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WO2015119072A1 - フローセルおよび送液システム - Google Patents

フローセルおよび送液システム Download PDF

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WO2015119072A1
WO2015119072A1 PCT/JP2015/052825 JP2015052825W WO2015119072A1 WO 2015119072 A1 WO2015119072 A1 WO 2015119072A1 JP 2015052825 W JP2015052825 W JP 2015052825W WO 2015119072 A1 WO2015119072 A1 WO 2015119072A1
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WO
WIPO (PCT)
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liquid
flow path
negative pressure
flow
meniscus
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2015/052825
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
勝義 林
弦 岩崎
鈴代 井上
松浦　伸昭
勉 堀内
為近　恵美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nippon Telegraph and Telephone Corp
Original Assignee
Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Nippon Telegraph and Telephone Corp filed Critical Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority to US15/115,881 priority Critical patent/US9945773B2/en
Priority to JP2015560969A priority patent/JP6133446B2/ja
Publication of WO2015119072A1 publication Critical patent/WO2015119072A1/ja
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/05—Flow-through cuvettes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
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    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
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    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1095—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
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    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Definitions

  • the present invention relates to a flow cell and a liquid delivery system.
  • Such techniques may employ simple measurement methods such as fluorescence measurement, absorption measurement, electrochemical measurement, QCM (Quartz Crystal Microbalance) measurement, ATR (Attenuated Total Reflection) measurement, SPR (surface plasma resonance) measurement, etc.
  • SPR measurement does not require labeling of the sample liquid for detection, can directly detect antigen-antibody reaction, binding of DNA, etc., and can simplify the measurement procedure (for example, See Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1.).
  • the SPR measurement can be made linear or planar in the measurement region, the flow velocity between the two points can also be measured by measuring the time difference of the refractive index change at the two points (for example, see Patent Document 4) ).
  • a sample cell capable of holding a sample solution is used.
  • a trace amount of sample solution is supplied to the sample cell, and the sample cell is flowed and transferred to a detection unit for performing measurement.
  • measurement can be performed with higher sensitivity and higher efficiency without reducing the concentration of the sample such as DNA or antibody dissolved or dispersed in the sample solution.
  • the sample cell thus flowing the sample solution to the detection unit is called a flow cell.
  • Various methods have been proposed as methods for transferring a small amount of sample solution by a flow cell. For example, there is a method of transferring the sample solution to the flow path formed in the flow cell by applying an external pressure by a syringe pump or the like. In addition, there are a method of transporting by electrostatic force, an electrowetting method, a method of transporting a sample solution by volume change due to heating and generation of air bubbles, a method of utilizing an electroosmotic flow, and the like.
  • a method has also been proposed in which a sample solution is transferred by forming in the flow cell a channel or a region capable of exhibiting capillary action with respect to the sample solution (for example, see Patent Document 2).
  • a supply unit provided with an inlet through which the sample solution is introduced
  • a transfer unit provided with a capillary pump for sucking the introduced sample solution
  • a measurement provided between the inlet and the capillary pump
  • a flow cell in which flow paths for forming a flow path are formed along a straight line along the planar direction of a plate-like flow cell.
  • Such a liquid feeding method using capillary force is called a passive pump because it does not require an external driving force.
  • a flow cell having this passive pump is advantageous for on-site measurement such as point-of-care, since it does not require a peripheral device for liquid delivery.
  • the flow cell described in Patent Document 1 since the sample liquid does not flow out of the flow cell, the influence of the biohazard on the operator is also small, and the waste associated with the measurement can be reduced.
  • one flow cell is disposable for one measurement, measurement errors such as cross contamination can be suppressed.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the flow cell as described above is a disposable type aiming at easy measurement on site.
  • the flow cell is not disposable, and after the sample liquid flows in the flow channel, the flow channel is washed by continuously flowing water and the washing liquid, and the flow of the next sample liquid is repeatedly measured to lower the measurement cost. be able to.
  • a supply unit provided with an introduction port into which the sample solution is introduced, a discharge unit provided with a discharge port for drawing out the sample solution, and a supply unit and a discharge unit are provided.
  • a flow cell provided with a flow path for measurement.
  • this flow cell it is general to control the liquid delivery by a pump (see, for example, Patent Documents 5 and 6). Specifically, negative pressure is applied to a pump connected to the outlet port, and the sample liquid and the cleaning liquid supplied to the supply unit are suctioned into the flow path, whereby the liquid is transferred.
  • Such repeated measurement is, for example, effective for blood coagulation measurement.
  • lifestyle-related diseases associated with westernization of eating habits, accumulation of exercise and stress, progress of aging, etc. have become major social problems.
  • thrombosis is one of the diseases caused by lifestyle-related diseases, thrombosis is strongly correlated with myocardial infarction. Therefore, performing blood coagulation measurement in regular blood tests will become increasingly important in the future.
  • Patent No. 04987088 Patent No. 05042371 gazette International Publication No. 2009/145172 Patent No. 04897054 Patent No. 4853927 JP 10-160658 A
  • control of the liquid transfer by the pump as described above has been difficult. This is because the flow cell is very small and the amount of liquid to be fed is also very small, so it is necessary to delicately operate the pump in order to make the liquid stagnate in the flow path and the outlet. In addition, since control of liquid transfer by the pump is also affected by residual pressure in the piping and the like, a time delay occurs and a water hammer is caused, so the operation is further complicated. .
  • an object of this invention is to provide the flow cell and the liquid feeding system which can perform control of liquid feeding of trace amount liquid more easily.
  • the flow cell according to the present invention is formed in the main body, the recess formed in the main body, and the main body, one end is opened in the inner wall surface of the recess, and the other end is the main body
  • the flow path generates negative pressure to the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path
  • the recess is a meniscus of the liquid introduced into the recess
  • positive pressure or negative pressure that is smaller in absolute value than negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path is generated.
  • the liquid delivery system according to the present invention is formed in the pump generating negative pressure, the main body, the recess formed in the main body, and the main body, one end being open to the inner wall surface of the recess and the other end being the main body And a pipe connecting the pump and the other end of the flow path of the flow cell, and the flow path is negative by the meniscus of the liquid introduced into the flow path.
  • the recess generates a positive pressure on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the recess, or a negative pressure smaller in absolute value than a negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow passage
  • the pump has an absolute value smaller than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow passage, and the pump has an absolute value larger than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the recess.
  • Large constant negative pressure It is characterized in that Jill.
  • the absolute value is smaller than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path, and by the meniscus of the liquid introduced into the recess If a liquid is supplied to the recess after applying a constant negative pressure whose absolute value is larger than the working negative pressure, the negative pressure generated by the pump is larger than the negative pressure generated by the meniscus of the liquid introduced into the recess.
  • the negative pressure generated by the meniscus of the liquid introduced into the flow channel is larger than the negative pressure by the pump. The movement of the liquid introduced into the channel stops. As a result, since it is not necessary to operate the pump delicately, it is possible to control the delivery of a small amount of liquid more easily.
  • FIG. 1 is a plan view schematically showing the configuration of the SPR measurement system.
  • FIG. 2 is a front view schematically showing the configuration of part of the SPR measurement system.
  • FIG. 3 is a perspective view schematically showing a configuration of a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of an essential part schematically showing a configuration of a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view for explaining a method of manufacturing a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5B is a cross-sectional view for explaining the method of manufacturing a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5C is a cross sectional view for illustrating the method for manufacturing the flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5D is a cross sectional view for illustrating the method for manufacturing the flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5E is a cross-sectional view for explaining a method of manufacturing a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5F is a cross-sectional view for explaining the method of manufacturing a flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5G is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the flow cell according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 6A is a diagram for explaining measurement operation by the SPR measurement system.
  • FIG. 6B is a diagram for explaining the measurement operation by the SPR measurement system.
  • FIG. 6C is a diagram for explaining the measurement operation by the SPR measurement system.
  • FIG. 6D is a diagram for explaining measurement operation by the SPR measurement system.
  • FIG. 7 is a diagram showing the measurement results of the flow rate when pure water and a phosphate buffer solution are alternately supplied.
  • FIG. 8 is a diagram showing measurement results of blood coagulation measurement.
  • FIG. 9 is a diagram showing measurement results of blood coagulation measurement.
  • the SPR measurement system includes a pipetting device 1 for selectively supplying a sample and a reagent, and a flow cell to which the sample and the reagent are supplied from the pipetting device 1 2, an SPR measurement device 3 for performing SPR measurement using the flow cell 2, a pump 4 for generating a constant negative pressure, and a pressure between the flow cell 2 and the pump 4 to adjust the pressure applied to the flow cell 2 And a pressure control container 5.
  • the flow cell 2 is formed inside the main body 21 with a plate-like main body 21 having a substantially rectangular shape in plan view, a recess 22 formed on the upper surface of the main body 21, and The lower end of the portion 22 is provided with a flow passage 23 whose one end is connected, and a recess formed in the main body 21 and a lead-out portion 24 whose lower end is connected with the other end of the flow passage 23.
  • the cross-sectional area in the direction orthogonal to the flow direction of the liquid introduced into the introduction portion 22 (hereinafter referred to as “the cross-sectional area of the introduction portion 22”) is the flow direction of the liquid introduced into the flow path 23 And a cross-sectional area in a direction orthogonal to the cross-sectional area (hereinafter referred to as “the cross-sectional area of the flow path 23").
  • the main body 21 is formed of, for example, a resin material.
  • the introduction portion 22 is a flow passage formed in a cylindrical shape (circular pipe) whose one end is open to the upper surface of the main body 21 and the other end is closed.
  • the inner wall surface of the introducing portion 22 is formed of a material having hydrophobicity or a material having hydrophilicity with respect to the liquid to be introduced into the flow cell 2.
  • the pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced from the opening of the introduction part 22 is a positive pressure when the inner wall surface of the introduction part 22 is hydrophobic, or when the inner wall surface is hydrophilic. It becomes negative pressure.
  • the liquid introduced into the flow path 23 causes the liquid introduced into the introduction part 22 to be more negative pressure acting on the liquid.
  • the negative pressure acting on the liquid is formed to be a negative pressure with a smaller absolute value.
  • the positive pressure acting on the liquid by the meniscus means the force to apply pressure in the discharge direction at the introduction side of the liquid introduced into the introduction portion 22 and the flow path 23, in other words, the liquid against the gas-liquid interface of the liquid It is the force that puts pressure on the liquid in the direction towards the side.
  • the negative pressure acting on the liquid by the meniscus means the force to apply pressure in the suction direction at the introduction side of the liquid introduced into the introduction portion 22 and the flow path 23, in other words, the gas side with respect to the gas-liquid interface of the liquid Is the force that puts pressure on the liquid in the direction of.
  • the pressure Pr due to the meniscus formed in the cylindrical introduction portion 22 can be expressed by the following equation (1).
  • r represents the radius of the introducing portion 22
  • ⁇ represents the contact angle with the inner wall surface of the introducing portion 22
  • ⁇ represents the surface tension coefficient of the liquid introduced into the introducing portion 22.
  • a negative pressure of 24.25 [Pa] is applied to the water introduced into the introduction part 22 by the meniscus formed in the introduction part 22, and to move the water in the direction of the flow path 23, This means that the side of the passage 23, that is, the pump 4 needs to be sucked at a negative pressure of 24.25 [Pa] or more.
  • the flow path 23 is a tube having a rectangular cross section that extends in a direction parallel to the upper surface of the main body 21.
  • One end of the flow path 23 is open to the inner wall surface of the bottom of the introduction portion 22, and the other end is open to the inner wall surface of the bottom of the lead-out portion 24.
  • the inner wall surface of the flow passage 23 is formed such that the meniscus of the liquid introduced into the flow passage 23 generates a negative pressure.
  • the inner wall surface of the flow path 23 is formed of a material having hydrophilicity to the liquid supplied to the flow cell 2. Therefore, when a liquid is introduced into the hydrophilic flow path 23 to form a meniscus, the liquid exerts a negative pressure on the liquid.
  • the pressure Pc by the meniscus formed in the flow path 23 having a substantially rectangular cross section can be expressed by the following equation (2).
  • d is the thickness of the flow passage 23
  • w is the width of the flow passage 23
  • ⁇ t is the contact angle on the upper surface of the flow passage 23
  • ⁇ b is the contact angle on the lower surface of the flow passage 23
  • ⁇ 1 is the flow passage 23
  • the contact angle on the left surface, ⁇ r represents the contact angle on the right surface of the flow path 23.
  • the lead-out portion 24 is a flow passage formed in a cylindrical shape (circular pipe) whose one end is open to the upper surface of the main body 21 and the other end is closed. The other end of the pipe 51 whose one end is connected to the pressure adjustment container 5 is connected to the lead-out portion 24.
  • the flow cell 2 when the flow cell 2 is used for SPR measurement, at least a part of the lower surface of the flow path 23 is provided with a detection unit (not shown) made of Au or the like. The manufacturing method of such a flow cell 2 is mentioned later.
  • the SPR measurement device 3 is a device that performs measurement by the SPR method. In the present embodiment, the liquid flowing in the flow path 23 of the flow cell 2 disposed on the SPR measurement device 3 is measured.
  • the pump 4 is a pump that generates a constant negative pressure, and is connected to the outlet 24 of the flow cell 2 via the pipe 41, the pressure control container 5 and the pipe 51.
  • the constant negative pressure is smaller in absolute value than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path 23 in which the inner wall surface is formed to be hydrophilic, and the inner wall surface is formed to be hydrophilic.
  • the absolute value is a constant value larger than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the introduction portion 22.
  • the negative pressure value of the pump 4 is the value of the liquid
  • the absolute value is set to be smaller than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path 23.
  • the negative pressure generated by the pump 4 is the same “negative pressure” with the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus formed thereon by the liquid introduced into the introduction part 22 or the flow path 23, but the pressure The directions are different. That is, the negative pressure generated by the pump 4 is a pressure in the direction in which the liquid supplied to the introduction portion 22 is sucked toward the flow path 23. On the other hand, the negative pressure due to the meniscus formed in the introducing portion 22 or the flow path 23 is a pressure in the direction of sucking the liquid toward the introducing portion 22 in the case of the liquid in the flow path 23.
  • the pressure adjusting container 5 is a cylindrical hollow container, and the other end of the pipe 41 and the one end of the pipe 51 whose other end is connected to the outlet portion 24 of the flow cell 2 are connected to the upper end. Such a pressure adjusting container 5 cancels the pressure difference generated by the liquid in the pipe 51 and operates the pump 4 normally.
  • a silicon wafer 100 is prepared, and a resist 101 is formed on the silicon wafer 100.
  • the silicon wafer 100 is subjected to sulfuric acid / hydrogen peroxide cleaning, so-called piranha cleaning for 30 minutes and then dried at 200 ° C. for 20 minutes.
  • a thick film resist SU8 may be used as the resist 101, and this may be applied on the silicon wafer 100 by a spin coating method.
  • a mold 102 corresponding to the shape of the flow path 23 is formed on the silicon wafer 100 by photolithography.
  • the silicon wafer 100 coated with the resist 101 is sequentially baked at 65 ° C. for 30 minutes and 95 ° C. for 270 minutes, exposed to aligner, and post-baked at 95 ° C. for 90 minutes. Do.
  • rinsing may be performed with isopropyl alcohol and acetone, and an outer frame may be attached to the peripheral portion to complete the mold.
  • the size of the mold corresponding to the flow path 23 is 0.075 [mm] in thickness, 1 [mm] in width, and 9 [mm] in length.
  • hydrophilic PDMS 103 is applied onto the silicon wafer 100 on which the mold 102 has been made.
  • hydrophilic PDMS 103 can be obtained by adding 1% by weight of polyether-modified silicon (trisiloxane ethoxylate) (SILWET L-77) to hydrophobic PDMS before solidification, and subjecting it to vacuum degassing.
  • the hydrophobic PDMS before solidification is a mixture of PDMS base (SYLGARD 184) and a polymerization initiator at a ratio of 10: 1 and degassed under reduced pressure.
  • the hydrophilic PDMS 103 may be applied using a microdispenser, a method using a brush or the like, or a printing technique such as intaglio, letterpress, lithography, or stencil.
  • a hydrophobic PDMS 104 is formed on the hydrophilic PDMS 103, as shown in FIG. 5D.
  • the hydrophobic PDMS 104 may be uniformly formed on the hydrophilic PDMS 103 with a thickness of about 3 mm, and then heated for 120 minutes to be solidified.
  • the hydrophilic PDMS 103 in which the groove 105 corresponding to the silicon wafer 100 and the mold 102 and the flow path 23 is formed and the hydrophobic PDMS 104 provided on the hydrophilic PDMS 103. And separate. Subsequently, as shown in FIG. 5F, through holes 106 are formed at both ends of the groove 105, which communicate the groove 105 with the upper surface of the hydrophobic PDMS 104.
  • the through hole 106 corresponds to the introduction portion 22 or the extraction portion 24.
  • the through hole 106 corresponding to the introduction portion 22 is formed to have a diameter of 3 mm
  • the through hole 106 corresponding to the lead portion 24 is formed to have a diameter of 1.5 mm.
  • the SPR substrate 107 is prepared, and the lower surface of the hydrophilic PDMS 103 is adhered to the upper surface thereof. Thereby, the flow cell 2 is completed.
  • the SPR substrate 107 is a substrate mounted on the SPR measurement device 3 and is formed by sputtering and depositing a titanium thin film 109 and a gold thin film 110 sequentially on the BK7 glass substrate 108.
  • adhesion is performed by reactive ion etching (power 70 [W], oxygen partial pressure 10 [Pa], flow rate 100 [sccm], 5 seconds) in an oxygen atmosphere and the upper surface of the hydrophilic PDMS 103 and the upper surface of the SPR substrate 107 Activate and stick these faces together.
  • reactive ion etching power 70 [W], oxygen partial pressure 10 [Pa], flow rate 100 [sccm], 5 seconds
  • the inner wall surface of the flow path 23 is hydrophilic because it is formed of the hydrophilic PDMS 103. Therefore, when a meniscus is formed, a negative pressure is applied to the liquid flowing into the flow path 23 by the meniscus.
  • the inner wall surfaces of the introduction part 22 and the extraction part 24 are hydrophobic because they are made of the hydrophobic PDMS 104. Therefore, when a meniscus is formed, positive pressure is applied to the liquid flowing into the inlet 22 and the outlet 24 by the meniscus.
  • priming water is injected from the opening of the introducing unit 22 in advance, so that the flow path 23 and the introducing unit 24 are filled with water.
  • the pressure of the pump 4 is set to a constant negative pressure, and deionized water ⁇ is introduced into the opening of the introduction portion 22 of the flow cell 2 by the dispenser 1, as shown in FIG. 6A.
  • the pressure of the pump 4 is set to -100 [Pa]. Further, 0.01 [ml] of pure water ⁇ was introduced into the opening of the introduction portion 22 of the flow cell 2 by the pipetting device 1. In the present embodiment, since the volume of the introducing part 22 is about 0.02 [ml], the pure water ⁇ does not overflow from the opening of the introducing part 22 as shown in FIG. 6B. At this time, the inner wall surface of the introducing portion 22 is formed of the hydrophobic PDMS 104. Therefore, the meniscus m1 formed of the liquid injected into the introduction portion 22 is convex, and applies a positive pressure, that is, a force for moving the liquid toward the flow path 23.
  • the phosphate buffer solution ⁇ is introduced into the opening of the introduction portion 22 of the flow cell 2 by the dispenser 1.
  • 0.01 [ml] of phosphate buffer solution ⁇ is introduced.
  • the meniscus m2 in which the pure water ⁇ is formed at the end of the flow path 23 on the introducing portion 22 side disappears with the introduction of the phosphate buffer solution ⁇ , so the negative pressure generated by the meniscus m2 disappears.
  • a meniscus m3 is formed in the introducing portion 22 by the phosphate buffer solution ⁇ .
  • the phosphate buffer solution ⁇ injected into the introducing unit 22 is moved from the introducing unit 22 to the flow passage 23 by the force (positive pressure) by the meniscus m 3 and the pressure (negative pressure) from the pump 4. Go on.
  • the inner wall surface of the introducing portion 22 is hydrophobic, the flow rate of the phosphate buffer solution ⁇ is faster than that of the hydrophilic case, and the dirt of the phosphate buffer solution ⁇ adheres to the inner wall surface. It becomes difficult.
  • the boundary of the liquids can be observed by the SPR measurement device 3. Since the SPR measurement device 3 used in the present embodiment has an observation area of 3.5 mm in the flow direction of the flow path 23, the time at which the boundary of the liquid crosses the observation area is measured. , The flow rate of the liquid can be determined.
  • the phosphate buffer solution ⁇ also stops at the end portion of the flow path 23 on the introduction portion 22 side when it flows through the introduction portion 22.
  • the liquid automatically moves toward the flow path 23, and when the liquid flows through the introduction portion 22, the movement automatically stops.
  • the pump is not finely controlled as in the prior art, it is possible to control the delivery of a very small amount of liquid simply by supplying the liquid to the introduction part 22.
  • it can be in the state which the liquid accumulated in the flow path 23 and the lead-out part 24. FIG. As a result, it is possible to save the trouble of supplying priming water again.
  • the pure water ⁇ and the phosphate buffer solution ⁇ can be repeatedly measured by injecting the pure water ⁇ and the phosphate buffer solution ⁇ alternately and sequentially to the introduction portion 22 in this order.
  • Prothrombin is a coagulation factor responsible for the hemostatic action of blood.
  • the prothrombin time is used to evaluate the coagulation ability by this prothrombin.
  • the measurement of prothrombin time is used as an index for determining the anticoagulant dose in liver function tests (cirrhosis, liver cancer) and operations such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • liver function tests cirrhosis, liver cancer
  • operations such as myocardial infarction and cerebral infarction.
  • the time until the plasma is coagulated by the reagent is measured, but when the coagulation measurement is performed in the flow cell, the flow path is clogged and repeated measurement can not be performed.
  • measurement can be repeatedly performed by performing measurement according to the following procedure.
  • the SPR measurement device 3 it is possible to measure the passage time (flow rate) of the interface between the coagulation activator and the plasma. If the same operation is performed from the introduction of the above-described channel detergent, measurement can be repeated.
  • FIG. 8 The measurement results when blood coagulation measurement is repeated (10 times) according to such a procedure are shown in FIG. As shown in FIG. 8, the flow velocity shows a substantially constant value at about 4.5 [mm / s].
  • FIG. 8 the result of performing and comparing the same measurement with the plasma in which activation rates differ is shown in FIG.
  • the flow rate was 6.6 [mm / s] for plasma with an activation rate of 33%, and 5.4 [mm / s] for plasma with an activation rate of 86%.
  • the higher the activation rate of the plasma the easier it is to coagulate and the lower the flow rate is measured, which is an effective indicator of blood coagulation ability measurement. Recognize.
  • the absolute value is smaller than the negative pressure exerted on the liquid by the meniscus of the liquid introduced into the flow path 23 at the other end of the flow path 23 by the pump 4
  • the present invention is applied to the SPR measurement system as an example, but it goes without saying that the system can be applied to various systems as long as it is a system for measuring a small amount of liquid fed in the flow channel of the flow cell. Yes.
  • the inner wall surface of the introducing portion 22 is formed by the hydrophobic PDMS 104, and the inner wall surface of the flow path 23 is formed by the hydrophilic PDMS 103, but the present invention is limited thereto Alternatively, both the inner wall surface of the introduction portion 22 and the inner wall surface of the flow path 23 may be formed of the hydrophilic PDMS 103.
  • the concave meniscus m2 formed in the pure water ⁇ at the end of the flow path 23 on the introduction portion 22 side disappears by the phosphate buffer solution ⁇ supplied from the introduction portion 22.
  • a new concave meniscus of the phosphate buffer solution ⁇ is formed in the hydrophilic introducing portion 22.
  • the cross-sectional area of the introduction part 22 is larger than the cross-sectional area of the flow path 23, the new meniscus formed in the introduction part 22 is more than the force (negative pressure) by the meniscus m2 formed in the flow path 23.
  • the force (negative pressure) is smaller.
  • the present invention is not limited thereto.
  • a convex meniscus m3 is formed in the introduction portion 22, so that the cross-sectional area of the introduction portion 22 is formed to be smaller than or equal to the cross-sectional area of the flow path 23. Good.
  • the present invention can be applied to various devices and methods using a flow cell.

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Abstract

　フローセル（２）は、平面視略矩形の板状の本体（２１）と、この本体（２１）上面に形成された凹部からなる導入部（２２）と、本体（２１）内部に形成され、導入部（２２）の下端に一端が接続された流路（２３）と、本体（２１）に形成された凹部からなり、下端に流路（２３）の他端が接続された導出部（２４）とを備えている。ここで、導入部（２２）は、開口から導入された液体のメニスカスによってその液体に、正圧、または、流路（２３）に導入されたその液体によって液体に働く負圧よりも絶対値の小さい負圧を生じさせるように形成されている。流路（２３）は、流路（２３）内に導入された液体のメニスカスによって液体に負圧を生じさせるように形成されている。　微量な液体の送液を制御をより容易に行うことができるフローセル、および、送液システムを提供する。

Description

フローセルおよび送液システム
　本発明は、フローセルおよび送液システムに関するものである。
　臨床検査や生化学分野での検査では各種測定が行われるが、このときの測定対象の試料溶液は微量な場合が多い。このため、マイクロＴＡＳ（Total Analysis Systems）やLab on a Chipなど、小さなチップで微量の液体の流れを制御することにより、高感度に測定する技術が提案されている。
　このような技術では、蛍光測定、吸光測定、電気化学測定、ＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）測定、ＡＴＲ（Attenuated Total Reflection）測定、ＳＰＲ（surface plasmon resonance）測定などの簡便な測定法を採用することが多い。なかでもＳＰＲ測定は検出のための検体液のラベル化が不要であり、抗原抗体反応やDNAの結合などを直接検出することができ、かつ、測定の手順も単純化することができる（例えば、特許文献１～３、非特許文献１参照。）。また、ＳＰＲ測定は、測定領域を線状や面状にできるので、２地点の屈折率変化の時間差を測定することでその２地点間の流速を測定することもできる（例えば、特許文献４参照。）。
　これらの測定では、試料溶液を保持可能な試料セルが用いられている。試料セルに微量の試料溶液を供給して、その試料セルにおいて測定を行う検出部まで流し移送する。これにより、試料溶液に溶解または分散しているＤＮＡや抗体などの検体の濃度を低下させることなく、より高感度、高効率に測定を行うことができる。このように試料溶液を検出部へと流す試料セルは、フローセルと呼ばれている。
　フローセルで微量な試料溶液を移送する方法として、各種方法が提案されている。例えば、シリンジポンプ等によって外部から圧力をかけることによって、フローセルに形成した流路に試料溶液を移送させる方法がある。また、静電気力で移送させる方法、エレクトロウェッティング法、加熱による体積変化や気泡の生成により試料溶液を移送させる方法、電気浸透流を利用する方法などがある。
　近年では、フローセルに、試料溶液に対して毛細管現象を発現可能な流路またはポンプとなる領域を形成することにより試料溶液を移送する方法も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。この方法では、試料溶液が導入される導入口を備えた供給部と、導入された試料溶液を吸引する毛細管ポンプを備えた移送部と、導入口と毛細管ポンプとの間に設けられた測定のための流路とを、板状のフローセルの平面方向に沿って直線上に並んで形成したフローセルが提案されている。このフローセルでは、試料溶液を導入口に供給すると、試料溶液が導入口から流路を通って毛細管ポンプに到達し、この毛細管ポンプに吸引されて連続的に流路を流れることとなる。また、流路の両端に半径の異なる液滴を形成し、液滴に生じる表面張力の大きさの違いにより、液体を移送する方法も提案されている。（例えば、非特許文献２参照。）
　このような毛細管力を利用した送液方法は、外部からの駆動力を必要としないので、パッシブポンプと呼ばれている。このパッシブポンプを有するフローセルは、送液のための周辺装置を必要としないので、ポイントオブケアなどのオンサイトでの測定に有利となる。特に、特許文献１に記載されたフローセルは、検体液がフローセル外部に流出しないので、オペレータが受けるバイオハザードの影響も少なく、測定に伴う廃棄物も少なくすることができる。また、フローセルは、１回の測定に１つを使い捨てるので、クロスコンタミネーション等の測定エラーを抑えることができる。
　このようなフローセルを作製する材料としては、リソグラフィーによる製造方法を利用するため、シリコン、石英、ガラスウエハなどが用いられてきた。フローセルにするための接着する方法として、高温にして融着する方法、陽極接合、フッ酸による接合などがある。
　また、バイオセンサとして機能させる場合には、バイオ材料をフローセル内に固定化することが併せて行われる。ところが、バイオ材料は高温、強酸、強アルカリ、有機溶剤耐性が低いため、バイオ材料を固定化した後に上述したような接合方法でフローセルを作製するとバイオセンサとして機能させることが困難となってしまう。
　そこで、近年、ポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane：以下、「ＰＤＭＳ」と言う。）をフローセルの材料として用いることが研究されている。これは、ＰＤＭＳのガラスやシリコンの基板に対する自己接着力が強いため、接着のプロセスを必要とせず、基板の上に搭載するだけで簡便にフローセルを作製することができるからである。また、ＰＤＭＳは水溶液に対する接触角が９０度以上あり、疎水性である。したがって、液滴の表面張力による送液に関しては、液滴を形成するために疎水性であることは好都合であるが、あらかじめ呼び水となる溶液を導入するにはピペットなどによる強制的な送液が前準備として必要となる。これは、流路を構成する基板が親水性であっても残りの面が疎水性のＰＤＭＳであるため、外部から加圧しなければ水溶液が入っていかないためである。
　このことからも、毛細管力を駆動力とするパッシブポンプをＰＤＭＳだけで実現することは難しいことは明らかである。このため、ＰＤＭＳ表面に試薬を塗布し親水性にすることが行われるが、時間と共に親水性が失われていくといった問題点があった。そこで、ＰＤＭＳ自体に改質剤を添加し、ＰＤＭＳ自体を親水性にして血液検査用フローセルを作製した研究が行われている（例えば、非特許文献３参照。）。
　上述したようなフローセルは、現場での簡便な測定を目指した使い捨て型である。一方で、分析センター等に多くの検体液を集め大量の分析を行う需要も存在する。このような場合には、電力や水・薬液が十分に利用できる環境にあり、また測定装置に対する大きさの制約も少ない。このため、フローセルは使い捨てでなく、流路に検体液を流した後、水や洗浄液を続けて流すことにより流路を洗浄して次の検体液を流す繰り返し測定の方が測定コストを低くすることができる。
　そこで、繰り返し測定を実現するために、試料溶液が導入される導入口を備えた供給部と、試料溶液を導出する導出口を備えた排出部と、供給部と排出部との間に設けられた測定のための流路とを備えたフローセルが提案されている。このフローセルでは、ポンプにより送液を制御することが一般的である（例えば、特許文献５，６参照。）。具体的には、導出口に接続したポンプに負圧をかけて、供給部に供給した検体液や洗浄液を流路へと吸引することにより、それらの液体の送液が行われている。
　このようなフローセルで繰り返し測定を行う場合、例えばポンプに負圧をかけ続けて流路や導出部の液体を吸引しきってしまうと、次に測定する液体を供給部に液体を供給しても流路内や導出部内に気体が存在するので、その液体を吸引することが困難となってしまう。このようなときには、フローセルに呼び水を供給して流路や導出部を液体で満たさなければならないので、手間がかかる。そこで、繰り返し測定では、流路および導出部に液体が滞留した状態となるようポンプの動作を制御することが行われている。例えば、導入部内の液体が流路に流れ切った時点で、ポンプを停止させることにより、流路および導出部内に液体が滞留した状態とするようにしている。
　このような繰り返し測定は、例えば、血液凝固測定に効果的である。近年、食生活の欧米化、運動不足やストレスの蓄積、高齢化の進行などに伴う生活習慣病が大きな社会問題になっている。生活習慣病が原因となる病気として血栓症が挙げられるが、血栓症は心筋梗塞と強い相関がある。したがって、定期的な血液検査において血液凝固測定を行うことは今後ますます重要になっていく。
特許第０４９８７０８８号公報 特許第０５０４２３７１号公報 国際公開第２００９／１４５１７２号 特許第０４８９７０５４号公報 特許第４８５３９２７号公報 特開平１０－１６０６５８号公報
Tsutomu Horiuchi，Toru Miura，Yuzuru Iwasaki，Michiko Seyama，Suzuyo Inoue，Jun-ichi Takahashi，Tsuneyuki Haga and Emi Tamechika、"Passive fluidic chip composed of integrated vertical capillary tubes developed for on-site SPR immunoassay analysis targeting real samples."、Sensors 12, no. 6: （2012） 7095-7108 Glenn M. Walker and David J. Beebe、"A passive pumping method for microfluidic devices"、Lab Chip ,2 （2002） 131-134 YuChang Kima，Seung-Hoon Kimb，Duckjong Kima，Sang-Jin Parka，Je-Kyun Parkb、"Plasma extraction in a capillary-driven microfluidic device using surfactant-added poly（dimethylsiloxane）"、Sens. Actuators B, 145 （2010） 861-868
　しかしながら、上述したようなポンプによる送液の制御は困難なものとなっていた。これは、フローセルが微小であり、送液する液体の量も微量なので、流路や導出部内に液体が滞留した状態とするには、ポンプを繊細に操作する必要があるからである。また、ポンプによる送液の制御は、配管内の残圧等の影響も受けるので、時間的な遅延が発生したり、ウォーターハンマーを引き起こしたりするので、さらにその操作が煩雑なものとなっていた。
　そこで、本発明は、微量な液体の送液の制御をより容易に行うことができるフローセルおよび送液システムを提供することを目的とする。
　上述したような課題を解決するために、本発明に係るフローセルは、本体と、この本体に形成された凹部と、本体内に形成され、一端が凹部の内壁面に開口し、他端が本体の外部に開口する流路とを有し、流路は、当該流路内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に負圧を生じさせ、凹部は、当該凹部内に導入された液体のメニスカスによって液体に、正圧、または、流路内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧より絶対値の小さい負圧を生じさせることを特徴とするものである。
　また、本発明に係る送液システムは、負圧を生じるポンプと、本体と、この本体に形成された凹部と、本体内に形成され、一端が凹部の内壁面に開口し、他端が本体の外部に開口する流路とを有するフローセルと、ポンプとフローセルの流路の他端とを接続する管とを備え、流路は、当該流路内に導入された液体のメニスカスによって液体に負圧を生じさせ、凹部は、当該凹部内に導入された液体のメニスカスによって液体に、正圧、または、流路内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧より絶対値の小さい負圧を生じさせ、ポンプは、流路内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が小さく、凹部内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が大きい一定の負圧を生じることを特徴とするものである。
　本発明によれば、ポンプにより流路の他端に、流路内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が小さく、凹部内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が大きい一定の負圧をかけた上で、凹部に液体を供給すると、凹部に導入された液体のメニスカスによって生じる負圧よりもポンプによる負圧の方が大きいので凹部に導入された液体が流路へと移動し、その凹部に導入された液体が凹部を流れ切ると、流路に導入された液体のメニスカスによって生じる負圧がポンプによる負圧よりも大きいので流路に導入された液体の移動が停止する。結果として、ポンプを繊細に操作しなくてよいので、微量な液体の送液の制御をより容易に行うことができる。
図１は、ＳＰＲ測定システムの構成を模式的に示す平面図である。 図２は、ＳＰＲ測定システムの一部の構成を模式的に示す正面図である。 図３は、本発明の実施の形態に係るフローセルの構成を模式的に示す斜視図である。 図４は、本発明の実施の形態に係るフローセルの構成を模式的に示す要部断面図である。 図５Ａは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｂは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｃは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｄは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｅは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｆは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図５Ｇは、本発明の実施の形態に係るフローセルの製造方法を説明するための断面図である。 図６Ａは、ＳＰＲ測定システムによる測定動作を説明するための図である。 図６Ｂは、ＳＰＲ測定システムによる測定動作を説明するための図である。 図６Ｃは、ＳＰＲ測定システムによる測定動作を説明するための図である。 図６Ｄは、ＳＰＲ測定システムによる測定動作を説明するための図である。 図７は、純水とリン酸緩衝溶液を交互に供給したときの流速の測定結果を示す図である。 図８は、血液凝固測定の測定結果を示す図である。 図９は、血液凝固測定の測定結果を示す図である。
　以下、図面を参照して本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本実施の形態は、ＳＰＲ測定システムに適用した場合を例に説明する。
＜ＳＰＲ測定システムの構成＞
　図１、図２に示すように、本実施の形態に係るＳＰＲ測定システムは、検体や試薬を選択的に供給する分注器１と、この分注器１から検体や試薬が供給されるフローセル２と、このフローセル２を用いてＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定装置３と、一定の負圧を生じさせるポンプ４と、フローセル２とポンプ４との間に設けられ、フローセル２にかけられる圧力を調整する圧力調整容器５とを備えている。
　フローセル２は、図３，図４に示すように、平面視略矩形の板状の本体２１と、この本体２１上面に形成された凹部からなる導入部２２と、本体２１内部に形成され、導入部２２の下端に一端が接続された流路２３と、本体２１に形成された凹部からなり、下端に流路２３の他端が接続された導出部２４とを備えている。なお、導入部２２に導入される液体の流れる方向と直交する方向の断面積（以下、これを「導入部２２の断面積」と呼ぶ。）は、流路２３に導入される液体の流れる方向と直交する方向の断面積（以下、これを「流路２３の断面積」と呼ぶ。）よりも大きく形成されている。
　本体２１は、例えば樹脂材料から形成されている。
　導入部２２は、一端が本体２１の上面に開口し、他端が封鎖された円筒状（円管）に形成された流路である。導入部２２の内壁面は、フローセル２に導入される液体に対して、疎水性を有する材料または親水性を有する材料で形成されている。この導入部２２の開口から導入された液体のメニスカスによってその液体に働く圧力は、当該導入部２２の内壁面が疎水性の場合には正圧、または、その内壁面が親水性の場合には負圧となる。さらに、導入部２２の断面積が流路２３の断面積よりも大きく形成されているため、流路２３に導入されたその液体によって液体に働く負圧よりも導入部２２に導入された液体によって液体に働く負圧の方が絶対値の小さい負圧となるように形成されている。
　ここで、メニスカスによって液体に働く正圧とは、導入部２２および流路２３に導入された液体の導入側部分において吐出方向に圧力をかける力、言い換えると、液体の気液界面に対して液体側に向かう方向にその液体に圧力をかける力である。一方、メニスカスによって液体に働く負圧とは、導入部２２および流路２３に導入された液体の導入側部分において吸引方向に圧力をかける力、言い換えると、液体の気液界面に対して気体側に向かう方向にその液体に圧力をかける力である。
　円筒状の導入部２２に形成されるメニスカスによる圧力Ｐｒは、下式（１）で表すことができる。この下式（１）において、ｒは導入部２２の半径、θは導入部２２内壁面との接触角、γは導入部２２に導入される液体の表面張力係数を表している。
Ｐｒ＝－（２γ／ｒ）ｃｏｓθ　・・・（１）
　例えば、導入部２２に水（γ＝７２．７５×１０－３［Ｎ／ｓ］）が供給され、導入部２２の半径ｒが３［ｍｍ］、導入部２２内壁面が親水性（接触角θ＝６０［°］）の場合、圧力Ｐｒは－２４．２５［Ｐａ］となる。これは、導入部２２に形成されたメニスカスにより導入部２２に導入された水に２４．２５［Ｐａ］の負圧がかかっており、その水を流路２３の方向に移動させるには、流路２３の側、すなわちポンプ４が２４．２５［Ｐａ］以上の負圧で吸引する必要があることを意味している。
　流路２３は、本体２１の上面に平行な方向に延在する、断面矩形の管である。流路２３の一端は、導入部２２底部の内壁面に開口し、他端は導出部２４底部の内壁面に開口している。この流路２３の内壁面は、流路２３内に導入された液体のメニスカスが負圧を生じさせるように形成されている。具体的には、流路２３の内壁面は、フローセル２に供給される液体に対して親水性を有する材料で形成されている。したがって、親水性の流路２３内に液体が導入されてメニスカスが形成されると、その液体にはそのメニスカスによって負圧がかかることとなる。
　ここで、断面略矩形の流路２３に形成されるメニスカスによる圧力Ｐｃは、下式（２）で表すことができる。この下式（２）において、ｄは流路２３の厚さ、ｗは流路２３の幅、θｔは流路２３上面の接触角、θｂは流路２３下面の接触角、θｌは流路２３左面の接触角、θｒは流路２３右面の接触角を表している。
Ｐｃ＝－γ｛（ｃｏｓθｌ／ｄ）＋（ｃｏｓθｂ／ｄ）＋（ｃｏｓθｌ／ｗ）＋（ｃｏｓθｒ／ｗ）｝　・・・（２）
　各面の接触角θが同一であるとすると、上式（２）は下式（３）と表すことができる。
Ｐｃ＝－２γｃｏｓθ｛（１／ｄ）＋）１／ｗ）｝　・・・（３）
　例えば、流路２３に水（γ＝７２．７５×１０－３［Ｎ／ｓ］）が供給され、流路２３の厚さが０．０７５［ｍｍ］、幅が１［ｍｍ］、流路２３の内壁面が親水性（接触角θ＝６０［°］）の場合、圧力Ｐｒは－１０４２．７５［Ｐａ］となる。これは、流路２３に形成されたメニスカスによって流路２３に導入された水に１０４２．７５［Ｐａ］の負圧がかかっており、その水を導出部２４の方向に移動させるには、導出部２４の側、すなわちポンプ４が１０４２．７５［Ｐａ］以上の負圧で吸引する必要があることを意味している。
　導出部２４は、一端が本体２１の上面に開口し、他端が封鎖された円筒形状（円管）に形成された流路である。この導出部２４には、一端が圧力調整容器５に接続された管５１の他端が接続されている。
　なお、本実施の形態において、フローセル２は、ＳＰＲ測定に用いる場合は、流路２３の下面の少なくとも一部にＡｕ等からなる検出部（図示せず）が設けられている。
　このようなフローセル２の製造方法については後述する。
　ＳＰＲ測定装置３は、ＳＰＲ法により測定を行う装置である。本実施の形態では、ＳＰＲ測定装置３上に配置されたフローセル２の流路２３を流れる液体に対して測定を行う。
　ポンプ４は、一定の負圧を生じさせるポンプであり、管４１、圧力調整容器５および管５１を介してフローセル２の導出部２４と接続されている。ここで、一定の負圧は、内壁面が親水性に形成された流路２３内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が小さく、内壁面が親水性に形成された導入部２２内に導入された液体のメニスカスによってその液体に働く負圧よりも絶対値が大きい一定の値である。なお、内壁面が疎水性に形成された導入部２２に導入した液体によって導入部２２に形成されたメニスカスによってその液体に正圧がかかる場合でも、ポンプ４の負圧の値は、その液体が流路２３内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が小さくなるように設定される。
　ここで、ポンプ４が生じさせる負圧は、導入部２２または流路２３に導入される液体によってそれらに形成されるメニスカスによってその液体に働く負圧とともに同じ“負圧”ではあるが、圧力をかける方向が異なるものとなっている。すなわち、ポンプ４が生じさせる負圧は、導入部２２に供給された液体を流路２３に向かって吸引する方向の圧力である。一方、導入部２２または流路２３に形成されるメニスカスによる負圧は、流路２３内の液体の場合、この液体を導入部２２に向かって吸引する方向の圧力である。
　圧力調整容器５は、筒状の中空容器からなり、上端には管４１の他端と、他端がフローセル２の導出部２４に接続された管５１の一端とが接続されている。このような圧力調整容器５は、管５１内の液体で生じる圧力差をキャンセルし、ポンプ４を正常に動作させるものである。
＜フローセルの製造方法＞
　次に、本実施の形態に係るフローセル２の製造方法の一例について、図５Ａ～図５Ｇを参照して説明する。
　まず、流路２３の形状に対応する鋳型を作成するために、図５Ａに示すように、シリコンウエハ１００を用意し、このシリコンウエハ１００上にレジスト１０１を形成する。例えば、シリコンウエハ１００は、レジスト１０１を塗布する前に、硫酸過水洗浄、いわゆるピラニア洗浄を３０分行った後、２００℃で２０分乾燥させたものを用意する。また、レジスト１０１には厚膜レジストＳＵ８を用い、これをスピンコート法によりシリコンウエハ１００上に塗布すればよい。
　続いて、図５Ｂに示すように、フォトリソグラフィ法により、シリコンウエハ１００上に流路２３の形状に対応する鋳型１０２を作成する。例えば、図５Ａに示すようにレジスト１０１が塗布されたシリコンウエハ１００に対して、６５℃で３０分、９５℃で２７０分で順次ベークし、アライナーで露光した後、９５℃で９０分ポストベークする。そして、ＳＵ８用現像液で現像した後、イソプロピルアルコール・アセトンでリンスを行い、周辺部に外枠を取り付けて鋳型を完成させればよい。なお、本実施の形態において、流路２３に対応する部分の鋳型のサイズは、厚さ０．０７５［ｍｍ］、幅１［ｍｍ］、長さ９［ｍｍ］である。
　鋳型１０２を作成すると、図５Ｃに示すように、鋳型１０２が作成されたシリコンウエハ１００上に親水性ＰＤＭＳ１０３を塗布する。
　例えば、親水性ＰＤＭＳ１０３には、固化前の疎水性ＰＤＭＳにポリエーテル変性シリコン（トリシロキサンエトキシレート）（SILWET L-77）を重量比で１パーセント添加し、減圧脱泡したものを用いることができる。固化前の疎水性ＰＤＭＳは、ＰＤＭＳベース（SYLGARD 184）と重合開始剤を１０：１の割合で混合して減圧脱泡したものである。親水性ＰＤＭＳ１０３の塗布は、マイクロディスペンサ、刷毛などを用いる方法、凹版、凸版、平版、孔版などの印刷技術を用いればよい。
　親水性ＰＤＭＳ１０３を塗布した後、図５Ｄに示すように、この親水性ＰＤＭＳ１０３上に疎水性ＰＤＭＳ１０４を形成する。
　例えば、疎水性ＰＤＭＳ１０４は、親水性ＰＤＭＳ１０３上に厚さ約３［ｍｍ］で一様に形成した後、１２０分加熱して固化させればよい。
　疎水性ＰＤＭＳ１０４が固化すると、図５Ｅに示すように、シリコンウエハ１００および鋳型１０２と、流路２３に対応する溝１０５が形成された親水性ＰＤＭＳ１０３およびこの親水性ＰＤＭＳ１０３上に設けられた疎水性ＰＤＭＳ１０４とを分離する。
　続いて、図５Ｆに示すように、溝１０５の両端に、この溝１０５と疎水性ＰＤＭＳ１０４の上面とを連通する貫通孔１０６を形成する。この貫通孔１０６は、導入部２２または導出部２４に対応する。例えば、導入部２２に対応する貫通孔１０６は直径３［ｍｍ］、導出部２４に対応する貫通孔１０６は直径１．５［ｍｍ］に形成する。
　貫通孔１０６を形成すると、図５Ｇに示すように、ＳＰＲ基板１０７を用意し、この上面に親水性ＰＤＭＳ１０３の下面を接着する。これにより、フローセル２が完成する。
　ここで、ＳＰＲ基板１０７は、ＳＰＲ測定装置３上に載置する基板であって、ＢＫ７ガラス基板１０８上にチタン薄膜１０９と金薄膜１１０を順にスパッタ蒸着したものである。例えば、接着は、酸素雰囲気中での反応性イオンエッチング（パワー７０［Ｗ］、酸素分圧１０［Ｐａ］、流量１００［ｓｃｃｍ］、５秒）で親水性ＰＤＭＳ１０３の上面とＳＰＲ基板１０７の上面を活性化し、これらの面を貼り合わせる。
　作成したフローセル２において、流路２３の内壁面は、親水性ＰＤＭＳ１０３で形成されているので、親水性になっている。したがって、流路２３に流入した液体には、メニスカスが形成された場合、そのメニスカスによって負圧がかかることとなる。
　一方、導入部２２および導出部２４の内壁面は、疎水性ＰＤＭＳ１０４からなるので、疎水性になっている。したがって、導入部２２および導出部２４に流入した液体には、メニスカスが形成された場合、そのメニスカスによって正圧がかかることとなる。
＜ＳＰＲ測定システムによる測定動作＞
　次に、このような製造方法によって作成されたフローセル２を備えたＳＰＲ測定システムによる測定動作について、図６Ａ～図６Ｄを参照して説明する。
　なお、本実施の形態では、純水αとリン酸緩衝容液βを交互にフローセル２に流して、それぞれの流速を測定する場合を例に説明する。例えば、分注器１として武蔵エンジニアリング社製自動分注器PIPETMASTER-200S、ＳＰＲ測定装置としてNTT-AT社製smart SPR、ポンプ４としてFluigent社製のポンプMFCS-VACを用いることができる。
　まず、予め導入部２２の開口から呼び水を注入し、流路２３および導出部２４が水で満たされた状態としておく。この状態にした後、ポンプ４の圧力を一定の負圧に設定し、図６Ａに示すように、分注器１によりフローセル２の導入部２２の開口に純水αを導入する。
　本実施の形態において、ポンプ４の圧力は、－１００［Ｐａ］に設定した。
　また、分注器１によりフローセル２の導入部２２の開口に、０．０１［ｍｌ］の純水αを導入した。本実施の形態において、導入部２２の容積は約０．０２［ｍｌ］なので、図６Ｂに示すように、純水αは導入部２２の開口からあふれることはない。
　このとき、導入部２２の内壁面は、疎水性ＰＤＭＳ１０４で形成されている。したがって、導入部２２に注入された液体で形成されるメニスカスｍ１は、凸状となり、その液体に対して正圧、すなわち、流路２３に向かって移動させる力をかける。
　このように、導入部２２に形成されるメニスカスによる圧力（正圧）と、ポンプ４からの圧力（負圧）により、導入部２２に注入された純水αは、導入部２２から流路２３へと移動してゆく。流路２３に移動した純水αは、流路２３を通過した後、導出部２４を通り管５１から圧力調整容器５に導入される。
　導入部２２に注入された純水αが全て流路２３に流れ込み、流路２３の導入部２２側の端部近傍にメニスカスｍ２が形成されると、図６Ｃに示すように、純水αの移動が停止する。これは、流路２３に形成されたメニスカスｍ２による圧力（負圧）の方が、ポンプ４による圧力（負圧）よりも大きいからである。
　このとき、流路２３に形成されるメニスカスｍ２による圧力とポンプ４による圧力は何れも負圧であるが、上述したように吸引する方向が異なる、すなわち、メニスカスｍ２は流路２３内の液体を導入部２２に向かう方向に吸引し、ポンプ４は流路２３内の液体を導出部２４に向かう方向に吸引する。このため、メニスカスｍ２による圧力の方がポンプ４による圧力よりも大きいので、液体（純水α）の移動が停止することとなる。
　純水αの移動が停止すると、図６Ｄに示すように、分注器１によりフローセル２の導入部２２の開口にリン酸緩衝溶液βを導入する。本実施の形態では、０．０１［ｍｌ］のリン酸緩衝溶液βを導入する。
　すると、流路２３の導入部２２側の端部に純水αが形成していたメニスカスｍ２が、リン酸緩衝溶液βの導入とともに消失するので、そのメニスカスｍ２により生じていた負圧がなくなる。一方、導入部２２には、リン酸緩衝溶液βによりメニスカスｍ３が形成される。これにより、そのメニスカスｍ３による力（正圧）と、ポンプ４からの圧力（負圧）により、導入部２２に注入されたリン酸緩衝溶液βは、導入部２２から流路２３へと移動してゆく。この場合、導入部２２の内壁面が疎水性となっているため、親水性の場合に比べてリン酸緩衝溶液βの流速が速くなり、その内壁面にリン酸緩衝溶液βの汚れが付着し難くなる。
　このとき、純水αとリン酸緩衝溶液βの屈折率は大きく異なるので、ＳＰＲ測定装置３でそれらの液体の境界を観測することができる。本実施の形態で使用したＳＰＲ測定装置３は、流路２３の流れ方向に３．５［ｍｍ］の観測領域を備えているので、液体の境界がその観測領域を横切る時間を測定することで、液体の流速を求めることができる。
　そして、リン酸緩衝溶液βも純水αの場合と同様に、導入部２２を流れ切ると、流路２３の導入部２２側の端部で停留することになる。このように、導入部２２に液体を導入すると、自動的にその液体が流路２３に向かって移動し、導入部２２を流れ切ると、その移動が自動的に停止する。これにより、従来のようにポンプを繊細に制御しなくても、導入部２２に液体を供給するだけで、微量の液体の送液の制御を行うことができる。また、従来のようにポンプを繊細に制御しなくても、流路２３および導出部２４に液体が滞留した状態とすることができる。これにより、呼び水を再度供給する手間を省くこともできる。
　そして、引き続き、純水α、そしてリン酸緩衝溶液βの順番で交互に導入部２２に注入することにより、純水αとリン酸緩衝溶液βを繰り返して測定することができる。
　このような手順で純水αとリン酸緩衝溶液βを交互に導入部２２に供給して境界の移動速度を繰り返し（２０回）測定したときの測定結果を図７に示す。この図７に示すように、境界の移動速度、すなわち、流路２３を流れる液体の流速は、ほぼ一定の値を示している。
　このように、導入部２２に液体を供給するだけで、従来のようにポンプによる微量な流体の送液を制御しなくても、流路２３に液体を一定の速度で流すことができる。
＜血液凝固測定＞
　次に、本実施の形態による血液凝固測定について説明する。
　血液の止血作用を担う凝固因子にプロトロンビンがある。このプロトロンビンによる凝固能の評価にプロトロンビン時間が用いられる。プロトロンビン時間の測定は、肝機能検査(肝硬変、肝臓がん)や、心筋梗塞や脳梗塞等の手術の際の抗凝固剤投与量を決定する際の指標として利用される。従来では、血漿が試薬により凝固するまでの時間を測定するが、フローセル内で凝固測定を行うと流路が目詰まりしてしまい、繰り返し測定ができなかった。しかしながら、本実施の形態では、以下の手順で測定を行うことにより、繰り返し測定を行うことができる。
　まず、分注器１のリザーバーに血漿(活性化率100%)、凝固活性化剤、流路洗浄液、純水を予め必要量用意し、フローセル２の導入部２２の開口に、流路用洗剤、純水を順番に必要量導入する。続いて、凝固活性化剤を供給した後、これを流路２３中に停留させておく。この状態から、血漿を導入部２２より導入すると共にＳＰＲ測定装置３により測定を開始する。すると、血漿と流路２３中の凝固活性化剤の界面(導入部２２と流路２３の接続部分)において凝固反応が開始するが、凝固活性剤が血漿の導入と共に流路２３中を流れ始めるので、流路２３が目詰まりすることはない。
　このとき、ＳＰＲ測定装置３においては、凝固活性化剤と血漿の界面の通過時間(流速)を測定することができる。再び上述した流路用洗剤の導入から同様の操作を行えば、繰り返し測定が可能となる。
　このような手順で血液凝固測定を繰り返し（１０回）測定したときの測定結果を図８に示す。この図８に示すように、流速は約４．５［ｍｍ／ｓ］でほぼ一定の値を示している。
　また、同様の測定を活性化率が異なる血漿で行って比較した結果を図９に示す。活性化率が３３％の血漿では流速が６．６［ｍｍ／ｓ］、活性化率８６％の血漿では５．４［ｍｍ／ｓ］であった。活性化率が１００％の図８の測定結果と比較すると、活性化率が高い血漿ほど凝固しやすく、流速が低く測定されることが示され、血液凝固能測定の有効な指標となることがわかる。
　以上説明したように、本実施の形態によれば、ポンプ４により流路２３の他端に、流路２３内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が小さく、導入部２２内に導入された液体のメニスカスによって液体に働く負圧よりも絶対値が大きい一定の負圧をかけた上で、導入部２２に液体を供給すると、導入部２２に導入された液体のメニスカスによって生じる負圧よりもポンプ４による負圧の方が大きいので導入部２２に導入された液体が流路２３へと移動し、導入部２２に導入された液体が導入部２２を流れ切ると、流路２３に導入された液体のメニスカスによって生じる負圧がポンプ４による負圧よりも大きいので流路２３に導入された液体の移動が停止する。結果として、ポンプ４を繊細に操作しなくてよいので、微量な液体の送液の制御をより容易に行うことができる。
　なお、本実施の形態では、ＳＰＲ測定システムに適用した場合を例に説明したが、フローセルの流路内を送液する微量の液体について測定を行うシステムであれば、各種システムに適用できることは言うまでもない。
　また、本実施の形態では、流路２３の全体を親水性とする場合を例に説明したが、少なくとも導入部２２との接続部近傍のみが親水性であればよい。
　さらに、本実施の形態では、導入部２２の内壁面を疎水性ＰＤＭＳ１０４により形成し、流路２３の内壁面を親水性ＰＤＭＳ１０３により形成するようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、導入部２２の内壁面および流路２３の内壁面の双方を親水性ＰＤＭＳ１０３により形成するようにしてもよい。
　この場合、流路２３の導入部２２側の端部に純水αが形成していた凹状のメニスカスｍ２が、導入部２２から供給されたリン酸緩衝溶液βにより消失するので、そのメニスカスｍ２（図６参照）により流路２３に生じていた導入部２２側への負圧が無くなると同時に、親水性の導入部２２にはリン酸緩衝溶液βによる新たな凹状のメニスカスが形成される。ここで、導入部２２の断面積が流路２３の断面積よりも大きいことから、流路２３に形成されたメニスカスｍ２による力（負圧）よりも導入部２２に形成された新たなメニスカスによる力（負圧）の方が小さくなる。したがって、導入部２２の新たなメニスカスによる力（負圧）よりもポンプ４からの圧力（負圧）の方が大きくなるので、導入部２２に注入されたリン酸緩衝溶液βが導入部２２から流路２３へと移動することになる。
　さらに、本実施の形態では、導入部２２の断面積が流路２３の断面積よりも大きく形成されているようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、導入部２２の内壁面が疎水性の場合、当該導入部２２には凸状のメニスカスｍ３が形成されるので、導入部２２の断面積が流路２３の断面積よりも小さく若しくは同等に形成されるようにしてもよい。
　本発明は、フローセルを用いる各種装置や方法に適用することができる。
　１…分注器、２…フローセル、３…ＳＰＲ測定装置、４…ポンプ、５…圧力調整容器、２１…本体、２２…導入部、２３…流路、２４…導出部、５１…管。

Claims (5)

  1. 　本体と、
    　この本体に形成された凹部と、
    　前記本体内に形成され、一端が前記凹部の内壁面に開口し、他端が前記本体の外部に開口する流路と
    　を有し、
    　前記流路は、当該流路内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に負圧を生じさせ、
    　前記凹部は、当該凹部内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に、正圧、または、前記流路内に導入された前記液体のメニスカスによって前記液体に働く負圧より絶対値の小さい負圧を生じさせる
    　ことを特徴とするフローセル。
  2. 　前記凹部に導入される液体の流れる方向と直交する方向の断面積は、前記流路に導入される液体の流れる方向と直交する方向の断面積よりも大きい
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフローセル。
  3. 　前記流路の内壁面は、親水性に形成され、
    　前記凹部の内壁面は、疎水性に形成される
    　ことを特徴とする請求項１記載のフローセル。
  4. 　前記流路の内壁面は、親水性に形成され、
    　前記凹部の内壁面は、親水性に形成される
    　ことを特徴とする請求項２記載のフローセル。
  5. 　負圧を生じるポンプと、
    　本体と、この本体に形成された凹部と、前記本体内に形成され、一端が前記凹部の内壁面に開口し、他端が前記本体の外部に開口する流路とを有するフローセルと、
    　前記ポンプと前記フローセルの前記流路の他端とを接続する管と
    　を備え、
    　前記流路は、当該流路内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に負圧を生じさせ、
    　前記凹部は、当該凹部内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に働く圧力が、正圧、または、前記流路内に導入された前記液体のメニスカスによって前記液体に働く負圧より絶対値の小さい負圧を生じさせ、
    　前記ポンプは、前記流路内に導入された前記液体のメニスカスによって前記液体に働く負圧よりも絶対値が小さく、前記凹部内に導入された液体のメニスカスによって前記液体に働く負圧よりも絶対値が大きい一定の負圧を生じる
    　ことを特徴とする送液システム。
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