ごとの網羅的遺伝子発現解析を実行することが可能となったが、そのためには、比較的広い核酸捕捉領域４を設ける必要があった。そのため、単位面積あたりに配置することができる細胞捕捉部の数は１平方ｃｍあたり１０００個程度となる。シーケンシングする遺伝子を特定の遺伝子に数十～数百に絞ることによってこの数は２～３桁増やすことが可能となる。このような特定の遺伝子のみを選択的にシーケンシングすることによって遺伝子発現解析を行うためのサンプル調製方法を図５に示す。
　PCR増幅用共通配列(Reverse：配列番号２)が付加された複数（数十~数百種）のターゲット遺伝子特異的配列プライマー３７をcDNA鎖へアニールさせる（図5(e-1)）。その後は上述と同様に相補鎖伸長時に図５(e-2)の矢印の方向に塩基配列を決定することができる。また本例では、一例として、20種類(ATP5B、 GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、RPL4、RPLP1、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、VIM、RPLP0、RPLP2、RPLP27及びOAZ1)の遺伝子特異的配列にターゲット遺伝子のポリAテールから109±8塩基上流部分の20±5塩基を用いることができる（配列番号３～２２）。
　また、上述した例では、捕捉対象の核酸分子をmRNAとしたが、捕捉対象はゲノムDNA及びマイクロRNAでも良い。たとえば、ゲノムDNAを対象とする場合には細胞破砕用の溶液にDNAを切断する制限酵素を混和し、制限酵素や細胞破砕活性の十分低い温度で細胞とともに溶液を導入後、好適な温度まで上げればよい。また、ゲノム配列を捕捉するためにポリＴプローブの代わりにランダムな６塩基の混合プローブを用いるか、制限酵素の特異配列の混合プローブを核酸捕捉手段とすればよい。また、計測対象がマイクロRNAの場合には細胞破砕溶液はmRNAの場合と同じでポリＴプローブの変わりに計測したいマイクロRNAの一部に相補的な配列の混合プローブを固定すればよい。

　　＜核酸解析用アレイデバイスにおけるDNAプローブの固定化＞
　一方、核酸解析用アレイデバイスでは、DNAプローブを固定化する際にも優れた効果を奏する。DNAプローブ（ポリTプローブ）を固定するには、上述のように複数の核酸捕捉領域４となる領域を親水性表面とした後、0.3mg/mlのシラン化プリング剤GTMSi（GTMSi：3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane信越化学）及び酸触媒である0.02%酢酸を含む水溶液を空間２に導入し、ただちにミネラルオイル等の非極性溶媒を導入する。これによって、親水性表面の上方空間部のみに水溶液を残存させるとともに、親水性表面以外の領域（上述の例では疎水加工された表面）の上方空間部にある水溶液をミネラルオイルで置換することができる。すなわち、この処理で、複数の親水性表面の上方空間部を個別化することができる。この状態で２時間反応させる。
　その後、空間２の内容積の１００倍量のエタノールを空間２内に導入することにより内部を洗浄し、その後、溶液をすべて排出し、１１０℃２時間熱反応させる。次に、１μＭストレプトアビジン溶液を空間２に導入することで、当該溶液により複数の親水性表面の上方空間部を互いに連通した状態とし、６時間室温にて反応させる。これにより、親水性表面にストレプトアビジン３３を固定することができる。次に、未反応グリシド基をブロックし、過剰なストレプトアビジンを除去するために、空間２の内容積の１０倍量の10ｍMのグリシンと0.01％SDSと0.15MのNaClを含むホウ酸バッファ(pH 8.5)を5分間かけて導入・排出し、内容積の１０倍量の６０℃に加熱された0.01%のSDSと0.3M NaClを含む30mMクエン酸ナトリウムバッファ（2xSSC、pH 7.0）を通過させる。最後に空間２の内容積の１００倍量の0.1%Tween 20を含む10mTrisを導入・排出し洗浄を完了する。
　そして、空間２の内容積と等量の１０μＭの5’末端をビオチン修飾したポリＴ（３０塩基、末端にＶＮ配列を含む（配列番号１））合成ＤＮＡオリゴマーと１MのNaCl及び0.1%のTween20を含む10mMのTrisHCl溶液を空間２に導入し、３０分反応させた後、再度前記１０倍量の６０℃に過熱された2xSSCバッファを導入・排出後、１００倍量の0.1%Tween 20を含むTris HClバッファを空間２に通過させることによって洗浄する。
　以上の処理により、親水性表面とした複数の領域にDNAプローブを固定することができ、透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７に複数の核酸捕捉領域４を形成することができる。上述した複数の核酸捕捉領域４の作製手順においても、複数の親水性表面の上方空間部を互いに連通した状態と個別化した状態とを作り出し、親水性表面以外の領域にDNAプローブが固定されないようにすることができる。
　　＜核酸解析装置＞
　ところで、上述した核酸解析用アレイデバイスを用いた核酸解析装置のシステム全体の構成について説明する。図６に解析全体のフローを示し、図７及び図８にシステム全体の構成を示した。まず、解析全体のフローについて説明する。まず、細胞縣濁溶液を反応デバイス内に導入し、細胞を細胞捕捉手段である貫通孔１で捕捉する。次に、捕捉した細胞の顕微鏡像を取得する。顕微鏡像は蛍光イメージ、明視野イメージや非線形顕微鏡イメージなど細胞の形状を大幅に破壊せずに取得できる光学像であることが好ましい。次に、核酸解析用アレイデバイス中へミネラルオイルなどの非極性溶媒を導入することによって、単一細胞ごとに反応溶液を分離する。これは、核酸解析用アレイデバイス中へミネラルオイルなどの非極性溶媒を導入することによって、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化することと同義である。
　次に、シーケンシング可能なサンプル調製を行う。本例の場合は、逆転写によってcDNAを合成後、mRNAを分解し、シーケンシング用プライマーをハイブリさせる。その後、複数の核酸捕捉領域４で前記サンプルのシーケンシングを同時に実行する。このシーケンシングデータと前記顕微鏡像を対応させることによって、イメージングと遺伝子解析の対応をとることが可能となる。
　次にこのフローを実現する核酸解析装置のシステム全体構成を説明する。図７及び８に示すように、核酸解析装置は、上述した核酸解析用アレイデバイスを搭載するデバイス載置部２０と、デバイス載置部２０に載置された核酸解析用アレイデバイスに対する液体の供給及び当該核酸解析用アレイデバイスに供給された液体の排出を制御する給排水制御部３０と、デバイス載置部２０に載置された核酸解析用アレイデバイスを用いて実行された核酸解析の結果を検出する検出部４０とを備える。
　デバイス載置部２０は、核酸解析用アレイデバイスを搭載して所定の核酸解析処理を可能とすれば良く、その構成について特に限定されない。一例として、デバイス載置部２０は、上面に載置された核酸解析用アレイデバイスの温度を調整するペルチェ素子７４と、ペルチェ素子７４ごと核酸解析用アレイデバイスを面内に回転させる回転ステージ７５と、ＸＹＺステージ７６とを備える。これら、回転ステージ７５とＸＹＺステージ７６は制御系７７に動作制御されている。
　給排水制御部３０は、所定の核酸解析処理に応じて、デバイス載置部２０に載置された核酸解析用アレイデバイスに対する液体の供給及び排出を可能とすれば良く、その構成について特に限定されない。一例として、給排水制御部３０は、複数の試薬チューブ８１を配置した試薬用リザバ８３と、試薬チューブ８１内の試薬類を核酸解析用アレイデバイス内に供給するとともに核酸解析用アレイデバイス内の溶液を排出するシリンジ８５と、溶液を溜める廃液ビン８６とを備えている。なお、これら試薬用リザバ８３とシリンジ８５と核酸解析用アレイデバイスと廃液ビン８６とは、それぞれ配管を介して連結されており、配管上に配設された複数のピンチバルブ８７～９３によって配管の連通及び閉塞を制御可能となっている。また、給排水制御部３０において、複数の試薬チューブ８１から試薬類を吸引するためのシッパ８２がシリンジ８５と連結している。さらに、給排水制御部３０において、試薬用リザバ８３は、シッパ８２に対して正確に位置決めできるようにＸＹＺステージ８４に取り付けられている。
　検出部４０は、所定の核酸解析処理に応じた解析結果を検出できるものであれば良く、その構成について特に限定されない。一例として、検出部４０は、水銀ランプ７１、照射レンズ７２、励起フィルタ７３、ダイクロイックミラー７８及び対物レンズ７４からなる励起光照射光学系と、結像レンズ７９及び撮像素子８０からなる蛍光検出光学系とから構成される。
　以上のように構成された核酸解析装置では、水銀ランプ７１の励起光源の光を照射レンズ７２でコリメートし、励起フィルタ７３で単色光にして、ダイクロイックミラー７８とNA=0.8で倍率４０倍の対物レンズ７４を介して、計測対象とする細胞を励起照射する。たとえば、細胞の蛍光色素をAnnexin V FITCとHoechst Dyeを用いた場合、前者は488nm励起で535nmの発光を示し、後者は355nm励起で465nmの発光を示す。前者の蛍光でアポトーシス過程にある細胞膜を染色し、後者で核を染色することができる。このイメージングによって細胞の生死を推定することができる。このようなイメージングに適したダイクロイックミラー７８はFITC蛍光のイメージングの時にはエッジ波長505nmのもので、Hoechst蛍光のイメージングの時にはエッジ波長385nmのものである。
　撮像素子８０上に４０倍で結像するように配置した結像レンズ７９を配置した。細胞は撮像素子８０の撮像エリア上には１つの細胞の像しか収まらないため、多数の細胞を撮像するため、ＸＹＺステージ７６を用いて核酸解析用アレイデバイスを移動させて対応している。
　次に、図８を用いてサンプル調製のための反応系について説明する。核酸解析用アレイデバイスの２つのインレット１１及び１２に細胞溶液や各種試薬を導入する方法について説明する。細胞溶液と各種試薬は、それぞれ試薬用チューブ８１に分注され、試薬用リザバ８３により適切な温度となるように温度調整されている（たとえば、試薬の種類毎に４℃と３７℃および６０℃での設定）。この試薬リザバ８３はＸＹＺステージ８４上に載っており、シッパ８２から必要な試薬やサンプルを選んで吸引できるように、ＸＹ位置を調整したうえで、図のＺ方向に移動させて、シッパ８２の先端が溶液内に沈むようにする。試薬や細胞溶液を吸引するときはピンチバルブ８７を開けて、ピンチバルブ８８及び８９を閉めて、シリンジ８５を引く。次に、吸引した試薬等をインレット１１から導入しアウトレット１４から排出する場合、ピンチバルブ８９、９０及び９２を開けて、ピンチバルブ８７、８８、９１及び９３を閉めて、シリンジ８５を押す。細胞溶液を導入して、細胞捕捉させるときがこの場合相当する。また、多くの試薬もこれと同じバルブ開閉状態で対応可能である。一方、洗浄やミネラルオイルを除去する場合は前記状態にセットする前に、インレット１１及び１２の両方から試薬を導入し、アウトレット１３及び１４の両方から排出する開閉状態を選択する。この開閉状態とは、ピンチバルブ８９と９０と９１と９２と９３を開けて、ピンチバルブ８７と８８を閉めて、シリンジ８５を押す。核酸解析用アレイデバイスから排出された溶液は廃液ビン８６にためられる。また、余分に吸引した試薬はピンチバルブ８８を開けて、ピンチバルブ８７、８９を閉めて、シリンジ８５を押すことによって廃液ビン８６に排出される。このように試薬の核酸解析用アレイデバイスへの供給及び排出を制御系７７の制御の元で、図３、４及び５で示した各種反応を自動的に実行することが可能となる。
　次に、単分子（一分子）シーケンシングの方法について説明する。ここで単分子シーケンシングとは図４(d-3)や図５(e-2)で示すように、核酸捕捉領域４に固定されたcDNAを一分子ごとに塩基伸長過程を蛍光計測することによって全長又はその一部３４の配列を決定することを指す。図７に示すように、核酸解析装置は、100mW出力で473nm/515nm/532nmの半導体励起固体レーザと100mW出力で635nmの半導体レーザを合波したレーザモジュール９４を備える。出力はファイバ９５で先端にNA=0.2のカップリングレンズ９６を実装した。カップリングレンズ９６を介して、透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７側面からレーザ９７を入射して多重反射光とする。表面に固定されたＤＮＡ上の蛍光体をＴＩＲ（Total Internal Reflection）モードで励起している。核酸捕捉領域４上の個々の分子毎の蛍スポットのイメージは撮像素子８０で撮影し、制御系７７で４種類の塩基(dATP、dGTP、dTTP及びdCTP)のうちのどの塩基が導入されているかの情報と照らし合わせて、個々のスポットごとに配列決定を行う。このときＴＩＲ励起は回転ステージ７５を90度回転させて、0度と90度の２つの方向からの励起時の蛍光像を２枚の像に分けて撮像する。このようなことをする理由は、細胞捕捉手段である貫通孔１であるため、貫通孔１と同一直線上に存在する塩基配列の決定が困難であるからである。もちろん、後に示すように細胞捕捉手段が貫通孔１でなく表面処理によって化学的作用による場合はこの限りではない。配列決定時には試薬はインレット１１及び１２から注入し、アウトレット１３及び１４から排出する。これによって、空間２に供給された試薬類を均一な濃度に保つことができる。
　　＜核酸解析用アレイデバイスを用いた核酸解析方法の変形例１＞
　ところで、核酸解析用アレイデバイスにおける反応は、図３に示したものに限定されず、例えば、図９及び１０に示すような、細胞ごとに細胞認識配列をもつＰＣＲ産物６３を合成するものであってもよい。詳細には、まず、図９に示すように、ポリT配列の５’末端側に、核酸捕捉領域４の位置ごとに配列の異なる細胞認識配列とPCR増幅用共通配列 (Forward方向)が順に接続された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有するDNAプローブを、上述した方法に準じて固定する。これにより、図９及び１０に示すプロセスの結果、細胞ごとに細胞認識配列をもつＰＣＲ産物６３を得ることができ、シーケンシングを核酸解析用アレイデバイスの外で実行しても細胞の識別情報を失わないようにすることができる。
　以下に図９、１０の反応について説明する。図９のcDNAの合成までは図３で示した方法と同じである。その後、断片化酵素とポリＡ付加の酵素を含む溶液を低温（４℃）で空間２にインレット１１及び１２から導入し、直ちにミネラルオイルを同様に導入する。これにより、図２に示した状態と同様に、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化することができる。その後、所定の反応温度として合成したcDNAの断片化と、断片に対するポリＡ付加を同時に行い、図１０(d)のように断片化したcDNA３４にポリＡ５１が付加ものを合成する。その後、溶液を排出しポリＴにＰＣＲ用共通プライマが接続したプローブをハイブリさせ（図１０(e)）、最後にTaqポリメラーゼとdNTPと適切な金属イオン(Mg2+)を含むバッファで空間２内の溶液及びミネラルオイルを置換し、９６℃（３０秒）と５５℃（１分３０秒）のサーマルサイクルを２０回加えることによってＰＣＲ産物６３を得る。これをデバイスの外にアウトレット１３及び１４から排出し回収後、シーケンシングのための処理を行う。その結果として得られた配列情報には、細胞認識配列情報が含まれているため、複数の核酸捕捉領域４のうちどの核酸捕捉領域４のcDNAのものであるか知ることができる。
　　＜核酸解析用アレイデバイスの変形例＞
　ところで、上述した核酸解析用アレイデバイスは、図１に示すような透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７を含み、これら透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７のそれぞれに複数の核酸捕捉領域４を形成した構成であったが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは本構成に限定されるものではない。例えば、図１１に示すように、核酸解析用アレイデバイスは、細胞捕捉用隔壁７のみに複数の核酸捕捉領域４を形成したものでも良い。この場合、透明基板５及び６には、親水性を付与する処理や撥水処理を行う必要が無く、より簡便な構成とすることができる。また、図１１に示した核酸解析用アレイデバイスでは、空間２内に水溶液を導入した後にミネラルオイル等の非極性溶媒を導入することで、水溶液の液滴が複数の核酸捕捉領域４を覆うこととなり、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化することができる。このような構成にすることによって、水溶液の液滴が透明基板５及び６に接触せずミネラルオイルの導入と排出がより容易となる。
　また、上述した核酸解析用アレイデバイスは、図１に示すように、透明基板５及び６に挟み込まれる細胞捕捉用隔壁７が平板状であったが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは本構成に限定されるものではない。例えば、図１２に示すように、核酸解析用アレイデバイスは、リブ１８０１を有し、リブ１８０１により囲まれる凹部内に核酸捕捉領域４を形成した細胞捕捉用隔壁７を備える構成であってもよい。すなわち、図１２に示す核酸解析用アレイデバイスでは、凹部を構成する内面（すなわち側面と底面）と凹部を囲う外縁の領域が高い親水性表面であり、凹部内の底面にDNAプローブを固定化している。
　この場合、空間２内に水溶液を導入した後にミネラルオイル等の非極性溶媒を導入すると、非極性溶媒は、リブ１８０１の上面と透明基板５及び６とで形成される空間に保持され、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化することとなる。このように、リブ１８０１を設けることによって、ミネラルオイル等の非極性溶媒が溜まる部分の厚さが薄くなり、より安定に個別化状態を形成することが可能となる。
　一方、上述した核酸解析用アレイデバイスは、図１に示すように、透明基板５及び６に挟み込まれる細胞捕捉用隔壁７を備える構成であったが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは本構成に限定されるものではない。例えば、図１３に示すように、核酸解析用アレイデバイスは、一対の透明基板５及び６により空間２を構成し、これら透明基板５及び６のいずれか一方で単一の細胞を捕捉するような構成であってもよい。例えば、核酸解析用アレイデバイスは、透明基板６に形成された複数の核酸捕捉領域４の略中心部に細胞捕捉処理部１３０１をそれぞれ有している。細胞捕捉処理部１３０１の大きさは、捕捉対象の細胞の直径に応じて適宜設定することができる。より具体的には、フィブロネクチンを高密度で直径１μｍにわたって固定することで細胞捕捉処理部１３０１とすることができる。
　この場合、核酸解析用アレイデバイスは、インレット１１及びアウトレット１４により空間２への液体の供給及び排出を行うことができ、構成を簡略化することができる。これらインレット１１及びアウトレット１４を用いた反応手順は以下の通りである。
　細胞を捕捉するために、培養液や生理食塩水または血清中に縣濁した細胞溶液をインレット１１からアウトレット１４に向かって流す。細胞溶液をゆっくり流すことによって、細胞捕捉領域に細胞がブラウン運動によって、ランダムに接触し、細胞膜と細胞捕捉処理部１３０１に固定した物質との選択的結合によって細胞が捕捉される。さらに、細胞の大きさが細胞捕捉処理部１３０１の大きさよりも大きくため、２つ以上の細胞が同一の細胞捕捉処理部１３０１に捕捉される可能性は小さい。
　次に、細胞破砕用の溶液をインレット１１からアウトレット１４に向かって流す。界面活性剤を含むバッファ溶液を用いることが一般的である。本例では0.5％のTween 20と1MのNaClを含むTris-HCl(pH8.0)を用いることができる。その後、ミネラルオイルなどの非極性溶媒をインレット１１からアウトレット１４に流す。このようにすることによって、図１２(b)に示すように、界面活性剤を含む溶液が親水処理をした複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８にだけ残され、核酸捕捉領域４以外の領域の上方空間部９はミネラルオイルで満たされることとなる。これにより、図１３に示す核酸解析用アレイデバイスにおいても、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化することができる。このように複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を個別化した状態で、空間２の温度を上げることで、単一細胞を個別化した状態で破砕することができる。その後、必要に応じて、水溶液をインレット１１からアウトレット１４に向かって流すことによって、ミネラルオイル（非極性溶媒）が排出され、溶液の分離が解消され、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を当該水溶液で連通することができる。
　また、図１３に示した核酸解析用アレイデバイスは、透明基板５及び６のそれぞれに複数の核酸捕捉領域４を形成する構成であったが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは本構成に限定されるものではない。例えば、図１４に示すように、核酸解析用アレイデバイスは、透明基板５及び６のうち細胞捕捉手段を有する方にのみ複数の核酸捕捉領域４を形成したような構成であってもよい。すなわち、核酸解析用アレイデバイスは、図１４に示すように、複数の核酸捕捉領域４と、核酸捕捉領域４の略中心部に形成した細胞捕捉処理部１３０１とを有する透明基板６を備える。このように構成した核酸解析用アレイデバイスは、撥水加工や親水性を付与する処理に係るコストを低減することができる。また、このように構成した核酸解析用アレイデバイスは、水溶液の液滴が透明基板５に接触せずミネラルオイルの導入と排出がより容易となる。
　さらに、図１３に示した核酸解析用アレイデバイスは、細胞捕捉処理部１２０１を有する複数の核酸捕捉領域４が形成された透明基板６が平板状であったが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイスは本構成に限定されるものではない。例えば、図１５に示すように、核酸解析用アレイデバイスは、細胞捕捉処理部１２０１を有する複数の核酸捕捉領域４が凹部内に形成されたものであっても良い。図１５に示す核酸解析用アレイデバイスでは、凹部を構成する内面（すなわち側面と底面）が高い親水性表面であり、凹部内の底面にDNAプローブを固定化している。このように、凹部内に複数の核酸捕捉領域４を形成すると、ミネラルオイル等の非極性溶媒が溜まる部分の厚さが薄くなり、より安定に個別化状態を形成することが可能となる。また、このように構成した核酸解析用アレイデバイスは、水溶液の液滴が透明基板５に接触せずミネラルオイルの導入と排出がより容易となる。
　　＜核酸解析用アレイデバイスを用いた核酸解析方法の変形例２＞
　核酸解析用アレイデバイスにおける反応は、図３或いは図９及び１０に示したような単分子シーケンス反応に限定されるものではない。すなわち、核酸解析用アレイデバイスにおける反応は、図１６に示すように、一分子を種にした増幅を行い、この増幅産物の配列解析（シーケンシング）によって単一細胞レベルでの遺伝子発現解析を行うものであってもよい。すなわち、本例では、単分子シーケンスを用いる代わりに、一分子を種にした増幅後、増幅した産物のクラスタに対するシーケンシングを行う。なお、本例に使用する核酸解析用アレイデバイスは、上述した例と同じものを使用することができる。また、本例に示す反応手順については、図３と図４の(d-1)までは共通である。
　ただし、本例では、DNAプローブをより高密度、例えば固定面密度を5nm四方に１分子以上とすることが好ましい。例えば、複数の核酸捕捉領域４の表面にアクリルアミドなどのゲルやポリマを固定し、当該ポリマ上にDNAプローブを固定することによって固定面密度を向上させることが可能となる。具体的には、1nm四方に１分子のDNAプローブを固定することもできる。
　図１６(f-1)は図４(d-2)と同じで、末端に付加したポリＡプローブ３５にハイブリするポリＴプローブ３６（ポリＴの塩基長は３０ベースで３‘末端はＶＮ）と鎖置換活性をもつBstポリメラーゼと基質（dNTP）を核酸解析用アレイデバイスの空間２の内容積と等量だけ導入し、温度を42度（ポリＴのハイブリのメルティング温度付近の温度）に保って、２時間反応させる。これによってテンプレートウェーキング反応とよばれる増幅反応（PNAS, vol. 110, No. 35, (2013) p. 14320-14323を参照のこと）、すなわち、図１６(f-2～f-5)に示すようにcDNA１５０１を核にアイランド上に同じ配列が平面状を広がりながら増幅する反応が進行する。この反応は等温反応であり、反応可能なポリＴプローブ３６がなくなるまで反応が進行する。その結果、最初にランダムに形成されたcDNA１５０１を核にしてモザイク上に同じ配列のcDNAの複製配列のクラスタが形成される。１つのクラスタサイズは最初に合成されたcDNAの分子の間隔が反映される。この増幅過程後、上述した例と同様の蛍光体によるシーケンシングを実行することができるが、本例では一分子に対してシーケンスを決定する必要ななく、１つのクラスタに対して配列決定すれば十分である。したがって、本例では、図７及び８に示した核酸解析装置のうち、透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７内部に励起光を照射するＴＩＲによる蛍光計測は不要となる。本例では、図７及び８に示した核酸解析装置における落射型光学顕微鏡の構成で水銀ランプ７１による蛍光体の励起でも十分な強度で蛍光イメージを取得することが可能となる。また、本例では、上述のように透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７内部に励起光を通す必要がないため、これら透明基板５及び６並びに細胞捕捉用隔壁７として使用できる材料も樹脂を含め多様な材料を選択することができる。すなわち。本例では、背景蛍光の低い樹脂材料としてしられている透明サイクリックポリオレフィンを使用することができるが、透明ポリカーボネートを使用してもよい。
　また、本例では、cDNA全体に対する増幅を行ったが、図９及び１０に示した例のように全長のcDNAを断片化した後に相補鎖合成して、cDNAの短い断片に対して図１６(f-1)の状態のサンプルを合成を上記増幅工程を実行してもよいことは言うまでもない。
　さらに、１分子からの増幅方法としてNucleic Acids Res.　Vol. 34, e22 (2006).に記載のブリッジ増幅を用いてもよい。
　なお、本例では、核酸解析方法の一例として、図３或いは図９及び１０に示したような単分子シーケンス反応とは異なるDNAシーケンシング法を説明したが、本発明に係る核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法は、DNAシーケンシング法に限定されない。本発明に係る核酸解析用アレイデバイス、核酸解析装置及び核酸解析方法は、例えばNature biotechnology vol. 26, (3), p. 317 (2008)に示されている、ＤＮＡ配列を定量する他の定量方法を用いてもよいことは言うまでもない。
＜第２の実施形態＞
　上述した第１の実施形態では、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を互いに連通する又は個別化する制御手段が、核酸捕捉領域と当該核酸捕捉領域を囲う領域とを比較したときに核酸捕捉領域が高い親水性表面とすることであった。しかし、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を高いに連通する又は個別化する制御手段はこのような形態に限定されるものではない。第２の実施形態は、複数の核酸捕捉領域４が形成された第１基板と、当該第１基板と対向する位置に配設された第２基板とを有し、第１基板と第２基板とが当接又は離間することによって、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部８を互いに連通する又は個別化するものである。
　詳細に、核酸解析用アレイデバイスは、図１７に示すように、複数の核酸捕捉領域４が凹部内に形成された第１の基板１７０１と、第１の基板１７０１に対して接離自在に配設された第２の基板１７０２とを備える。図１７に示す核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域４には、それぞれ略中心部に細胞捕捉処理部１７０３が形成されている。細胞捕捉処理部１７０３は、直径１μｍの略円形でフィブロネクチンを高密度で固定したものである。
　また、第２の基板１７０２は、空間２に対して液体を供給するインレット１１と、弾性部材１７０４とを備えている。弾性部材１７０４は、防水性と弾力性のあるゴム材料から形成されている。可動ステージ１７０５が弾性部材１７０４より内側の第２の基板１７０２を押し下げることによって、第２の基板１７０２が第１の基板１７０１に当接することができる。
　以上のように構成された核酸解析用アレイデバイスでは、第１の基板１７０１と第２の基板１７０２とが離間した状態でインレット１１から溶液が供給されると、複数の核酸捕捉領域４の上方空間が当該溶液により連通した状態となる。そして、可動ステージ１７０５が第２の基板１７０２を押し下げて第２の基板１７０２が第１の基板１７０１に当接すると、複数の核酸捕捉領域４の上方空間部はそれぞれ個別化される。このとき余分な液体はアウトレット１４から外部へ排出される。
１…貫通孔、２…空間、３…細胞、４…核酸捕捉領域、５及び６…透明基板、７…細胞捕捉用隔壁、８…核酸捕捉領域４の上方空間部、９…領域１５の上方空間部、１０…側壁、１１及び１２…インレット、１３及び１４…アウトレット、２０…デバイス載置部、３０…給排水制御部、４０…検出部
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

  1. 　基盤と、
    　当該基盤の少なくとも一主面に配置され、核酸を捕捉する核酸捕捉手段を有する複数の核酸捕捉領域と、
    　当該複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通する或いは個別化する制御手段と、
    　を備える核酸解析用アレイデバイス。
  2. 　上記制御手段は、上記核酸捕捉領域と当該核酸捕捉領域を囲う領域とを比較したときに上記核酸捕捉領域が高い親水性表面とすることを特徴とする請求項１記載の核酸解析用アレイデバイス。
  3. 　上記核酸捕捉領域は、１又は複数の細胞を捕捉する細胞捕捉手段を有していることを特徴とする請求項１記載の核酸解析用アレイデバイス。
  4. 　上記核酸捕捉領域は、上記核酸捕捉領域に形成された細胞より小径の貫通孔であることを特徴とする請求項３記載の核酸解析用アレイデバイス。
  5. 　上記核酸捕捉領域は、上記基盤の一主面に形成された凹部の内面、又は当該凹部の内面と当該凹部の外周を囲う領域とであり、上記核酸捕捉手段が上記凹部の底面に固定されていることを特徴とする請求項１記載の核酸解析用アレイデバイス。
  6. 　上記基盤で形成される空間に液体を供給する及び当該空間内の液体を排出するための給排水機構を更に有することを特徴とする請求項１記載の核酸解析用アレイデバイス。
  7. 　上記基盤は所定の間隔をもって配設された一対の基板であり、上記複数の核酸捕捉領域は当該一対の基板の互いに対向する面における対向する領域に形成されたことを特徴とする請求項１記載の核酸解析用アレイデバイス。
  8. 　請求項１乃至７いずれか一項記載の核酸解析用アレイデバイスを搭載するデバイス載置部と、
    　上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスに対する液体の供給及び当該核酸解析用アレイデバイスに供給された液体の排出を制御する給排水制御部と、
    　上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスを用いて実行された核酸解析の結果を検出する検出部と
    　を備える核酸解析装置。
  9. 　上記給排水制御部により上記核酸解析用アレイデバイスに対して供給する液体として、少なくとも、核酸解析試薬と非極性溶媒とを備えることを特徴とする請求項８記載の核酸解析装置。
  10. 　上記給排水制御部により上記核酸解析用アレイデバイスに対して供給する液体として、細胞懸濁液を備えることを特徴とする請求項８記載の核酸解析装置。
  11. 　上記給排水制御部は、上記デバイス載置部に載置された核酸解析用アレイデバイスに対して、核酸解析試薬を供給した後に非極性溶媒を供給し、上記核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域上の空間に核酸解析試薬を滞留させるとともに非極性溶媒により各核酸捕捉領域を個別化することを特徴とする請求項８記載の核酸解析装置。
  12. 　請求項１乃至７いずれか一項記載の核酸解析用アレイデバイスに対して、当該核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域の上方空間部を互いに連通した状態で核酸解析試薬を供給する工程と、
    　その後、当該核酸解析用アレイデバイスにおける複数の核酸捕捉領域を個別化した状態で核酸解析を実行する工程と
    　を含む核酸解析方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019079593A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
US10975427B2 (en) 2017-01-20 2021-04-13 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008539711A (ja) * 2005-05-03 2008-11-20 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 個々に細胞を解析するための装置及び方法
JP2011516034A (ja) * 2008-02-29 2011-05-26 ノースウエスタン ユニバーシティ 生物反応促進用バリア
WO2011068088A1 (ja) * 2009-12-04 2011-06-09 株式会社日立製作所 ２次元cDNAライブラリを用いた遺伝子発現解析方法
WO2014020657A1 (ja) * 2012-07-30 2014-02-06 株式会社日立製作所 タグ配列付き2次元cDNAライブラリーデバイス、並びにこれを用いた遺伝子発現解析方法及び遺伝子発現解析装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008539711A (ja) * 2005-05-03 2008-11-20 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 個々に細胞を解析するための装置及び方法
JP2011516034A (ja) * 2008-02-29 2011-05-26 ノースウエスタン ユニバーシティ 生物反応促進用バリア
WO2011068088A1 (ja) * 2009-12-04 2011-06-09 株式会社日立製作所 ２次元cDNAライブラリを用いた遺伝子発現解析方法
WO2014020657A1 (ja) * 2012-07-30 2014-02-06 株式会社日立製作所 タグ配列付き2次元cDNAライブラリーデバイス、並びにこれを用いた遺伝子発現解析方法及び遺伝子発現解析装置

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10975427B2 (en) 2017-01-20 2021-04-13 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
US12344890B2 (en) 2017-01-20 2025-07-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
WO2019079593A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
US11193166B2 (en) 2017-10-19 2021-12-07 Omniome, Inc. Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows

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