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WO2015186770A1 - ＣＫＡＰ５遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ医薬組成物 - Google Patents

ＣＫＡＰ５遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ医薬組成物 Download PDF

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WO2015186770A1
WO2015186770A1 PCT/JP2015/066134 JP2015066134W WO2015186770A1 WO 2015186770 A1 WO2015186770 A1 WO 2015186770A1 JP 2015066134 W JP2015066134 W JP 2015066134W WO 2015186770 A1 WO2015186770 A1 WO 2015186770A1
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WO
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enyl
compound
octadeca
lipid
double
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PCT/JP2015/066134
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English (en)
French (fr)
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隼人 藪内
佳奈 栗原
亜由美 山田
径子 中橋
剣太朗 畑中
志保 戸村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Kirin Co Ltd
Dicerna Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Dicerna Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Priority to EP15803771.3A priority patent/EP3153172A4/en
Priority to KR1020167035830A priority patent/KR20170012366A/ko
Priority to AU2015269485A priority patent/AU2015269485A1/en
Priority to CN201580029697.8A priority patent/CN106456661A/zh
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    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to a composition that suppresses CKAP5 gene expression, a pharmaceutical comprising the composition, and the like.
  • Cytoskeleton-associated protein 5 is a protein that interacts with microtubules and is encoded by the CKAP5 gene in humans (“DNA Res”, Volume 2, p.37-43, “European Journal” Eur J Biochem “, Vol. 234, p.406-13," Entrez Gene (NCBI (National Center for Biotechnology information) Gene database): CKAP5 cytoskeleton associated protein 5 ").
  • CKAP5 is also known as ch-TOG, and XMAP215 is its homolog in Xenopus (see “Molecular Biology of the Cell”, Vol. 15, p. 1580-1590).
  • CKAP5 has been shown to have at least two functions in microtubule formation, one that inhibits the depolymerization of centromeric microtubules by MCAK (KIF2C) and the other that is also involved in the formation of centrosomes (See “Molecular and Cellular Biology”, Vol. 28, p. 7199-7211).
  • CKAP5 is also known to interact with TACC1, which is enhanced in breast cancer (“Oncogene”, Vol. 22, p. 8102-16, “Biochemical Journal (Biochem J), 363, p.195-200 ”,“ Entrez Gene (NCBI (National Center for Biotechnology information) Gene database): TACC1 transforming, acidic coiled-coil containing protein 1 ”).
  • CKAP5 is highly expressed in human liver cancer and colorectal cancer (see “Eurian Journal of Biochemistry”, Vol. 234, p. 406-13). It has been reported as a target candidate in multiple myeloma as well as RRM1, USP8, etc. (see “Cancer Res”, Vol. 72, p.757-68). From this background, CKAP5 is considered to be a good target for anticancer agents, but there is still no effective treatment for cancers targeting CKAP5.
  • RNAi RNA interference
  • RNAi has been extensively verified in in vivo tests, with effects in fetal animals using siRNAs of 50 base pairs or less (see US Patent Application Publication No. 2002/132788) and effects in adult mice (See International Publication No. 03/10180).
  • siRNA is administered intravenously to mouse fetuses, the effect of suppressing the expression of specific genes has been confirmed in the kidney, spleen, lung, pancreas, and liver organs (“Nature Genetics”, (See 2002, Vol. 32, Vol. 1, No. 1, p. 107-108).
  • CKAP5 siRNA is described in, for example, Patent Document 1.
  • Patent Document 2 discloses a pharmaceutical containing siRNA and, for example, 1,2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) and the like.
  • DLinDMA, etc. is a structurally similar cationic lipid, N- (2,3-di (9-), for the purpose of developing more flexible cationic lipids and thereby enhancing membrane fluidity of liposomes.
  • Patent Document 3 discloses a medicine containing siRNA and, for example, 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-1,3-dioxolane (DLin-K-DMA).
  • Patent Document 4 discloses, for example, trans-3,4-bis (((Z) -octadeca-9-enoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound I-3).
  • An object of the present invention is to provide a composition that suppresses CKAP5 gene expression, a pharmaceutical comprising the composition, and the like.
  • the present invention relates to the following (1) to (23).
  • Lipid particles are further represented by formula (II)
  • R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms
  • R 6 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, Monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons).
  • composition according to (1) above which is a lipid particle containing a cationic lipid.
  • R 4 and R 5 are identically dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3,7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14 -Trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15-tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl, (Z)- Tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -o
  • R 4 and R 5 are the same as tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (9Z, 12Z
  • the composition according to the above (2) which is) -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl.
  • R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy,
  • (6) The composition according to any one of (1) to (5), wherein R 3 is a hydrogen atom or methyl.
  • L 1 and L 2 are -O-CO-, and R 1 and R 2 are identically dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, tetracosyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl, (11Z, 14Z) -icosa- 11,14-dien
  • L 1 and L 2 are -CO-O-, and R 1 and R 2 are identically tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, henicosyl, tricosyl, (Z) -tridec-8-enyl, ( (Z) -pentadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-10-enyl, ( 8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -heptadeca-8,11,14-trienyl, (Z) -nonadec-10-enyl, (10Z, 13Z) -nonadec-10 , 13-dienyl, (11Z, 14Z)
  • composition according to any one of (1) to (8) which contains a nucleic acid.
  • Cationic lipid forms a complex with the double-stranded nucleic acid, or forms a complex with a combination of neutral lipid and / or polymer and the double-stranded nucleic acid.
  • Cationic lipid forms a complex with the double-stranded nucleic acid, or forms a complex with a combination of neutral lipid and / or polymer and the double-stranded nucleic acid
  • (13) The method according to (12) above, wherein the cell is a cell in a mammalian tumor.
  • the method according to (12) above, wherein the cell is a cell in the large intestine, pancreas, stomach, small intestine, liver or esophagus of a mammal.
  • the method according to any one of the above (12) to (14), wherein the method of introducing into cells is a method of introducing into cells by intravenous administration.
  • the method of administration is intravenous administration.
  • a method for treating cancer comprising administering the composition according to any one of (1) to (11) to a mammal.
  • composition of the present invention can be administered to mammals to suppress CKAP5 gene expression in vivo and treat CKAP5-related diseases.
  • the amount of CKAP5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of MIAPaCa-2 xenograft mice each corresponding to siRNA 10 mg / kg of preparations 1-A to 1-B obtained in Example 1 is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA.
  • the relative value was calculated as a relative value to the saline using the amount of mRNA of HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) of each sample as an internal control as mRNA that is universally expressed when semi-quantifying the mRNA of CKAP5.
  • the amount of CKAP5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of the siRNA 1- 10 mg / kg equivalent of each of the preparations 1-C to 1-F obtained in Example 2 to MIAPaCa-2 xenograft mice is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA.
  • the relative value was calculated as a relative value to the saline using the amount of mRNA of HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) of each sample as an internal control as mRNA that is universally expressed when semi-quantifying the mRNA of CKAP5.
  • the amount of human CKAP5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of siRNA 10 mg / kg equivalent of each of preparations 1-D to 1-E obtained in Example 2 to MIAPaCa-2 xenograft mice is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA.
  • the relative value was calculated as a relative value to the saline using the amount of mRNA of HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) of each sample as an internal control as mRNA that is universally expressed when semi-quantifying the mRNA of CKAP5.
  • the amount of mouse CKAP5 mRNA in bone marrow cells 48 hours after administration of each of the preparations 1-D to 1-E obtained in Example 2 corresponding to siRNA 10 mg / kg to MIAPaCa-2 xenograft mice is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA.
  • the relative value was calculated as a relative value to the saline using the amount of mRNA of HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) of each sample as an internal control as mRNA that is universally expressed when semi-quantifying the mRNA of CKAP5.
  • HPRT1 hyperxanthine phosphoribosyltransferase 1
  • FIG. 6 shows the transition of the relative value of tumor volume when siRNA 10 mg / kg equivalent of preparation 1-B obtained in Example 3 was administered to MIAPaCa-2 xenograft mice on day 0 and day 7.
  • FIG. The vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • Each white circle represents a physiological saline administration group, and each black circle represents a preparation administration group.
  • the transition of the relative value of the tumor volume when siRNA 10 mg / kg equivalent amount of the preparation 1-D obtained in Example 3 was administered to the MIAPaCa-2 xenograft mouse on the 0th and 7th days is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • Each white circle represents a physiological saline administration group, and each black circle represents a preparation administration group.
  • FIG. 3 shows the transition of the relative value of tumor volume when siRNA 10 mg / kg equivalent of formulation 1-E obtained in Example 3 was administered to MIAPaCa-2 xenograft mice on day 0 and day 7.
  • the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • Each white circle represents a physiological saline administration group, and each black circle represents a preparation administration group.
  • FIG. 6 shows the transition of the relative value of the tumor volume when MIAPaCa-2 xenografted mice were administered on day 0 and day 7 with an equivalent amount of siRNA 10 mg / kg of preparation 1-G obtained in Example 3.
  • FIG. The vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • Each white circle represents a physiological saline administration group, and each black circle represents a preparation administration group.
  • Relative tumor volume when siRNA 10 mg / kg equivalent of formulation 1-A ′ and 1-B ′′ obtained in Example 4 was administered to MIAPaCa-2 xenografted mice on day 0 and day 7 Shows the transition of values.
  • the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • the white circles indicate the physiological saline administration group, the black circles indicate the preparation 1-A ′, and the dark black triangles indicate the preparation 1-B ′′ administration group.
  • MIAPaCa-2 xenograft mice were treated with siRNA 10 mg / kg equivalent of formulation 1-B '' ', 1-C' 'and 1-E' 'obtained in Example 5 on day 0 and day 7. The transition of the relative value of the tumor volume at the time of administration is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • the white circles represent the physiological saline administration group
  • the black circles represent the preparation 1-E ′′
  • the black triangles represent the preparation 1-B ′′ administration group
  • the black squares represent the 1-C ′′ administration group.
  • MIAPaCa-2 xenograft mice were treated with siRNA 10 mg / kg equivalent to preparations 1-B '' ', 1-D' 'and 1-F' 'obtained in Example 5 on day 0 and day 7.
  • the transition of the relative value of the tumor volume at the time of administration is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
  • the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
  • the white circles represent the physiological saline administration group
  • the black circles represent the preparation 1-D ′′
  • the black triangles represent the preparation 1-B ′′ administration group
  • the black squares represent the 1-F ′′ administration group.
  • the present invention provides a composition comprising a double-stranded nucleic acid having the ability to reduce or stop the expression of the CKAP5 gene as a drug, and lipid particles containing a cationic lipid. Also provided is a method for treating a CKAP5-related disease by administering the composition to a mammal to suppress CKAP5 gene expression in vivo.
  • the present invention treats or prevents hyperproliferative diseases or disorders (e.g., leukemia, melanoma, celloma, cancer, tumor, adenoma) or one or more angiogenic diseases associated with inappropriate CKAP5 gene expression.
  • a method for providing is also provided.
  • the lipid particles in the composition of the present invention have the formula (I)
  • R 1 and R 2 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms, L 1 and L 2 are the same or different and are —CO—O— or —O—CO—, a and b are the same or different and are 1 to 3, R 3 is a hydrogen atom, an alkyl having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl having 3 to 6 carbon atoms).
  • the compound represented by the formula (I) may be referred to as the compound (I). The same applies to the compounds of other formula numbers.
  • the lipid particles in the composition of the present invention include the compound (I) and the formula (II)
  • R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms
  • R 6 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, Monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons). It is a lipid particle containing a cationic lipid.
  • examples of the linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3, 7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15 -Tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl and the like.
  • the linear or branched alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
  • the linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
  • R 1 and R 2 are preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms.
  • R 1 and R 2 are more preferably linear or branched alkyl or alkenyl having 12 to 24 carbon atoms, and further preferably linear alkenyl having 12 to 24 carbon atoms. .
  • examples of the linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3, 7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15 -Tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl and the like.
  • the linear or branched alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
  • the linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
  • the alkynyl in the form of a ring may be used, and examples thereof include dodeca-11-ynyl, tetradec-6-ynyl, hexadec-7-ynyl, hexadec-5,7-diynyl, octadec-9-ynyl and the like.
  • R 4 and R 5 are preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms.
  • R 4 and R 5 are more preferably linear or branched alkyl or alkenyl having 12 to 24 carbon atoms, and further preferably linear alkenyl having 12 to 24 carbon atoms. .
  • examples of the alkyl having 1 to 6 carbon atoms include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, cyclopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, Cyclobutyl, cyclopropylmethyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, neopentyl, tert-pentyl, cyclopentyl, hexyl, cyclohexyl and the like, preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl Examples include butyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, tert-pentyl, neopentyl, hexyl, and more preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, cycl
  • alkenyl having 3 to 6 carbon atoms examples include allyl, 1-propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, and preferably allyl.
  • alkyl moiety in the substituted alkyl having 1 to 6 carbons and the alkenyl moiety in the substituted alkenyl having 3 to 6 carbons are as defined above for the alkyl having 1 to 6 carbons and the alkenyl having 3 to 6 carbons, respectively. .
  • a hydrogen ion may be coordinated to a lone pair on the nitrogen atom in the structure, and the nitrogen atom coordinated with the hydrogen ion is a pharmaceutically acceptable anion.
  • the compound (I) and the compound (II) also include a compound in which a hydrogen ion is coordinated to a lone electron pair on the nitrogen atom.
  • pharmaceutically acceptable anions include inorganic ions such as chloride ion, bromide ion, nitrate ion, sulfate ion and phosphate ion, acetate ion, oxalate ion, maleate ion, fumarate ion and citrate ion.
  • organic acid ions such as benzoate ion and methanesulfonate ion.
  • pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl and piperidin-4-yl are respectively those in which the hydrogen atom bonded on the nitrogen atom in the ring is converted to methyl or ethyl Is included.
  • monoalkylamino and dialkylamino one each and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above) or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl Alternatively, it may be any amino substituted with alkyl having 1 to 6 carbon atoms substituted with morpholinyl (as defined above), such as methylamino, ethylamino, propylamino, butylamino, pentylamino, hexylamino, dimethylamino, Diethylamino, ethylmethylamino, methylpropylamino, butylmethylamino, methylpentylamino, hexylmethylamino, aminoethylamino, aminopropylamino, (aminoethyl) methylamino, bis (aminoethy
  • amino, monoalkylamino, and dialkylamino each form a hydrogen ion coordinated to a lone pair of electrons on the nitrogen atom to form an ammonio, monoalkylammonio, and dialkylammonio.
  • Amino, monoalkylamino and dialkylamino include ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio, respectively.
  • an ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio in which a hydrogen ion is coordinated to a lone pair of electrons on the nitrogen atoms of amino, monoalkylamino and dialkylamino are pharmaceutically acceptable anions (as defined above). ) And a salt.
  • Alkoxy includes alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or alkyl having 1 to 6 carbon atoms substituted with amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl (as described above). Hydroxy) substituted with the same meaning), for example, methoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, pentyloxy, hexyloxy, aminoethoxy, methylaminoethoxy and the like, preferably methoxy, ethoxy, aminoethoxy, methylamino And ethoxy.
  • monoalkylcarbamoyl and dialkylcarbamoyl one each and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl Or carbamoyl substituted with morpholinyl-substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), for example, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, propylcarbamoyl, butylcarbamoyl, pentylcarbamoyl, hexylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, Diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, methylpropylcarbamoyl, butylmethylcarbamoyl, methylpentyl
  • R 1 and R 2 are the same or different and dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, tetracosyl, ( (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, ( Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl (11Z, 14Z) -icos
  • L 1 and L 2 when it is -CO-O-, R 1 and R 2 are the same or different tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, henicosyl, tricosyl, (Z) - trideca -8 -Enyl, (Z) -pentadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-10 -Enyl, (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -heptadeca-8,11,14-trienyl, (Z) -nonadec-10-enyl, (10Z, 13Z) -Nonadeca-10,13-dienyl, (11Z,
  • a and b are more preferably 1 at the same time. It is also a more preferred embodiment of the present invention that a and b are 1 at the same time, and L 1 and L 2 are —CO—O—.
  • R 1 and R 2 are preferably the same or different and are (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, more preferably the same (Z Most preferred is) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl.
  • R 3 is more preferably a hydrogen atom or methyl. It is also possible that a and b are 1, L 1 and L 2 are identically —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—, and R 3 is methyl,
  • R 1 and R 2 may be the same or different and are (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl. More preferably, it is most preferably (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl.
  • L 1 and L 2 are also preferably —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—. More preferably, R 1 and R 2 are the same or different and are (Z) -heptadeca-5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl, and preferably (Z)- Most preferred is heptadeca-5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl.
  • R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl.
  • R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different one to three amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl , Monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, preferably an alkyl having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, hydrogen atom, methyl or one amino, hydroxy or carbamoyl It is more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl group having 3 to 6 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, methyl or the like.
  • R 6 is a hydrogen atom, which is one of the more preferable embodiments of the present invention.
  • R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadec-9-enyl, (9Z , 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl, more preferably (Z) -hexadeca- Most preferred is 9-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
  • R 6 is methyl.
  • R 4 and R 5 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadec-9-enyl, (9Z , 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl, more preferably (Z) -hexadeca- Most preferred are 9-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
  • Compound (I) can be obtained by a method similar to the production method described in International Publication No. 2011/136368. If the defined group changes under the conditions of the production method or is inappropriate for carrying out the production method, a method for introducing and removing protecting groups commonly used in organic synthetic chemistry [for example, Protective Groups In-organic synthesis 3rd edition (Protective Group Organic Synthesis, third edition), by TWGreene, John Wiley & Sons Inc. (1999) etc.] to produce the target compound Can do. Further, the order of reaction steps such as introduction of substituents can be changed as necessary.
  • Manufacturing method 1 Compound (II) can be produced by the following method.
  • R 4 , R 5 and R 6 are as defined above, and Z is a chlorine atom, bromine atom, iodine atom, trifluoromethanesulfonyloxy, methanesulfonyloxy, benzenesulfonyloxy, p-toluenesulfonyl) (Represents a leaving group such as oxy)
  • Step 1 and 2 Compound (IIIb) is obtained by reacting Compound (IIIa) and Compound (IVa) in the absence of a solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes. It can be produced by reacting for ⁇ 100 hours. Further, compound (II) is obtained by reacting compound (IIIb) and compound (IVb) in the absence of a solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. It can be produced by reacting for 5 minutes to 100 hours.
  • solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • Examples of the base include potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7- Undecene (DBU).
  • Compound (IIIa) is a commercially available product or a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Course 14 ⁇ Synthesis of organic compounds II '', 5th edition, p.351, Maruzen (2005)) or a method analogous thereto.
  • Compound (IVa) and Compound (IVb) are commercially available or known methods (e.g., 5th edition Experimental Chemistry Course 13 ⁇ Synthesis of organic compounds I '', 5th edition, p.374, Maruzen (2005)) Or it can obtain by the method according to it.
  • Compound (IIa) in the case where R 4 and R 5 are the same can be obtained by using 2 equivalents or more of compound (IVa) in Step 1.
  • R 6 is —CHR A R B (wherein R A and R B are the same or different and each represents a hydrogen atom, an alkyl having 1 to 5 carbon atoms, an alkenyl having 2 to 5 carbon atoms, or pyrrolidine.
  • R a and R B are, it is identical to the hydrogen atom Except for cases, alkyl of R A and R B, the alkyl moiety of the substituted alkyl, the total number of carbon atoms of the alkenyl moiety of alken
  • Compound (IIb) is compound (IIc) in which R 6 of compound (II) is a hydrogen atom, preferably 1 to 10 equivalents of compound (V), and preferably 1 to a large excess amount in a solvent. It can be produced by reacting at a temperature between ⁇ 20 ° C. and 150 ° C. for 5 minutes to 72 hours in the presence of a reducing agent and preferably 1 to 10 equivalents of an acid.
  • Examples of the solvent include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • Examples of the reducing agent include sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride and the like.
  • Examples of the acid include hydrochloric acid and acetic acid.
  • Compound (V) is a commercially available product or a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Lecture 15 ⁇ Synthesis of Organic Compounds III '', 5th edition, p.1, Maruzen (2005), 5th edition experimental chemistry. Lecture 15 “Synthesis of Organic Compounds III”, 5th Edition, p.153, Maruzen (2005)) or similar.
  • R 6 is —CH 2 —C (OH) R C R D (wherein R C and R D are the same or different and are a hydrogen atom, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, carbon number 2-4 alkenyl, pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-2-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, morpholin-2-yl, morpholin-3-yl or the same or 1 to 4 carbon atoms substituted with 1 or 2 amino, monoalkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, or 2 to a 4 alkenyl, R C and R D are, except when the same hydrogen atom, alkyl of R C and R D, substituted alkyl
  • Compound (IId) can be produced by reacting compound (IIc) and compound (VI) in a solvent or without solvent at a temperature between 0 ° C. and 230 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
  • the solvent include methanol, ethanol, 1-propanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide. , N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide and the like, and these may be used alone or in combination.
  • Compound (VI) is obtained as a commercial product or obtained by a known method (for example, 5th edition Experimental Chemistry Course 17 “Synthesis of Organic Compounds V”, 5th edition, p.186, Maruzen (2005)) or in conformity thereto. be able to.
  • Conversion of the functional group contained in R 4 , R 5 or R 6 in compound (II) can be carried out by a known method (for example, Comprehensive Organic Transformations 2nd edition, RC Larock (Larock ), A method described in Vch Verlagsgesellschaft Mbh (1999), etc.] or in accordance with them.
  • the intermediates and target compounds in each of the above production methods are isolated and purified by separation and purification methods commonly used in synthetic organic chemistry, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, and various chromatography. be able to.
  • the intermediate can be subjected to the next reaction without any particular purification.
  • compounds (I) and (II) there may be stereoisomers such as geometric isomers and optical isomers, tautomers, etc., but compounds (I) and (II) Includes all possible isomers, including these, and mixtures thereof.
  • Some or all of the atoms in compound (I) and compound (II) may be replaced with the corresponding isotope atoms, respectively, and compound (I) and compound (II) are replaced with these isotope atoms.
  • the compound is also included.
  • some or all of the hydrogen atoms in the compounds (I) and (II) may be hydrogen atoms having an atomic weight of 2 (deuterium atoms).
  • a compound in which part or all of each atom in compound (I) and compound (II) is replaced with the corresponding isotope atom is produced by a method similar to the above production method using a commercially available building block. can do.
  • compounds in which some or all of the hydrogen atoms in the compounds (I) and (II) are replaced with deuterium atoms include, for example, alcohols, carboxyls using iridium complexes as catalysts and deuterium as a deuterium source. It can also be synthesized using a method of deuterating an acid or the like [Journal of American Chemical Society (see J. Am. Chem. Soc.), Vol. 124, No. 10, 2092 (2002)].
  • the double-stranded nucleic acid as a drug used in the present invention is a double-stranded nucleic acid having the ability to reduce or stop the expression of the CKAP5 gene when introduced into a mammalian cell,
  • the double-stranded nucleic acid may be any molecule as long as it is a double-stranded molecule obtained by polymerizing nucleotides and / or molecules having functions equivalent to the nucleotides, such as RNA that is a polymer of ribonucleotides, Examples include DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotides, chimeric nucleic acids composed of RNA and DNA, and nucleotide polymers in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide.
  • a derivative containing at least one molecule obtained by polymerizing a nucleotide and / or a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide as a constituent unit is also included in the double-stranded nucleic acid of the present invention.
  • PNA peptide nucleic acids
  • OPNA oxypeptide nucleic acids
  • PRNA peptide ribonucleic acids
  • uridine U in RNA and thymine T in DNA can be replaced with each other.
  • nucleotide derivatives examples include nucleotide derivatives.
  • the nucleotide derivative may be any molecule as long as it is a modified nucleotide. For example, it improves nuclease resistance or stabilizes from other degradation factors compared to naturally-occurring RNA or DNA.
  • a molecule in which ribonucleotides or deoxyribonucleotides are modified is preferably used.
  • nucleotide derivatives include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides, and the like.
  • the sugar-modified nucleotide any or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide may be modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom.
  • '-Modified nucleotides are preferably used.
  • Examples of the modifying group in the sugar moiety-modified nucleotide include 2′-cyano, 2′-alkyl, 2′-substituted alkyl, 2′-alkenyl, 2′-substituted alkenyl, 2′-halogen and 2′-O-cyano.
  • a crosslinked structure-type artificial nucleic acid having a structure in which the modifying group at the 2 ′ position is crosslinked to the carbon atom at the 4 ′ position, more specifically, the oxygen atom at the 2 ′ position and the 4 ′ position Locked Nucleic Acid (LNA) in which the carbon atom at the position is cross-linked via methylene, and Ethylene bridged nucleic acid (ENA) (Nucleic Acid Research, 32 , e175 (2004)] and the like are also included in the nucleotides substituted with a modifying group at the 2 ′ position in the present invention.
  • BNA crosslinked structure-type artificial nucleic acid
  • 2′-cyano, 2′-fluoro, 2′-chloro, 2'-bromo, 2'-trifluoromethyl, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-O-isopropyl, 2'-O-trifluoromethyl, 2'-O- [2- (Methoxy) ethyl], 2'-O- (3-aminopropyl), 2'-O- [2- (N, N-dimethyl) aminooxy] ethyl, 2'-O- [3- (N, N -Dimethylamino) propyl], 2'-O- ⁇ 2- [2- (N, N-dimethylamino) ethoxy] ethyl ⁇ , 2'-O- [2- (methylamino) -2-oxoethyl], 2 '-Se-methyl and the like are more preferable, 2'-O-methyl, 2'-O-ethyl, 2'-fluoro
  • the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide can also define a preferred range based on its size, and the size corresponding to the size of -O-butyl is preferred from the size of fluoro, and the size of -O-methyl To a size corresponding to the size of -O-ethyl is more preferable.
  • Alkyl in the modifying group of the sugar-modified nucleotide is synonymous with alkyl having 1 to 6 carbon atoms in compound (II).
  • Alkenyl in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide has the same meaning as alkenyl having 3 to 6 carbon atoms in compound (II).
  • Examples of the halogen in the modifying group of the sugar-modified nucleotide include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
  • amino acids in amino acid residues include aliphatic amino acids (specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.), hydroxy amino acids (specifically, serine, threonine, etc.), acidic amino acids (specifically, Is aspartic acid, glutamic acid, etc.), acidic amino acid amide (specifically, asparagine, glutamine, etc.), basic amino acid (specifically, lysine, hydroxylysine, arginine, ornithine, etc.), sulfur-containing amino acid (specifically, Cysteine, cystine, methionine, etc.), imino acids (specifically, proline, 4-hydroxyproline, etc.) and the like.
  • aliphatic amino acids specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.
  • hydroxy amino acids specifically, serine, threonine, etc.
  • acidic amino acids specifically, Is aspartic
  • substituent in the modified group of the sugar-modified nucleotide and the substituted alkenyl include, for example, halogen (as defined above), hydroxy, sulfanyl, amino, oxo, -O-alkyl (the alkyl part of the -O-alkyl is -S-alkyl (the alkyl part of the -S-alkyl is the same as the alkyl), -NH-alkyl (the alkyl part of the -NH-alkyl is the same as the alkyl), dialkylaminooxy ( The two alkyl moieties of the dialkylaminooxy are the same or different and have the same meaning as the alkyl), dialkylamino (the two alkyl parts of the dialkylamino are the same or different and have the same meaning as the alkyl), dialkylaminoalkyleneoxy (the dialkylaminooxy The two alkyl moieties of alkyleneoxy are the same or different and have
  • the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorodithioate bond
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with an alkylphosphonate bond a phosphate
  • Examples thereof include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond.
  • any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
  • oxygen atoms are substituted with sulfur atoms
  • hydrogen atoms are substituted with alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms
  • methyl groups are substituted with hydrogen atoms or alkyl groups with 2 to 6 carbon atoms
  • Examples thereof include those in which an amino group is protected with a protecting group such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • nucleotide derivative a nucleotide or sugar moiety
  • dyes and other chemical substances added examples include dyes and other chemical substances added.
  • 5'-polyamine-added nucleotide derivatives examples include a fluorescent dye-added nucleotide derivative, a Cy3 fluorescent dye-added nucleotide derivative, a 6-fluorescein (FAM) -added nucleotide derivative, and a biotin-added nucleotide derivative.
  • FAM 6-fluorescein
  • Nucleotide derivatives also form cross-linked structures such as alkylene structures, peptide structures, nucleotide structures, ether structures, ester structures, and combinations of at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in double-stranded nucleic acids. May be.
  • the double stranded nucleic acid has a sufficient length to be processed by Dicer to produce siRNA.
  • the double-stranded nucleic acid anneals to the sense strand under biological conditions, such as a sense strand, preferably between 26 and 30 nucleotides in length, and conditions found in the cytoplasm of the cell. Contains the antisense strand.
  • a double-stranded nucleic acid may have several characteristics that enhance its processing by Dicer.
  • the double stranded nucleic acid has a length sufficient to be processed by Dicer to produce siRNA and at least one, preferably all of the following properties: (i) the double stranded nucleic acid is asymmetric Yes, for example, with a 3 ′ overhang on the antisense strand. (ii) A nucleotide derivative (as defined above) is included at the 3 ′ end of the sense strand for Dicer binding and processing.
  • Suitable nucleotide derivatives include nucleotides such as deoxyribonucleotides, acyclonucleotides, and the like, and sterically crowded molecules such as fluorescent molecules and the like, preferably deoxyribonucleotides.
  • nucleotide derivatives are used, they are replaced with ribonucleotides in the double stranded nucleic acid so that the length of the double stranded nucleic acid does not change.
  • the sense strand contains a phosphate at the 5 ′ end. 5'-terminal containing phosphate is modified with a phosphate group or a group that can be converted to a phosphate group by a nucleolytic enzyme in vivo, etc. Has been.
  • double stranded nucleic acids preferably have one or more 2′-O-methyl modified nucleotides in the antisense strand, or the sense strand, or both strands.
  • the sense strand comprises 25-28 nucleotides, and the 2 nucleotides at the 3 ′ end of the sense strand are deoxyribonucleotides.
  • the sense strand contains a phosphate at the 5 ′ end.
  • the antisense strand contains 26-30 nucleotides and contains a 1-4 ′ 3 ′ overhang.
  • the antisense and sense strands have one or more 2′-O-methyl modified nucleotides.
  • the antisense strand comprises a phosphate at the 3 ′ end of the sense strand
  • the antisense strand comprises a phosphate at the 3 ′ end of the sense strand
  • the double-stranded nucleic acid used in the present invention includes derivatives in which an oxygen atom or the like contained in a phosphoric acid part, an ester part, or the like in the structure of the nucleic acid is substituted with another atom such as a sulfur atom.
  • the sugar that binds to the 5 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a 5′-position hydroxyl group, a phosphate group or the aforementioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
  • the sugar that binds to the 3 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a phosphate group or the above-mentioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo in each 3 ′ position. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
  • the double-stranded nucleic acid used in the present invention may be produced using a known RNA or DNA synthesis method and RNA or DNA modification method. Double stranded nucleic acids can be designed to interact with target sequences within the CKAP5 gene sequence. The sequence of one strand of a double stranded nucleic acid is complementary to the target site sequence described above. Double stranded nucleic acids can be chemically synthesized using the methods described herein. RNA may be produced enzymatically or by partial / total organic synthesis, and modified ribonucleotides can be introduced in vitro by enzymatic or organic synthesis. In one embodiment, each chain is prepared chemically.
  • RNA molecules are known in the art [see Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 32, p. 936-948].
  • double stranded nucleic acids can be synthesized by using solid phase oligonucleotide synthesis methods (e.g., Usman et al., U.S. Patent No. 5,804,683; U.S. Patent No. 5,831,071; U.S. Patents).
  • each single-stranded nucleic acid is determined by capillary electrophoresis (CE) on a Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif).
  • CE capillaries have an inner diameter of 100 ⁇ m and contain ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
  • ssDNA 100R Gel (Beckman-Coulter).
  • about 0.6 nmole of oligonucleotide is injected into the capillary and run in an electric field of 444 V / cm and detected by UV absorbance at 260 nm.
  • Denatured tris-borate-7M-urea running buffer is purchased from Beckman-Coulter.
  • Single-stranded nucleic acids are obtained that are at least 90% pure as assessed by CE for use in the experiments described below.
  • Compound identity is determined by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass on a Voyager DE.TM.Biospectometry workstation (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) According to the manufacturer's recommended protocol Validated by spectroscopy.
  • the relative molecular mass of single stranded nucleic acids can be obtained within 0.2% of the expected molecular mass.
  • Single-stranded nucleic acids are resuspended at a concentration of 100 ⁇ M in a buffer consisting of 100 mM potassium acetate, 30 mM HEPES, pH 7.5.
  • Complementary sense and antisense strands are mixed in equivalent molar amounts to obtain a final solution of 50 ⁇ M double stranded nucleic acid.
  • the sample is heated to 95 ° C. for 5 minutes and allowed to cool to room temperature before use.
  • Double-stranded nucleic acids are stored at -20 ° C.
  • Single stranded nucleic acids are lyophilized or stored at ⁇ 80 ° C. in nuclease-free water. Specific examples of the double-stranded nucleic acid used in the present invention are shown in Table 3.
  • sugars that bind to the bases with r, m, and d in the table are ribose, ribose in which the hydroxyl group at the 2 ′ position is substituted with —O-methyl, and deoxyribose, respectively.
  • the lipid particle in the present invention is a lipid particle containing compound (I), or compound (I) and compound (II), and a double-stranded nucleic acid.
  • compound (I), or compound (I) and Complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (I), or a combination of compound (I) and compound (II) with neutral lipid and / or polymer, and double-stranded nucleic acid Lipid particles containing a complex with the complex, lipid particles composed of the complex and a lipid membrane encapsulating the complex, and the like.
  • the lipid membrane may be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
  • the lipid membrane may contain compound (I), compound (II), neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
  • the lipid particles in the present invention include, for example, a complex of compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or a combination of compound (II) with a neutral lipid and / or polymer and a double-stranded nucleic acid. Examples also include a lipid particle comprising a complex and a lipid membrane encapsulating the complex, and containing the compound (I) in the lipid membrane.
  • the lipid membrane in this case may also be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
  • the lipid membrane may contain compound (II), neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
  • a complex of a double-stranded nucleic acid and a membrane composed of a lipid monolayer reverse micelle
  • a complex of a double-stranded nucleic acid and a liposome a double-stranded nucleic acid and a micelle
  • a complex of a double-stranded nucleic acid and a membrane composed of a lipid monolayer or a complex of a double-stranded nucleic acid and a liposome.
  • the lipid particles composed of the complex and a lipid bilayer encapsulating the complex include liposomes composed of the complex and a lipid bilayer encapsulating the complex.
  • the lipid particles may be one or more of compound (I) and compound (II), and compound (I) and / or compound (II) may be compound (I).
  • a cationic lipid other than compound (II) may be mixed.
  • Examples of cationic lipids other than compound (I) and compound (II) include, for example, DOTMA, DOTAP and the like disclosed in JP-A-61-161246 (US Pat. N- [1- (2,3-dioleyloxypropyl)]-N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide (DORIE), disclosed in US Pat. No.
  • Cationic lipids having a tertiary amine moiety having two unsubstituted alkyl groups or a quaternary ammonium moiety having three unsubstituted alkyl groups are more preferred.
  • Examples thereof include cationic lipids having the tertiary amine moiety.
  • the unsubstituted alkyl group at the tertiary amine moiety and the quaternary ammonium moiety is more preferably a methyl group.
  • the lipid particles in the present invention can be produced according to a known production method or similar methods, and may be produced by any production method.
  • a known liposome preparation method can be applied to the production of a liposome, which is one of lipid particles.
  • Known liposome preparation methods include, for example, Bangham et al.'S liposome preparation method ["Journal of Molecular Biology", 1965, Vol. 13, p.238-252] , Ethanol injection method ["Journal of Cell Biol.”, 1975, Vol. 66, pp. 621-634], French press method ["FEBS Letters”] , 1979, Vol. 99, pp. 210-214], freeze-thaw method [“Arch. Biochem.
  • liposomes for example, an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), for example, an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride can be added. is there.
  • an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride
  • Liposomes can also be produced by dissolving lipids or the like in an organic solvent such as ethanol and distilling off the solvent, and then adding physiological saline or the like and stirring to form liposomes.
  • the lipid particles in the present invention include, for example, compound (I), compound (I) and compound (II), cationic lipid other than compound (I) and compound (I) and compound (II) or compound (I) And cationic lipid other than compound (II) and compound (I) and compound (II) are dissolved in chloroform in advance, and then an aqueous solution of double-stranded nucleic acid and methanol are added and mixed to form a cationic lipid / double-stranded nucleic acid.
  • the chloroform layer is taken out and polyethylene glycolated phospholipid, neutral lipid and water are added to form a water-in-oil (W / O) emulsion, which is then processed by the reverse phase evaporation method.
  • a double-stranded nucleic acid is dissolved in an acidic aqueous electrolyte solution, lipid (in ethanol) is added, and the ethanol concentration is lowered to 20 v / v% to Preparing double-stranded nucleic acid-encapsulating liposomes, sizing filtration, After removing excess ethanol by dialysis, the pH of the sample is further increased and dialyzed to remove double-stranded nucleic acid adhering to the liposome surface (Japanese Patent Publication No. 2002-501511 and Biokimika Et Biophysica). Acta (Biochimica et Biophysica Acta, 2001, Vol. 1510, see pages 152-166) and the like.
  • lipid particles in the present invention a liposome composed of a complex and a lipid bilayer membrane encapsulating the complex is produced, for example, as described in WO 02/28367 and WO 2006/080118 It can be manufactured according to the method.
  • lipid particles in the present invention for example, compound (I) or compound (I) and complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (I) or compound (I) and compound (II) A complex of a combination of a neutral lipid and / or a polymer with a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, wherein the lipid membrane contains compound (I), compound (II), and / or Alternatively, lipid particles containing a cationic lipid other than compound (I) and compound (II), a complex of compound (II) and double-stranded nucleic acid, or compound (II) with neutral lipid and / or polymer A complex of a combination and a double-stranded nucleic acid and a lipid membrane that encapsulates the complex, lipid particles containing compound (I) or compound (I) and compound (II) in the lipid membrane, etc.
  • each complex is produced and dispersed without dissolving the complex in water or a 0-20% ethanol aqueous solution (solution A).
  • solution A ethanol aqueous solution
  • each lipid membrane component is dispersed in the ethanol aqueous solution. It can be obtained by dissolving (liquid B), mixing liquid A and liquid B, and adding water appropriately.
  • the compound (I), the compound (II), and the cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the liquid A and the liquid B may be used alone or in combination.
  • compound (I), or a complex of compound (I) and compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or compound (I), or compound (I) and compound (II) are included.
  • Lipid particles in the present invention include compound (I), or a complex of compound (I) and compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or compound (I), or compound (I) and compound (II). It is composed of a complex of a combination of a neutral lipid and / or polymer and a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I), compound (II) or compound (I ) And a lipid particle containing a cationic lipid other than compound (II), more preferably compound (I), or a complex of compound (I) and compound (II) and a double-stranded nucleic acid, or compound (I) Or a combination of compound (I) and compound (II) with a neutral lipid and / or polymer and a double-stranded nucleic acid, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the compound in the lipid membrane (I).
  • the lipid membrane contains compound (I) A lipid particle or compound (II) or a combination of compound (II) with a neutral lipid and a complex of a double-stranded nucleic acid and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I) And lipid particles containing compound (II) are more preferred.
  • the total number of molecules of compound (I) and compound (II) in the complex is preferably 0.5 to 4 times, more preferably 1.5 to 3.5 times the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. Is more preferably 2 to 3 times.
  • the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) and cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the complex is based on the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. It is preferably 0.5 to 4 times, more preferably 1.5 to 3.5 times, and even more preferably 2 to 3 times.
  • the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) in the lipid particle is the double chain.
  • the number is preferably 1 to 10 times, more preferably 2.5 to 9 times, and even more preferably 3.5 to 8 times the number of phosphorus atoms in the nucleic acid.
  • the total number of molecules of the compound (I) and the compound (II) and cationic lipids other than the compound (I) and the compound (II) in the lipid particles is based on the number of phosphorus atoms of the double-stranded nucleic acid. It is preferably 1 to 10 times, more preferably 2.5 to 9 times, and even more preferably 3.5 to 8 times.
  • Neutral lipids may be any of simple lipids, complex lipids or derived lipids, such as, but not limited to, phospholipids, glyceroglycolipids, sphingoglycolipids, sphingoids or sterols.
  • the lipid particles of the present invention contain neutral lipids, the total number of neutral lipid molecules is compound (I) and compound (II), and cationic lipids other than compound (I) and compound (II). Is preferably 0.1 to 1.8 times, more preferably 0.3 to 1.1 times, and still more preferably 0.4 to 0.9 times.
  • the lipid particles in the present invention may contain a neutral lipid in a complex, may be contained in a lipid membrane encapsulating the complex, or at least contained in a lipid membrane encapsulating the complex. More preferably, it is contained in both the complex and the lipid membrane encapsulating the complex.
  • phospholipids in neutral lipids include phosphatidylcholine (specifically soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), dimyristoylphosphatidylcholine).
  • EPC egg yolk phosphatidylcholine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • POPC palmitoyloleoylphosphatidylcholine
  • dimyristoylphosphatidylcholine dimyristoylphosphatidylcholine
  • DMPC dioleoylphosphatidylcholine
  • DOPC dioleoylphosphatidylcholine
  • phosphatidylethanolamine specifically distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE), dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE)), Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), 16-0-monomethyl PE, 16-0-dimethyl PE, 18-1-trans PE, palmitoyl oleoyl-phosphatidylethanolamine ( POPE), 1 -stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine (SOPE), etc.), glycerophospholipids (specifically phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, palmitoyloleoylphosphatidylglycerol (PO
  • Examples of the glyceroglycolipid in the neutral lipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
  • glycosphingolipid in the neutral lipid examples include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside, and the like.
  • Examples of the sphingoid in the neutral lipid include sphingan, icosasphingan, sphingosine, and derivatives thereof.
  • Derivatives include, for example, —NH 2 such as sphingan, icosasphingan, or sphingosine —NHCO (CH 2 ) xCH 3 (wherein x is an integer of 0 to 18, among which 6, 12 or 18 is preferred) And the like converted to.
  • sterols in neutral lipids include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, ⁇ -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol or 3 ⁇ - [N- (N ', N'-dimethyl Aminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and the like.
  • Neutral lipids preferably include phospholipids, sterols, and the like, more preferably phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and cholesterol, and still more preferably phosphatidylethanolamine, cholesterol, and combinations thereof.
  • macromolecules include proteins, albumin, dextran, polyfect, chitosan, dextran sulfate, such as poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyaspartic acid, styrene maleic acid copolymer, isopropylacrylamide-acrylpyrrolidone copolymer
  • examples thereof include one or more polymers such as a polymer, a polyethylene glycol-modified dendrimer, polylactic acid, polylactic acid polyglycolic acid, or polyethylene glycolated polylactic acid, or a salt thereof.
  • the salts in the polymer include, for example, metal salts, ammonium salts, acid addition salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like.
  • the metal salt include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt.
  • the ammonium salt include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
  • the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate or phosphate, and organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate or citrate.
  • organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
  • amino acid addition salts include addition salts such as glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid or lysine.
  • the lipid particles in the present invention preferably further contain a water-soluble polymer lipid derivative or fatty acid derivative.
  • the lipid derivative or fatty acid derivative of the water-soluble polymer may be contained in a complex, may be contained in a lipid membrane encapsulating the complex, and both the complex and the lipid membrane encapsulating the complex It is more preferable to contain.
  • the total number of molecules of the lipid derivative and fatty acid derivative of the water-soluble polymer is the compound (I) and the compound (II), and It is preferably 0.05 to 0.3 times, more preferably 0.07 to 0.25 times, more preferably 0.1 to 0.2 times the total number of cationic lipid molecules other than Compound (I) and Compound (II). Further preferred.
  • a water-soluble polymer lipid derivative or fatty acid derivative has a property that a part of the molecule binds to other constituents of the lipid particle by, for example, hydrophobic affinity, electrostatic interaction, etc., and the other part is a lipid particle.
  • a substance having a two-sided property which has a property of binding with a solvent at the time of manufacture, for example, by hydrophilic affinity, electrostatic interaction or the like, is preferable.
  • lipid derivatives or fatty acid derivatives of water-soluble polymers include polyethylene glycol, polyglycerin, polyethyleneimine, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyacrylamide, oligosaccharide, dextrin, water-soluble cellulose, dextran, chondroitin sulfate, chitosan, polyvinyl Pyrrolidone, polyaspartic acid amide, poly-L-lysine, mannan, pullulan, oligoglycerol and the like or their derivatives and neutral lipids, compound (I) or compound (II) listed in the definition of the lipid particles, Or, for example, those formed by binding with fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid or lauric acid, salts thereof, and the like, more preferably lipid derivatives such as polyethylene glycol derivatives, polyglycerin derivatives or the like Examples thereof include fatty acid derivatives and salts thereof, and more preferred are lipid derivatives
  • lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyethylene glycol derivatives include polyethylene glycolated lipids (specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
  • PEG-DSPE 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • PEG-DMPE Etc. 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • PEG-DMPE Etc. polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor EL, etc.
  • polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters specifically polyoxyethylene sorbitan monooleate, etc.
  • polyethylene glycol fatty acid esters etc.
  • PEG-DSPE and PEG-DMPE are preferred.
  • lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyglycerin derivatives include polyglycerinized lipids (specifically polyglycerin-phosphatidylethanolamine) and polyglycerin fatty acid esters, and more preferably polyglycerinized lipids. can give.
  • the lipid particles in the present invention can be optionally subjected to surface modification with, for example, a water-soluble polymer, a polyoxyethylene derivative, etc.
  • a water-soluble polymer for example, a water-soluble polymer, a polyoxyethylene derivative, etc.
  • a polymer that can be used for the surface modification include dextran, pullulan, mannan, amylopectin, and hydroxyethyl starch.
  • the polyoxyethylene derivative include polysorbate 80, Pluronic F68, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyoxyethylene lauryl alcohol, and PEG-DSPE.
  • the average particle size of the lipid particles in the present invention can be freely selected as desired, but is preferably the following average particle size.
  • a method for adjusting the average particle size for example, an extrusion method, a method of mechanically crushing large multilamellar liposomes (MLV) or the like (specifically using a manton gourin, a microfluidizer, etc.) [Müller (RH Muller), S. Benita, B. Bohm, “Emulsion and Nanosuspensions for the Soluble Drugs”, Germany, Germany Scientific Publishers Stuttgart (1998, see pages 267-294).
  • MLV multilamellar liposomes
  • the average size of the lipid particles in the present invention is preferably about 10 nm to 1000 nm, more preferably about 30 nm to 300 nm, and further preferably about 50 nm to 200 nm.
  • the double-stranded nucleic acid in the composition of the present invention can be introduced into cells by administering the composition of the present invention to mammalian cells.
  • the method of introducing the composition of the present invention into a mammalian cell in vivo may be performed according to known transfection procedures that can be performed in vivo.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is intravenously administered to mammals including humans, it is delivered to, for example, an organ or site in which cancer or inflammation has occurred, and the composition of the present invention is contained in the cells of the delivery organ or site.
  • the double-stranded nucleic acid can be introduced.
  • cancer or inflamed organs or sites include, but are not limited to, stomach, large intestine, pancreas, stomach, small intestine, liver, lung, spleen, kidney, bladder, skin, blood vessel, eyeball, esophagus, etc.
  • compositions of the present invention are intravenously administered to mammals including humans, so that it is delivered to, for example, blood vessels, liver, lungs, spleen and / or kidney, and the composition of the present invention is delivered into cells of a delivery organ or site.
  • a double-stranded nucleic acid in a product can be introduced.
  • Blood, liver, lung, spleen and / or kidney cells may be normal cells.
  • CKAP5-related diseases such as leukemia, melanoma, cell tumor, cancer Tumors, adenomas, etc.
  • the administration subject is preferably a human.
  • the composition of the present invention can also be used as a tool for verifying the effectiveness of suppressing the CKAP5 gene in an in vivo drug efficacy evaluation model relating to a therapeutic or preventive agent for cancer.
  • composition of the present invention When used as a therapeutic or prophylactic agent for cancer, it is desirable to use the most effective route for treatment, preferably intravenous administration or intramuscular administration. More preferred is intravenous administration.
  • the dose varies depending on the disease state, age, route of administration, etc. of the administration subject, but for example, it may be administered such that the daily dose converted to double-stranded nucleic acid is about 0.1 ⁇ g to 1000 mg.
  • preparations suitable for intravenous administration or intramuscular administration include injections, and lipid particle dispersions prepared by the above-described method can be used as they are, for example, in the form of injections.
  • the dispersion can be used after removing the solvent, for example, by filtration, centrifugation, etc., or the dispersion can be used after lyophilization, and / or an excipient such as mannitol, lactose, trehalose, maltose or glycine.
  • the added dispersion can be lyophilized for use.
  • injection is performed by mixing, for example, water, acid, alkali, various buffers, physiological saline or amino acid infusion, etc.
  • an injection can be prepared by adding an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
  • it can also be cryopreserved by adding a cryopreservation agent such as glycerin.
  • Methyldi ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound II-1) Methylamine (Aldrich, approx. 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.5 mL, 21.0 mmol) was added to (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate , Inc), 1.03 g, 3.00 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 150 ° C. for 90 minutes using a microwave reactor.
  • reaction solution is diluted with ethyl acetate, washed with 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and then with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give methyl ((9Z, 12Z) -octadeca A crude product of -9,12-dienyl) amine was obtained.
  • the crude product obtained was (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 0.93 g, 2.70 mmol) and 50% aqueous sodium hydroxide (0.960 g, 12.0 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 135 ° C. for 60 minutes in an oil bath. After cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed with water and then with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • Reference example 2 Methyldi ((Z) -hexadec-9-enyl) amine (Compound II-2)
  • methylamine manufactured by Aldrich, approximately 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.0 mL, 20.0 mmol
  • (Z) -hexadec-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc.
  • Compound II-2 (0.491 g, 51.6%) was obtained using 1.21 g, 3.80 mmol).
  • Reference example 3 Methyldi ((11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl) amine (Compound II-3)
  • methylamine manufactured by Aldrich, about 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 16.0 mL, 32.0 mmol
  • (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl methanesulfonate (Nu- Chek Prep, Inc., 2.98 g, 8.00 mmol) was used to obtain compound II-3 (1.27 g, 54.4%).
  • Reference example 4 Di ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound II-4)
  • ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., approximately 2 mol / L methanol solution, 18.0 mL, 36.0 mmol
  • (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu -Chek Prep, Inc., 2.79 g, 8.10 mmol) was used to obtain compound II-4 (0.838 g, 36.2%).
  • Reference Example 5 Di ((Z) -octadeca-9-enyl) amine (Compound II-5)
  • ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., about 2 mol / L methanol solution, 12.0 mL, 24.0 mmol
  • Z) -octadeca-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 1.87 g, 5.40 mmol) was used to obtain compound II-5 (0.562 g, 36.2%).
  • Reference Example 11 trans-1-Methyl-3,4-bis (((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound I-3)
  • Compound I-2 80 mg, 0.12 mmol obtained in Reference Example 10 was dissolved in 1,2-dichloroethane (1.5 mL) and methanol (1.5 mL), and formaldehyde (0.091 mL, 1.22 mmol), sodium triacetoxy was dissolved.
  • Borohydride manufactured by Acros Organics, 129 mg, 0.610 mmol
  • This suspension was passed through a 0.2 ⁇ m polycarbonate membrane filter and a 0.05 ⁇ m polycarbonate membrane filter at room temperature to obtain a dispersion of lead particles.
  • the average particle size of the lead particles obtained with a particle size measuring device Zetasizer Nano ZS, manufactured by Malvern Instruments) was measured and confirmed to be within the range of 30 nm to 100 nm.
  • a dispersion of lipid / double-stranded nucleic acid complex particles was prepared.
  • a solution of lipid membrane constituents was prepared. After heating the resulting lipid membrane component solution, the resulting dispersion of cationic lipid / double-stranded nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and several times the amount of distilled water is mixed. Were mixed to obtain a crude preparation.
  • the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further replacing the solvent with physiological saline, and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, by measuring the siRNA concentration of the obtained preparation and diluting with physiological saline so that the siRNA concentration is 1.0 mg / mL, preparations 1-A and 1-B (compound II-1 and compound II A composition containing I-3 as a lipid and siRNA A or B as a double-stranded nucleic acid) was obtained. The average particle size of lipid particles in the preparation was measured with a particle size measuring device. The results are shown in Table 4.
  • Example 2 Using the compound II-1 obtained in Reference Example 1, the compound I-3 obtained in Reference Example 11, and siRNA C to F shown in Table 3, preparations 1-C to F were prepared in the same manner as in Example 1. (A composition containing Compound II-1 and Compound I-3 as lipids and siRNA C to F as double-stranded nucleic acids) was obtained. It measured with the particle diameter measuring apparatus. The results are shown in Table 5.
  • Example 3 Using the compound II-1 obtained in Reference Example 1, the compound I-3 obtained in Reference Example 11, and siRNA B, D, E and G shown in Table 3, preparation 1 was prepared in the same manner as in Example 1. -B ', 1-D', 1-E 'and 1-G (composition containing compound II-1 and compound I-3 as lipids and siRNA B, D, E and G as double stranded nucleic acids) Product). It measured with the particle diameter measuring apparatus. The results are shown in Table 6.
  • Example 4 Using the compound II-1 obtained in Reference Example 1, the compound I-3 obtained in Reference Example 11, and siRNA A or B of Table 3, preparation 1-A ′ and 1-B ′′ (a composition containing Compound II-1 and Compound I-3 as lipids and siRNA A and B as double-stranded nucleic acids) was obtained. It measured with the particle diameter measuring apparatus. The results are shown in Table 7.
  • Example 5 The same method as in Example 1 using Compound II-1 obtained in Reference Example 1, Compound I-3 obtained in Reference Example 11, and siRNA B, C, D, E, and F shown in Table 3 Formulations 1-B ''',1-C'',1-D'',1-E''and1-F''(compounds II-1 and I-3 as lipids and siRNA B , C, D, E and F as a double-stranded nucleic acid). It measured with the particle diameter measuring apparatus. The results are shown in Table 8.
  • Test example 1 Using the preparations 1-A to B obtained in Example 1, an in vivo mRNA knockdown evaluation test was performed by the following methods. Human pancreatic cancer-derived cell line MIA PaCa-2 received from JCRB cell bank, 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO) and 1vol% penicillin-streptomycin (GIBCO, 15140-122) was cultured in a DMEM medium containing Glucose (GIBCO, 11995-065) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • GIBCO inactivated fetal calf serum
  • GIBCO 1vol% penicillin-streptomycin
  • MIA PaCa-2 was suspended in phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 1.6 ⁇ 10 8 cells / mL, and 50 ⁇ L of this cell suspension was subcutaneously applied to the back of SCID mice (received from CLEA Japan). (8 ⁇ 10 6 cells / 0.05 mL phosphate buffered saline (PBS) / mouse).
  • the group was divided into 5 mice per group using the tumor volume as an index, and each formulation obtained in Example 1 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg was intravenously administered to mice.
  • physiological saline administration group physiological saline 10 mL / kg was administered. Mice were weighed before administration and 48 hours after administration.
  • mice were euthanized after weighing and subcutaneous tumors were removed.
  • the excised tumor was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • For the obtained tumor sample add 0.5 mL of Trizol reagent (Invitrogen, 10296-028) and 5 mm zirconia balls (Aswan, 5-4060-13) to the 2 mL round bottom tube containing the sample. Then, it was crushed with Tissue lyser II (QIAGEN) under the conditions of 1/25 freq, 1.5 minutes ⁇ 2 times.
  • Trizol reagent Invitrogen, 10296-028
  • 5 mm zirconia balls Aswan, 5-4060-13
  • the concentration of the extracted RNA was measured with an absorptiometer DropSense96 (manufactured by Trinean), and reverse transcription of RNA corresponding to 500-1000 ng was performed using a Transcriptor (manufactured by Roche, 4897030).
  • the reaction solution and reaction conditions followed the instruction manual attached to the Transcriptor.
  • the obtained cDNA sample was diluted 10-fold with dH 2 O and used as a template for quantitative PCR (qPCR).
  • TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542) and TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, 4331182) were used for the qPCR reaction.
  • the conditions for the PCR reaction were in accordance with the instruction manual attached to TaqMan Gene Expression.
  • the amount of mRNA of the specimen was calculated as a relative ratio when the amount of CKAP5 mRNA was 1 in the physiological saline administration group.
  • FIG. 1 shows the amount of CKAP5 mRNA in the tumor.
  • Example 1 suppressed the expression of CKAP5 gene as compared with the physiological saline administration group.
  • Test example 2 Using the preparations 1-C to F obtained in Example 2, an in vivo mRNA knockdown evaluation test was performed in the same manner as in Test Example 1.
  • FIG. 2 shows the amount of CKAP5 mRNA in the tumor.
  • each preparation obtained in Example 2 suppressed the expression of the CKAP5 gene as compared with the physiological saline administration group.
  • Test example 3 Using the preparations 1-D to E obtained in Example 2, an in vivo mRNA knockdown evaluation test was performed by the following methods. Human pancreatic cancer-derived cell line MIA PaCa-2 received from JCRB cell bank, 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO) and 1vol% penicillin-streptomycin (GIBCO, 15140-122) was cultured in a DMEM medium containing Glucose (GIBCO, 11995-065) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • GIBCO inactivated fetal calf serum
  • GIBCO penicillin-streptomycin
  • MIA PaCa-2 was suspended in phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 1.6 ⁇ 10 8 cells / mL, and 50 ⁇ L of this cell suspension was subcutaneously applied to the back of SCID mice (received from CLEA Japan). (8 ⁇ 10 6 cells / 0.05 mL PBS / animal). The group was divided into 5 mice per group using the tumor volume as an index, and each formulation obtained in Example 2 in an amount corresponding to siRNA 10 mg / kg was intravenously administered to mice. In the physiological saline administration group, physiological saline 10 mL / kg was administered. Mice were weighed before administration and 48 hours after administration.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542) was used for the qPCR reaction.
  • primer / probe TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, 4331182) corresponding to each gene of human mouse were used. The conditions for the PCR reaction were in accordance with the instruction manual attached to TaqMan Gene Expression.
  • the amount of mRNA of the specimen was calculated as a relative ratio when the amount of mRNA of human CKAP5 and mouse CKAP5 was 1 in the physiological saline administration group.
  • FIG. 3 shows the amount of human CKAP5 mRNA in the tumor.
  • FIG. 4 shows the amount of mouse CKAP5 mRNA in bone marrow cells.
  • Example 2 suppressed the expression of CKAP5 gene in the tumor compared to the saline-administered group, while almost no expression of CKAP5 gene in normal bone marrow. Did not suppress.
  • Test example 4 Using the preparations 1-B ′, 1-D ′, 1-E ′ and 1-G obtained in Example 3, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 1, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was performed so that there were 6 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and each formulation obtained in Example 3 in an amount corresponding to 10 mg / kg of siRNA was intravenously administered on Day 0 and Day 7. As a control, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured from Day 0 to Day 21, and the tumor volume and volume ratio were calculated using the following formula. Figures 5 to 8 show changes in the relative value of the tumor volume.
  • each formulation obtained in Example 3 had a stronger antitumor effect than the physiological saline administration group. Therefore, it has been clarified that the composition of the present invention can be administered to a mammal to reduce the expression of the CKAP5 gene and treat CKAP5-related diseases in vivo.
  • Test Example 5 Using the preparations 1-A ′ and 1-B ′′ obtained in Example 4, a tumor growth evaluation test was performed by the following method. In the same manner as in Test Example 1, the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was performed so that there were 6 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and each formulation obtained in Example 4 in an amount corresponding to 10 mg / kg of siRNA was intravenously administered on Day 0 and Day 7. As a control, physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured from Day 0 to Day 21, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 4. FIG. 9 shows the transition of the relative value of the tumor volume.
  • each preparation obtained in Example 4 had a stronger antitumor effect than the physiological saline administration group. Therefore, it has been clarified that the composition of the present invention can be administered to a mammal to reduce the expression of the CKAP5 gene and treat CKAP5-related diseases in vivo.
  • Test Example 6 Using the preparations 1-B ′ ′′, 1-C ′′, 1-D ′′, 1-E ′′ and 1-F ′′ obtained in Example 5, tumor growth evaluation test by the following method Carried out.
  • the test was performed using a xenograft model in which MIA PaCa-2, which is a human pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was performed so that there were 6 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and each formulation obtained in Example 5 was administered intravenously on Day 0 and Day 7 in an amount corresponding to 10 mg / kg of siRNA.
  • physiological saline 10 mL / kg was administered. The tumor diameter of each individual was measured from Day 0 to Day 21, and the tumor volume and volume ratio were calculated in the same manner as in Test Example 4.
  • Figures 10 and 11 show the transition of the relative value of the tumor volume.
  • each preparation obtained in Example 5 had a stronger antitumor effect than the physiological saline administration group. Therefore, it has been clarified that the composition of the present invention can be administered to a mammal to reduce the expression of the CKAP5 gene and treat CKAP5-related diseases in vivo.
  • composition of the present invention can be administered to mammals to suppress CKAP5 gene expression in vivo and treat CKAP5-related diseases.

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Abstract

　本発明は、アンチセンス鎖が配列番号1～6のいずれか1つのCKAP5遺伝子のmRNAの連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有する、薬物としての二本鎖核酸と、式(I) (式中、R1およびR2は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、 L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、 aおよびbは、同一または異なって1～3であり、 R3は水素原子、炭素数1～6のアルキルまたは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有するCKAP5遺伝子発現を抑制する組成物、および該組成物からなる医薬等を提供する。

Description

ＣＫＡＰ５遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ医薬組成物
　本発明は、CKAP5遺伝子発現を抑制する組成物、該組成物からなる医薬等に関する。
　Cytoskeleton-associated protein 5 (CKAP5)は微小管と相互作用する蛋白質で、ヒトではCKAP5遺伝子でコードされている(“ディエヌエー リサーチ (DNA Res)”, 第2巻,　p.37-43、“ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー(Eur J Biochem)”, 第234巻, p.406-13、“Entrez Gene (NCBI (National Center for Biotechnology information) Gene database): CKAP5 cytoskeleton associated protein 5”参照)。CKAP5はch-TOGとしても知られ、またアフリカツメガエルではXMAP215がそのホモログである(“モレキュラー バイオロジー オブ ザ セル (Molecular Biology of the Cell)”, 第15巻, p.1580-1590参照 )。
　CKAP5は微小管形成において少なくとも2つの機能を有することが示されており、ひとつはMCAK (KIF2C)による動原体微小管の脱重合を抑制すること、もうひとつは中心体の形成にも関わることである(“モレキュラー アンド セルラー バイオロジー (Molecular and Cellular Biology)”, 第28巻, p.7199-7211参照 )。CKAP5はまた、乳癌で機能が亢進しているTACC1とも相互作用することが知られている(“オンコジーン (Oncogene)”, 第22巻, p.8102-16、“バイオケミカル ジャーナル(Biochem J), 第363巻, p.195-200”、“Entrez Gene (NCBI (National Center for Biotechnology information) Gene database): TACC1 transforming, acidic coiled-coil containing protein 1”参照 )。ヒト肝癌と大腸癌においてCKAP5は高発現していることが知られており(“ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー(Eur J Biochem)”, 第234巻, p.406-13参照 )、また近年、MCL1, RRM1, USP8などとともに多発性骨髄腫においても標的候補として報告されている(“キャンサー　リサーチ(Cancer Res)”, 第72巻, p.757-68参照 )。このような背景からCKAP5は抗癌剤の良い標的であると考えられるが、CKAP5を標的とした癌等の有効な治療法はまだない。
　標的遺伝子の発現を抑制する方法として、例えばRNA干渉(RNA interference、以下、RNAiとよぶ)を利用した方法等が知られており、具体的には、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNAを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象が報告されている(“ネイチャー(Nature)”, 1998年, 第391巻, 第6669号, p.806-811参照)。また、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖RNAの代わりに、21～23塩基の長さの二本鎖RNAを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることが見出され、これはshort interfering RNA(siRNA)と名づけられている(国際公開第01/75164号参照)。
　RNAiについては、in　vivo試験においても多く検証されており、50塩基対以下のsiRNAを用いた胎児の動物での効果(米国特許出願公開第2002/132788号明細書参照)および成体マウスでの効果(国際公開第03/10180号参照)が報告されている。また、siRNAをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓および肝臓の各臓器で特定の遺伝子の発現抑制効果が確認されている(“ネイチャー　ジェネティクス(Nature Genetics)”, 2002年, 第32巻, 第1号, p.107-108参照)。さらに、脳細胞においてもsiRNAを直接投与することで特定の遺伝子が発現抑制されることが報告されている(“ネイチャー　バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)”, 2002年, 第20巻, 第10号, p.1006-1010参照)。
　CKAP5 siRNAは、例えば特許文献1等に記載されている。
　siRNA類を含有する医薬は、例えば、特許文献2、特許文献3、特許文献4等に記載されている。
　特許文献2中には、siRNA類と、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)等を含有する医薬が開示されている。DLinDMA等は、より柔軟なカチオン性脂質を開発すること、それによりリポソーム等の膜流動性を高めることを目的に、構造上類似のカチオン性脂質であるN-(2,3-ジ(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ)プロパン-1-イル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)およびN-(2,3-ジオレイルオキシプロパン‐1-イル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)の高級アルキル基を、不飽和部位を少なくとも2ヵ所含む高級アルキル基としたことにより特徴付けられる。また、特許文献3中には、siRNA類と、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-1,3-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等を含有する医薬が開示されている。
　また、特許文献4中には、例えば、trans-3,4-ビス(((Z)-オクタデカ-9-エノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-3)等が開示されている。
国際公開第2004/045543号 国際公開第2005/121348号 国際公開第2009/086558号 国際公開第2011/136368号
　本発明の目的は、CKAP5遺伝子発現を抑制する組成物、該組成物からなる医薬等を提供することである。
　本発明は、以下の(1)～(23)に関する。
(1)　センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも25塩基対を有し、該アンチセンス鎖は、配列番号1～6のいずれか1つのCKAP5遺伝子のmRNAの連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有し、最大35ヌクレオチドの長さを有する、薬物としての二本鎖核酸と、式(I)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 (式中、R1およびR2は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
aおよびbは、同一または異なって1～3であり、
R3は水素原子、炭素数1～6のアルキルまたは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する組成物。
(2) 脂質粒子が、さらに式(II)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 (式中、R4およびR5は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
R6は水素原子、炭素数1～6のアルキル、炭素数3～6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である、前記(1)記載の組成物。
(3) R4およびR5が、同一にドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(2)記載の組成物。
(4) R4およびR5が、同一にテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである前記(2)記載の組成物。
(5) R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルである前記(3)または(4)記載の組成物。
(6) R3が水素原子またはメチルである前記(1)～(5)のいずれかに記載の組成物。
(7) L1およびL2が-O-CO-であり、R1およびR2が、同一にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(1)～(6)のいずれかに記載の組成物。
(8) L1およびL2が、-CO-O-であり、R1およびR2が、同一にトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである前記(1)～(6)のいずれかに記載の組成物。
(9) 薬物として、配列番号7および8、9および10、11および12、13および14、15および16、17および18、または19および20の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸を含有する前記(1)～(8)のいずれかに記載の組成物。
(10) カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成している、前記(1)～(9)のいずれかに記載の組成物。
(11) カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成しており、脂質粒子が該複合体と該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質粒子である前記(1)～(9)のいずれかに記載の組成物。
(12) 前記(1)～(11)のいずれかに記載の組成物を用いて該二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、CKAP5遺伝子の発現を抑制する方法。
(13) 細胞が、ほ乳類の腫瘍にある細胞である前記(12)記載の方法。
(14) 細胞が、ほ乳類の大腸、膵臓、胃、小腸、肝臓または食道にある細胞である前記(12)記載の方法。
(15) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である前記(12)～(14)のいずれかに記載の方法。
(16) 前記(1)～(11)のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、CKAP5関連疾患の治療方法。
(17) 投与する方法が、静脈内投与である前記(16)記載の方法。
(18) 前記(1)～(11)のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、癌の治療方法。
(19) 投与する方法が、静脈内投与である前記(18)記載の方法。
(20) 前記(1)～(11)のいずれかに記載の組成物を含む、CKAP5関連疾患の治療に用いるための医薬。
(21) 静脈内投与用である前記(20)記載の医薬。
(22) 前記(1)～(11)のいずれかに記載の組成物を含む、癌の治療剤。
(23) 静脈内投与用である前記(22)記載の癌の治療剤。
　例えば本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子発現を抑制し、CKAP5関連疾患を治療することができる。
MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例1で得られた製剤1-A～1-BのそれぞれsiRNA 10 mg/kg相当量を投与後48時間後の腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。縦軸はCKAP5 mRNA量の相対値を示す。なお、相対値は、CKAP5のmRNAを準定量するに際して普遍的に発現しているmRNAとして、各サンプルのHPRT1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)のmRNA量を内部対照としてsalineとの相対値として算出した。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例2で得られた製剤1-C～1-FのそれぞれsiRNA 10 mg/kg相当量を投与後48時間後の腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。縦軸はCKAP5 mRNA量の相対値を示す。なお、相対値は、CKAP5のmRNAを準定量するに際して普遍的に発現しているmRNAとして、各サンプルのHPRT1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)のmRNA量を内部対照としてsalineとの相対値として算出した。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例2で得られた製剤1-D～1-EのそれぞれsiRNA 10 mg/kg相当量を投与後48時間後の腫瘍中ヒトCKAP5 mRNA量を示す。縦軸はCKAP5 mRNA量の相対値を示す。なお、相対値は、CKAP5のmRNAを準定量するに際して普遍的に発現しているmRNAとして、各サンプルのHPRT1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)のmRNA量を内部対照としてsalineとの相対値として算出した。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例2で得られた製剤1-D～1-EのそれぞれsiRNA 10 mg/kg相当量を投与後48時間後の骨髄細胞中マウスCKAP5 mRNA量を示す。縦軸はCKAP5 mRNA量の相対値を示す。なお、相対値は、CKAP5のmRNAを準定量するに際して普遍的に発現しているmRNAとして、各サンプルのHPRT1(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)のmRNA量を内部対照としてsalineとの相対値として算出した。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例3で得られた製剤1-BのsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例3で得られた製剤1-DのsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例3で得られた製剤1-EのsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例3で得られた製剤1-GのsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例4で得られた製剤1-A’および1-B’’のsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤１－A’, 黒三角は製剤１－B’’投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例5で得られた製剤1-B’’’, 1-C’’および1-E’’のsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤1-E’’, 黒三角は製剤1-B’’’投与群、黒四角は1-C’’投与群を示す。 MIAPaCa-2ゼノグラフトマウスに実施例5で得られた製剤1-B’’’, 1-D’’および1-F’’のsiRNA 10 mg/kg相当量を0日目および7日目に投与した際の腫瘍体積の相対値の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。それぞれ白丸は生理食塩水投与群、黒丸は製剤1-D’’, 黒三角は製剤1-B’’’投与群、黒四角は1-F’’投与群を示す。
　本発明は、薬物としてのCKAP5遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸と、カチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する組成物を提供する。
　また、該組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子発現を抑制し、CKAP5関連疾患を治療する方法も、提供する。
　本発明は、過剰増殖性疾病または疾患(例えば、白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫)または不適切なCKAP5遺伝子の発現に関連する1つ以上の血管新生性疾病を治療または予防するための方法も、提供する。
　本発明の組成物における脂質粒子は、式(I)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 (式中、R1およびR2は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
aおよびbは、同一または異なって1～3であり、
R3は水素原子、炭素数1～6のアルキルまたは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する。以下、式(I)で表される化合物を、化合物(I)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
　また、本発明の組成物における脂質粒子は、化合物(I)および式(II)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 (式中、R4およびR5は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
R6は水素原子、炭素数1～6のアルキル、炭素数3～6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である。
　式(I)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキルとしては、例えばドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル等があげられる。
　式(I)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルケニルとしては、1～3つの2重結合を含む炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルケニルであればよく、例えば(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等があげられ、好ましくは(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル等があげられる。
　式(I)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキニルとしては、1～3つの3重結合を含む炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、トリデカ-12-イニル、ペンタデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ペンタデカ-4,6-ジイニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、ヘプタデカ-8-イニル、オクタデカ-9-イニル等があげられる。
　なお、化合物(I)において、R1およびR2は、同一の、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであることが好ましい。また、R1およびR2は、炭素数12～24の直鎖状もしくは分枝状のアルキルもしくはアルケニルであることがより好ましく、炭素数12～24の直鎖状のアルケニルであることがさらに好ましい。
　式(II)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状もしくは分枝状のアルキルとしては、例えばドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル等があげられる。
　式(II)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルケニルとしては、1～3つの2重結合を含む炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルケニルであればよく、例えば(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニル等があげられ、好ましくは(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル等があげられる。
　式(II)の各基の定義において、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキニルとしては、1～3つの3重結合を含む炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキニルであればよく、例えばドデカ-11-イニル、テトラデカ-6-イニル、ヘキサデカ-7-イニル、ヘキサデカ-5,7-ジイニル、オクタデカ-9-イニル等があげられる。
　なお、化合物(II)において、R4およびR5は、同一の、炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであることが好ましい。また、R4およびR5は、炭素数12～24の直鎖状もしくは分枝状のアルキルもしくはアルケニルであることがより好ましく、炭素数12～24の直鎖状のアルケニルであることがさらに好ましい。
　式(I)および式(II)の各基の定義において、炭素数1～6のアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロブチル、シクロプロピルメチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル等があげられ、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等があげられ、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピル等があげられる。
　炭素数3～6のアルケニルとしては、例えばアリル、1-プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等があげられ、好ましくはアリル等があげられる。
　置換された炭素数1～6のアルキルにおけるアルキル部分および置換された炭素数3～6のアルケニルにおけるアルケニル部分は、それぞれ前記炭素数1～6のアルキルおよび炭素数3～6のアルケニルと同義である。
　化合物(I)および化合物(II)において、構造中の窒素原子上の孤立電子対に水素イオンが配位してもよく、該水素イオンが配位した窒素原子は、製薬上許容し得る陰イオンと塩を形成していてもよく、化合物(I)および化合物(II)は、該窒素原子上の孤立電子対に水素イオンが配位した化合物も包含する。
　製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等があげられる。
　式(II)の定義において、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルおよびピペリジン-4-イルは、それぞれ、環中の窒素原子上に結合した水素原子が、メチルまたはエチルに変換されたものを包含する。
　モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノとしては、それぞれ1つおよび同一または異なって2つの、炭素数1～6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキル(前記と同義)で置換されたアミノであればよく、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、メチルプロピルアミノ、ブチルメチルアミノ、メチルペンチルアミノ、ヘキシルメチルアミノ、アミノエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、(アミノエチル)メチルアミノ、ビス(アミノエチル)アミノ等があげられ、好ましくはメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、アミノプロピルアミノ、ビス(アミノエチル)アミノ等があげられる。
　化合物(II)において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを包含する。この場合、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。
　アルコキシとしては、炭素数1～6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキル(前記と同義)で置換されたヒドロキシであればよく、例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、アミノエトキシ、メチルアミノエトキシ等があげられ、好ましくはメトキシ、エトキシ、アミノエトキシ、メチルアミノエトキシ等があげられる。
　モノアルキルカルバモイルおよびジアルキルカルバモイルとしては、それぞれ1つおよび同一または異なって2つの、炭素数1～6のアルキル(前記と同義)または、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキル(前記と同義)で置換されたカルバモイルであればよく、例えばメチルカルバモイル、エチルカルバモイル、プロピルカルバモイル、ブチルカルバモイル、ペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル、メチルプロピルカルバモイル、ブチルメチルカルバモイル、メチルペンチルカルバモイル、ヘキシルメチルカルバモイル、アミノエチルカルバモイル、アミノプロピルカルバモイル、(アミノエチル)メチルカルバモイル、ビス(アミノエチル)カルバモイル等があげられ、好ましくはメチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル等があげられる。
　化合物(I)において、L1およびL2が、-O-CO-である場合には、R1およびR2は、同一または異なってドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであることがより好ましく、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることがさらに好ましい。なお、いずれの場合も、R1およびR2は、同一であることがさらに好ましい。
　また、L1およびL2が、-CO-O-である場合には、R1およびR2は、同一または異なってトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルであることがより好ましく、同一または異なってトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルまたは(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニルであることがさらに好ましい。なお、いずれの場合も、R1およびR2は、同一であることが好ましい。
　また、aおよびbは、同時に1であることがより好ましい。
　また、aおよびbが、同時に1であり、L1およびL2が、-CO-O-であることも本発明のより好ましい形態の一つである。その場合には、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
　また、R3は水素原子またはメチルであることがより好ましい。
　また、aおよびbが1であり、L1およびL2が、同一に-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、R3がメチルであることも、本発明のさらに好ましい形態の1つであり、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
　なお、R3が水素原子の場合には、L1およびL2が、同一に-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であることも、本発明のより好ましい形態の1つであり、R1およびR2は、同一または異なって(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることが最も好ましい。
　化合物(II)において、R4およびR5は、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
　また、R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルであることが好ましく、水素原子、メチルまたは1つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル等であることが最も好ましい。
　また、R6が水素原子であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合、R4およびR5は、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
　また、R6がメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合、R4およびR5は、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
　化合物(I)は、国際公開第2011/136368号に記載の製造方法と同様の方法で得ることができる。なお、定義した基が該製造方法の条件下で変化するかまたは該製造方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ　グループス　イン　オーガニック　シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の方法]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　次に化合物(II)の製造方法について説明する。なお、以下に示す製造方法において、定義した基が該製造方法の条件下で変化するかまたは該製造方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ　グループス　イン　オーガニック　シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の方法]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　製造方法1
　化合物(II)は以下の方法によって製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 (式中、R4、R5およびR6は、それぞれ前記と同義であり、Zは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ等の脱離基を表す)
工程1および2
　化合物(IIIb)は、化合物(IIIa)と化合物(IVa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1～10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間～100時間反応させることにより製造することができる。さらに、化合物(II)は、化合物(IIIb)と化合物(IVb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1～10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間～100時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム　tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
　化合物(IIIa)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座14「有機化合物の合成II」、第5版、p.351、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　化合物(IVa)および化合物(IVb)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座13「有機化合物の合成I」、第5版、p.374、丸善(2005年))もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
　R4とR5が同一の場合の化合物(IIa)は、工程1において、2当量以上の化合物(IVa)を用いることで得ることができる。
　製造方法2
　化合物(II)のうち、R6が-CHRARB(式中、RAおよびRBは、同一または異なって水素原子、炭素数1～5のアルキル、炭素数2～5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～5のアルキルもしくは炭素数2～5のアルケニルであるか、または隣接する炭素原子と一緒になってピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルもしくはピペリジン-4-イルを形成し、RAおよびRBが、同一に水素原子である場合を除き、RAおよびRBのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1～5であり、RAおよびRBのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RAおよびRBのもう一方は、水素原子、炭素数1～5のアルキル、炭素数2～5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～5のアルキルもしくは炭素数2～5のアルケニルであり、RAおよびRBが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2または3である)である、化合物(IIb)は以下の方法によって製造することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 (式中、R4、R5、RAおよびRBは、それぞれ前記と同義である)
工程3
　化合物(IIb)は、化合物(II)のうちのR6が水素原子である化合物(IIc)を、好ましくは1～10当量の化合物(V)と、溶媒中、好ましくは1～大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1～10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間～72時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
　酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。
　化合物(V)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座15「有機化合物の合成III」、第5版、p.1、丸善(2005年)、第5版実験化学講座15「有機化合物の合成III」、第5版、p.153、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。
　製造方法3
　化合物(II)のうち、R6が-CH2-C(OH)RCRD(式中、RCおよびRDは、同一または異なって水素原子、炭素数1～4のアルキル、炭素数2～4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～4のアルキルもしくは炭素数2～4のアルケニルであり、RCおよびRDが、同一に水素原子である場合を除き、RCおよびRDのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1～4であり、RCおよびRDのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RCおよびRDのもう一方は水素原子、炭素数1～4のアルキル、炭素数2～4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは1つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～4のアルキルもしくは炭素数2～4のアルケニルであり、RCおよびRDが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2である)である、化合物(IId)は以下の方法によって製造することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 (式中、R4、R5、RCおよびRDは、それぞれ前記と同義である)
工程4
　化合物(IId)は、化合物(IIc)と化合物(VI)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230 ℃の間の温度で、5分間から100時間反応させることにより製造することができる。
　溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
　化合物(VI)は、市販品としてまたは公知の方法(例えば、第5版実験化学講座17「有機化合物の合成V」、第5版、p.186、丸善(2005年))もしくはそれに準じて得ることができる。
　化合物(II)におけるR4、R5またはR6に含まれる官能基の変換は、公知の方法[例えば、コンプリヘンシブ　オーガニック　トランスフォーメーションズ　第2版(Comprehensive Organic Transformations 2nd edition)、R.C.ラロック(Larock)著、Vch Verlagsgesellschaft Mbh(1999年)等に記載の方法]でまたはそれらに準じて行うこともできる。
　上記各製造方法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
　化合物(I)および化合物(II)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、化合物(I)および化合物(II)は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
　化合物(I)および化合物(II)中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)および化合物(II)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)および化合物(II)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
　化合物(I)および化合物(II)中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造方法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)および化合物(II)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸等を重水素化する方法[ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサイエティ(J.Am.Chem.Soc.), Vol.124,No.10,2092(2002)参照]等を用いて合成することもできる。
　化合物(I)の具体例を第1表に示し、化合物(II)の具体例を第2表に示す。ただし、本発明における化合物(I)および化合物(II)は、これらに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　また、本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸は、哺乳類細胞に導入された場合、CKAP5遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸であって、
センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸であり、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも25塩基対を有し、該アンチセンス鎖は、配列番号1～6のいずれか1つのCKAP5遺伝子のmRNA(CKAP5 mRNA)の標的配列の、連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有し、最大35ヌクレオチドの長さを有する二本鎖核酸である。
　二本鎖核酸としては、ヌクレオチドおよび/または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した二本鎖の分子であれば、いかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、ヌクレオチドおよび/または該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子を、構成単位として少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の二本鎖核酸に含まれる。さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)]等もあげられる。なお、本発明において、RNA中のウリジンUと、DNAにおけるチミンTとは、それぞれ読み替えることができる。
　ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えば天然由来のRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
　ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
　糖部修飾ヌクレオチドにおける修飾基としては、例えば、2’-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-アルケニル、2’-置換アルケニル、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-S-アルキル、2’-S-置換アルキル、2’-S-アルケニル、2’-S-置換アルケニル、2’-アミノ、2’-NH-アルキル、2’-NH-置換アルキル、2’-NH-アルケニル、2’-NH-置換アルケニル、2’-SO-アルキル、2’-SO-置換アルキル、2’-カルボキシ、2’-CO-アルキル、2’-CO-置換アルキル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル、2’-SiH2-アルキル、2’-SiH2-置換アルキル、2’-ONO2、2’-NO2、2’-N3、2’-アミノ酸残基(アミノ酸のカルボン酸から水酸基が除去されたもの)、2’-O-アミノ酸残基(前記アミノ酸残基と同義)等があげられる。また、2’位の修飾基が4’位の炭素原子に架橋した構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、およびエチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[ヌクレイック　アシッズ　リサーチ(Nucleic Acid Research), 32, e175(2004)]等も本発明における2’位において修飾基で置換されたヌクレオチドに含まれる。
　糖部修飾ヌクレオチドの修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
　また、糖部修飾ヌクレオチドの修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。
　糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルキルは、化合物(II)における炭素数1～6のアルキルと同義である。
　糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルケニルは、化合物(II)における炭素数3～6のアルケニルと同義である。
　糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
　アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドの修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルにおける置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該ジアルキルアミノアルキレンオキシの2つのアルキル部分は同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1～3である。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
　塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1～6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2～6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1～6のアルキル基、炭素数1～6のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
　さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5蛍光色素付加ヌクレオチド誘導体、Cy3蛍光色素付加ヌクレオチド誘導体、6-フルオレセイン(FAM)付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
　また、ヌクレオチド誘導体は、二本鎖核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
　二本鎖核酸は、siRNAを産生するためダイサーによってプロセッシングされるために十分な長さを有する。本態様に従って、二本鎖核酸は、好ましくは26から30ヌクレオチドの間の長さのセンス鎖、および、細胞の細胞質中に見出される条件等の、生物学的条件下で、センス鎖とアニーリングするアンチセンス鎖を含む。
　また、二本鎖核酸は、ダイサーによるそのプロセッシングを亢進させるいくつかの特性を有してもよい。本態様に従って、二本鎖核酸はダイサーによってプロセッシングされsiRNAを産生するために十分な長さ、および、以下の特性の少なくとも1つ、好ましくはすべてを有する:(i)二本鎖核酸は非対称であり、例えば、アンチセンス鎖に3'突出物を有する。(ii)センス鎖の3'末端にヌクレオチド誘導体(前記と同義)を、ダイサー結合およびプロセッシングのために含有する。適切なヌクレオチド誘導体としては、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、およびその類似物等のヌクレオチド、および、蛍光分子およびその類似物等の立体的に混み合った分子、好ましくはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド誘導体が使用される場合、それらは、二本鎖核酸の長さが変化しないように、二本鎖核酸中のリボヌクレオチドと置換される。(iii)センス鎖は、5'末端にリン酸を含む。5'末端にリン酸を含むとは、5’末端の塩基に結合する糖の5’位の水酸基が、リン酸基または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基に変換される基によって修飾されている。
　また、二本鎖核酸は、好ましくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖、または両方の鎖において、1つまたはそれ以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。
　最も好ましくは、センス鎖は25～28ヌクレオチドを含み、センス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。センス鎖は、5'末端にリン酸を含む。アンチセンス鎖は、26～30ヌクレオチドを含み、そして、1～4ヌクレオチドの3'突出部を含む。アンチセンス鎖およびセンス鎖は、1つまたはそれ以上の2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを有する。
　例えば、25ヌクレオチドセンス鎖、および2ヌクレオチドの3'突出部を含む27ヌクレオチドアンチセンス鎖で、センス鎖およびアンチセンス鎖の5'末端の第一塩基をポジション番号1と数える場合、2'-O-メチル修飾の位置としては、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、25および27、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、21、23、25、26および27、センス鎖のポジション番号1、2、4、6、8、12、14、16、18および23ならびにアンチセンス鎖のポジション番号1、2、3、4、11、13、15、17、19、21、23、25、26および27等があげられ、いずれの場合も、好ましくはセンス鎖の3'末端の2ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は5'末端にリン酸を含む。
　本発明で用いられる二本鎖核酸には、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。
　また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の5’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ5’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
　また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
　なお、本発明で用いられる二本鎖核酸は、既知のRNAまたはDNA合成法、およびRNAまたはDNA修飾法を用いて製造すればよい。
　二本鎖核酸は、CKAP5遺伝子配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。
　二本鎖核酸の1つの鎖の配列は、上で記述した標的部位配列に対して相補的である。二本鎖核酸は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。
　RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Nucleic. Acids. Res. ）、1998年、第32巻、p.936-948参照 ]。一般に、二本鎖核酸は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる(たとえば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号明細書;米国特許第5,831,071号明細書;米国特許第5,998,203号明細書;米国特許第6,117,657号明細書;米国特許第6,353,098号明細書;米国特許第6,362,323号明細書;米国特許第6,437,117号明細書;米国特許第6,469,158号明細書;Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号明細書;米国特許第6,008,400号明細書;米国特許第6,111,086号明細書を参照)。
　一本鎖核酸は、固相ホスホロアミダイト法（ヌクレイック　アシッズ　リサーチ（Nucleic. Acids. Res.)、1993年、第30巻、p.2435-2443参照)を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。高さ.25 cm (Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE-HPLC)を使用して精製する。勾配は、90:10の緩衝液A:Bから52:48の緩衝液A:Bに変化し、緩衝液Aは100mM Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mM Tris pH 8.5(1MのNaCl)である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
　各一本鎖核酸の純度は、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif)でのキャピラリー電気泳動(CE)によって決定される。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)を含む。典型的には、約0.6nmoleのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V/cmの電界において実行して、260nmにおけるUV吸光度によって検出される。変性トリス-ホウ酸-7M-尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入する。以下に記述した実験に使用するための、CEによって評価すると少なくとも90%純粋である一本鎖核酸が得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometryワークステーション(Applied Biosystems、Foster City,、Calif.)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分光法によって検証される。一本鎖核酸の相対的な分子質量は、予想される分子質量の0.2%以内で得ることができる。
　一本鎖核酸は、100mM 酢酸カリウム、30mM HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μM濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μM二本鎖核酸の最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、-20℃にて保存する。一本鎖核酸は、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃で貯蔵する。
　本発明で用いられる二本鎖核酸の具体例を第3表に示す。なお、表中のr、mおよびdが付された塩基に結合する糖は、それぞれリボース、2’位の水酸基が-O-メチルで置換されているリボースおよびデオキシリボースである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明における脂質粒子は、化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と、二本鎖核酸とを含有する脂質粒子であり、例えば、化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と、二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと、二本鎖核酸との複合体を含有する脂質粒子、該複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質粒子等があげられる。脂質膜は、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(I)、化合物(II)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
　また、本発明における脂質粒子としては、例えば化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(II)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
　該複合体の形態としては、いずれの場合も二本鎖核酸と脂質一重層からなる膜(逆ミセル)との複合体、二本鎖核酸とリポソームとの複合体、二本鎖核酸とミセルとの複合体等があげられ、好ましくは二本鎖核酸と脂質一重層からなる膜との複合体または二本鎖核酸とリポソームとの複合体があげられる。
　該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成された脂質粒子としては、該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム等があげられる。
　なお、本発明における脂質粒子には、化合物(I)および化合物(II)のそれぞれ一種または複数種を使用してもよく、また化合物(I)および/または化合物(II)には、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
　化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、DOTMA、DOTAP等、国際公開第91/16024号および国際公開第97/019675号中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等、国際公開第2005/121348号中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号中で開示される、DLin-K-DMA等があげられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質があげられ、より好ましくは該3級アミン部位を有するカチオン性脂質があげられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
　本発明における脂質粒子は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってもよい。例えば、脂質粒子の1つであるリポソームの製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム(Bangham)らのリポソーム調製法[“ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジー(J. Mol. Biol.)”,1965年,第13巻,p.238-252参照]、エタノール注入法[“ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー(J. Cell Biol.)”,1975年,第66巻,p.621-634参照]、フレンチプレス法[“エフイービーエス　レターズ(FEBS Lett.)”, 1979年, 第99巻, p.210-214参照]、凍結融解法[“アーカイブス　オブ　バイオケミストリー　アンド　バイオフィジックス(Arch.Biochem.Biophys.)”,1981年,第212巻,p.186-194参照]、逆相蒸発法[“プロシーディングズ　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)”,1978年,第75巻, p.4194-4198参照]またはpH勾配法(例えば特許第2572554号公報、特許第2659136号公報等参照)等があげられる。リポソームの製造の際にリポソームを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。
　また、本発明における脂質粒子は、例えば、化合物(I)、化合物(I)および化合物(II)、化合物(I)と化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質または化合物(I)および化合物(II)と化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いで二本鎖核酸の水溶液とメタノールを加えて混合してカチオン性脂質/二本鎖核酸の複合体を形成させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理して製造する方法(特表2002-508765号公報参照)や、二本鎖核酸を、酸性の電解質水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げて前記二本鎖核酸内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpHを上げて透析してリポソーム表面に付着した二本鎖核酸を除去して製造する方法(特表2002-501511号公報およびバイオキミカ　エト　バイオフィジカ　アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),2001年, 第1510巻, p.152-166参照)等によって製造することができる。
　本発明における脂質粒子のうち、複合体および該複合体を封入した脂質二重膜から構成されたリポソームは、例えば、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って製造することができる。
　また、本発明における脂質粒子のうち、例えば化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子、化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子等は、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って、それぞれの複合体を製造し、水または0～20%エタノール水溶液中に、該複合体を溶解させずに分散させ(A液)、別途、それぞれの脂質膜成分を、エタノール水溶液中に溶解させ(B液)、A液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えることで、得ることができる。また、A液およびB液中の化合物(I)、化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質は、それぞれ一種または複数種を使用してもよい。
　なお、本発明において、化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と、二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子、化合物(II)と核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子等の製造中および製造後に、複合体中の二本鎖核酸と脂質膜中のカチオン性脂質との静電相互作用や、複合体中のカチオン性脂質と脂質膜中のカチオン性脂質との融合によって、複合体および膜の構造が変位したものも、それぞれ化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と、二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子、化合物(II)と核酸との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子等に包含される。
　本発明における脂質粒子としては、化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質粒子がより好ましく、化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)と二本鎖核酸との複合体、あるいは化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/または高分子を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、または化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子がより好ましく、化合物(I)もしくは化合物(I)に中性脂質を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質粒子または化合物(II)もしくは化合物(II)に中性脂質を組み合わせたものと二本鎖核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質粒子がさらに好ましい。
　該複合体中の化合物(I)および化合物(II)の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して0.5～4倍であるのが好ましく、1.5～3.5倍であるのがより好ましく、2～3倍であるのがさらに好ましい。また、該複合体中の化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して0.5～4倍であるのが好ましく、1.5～3.5倍であるのがより好ましく、2～3倍であるのがさらに好ましい。
　本発明の脂質粒子において、複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成される場合には、該脂質粒子中の化合物(I)および化合物(II)の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して1～10倍であるのが好ましく、2.5～9倍であるのがより好ましく、3.5～8倍であるのがさらに好ましい。また、該脂質粒子中の化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該二本鎖核酸のリン原子の数に対して1～10倍であるのが好ましく、2.5～9倍であるのがより好ましく、3.5～8倍であるのがさらに好ましい。
　中性脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイドまたはステロール等があげられるがこれらに限定されない。
　本発明の脂質粒子において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1～1.8倍であるのが好ましく、0.3～1.1倍であるのがより好ましく、0.4～0.9倍であるのがさらに好ましい。本発明における脂質粒子は、中性脂質を、複合体に含有していてもよく、該複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも該複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、該複合体および該該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
　中性脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1 -ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。
　中性脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等があげられる。
　中性脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等があげられる。
　中性脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシンまたはそれらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH2を-NHCO(CH2)xCH3(式中、xは0～18の整数であり、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等があげられる。
　中性脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロールまたは3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等があげられる。
　中性脂質として、好ましくはリン脂質、ステロール等があげられ、より好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールがあげられ、さらに好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロールおよびそれらの組み合わせがあげられる。
　高分子としては、例えばタンパク質、アルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子またはそれらの塩の1以上があげられる。
　ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等があげられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩があげられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩があげられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩があげられる。
　また、本発明における脂質粒子は、さらに水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有することが好ましい。該水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体は、複合体に含有していてもよく、複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、複合体および該複合体を封入する脂質膜ともに含有していることがより好ましい。
　本発明の脂質粒子において水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、水溶性高分子の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.05～0.3倍であるのが好ましく、0.07～0.25倍であるのがより好ましく、0.1～0.2倍であるのがさらに好ましい。
　水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体は、分子の一部が脂質粒子の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもち、他の部分が脂質粒子の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質をもつ、2面性をもつ物質であるのが好ましい。
　水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、前記脂質粒子の定義の中であげた中性脂質、化合物(I)もしくは化合物(II)、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの、それらの塩等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体およびそれらの塩があげられる。
　ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質(具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DSPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-DMPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR　EL)等)、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられ、さらに好ましくはPEG-DSPE、PEG-DMPEがあげられる。
　ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。
　また、本発明における脂質粒子には、例えば水溶性高分子、ポリオキシエチレン誘導体等による表面改質も任意に行うことができる[ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス　リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー　プレス　インク(CRC Press Inc), 1995年, p.93-102参照]。表面改質に使用し得る高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート80、プルロニックF68、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコールまたはPEG-DSPE等があげられる。該表面改質によって、脂質粒子中の複合体および脂質膜に水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有させることができる。
　本発明における脂質粒子の平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記する平均粒子径とするのが好ましい。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)等を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法[ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン　アンド　ナノサスペンジョンズ　フォー　ザ　フォーミュレーション　オブ　ポアリー　ソラブル　ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック　パブリッシャーズ　スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart), 1998年, p.267-294参照]等があげられる。
　本発明における脂質粒子の大きさは、平均粒子径が約10nm～1000nmであるのが好ましく、約30nm～300nmであるのがより好ましく、約50nm～200nmであるのがさらに好ましい。
　本発明の組成物を、ほ乳類の細胞に投与することで、本発明の組成物中の二本鎖核酸を細胞内に導入することができる。
　インビボにおける本発明の組成物のほ乳類の細胞への導入方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。例えば、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば癌または炎症の生じた臓器または部位へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸を導入することができる。癌または炎症の生じた臓器または部位としては、特に限定されないが、例えば胃、大腸、膵臓、胃、小腸、肝臓、肺、脾臓、腎臓、膀胱、皮膚、血管、眼球、食道等があげられ、好ましくは大腸、膵臓、胃、小腸、肝臓または食道があげられる。また、本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば血管、肝臓、肺、脾臓および/または腎臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸を導入することができる。血管、肝臓、肺、脾臓および/または腎臓の細胞は、正常細胞であってもよい。
　送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸が導入されると、その細胞内のCKAP5遺伝子の発現を低下させ、CKAP5関連疾患、例えば白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫等を治療することができる。
　即ち、本発明の組成物を哺乳動物に投与することで、CKAP5遺伝子の発現を低下させ、CKAP5関連疾患、例えば白血病、メラノーマ、細胞腫、癌、腫瘍、腺腫等を治療することができる。投与対象は、人であることが好ましい。
　また、本発明における組成物は、癌の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、CKAP5遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
　本発明の組成物を、癌の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
　投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖核酸に換算した1日投与量が約0.1μg～1000mgとなるように投与すればよい。
　静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製した脂質粒子の分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
　注射剤の場合、前記の脂質粒子の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
　次に、実施例、参考例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。
　なお、参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
参考例1
メチルジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(化合物II-1)
　メチルアミン(アルドリッチ(Aldrich)社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.5 mL、21.0 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル　メタンスルホナート(ニューチェック　プレップ(Nu-Chek Prep,Inc)社製, 1.03 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて150℃で90分間加熱撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することでメチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミンの粗生成物を得た。
　得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル　メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 0.93 g, 2.70 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g, 12.0 mmol)を加え、油浴上135℃で60分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0～97/3)で精製することにより化合物II-1(1.07 g, 67.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 529 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 32H), 1.40-1.51 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例2
メチルジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)アミン (化合物II-2)
　参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.0 mL、20.0 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.21 g, 3.80 mmol)を用い、化合物II-2(0.491 g, 51.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 36H), 1.46-1.57 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.33 (s, 3H), 2.45 (t, J = 7.9 Hz, 4H), 5.29-5.41 (m, 4H).
参考例3
メチルジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミン (化合物II-3)
　参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、16.0 mL、32.0 mmol)および(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.98 g, 8.00 mmol)を用い、化合物II-3(1.27 g, 54.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 585 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.27 (br s, 40H), 1.39-1.51 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.79 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例4
ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン (化合物II-4)
　参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.79 g, 8.10 mmol)を用い、化合物II-4(0.838 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 515 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.30 (br s, 33H), 1.41-1.54 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.59 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例5
ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物II-5)
　参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.87 g, 5.40 mmol)を用い、化合物II-5(0.562 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 45H), 1.41-1.52 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例6
メチルジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物II-6)
　参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、11.2 mL、22.4 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.11 g, 6.09 mmol)を用い、化合物II-6(1.20 g, 70.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 533 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27 (br s, 44H), 1.39-1.50 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例7
trans-1-(tert-ブトキシカルボニル)-3,4-ビス(((Z)-オクタデカ-9-エノイルオキシ)メチル)ピロリジン (化合物VII-1)
　国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(156 mg, 0.674 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、オレイン酸(東京化成工業社製、419 mg, 1.48 mmol)、水溶性 カルボジイミド(WSCD)(国産化学社製、297 mg, 1.55 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製、DMAP (20.6 mg, 0.169 mmol)を加え室温で終夜撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/クロロホルム=50/50～0/100)で精製することにより化合物VII-1 (280 mg, 54.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 761 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.25-1.46 (m, 36H), 1.46 (s, 9H), 1.46-1.66 (m, 8H), 1.97-2.04 (m, 8H), 2.27-2.38 (m, 6H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例8
trans-1-(tert-ブトキシカルボニル)-3,4-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)ピロリジン (化合物VII-2)
　参考例7と同様の方法で、国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(150 mg, 0.674 mmol)およびリノール酸(アルドリッチ社製、400 mg, 1.48 mmol)を用い、化合物VII-2 (351 mg, 71.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 757 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.45 (m, 26H), 1.46 (s, 9H), 1.47-1.68 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.26-2.38 (m, 6H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例9
trans-3,4-ビス(((Z)-オクタデカ-9-エノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-1)
　参考例7で得られた化合物VII-1 (278 mg, 0.366 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.563 mL, 7.31 mmol)を加え室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、プラスチックカラムに充填したBONDESIL-SCX(ヴァリアン(VARIAN)社製、6 g)の上部に吸着させ、メタノールで洗浄し、次いでアンモニア　メタノール溶液(東京化成工業社製、2 mol/L)で目的物を溶出させた。目的物を含むフラクションを減圧下濃縮することで化合物I-1 (162 mg, 67.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 661 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.35 (m, 40H), 1.56-1.64 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.09-2.16 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 2H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例10
trans-3,4-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-2)
　参考例9と同様の方法で、参考例8で得られた化合物VII-2(350 mg, 0.463 mmol)を用い、化合物I-2 (224 mg, 73.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 2.09-2.17 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.3 Hz, 2H), 3.99-4.13 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例11
trans-1-メチル-3,4-ビス(((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-3)
　参考例10で得られた化合物I-2 (80 mg, 0.12 mmol)を1,2-ジクロロエタン(1.5 mL)、メタノール(1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.091 mL, 1.22 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロス　オーガニクス(Acros Organics)社製、129 mg, 0.610 mmol)を複数回にわたって加え室温で1.5時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0～93/7)で精製することで化合物I-3 (66 mg, 81%)を得た。
ESI-MS m/z: 671 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.25-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.13-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.66 (dd, J = 9.2, 7.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例12
trans-1-メチル-3,4-ビス(((Z)-オクタデカ-9-エノイルオキシ)メチル)ピロリジン(化合物I-4)
　参考例11と同様の方法で、参考例9で得られた化合物I-1 (50 mg, 0.076 mmol)を用い、化合物I-4 (47 mg, 92%)を得た。
ESI-MS m/z: 675 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35 (m, 40H), 1.56-1.65 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.15-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
実施例1
　参考例1で得られた化合物II-1および参考例11で得られた化合物I-3、および第3表のsiRNA AまたはBを用いて、以下のように製剤を製造した。
　二本鎖核酸は蒸留水に溶解し24 mg/mLに調製して用いた(以下siRNA溶液という)。
　化合物II-1/PEG-DSPE Na=57.3/5.52 mmol/Lとなるように、各脂質を塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。粒子径測定装置(Zetasizer Nano ZS，Malvern Instruments社製)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液 に、siRNA 溶液を、3:1(=リード粒子の分散液:siRNA溶液)の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を調製した。
　一方、化合物II-1/化合物I-3/PEG-DSPE Na/DSPC/コレステロール= 2.98/5.97/2.94/5.71/11.8 mmol/Lとなるように、各脂質を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
　得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/二本鎖核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
　得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに溶媒を生理食塩水に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに、得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生理食塩水を用いて希釈することで、製剤1-Aおよび1-B (化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA AまたはBを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で製剤中の脂質粒子の平均粒子径を測定した。結果を第4表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例2
　参考例1で得られた化合物II-1および参考例11で得られた化合物I-3、および第3表のsiRNA C～Fを用い、実施例1と同様の方法により製剤1-C～F(化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA C～Fを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で測定した。結果を第5表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
実施例3
　参考例1で得られた化合物II-1および参考例11で得られた化合物I-3、および第3表のsiRNA B, D, EおよびGを用い、実施例1と同様の方法により製剤1-B’, 1-D’, 1-E’および1-G (化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA B, D, EおよびGを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で測定した。結果を第6表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
実施例4
　参考例1で得られた化合物II-1および参考例11で得られた化合物I-3、および第3表のsiRNA AまたはBを用い、実施例1と同様の方法により製剤1-A’および 1-B’’ (化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA AおよびBを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で測定した。結果を第7表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例5
　参考例1で得られた化合物II-1および参考例11で得られた化合物I-3、および第3表のsiRNA B, C, D, E, およびFを用い、実施例1と同様の方法により製剤1-B’’’, 1-C’’, 1-D’’, 1-E’’および 1-F’’ (化合物II-1および化合物I-3を脂質として含有し、siRNA B, C, D, EおよびFを二本鎖核酸として含有する組成物)を得た。粒子径測定装置で測定した。結果を第8表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
試験例1
　実施例1で得られた製剤1-A～Bを用いて、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
　ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2はJCRB細胞バンクより受領し、10%非働化ウシ胎仔血清(ギブコ(GIBCO)社製)および1vol%ペニシリン‐ストレプトマイシン(GIBCO社製、15140-122)を含む高グルコース含有DMEM培地(GIBCO社製, 11995-065)で37℃、5%CO2条件下で培養した。MIA PaCa-2を1.6×108 cells / mLの濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し、この細胞懸濁液50 μLをSCIDマウス(日本クレアより入荷)の背部皮下に移植した(8×106 cells /0.05mL リン酸緩衝生理食塩水(PBS) / 匹)。腫瘍体積を指標に一群5匹として群分けを行い、siRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例1で得られた各製剤をマウスに静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水 10mL/kgを投与した。投与前および投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
　得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに0.5 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 10296-028)および5mmのジルコニアボール (アズワン製, 5-4060-13)を添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 分 x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 分)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 分)した。得られた上清200uLを用い、ハイスループット核酸抽出機MagNA Pure96 (ロシュ(Roche)製、5195322)およびCellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製、5467535)にて添付の使用説明に従いRNAを抽出した。抽出したRNAの濃度を吸光光度計DropSense96 (トリニアン (Trinean)製)にて測定し、500-1000 ng相当のRNAについてTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液、反応条件はTranscriptor添付の使用説明書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、定量PCR(qPCR)の鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、CKAP5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
　図1に、腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。
　図1から明らかなように、実施例1で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて、CKAP5遺伝子の発現を抑制した。
試験例2
　実施例2で得られた製剤1-C～Fを用いて、それぞれ試験例1と同様の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
　図2に、腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。
　図2から明らかなように、実施例2で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて、CKAP5遺伝子の発現を抑制した。
試験例3
　実施例2で得られた製剤1-D～Eを用いて、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
　ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2はJCRB細胞バンクより受領し、10%非働化ウシ胎仔血清(ギブコ(GIBCO)社製)および1vol%ペニシリン‐ストレプトマイシン(GIBCO社製、15140-122)を含む高グルコース含有DMEM培地(GIBCO社製, 11995-065)で37℃、5%CO2条件下で培養した。MIA PaCa-2を1.6×108 cells / mLの濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し、この細胞懸濁液50 μLをSCIDマウス(日本クレアより入荷)の背部皮下に移植した(8×106 cells /0.05mL PBS /匹)。腫瘍体積を指標に一群5匹として群分けを行い、siRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例2で得られた各製剤をマウスに静脈内投与した。生理食塩水投与群は、生理食塩水 10mL/kgを投与した。投与前および投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍および大腿骨内腔骨髄細胞を摘出した。摘出した腫瘍および骨髄細胞は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
　得られた腫瘍サンプルについて、試験例1と同様の方法でRNAを抽出し、抽出したRNAからcDNAを得、試験例1と同様にqPCR反応の鋳型とした。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542)を用いた。またprimer/probeとして、それぞれヒト　マウスの各遺伝子に対応する TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、ヒトCKAP5およびマウスCKAP5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
　図3に、腫瘍中ヒトCKAP5 mRNA量を示す。
　図4に、骨髄細胞中マウスCKAP5 mRNA量を示す。
　図3,4から明らかなように、実施例2で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて、腫瘍中CKAP5遺伝子の発現を抑制する一方、正常骨髄中CKAP5遺伝子の発現はほとんど抑制しなかった。
試験例4
　実施例3で得られた製剤1-B’, 1-D’, 1-E’および1-Gを用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
　試験例1と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群6匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0およびDay7にsiRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例3で得られた各製剤を静脈内投与した。対照として生理食塩水 10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay21まで測定し、以下の式を用いて腫瘍体積、体積比を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
 　図5～図8に腫瘍体積の相対値の推移を示す。
　図5～図8から明らかなように、インビボで薬効評価試験した結果、実施例3で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて抗腫瘍作用が強かった。
　よって、本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子の発現を低下させ、CKAP5関連疾患を治療することができることが明らかになった。
試験例5
　実施例4で得られた製剤1-A’および1-B’’を用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
　試験例1と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群6匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0およびDay7にsiRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例4で得られた各製剤を静脈内投与した。対照として生理食塩水 10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay21まで測定し、試験例4と同様にして腫瘍体積、体積比を算出した。図9に腫瘍体積の相対値の推移を示す。
　図9から明らかなように、インビボで薬効評価試験した結果、実施例4で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて抗腫瘍作用が強かった。
　よって、本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子の発現を低下させ、CKAP5関連疾患を治療することができることが明らかになった。
試験例6
　実施例5で得られた製剤1-B’’’, 1-C’’, 1-D’’, 1-E’’および1-F’’を用いて、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
　試験例1と同様にして、ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群6匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0およびDay7にsiRNA 10 mg/kgに相当する量の実施例5で得られた各製剤を静脈内投与した。対照として生理食塩水 10mL/kgを投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay21まで測定し、試験例4と同様にして腫瘍体積、体積比を算出した。図10、11に腫瘍体積の相対値の推移を示す。
　図10、11から明らかなように、インビボで薬効評価試験した結果、実施例5で得られた各製剤は、生理食塩水投与群に比べて抗腫瘍作用が強かった。
　よって、本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子の発現を低下させ、CKAP5関連疾患を治療することができることが明らかになった。
　本発明の組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、CKAP5遺伝子発現を抑制し、CKAP5関連疾患を治療することができる。
配列番号1-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号2-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号3-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号4-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号5-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号6-CKAP5mRNA内のターゲット
配列番号7-siRNA センス
配列番号8-siRNA アンチセンス
配列番号9-siRNA センス
配列番号10-siRNA アンチセンス
配列番号11-siRNA センス
配列番号12-siRNA アンチセンス
配列番号13-siRNA センス
配列番号14-siRNA アンチセンス
配列番号15-siRNA センス
配列番号16-siRNA アンチセンス
配列番号17-siRNA センス
配列番号18-siRNA アンチセンス
配列番号19-siRNA センス
配列番号20-siRNA アンチセンス

Claims (23)

  1. センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも25塩基対を有し、該アンチセンス鎖は、配列番号1～6のいずれか1つのCKAP5遺伝子のmRNAの連続する少なくとも19塩基の配列に相補的な塩基の配列を有し、最大35ヌクレオチドの長さを有する、薬物としての二本鎖核酸と、式(I)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     (式中、R1およびR2は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
    L1およびL2は、同一または異なって-CO-O-または-O-CO-であり、
    aおよびbは、同一または異なって1～3であり、
    R3は水素原子、炭素数1～6のアルキルまたは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子を含有する組成物。
  2. 脂質粒子が、さらに式(II)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (式中、R4およびR5は、同一または異なって炭素数12～24の直鎖状または分枝状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルであり、
    R6は水素原子、炭素数1～6のアルキル、炭素数3～6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質粒子である、請求項1記載の組成物。
  3. R4およびR5が、同一にドデシル、トリデシル、テトラデシル、2,6,10-トリメチルウンデシル、ペンタデシル、3,7,11-トリメチルドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、6,10,14-トリメチルペンタデカン-2-イル、ノナデシル、2,6,10,14-テトラメチルペンタデシル、イコシル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項2記載の組成物。
  4. R4およびR5が、同一にテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである請求項2記載の組成物。
  5. R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1～3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1～6のアルキルもしくは炭素数3～6のアルケニルである請求項3または4記載の組成物。
  6. R3が水素原子またはメチルである請求項1～5のいずれかに記載の組成物。
  7. L1およびL2が-O-CO-であり、R1およびR2が、同一にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項1～6のいずれかに記載の組成物。
  8. L1およびL2が、-CO-O-であり、R1およびR2が、同一にトリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-ヘプタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである請求項1～6のいずれかに記載の組成物。
  9. 薬物として、配列番号7および8、9および10、11および12、13および14、15および16、17および18、または19および20の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸を含有する請求項1～8のいずれかに記載の組成物。
  10. カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成している、請求項1～9のいずれかに記載の組成物。
  11. カチオン性脂質が、該二本鎖核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該二本鎖核酸との複合体を形成しており、脂質粒子が該複合体と該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質粒子である請求項1～9のいずれかに記載の組成物。
  12. 請求項1～11のいずれかに記載の組成物を用いて該二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、CKAP5遺伝子の発現を抑制する方法。
  13. 細胞が、ほ乳類の腫瘍にある細胞である請求項12記載の方法。
  14. 細胞が、ほ乳類の大腸、膵臓、胃、小腸、肝臓または食道にある細胞である請求項12記載の方法。
  15. 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である請求項12～14のいずれかに記載の方法。
  16. 請求項1～11のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、CKAP5関連疾患の治療方法。
  17. 投与する方法が、静脈内投与である請求項16記載の方法。
  18. 請求項1～11のいずれかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、癌の治療方法。
  19. 投与する方法が、静脈内投与である請求項18記載の方法。
  20. 請求項1～11のいずれかに記載の組成物を含む、CKAP5関連疾患の治療に用いるための医薬。
  21. 静脈内投与用である請求項20記載の医薬。
  22. 請求項1～11のいずれかに記載の組成物を含む、癌の治療剤。
  23. 静脈内投与用である請求項22記載の癌の治療剤。
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