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WO2016098169A1 - 液体クロマトグラフ - Google Patents

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WO2016098169A1
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泰郎 小倉
ミカエル ルヴィ
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Shimadzu Corp
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Definitions

  • the present invention relates to a liquid chromatograph having a concentration extraction column used for pretreatment such as concentration of a target component contained in a sample solution, and an analysis column for separating the target component from other components.
  • a high-performance liquid chromatograph HPLC
  • HPLC high-performance liquid chromatograph
  • LC / MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating an example of a configuration of a main part of an LC / MS that includes a sample pretreatment device that is conventionally used.
  • a mobile phase supply channel 103 provided with an analysis pump 102 is connected to a port of a 6-port 2-position high pressure switching valve 111, and the mobile phase container is operated by the operation of the analysis pump 102.
  • the mobile phase sucked from 101 is supplied to the mobile phase supply channel 103.
  • An analysis flow path 104 provided with an analysis column 105 and a mass spectrometer (MS) 106 is connected to the f port of the high-pressure switching valve 111.
  • the ports b to g of the 7-port 6-position low-pressure switching valve 115 are connected to the flow path to the sample container 116 filled with the sample (however, the flow paths connected to the ports d to g are omitted here)
  • the pretreatment flow path 113 provided with an infusion pump 114 is connected to the common port a, and the other end of the flow path 113 is connected to the port d of the high pressure switching valve 111. .
  • a concentration column 112 filled with a collection agent is connected, and a drainage flow path 117 reaching a drainage port is connected to the port c.
  • the injection pump 114 is operated with the high-pressure switching valve 111 connected in a dotted line and the low-pressure switching valve 115 connected in a solid line. Then, a liquid sample to be analyzed (for example, a sample derived from a living body or a sample collected from soil) is flowed to the concentration column 112, and the target component in the sample is captured by the collection agent in the concentration column 112.
  • a liquid sample to be analyzed for example, a sample derived from a living body or a sample collected from soil
  • the high-pressure switching valve 111 is switched to the connection state indicated by the solid line, the concentration column 112 and the analysis flow path 104 are connected, and the analysis pump
  • the mobile phase is supplied from the mobile phase supply flow path 103 to the concentration column 112 by 102.
  • the target component is eluted from the trapping agent in the concentration column 112, is introduced into the analysis column 105 along the flow of the mobile phase, and is separated in the time direction while passing through the analysis column 105.
  • the mass spectrometer 106 sequentially detects the mobile phase containing the components eluted from the analysis column 105 and outputs detection signals corresponding to the respective components.
  • a column with a scavenger supported on a polymer is suitable for the concentration column. This is because a column using a polymer has resistance to a wide range of pH solutions, and various solutions can be used as an eluent.
  • a column using silicate, which will be described later, cannot use a solution having a pH of 7 or higher, whereas a column using a polymer is included in, for example, the above-described biological samples or samples collected from soil.
  • an ammonium hydroxide solution or an ammonium carbonate solution having a high pH can be used.
  • a column in which the stationary phase is supported on silicate is suitable for the analytical column. This is because the column using silicate has higher component separation performance than the column using polymer.
  • the sample pretreated by the concentration column 112 of the sample pretreatment apparatus is eluted into the mobile phase, and introduced into the analysis column 105 as it is to separate components.
  • a solution having a pH of 7 or less must be used as the eluent (also mobile phase).
  • a polymer column having inferior component separation characteristics must be used as the analytical column 105.
  • the problem to be solved by the present invention is a liquid chromatograph having a concentration column for capturing a target component in a sample and performing a pretreatment such as concentration and an analysis column for separating the target component.
  • a liquid chromatograph capable of using a column, an eluate and a transfer liquid suitable for pretreatment and separation of components, respectively.
  • the liquid chromatograph according to the present invention which has been made to solve the above problems, a) a concentration column to capture the target component in the liquid sample; b) an analytical column for separating the target component from other components; c) A state in which a flow path for supplying a sample introduction mobile phase containing a liquid sample to the concentration column is formed and a flow for supplying an eluate for eluting the target component captured by the concentration column to the concentration column.
  • a second channel switching unit that switches between a state of forming a channel to be fed to the analysis column via the storage unit.
  • the target component is pretreated and separated as follows. First, a sample introduction mobile phase containing a liquid sample is fed to a concentration column, and a target component is captured therein. Then, the eluate is supplied to the concentration column using the first flow path switching unit, and the target component is eluted and stored in the first storage unit. During this time, the analytical mobile phase is supplied to the analytical column. Subsequently, the second flow path switching unit is switched, and the eluate containing the target component stored in the first storage unit is placed on the flow of the analysis mobile phase and introduced into the analysis column.
  • the flow path for feeding the eluate to the concentration column by the first flow path switching unit, and the flow path for feeding the mobile phase for analysis to the analysis column by the second flow path switching unit. are formed as independent channels. Moreover, the 1st storage part which stores the eluate containing a target component once is provided. Therefore, different solutions can be fed to these flow paths. Further, the analysis mobile phase is not fed to the concentration column, and a large amount of the eluate is not introduced into the analysis column. Therefore, it is possible to use a concentration column and an eluate, an analysis column and a mobile phase suitable for pretreatment and analysis of the target component, respectively.
  • the liquid chromatograph according to the present invention further comprises: f) a second reservoir for storing the eluate; g) A state in which a flow path for feeding the eluate to the second reservoir is formed, and a mobile phase for sample introduction is fed to the second reservoir and the eluate stored in the second reservoir is It is preferable to include a third flow path switching unit that switches between a state in which a flow path to be sent to the concentration column is formed.
  • the liquid chromatograph including the second storage unit and the third flow path switching unit, first, the minimum amount of eluate necessary for eluting the target component is stored in the second storage unit. Then, the sample introduction mobile phase containing the liquid sample is fed to the concentration column, and the target component is captured therein. Subsequently, the flow path is switched by the second flow path switching unit, and the eluate stored in the second storage unit is sent out by the sample introduction mobile phase (not including the liquid sample) and sent to the concentration column to supply the target component. Elute and store in the first reservoir.
  • the target component is eluted in a necessary minimum amount of the eluate, a solution containing the target component at a high concentration can be analyzed.
  • liquid chromatograph By using the liquid chromatograph according to the present invention, it is possible to use a concentration column and an eluent, an analysis column and a mobile phase suitable for pretreatment and analysis of the target component, respectively.
  • the liquid chromatograph of this embodiment is used for separating and analyzing the target component from other components after subjecting the target component contained in the liquid sample to pretreatment for concentration and washing.
  • FIG. 2 is a flow path configuration diagram of the liquid chromatograph of the present embodiment.
  • the flow path of the liquid chromatograph of the present embodiment includes a 10-way valve 1 (cooperating with pumps 4 and 6 to be described later to form a first flow path switching unit of the present invention), a first 6-way valve 11 ( Three flow path switching valves, which correspond to the third flow path switching section of the present invention, and a second six-way valve 13 (corresponding to the second flow path switching section of the present invention) are arranged.
  • the first six-way valve 11 used for sample introduction and pretreatment is a low-pressure valve
  • the second six-way valve 13 used for feeding the mobile phase for analysis is a high-pressure valve.
  • the 10-way valve 1 is formed with flow paths that always connect port A and port F, and port B and port H, respectively. Further, the port C of the 10-way valve 1 is connected to the analysis column section 40, the port E is connected to the port J via the sample injection section 2, the port D is connected to the analysis mobile phase supply flow path 27, and the port G is a pretreatment water system. The port K is connected to the solvent supply channel 22 and the pretreatment solvent supply channel 24, respectively.
  • Port a of the first six-way valve 11 is port m of the second six-way valve 13
  • port b is through the concentration column 30 to port f
  • port c is to the pretreatment solvent supply channel 24, Each is connected.
  • a second reservoir 12 having a capacity of 50 ⁇ l is provided in the flow path connecting the port d and the port e of the first six-way valve 11.
  • the first reservoir 14 having a capacity of 100 ⁇ l is provided in the flow path connecting the port g and the port j of the second 6-way valve 13. Further, the port h of the second six-way valve 13 is connected to the analysis aqueous solvent supply flow path 25, the port i is connected to the analysis mobile phase supply flow path 27, and the port k is connected to the waste liquid flow path 28. .
  • a container 3 containing the pretreatment aqueous solvent and a pump 4 for supplying the aqueous solvent in the container 3 to the port G of the 10-way valve 1 are arranged.
  • a pump 6 for feeding to the processing mixer 9 is arranged.
  • the analysis aqueous solvent supply channel 25 has a container 15 containing the analysis aqueous solvent and a pump 16 for supplying the aqueous solvent in the container 15 to the port h of the second six-way valve 13.
  • the analysis organic solvent supply flow path 26 includes a container 7 containing the analysis organic solvent, and an analysis mixer in which the organic solvent in the container 7 is disposed on the analysis mobile phase supply flow path 27.
  • a pump 8 for feeding to 10 is arranged.
  • the concentration column section 30 includes six types of concentration columns 32 arranged in parallel, and two flow path switching sections 31 and 33 for switching the flow paths connected to these concentration columns 32.
  • Each of the six types of concentration columns 32 is a column in which a collecting agent is supported on a polymer, and the diameter and length of the column and the type of the collecting agent are different.
  • the analysis column section 40 includes six types of analysis columns 42 arranged in parallel and two flow path switching sections 41 and 43 for switching the flow paths connected to the analysis columns 42.
  • Each of the six types of analytical columns 42 is a column in which a stationary phase is supported on a silicate, and the diameter and length of the column and the type of stationary phase are different.
  • a detector 50 is disposed on the outlet side of the analysis column unit 40, and components separated in the analysis column 42 (and an analysis mobile phase) are sequentially detected.
  • a flow path through which various solvents are fed is indicated by a solid line.
  • a pretreatment aqueous solvent is used as the sample introduction mobile phase
  • a pretreatment organic solvent is used as the eluent
  • a mixed liquid of the pretreatment aqueous solvent and the pretreatment organic solvent is used as the cleaning liquid.
  • a mixed liquid of an aqueous solvent for analysis and an organic solvent for analysis is used as the mobile phase for analysis.
  • the eluate storage step In the eluate storage step, the eluate is stored in the second storage unit 12 using the flow path indicated by the solid line in FIG. Specifically, the pump 6 is operated to pass the pretreatment organic solvent through the pretreatment organic solvent supply channel 23 and the pretreatment solvent supply channel 24 to the port c of the first six-way valve 11. And 50 ⁇ l of the pretreatment organic solvent (eluent) is stored in the second storage unit 12 disposed between the port d and the port e.
  • the pump 16 is operated to analyze the analysis aqueous solvent through the analysis aqueous solvent supply flow path 25 and the ports h and g of the second six-way valve 13, the first reservoir 14, the port j and the port i.
  • the pump 8 is operated to feed the organic solvent for analysis to the mixer 10 for analysis. Then, these are mixed by the analysis mixer 10 to create an analysis mobile phase, and the analysis mobile phase is supplied to the analysis column 42 in the analysis column section 40 through the analysis mobile phase supply flow path 27 and the ports D and C of the 10-way valve 1. To send. Note that the analysis mobile phase is supplied to the analysis column 42 through this flow path until the washing step described later.
  • sample injection step In the eluate storage step, the target component in the liquid sample is captured in the concentration column 32 using the flow path shown by the solid line in FIG. First, the flow path of the first six-way valve 11 is switched. Then, the pump 4 is operated, and the pretreatment aqueous solvent (sample introduction mobile phase) is supplied to the port G of the 10-way valve 1 through the pretreatment aqueous solvent supply channel 22. A liquid sample is injected from the sample injection unit 2 into the sample introduction mobile phase. As a result, the liquid sample rides on the flow of the sample introduction mobile phase and is introduced into the concentration column 32 through the pretreatment solvent supply channel 24 and the ports c and b of the first six-way valve 11 and is included in the liquid sample. The target component to be collected is trapped in the concentration column 32.
  • [Washing step] In the washing step, the target component captured in the concentration column 32 is washed using the pretreatment organic solvent passage 23 in addition to the passage shown by the solid line in FIG.
  • the sample injection unit 2 is stopped and the pump 6 is operated to feed the pretreatment organic solvent to the pretreatment mixer 9.
  • the pretreatment mixer 9 the pretreatment aqueous solvent and the pretreatment organic solvent are mixed, and the mixed solution (washing solvent) is fed to the concentration column 32 through the same flow path as described above.
  • the cleaning solvent removes unnecessary components other than the target component trapped inside the concentration column 32, and the cleaning liquid containing the unnecessary components passes through the first 6-way valve 11 and the second 6-way valve 13 to be a waste liquid. It is discharged into the flow path.
  • Target component elution step In the target component elution step, the target component captured in the concentration column 32 is eluted using the flow path shown by the solid line in FIG. 5 and stored in the first storage unit 14. In this step, first, the flow paths of both the first six-way valve 11 and the second six-way valve 13 are switched. By switching the flow path of the first six-way valve 11, the mixed liquid of the pretreatment aqueous solvent and the pretreatment organic solvent is fed to the second reservoir 12. 50 ⁇ l of the pretreatment organic solvent (eluent) stored in the second storage unit 12 is sent out by this mixed solution and introduced into the concentration column 32.
  • the target component captured in the concentration column 32 is eluted into the eluate, and is first stored through the port b and port a of the first six-way valve 11 and the port m and port g of the second six-way valve 13. Sent to the unit 14.
  • the analytical aqueous solvent introduced into the first reservoir 14 in the previous step is sent out by the eluate containing the target component and discharged to the waste liquid channel 28.
  • the analytical aqueous solvent fed from the analytical aqueous solvent supply flow path 25 is fed to the analytical mixer 10 through the port h and port i of the second six-way valve 13, Here, it is mixed with an organic solvent for analysis and fed to the analysis column 42. That is, the analysis mobile phase is sent to the analysis column 42 through a flow path different from that up to the washing step.
  • the eluate containing the target component stored in the first storage unit 14 is introduced into the analysis column 42 using the flow path indicated by the solid line in FIG.
  • the flow path of the second six-way valve 13 is switched, and the analysis aqueous solvent supplied from the analysis aqueous solvent supply flow path 25 is supplied to the first reservoir 14.
  • the eluate containing the target component stored in the first storage unit 14 is sent out by this aqueous solvent and sent to the mixer 10 for analysis.
  • the analytical aqueous solvent and the analytical organic solvent are mixed.
  • the target component rides on the flow of the analysis mobile phase, is introduced into the analysis column 42 through the port D and the port C of the 10-way valve 1, separated into components, and then detected by the detector 50.
  • the flow path of the first six-way valve 11 is switched while the target component is separated and detected as described above, and the pump 4 is operated to concentrate the pretreatment aqueous solvent (sample introduction mobile phase) in the concentration column 32.
  • the solvent in the flow path is replaced with a pretreatment aqueous solvent, and preparation for the next analysis is performed.
  • the flow path for supplying the eluate (pretreatment organic solvent) to the concentration column 32 and the flow for supplying the analysis mobile phase to the analysis column 42 is formed as an independent channel, and the analysis mobile phase is not fed to the concentration column 32 at a high pressure, and a large amount of eluate is not fed to the analysis column 42.
  • the eluate containing the target component eluted from the concentration column 32 is temporarily stored in the first storage unit 14. Therefore, columns suitable for pretreatment such as concentration and washing of the target component and separation / analysis of the target component can be used, and a solution optimal for each purpose can be used.
  • the target component can be introduced into the analysis column 42 without pretreatment (that is, without capturing the target component in the concentration column 32).
  • the flow path is switched by the 10-way valve 1 and the liquid sample is injected from the sample injection unit 2 so that the liquid sample is put on the flow of the analysis mobile phase supplied from the analysis mixer 10. It can be introduced into the analytical column 42.
  • a flow path suitable for both an analysis requiring pretreatment such as concentration and washing of the target component and an analysis not requiring pretreatment can be formed.
  • the pretreatment aqueous solvent is used as the sample introduction mobile phase
  • the pretreatment organic solvent is used as the eluent
  • the mixed solution thereof is used as the cleaning liquid.
  • a mixed solution of organic solvents was used, but these can be appropriately changed according to the target component.
  • the pretreatment mixer 9 is arranged between the port K of the 10-way valve 1 and the port c of the first 6-way valve 11, and the ports i and 10 of the second 6-way valve 13 are arranged.
  • the analysis mixer 10 is disposed between the valves D, the mixer may be disposed at a location other than these as long as a required mixed solution can be produced.
  • the mixer in consideration of accurately controlling the mixing ratio of the solvents, it is preferable to arrange the mixer at a position as close as possible to the target column as in the above embodiment. Furthermore, in the said Example, although the capacity

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Abstract

　液体試料中の目的成分を捕捉するための濃縮カラム３２と、目的成分を他の成分から分離するための分析カラム４２と、液体試料を含む試料導入用移動相を濃縮カラム３２に送給する流路を形成する状態と濃縮カラム３２に捕捉された目的成分を溶出させる溶出液を該濃縮カラム３２に送給する流路を形成する状態とを切り替える第１流路切替部１、４、６と、目的成分を含む溶出液を貯留するための第１貯留部１４と、分析用移動相を分析カラム４２に送給する流路及び濃縮カラム３２からの溶出液を第１貯留部１４に送給する流路を形成する状態と分析用移動相を第１貯留部１４を経由して分析カラム４２に送給する流路を形成する状態とを切り替える第２流路切替部１３とを備えることを特徴とする液体クロマトグラフ。

Description

液体クロマトグラフ
　本発明は、試料液に含まれる目的成分の濃縮等の前処理に用いられる濃縮抽出カラムと、目的成分を他の成分から分離するための分析カラムを有する液体クロマトグラフに関する。
　分析対象である目的成分以外に様々な不要成分を含む液体試料について、そうした各種成分を分離して所望の目的成分の定性分析、定量分析を行うために、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）やＨＰＬＣの検出器として質量分析計を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）が広く使用されている。こうした分析装置で目的成分の分析精度や感度を高めるために分析カラムでの分離条件を適切に設定することが重要なのはもちろんであるが、試料を分析カラムに導入する前の段階で、目的成分の分析を妨害する成分や分析に不要な成分を除去したり、或いは、目的成分を濃縮したりするといったことが益々重要になってきている。こうした目的のために、従来より自動試料前処理装置が使用されている。
　液体クロマトグラフ用の試料前処理装置は、高圧流路切替バルブや試料中の目的成分を捕捉して濃縮するための濃縮カラムを用いたカラムスイッチングによるものが一般的である（例えば特許文献１～３）。図１は、従来用いられている、試料前処理装置を備えたＬＣ／ＭＳの要部の構成の一例を示す概略図である。
　試料前処理装置１１０において、６ポート２ポジション型の高圧切替バルブ１１１のａポートには分析用ポンプ１０２が設けられた移動相供給流路１０３が接続され、分析用ポンプ１０２の動作により移動相容器１０１から吸引された移動相が移動相供給流路１０３に供給される。この高圧切替バルブ１１１のｆポートには、分析カラム１０５及び質量分析計（ＭＳ）１０６が設けられた分析流路１０４が接続されている。７ポート６ポジション型の低圧切替バルブ１１５のポートｂ～ｇには試料を満たした試料容器１１６に至る流路が接続され（但し、ここではポートｄ～ｇに接続される流路は記載を省略している）、共通ポートａには、途中に注入用ポンプ１１４が設けられた前処理流路１１３が接続され、該流路１１３の他端は高圧切替バルブ１１１のポートｄに接続されている。高圧切替バルブ１１１のポートｂ、ポートｅ間には、内部に捕集剤を充填した濃縮カラム１１２が接続され、さらにポートｃには排液口に至る排液流路１１７が接続されている。
　上記ＬＣ／ＭＳにおいて、試料の前処理時には、高圧切替バルブ１１１を点線で示す接続状態、低圧切替バルブ１１５を実線で示す接続状態にして、注入用ポンプ１１４を作動させる。すると、分析対象である液体試料（例えば生体由来の試料や土壌から採取した試料）が濃縮カラム１１２に流され、該試料中の目的成分が濃縮カラム１１２内の捕集剤に捕捉される。所定時間、液体試料を濃縮カラム１１２に流して目的成分を十分に捕捉した後に、高圧切替バルブ１１１を実線で示す接続状態に切り替え、濃縮カラム１１２と分析流路１０４とを接続し、分析用ポンプ１０２により移動相を移動相供給流路１０３から濃縮カラム１１２に供給する。すると、濃縮カラム１１２内の捕集剤から目的成分が溶出し移動相の流れに乗って分析カラム１０５に導入され、分析カラム１０５を通過する間に時間方向に成分分離される。質量分析計１０６は分析カラム１０５から溶出した成分を含む移動相を順次検出し、それぞれの成分に対応した検出信号を出力する。
特開２００５－３１０１２号公報 特開２００７－２９２６２０号公報 特開２０１０－１３９４４８号公報
　濃縮カラムには、捕集剤をポリマーに担持したカラムが適している。これは、ポリマーを用いたカラムが広範囲のｐＨの溶液に耐性を有し、溶出液として多様な溶液を用いることができるためである。後述する、ケイ酸塩を用いたカラムではｐＨが７以上の溶液を用いることができないのに対し、ポリマーを用いたカラムでは、例えば、上述した生体由来の試料や土壌から採取した試料に含まれるアンモニウム基を有する目的成分を溶出させるためにｐＨが高い水酸化アンモニウム溶液や炭酸アンモニウム溶液を用いることができる。
　一方、分析カラムには固定相をケイ酸塩に担持したカラムが適している。これは、ケイ酸塩を用いたカラムが、ポリマーを用いたカラムに比べて高い成分分離性能を有するためである。
　図１の液体クロマトグラフでは、試料前処理装置の濃縮カラム１１２で前処理された試料を移動相に溶出させ、そのまま分析カラム１０５に導入して成分分離する。この構成において成分分離性能が高いケイ酸塩のカラムを分析カラム１０５として用いると、溶出液（兼移動相）としてｐＨが７以下の溶液を用いなければならない。
　一方、溶出液（兼移動相）としてｐＨが７以上の溶液を用いるためには、分析カラム１０５として成分分離特性が劣るポリマーのカラムを用いなければならない。
　本発明が解決しようとする課題は、試料中の目的成分を捕捉して濃縮等の前処理を行うための濃縮カラム及び目的成分を分離するための分析カラムを有する液体クロマトグラフであって、目的成分の前処理と分離にそれぞれ適したカラム、溶出液及び移動液を使用することができる液体クロマトグラフを提供することである。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る液体クロマトグラフは、
　a) 液体試料中の目的成分を捕捉するための濃縮カラムと、
　b) 前記目的成分を他の成分から分離するための分析カラムと、
　c) 液体試料を含む試料導入用移動相を前記濃縮カラムに送給する流路を形成する状態と、前記濃縮カラムに捕捉された目的成分を溶出させる溶出液を該濃縮カラムに送給する流路を形成する状態と、を切り替える第１流路切替部と、
　d) 前記目的成分を含む溶出液を貯留するための第１貯留部と、
　e) 分析用移動相を前記分析カラムに送給する流路及び前記濃縮カラムからの溶出液を前記第１貯留部に送給する流路を形成する状態と、分析用移動相を前記第１貯留部を経由して前記分析カラムに送給する流路を形成する状態と、を切り替える第２流路切替部と
　を備えることを特徴とする。
　本発明に係る液体クロマトグラフでは、以下のように目的成分を前処理して成分分離する。
　まず、液体試料を含む試料導入用移動相を濃縮カラムに送給し、その内部に目的成分を捕捉する。そして、第１流路切替部を用いて濃縮カラムに溶出液を送給し、目的成分を溶出させて第１貯留部に貯留する。この間、分析カラムには分析用移動相を送給しておく。続いて、第２流路切替部を切り替え、第１貯留部に貯留された目的成分を含む溶出液を分析用移動相の流れに乗せて分析カラムに導入する。
　本発明に係る液体クロマトグラフでは、第１流路切替部により溶出液を濃縮カラムに送給する流路が、第２流路切替部により分析用移動相を分析カラムに送給する流路が、それぞれ独立した流路として形成される。また、目的成分を含む溶出液を一旦貯留する第１貯留部が設けられている。そのため、これらの流路にそれぞれ異なる溶液を送給することができる。また、分析用移動相が濃縮カラムに送給されることがなく、溶出液が大量に分析カラムに導入されることもない。従って、目的成分の前処理と分析にそれぞれ適した濃縮カラムと溶出液、分析カラムと移動相を用いることができる。
　本発明に係る液体クロマトグラフは、さらに、
　f) 溶出液を貯留するための第２貯留部と、
　g) 溶出液を前記第２貯留部に送給する流路を形成する状態と、試料導入用移動相を前記第２貯留部に送給し該第２貯留部に貯留された溶出液を前記濃縮カラムに送出する流路を形成する状態と、を切り替える第３流路切替部と
　を備えることが好ましい。
　第２貯留部及び第３流路切替部を備える態様の液体クロマトグラフでは、まず、目的成分を溶出させるために必要な最小限の量の溶出液を第２貯留部に貯留する。そして、液体試料を含む試料導入用移動相を濃縮カラムに送給し、その内部に目的成分を捕捉させる。続いて、第２流路切替部により流路を切り替え、第２貯留部に貯留された溶出液を試料導入用移動相（液体試料を含まない）で送り出して濃縮カラムに送給し目的成分を溶出させて第１貯留部に貯留する。この態様の液体クロマトグラフでは、必要最小限の量の溶出液に目的成分を溶出させるため、高濃度の目的成分を含む溶液を分析することができる。
　本発明に係る液体クロマトグラフを用いることにより、目的成分の前処理と分析にそれぞれ適した濃縮カラムと溶出液、分析カラムと移動相を用いることができる。
従来の液体クロマトグラフの流路構成図。 本発明に係る液体クロマトグラフの一実施例の流路構成図。 本実施例の液体クロマトグラフにおける溶出液収容ステップにおいて使用する流路を説明する図。 本実施例の液体クロマトグラフにおける試料注入ステップにおいて使用する流路を説明する図。 本実施例の液体クロマトグラフにおける目的成分溶出ステップにおいて使用する流路を説明する図。 本実施例の液体クロマトグラフにおける分析ステップにおいて使用する流路を説明する図。
　本発明に係る液体クロマトグラフの一実施例について、以下、図面を参照して説明する。本実施例の液体クロマトグラフは、液体試料に含まれる目的成分に対して濃縮及び洗浄の前処理を施した後、該目的成分を他の成分から分離して分析するために用いられる。
　図２は、本実施例の液体クロマトグラフの流路構成図である。本実施例の液体クロマトグラフの流路には、１０方バルブ１（後述するポンプ４及び６と協働して本発明の第１流路切替部を構成）、第１の６方バルブ１１（本発明の第３流路切替部に相当）、及び第２の６方バルブ１３（本発明の第２流路切替部に相当）の３つの流路切替バルブが配置されている。試料の導入及び前処理に用いられる第１の６方バルブ１１は低圧バルブであり、分析用移動相の送給に用いられる第２の６方バルブ１３は高圧バルブである。
　１０方バルブ１には、ポートＡとポートＦ、ポートＢとポートＨをそれぞれ常時接続する流路が形成されている。また、１０方バルブ１のポートＣは分析カラム部４０に、ポートＥは試料注入部２を介してポートＪに、ポートＤは分析用移動相供給流路２７に、ポートＧは前処理用水系溶媒供給流路２２に、ポートＫは前処理用溶媒供給流路２４に、それぞれ接続されている。
　第１の６方バルブ１１のポートａは第２の６方バルブ１３のポートｍに、ポートｂは濃縮カラム部３０を介してポートｆに、ポートｃは前処理用溶媒供給流路２４に、それぞれ接続されている。また、第１の６方バルブ１１のポートｄとポートｅを結ぶ流路には容量50μlの第２貯留部１２が設けられている。
　第２の６方バルブ１３のポートｇとポートｊを結ぶ流路には容量100μlの第１貯留部１４が設けられている。また、第２の６方バルブ１３のポートｈは分析用水系溶媒供給流路２５に、ポートｉは分析用移動相供給流路２７に、ポートｋは廃液流路２８に、それぞれ接続されている。
　前処理用水系溶媒供給流路２２には、前処理用水系溶媒が収容された容器３と、該容器３内の水系溶媒を１０方バルブ１のポートＧに送給するためのポンプ４が配置されている。
　前処理用有機系溶媒供給流路２３には、前処理用有機系溶媒が収容された容器５と、該容器５内の有機系溶媒を前処理用溶媒供給流路２４上に配置された前処理用ミキサー９に送給するためのポンプ６が配置されている。
　分析用水系溶媒供給流路２５には、分析用水系溶媒が収容された容器１５と、該容器１５内の水系溶媒を第２の６方バルブ１３のポートｈに送給するためのポンプ１６が配置されている。
　分析用有機系溶媒供給流路２６には、分析用有機系溶媒が収容された容器７と、該容器７内の有機系溶媒を分析用移動相供給流路２７上に配置された分析用ミキサー１０に送給するためのポンプ８が配置されている。
　濃縮カラム部３０は、並列に配置された６種類の濃縮カラム３２と、これらの濃縮カラム３２につながる流路を切り替えるための２つの流路切替部３１、３３を備えている。６種類の濃縮カラム３２はいずれも捕集剤をポリマーに担持したカラムであり、カラムの径や長さ、捕集剤の種類がそれぞれ異なる。
　分析カラム部４０も同様に、並列に配置された６種類の分析カラム４２と、これらの分析カラム４２につながる流路を切り替えるための２つの流路切替部４１、４３を備えている。６種類の分析カラム４２はいずれも固定相をケイ酸塩に担持したカラムであり、カラムの径や長さ、固定相の種類がそれぞれ異なる。
　また、分析カラム部４０の出口側には検出器５０が配置され、分析カラム４２において分離された成分（及び分析用移動相）が順次検出される。
　以下、本実施例の液体クロマトグラフを用いた試料の前処理及び分析に関する動作について、図３～図６を参照して説明する。各ステップにおいて参照する図では各種溶媒が送給される流路を実線で示す。本実施例では、試料導入用移動相として前処理用水系溶媒を、溶出液として前処理用有機系溶媒を、洗浄液として前処理用水系溶媒と前処理用有機系溶媒の混合液を用いる。また、分析用移動相として、分析用水系溶媒と分析用有機系溶媒の混合液を用いる。
　[溶出液収容ステップ]
　溶出液収容ステップでは、図３に実線で示す流路を使用して第２貯留部１２に溶出液を貯留する。
　具体的には、ポンプ６を動作させて、前処理用有機系溶媒供給流路２３及び前処理用溶媒供給流路２４を通じて、前処理用有機系溶媒を第１の６方バルブ１１のポートｃに送給し、ポートｄとポートｅの間に配置された第２貯留部１２に50μlの前処理用有機系溶媒（溶出液）を貯留する。
　また、ポンプ１６を動作させ、分析用水系溶媒を分析用水系溶媒供給流路２５及び第２の６方バルブ１３のポートｈ、ポートｇ、第１貯留部１４、ポートｊ、及びポートｉを通じて分析用ミキサー１０に送給するとともに、ポンプ８を動作させて分析用有機系溶媒を分析用ミキサー１０に送給する。そして、分析用ミキサー１０でこれらを混合して分析用移動相を作成し、分析用移動相供給流路２７及び１０方バルブ１のポートＤ、ポートＣを通じて分析カラム部４０内の分析カラム４２に送給する。なお、後述する洗浄ステップまでの間、分析カラム４２にはこの流路により分析用移動相が送給される。
　[試料注入ステップ]
　溶出液収容ステップでは、図４に実線で示す流路を使用して液体試料中の目的成分を濃縮カラム３２内に捕捉する。
　まず、第１の６方バルブ１１の流路を切り替える。そして、ポンプ４を動作させ、前処理用水系溶媒供給流路２２を通じて前処理用水系溶媒（試料導入用移動相）を１０方バルブ１のポートＧに送給する。また、試料注入部２から試料導入用移動相に液体試料を注入する。これにより、液体試料は試料導入用移動相の流れに乗って前処理用溶媒供給流路２４及び第１の６方バルブ１１のポートｃ、ポートｂを通じて濃縮カラム３２に導入され、液体試料に含まれる目的成分が濃縮カラム３２内に捕捉される。
　[洗浄ステップ]
　洗浄ステップでは、図４に実線で示す流路に加えて前処理用有機系溶媒流路２３を使用して濃縮カラム３２内に捕捉した目的成分を洗浄する。
　このステップでは、試料注入部２を停止するとともに、ポンプ６を動作させて前処理用有機系溶媒を前処理用ミキサー９に送給する。前処理用ミキサー９では前処理用水系溶媒と前処理用有機系溶媒が混合され、その混合液（洗浄溶媒）が上記同様の流路で濃縮カラム３２に送給される。この洗浄溶媒により、濃縮カラム３２の内部に捕捉された目的成分以外の不要な成分が除去され、不要成分を含む洗浄液が第１の６方バルブ１１及び第２の６方バルブ１３を通って廃液流路に排出される。
　[目的成分溶出ステップ]
　目的成分溶出ステップでは、図５に実線で示す流路を使用して濃縮カラム３２内に捕捉された目的成分を溶出させて第１貯留部１４に貯留する。
　このステップでは、まず第１の６方バルブ１１及び第２の６方バルブ１３の両方の流路を切り替える。第１の６方バルブ１１の流路を切り替えたことにより、前処理用水系溶媒と前処理用有機系溶媒の混合液は第２貯留部１２に送給される。第２貯留部１２内に貯留された50μlの前処理用有機系溶媒（溶出液）はこの混合液により送り出されて濃縮カラム３２に導入される。濃縮カラム３２内に捕捉された目的成分は、この溶出液に溶出し、第１の６方バルブ１１のポートｂ、ポートａ、第２の６方バルブ１３のポートｍ、ポートｇを通じて第１貯留部１４に送られる。先のステップで第１貯留部１４に導入されていた分析用水系溶媒は目的成分を含む溶出液により送り出され、廃液流路２８に排出される。
　目的成分溶出ステップでは、分析用水系溶媒供給流路２５から送給される分析用水系溶媒は、第２の６方バルブ１３のポートｈ、ポートｉを通って分析用ミキサー１０に送給され、ここで分析用有機系溶媒と混合されて分析カラム４２に送給される。即ち、洗浄ステップまでとは異なる流路により分析用移動相が分析カラム４２に送給される。
　[分析ステップ]
　分析ステップでは、図６に実線で示す流路を使用して、第１貯留部１４に貯留された目的成分を含む溶出液を分析カラム４２に導入する。
　このステップでは、第２の６方バルブ１３の流路を切り替え、分析用水系溶媒供給流路２５から供給される分析用水系溶媒を第１貯留部１４に送給する。第１貯留部１４内に貯留された目的成分を含む溶出液はこの水系溶媒により送出され、分析用ミキサー１０に送られる。また、ここで分析用水系溶媒と分析用有機系溶媒とが混合される。そして、目的成分は分析用移動相の流れに乗って、１０方バルブ１のポートＤ及びポートＣを通って分析カラム４２に導入され、成分分離された後、検出器５０で検出される。
　また、上記のように目的成分を分離・検出する間に第１の６方バルブ１１の流路を切り替え、ポンプ４を動作させて前処理用水系溶媒（試料導入用移動相）を濃縮カラム３２に送給して流路内の溶媒を前処理用水系溶媒に置換し、次の分析のための準備を行う。
　以上説明したように、本実施例の液体クロマトグラフでは、濃縮カラム３２に溶出液（前処理用有機系溶媒）を送給する流路と、分析カラム４２に分析用移動相を送給する流路が独立した流路として形成されており、濃縮カラム３２に分析用移動相が高圧で送給されたり、分析カラム４２に大量の溶出液が送給されることがない。また、濃縮カラム３２から溶出させた目的成分を含む溶出液が第１貯留部１４に一旦貯留される。そのため、目的成分の濃縮や洗浄等の前処理と、目的成分の分離・分析にそれぞれ適したカラムを用いることができ、また、それぞれの目的に最適な溶液を用いることができる。
　また、上記実施例の液体クロマトグラフでは、目的成分の前処理を行うことなく（即ち濃縮カラム３２内に目的成分を捕捉することなく）分析カラム４２に導入することもできる。具体的には、１０方バルブ１により流路を切り替えるとともに、試料注入部２から液体試料を注入することで、液体試料を分析用ミキサー１０から送給される分析用移動相の流れに乗せて分析カラム４２に導入することができる。このように、本実施例の液体クロマトグラフでは、目的成分の濃縮や洗浄といった前処理を要する分析と前処理を必要としない分析の両方に適した流路を形成することができる。
　上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。
　上記実施例では、試料導入用移動相として前処理用水系溶媒を、溶出液として前処理用有機系溶媒を、洗浄液としてそれらの混合液を用い、分析用移動相として分析用水系溶媒と分析用有機系溶媒の混合液を用いたが、これらは目的成分に応じて適宜に変更することができる。
　また、上記実施例では、１０方バルブ１のポートＫと第１の６方バルブ１１のポートｃの間に前処理用ミキサー９を配置し、第２の６方バルブ１３のポートｉと１０方バルブＤの間に分析用ミキサー１０を配置したが、所要の混合液を作製可能な位置であればこれら以外の場所にミキサーを配置してもよい。ただし、溶媒の混合比を正確に制御することを考慮すると、上記実施例のように目的のカラムにできるだけ近い位置にミキサーを配置することが好ましい。
　さらに、上記実施例では、第１貯留部１４の容量を100μl、第２貯留部１２の容量を50μlとしたが、これらの容量は目的成分の量等に応じて適宜に変更すればよい。ただし、目的成分が溶出した溶出液を確実に分析に供するためには、第１貯留部１４の容量を第２貯留部１２の容量よりも多くする（例えば上記実施例のように２倍の容量とする）ことが好ましい。
１…１０方バルブ
２…試料注入部
９…前処理用ミキサー
１０…分析用ミキサー
１１、１３…６方バルブ
１２…第２貯留部
１４…第１貯留部
２２…前処理用水系溶媒供給流路
２３…前処理用有機系溶媒供給流路
２４…前処理用溶媒供給流路
２５…分析用水系溶媒供給流路
２６…分析用有機系溶媒供給流路
２７…分析用移動相供給流路
２８…廃液流路
３０…濃縮カラム部
３１…流路切替バルブ
３２…濃縮カラム
４０…分析カラム部
４１…流路切替バルブ
４２…分析カラム
５０…検出器

Claims (4)

  1. 　a) 液体試料中の目的成分を捕捉するための濃縮カラムと、
    　b) 前記目的成分を他の成分から分離するための分析カラムと、
    　c) 液体試料を含む試料導入用移動相を前記濃縮カラムに送給する流路を形成する状態と、前記濃縮カラムに捕捉された目的成分を溶出させる溶出液を該濃縮カラムに送給する流路を形成する状態と、を切り替える第１流路切替部と、
    　d) 前記目的成分を含む溶出液を貯留するための第１貯留部と、
    　e) 分析用移動相を前記分析カラムに送給する流路及び前記濃縮カラムからの溶出液を前記第１貯留部に送給する流路を形成する状態と、分析用移動相を前記第１貯留部を経由して前記分析カラムに送給する流路を形成する状態と、を切り替える第２流路切替部と
    　を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ。
  2. 　f) 溶出液を貯留するための第２貯留部と、
    　g) 溶出液を前記第２貯留部に送給する流路を形成する状態と、試料導入用移動相を前記第２貯留部に送給し該第２貯留部に貯留された溶出液を前記濃縮カラムに送出する流路を形成する状態と、を切り替える第３流路切替部と
    　を備えることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ。
  3. 　前記第１貯留部の容量が前記第２貯留部の容量よりも大きいことを特徴とする請求項２に記載の液体クロマトグラフ。
  4. 　前記濃縮カラムを経由せずに液体試料を含む分析用移動相を前記分析カラムに導入可能であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
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