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WO2015118843A1 - 試料検出プレート、これを用いた蛍光検出システム及び蛍光検出方法 - Google Patents

試料検出プレート、これを用いた蛍光検出システム及び蛍光検出方法 Download PDF

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WO2015118843A1
WO2015118843A1 PCT/JP2015/000416 JP2015000416W WO2015118843A1 WO 2015118843 A1 WO2015118843 A1 WO 2015118843A1 JP 2015000416 W JP2015000416 W JP 2015000416W WO 2015118843 A1 WO2015118843 A1 WO 2015118843A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
substrate
fluorescence
autofluorescence
detection plate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/000416
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
謙司 永冨
中谷　将也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Original Assignee
Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd filed Critical Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority to JP2015561212A priority Critical patent/JP6455790B2/ja
Priority to EP15746094.0A priority patent/EP3104167A4/en
Publication of WO2015118843A1 publication Critical patent/WO2015118843A1/ja
Priority to US15/226,368 priority patent/US10101272B2/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a sample detection plate used in a fluorescence detection system in observation of a sample, a fluorescence detection system using the sample detection plate, and a fluorescence detection method.
  • a method for detecting cells having a predetermined form for example, there is a method in which a specific protein or nucleus is fluorescently labeled with a fluorescent dye and observed with a microscope equipped with a fluorescence observation optical system.
  • the number of cells in the field of view is counted.
  • the outline of the cell is detected and the inside and outside of the cell are identified.
  • a method for specifying the outer shape of a cell for example, a method using a phase difference image captured by a phase difference observation optical system is known.
  • a method using a fluorescent image captured by a fluorescence observation optical system is known.
  • Patent Document 1 is known as a prior art document related to the invention of the present application.
  • the conventional detection method uses a microscope equipped with a phase difference observation optical system to detect the outer shape of a cell.
  • a microscope equipped with a fluorescence observation optical system is used to detect fluorescently labeled cells. Therefore, there is a problem that a phase difference observation optical system is required in addition to the fluorescence observation optical system in order to detect the outer shape of the cell and the fluorescence-labeled cell.
  • the present disclosure solves the above-described problems, and includes a sample detection plate and a sample that can detect the outer shape of a sample with a detection apparatus that has a fluorescence optical system and does not have a phase difference observation optical system.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescence detection system and a fluorescence detection method using a detection plate.
  • a sample detection plate includes a first substrate having a first surface and a first substrate having a first wavelength so as to accommodate a sample that absorbs an electromagnetic wave having a predetermined wavelength. And a sample storage portion provided on the surface.
  • the first substrate includes a first material that emits autofluorescence by electromagnetic waves having a predetermined wavelength.
  • the sample detection plate of the present disclosure uses a phase difference observation optical system by detecting autofluorescence emitted from a substrate by an electromagnetic wave having a predetermined wavelength irradiated on the sample detection plate, using a detection device having a fluorescence optical system.
  • the outer shape of the sample can be detected without any problem.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view schematically showing a sample detection plate according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a fluorescence detection system according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a graph showing an electromagnetic wave absorption spectrum of hemoglobin.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a fluorescence observation image in the sample storage unit.
  • FIG. 5 is a top perspective view schematically showing another sample detection plate in the embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6 is a top perspective view and a cross-sectional view schematically showing another sample detection plate in the embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view schematically showing another sample detection plate in the embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view schematically showing the configuration of the sample detection plate 10.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the configuration of the fluorescence detection system 15.
  • the sample detection plate 10 shown in FIG. 2 is a cross-sectional view.
  • the sample detection plate 10 is used, for example, in a detection apparatus having a fluorescence optical system, and is used for detecting the outer shape of the sample.
  • Fluorescence optical system is a set of components included in a detection apparatus and necessary for detecting fluorescence emitted from an object.
  • the fluorescence optical system is configured, for example, by combining some or all of a light source, a lens, a mirror, and a light receiving unit built in the detection device.
  • the fluorescence detection system 15 includes a sample detection plate 10 and a fluorescence detection device 11.
  • the sample detection plate 10 contains a first substrate 1 having a first surface 1A and a second surface 1B facing away from the first surface 1A, and a sample 3 that absorbs an electromagnetic wave 8 of a predetermined wavelength. In this manner, the sample storage unit 2 is provided on the first surface 1A of the first substrate 1.
  • the first substrate 1 is made of a first material that emits autofluorescence 9A by an electromagnetic wave having a predetermined wavelength.
  • the sample detection plate 10 has a second substrate 4 that faces the first surface 1A.
  • the sample container 2 is sandwiched between the first substrate 1 and the second substrate 4.
  • the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 is detected by the electromagnetic wave 8 irradiated to the sample detection plate 10, so that the outer shape of the sample 3 can be detected. Detection can be easily performed without using a phase difference optical system.
  • the sample 3 is, for example, a cell or a living tissue.
  • first surface 1A of the first substrate 1 will be described as an upper surface
  • second surface 1B will be described as a lower surface
  • the first substrate 1 is made of a first material that emits autofluorescence 9A by an electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength.
  • the fluorescence detection system 15 receives the autofluorescence 9A of the sample detection plate 10 with respect to the electromagnetic wave 8, and detects the outer shape of the sample 3. Therefore, it is desirable that the intensity of the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 with respect to the electromagnetic wave 8 is somewhat large. As the intensity of the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 increases, the fluorescence detection system 15 can obtain a clearer image of the contour of the sample 3.
  • the first material of the first substrate 1 is preferably a material in which the intensity of the autofluorescence emitted from the first substrate 1 by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength is larger than the intensity of the autofluorescence of the glass.
  • the first material is, for example, a resin material such as polycarbonate, polystyrene, cycloolefin copolymer, acrylic, or polydimethylsiloxane.
  • the polycarbonate emits autofluorescence 9A having a high intensity with respect to the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength. Therefore, the first substrate 1 desirably includes polycarbonate.
  • the intensity of the autofluorescence 9A can be adjusted by changing the thickness of the first substrate 1, the content of the first material, etc. in addition to the material of the first substrate 1.
  • the shape of the first substrate 1 can be freely set according to the configuration of the detection device, such as a square, a rectangle, or a disk shape.
  • the sample storage unit 2 is provided on the upper surface side of the first substrate 1 and stores the sample 3 that absorbs the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength.
  • the sample container 2 is configured by one region located on the upper surface of the first substrate 1.
  • the sample container 2 can be constituted by, for example, a depression formed in the first substrate 1 by etching or the like.
  • substrate 1 may adhere
  • the sample storage layer has, for example, a through hole.
  • the sample storage portion 2 is a recess formed by a through hole and a flat plate of the sample storage layer.
  • the size, depth, and number of the sample storage unit 2 are determined by the size of the sample, the size of the light source 5 and the light receiving unit 7 of the detection device, and the like.
  • the number of samples 3 accommodated in the sample accommodating portion 2 can be adjusted by setting the size and depth of the sample accommodating portion 2 in advance.
  • the sample 3 is desirably accommodated in a single layer on the bottom surface of the sample accommodating portion 2.
  • the sample 3 is accommodated in a stacked state in the sample accommodating portion 2, it is difficult to identify the shape of the sample at the time of detection.
  • the sample detection plate 10 further has a second substrate 4.
  • the second substrate 4 has a function as a lid provided so as to cover the sample storage unit 2.
  • the second substrate 4 it is possible to prevent the sample 3 accommodated in the sample accommodating portion 2 from being scattered from the sample accommodating portion 2 during the detection operation.
  • substrate 4 does not need to be provided.
  • the fluorescence detection device 11 has a fluorescence optical system.
  • the fluorescence optical system includes a light source 5, a mirror 6, and a light receiving unit 7.
  • the light source 5 emits an electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength.
  • the electromagnetic wave 8 is excitation light such as a laser.
  • the mirror 6 reflects the electromagnetic wave 8 radiated from the light source 5 toward the sample detection plate 10.
  • the mirror 6 transmits the fluorescence 9 emitted from the sample detection plate 10.
  • the light receiving unit 7 receives the fluorescence 9 transmitted through the mirror 6. Moreover, you may have the image generation part 16 which produces
  • the fluorescence detection system 15 detects the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength from above the upper surface of the first substrate 1.
  • the light receiving unit 7 that receives the autofluorescence 9A emitted from the sample detection plate 10 is provided above the upper surface of the first substrate. Further, the light source 5 that emits the electromagnetic wave 8 is provided above the upper surface of the first substrate 1 in the same manner as the light receiving unit 7.
  • the sample detection plate 10 is irradiated with an electromagnetic wave 8 from a light source 5 provided on the upper surface side of the first substrate 1.
  • the first substrate 1 is made of a first material that emits autofluorescence 9A by electromagnetic waves 8. Therefore, the first substrate 1 emits autofluorescence 9A when irradiated with the electromagnetic wave 8.
  • the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 is received by the light receiving unit 7 provided on the upper surface side of the sample detection plate 10. Further, the sample 3 accommodated in the sample accommodating portion 2 absorbs a part of the electromagnetic wave 8 irradiated to the sample detection plate 10.
  • the location of the light source 5 that irradiates the electromagnetic wave 8 is not limited to the upper surface side of the first substrate 1.
  • the light source 5 may be provided on the lower surface side of the first substrate 1 or may be provided on the side surface side.
  • the electromagnetic wave 8 when the electromagnetic wave 8 is in a positional relationship where it directly enters the light receiving unit 7, the luminance of the background of the fluorescence observation image may be increased. In this case, it is desirable to further arrange a wavelength-selective optical filter or the like for reducing the electromagnetic wave 8 in the light receiving unit 7.
  • the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength is determined by the absorption wavelength spectrum of the sample 3.
  • the sample 3 that absorbs the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength is, for example, red blood cells.
  • FIG. 3 is a graph showing an absorption wavelength spectrum of hemoglobin contained in red blood cells. Hemoglobin contained in erythrocytes strongly absorbs electromagnetic waves particularly in a wavelength band of 450 nm or less. On the other hand, in the wavelength band of 400 nm or less including the ultraviolet region, there is a concern of damaging the biomaterial. Therefore, when the sample 3 stored in the sample storage unit 2 is an erythrocyte, it is preferable to use an electromagnetic wave having a wavelength of 400 nm to 450 nm as the electromagnetic wave having a predetermined wavelength.
  • the sample need not be limited to red blood cells, and may be plant cells having chlorophyll, for example.
  • the absorption wavelength band of chlorophyll is approximately 400 nm to 450 nm
  • the electromagnetic wave having a predetermined wavelength is preferably approximately 400 nm to 450 nm as in the case of the erythrocytes.
  • the electromagnetic wave absorbed by the sample 3 is not limited to the electromagnetic wave 8 irradiated from the light source.
  • the sample 3 may absorb autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1.
  • the electromagnetic wave of a predetermined wavelength means autofluorescence 9A.
  • the second material constituting the second substrate 4 is a material that does not emit autofluorescence with respect to electromagnetic waves with a predetermined wavelength, or the first substrate 1 with respect to electromagnetic waves with a predetermined wavelength. It is desirable that the material emits autofluorescence with a fluorescence intensity smaller than the fluorescence intensity of the autofluorescence emitted from.
  • the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1 passes through the sample storage unit 2 and the second substrate 4 and is received by the light receiving unit 7.
  • the second material of the second substrate 4 for example, glass or resin can be used.
  • the second material is preferably a transparent material. In the case where a resin is used for the second material, it is desirable that the second substrate 4 is made of a resin whose autofluorescence fluorescence intensity is lower than that of the autofluorescence fluorescence of the first material.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the fluorescence observation image 14 in the sample storage unit 2.
  • the region 12 where the sample 3 is captured is detected darkly. Further, the region 13 where the sample 3 is not captured is detected brightly.
  • the autofluorescence 9A of the first substrate 1 due to the electromagnetic wave 8 is received by the light receiving unit 7, so that a bright image is taken.
  • the intensity of the autofluorescence 9A from the first substrate 1 received by the light receiving unit 7 is the region 13 where the sample 3 is not captured. Smaller than Therefore, the region 12 where the sample 3 is captured is imaged as a dark part.
  • the following method can be used.
  • the area of the dark part per sample may be a known value in advance or may be a value obtained by an observer's work or image processing. Moreover, when calculating
  • the area of the dark part in the fluorescence observation image 14 is obtained by a histogram or the like. Then, this is divided by the area of the dark part per sample. This result can be used as the count value of the sample 3. Note that the threshold value for extracting the dark part is appropriately adjusted.
  • the fluorescence observation image 14 may have a minimum luminance value at the central portion of the sample 3. Due to the difference in the amount of electromagnetic wave absorption in the sample 3, a minimum luminance value can be seen in the central portion of the sample 3 in the fluorescence observation image 14. In this case, it is also possible to count the sample 3 by searching for a point at which the luminance becomes a minimum value using a peak analysis technique in the fluorescence observation image 14. In the sample 3, even when the contents are distributed at a high concentration in the center, a minimum value of luminance may be seen in the fluorescence observation image 14 for the same reason. Also in this case, the sample 3 can be counted using the same method.
  • the first substrate 1 that emits the autofluorescence 9A by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength is used as a single substrate.
  • a structure in which a material that does not emit autofluorescence and a material that emits autofluorescence may be laminated.
  • the same effect can be obtained even when a polycarbonate thin film that emits autofluorescence is applied to a glass substrate.
  • a sample detection plate 10 is prepared, a sample 3 is accommodated in the sample detection plate 10, an electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength is applied from the first surface side of the first substrate 1, and the sample accommodation portion 2 is accommodated.
  • the auto-fluorescence 9A emitted from the first substrate 1 by the electromagnetic wave 8 is irradiated from the first surface side of the first substrate 1 through the sample storage unit 2 and received.
  • An image is generated using the autofluorescence 9A of the first substrate 1.
  • the sample 3 is stained with a fluorescent dye that emits fluorescence by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength.
  • the fluorescence from the fluorescent dye can be simultaneously detected using the fluorescence detection device 11 by staining the protein on the nucleus or the cell membrane with the fluorescent dye.
  • detection of the outer shape of the cell by autofluorescence 9A from the first substrate 1 and detection of fluorescence of the nucleus in the cell by fluorescence from the fluorescent dye can be performed simultaneously.
  • the wavelength of the electromagnetic wave 8 that excites each of the autofluorescence 9A of the first substrate 1 and the fluorescence emitted from the fluorescent dye is substantially the same.
  • the fluorescence detection apparatus 11 can simultaneously detect the outer shape of the cell with one wavelength and detect the fluorescence of the nucleus or the like with the fluorescent dye.
  • the sample 3 may be accommodated in the sample accommodating portion 2 together with the solution containing the fluorescent dye.
  • the fluorescence intensity emitted from the fluorescent dye contained in the solution is preferably larger than the fluorescence intensity of the autofluorescence 9A emitted from the first substrate 1.
  • an area where the fluorescence intensity is smaller than a predetermined threshold is determined as a sample area, and an area where the fluorescence intensity is larger than a predetermined threshold is determined as a background area.
  • the sample area indicates the area 12 where the sample is captured.
  • the background area indicates the area 13 where the sample is not captured.
  • FIG. 5 is a top perspective view schematically showing the sample detection plate 20 in the first modification.
  • the sample detection plate 20 has a configuration in which a plurality of sample storage portions 22 are provided on a substrate 21.
  • a flow path 23 configured to allow a sample to pass between the plurality of sample accommodating portions 22 is provided on the substrate 21.
  • the sample detection plate 20 can easily introduce the sample into the sample storage unit 22 by forming the flow path 23.
  • the substrate 21 includes a first material that emits autofluorescence by an electromagnetic wave having a predetermined wavelength.
  • FIG. 6 shows an exploded perspective view and a cross-sectional view of the disk-shaped sample detection plate 30 in the second modification. Further, an enlarged view of the sample storage portion 32 provided on the substrate 31 is shown.
  • the sample detection plate 30 has a disk shape like an optical disk such as a CD or a DVD, and a circular hole 34 is provided at the center.
  • the sample detection plate 30 includes a substrate 31, a sample storage portion 32 provided on the substrate 31, and a substrate 33 provided so as to cover the sample storage portion 32.
  • the substrate 31 includes a first material that emits autofluorescence by electromagnetic waves having a predetermined wavelength.
  • the sample accommodating part 32 is circular in top view, it is not restricted to this.
  • the substrate 31 includes a base material 31a and a sample storage layer 31b.
  • the sample storage layer 31b is a layer in which the sample storage unit 32 is formed.
  • the sample storage layer 31b is made of resin, for example.
  • the sample storage layer 31b is joined to the upper surface of the base material 31a with an adhesive or the like.
  • the first material that emits autofluorescence 9A is included in the base material 31a.
  • the first material may be contained in the sample containing layer 31b or may be contained in both the base material 31a and the sample containing layer 31b.
  • the existing optical pickup device is a device used for reproducing CDs, DVDs, and Blu-ray discs.
  • the light receiving unit receives autofluorescence emitted from the substrate 31 by electromagnetic waves having a predetermined wavelength. Therefore, it is desirable that the intensity of the autofluorescence emitted from the substrate 33 is smaller than the intensity of the autofluorescence of the substrate 31. That is, the substrate 31 is made of a first material that emits autofluorescence due to electromagnetic waves irradiated from a light source provided on the upper surface side of the substrate 33.
  • the substrate 33 is preferably a second material that emits autofluorescence with a fluorescence intensity smaller than the fluorescence intensity of the autofluorescence emitted from the substrate 31 with respect to an electromagnetic wave having a predetermined wavelength.
  • FIG. 7 shows a fluorescence detection system 45 in the third modification.
  • the fluorescence detection system 45 is different from the fluorescence detection system 15 in that the fluorescence detection device 11 is provided below the lower surface of the substrate 41 of the sample detection plate 40.
  • the electromagnetic wave 8 radiated from the light source 5 is applied to the substrate 44 through the sample storage portion 42.
  • the light receiving unit 7 receives the autofluorescence 9A emitted from the substrate 44. Therefore, in the sample detection plate 40, the substrate 44 is made of a first material that emits autofluorescence 9A by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength.
  • the substrate 41 is preferably made of a second material having a fluorescence intensity of autofluorescence emitted by the electromagnetic wave 8 having a predetermined wavelength, which is smaller than that of the first material.
  • a sample accommodating portion 42 that accommodates a sample 43 that absorbs electromagnetic waves of a predetermined wavelength is provided on the upper surface of the substrate 41.
  • the substrate 44 is provided to face the substrate 41 so as to cover the sample storage portion 42. That is, the sample storage portion 42 is provided on the lower surface of the substrate 44.
  • the autofluorescence 9A emitted from the substrate 44 by the electromagnetic wave 8 of a predetermined wavelength is detected by the light receiving unit 7 through the sample storage unit 42. That is, the substrate 44 has the function of the first substrate 1 shown in FIG.
  • the substrate 41 has the function of the second substrate 4 shown in FIG.
  • the external shape of the cell is detected by detecting the autofluorescence 9A emitted from the substrate 44 by the electromagnetic wave 8 irradiated to the sample detection plate 40. be able to.
  • the position of the light source 5 is not limited to the lower surface side of the substrate 41 of the sample detection plate 40.
  • the light source 5 may be configured on the upper surface side of the substrate 41 or may be configured on the side surface side.
  • the light receiving unit 7 receives the autofluorescence emitted from the substrate 33 by electromagnetic waves having a predetermined wavelength. . Therefore, it is desirable that the intensity of the autofluorescence emitted from the substrate 31 is smaller than the intensity of the autofluorescence of the substrate 33. That is, the substrate 33 is made of a first material that emits autofluorescence due to electromagnetic waves irradiated from a light source provided on the lower surface side of the substrate 31.
  • the substrate 31 is preferably a second material that emits autofluorescence having a fluorescence intensity smaller than the fluorescence intensity of autofluorescence emitted from the substrate 33 with respect to electromagnetic waves having a predetermined wavelength.
  • the substrate 33 has the function of the first substrate 1 shown in FIG.
  • the substrates 21 and 31 have the function of the second substrate 4 shown in FIG.
  • the detection device can acquire a captured image with a clear sample outline. Therefore, by processing the captured image, the outer shape of the sample can be detected, and the size and number of samples in the observation image can be easily obtained.
  • a sample in which a plurality of types of biomaterials are mixed fluorescent labeling is performed, and at least one type of biomaterial is specifically fluoresced in the sample, so that the sample of the mixed sample is identified in addition to detecting the outer shape of the cell.
  • fluorescent labeling is performed, and at least one type of biomaterial is specifically fluoresced in the sample, so that the sample of the mixed sample is identified in addition to detecting the outer shape of the cell.
  • nucleic acid staining dyes such as DAPI and SYTO40
  • the fluorescent dye and the substrate material may be selected so that the intensity of the autofluorescence generated on the substrate is smaller than the intensity of the fluorescent bright spot in the malaria parasite.
  • the intensity of the fluorescent luminescent spot is at least twice the intensity of the autofluorescence of the substrate, and the quantum yield and fluorescence wavelength of each material and the detection efficiency in the optical system are determined as indices.
  • the type of biomaterial or fluorescent dye is not limited to the above combination.
  • a sample in which red blood cells and reticulocytes are mixed may be used, and in this case, reticulocytes can be identified as fluorescent bright spots by using SYTO 40 that stains nucleic acids present only in reticulocytes.
  • sample need not be limited to biomaterials, and may be an organic compound or an inorganic substance.
  • directions such as “upper surface”, “lower surface”, “upper”, and “lower” indicate relative directions that depend only on the positional relationship of the components of the sample detection plate, and are absolute such as the vertical direction. It does not indicate a specific direction.
  • sample detection plate according to one or more aspects has been described based on the embodiment, but the present disclosure is not limited to this embodiment. Unless it deviates from the gist of the present invention, various modifications conceived by those skilled in the art have been made in this embodiment, and forms constructed by combining components in different embodiments are also within the scope of one or more aspects. May be included.
  • the present disclosure can detect the external shape of the sample by detecting autofluorescence emitted from the first substrate by the electromagnetic wave applied to the sample detection plate using a detection apparatus including a fluorescence optical system. Therefore, the size, number, density, etc. of the sample can be easily obtained.

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Abstract

　本開示に係る試料検出プレート（１０）は、第一の面（１Ａ）を有する第一の基板（１）と、所定の波長の電磁波（８）を吸収する試料（３）が収容されるように第一の基板（１）の第一の面（１Ａ）に設けられる試料収容部（２）と、を有する。第一の基板（１）は、所定の波長の電磁波（８）により自家蛍光（９Ａ）を発する第一の材料を含む。

Description

試料検出プレート、これを用いた蛍光検出システム及び蛍光検出方法
　本発明は、試料の観察において蛍光検出システムに使用される試料検出プレート、試料検出プレートを用いた蛍光検出システム、及び、蛍光検出方法に関する。
　多数の細胞中から、病原菌等に感染した細胞や所定の様態を有する細胞を検出することは、特に、臨床現場等の医療の分野において重要である。所定の様態を有する細胞を検出方法として、例えば、特定のタンパク質や核等を蛍光色素を用いて蛍光標識し、蛍光観察光学系を備える顕微鏡で観察する方法がある。
　また、観察した細胞の感染率等を算出する場合、視野内の細胞の個数を計測する。細胞の個数を計測するためには、細胞の外形を検出し、細胞の内側と外側を識別する。細胞の外形を特定するための方法は、例えば、位相差観察光学系で撮像した位相差画像を用いる方法が知られている。また、蛍光標識された細胞の観察は、蛍光観察光学系で撮像した蛍光画像を用いる方法が知られている。
　尚、本出願の発明に関連する先行技術文献としては、例えば、特許文献１が知られている。
特開２００６－１８３９４号公報
　上述の通り、細胞の細菌等の感染率を求める場合、観察領域内の細胞の外形の検出と蛍光標識された細胞の検出を行う。従来の検出方法は、細胞の外形を検出するために位相差観察光学系を備えた顕微鏡を用いる。また、蛍光標識された細胞の検出するために蛍光観察光学系を備えた顕微鏡を用いる。そのため、細胞の外形の検出と蛍光標識された細胞の検出を行うためには、蛍光観察光学系の他に、位相差観察光学系が必要であるという課題がある。
　本開示は、上記の課題を解決するものであり、蛍光光学系を有し、位相差観察光学系をもたなくてもよい検出装置で試料の外形の検出が可能となる試料検出プレート、試料検出プレートを用いた蛍光検出システム及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために本開示に係る試料検出プレートは、第一の面を有する第一の基板と、所定の波長の電磁波を吸収する試料が収容されるように第一の基板の第一の面に設けられる試料収容部と、を有する。第一の基板は、所定の波長の電磁波により自家蛍光を発する第一の材料を含む。
　本開示の試料検出プレートは、試料検出プレートに照射された所定の波長の電磁波により基板が発する自家蛍光を、蛍光光学系を有する検出装置を用いて検出することにより、位相差観察光学系を用いることなく試料の外形の検出を行うことができる。
図１は、本開示の実施の形態による試料検出プレートを模式的に示した分解斜視図である。 図２は、本開示の実施の形態による蛍光検出システムの模式図である。 図３は、ヘモグロビンの電磁波吸収スペクトルを示すグラフである。 図４は、試料収容部内の蛍光観察画像を模式的に示す図である。 図５は、本開示の実施の形態における別の試料検出プレートを模式的に示した上面斜視図である。 図６は、本開示の実施の形態における別の試料検出プレートを模式的に示した上面斜視図と断面図である。 図７は、本発明の実施の形態における別の試料検出プレートを模式的に示した断面図である。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本発明を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　（実施の形態）
　本開示の実施の形態における試料検出プレートについて図１～図７を参照しながら説明する。
　図１は、試料検出プレート１０の構成を模式的に示す分解斜視図である。図２は、蛍光検出システム１５の構成の模式図である。図２に示される試料検出プレート１０は、断面図である。
　試料検出プレート１０は、例えば、蛍光光学系を有する検出装置で使用され、試料の外形の検出に用いられる。
　蛍光光学系は、検出装置に含まれ、対象物が発する蛍光を検出するために必要な構成のまとまりである。蛍光光学系は、例えば、検出装置に内蔵される光源、レンズ、ミラー及び受光部の一部、または全部を組み合わせて構成される。
　蛍光検出システム１５は、試料検出プレート１０と蛍光検出装置１１とで構成される。
　試料検出プレート１０は、第一の面１Ａと第一の面１Ａに背向する第二の面１Ｂとを有する第一の基板１と、所定の波長の電磁波８を吸収する試料３が収容されるように第一の基板１の第一の面１Ａに設けられた試料収容部２を有する。第一の基板１は、所定の波長の電磁波により自家蛍光９Ａを発する第一の材料からなる。また、試料検出プレート１０は、第一の面１Ａと対向する第二の基板４を有する。試料収容部２は、第一の基板１と第二の基板４に挟まれている。
　このような構成とすることにより、蛍光光学系を有する検出装置において、試料検出プレート１０に照射された電磁波８により第一の基板１が発する自家蛍光９Ａを検出することで、試料３の外形の検出を、位相差光学系を用いることなく容易に行うことができる。試料３は、例えば細胞や生体組織等である。
　以下、第一の基板１における第一の面１Ａを上面、第二の面１Ｂを下面として説明する。
　第一の基板１は、所定の波長の電磁波８により自家蛍光９Ａを発する第一の材料からなる。蛍光検出システム１５は、電磁波８に対する試料検出プレート１０の自家蛍光９Ａを受光して、試料３の外形を検出する。そのため、電磁波８に対して第一の基板１が発する自家蛍光９Ａの強度はある程度大きい方が望ましい。第一の基板１から発せられる自家蛍光９Ａの強度が大きいほど、蛍光検出システム１５は、試料３の輪郭の画像を鮮明に取得することができる。
　したがって、第一の基板１の第一の材料は、所定の波長の電磁波８により第一の基板１から発せられる自家蛍光の強度がガラスの自家蛍光の強度よりも大きい材料が好ましい。第一の材料は、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、シクロオレフィンコポリマー、アクリル、ポリジメチルシロキサン等の樹脂材料等である。特に、ポリカーボネートは、所定の波長の電磁波８に対して強度の大きい自家蛍光９Ａを発する。そのため、第一の基板１は、ポリカーボネートを含むことが望ましい。また自家蛍光９Ａの強度は、第一の基板１の材料の他、第一の基板１の厚み、第一の材料の含有量等を変更することにより調整可能である。
　第一の基板１の形状は、例えば、正方形や長方形、円盤形状など、検出装置の構成に合わせて自由に設定することができる。
　試料収容部２は、第一の基板１の上面側に設けられており、所定の波長の電磁波８を吸収する試料３を収容する。図１において、試料収容部２は、第一の基板１の上面に位置する一つの領域で構成される。試料収容部２は、例えば、第一の基板１にエッチングなどにより形成した窪みで構成することができる。また、第一の基板１は、平板に試料収容層を接着させたものでもよい。試料収容層は、例えば貫通孔を有する。この場合、試料収容部２は、試料収容層の貫通孔と平板で形成されるくぼみである。
　試料収容部２の大きさや、深さ、数は、試料の大きさや、検出装置の光源５、受光部７の大きさ等により決定される。試料収容部２に収容される試料３の数は、試料収容部２の大きさや深さをあらかじめ設定することで調整することができる。
　試料３は、試料収容部２の底面に一層となるように収容されることが望ましい。試料３が、試料収容部２内において積み重なった状態で収容されると、検出時に試料の形状を識別することが困難になる。
　試料検出プレート１０は、さらに第二の基板４を有する。第二の基板４は、試料収容部２を覆うように設けられた蓋としての機能を有する。第二の基板４を設けることにより、試料収容部２に収容された試料３が検出動作中に、試料収容部２から周囲に飛散することを防止することができる。なお、試料収容部２内の試料が飛散しなければ、第二の基板４は設けなくてもよい。また、試料収容部２として、第二の基板４に、又は、第一の基板１及び第二の基板４の両方に窪みを設けてもよい。
　蛍光検出装置１１は、蛍光光学系を有する。蛍光光学系は、光源５、ミラー６及び受光部７を含む。光源５は、所定の波長を有する電磁波８を放射する。電磁波８は、例えばレーザー等の励起光である。ミラー６は、光源５から放射される電磁波８を試料検出プレート１０に向けて反射する。また、ミラー６は、試料検出プレート１０から放射された蛍光９を透過する。受光部７は、ミラー６を透過した蛍光９を受光する。また、受光した蛍光９を用いて画像を生成する画像生成部１６を有してもよい。
　蛍光検出システム１５は、所定の波長の電磁波８により第一の基板１から発せられる自家蛍光９Ａを第一の基板１の上面の上方から検出する。試料検出プレート１０から発せられる自家蛍光９Ａを受光する受光部７は、第一の基板の上面の上方に設けられる。また、電磁波８を放射する光源５は、受光部７と同様に第一の基板１の上面の上方に設けられる。
　試料検出プレート１０は、第一の基板１の上面側に設けられた光源５から電磁波８が照射される。第一の基板１は、電磁波８により自家蛍光９Ａを発する第一の材料からなる。そのため、第一の基板１は、電磁波８の照射により自家蛍光９Ａを発する。第一の基板１より発せられた自家蛍光９Ａは、試料検出プレート１０の上面側に設けられた受光部７により受光される。また、試料収容部２に収容される試料３は、試料検出プレート１０に照射される電磁波８の一部を吸収する。
　なお、電磁波８を照射する光源５の場所は、第一の基板１の上面側に限られない。光源５は、例えば、第一の基板１の下面側に設けられても、側面側に設けられていてもよい。ただし、電磁波８が受光部７に直接入射する位置関係となる場合、蛍光観察画像のバックグラウンドの輝度が高まる可能性がある。この場合、受光部７に電磁波８を低減する波長選択性の光学フィルタ等を、さらに配置することが望ましい。
　所定の波長の電磁波８は、試料３の吸収波長スペクトルにより決定される。所定の波長の電磁波８を吸収する試料３とは、例えば、赤血球などである。図３は、赤血球に含まれるヘモグロビンの吸収波長スペクトルを示すグラフである。赤血球に含まれるヘモグロビンは、特に４５０ｎｍ以下の波長帯において、電磁波を強く吸収する。一方、紫外線領域を含む４００ｎｍ以下の波長帯では、生体材料に損傷を与える懸念がある。したがって、試料収容部２に収容される試料３が赤血球である場合、所定の波長の電磁波としては、４００ｎｍ～４５０ｎｍの波長を有する電磁波を用いることが好ましい。また、試料は赤血球に限る必要はなく、例えば葉緑素を有する植物細胞であっても良い。この場合、クロロフィルの吸収波長帯は４００ｎｍ～４５０ｎｍ前後であり、所定の波長の電磁波には、上記赤血球と同様に４００ｎｍ～４５０ｎｍ前後が好ましい。なお、試料３が吸収する電磁波は、光源から照射される電磁波８に限られない。例えば、試料３は、第一の基板１が発する自家蛍光９Ａを吸収してもよい。この場合、所定の波長の電磁波は、自家蛍光９Ａを意味する。
　蛍光検出システム１５において、第二の基板４を構成する第二の材料は、所定の波長の電磁波に対して自家蛍光を発しない材料、または、所定の波長の電磁波に対して第一の基板１から発せられる自家蛍光の蛍光強度よりも小さい蛍光強度の自家蛍光を発する材料であることが望ましい。第一の基板１から発せられる自家蛍光９Ａは、試料収容部２および第二の基板４を透過して受光部７で受光される。そのため、所定の波長の電磁波に対する第二の基板４からの自家蛍光の強度が第一の基板１からの自家蛍光の強度より大きいと、第一の基板１から発せられる自家蛍光により検出される試料３の輪郭が明るくぼやけてしまい、試料３の外形を検出することが難しくなるためである。そのため、第二の基板４の第二の材料としては、例えば、ガラスや樹脂等を用いることができる。第二の材料は透明な材料であることが好ましい。第二の材料に樹脂を用いる場合、第二の基板４は、第一の材料の自家蛍光の蛍光強度と比較して、自家蛍光の蛍光強度が小さい樹脂で構成されることが望ましい。
　図４は、試料収容部２内の蛍光観察画像１４を模式的に示した図である。蛍光観察画像１４において、試料３が捕捉された領域１２は暗く検出される。また、試料３が捕捉されていない領域１３は明るく検出される。試料３が捕捉されていない領域１３では、電磁波８による第一の基板１の自家蛍光９Ａが受光部７で受光されるため、明るく撮像される。試料３が捕捉された領域１２では、試料３が電磁波８を吸収するため、受光部７で受光される第一の基板１からの自家蛍光９Ａの強度が、試料３が捕捉されていない領域１３に比べて小さい。そのため、試料３が捕捉された領域１２は、暗部として撮像される。
　このような構成とすることにより、蛍光光学系を備えた蛍光検出装置１１を用いて、試料検出プレート１０に照射された電磁波８により第一の基板１が発する自家蛍光９Ａを検出することで、細胞の外形の検出を行うことができる。
　蛍光観察画像１４に含まれる複数個の試料を計数する場合、次の手法を利用することが出来る。まず、試料１個あたりの暗部の面積を取得する。試料１個あたりの暗部の面積は、予め既知の値であっても、観察者の作業もしくは画像処理により求めた値であっても良い。また、観察者の作業もしくは画像処理により求める場合は、複数試料の暗部の面積から、試料１個あたりの平均値を代表値として用いても良い。次に、蛍光観察画像１４における暗部の面積をヒストグラム等で求める。そして、これを試料１個あたりの暗部の面積で除する。この結果を、試料３の計数値として用いることが可能である。なお、暗部を抽出するための閾値は、適宜調整される。また、試料３において、周辺部よりも中心部の厚みが大きい場合、蛍光観察画像１４は、試料３の中心部に輝度の極小値を有することがある。試料３内において、電磁波の吸収量が異なることにより、蛍光観察画像１４では、試料３の中心部に輝度の極小値が見られる。この場合、蛍光観察画像１４にピークアナライズの手法を用いて、輝度の極小値となる点を探索することにより、試料３を計数することも可能である。なお、試料３内において、中心部に内容物が高濃度に分布している場合も、同様の理由により、蛍光観察画像１４に輝度の極小値が見られることがある。この場合も、同様の方法を用いて、試料３を計数することができる。
　また、上記では、所定の波長の電磁波８により自家蛍光９Ａを発する第一の基板１を単一のものとしたが、自家蛍光を発しない材料と発する材料を積層した構造であっても良い。例えば、自家蛍光を発するポリカーボネートの薄膜を、ガラス基板に塗布したような構造であっても、同様の効果が得られる。
　次に、試料検出プレート１０を用いた蛍光検出方法について説明する。
　蛍光検出方法は、試料検出プレート１０を準備し、試料３を試料検出プレート１０に収容し、第一の基板１の第一の面側から、所定の波長の電磁波８を、試料収容部２を通過させて第一の基板１に照射し、電磁波８により第一の基板１から発せられる自家蛍光９Ａを、試料収容部２を通して第一の基板１の第一の面側から受光し、受光した第一の基板１の自家蛍光９Ａを用いて画像を生成する。
　試料の収容において、試料３を、所定の波長の電磁波８により蛍光を発する蛍光色素を用いて染色する。例えば、試料が細胞である場合、核または細胞膜上のタンパク質を蛍光色素で染色することにより、蛍光検出装置１１を用いて、蛍光色素からの蛍光を同時に検出することができる。このとき、第一の基板１からの自家蛍光９Ａにより細胞の外形の検出と、蛍光色素からの蛍光により細胞内の核等の蛍光検出とを、同時に行うことができる。また、第一の基板１の自家蛍光の９Ａと蛍光色素が発する蛍光のそれぞれを励起する電磁波８の波長を略一致させておくことが好ましい。これにより、蛍光検出装置１１は、１波長で同時に細胞の外形の検出と蛍光色素による核等の蛍光検出を行うことができる。
　また、試料３は、蛍光色素を含んだ溶液と共に試料収容部２に収容されてもよい。この場合、溶液からも電磁波８による蛍光が生じるため、より試料３が捕捉されていない領域１３と試料が捕捉された領域１２との輝度の差を大きくし、試料３の外形を明確に区別することができる。このとき、溶液に含まれる蛍光色素が発する蛍光強度は、第一の基板１が発する自家蛍光９Ａの蛍光強度より大きいことが好ましい。
　また、生成した画像において、蛍光強度が所定の閾値より小さい領域を試料領域、蛍光強度が所定の閾値より大きい領域を背景領域として判別する。試料領域は、試料が捕捉された領域１２を示す。背景領域は、試料が捕捉されていない領域１３を示す。
　図５は、第１の変形例における試料検出プレート２０を模式的に示した上面斜視図である。試料検出プレート２０は、複数の試料収容部２２を基板２１上に設けた構成である。複数の試料収容部２２間を試料が通るように構成した流路２３は、基板２１上に設けられる。試料検出プレート２０は、流路２３を形成することにより、試料を試料収容部２２に容易に導入することができる。基板２１は、所定の波長の電磁波により自家蛍光を発する第一の材料を含む。
　図６は、第２の変形例における円盤形状の試料検出プレート３０の分解斜視図と断面図を示す。また、基板３１に設けられる試料収容部３２の拡大図を示す。試料検出プレート３０は、ＣＤやＤＶＤ等の光ディスクと同様に円盤形状であり、中心に円形状の孔３４が設けられている。試料検出プレート３０は、基板３１と、基板３１に設けられた試料収容部３２と、試料収容部３２を覆うように設けられた基板３３を有する。基板３１は、所定の波長の電磁波により自家蛍光を発する第一の材料を含む。なお、試料収容部３２は、上面視において円形であるがこれに限られない。
　基板３１は、基材３１ａと、試料収容層３１ｂとからなる。試料収容層３１ｂは、試料収容部３２が形成された層である。試料収容層３１ｂは、例えば樹脂で構成される。試料収容層３１ｂは、基材３１ａの上面に接着剤等で接合されている。自家蛍光９Ａを発する第一の材料は、基材３１ａに含まれる。なお、第一の材料は、試料収容層３１ｂに含まれていても、基材３１ａと試料収容層３１ｂの両方に含まれていてもよい。このように、試料検出プレート３０を円盤形状とすることにより、既存の光ピックアップ装置と同様の構成を備える検出装置を用いて、試料の検出を行うことができる。なお、既存の光ピックアップ装置は、ＣＤやＤＶＤ、ブルーレイディスクの再生等に用いられる装置である。試料検出プレート３０において、蛍光光学系を含む光ピックアップ装置が基板３１の上部にある場合、受光部は、基板３１が所定の波長の電磁波により発する自家蛍光を受光する。そのため、基板３３が発する自家蛍光の強度は、基板３１の自家蛍光の強度よりも小さいことが望ましい。つまり、基板３１は、基板３３の上面側に設けられた光源から照射される電磁波により自家蛍光を発する第一の材料からなる。また、基板３３は、所定の波長の電磁波に対して基板３１から発せられる自家蛍光の蛍光強度よりも小さい蛍光強度の自家蛍光を発する第２の材料であることが望ましい。
　図７は、第３の変形例における蛍光検出システム４５を示す。蛍光検出システム４５が蛍光検出システム１５と異なる点は、蛍光検出装置１１が、試料検出プレート４０の基板４１の下面の下方に設けられることである。この場合、光源５から放射される電磁波８は、試料収容部４２を通って基板４４に照射される。そして、受光部７は、基板４４が発する自家蛍光９Ａを受光する。そのため、試料検出プレート４０において、基板４４は、所定の波長の電磁波８により自家蛍光９Ａを発する第一の材料で構成される。基板４１は、所定の波長の電磁波８により発する自家蛍光の蛍光強度が、第一の材料よりも小さい第二の材料で構成されることが望ましい。所定の波長の電磁波を吸収する試料４３が収容される試料収容部４２は、基板４１の上面に設けられる。基板４４は、試料収容部４２を覆うように基板４１に対向して設けられる。つまり、試料収容部４２は基板４４の下面に設けられる。所定の波長の電磁波８により基板４４から発せられる自家蛍光９Ａは、試料収容部４２を通って受光部７で検出される。つまり、基板４４は、図２に示す第一の基板１の機能を有する。また、基板４１は、図２に示す第二の基板４の機能を有する。
　このような構成とすることにより、蛍光光学系を有する蛍光検出装置１１において、試料検出プレート４０に照射された電磁波８により基板４４が発する自家蛍光９Ａを検出することで、細胞の外形を検出することができる。
　また、試料４３のタンパク質や核を蛍光試料で染色することにより、細胞の蛍光検出を同時に行うことができる。
　なお、光源５の位置は、試料検出プレート４０の基板４１の下面側に限定されない。例えば、光源５は、基板４１の上面側に設けられる構成であっても、側面側に設けられる構成であってもよい。
　同様にして、試料検出プレート３０において、蛍光光学系を含む光ピックアップ装置が基板３１よりも下部にある場合には、受光部７は、基板３３が所定の波長の電磁波により発する自家蛍光を受光する。そのため、基板３１が発する自家蛍光の強度は、基板３３の自家蛍光の強度よりも小さいことが望ましい。つまり、基板３３は、基板３１の下面側に設けられた光源から照射される電磁波により自家蛍光を発する第一の材料からなる。また、基板３１は、所定の波長の電磁波に対して基板３３から発せられる自家蛍光の蛍光強度よりも小さい蛍光強度の自家蛍光を発する第２の材料であることが望ましい。試料検出プレート２０においても同様である。つまり、基板３３は、図２に示す第一の基板１の機能を有する。また、基板２１、３１は、図２に示す第二の基板４の機能を有する。
　本開示における試料検出プレートを用いることにより、検出装置は、試料の輪郭が鮮明な撮像画像を取得することができる。そのため、撮像画像を画像処理することにより、試料の外形を検出でき、観察画像内の試料の大きさや数を容易に求めることができる。
　なお、複数種類の生体材料が混在する試料においては、蛍光標識を施し、試料のうち少なくとも１種類以上の生体材料を特異に蛍光させることで、細胞の外形の検出に加え、混在する試料の識別を容易に行うことが可能となる。例えば、細胞核を有するマラリア原虫と、細胞核を有さない赤血球の混在する試料に対し、核酸染色色素であるＤＡＰＩやＳＹＴＯ４０などにより標識を施すことで、試料はマラリア原虫だけが特異的に蛍光する状態となる。この試料を本発明における試料検出プレートを用いて蛍光観察することにより、マラリア原虫は蛍光輝点として検出され、赤血球は暗い外形として検出される。この場合、基板で生じる自家蛍光の強度が、マラリア原虫における蛍光輝点の強度よりも小さくなるよう、蛍光色素および基板の材料を選定すれば良い。具体的には、蛍光輝点の強度が、基板の自家蛍光の強度に比べて２倍以上であることが望ましく、各材料の量子収率および蛍光波長、光学系における検出効率を指標として決定される。これにより、観察される蛍光画像において、基板における自家蛍光の強度より明るい部分をマラリア原虫と識別し、暗い部分を赤血球と識別することが可能となる。
　また、生体材料または蛍光色素の種類は上記の組合せに限らない。例えば、赤血球と網赤血球の混在する試料でも良く、この場合、網赤血球にのみ存在する核酸を染色するＳＹＴＯ４０を用いることで、網赤血球が蛍光輝点として識別できるようになる。
　さらに、前記試料は生体材料に限定される必要はなく、有機化合物や無機物であっても構わない。
　なお、蛍光光学系を用いて細胞の外形を検出する方法として、細胞膜を蛍光色素により染色する方法がある。しかしながら、この方法では、細胞膜を染色する工程が必要になり、操作が煩雑になる。一方、本開示の試料検出プレート１０を用いると、細胞膜の蛍光色素による染色を必要としないため、簡単な操作で細胞の外形を検出できる。また、蛍光色素による細胞へのダメージも無くすことができる。
　なお、本発明において、「上面」「下面」「上方」「下方」等の方向を示す用語は試料検出プレートの構成要素の位置関係にのみ依存する相対的な方向を示し、鉛直方向等の絶対的な方向を示すものではない。
　以上、一つまたは複数の態様に係る試料検出プレートについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、一つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
　本開示は、蛍光光学系を備えた検出装置を用いて、試料検出プレートに照射された電磁波により第一の基板が発する自家蛍光を検出することで、試料の外形の検出を行うことができる。そのため、試料の大きさや数、密度等を容易に求めることができる。
　１　第一の基板
　１Ａ　第一の面
　１Ｂ　第二の面
　２、２２、３２、４２　試料収容部
　３、４３　試料
　４　第二の基板
　５　光源
　６　ミラー
　７　受光部
　８　電磁波
　９　蛍光
　９Ａ　自家蛍光
　１０、２０、３０、４０　試料検出プレート
　１１　蛍光検出装置
　１２　試料が捕捉された領域
　１３　試料が捕捉されていない領域
　１４　蛍光観察画像
　１５、４５　蛍光検出システム
　１６　画像生成部
　２１、３１、３３、４１、４４　基板
　２３　流路
　３１ａ　基材
　３１ｂ　試料収容層
　３４　孔

Claims (14)

  1. 　第一の面を有する第一の基板と、
    　所定の波長の電磁波を吸収する試料が収容されるように前記第一の基板の前記第一の面に設けられる試料収容部と、を備え、
    　前記第一の基板は前記所定の波長の電磁波により自家蛍光を発する第一の材料を含む試料検出プレート。
  2. 　前記第一の基板の前記第一の面と対向して設けられる第二の基板を備え、
    　前記試料収容部は、前記第一の基板および前記第二の基板によって挟まれる請求項１に記載の試料検出プレート。
  3. 　前記第二の基板は、前記所定の波長の電磁波により自家蛍光を発する第二の材料を含み、
    　前記第二の材料は、前記第一の材料が発する自家蛍光より蛍光強度の小さい自家蛍光を発する請求項２に記載の試料検出プレート。
  4. 　前記第二の基板は、透明な材料からなる請求項２または３に記載の試料検出プレート。
  5. 　前記第一の材料は、ポリカーボネートである請求項１～４の何れか１項に記載の試料検出プレート。
  6. 　前記試料収容部は、前記第一の基板に形成された凹部である請求項１～５の何れか１項に記載の試料検出プレート。
  7. 　前記試料収容部は、前記第二の基板に形成された凹部である請求項２～６の何れか１項に記載の試料検出プレート。
  8. 　前記試料収容部は複数個設けられる請求項１～７の何れか１項に記載の試料検出プレート。
  9. 　請求項１～８の何れか１項に記載の試料検出プレートと、
    　蛍光検出装置と、を備え、
    　前記蛍光検出装置は、
    　前記第一の基板の前記第一の面側から前記所定の波長の電磁波を放射する光源と、
    　前記第一の基板の前記第一の面側に設けられ、前記所定の波長の電磁波が照射されることにより前記第一の基板から発せられる自家蛍光を、前記試料収容部を通して受光する受光部と、
    　受光した自家蛍光を用いて画像を生成する画像生成部と、を備える蛍光検出システム。
  10. 　請求項１～８の何れか１項に記載の試料検出プレートを準備し、
    　前記試料を前記試料収容部に収容し、
    　前記第一の基板の前記第一の面側から、前記所定の波長の電磁波を、前記試料収容部を通過させて前記第一の基板に照射し、
    　前記電磁波により前記第一の基板から発せられる自家蛍光を、前記試料収容部を通して前記第一の基板の前記第一の面側から受光し、
    　前記受光した前記第一の基板の自家蛍光を用いて画像を生成する蛍光検出方法。
  11. 　前記収容において、前記試料を、前記所定の波長の電磁波により蛍光を発する蛍光色素を用いて染色する請求項１０に記載の蛍光検出方法。
  12. 　前記収容において、前記試料は溶液と共に前記試料収容部に収容され、
    　前記溶液中には前記蛍光色素を含み、
    　前記蛍光色素が発する蛍光強度は、前記第一の基板が発する前記自家蛍光の蛍光強度より大きい請求項１１に記載の蛍光検出方法。
  13. 　前記試料は赤血球であり、
    　前記所定の波長は、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以下である請求項１０～１２の何れか１項に記載の蛍光検出方法。
  14. 　生成した前記画像において、前記蛍光強度が所定の閾値より小さい領域を試料領域、前記蛍光強度が所定の閾値より大きい領域を背景領域として判別する請求項１０～１３の何れか１項に記載の蛍光検出方法。
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