WO2016093037A1

WO2016093037A1 - 検出装置および検出方法

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Publication number: WO2016093037A1
Application number: PCT/JP2015/082665
Authority: WO
Inventors: 幸登中村; 剛典永江; 高敏彼谷
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Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-06-16
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Also published as: JPWO2016093037A1; JP6627778B2

Abstract

　検出装置は、ホルダー、励起光照射部、蛍光検出部、および処理部を有する。ホルダーは、収容部と、反応場を含む金属膜とを有する検出チップを保持する。励起光照射部は、ホルダーに保持された金属膜に励起光を照射する。蛍光検出部は、励起光照射部が金属膜に励起光を照射したときに、金属膜上に存在する蛍光物質から放出される蛍光を少なくとも２回検出する。処理部は、蛍光検出部が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する。蛍光検出部は、反応場上の液体の深さが第１の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出し、かつ反応場上の液体の深さが第１の深さと異なる第２の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出する。

Description

検出装置および検出方法

　本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出する検出装置および検出方法に関する。

　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。

　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。ＳＰＦＳでは、所定の条件で金属膜に光を照射することで生じる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）を利用する。

　まず、ＳＰＦＳでは、被検出物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質は反応場で捕捉体に結合する。次いで、蛍光物質で標識された別の捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場で捕捉体に結合した被検出物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度で被検出物質を検出することができる。

　しかし、蛍光検出時に、被検出物質を標識していない未反応の蛍光物質が金属膜上に存在するとバックグラウンドノイズとなってしまう。このため、正確に被検出物質を検出するために、あらかじめ未反応の蛍光物質を洗浄により除去しておくことが好ましい。

　ＳＰＦＳは、励起光と表面プラズモンとを結合（カップリング）させる手段により、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳとに大別される。ＰＣ－ＳＰＦＳでは、１つの面に金属膜を形成されたプリズムを利用する。この方法では、プリズムと金属膜の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる。ＰＣ－ＳＰＦＳは、現在主流となっている方法であるが、プリズムを使用すること、および金属膜に対する励起光の入射角が大きいことから、検出装置の小型化の点で課題を有している。

　これに対し、ＧＣ－ＳＰＦＳは、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させる（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。ＧＣ－ＳＰＦＳは、プリズムを使用せず、かつ回折格子に対する励起光の入射角が小さいため、ＰＣ－ＳＰＦＳに比べて検出装置を小型化することができる。

特開２０１１－１５８３６９号公報

Keiko Tawa, Hironobu Hori, Kenji Kintaka, Kazuyuki Kiyosue, Yoshiro Tatsu, and Junji Nishii, "Optical microscopic observation of fluorescence enhanced by grating-coupled surface plasmon resonance", Optics Express, Vol. 16, pp. 9781-9790.

　上記のように、ＧＣ－ＳＰＦＳは、ＰＣ－ＳＰＦＳに比べて検出装置を小型化することができるという利点を有するが、ＧＣ－ＳＰＦＳについての研究は、ＰＣ－ＳＰＦＳについての研究に比べて進んでいない。したがって、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用する検出装置および検出方法には、検出感度に改善の余地がある。

　また、ＧＣ－ＳＰＦＳおよびＰＣ－ＳＰＦＳのいずれにおいても、未反応の蛍光物質によるバックグラウンドノイズの影響で、被検出物質を正確に検出できないおそれがある。バックグラウンドノイズの影響を除去するために、洗浄を行った場合、洗浄工程の間に被検出物質と、金属膜（または１次抗体）との結合状態が変化してしまうため、反応過程のリアルタイム測定ができないという問題がある。

　本発明の目的は、ＳＰＦＳを利用する検出装置および検出方法であって、金属膜上に未反応の蛍光物質が存在していたとしても、被検出物質の存在または量を正確に検出することができる検出装置および検出方法を提供することである。

　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するための検出装置であって、液体を収容するための収容部と、前記収容部の底部に配置され、かつ蛍光物質で標識されている被検出物質が直接的または間接的に固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを保持するためのホルダーと、前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射する励起光照射部と、液体が前記収容部内に存在する状態で、前記励起光照射部が前記金属膜に励起光を照射したときに、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を少なくとも２回検出する蛍光検出部と、前記蛍光検出部が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する処理部と、を有し、前記蛍光検出部は、前記反応場上の前記液体の深さが第１の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出し、かつ前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出する。

　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するための検出方法であって、液体を収容するための収容部と、前記収容部の底部に配置され、蛍光物質で標識されている被検出物質が直接的または間接的に固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを準備する第１工程と、前記反応場上の液体の深さが第１の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第２工程と、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第３工程と、前記第２工程および前記第３工程で得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する第４工程と、を有する。

　本発明によれば、ＳＰＦＳを利用する検出装置および検出方法において、被検出物質を高感度かつ簡単に検出することができる。また、本発明によれば、被検出物質をリアルタイムで検出することもできる。

図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。図２Ａは、実施の形態１～４に係るＳＰＦＳ装置で使用される検出チップの断面図であり、図２Ｂは、検出チップの平面図である。図３は、回折格子の斜視図である。図４は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。図５Ａ、Ｂは、実施の形態１、４に係るＳＰＦＳ装置の検出工程の一部を説明するための模式図である。図６Ａ、Ｂは、ＳＰＦＳ装置による被検出物質の検出原理を説明するための模式図である。図７は、変形例に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。図８は、ＳＰＦＳ装置で使用される変形例に係る検出チップの断面図である。図９は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。図１０は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。図１１は、実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。図１２は、実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。図１３は、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。図１４は、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。

　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

　［実施の形態１］
　実施の形態１では、金属膜上に存在する蛍光物質から放出される蛍光に含まれる第１の光（例えばｐ偏光）と、第２の光（例えばｓ偏光）とをそれぞれ検出するＧＣ－ＳＰＦＳ装置について説明する。実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置は、偏光子を有し、偏光子の回転角度の切り替えを行う。

　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図２Ａは、検出チップ１０の断面図であり、図２Ｂは、検出チップ１０の平面図である。図２Ａに示される断面図は、図２ＢにおけるＡ－Ａ線の断面を示している。図３は、回折格子１３の斜視図である。

　図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部１２０、搬送部１３０および制御部１４０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１３０のチップホルダー（ホルダー）１３２に２つの検出チップ（検出チップ１０および検出チップ１０’）を装着した状態で使用される。ＳＰＦＳ装置１００の構成および動作機構は、使用する検出チップ１０の構成および数によって適宜設計される。そこで、先に検出チップ１０、１０’について説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００について説明する。なお、検出チップ１０および検出チップ１０’は、それぞれの構成は同じであり、収容される液体の深さのみが異なる。検出チップ１０には、第１の深さｈ１で液体が収容され、検出チップ１０’には、第２の深さｈ２で液体が収容される。以下、検出チップの構成の説明では、検出チップ１０について説明する。

　図２Ａ、Ｂに示されるように、検出チップ１０は、基板１１と、基板１１の上に形成された金属膜１２と、基板１１上に配置された枠体１４とを有する。基板１１上に枠体１４を配置することで液体を収容するための収容部１５が形成される。また、金属膜１２は、回折格子１３を有しており、回折格子１３には捕捉体１６（例えば１次抗体）が固定化されている。したがって、回折格子１３の表面は、捕捉体１６と被検出物質とが結合するための反応場としても機能する。

　基板１１は、金属膜１２の支持部材である。基板１１の材料は、金属膜１２を支持できる機械的強度を有するものであれば特に限定されない。基板１１の材料の例には、ガラスや石英、シリコンなどの無機材料；アクリル樹脂やポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィンなどの樹脂が含まれる。

　金属膜１２は、収容部１５の底部において、基板１１上に配置されている。前述のとおり、金属膜１２は、回折格子１３を有している。本実施の形態では、金属膜１２（回折格子１３）は、収容部１５内に露出するように配置されている。金属膜１２に所定の入射角で光を照射すると、金属膜１２中に生じる表面プラズモンと、回折格子１３により生じるエバネッセント波とが結合して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じる。金属膜１２の材料は、表面プラズモンを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜１２の材料の例には、金、銀、アルミニウム、プラチナ、銅、これらの合金が含まれる。金属膜１２の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜１２の厚みは、特に限定されない。金属膜１２の厚みは、例えば３０～５００ｎｍであり、好ましくは１００～３００ｎｍである。

　回折格子１３は、金属膜１２に光を照射された時に、エバネッセント波を生じさせる。回折格子１３の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子１３は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。本実施の形態では、図３に示されるように、回折格子１３は、１次元回折格子であり、金属膜１２の表面に、互いに平行な複数の凸条（および凹条）が所定の間隔で形成されている。また、回折格子１３の断面形状も特に限定されない。回折格子１３の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。本実施の形態では、回折格子１３の断面形状は、矩形波形状である。なお、後述する励起光αの光軸は、ｘｚ平面に平行である。回折格子１３の溝（凹条）のピッチおよび深さは、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されず、照射される光の波長に応じて適宜設定されうる。たとえば、回折格子１３の溝のピッチは、１００ｎｍ～２０００ｎｍの範囲内であることが好ましく、回折格子１３の溝の深さは、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内であることが好ましい。

　回折格子１３の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板１１の上に金属膜１２を形成した後、金属膜１２に凹凸形状を付与してもよい。また、あらかじめ凹凸形状を付与された基板１１の上に、金属膜１２を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子１３を含む金属膜１２を形成することができる。

　回折格子１３には、被検出物質を捕捉するための捕捉体１６が固定化される。ここで、回折格子１３（金属膜１２）上において、捕捉体１６が固定化されている領域を、特に「反応場」という。捕捉体１６は、被検出物質に特異的に結合する。これにより、被検出物質は、間接的に金属膜１２（回折格子１３）に固定される。本実施の形態では、回折格子１３の表面に、捕捉体１６が略均一に固定化されている。

　捕捉体１６の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体１６は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などである。

　捕捉体１６の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、回折格子１３の上に、捕捉体１６を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）_１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体１６に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を回折格子１３に固定化し、この高分子に捕捉体１６を結合させてもよい。

　図１に示されるように、回折格子１３（金属膜１２）は、所定の入射角θ_１で励起光αを照射される。照射領域では、金属膜１２で生じた表面プラズモンと、回折格子１３により生じたエバネッセント波が結合し、ＳＰＲが生じる。照射領域に蛍光物質が存在する場合は、ＳＰＲにより形成された増強電場により、蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＧＣ－ＳＰＦＳでは、ＰＣ－ＳＰＦＳと異なり、蛍光βは特定の方向に指向性を持って出射される。たとえば、蛍光βの出射角θ_２は、２θ_１で近似される。なお、ＳＰＲが生じる条件では、励起光αの反射光γは、ほとんど生じない。

　枠体１４は、図２Ｂに示されるように、貫通孔を有する板である。枠体１４は、基板１１上に配置される。貫通孔の内面は、収容部１５の側面となる。枠体１４の厚みは、特に限定されず、収容部１５に収容する液体の量および深さに応じて設計される。枠体１４を基板１１上に固定する方法は、特に限定されない。たとえば、枠体１４は、両面に粘着性を有するシリコンシート（両面シール）などを使用して基板１１上に固定されうる。

　収容部１５は、金属膜１２（または基板１１）上に配置され、液体を収容する。本実施の形態では、一方の検出チップ１０の収容部１５には、第１の深さｈ１で液体が収容される。また、他方の検出チップ１０’の収容部１５には、第２の深さｈ２で液体が収容される。収容部１５内に収容される液体の深さは、特に限定されないが、第１の深さｈ１および第２の深さｈ２は、１０μｍ～１ｃｍの範囲内にあることが好ましい。第１の深さｈ１に対する第２の深さｈ２の比をｍ（ｈ２／ｈ１）とおくと、ｍは、０．９～１．１を除く、０．１～１０の範囲内にあることが好ましい。収容部１５の形状や大きさなどは、所望の量の液体を収容することができれば、特に限定されない。たとえば、収容部１５は、液体を収容するウェルであってもよいし、液体が連続して供給されうる流路（フローセル）であってもよい。収容部１５がウェルである検出チップは、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、バルクと金属膜１２表面との間の物質移動解析（リアルタイム測定）や、増強電場空間スケール（ｚ軸方向）の測定などにも好適である。収容部１５が流路である検出チップ１０は、例えば、一般的な被検出物質の測定（非リアルタイム測定）に加えて、金属膜１２表面に固定化された分子（捕捉体）に対する、別の分子（被検出物質）の反応定数解析（リアルタイム測定）などにも好適である。本実施の形態では、収容部１５は、ウェルである。前述のとおり、収容部１５は、枠体１４を基板１１上に配置することで形成されているが、収容部１５を形成する方法は、特に限定されない。収容部１５を形成する方法の他の例には、その下面に凹部を形成された蓋を基板１１上に配置することが含まれる。

　収容部１５に収容される液体の種類は、特に限定されない。液体の種類の例には、被検出物質を含む検体や、蛍光物質を含む標識液、緩衝液などが含まれる。通常、液体の屈折率および誘電率は、水の屈折率および誘電率と同程度である。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。

　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部１２０、搬送部１３０および制御部１４０を有する。

　励起光照射部１１０は、波長および光量が一定の励起光αを、検出チップ１０、１０’の金属膜１２（回折格子１３）に照射する。このとき、励起光照射部１１０は、金属膜１２中の表面プラズモンと結合できる回折光が回折格子１３で生じるように、金属膜１２の表面に対するｐ偏光の光を金属膜１２（回折格子１３）に照射する。励起光αの光軸は、回折格子１３における周期的構造の配列方向（図２Ａ、Ｂおよび図３におけるｘ軸方向）に沿う。したがって、ｘ軸に垂直かつ金属膜１２の表面に平行な軸をｙ軸とし、ｘ軸に垂直かつ金属膜１２の表面に垂直な軸をｚ軸とした場合、励起光αの光軸はｘｚ平面に平行である（図１参照）。励起光αは、金属膜１２の表面に対するｐ偏光の光であることから、励起光αの電界の振動方向は、励起光αの光軸および金属膜１２の表面に対する法線を含むｘｚ平面に平行である。

　励起光照射部１１０は、少なくとも光源１１１を有する。励起光照射部１１０は、さらにコリメートレンズや励起光フィルターなどを有していてもよい。

　光源１１１は、検出チップ１０、１０’の回折格子１３に向けて励起光αを出射する。光源１１１の種類は、特に限定されない。光源１１１の種類の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、光源１１１は、レーザーダイオードである。たとえば、光源１１１から出射される励起光αの波長は、４００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内である。

　コリメートレンズ（図示省略）は、光源１１１と検出チップ１０、１０’との間に配置され、光源１１１から出射された励起光αをコリメートする。レーザーダイオード（光源１１１）から出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、金属膜１２表面における照射スポットの形状が略円形となるように、レーザーダイオードは所定の姿勢で保持される。照射スポットのサイズとしては、例えば１ｍｍφ程度であることが好ましい。

　励起光フィルター（図示省略）は、光源１１１と検出チップ１０、１０’との間に配置され、光源１１１から出射された励起光αを整波する。励起光フィルターの種類の例には、バンドパスフィルターおよび直線偏光フィルターが含まれる。レーザーダイオード（光源１１１）からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、バンドパスフィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、レーザーダイオード（光源１１１）からの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、直線偏光フィルターは、レーザーダイオードからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。励起光フィルターは、金属膜１２にｐ偏光の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。

　金属膜１２に対する励起光αの入射角θ_１（図１参照）は、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度であることが好ましい。励起光αの入射角θ_１は、回折格子１３の溝のピッチや励起光αの波長、金属膜１２を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。励起光αの最適な入射角θ_１は、各種条件の変更により変わるため、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光αの光軸と検出チップ１０、１０’とを相対的に回転させることで入射角θ_１を調整する第１の角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第１の角度調整部は、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を中心として、励起光照射部１１０または検出チップ１０、１０’を回転させればよい。

　蛍光検出部１２０は、励起光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を通り、かつ金属膜１２の表面に対する法線を挟むように配置されている。蛍光検出部１２０は、金属膜１２（回折格子１３）上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも２回検出する。より具体的には、蛍光検出部１２０は、検出チップ１０の反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出し、かつ検出チップ１０’の反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出する。

　蛍光検出部１２０は、偏光子１２１、回転角度調整部１２２および受光センサー１２３を有する。蛍光検出部１２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。

　偏光子１２１は、検出チップ１０、１０’と受光センサー１２３との間において蛍光βの光路上に配置されている。偏光子１２１は、蛍光βから、金属膜１２の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とを取り出す。好ましくは、偏光子１２１は、蛍光βから、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０°のｐ偏光の光を第１の光として、前記平面（ｘｚ）に対する電界の振動方向の角度が９０°のｓ偏光の光を第２の光として取り出す。偏光子１２１の回転角度は、回転角度調整部１２２により調整される。偏光子１２１の種類は、所定の偏光方向の光を取り出すことができれば特に限定されない。偏光子１２１の種類の例には、偏光板、偏光プリズム、液晶フィルター、その他の偏光フィルターが含まれる。本実施の形態では、偏光子１２１は、偏光板である。

　回転角度調整部１２２は、偏光子１２１の回転角度を調整する。回転角度調整部１２２は、例えば、ステッピングモーターを含む。

　受光センサー１２３は、偏光子１２１により取り出された金属膜１２上の蛍光物質から放出された蛍光βを検出して、金属膜１２上の蛍光像を検出する。受光センサー１２３の種類は、特に限定されず、例えば、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管であり、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）やフォトダイオード（ＰＤ）、ＣＣＤイメージセンサーなどであってもよい。

　集光レンズ群（図示省略）は、検出チップ１０、１０’と、受光センサー１２３との間に配置され、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。集光レンズ群は、金属膜１２上の蛍光像を受光センサー１２３の受光面上に結像させる。

　蛍光フィルター（図示省略）は、検出チップ１０、１０’と、受光センサー１２３との間に配置される。蛍光フィルターは、例えば、カットフィルターおよび減光（ＮＤ）フィルターを含み、受光センサー１２３に到達する光から蛍光β以外のノイズ成分（例えば、励起光αや外光など）を除去したり、受光センサー１２３に到達する光の光量を調整したりする。

　ＧＣ－ＳＰＦＳでは、蛍光βは、回折格子１３（反応場）から特定の方向に指向性を持って出射される。したがって、金属膜１２表面の法線に対する蛍光検出部１２０の光軸の角度は、蛍光βの強度が最大となる角度（蛍光ピーク角）であることが好ましい。また、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光検出部１２０の光軸と検出チップ１０、１０’とを相対的に回転させることで蛍光検出部１２０の光軸の角度を調整する第２の角度調整部（図示省略）を有することが好ましい。たとえば、第２の角度調整部は、蛍光検出部１２０の光軸と金属膜１２との交点を中心として、蛍光検出部１２０または検出チップ１０、１０’を回転させればよい。

　搬送部１３０は、検出チップ１０、１０’の位置を移動させる。搬送部１３０は、搬送ステージ１３１およびチップホルダー１３２を有する。チップホルダー１３２は、搬送ステージ１３１に固定されており、検出チップ１０、１０’を着脱可能に保持する。チップホルダー１３２の形状は、検出チップ１０、１０’を保持することができ、かつ励起光αおよび蛍光βの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１３１は、チップホルダー１３２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１３１の形状も、励起光αおよび蛍光βの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１３１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

　制御部１４０は、励起光照射部１１０（光源１１１および第１の角度調整部）、蛍光検出部１２０（回転角度調整部１２２、受光センサー１２３および第２の角度調整部）および搬送部１３０（搬送ステージ１３１）の動作を制御する。また、制御部１４０は、蛍光検出部１２０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部１２０（受光センサー１２３）が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値、および必要に応じてノイズ値を算出する。制御部１４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図４は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図５Ａ、Ｂは、ＳＰＦＳ装置１００の検出工程の一部を説明するための模式図である。ここでは、捕捉体１６として１次抗体を使用し、１次抗体に捕捉された被検出物質に蛍光物質で標識された２次抗体を結合させることで被検出物質を蛍光物質で標識する例について説明する

　まず、検出の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、２つの検出チップ１０、１０’を準備して、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１３２に２つの検出チップ１０、１０’をそれぞれ設置する。また、検出チップ１０、１０’の金属膜１２上に保湿剤が存在する場合は、１次抗体が適切に被検出物質を捕捉できるように、金属膜１２上を洗浄して保湿剤を除去する。

　次いで、検体中の被検出物質と１次抗体とを結合させる（１次反応；工程Ｓ１２０）。具体的には、各検出チップ１０、１０’において、金属膜１２上に検体を提供して、検体と１次抗体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は、１次抗体に結合する。

　次いで、１次抗体に結合した被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１３０）。具体的には、蛍光物質で標識された２次抗体を含む蛍光標識液を金属膜１２上に提供して、１次抗体に結合した被検出物質と蛍光標識液とを接触させる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された２次抗体を含む緩衝液である。被検出物質が１次抗体に結合している場合は、被検出物質の少なくとも一部は、蛍光物質で標識される。この後説明するように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。しかしながら、蛍光物質で標識した後は、金属膜１２上を緩衝液などで洗浄し、遊離の２次抗体などを除去することが好ましい。

　なお、１次反応と２次反応の順番は、これに限定されない。たとえば、被検出物質を２次抗体に結合させた後に、これらの複合体を含む液体を金属膜１２上に提供してもよい。また、金属膜１２上に検体と蛍光標識液を同時に提供してもよい。

　次いで、励起光αを一方の検出チップ１０の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えば、ｐ偏光の光）を検出する（工程Ｓ１４０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３に、ＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ａを記録する。このとき、検出チップ１０の反応場上には、液体（例えば緩衝液や蛍光標識液など）が第１の深さｈ１で存在している。また、図５Ａに示されるように、制御部１４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第１の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、励起光αを同じ検出チップ１０の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えば、ｓ偏光の光）を検出する（工程Ｓ１５０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｂを記録する。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第２の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、検出対象とする反応場を切り替える（工程Ｓ１６０）。具体的には、制御部１４０は、搬送ステージ１３１を操作して、検出チップ１０、１０’を移動させる。これにより、励起光照射部１１０が他方の検出チップ１０’の反応場に励起光αを照射できるようにする。

　次いで、励起光αを他方の検出チップ１０’の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光を検出する（工程Ｓ１７０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０’の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｃを記録する。このとき、検出チップ１０’の反応場上には、検出チップ１０の反応場上に存在する液体と同じ液体が第２の深さｈ２で収容されている。また、図５Ａに示されるように、制御部１４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第１の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、励起光αを同じ検出チップ１０’の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光を検出する（工程Ｓ１８０）。具体的には、制御部１４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｄを記録する。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部１４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第２の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　２次反応（工程Ｓ１３０）の後に収容部１５内の蛍光標識液を、２次抗体を含まない緩衝液に置換して収容部１５内を洗浄した場合であっても、被検出物質に結合した２次抗体の一部は緩衝液中に離脱する。また、２次反応（工程Ｓ１３０）の後に洗浄を行わなかった場合は、収容部１５内には蛍光標識液がそのまま存在していることになる。したがって、いずれの場合においても、工程Ｓ１４０での検出値Ａおよび工程Ｓ１５０での検出値Ｂ、ならびに工程Ｓ１７０での検出値Ｃおよび工程Ｓ１８０での検出値Ｄは、ＳＰＲに起因する増強電場により励起された蛍光物質（主として１次抗体に捕捉された被検出物質を標識している蛍光物質）から放出された蛍光βの成分と、ＳＰＲに起因する増強電場以外の光（励起光αおよび外部光）により励起された蛍光物質（主として収容部１５内の液体中に遊離している蛍光物質）から放出された蛍光βの成分とを含む。

　最後に、制御部（処理部）１４０は、工程Ｓ１４０～Ｓ１８０において蛍光検出部１２０により得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１９０）。以下、当該シグナル値の算出方法について説明する。

　図６は、ＳＰＦＳ装置１００による被検出物質の検出原理を説明するための模式図である。図６Ａは、一方の検出チップ１０における回折格子１３（金属膜１２）の反応場上に第１の深さｈ１で液体が存在している状態を示し、図６Ｂは、他方の検出チップ１０’における回折格子１３（金属膜１２）の反応場上に第２の深さｈ２で液体が存在している状態を示している。また、図６Ａおよび図６Ｂにおいて、白色の星は、蛍光物質を示している。

　図６Ａに示されるように、第１の深さｈ１で液体が存在する状態で、反応場から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）とが含まれる。すなわち、蛍光βを検出したときの検出値は、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分Ｉ_ｐ１およびｓ偏光成分Ｉ_ｓ１）による成分と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分Ｉ_ｐ２およびｓ偏光成分Ｉ_ｓ２）による成分とが含まれる。このとき、Ｉ_ｐ１およびＩ_ｓ１は、主として１次抗体に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光βに因り、Ｉ_ｐ２およびＩ_ｓ２は、主として収容部１５内の液体に遊離している蛍光物質からの蛍光βに因る。したがって、第１の光（ｐ偏光成分）のみを検出する工程Ｓ１４０における受光センサー１２３の検出値Ａは、Ｉ_ｐ１およびＩ_ｐ２に由来し、第２の光（ｓ偏光成分）のみを検出する工程Ｓ１５０における受光センサー１２３の検出値Ｂは、Ｉ_ｓ１およびＩ_ｓ２に由来する。すなわち、反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ａ、Ｂは、以下の式（１）および式（２）でそれぞれ表される。

　また、図６Ｂに示されるように、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で、反応場から放出された蛍光βにも、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）とが含まれる。このとき、ＳＰＲに起因する増強電場の影響が及ぶ、回折格子１３の表面からの距離は、収容部１５内に収容されている液体の深さによらず、一定である。このため、第１の深さｈ１で液体が存在している状態と、第２の深さｈ２で液体が存在している状態とにおいて、Ｉ_ｐ１およびＩ_ｓ１の大きさは、同じである。

　一方、第１の深さｈ１に対する第２の深さｈ２の比がｍであるとき、反応場上にはｍ倍の量の液体が存在し、ｍ倍の量の蛍光物質が存在することとなる。このとき、液体の深さ（数μｍ～数ｃｍ）と比較すると、ＳＰＲに起因する増強電場の影響が及ぶ距離は、１００ｎｍ以下であり、無視できるほど小さい。このため、ｍは、第１の深さｈ１で収容されている液体中のＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けない領域の高さに対する、第２の深さｈ２で収容されている液体中のＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けない領域の高さの比に等しいと近似することができる。したがって、第２の深さｈ２で液体が存在する状態で放出された蛍光βには、第１の深さｈ１で液体が存在している状態で放出された蛍光βに含まれるＩ_ｐ２およびＩ_ｓ２がｍ倍の量含まれることとなる。反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で、蛍光検出部１２０が検出した検出値Ｃ、Ｄは、以下の式（３）および式（４）でそれぞれ表される。

　また、ＧＣ－ＳＰＦＳでは、金属膜１２上に固定されている被検出物質（主として１次抗体に捕捉されている被検出物質）を標識する蛍光物質から放出される蛍光βは、金属膜１２の表面に対するｐ偏光の光、または偏光角度がｐ偏光の光に近い光であることが分かっている。一方、金属膜１２上に固定されていない蛍光物質（主として液体中に遊離している蛍光物質）から放出される蛍光βは、ｐ偏光の光だけでなくｓ偏光の光もある程度含むことが分かっている。すなわち、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された蛍光βのうちｓ偏光の成分Ｉ_ｓ１については、ほぼ０であると近似することができる。したがって、制御部（処理部）１４０は、上記式（１）および式（３）でそれぞれ表される検出値Ａ、Ｃに基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値として、以下の式（５）で表されるＩ_ｐ１を算出することができる。

　さらに、必要に応じて制御部（処理部）１４０は、以下の式（６）～（８）でそれぞれ表される被検出物質の存在または量を示さないノイズ値Ｉ_ｐ２、Ｉ_ｓ１、およびＩ_ｓ２をさらに算出することもできる。

　以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。本発明では、上記の手順によりノイズの除去をすることができるため、ブランク値の測定を必ずしも行わなくてもよい。

　ただし、必要に応じて２次反応（工程Ｓ１３０）よりも前にブランク値の測定を行ってもよい。具体的には、収容部１５内の液体中に蛍光物質が存在しない状態で、工程Ｓ１４０～Ｓ１８０と同様の手順でブランク値Ａ’～Ｄ’をあらかじめ得ておく。この場合、工程Ｓ１９０において、各検出値Ａ～Ｄから各ブランク値Ａ’～Ｄ’をそれぞれ引いた上で、上記の算出方法によりシグナル値Ｉ_ｐ１、および必要に応じてノイズ値Ｉ_ｐ２、Ｉ_ｓ１、Ｉ_ｓ２の算出を行う。

　（効果）
　以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、金属膜１２上に未反応の蛍光物質が存在していたとしても、バックグラウンドノイズを除去して、被検出物質の存在または量を正確に検出することができる。このため、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、従来のＳＰＦＳ装置に比べてより高感度かつ簡単に被検出物質を検出することができる。

　また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、蛍光βに含まれるノイズ成分を除去することができるため、２次反応（工程Ｓ１３０）を行った後に遊離の２次抗体を除去しなくても被検出物質の検出を行うことができる。

　なお、本実施の形態では、１つの偏光子１２１を使用して、第１の光および第２の光を異時に検出する態様について説明したが、本実施の形態に係る検出装置および検出方法は、この態様に限定されない。たとえば、２つの偏光子および受光センサーを使用して、第１の光および第２の光を同時に検出してもよい。図７は、変形例に係るＳＰＦＳ装置１００’の構成を示す模式図である。図７に示されるように、変形例に係るＳＰＦＳ装置１００’では、回転角度調整部１２２が不要であり、蛍光検出部１２０’は、さらにハーフミラー１２４’、偏光子１２１’および受光センサー１２３’を有する。この場合、一方の偏光子１２１は、第１の光のみを透過するように調整され、他方の偏光子１２１’は、第２の光のみを透過するように調整される。これにより、金属膜１２上の蛍光物質から放出された蛍光βのうち、半分はハーフミラー１２４’を透過し、蛍光βに含まれる第１の光が受光センサー１２３により検出される。これと同時に、金属膜１２上の蛍光物質から放出された蛍光βのうち、残り半分はハーフミラー１２４’により反射され、蛍光βに含まれる第２の光が受光センサー１２３’により検出される。したがって、上記実施の形態の工程Ｓ１４０および工程Ｓ１５０と、工程Ｓ１７０および工程Ｓ１８０とをそれぞれ同時に行うことができる。

　また、上記の実施の形態では、２つの検出チップ１０、１０’を使用する態様について説明したが、本発明に係る検出装置および検出方法は、１つの検出チップのみを使用してもよい。この場合、検出チップは、収容部内に液体を収容したときに、第１の深さおよび第２の深さで液体を収容しうる収容部を有する。検出チップの例には、その収容部の底部に段部または傾斜面を有する検出チップが含まれる。図８は、変形例に係る検出チップ１０”の構成を示す模式図である。図８に示されるように、変形例に係る検出チップ１０”では、基板１１”に段差が形成されている。また、段差面の上段側および下段側の両方に金属膜１２（回折格子１３）が配置されている。これにより、収容部１５”内に液体を収容したときに、その上の液体の深さが第１の深さｈ１”となる第１の反応場１７”と、その上の液体の深さが第２の深さｈ２”となる第２の反応場１８”とが、段差面の上段側および下段側にそれぞれ配置される。検出チップの他の例には、段部や傾斜面を有する蓋部をさらに有する検出チップが含まれる。この場合、収容部内に液体を収容し、かつ蓋部を配置したときに、第１の反応場１７”および第２の反応場１８”が金属膜上に配置される。

　また、上記の実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、第１の光を検出する工程（工程Ｓ１４０）と、第２の光を検出する工程（工程Ｓ１５０）との順番は、これに限定されない。また、第１の光を検出する工程（工程Ｓ１７０）と、第２の光を検出する工程（工程Ｓ１８０）との順番も、これに限定されない。すなわち、第１の光を検出する工程の前に第２の光を検出してもよい。

　また、本実施の形態では、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用した検出装置および検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出装置および検出方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳを利用してもよい。この場合、検出チップ１０、１０’は、誘電体からなるプリズムを有し、金属膜１２は、プリズムの上に配置される。また、金属膜１２は、回折格子１３を有しない。励起光αは、プリズムを介して反応場に対応した金属膜１２の裏面に照射される。さらに、ＰＣ－ＳＰＦＳでは、捕捉体１６により捕捉されている被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光βは、ｐ偏光の光だけでなくｓ偏光の光もある程度含む。したがって、増強電場の影響を受けて生成された光に由来するＩ_ｓ１は、０であると近似することはできない。したがって、制御部（処理部）は、反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で蛍光検出部が第１の光として検出した検出値Ａと、反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で蛍光検出部が第２の光として検出した検出値Ｂと、反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で蛍光検出部が第１の光として検出した検出値Ｃと、反応場上の液体の深さが第２の深さｈ１の状態で蛍光検出部が第２の光として検出した検出値Ｄと、に基づいて、以下の式（９）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１＋Ｉ_ｓ１を算出する。さらに、制御部（処理部）は、必要に応じて以下の式（１０）および式（１１）により表される、第１の光に含まれるＳＰＲ鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、第２の光に含まれ、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とをさらに算出してもよい。

　［上記式において、ｍは第１の深さに対する第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］

　［実施の形態２］
　実施の形態２では、金属膜上に存在する蛍光物質から放出される蛍光に含まれる直線偏光（例えばｐ偏光）のみを検出するＧＣ－ＳＰＦＳ装置について説明する。実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置は、偏光子を有するが、偏光子の回転角度を切り替える必要がない。

　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図９は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置２００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部２２０、搬送部１３０および制御部２４０を有する。ＳＰＦＳ装置２００では、蛍光検出部２２０および制御部２４０のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１において説明したＳＰＦＳ装置１００と同一の構成要素については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　蛍光検出部２２０は、励起光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を通り、かつ金属膜１２の表面に対する法線を挟むように配置されている。蛍光検出部２２０は、金属膜１２（回折格子１３）上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも２回検出する。より具体的には、蛍光検出部２２０は、一方の検出チップ１０の反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で当該検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出し、かつ他方の検出チップ１０’の反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で当該検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出する。

　蛍光検出部２２０は、偏光子２２１および受光センサー１２３を有する。蛍光検出部２２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。

　偏光子２２１は、検出チップ１０、１０’と受光センサー１２３との間において蛍光βの光路上に配置されている。偏光子２２１は、蛍光βから、金属膜１２の表面に対する法線と励起光αの光軸とを含む平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の光を取り出す。好ましくは、偏光子２２１は、蛍光βから、前記平面（ｘｚ平面）に対する電界の振動方向の角度が０°のｐ偏光の光を取り出す。偏光子２２１の回転角度は、上記の直線偏光の光のみを透過するように調整（または固定）されている。偏光子２２１の種類は、所定の偏光方向の直線偏光の光を取り出すことができれば特に限定されない。偏光子２２１の種類の例は、例えば、実施の形態１の偏光子１２１と同じである。

　制御部２４０は、励起光照射部１１０（光源１１１および第１の角度調整部）、蛍光検出部２２０（受光センサー１２３および第２の角度調整部）および搬送部１３０（搬送ステージ１３１）の動作を制御する。また、制御部２４０は、蛍光検出部２２０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部２２０（受光センサー１２３）が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値、および必要に応じてノイズ値を算出する。制御部２４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置２００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図１０は、ＳＰＦＳ装置２００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

　まず、実施の形態１の工程Ｓ１１０、工程Ｓ１２０、および工程Ｓ１３０と同様に、検出の準備をする工程（工程Ｓ２１０）、１次反応（工程Ｓ２２０）、および２次反応（工程Ｓ２３０）を行う。これにより、蛍光物質で標識されている被検出物質が反応場に固定されている状態の検出チップ１０、１０’を、ＳＰＦＳ装置２００のチップホルダー１３２に配置することができる。

　次いで、励起光αを一方の検出チップ１０の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる直線偏光の光（例えば、ｐ偏光の光）を検出する（工程Ｓ２４０）。具体的には、制御部２４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３に、ＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ａを記録する。このとき、検出チップ１０の反応場上には、液体（例えば緩衝液や蛍光標識液など）が第１の深さｈ１で収容されている。

　次いで、検出対象とする反応場を切り替える（工程Ｓ２５０）。具体的には、制御部２４０は、搬送ステージ１３１を操作して、検出チップ１０、１０’を移動させる。これにより、励起光照射部１１０が他方の検出チップ１０’の反応場に励起光αを照射できるようにする。

　次いで、励起光αを他方の検出チップ１０’の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる直線偏光の光を検出する（工程Ｓ２６０）。具体的には、制御部２４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０’の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｂを記録する。このとき、検出チップ１０’の反応場上には、検出チップ１０の反応場上の液体と同じ液体が第２の深さｈ２で収容されている。また、制御部２４０は、偏光子２２１の回転角度を調整する必要がない。

　最後に、制御部（処理部）２４０は、蛍光検出部２２０により得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ２７０）。以下、当該シグナル値の算出方法について説明する。

　実施の形態１で述べたとおり、反応場から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）とが含まれる。本実施の形態において、工程Ｓ２４０および工程Ｓ２６０では、蛍光βに含まれる前述した直線偏光のみを検出するため、受光センサー１２３の検出値Ａ、Ｂは、Ｉ_ｐ１およびＩ_ｐ２に由来する。したがって、検出値Ａ、Ｂは、以下の式（１２）および式（１３）で表される。

　したがって、本実施の形態では、制御部（処理部）２４０は、上記の式（１２）および式（１３）で表される検出値Ａ、Ｂに基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値として、以下の式（１４）で表されるＩ_ｐ１を算出する。

　以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。

　（効果）
　実施の形態２に係る検出装置および検出方法では、実施の形態１に係る検出装置および検出方法と同様の効果を得ることができ、さらに偏光子２２１の回転角度を調整しなくてもよいため、検出装置の構成および検出方法が単純になる。

　［実施の形態３］
　実施の形態３では、金属膜上に存在する蛍光物質から放出される蛍光に含まれる蛍光（ｐ偏光の光およびｓ偏光の光を含む）を検出するＧＣ－ＳＰＦＳ装置について説明する。本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置は、偏光子を有しない。

　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図１１は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置３００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置３００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部３２０、搬送部１３０および制御部３４０を有する。ＳＰＦＳ装置３００では、蛍光検出部３２０および制御部３４０のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１において説明したＳＰＦＳ装置１００と同一の構成要素については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　蛍光検出部３２０は、励起光照射部１１０に対して、励起光αの光軸と金属膜１２との交点を通り、かつ金属膜１２の表面に対する法線を挟むように配置されている。蛍光検出部３２０は、金属膜１２（回折格子１３）上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも２回検出する。より具体的には、蛍光検出部３２０は、一方の検出チップ１０の反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出し、かつ他方の検出チップ１０’の反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを少なくとも１回検出する。

　蛍光検出部３２０は、少なくとも受光センサー１２３を有する。蛍光検出部３２０は、さらに集光レンズ群や開口絞り、蛍光フィルターなどを有していてもよい。

　制御部３４０は、励起光照射部１１０（光源１１および第１の角度調整部）、蛍光検出部３２０（受光センサー１２３および第２の角度調整部）および搬送部１３０（搬送ステージ１３１）の動作を制御する。また、制御部３４０は、蛍光検出部３２０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部３２０（受光センサー１２３）が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値、および必要に応じてノイズ値を算出する。制御部３４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置３００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図１２は、ＳＰＦＳ装置３００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

　まず、実施の形態１の工程Ｓ１１０、工程Ｓ１２０、および工程Ｓ１３０と同様に、検出の準備をする工程（工程Ｓ３１０）、１次反応（工程Ｓ３２０）、および２次反応（工程Ｓ３３０）を行う。これにより、蛍光物質で標識されている被検出物質が反応場に固定されている状態の検出チップ１０、１０’を、ＳＰＦＳ装置３００のチップホルダー１３２に配置することができる。

　次いで、励起光αを一方の検出チップ１０の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する（工程Ｓ３４０）。具体的には、制御部３４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３に、ＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ａを記録する。このとき、検出チップ１０の反応場上には、液体（例えば緩衝液や蛍光標識液など）が第１の深さｈ１で収容されている。

　次いで、検出対象とする反応場を切り替える（工程Ｓ３５０）。具体的には、制御部３４０は、搬送ステージ１３１を操作して、検出チップ１０、１０’を移動させる。これにより、励起光照射部１１０が他方の検出チップ１０’の反応場に励起光αを照射できるようにする。

　次いで、励起光αを他方の検出チップ１０’の反応場に照射しつつ、当該検出チップ１０’の反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βを検出する（工程Ｓ３６０）。具体的には、制御部３４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０’の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｂを記録する。このとき、検出チップ１０’の反応場上には、検出チップ１０の反応場上の液体と同じ液体が第２の深さｈ２で収容されている。

　最後に、制御部（処理部）３４０は、蛍光検出部３２０により得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ３７０）。以下、当該シグナル値の算出方法について説明する。

　実施の形態１で述べたとおり、反応場から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）とが含まれる。本実施の形態において、工程Ｓ３４０および工程Ｓ３６０では、ｐ偏光成分およびｓ偏光成分を含む蛍光βを検出するため、受光センサー１２３の検出値Ａ、Ｂは、Ｉ_ｐ１、Ｉ_ｐ２、Ｉ_ｓ１およびＩ_ｓ２に由来する。したがって、検出値Ａ、Ｂは、以下の式（１５）および式（１６）で表される。

　したがって、制御部（処理部）３４０は、上記の式（１５）および式（１６）で表される検出値Ａ、Ｂに基づいて、被検出物質の存在を示すシグナル値として、以下の式（１７）で表されるＩ_ｐ１を算出する。このとき、制御部（処理部）３４０は、Ｉ_ｓ１を０として計算を行う。

　（効果）
　実施の形態３に係る検出装置および検出方法は、実施の形態１に係る検出装置および検出方法と同様の効果を得ることができ、さらに偏光子を有していなくてもよいため、検出装置の構成および検出方法が単純になる。

　なお、上記実施の形態１～３では、制御部１４０、２４０、３４０は、搬送ステージ１３１を操作して、励起光αを照射する反応場を切替えたが、検出対象となる反応場を切替える方法は、これに限定されない。たとえば、制御部１４０、２４０、３４０は、検出チップ１０、１０’に対して励起光照射部１１０および蛍光検出部１２０、２２０、３２０を移動させて、励起光αが照射される反応場を切り替えてもよい。

　また、変形例に係る検出チップ１０”は、実施の形態２、３に係る検出装置および検出方法にも使用されうる。

　［実施の形態４］
　実施の形態４では、金属膜上に存在する蛍光物質から放出される蛍光に含まれる第１の光（例えばｐ偏光）と、第２の光（例えばｓ偏光）とをそれぞれ検出するＧＣ－ＳＰＦＳ装置について説明する。実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置は、収容部内に収容する液体の量を変えるための、液量調整部を有する。

　（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
　図１３は、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置４００の構成を示す模式図である。ＳＰＦＳ装置４００は、励起光照射部１１０、蛍光検出部１２０、搬送部１３０、制御部４４０および液量調整部４５０を有する。制御部４４０および液量調整部４５０のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、実施の形態１において説明したＳＰＦＳ装置１００と同一の構成要素については、同一の符号を付してその説明を省略する。

　また、図１３に示されるように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置４００では、１つの検出チップ１０のみが使用される。検出チップ１０の構成は、実施の形態１において使用した検出チップ１０と同一であるため、その説明を省略する。

　制御部４４０は、励起光照射部１１０（光源１１１および第１の角度調整部）、蛍光検出部１２０（受光センサー１２３および第２の角度調整部）、搬送部１３０（搬送ステージ１３１）および後述する液量調整部４５０（送液ポンプ駆動機構４５４）の動作を制御する。また、制御部４４０は、蛍光検出部１２０からの出力信号（検出結果）を処理する処理部としても機能する。具体的には、処理部は、蛍光検出部１２０（受光センサー１２３）が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値、および必要に応じてノイズ値を算出する。制御部４４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含み、ソフトウェアを実行するコンピュータである。

　液量調整部４５０は、チップホルダー１３２に保持された検出チップ１０の収容部１５内の液体の量を調整する。たとえば、液量調整部４５０は、収容部１５内の液体の量を増やしてもよいし、減らしてもよい。液量調整部４５０は、蛍光検出部１２０が反応場上の液体の深さが第１の深さｈ１の状態で蛍光βを検出する時と、蛍光検出部１２０が反応場上の液体の深さが第２の深さｈ２の状態で蛍光βを検出する時との間に、収容部１５内の液体の量を変化させる。液量調整部４５０は、例えば、シリンジポンプ４５１および送液ポンプ駆動機構４５４を含む。

　シリンジポンプ４５１は、シリンジ４５２と、シリンジ４５２内を往復動作可能なプランジャー４５３とによって構成される。プランジャー４５３の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。

　送液ポンプ駆動機構４５４は、プランジャー４５３の駆動装置、およびシリンジポンプ４５１の移動装置を含む。シリンジポンプ４５１の駆動装置は、プランジャー４５３を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ４５１の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の収容部１５内の液量を管理することができる。シリンジポンプ４５１の移動装置は、例えば、シリンジポンプ４５１を、シリンジ４５２の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との２方向に自在に動かす。シリンジポンプ４５１の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置４００の検出動作（本実施の形態に係る検出方法）について説明する。図１４は、ＳＰＦＳ装置４００の動作手順の一例を示すフローチャートである。

　まず、実施の形態１の工程Ｓ１１０、工程Ｓ１２０および工程Ｓ１３０と同様に、検出の準備をする工程（工程Ｓ４１０）、１次反応（工程Ｓ４２０）、および２次反応（工程Ｓ４３０）を行う。これにより、蛍光物質で標識されている被検出物質が反応場に固定されている状態の検出チップ１０を、ＳＰＦＳ装置４００のチップホルダー１３２に配置することができる。

　次いで、励起光αを検出チップ１０の反応場に照射しつつ、反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光（例えば、ｐ偏光の光）を検出する（工程Ｓ４４０）。具体的には、制御部４４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３に、ＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ａを記録する。このとき、検出チップ１０の反応場上には、液体（例えば緩衝液や蛍光標識液）が第１の深さｈ１で収容されている。また、図５Ａに示されるように、制御部４４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第１の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、励起光αを検出チップ１０の反応場に照射しつつ、反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光（例えば、ｓ偏光の光）を検出する（工程Ｓ４５０）。具体的には、制御部４４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｂを記録する。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部４４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第２の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、収容部内に液体を導入する（工程Ｓ４６０）。具体的には、制御部４４０は、液量調整部４５０を操作して、検出チップ１０の反応場に液体を導入する。このとき、収容部１５内の液体と同じ液体を供給する。これにより、収容部１５内において反応場上に存在する液体の深さを第１の深さｈ１から第２の深さｈ２にすることができる。

　次いで、励起光αを検出チップ１０の反応場に照射しつつ、反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第１の光を検出する（工程Ｓ４７０）。具体的には、制御部４４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｃを記録する。このとき、検出チップ１０の反応場上には、液体（例えば緩衝液）が第２の深さｈ２で収容されている。また、図５Ａに示されるように、制御部４４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第１の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　次いで、励起光αを検出チップ１０の反応場に照射しつつ、反応場上の蛍光物質から放出される蛍光βに含まれる第２の光を検出する（工程Ｓ４８０）。具体的には、制御部４４０は、励起光照射部１１０を操作して、検出チップ１０の回折格子１３にＳＰＲが発生するように励起光αを照射するとともに、受光センサー１２３の検出値Ｄを記録する。このとき、図５Ｂに示されるように、制御部４４０は、回転角度調整部１２２を操作して、蛍光βに含まれる第２の光のみが透過できるように、偏光子１２１の回転角度を調整する。

　最後に、制御部（処理部）４４０は、蛍光検出部１２０により得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ４９０）。以下、当該シグナル値の算出方法について説明する。

　実施の形態１で述べたとおり、反応場から放出された蛍光βには、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）と、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光（ｐ偏光成分およびｓ偏光成分）とが含まれる。本実施の形態において、工程Ｓ４４０および工程Ｓ４７０では、蛍光βに含まれるｐ偏光成分のみを検出するため、受光センサー１２３の検出値Ａ、Ｃは、Ｉ_ｐ１およびＩ_ｐ２に由来する。また、工程Ｓ４５０および工程Ｓ４８０では、蛍光βに含まれるｓ偏光成分のみを検出するため、受光センサー１２３の検出値Ｃ、Ｄは、Ｉ_ｓ１およびＩ_ｓ２に由来する。したがって、検出値Ａ～Ｄは、以下の式（１８）～（２１）で表される。

　したがって、制御部（処理部）４４０は、上記の式（１８）および式（２０）で表される検出値Ａ、Ｃに基づいて、被検出物質の存在を示すシグナル値として、以下の式（２２）で表されるＩ_ｐ１を算出する。制御部（処理部）４４０は、実施の形態１と同様に必要に応じて上記の式（６）～（８）で表されるノイズ値Ｉ_ｐ２、Ｉ_ｓ１、およびＩ_ｓ２の計算を行う。

　（効果）
　実施の形態４に係る検出装置および検出方法では、実施の形態１に係る検出装置および検出方法と同様の効果を得ることができ、さらに偏光子を有していなくてもよいため、検出装置の構成および検出方法が単純になる。

　なお、上記の実施の形態４では、工程Ｓ４６０において、収容部１５内に液体を導入する場合について説明したが、本発明に係る検出装置および検出方法では、収容部から液体を減らしてもよい。この場合も収容部内において反応場上の液体の深さを第１の深さから第２の深さにすることができる。

　また、上記各実施の形態では、金属膜１２側から励起光αを検出チップ１０、１０’に照射する例について説明したが、基板１１側から励起光αを検出チップ１０、１０’に照射してもよい。

　また、上記の実施の形態２～４では、ＧＣ－ＳＰＦＳを利用した検出装置および検出方法について説明したが、実施の形態２～４に係る検出装置および検出方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳを利用してもよい。この場合、検出チップ１０、１０’は、誘電体からなるプリズムを有し、金属膜１２は、プリズムの上に配置される。また、金属膜１２は、回折格子１３を有しない。励起光αは、プリズムを介して反応場に対応した金属膜１２の裏面に照射される。

　さらに、上記各実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００、２００、３００、４００では、検出値からノイズ成分を除去することができるため、収容部１５内に存在する未反応の蛍光物質を洗浄により除去する必要がない。このため、上記各実施の形態に係る検出装置は、被検出物質のリアルタイム測定にも使用されうる。この場合、検出装置は、反応場上の液体の深さが第１の深さの状態で金属膜（回折格子）に励起光を継続して照射し、蛍光物質から放出された蛍光に含まれる直線偏光の光を継続して検出する。これと並行して、検出装置は、反応場上の液体の深さが第２の深さの状態で金属膜（回折格子）に励起光を継続して照射し、蛍光物質から放出された蛍光に含まれる直線偏光の光を継続して検出する。ここで「継続」とは、連続して動作を行うことだけでなく、断続的に動作を行うことも含む。これにより、本実施の形態に係る検出装置および検出方法は、被検出物質を正確で経時的に、かつ簡易に検出することができる。

　以下、本発明について実施例を参照して説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。本実施例では、上記の実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置を使用して、被検出物質の存在および量を示すシグナル値およびノイズ値を算出した。

　１．検出チップの準備
　金属膜の回折格子上に、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を介して抗α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体が固定されている２つの検出チップを準備した。準備した２つの検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーにそれぞれ設置した。本実施例では、一方の検出チップの収容部には、深さが５０μｍとなるように液体が収容され、他方の検出チップの収容部には、深さが１００μｍとなるように液体が収容される。

　２．１次反応
　各検出チップの収容部にＡＦＰを含む検体を提供し、２５分間静置して、１次反応を行った。

　３．光学ブランク値の測定
　１次反応の後、収容部内の検体を除去し、収容部内をリン酸緩衝液で洗浄した。その後、回転角度調整部を操作して、ｐ偏光の光のみが透過できるように偏光板の回転角度を調整し、一方の検出チップの収容部内に深さ５０μｍで緩衝液が存在する状態で、波長６３７ｎｍの励起光を回折格子に照射した。これと同時に収容部内から放出された光に含まれるｐ偏光の光を検出し、ｐ偏光に対する光学ブランク値ｏＢ_ｐを得た。ｏＢ_ｐは、１５０ｃоｕｎｔであった。

　その後、回転角度調整部を操作して、ｓ偏光の光のみが透過できるように偏光板の回転角度を調整し、同じ検出チップの収容部内に深さ５０μｍで同じ緩衝液が存在する状態で、波長６３７ｎｍの励起光を回折格子に照射した。これと同時に収容部内から放出された蛍光に含まれるｓ偏光の光を検出し、ｓ偏光に対する光ブランク値ｏＢ_ｓを得た。ｏＢ_ｓは、１００ｃоｕｎｔであった。

　なお、他方の検出チップについても、収容部内に深さ１００ｎｍで液体が存在する状態で、上記の方法と同様に光学ブランク値の測定を行った。ｐ偏光およびｓ偏光の光学ブランク値は、上記の値とほぼ同じであった。

　４．２次反応
　各検出チップの収容部内に、蛍光色素としてAlexa-Fluor（登録商標）で標識された抗ＡＦＰ抗体を含む溶液（以下、蛍光標識液ともいう）を提供し、５分間静置して、２次反応を行った。

　５．蛍光の検出
　２次反応の後、光学ブランク値の測定と同様に、一方の検出チップの収容部内に深さ５０μｍで蛍光標識液が存在する状態で、励起光を回折格子に照射して、放出される蛍光に含まれるｐ偏光の光およびｓ偏光の光を検出した。また、他方の検出チップの収容部内に深さ１００μｍで蛍光標識液が存在する状態で、励起光を回折格子に照射して、放出される蛍光に含まれるｐ偏光の光およびｓ偏光の光を検出した。

　６．検出値の処理
　液体の深さが５０μｍの状態においてｐ偏光の光を検出したときの検出値Ａは、２０８０ｃоｕｎｔであり、ｓ偏光の光を検出したときの検出値Ｂは、１２６０ｃоｕｎｔであった。また、液体の深さが１００μｍの状態においてｐ偏光の光を検出したときの検出値Ｃは、３０００ｃоｕｎｔであり、ｓ偏光の光を検出したときの検出値Ｄは、２５７０ｃоｕｎｔであった。一方の検出チップの収容部に収容された液体の深さに対する、他方の検出チップの収容部に収容された液体の深さの比ｍは、２である。制御部（処理部）を用いて、上記の検出値Ａ、Ｃから以下の式（２３）で表されるように、被検出物質の量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出した。

　また、制御部（処理部）を用いて、上記の検出値から以下の式（２４）～（２６）で表されるように、ｐ偏光の光に含まれ、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、ｓ偏光の光に含まれ、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ１と、ｓ偏光の光に含まれ、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けて生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とを算出した。

　以上の結果から、未反応の蛍光物質を洗浄により除去しなくても、バックグラウンドノイズを除去し、被検出物質を検出できることがわかった。また、被検出物質の量を示すシグナル値のうち、ｓ偏光の光によるシグナル成分は、ほぼ０であり、十分小さいことを確認することができた。さらに、ＳＰＲに起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値も算出することができた。

　本出願は、２０１４年１２月９日出願の特願２０１４－２４９０３８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

　本発明に係る検出装置および検出方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。

　また、本発明に係る検出装置および検出方法は、蛍光標識液などを提供した後に金属膜表面を洗浄しなくても、被検出物質を高い信頼性で検出することもできる。よって、検出時間の短縮化が図られるだけでなく、小型化可能な定量免疫測定装置ならびに非常に簡易な定量免疫測定システムの開発、普及および発展に寄与することも期待される。

　１０、１０’、１０”　検出チップ
　１１、１１”　基板
　１２　金属膜
　１３　回折格子
　１４　枠体
　１５、１５”　収容部
　１６　捕捉体
　１７”　第１の反応場
　１８”　第２の反応場
　１００、１００’、２００、３００、４００　表面プラズモン増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
　１１０　励起光照射部
　１１１　光源
　１２０、１２０’、２２０、３２０　蛍光検出部
　１２１、１２１’、２２１　偏光子
　１２２　回転角度調整部
　１２３、１２３’、　受光センサー
　１２４’　ハーフミラー
　１３０　搬送部
　１３１　搬送ステージ
　１３２　チップホルダー
　１４０、２４０、３４０、４４０　制御部（処理部）
　４５０　液量調整部
　４５１　シリンジポンプ
　４５２　シリンジ
　４５３　プランジャー
　４５４　送液ポンプ駆動機構
　ｈ１、ｈ１”　第１の深さ
　ｈ２、ｈ２”　第２の深さ
　α　励起光
　β　蛍光
　γ　反射光

Claims

　表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するための検出装置であって、
　液体を収容するための収容部と、前記収容部の底部に配置され、かつ蛍光物質で標識されている被検出物質が直接的または間接的に固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを保持するためのホルダーと、
　前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に、表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射する励起光照射部と、
　液体が前記収容部内に存在する状態で、前記励起光照射部が前記金属膜に励起光を照射したときに、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を少なくとも２回検出する蛍光検出部と、
　前記蛍光検出部が検出した２以上の検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する処理部と、
　を有し、
　前記蛍光検出部は、前記反応場上の前記液体の深さが第１の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出し、かつ前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さの状態で少なくとも１回蛍光を検出する、
　検出装置。
　前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記収容部内の前記液体の量を変化させる液量変化部をさらに有し、
　前記液量変化部は、前記蛍光検出部が前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で蛍光を検出する時と、前記蛍光検出部が前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で蛍光を検出する時との間に、前記収容部内の前記液体の量を変化させる、
　請求項１に記載の検出装置。
　前記ホルダーは、２つの前記検出チップを保持し、
　一方の前記検出チップは、前記収容部に前記液体を収容したときに、その上の前記液体の深さが前記第１の深さとなる第１の反応場を有し、
　他方の前記検出チップは、前記収容部に前記液体を収容したときに、その上の前記液体の深さが前記第２の深さとなる第２の反応場を有する、
　請求項１に記載の検出装置。
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記励起光照射部は、前記回折格子に励起光を照射し、
　前記処理部は、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が検出した検出値Ａと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が検出した検出値Ｂとに基づいて、以下の式（１）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記蛍光物質から放出される蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光照射部が照射する励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とを同時または異時に取り出す偏光子をさらに有し、
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記励起光照射部は、前記回折格子に励起光を照射し、
　前記蛍光検出部は、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
　前記処理部は、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第１の光として検出した検出値Ａと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第１の光として検出した検出値Ｃと、に基づいて、以下の式（２）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記処理部は、前記検出値Ａと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第２の光として検出した検出値Ｂと、前記検出値Ｃと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第２の光として検出した検出値Ｄと、に基づいて、以下の式（３）～（５）により、前記第１の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、前記第２の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けて生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ１と、前記第２の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とをさらに算出する、請求項５に記載の検出装置。
　前記蛍光物質から放出される蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光照射部が照射する励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とを同時または異時に取り出す偏光子をさらに有し、
　前記検出チップは、誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの上に配置された前記金属膜とを有し、
　前記励起光照射部は、前記プリズムを介して前記反応場に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射し、
　前記蛍光検出部は、前記第１の光および前記第２の光をそれぞれ検出し、
　前記処理部は、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第１の光として検出した検出値Ａと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第２の光として検出した検出値Ｂと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第１の光として検出した検出値Ｃと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が前記第２の光として検出した検出値Ｄと、に基づいて、以下の式（６）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１＋Ｉ_ｓ１を算出する、
　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記処理部は、以下の式（７）および式（８）により、前記第１の光に含まれる前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、前記第２の光に含まれる前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とをさらに算出する、請求項７に記載の検出装置。
　前記蛍光物質から放出される蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と前記励起光照射部が照射する励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の光を取り出す偏光子をさらに有し、
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記励起光照射部は、前記回折格子に励起光を照射し、
　前記蛍光検出部は、前記直線偏光の光を検出し、
　前記処理部は、前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さの状態で前記蛍光検出部が検出した検出値Ａと、前記反応場上の前記液体の深さが前記第２の深さの状態で前記蛍光検出部が検出した検出値Ｂとに基づいて、以下の式（９）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
　前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
　請求項５～８のいずれか一項に記載の検出装置。
　前記直線偏光の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光である、請求項９に記載の検出装置。
　表面プラズモン共鳴を利用して被検出物質を検出するための検出方法であって、
　液体を収容するための収容部と、前記収容部の底部に配置され、蛍光物質で標識されている被検出物質が直接的または間接的に固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを準備する第１工程と、
　前記反応場上の液体の深さが第１の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第２工程と、
　前記反応場上の前記液体の深さが前記第１の深さと異なる第２の深さとなるように前記液体が前記収容部内に存在する状態で、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光を照射し、前記金属膜上に存在する前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する第３工程と、
　前記第２工程および前記第３工程で得られた検出値に基づいて、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する第４工程と、
　を有する、検出方法。
　前記第２工程および前記第３工程の間に、前記収容部内の液体の量を変える工程をさらに有する、請求項１２に記載の検出方法。
　前記第１工程では、２つの前記検出チップを準備し、
　一方の前記検出チップは、前記収容部に前記液体を収容したときに、その上の前記液体の深さが前記第１の深さとなる第１の反応場を有し、
　他方の前記検出チップは、前記収容部に前記液体を収容したときに、その上の前記液体の深さが前記第２の深さとなる第２の反応場を有する、
　請求項１２に記載の検出方法。
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記第２工程および前記第３工程では、前記回折格子に励起光を照射し、
　前記第４工程では、前記第２工程で得られた検出値Ａと、前記第３工程で得られた検出値Ｂとに基づいて、以下の式（１）で表される被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１２～１４のいずれか一項に記載の検出方法。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記第２工程および前記第３工程では、それぞれ、前記蛍光物質から放出される蛍光のうち、前記金属膜の表面に対する法線と励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とをそれぞれ検出し、
　前記第４工程では、前記第２工程で前記第１の光として検出した検出値Ａと、前記第３工程で前記第１の光として検出した検出値Ｃと、に基づいて、以下の式（２）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１２～１４のいずれか一項に記載の検出方法。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記第４工程では、前記検出値Ａと、前記第２工程で前記第２の光として検出した検出値Ｂと、前記検出値Ｃと、前記第４工程で前記第２の光として検出した検出値Ｄと、に基づいて、以下の式（３）～（５）により、前記第１の光に含まれ、前記プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、前記第２の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けて生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ１と、前記第２の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とをさらに算出する、請求項１６に記載の検出方法。
　前記検出チップは、誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの上に配置された前記金属膜とを有し、
　前記第２工程および前記第３工程では、それぞれ、前記プリズムを介して前記反応場に対応した前記金属膜の裏面に励起光を照射し、前記蛍光物質から放出される蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の第１の光と、前記平面に対する電界の振動方向の角度が９０±３０°の範囲内の第２の光とをそれぞれ検出し、
　前記第４工程では、前記第２工程で前記第１の光として検出した検出値Ａと、前記第２工程で前記第２の光として検出した検出値Ｂと、前記第３工程で前記第１の光として検出した検出値Ｃと、前記第３工程で前記第２の光として検出した検出値Ｄと、に基づいて、以下の式（６）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１＋Ｉ_ｓ１を算出する、
　請求項１２～１４のいずれか一項に記載の検出方法。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記第４工程では、以下の式（７）および式（８）により、前記第１の光に含まれ、前記プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｐ２と、前記第２の光に含まれ、前記表面プラズモン共鳴に起因する増強電場の影響を受けずに生成された光に由来するノイズ値Ｉ_ｓ２とをさらに算出する、請求項１８に記載の検出方法。
　前記検出チップの前記金属膜は、前記反応場に対応する位置に回折格子を有しており、
　前記第２工程および前記第３工程では、それぞれ、前記蛍光物質から放出される蛍光から、前記金属膜の表面に対する法線と励起光の光軸とを含む平面に対する電界の振動方向の角度が０±３０°の範囲内の直線偏光の光を検出し、
　前記第４工程では、前記第２工程で検出した検出値Ａと、前記第３工程で検出した検出値Ｂと、に基づいて、以下の式（９）により被検出物質の存在または量を示すシグナル値Ｉ_ｐ１を算出する、
　請求項１２～１４のいずれか一項に記載の検出方法。

　［上記式において、ｍは前記第１の深さに対する前記第２の深さの比であり、１以外の正の実数である。］
　前記第１の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光であり、
　前記第２の光は、前記金属膜の表面に対するｓ偏光の光である、
　請求項１７～１９のいずれか一項に記載の検出方法。
　前記直線偏光の光は、前記金属膜の表面に対するｐ偏光の光である、請求項２０に記載の検出方法。