[go: up one dir, main page]

WO2015167016A1 - 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents

新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2015167016A1
WO2015167016A1 PCT/JP2015/063140 JP2015063140W WO2015167016A1 WO 2015167016 A1 WO2015167016 A1 WO 2015167016A1 JP 2015063140 W JP2015063140 W JP 2015063140W WO 2015167016 A1 WO2015167016 A1 WO 2015167016A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
flavone
seq
polynucleotide
sugar
hydroxyl group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/063140
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2015167016A9 (ja
Inventor
田中　良和
奈央子 興津
啓祐 松井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Holdings Ltd filed Critical Suntory Holdings Ltd
Priority to EP15786355.6A priority Critical patent/EP3138908A4/en
Priority to CA2947540A priority patent/CA2947540C/en
Priority to US15/308,117 priority patent/US10087427B2/en
Priority to RU2016147263A priority patent/RU2016147263A/ru
Priority to JP2016516426A priority patent/JP6602291B2/ja
Publication of WO2015167016A1 publication Critical patent/WO2015167016A1/ja
Publication of WO2015167016A9 publication Critical patent/WO2015167016A9/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)

Definitions

  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4'-glucoside, and use thereof.
  • the flower color is attributed to four types of pigments: flavonoids, carotenoids, chlorophyll, and betalain.
  • flavonoids exhibit various colors such as yellow, red, purple, and blue.
  • Anthocyanin One group exhibiting red, purple, and blue is collectively called anthocyanin, and the variety of anthocyanin structure is one of the causes of the variety of flower colors.
  • Anthocyanins can be roughly classified into three groups depending on the structure of aglycone, considering their biosynthetic pathway. Vivid red flowers such as carnation and geranium often contain pelargonidin-type anthocyanins, and blue and purple flowers often contain delphinidin-type anthocyanins. The lack of blue and purple varieties in roses, carnations, chrysanthemums and lilies is due to the inability of these plants to synthesize delphinidin-type anthocyanins.
  • anthocyanins are modified with one or more aromatic acyl groups, (ii) anthocyanins coexist with pigments such as flavones and flavonols (Iii) iron ions and aluminum ions coexist with anthocyanins, (iv) the pH of vacuoles where anthocyanins are localized increases from neutral to weakly alkaline, or (v) anthocyanins, pigments, metals It is considered that one of ions forming a complex (such anthocyanins are called metalloanthocyanins) is necessary (hereinafter, Non-Patent Document 1).
  • Flavonoid and anthocyanin biosynthesis has been well studied, and related biosynthetic enzymes and genes encoding them have been identified (see Non-Patent Document 2 below).
  • the gene of flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (F3'5'H) that hydroxylates the flavonoid B ring necessary for delphinidin biosynthesis has been obtained from many plants.
  • these F3′5′H genes are introduced into carnations (hereinafter, see Patent Document 1), roses (hereinafter, Non-Patent Document 3, Patent Documents 2, 3), and chrysanthemums (hereinafter, Patent Document 4).
  • a genetically modified plant in which delphinidin is accumulated in the petals and the color of the flower changes to blue has been created (see Non-Patent Document 4 below).
  • Such carnations and roses are commercially available.
  • Flavon is a kind of organic compound and is a cyclic ketone of a flavan derivative. In a narrow sense, a compound having the chemical formula C 15 H 10 O 2 and a molecular weight of 222.24, 2,3-didehydroflavan-4-one ( 2,3-didehydroflavan-4-one). In a broad sense, derivatives belonging to flavones are referred to as “flavones”. Flavonoids (flavones) in a broad sense are one of the flavonoid categories. Among flavonoids, those having a flavone structure as a basic skeleton and having no hydroxyl group at the 3-position are classified as “flavones”.
  • flavones include apigenin (apigenin; 4 ′, 5,7-trihydroxyflavone) and luteolin (luteolin; 3 ′, 4 ′, 5,7-tetrahydroxyflavone).
  • flavone means a flavone in a broad sense, that is, a derivative belonging to flavones.
  • the gene of flavone synthase (FNS) necessary for flavone biosynthesis is also obtained from many plants. It has been known that flavones have an effect of darkening the color of anthocyanins in blue when they coexist with anthocyanins, and these FNS genes have attracted attention in flower color modification.
  • FNS gene together with F3′5′H into a rose that does not have the ability to synthesize flavones, delphinidin is accumulated in petals, and at the same time, flavones are accumulated, and the color of the flower is further changed to blue (hereinafter referred to as a patent). Reference 5).
  • flavone In addition to flower-blue coloration, flavone absorbs ultraviolet rays, so it protects plants from ultraviolet rays and functions as a signal for insect vision in insect flowers. Flavones are also involved in the interaction between plants and soil microorganisms. Furthermore, flavones are also used as a material for food and cosmetics as a healthy component. For example, flavone is said to have an anti-cancer effect, and it has been demonstrated that ingestion of foods containing a large amount of flavone can help treat or prevent cancer.
  • genes that modify anthocyanins and flavones have been obtained from many plants.
  • glycosyltransferases acyltransferases, methyltransferases, and the like.
  • glycosyltransferase (GT) that catalyzes glycosylation is described.
  • GT glycosyltransferase
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 3-position of anthocyanin has been isolated from gentian, perilla, petunia, rose, snapdragon (hereinafter, non-patent documents 4 to 6, patents). Reference 6).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 5-position of anthocyanin has been isolated from perilla, petunia, gentian, verbena, torenia and the like (hereinafter, non-patent documents 5 to 7, patent document 7). reference).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of flavone has been isolated from Arabidopsis thaliana (refer to Non-Patent Document 8 below).
  • a gene encoding a protein having the activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of baicalen has been isolated from Scutella niger, and the protein expressing this gene in Escherichia coli has the activity of transferring glucose to the 7-position hydroxyl group of flavonoids. It has also been reported to catalyze a reaction showing the following (see Non-Patent Document 9).
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 3'-position of anthocyanin has been isolated from gentian, sturgeon, and cineraria (see Patent Document 8 below).
  • glycosyltransferase uses UDP-glucose as a sugar donor, but recently a glycosyltransferase using acylglucose as a sugar donor has also been identified.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 5-position of anthocyanidin 3-glucoside was isolated from carnation, and a gene encoding a protein having an activity of transferring glucose to the hydroxyl group at the 7-position was isolated from delphinium. (See Non-Patent Documents 10 and 13 below).
  • glycosyltransferases have many proteins having activity to transfer glucose to various hydroxyl groups, but it is considered that many glycosyltransferases whose functions have not been identified still remain. Therefore, there is still a need to obtain glycosyltransferases that function in plants and are useful for flower color modification.
  • flavones Changing the physical properties of flavones is necessary to change the color of flowers and to develop food, pharmaceutical and cosmetic materials. For example, the carnations, roses, and chrysanthemums that accumulate delphinidin are bluish purple. Research is being conducted to make these colors even bluer.
  • Metalloanthocyanins represented by the pigments of camellia, cornflower, salvia, and nemophila are composed of 6 anthocyanins, 6 flavones, and 2 atoms of metal ions, and the components are assembled to form a stable blue pigment.
  • nemophila metalloanthocyanins are formed from nemophilin, malonyl apigenin 4 ′, 7-diglucoside, Mg 2+ , and Fe 3+ .
  • Salvia metalloanthocyanins are formed from cyanosalbianin, apigenin 4 ′, 7-diglucoside, and Mg 2+ .
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a polynucleotide encoding a protein having an activity of specifically transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside, and use thereof. It is to be.
  • the present inventor has intensively studied and conducted experiments. As a result, a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside, has been isolated. It was released and it was confirmed that it could be used, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • polynucleotide according to [1] above which is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5.
  • polynucleotide according to [1] which is a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • [6] A protein encoded by the polynucleotide according to any one of [1] to [5].
  • a polynucleotide encoding a protein having the activity of: The vector according to [7] above, which comprises a polynucleotide selected from the group consisting of:
  • [10] A method for adding a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of a flavone using the polynucleotide according to any one of [1] to [5].
  • a polynucleotide encoding an active protein and (e) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and transferring a sugar to a hydroxyl group at the 4 ′ position of flavone
  • a protein having an activity to transfer sugar specifically to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside is used for modification of flower color by expressing it constitutively or tissue-specifically in a plant. be able to.
  • Flavones are easily generated by introducing a protein having an activity of transferring sugar to the 7-position hydroxyl group of flavone 4'-glucoside. can do.
  • a protein having an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of a flavone is expressed in a plant together with a protein having an activity of transferring a sugar to the 7-position hydroxyl group, so that the 4′-position and the 7-position of the flavone are expressed.
  • a flavone with sugar added to both hydroxyl groups is produced.
  • a method for producing a flavone in which a sugar is added to the hydroxyl group at the 7-position particularly a flavone in which a sugar is added to both the hydroxyl groups at the 4′-position and the 7-position, and a composition comprising the flavone obtained by the production method.
  • NmGT22 protein It is the figure which summarized the reactivity with respect to various flavonoid substrates of NmGT22 protein. It is an alignment figure which compares the amino acid sequence of the enzyme (VvgGT2) which adds saccharide
  • the present invention relates to (a) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5; (B) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5, and has an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone
  • the term “polynucleotide” means DNA or RNA.
  • stringent conditions refers to conditions that enable selective and detectable specific binding between a polynucleotide or an oligonucleotide and genomic DNA. Stringent conditions are defined by a suitable combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is decreased, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased. In addition, washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • the term “stringent conditions” means that the degree of “identity” between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. Further, it means a condition that specifically hybridizes only between nucleotide sequences having high identity, such as 97% or more, most preferably 98% or more.
  • Examples of the “stringent conditions” include conditions where the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, pH 6 to 8 at a temperature of 60 ° C.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • the gene selected by such hybridization may be naturally derived, for example, a plant-derived gene or a non-plant-derived gene.
  • the gene selected by hybridization may be cDNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 Means an amino acid sequence wherein a certain number of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • Site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory It can be performed according to the method described in Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, etc.
  • the DNA according to the present invention is a primer designed based on the nucleotide sequence of the target gene using a method known to those skilled in the art, for example, a method of chemically synthesizing by the phosphoramidide method, etc. It can be obtained by a nucleic acid amplification method using
  • the term “identity” refers to each amino acid residue constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or a polynucleotide sequence (or base sequence). Or the amount (number) of each base that can be determined to be the same in each other's fitness, meaning the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences “Identity” can be easily calculated. Many methods are known for measuring identity between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term “identity” is well known to those skilled in the art (eg, Lesk, A. M. (Ed. ), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W.
  • the numerical value of “identity” described in the present specification may be a numerical value calculated using an identity search program known to those skilled in the art unless otherwise specified, but preferably, MacVector It is a numerical value calculated using the ClustalW program of the application (version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England).
  • the polynucleotide (nucleic acid, gene) of the present invention “encodes” a protein of interest.
  • encode means that the protein of interest is expressed in a state having the activity.
  • encode includes both the meaning of encoding the protein of interest as a continuous structural sequence (exon) or encoding via an intervening sequence (intron).
  • a gene having a native base sequence can be obtained, for example, by analysis using a DNA sequencer as described in the following examples.
  • DNA encoding an enzyme having a modified amino acid sequence can be synthesized using conventional site-directed mutagenesis or PCR based on DNA having a native base sequence.
  • a DNA fragment to be modified is obtained by restriction enzyme treatment of native cDNA or genomic DNA, using this as a template, site-directed mutagenesis or PCR method is performed using a primer into which a desired mutation is introduced, A modified DNA fragment is obtained. Thereafter, the DNA fragment into which this mutation has been introduced may be ligated with a DNA fragment encoding another part of the target enzyme.
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the target amino acid sequence
  • a DNA encoding a full-length amino acid sequence is cleaved with a desired restriction enzyme, and the result When the obtained DNA fragment does not encode the entire target amino acid sequence, a DNA fragment consisting of the missing portion sequence may be synthesized and ligated.
  • the obtained polynucleotide is expressed using a gene expression system in Escherichia coli and yeast, and the enzyme activity is measured, so that the obtained polynucleotide becomes a hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside. It can be confirmed that it encodes a protein having an activity of transferring sugar. Furthermore, by expressing the polynucleotide, a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 7-position of a flavone, particularly a flavone 4'-glucoside, can be obtained.
  • a protein having an activity of transferring a saccharide to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside even if an antibody against the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used.
  • the present invention also relates to (recombinant) vectors, in particular expression vectors, comprising a polynucleotide as described above, and also to a host transformed with the vector.
  • Prokaryotes or eukaryotes can be used as the host.
  • a common host such as a bacterium, for example, a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an Escherichia coli, a microorganism belonging to the genus Bacillus, for example, Bacillus subtilis can be used.
  • eukaryotes lower eukaryotes such as eukaryotic microorganisms such as yeast or filamentous fungi that are fungi can be used.
  • yeast examples include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae.
  • filamentous fungi examples include microorganisms belonging to the genus Aspergillus, such as Aspergillus oryzae. Examples include microorganisms belonging to the genus Aspergillus niger and Penicillium.
  • animal cells or plant cells can be used.
  • animal cells cell systems such as mice, hamsters, monkeys, and humans are used.
  • insect cells such as silkworm cells and silkworm adults themselves are used. Used as a host.
  • the expression vector of the present invention further includes the following (f) to (j): (F) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; (G) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 3 and has an activity of transferring a sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone
  • a polynucleotide encoding H) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (I)
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and transfers sugar to the hydroxyl group at the 4 ′ position of flavone.
  • a polynucleotide encoding a protein having the activity of: A polynucleotide selected from the group consisting of: These polynucleotides encode proteins having the activity of transferring sugars to the 4′-position hydroxyl group of flavones, and are described in detail in International Publication No. WO2013 / 108794 (Patent Document 11).
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region, for example, a promoter, a terminator, an origin of replication, etc., depending on the type of host into which they are introduced.
  • an expression control region for example, a promoter, a terminator, an origin of replication, etc., depending on the type of host into which they are introduced.
  • promoters for bacterial expression vectors conventional promoters such as trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc. are used, and as yeast promoters, for example, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc. are used.
  • yeast promoters for example, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, etc.
  • the promoter for filamentous fungi for example, amylase promoter, trpC promoter and the like are used.
  • viral promoters such as SV40 early promoter and SV40 rate promoter are used.
  • promoters that constitutively express polynucleotides in plant cells include cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, rd29A gene promoter, rbcS promoter, mac-1 promoter, and the like.
  • tissue-specific gene expression a promoter of a gene that is specifically expressed in the tissue can be used.
  • An expression vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme, ligase or the like.
  • transformation of a host with an expression vector can be performed according to a conventional method.
  • the host transformed with the expression vector is cultured, cultivated or grown, and recovered from the culture or medium according to a conventional method, for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, etc.
  • the target protein can be obtained by purification.
  • a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 7-position of flavone 4′-glucoside, particularly a flavone derived from nemophila is described.
  • the polynucleotide according to the present invention is derived from nemophila.
  • the gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside may be a plant, an animal, or a microorganism. As long as it has an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of flavone, it can be used to change the flower color in plants regardless of the origin.
  • the present invention is obtained by introducing an exogenous polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside, and incorporating this into the plant. It also relates to a plant or its progeny or parts or tissues thereof. The form of the part or tissue can be a cut flower.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside according to the present invention, glycosylation at the 7-position of flavone, particularly flavone 4′-glucoside Or can suppress such glycosylation, and as a result, the flower color in the plant can be changed.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring sugar to the hydroxyl group at the 4′-position of the flavone may be introduced into a plant. This makes it possible to efficiently biosynthesize flavones in which sugars are added to both the 4′-position and the 7-position hydroxyl groups in plants.
  • a technique for introducing a polynucleotide into a plant and expressing the polynucleotide constitutively or tissue-specifically can be used.
  • Introduction of DNA into a plant can be performed by methods known to those skilled in the art, such as the Agrobacterium method, binary vector method, electroporation method, PEG method, particle gun method, and the like.
  • transformable plants include roses, carnations, chrysanthemum, snapdragons, cyclamen, orchids, eustoma, freesia, gerbera, gladiolus, gypsophila, kalanchoe, lily, pelargonium, geranium, petunia, torenia, tulip, anthurium, moth orchid , Rice, barley, wheat, rapeseed, potato, tomato, poplar, banana, eucalyptus, sweet potato, soybean, alfalsa, rubin, corn, cauliflower, dahlia and the like.
  • the present invention also relates to a processed product (cut flower processed product) using the cut flower.
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • the flavone in which sugar is added to the hydroxyl group at the 7-position produced by the production method of the present invention particularly the flavone in which sugar is added to both the hydroxyl groups at the 4′-position and the 7-position, It can be used for applications such as methods.
  • RNAi method it is also possible to suppress the expression of a target gene in a plant by an antisense method, a cosuppression method, an RNAi method, or the like.
  • Methods for suppressing the expression of the target gene can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • antisense RNA / DNA technology Bioscience and Industry, 50, 322 (1992), Chemistry, 46, 681] (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell Engineering, 16,1463 (1997)]
  • Triple helix technology Triple helix technology [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)].
  • suppression of gene expression is performed using a single-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the antisense strand of the gene according to the present invention.
  • a method is known as an antisense method.
  • expression of a target gene is suppressed by expressing RNA having a sequence complementary to the gene whose expression is to be suppressed at a high level.
  • single-stranded RNA comprising the entire nucleotide sequence identical to the antisense strand of the polynucleotide (gene) according to the present invention can be used.
  • a single-stranded RNA comprising a part of the same nucleotide sequence as the antisense strand of the gene according to the present invention can also be used.
  • Such partial single-stranded RNA is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the gene according to the present invention and can be appropriately designed by those skilled in the art, but is preferably specific for the gene according to the present invention.
  • the chain length is preferably 5 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 10 to 20 nucleotides.
  • Suppression of gene expression is performed using a single-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the sense strand of the gene according to the present invention. That is, this sense single-stranded nucleic acid can be used for the suppression of gene expression according to the present invention, similarly to the above-described antisense single-stranded nucleic acid.
  • single-stranded RNA comprising the entire nucleotide sequence identical to the sense strand of the gene according to the present invention can be used.
  • a single-stranded RNA comprising a part of the same nucleotide sequence as the gene sense strand can also be used.
  • Such partial single-stranded RNA is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the gene according to the present invention and can be appropriately designed by those skilled in the art, but is preferably specific for the gene according to the present invention.
  • the chain length is preferably 5 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 10 to 20 nucleotides.
  • suppression of gene expression is performed using a double-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the gene according to the present invention.
  • a double-stranded nucleic acid molecule comprising all or part of the same nucleotide sequence as the gene according to the present invention.
  • an antisense or sense single-stranded nucleic acid of the gene according to the present invention can be expressed in angiosperms.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention is preferably DNA, and its chain length and specific nucleotide sequence correspond to the chain length and nucleotide sequence of the intended single-stranded nucleic acid molecule.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention when the antisense single-stranded nucleic acid is expressed, includes the antisense strand of the gene according to the present invention as a coding strand.
  • the double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention when the sense single-stranded nucleic acid is expressed, includes the sense strand of the gene according to the present invention as a coding strand.
  • Double-stranded nucleic acid molecules can be expressed in plants using methods known to those skilled in the art.
  • an expression vector containing a promoter, a double-stranded nucleic acid molecule according to the present invention, a transcription terminator, etc. is introduced into a target plant, and the resulting plant is cultivated to express the double-stranded nucleic acid molecule.
  • An expression vector can be introduced into a plant by methods known to those skilled in the art, for example, the Agrobacterium method, binary vector method, electroporation method, PEG method, particle gun method and the like.
  • RNA As another example of the method for suppressing gene expression using the nucleic acid molecule according to the present invention, there is a cosuppression method.
  • a sense double-stranded DNA having the entire nucleotide sequence of the gene according to the invention is introduced into the target plant.
  • the sense single-stranded RNA according to the present invention is expressed, and the expression of the gene is extremely suppressed by this RNA (Plant Cell 9: 1357-1368, 1997).
  • the present invention provides a novel polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone (particularly flavone 4'-glucoside).
  • a protein having an activity of specifically transferring a sugar to the 7-position hydroxyl group of flavone (particularly flavone 4′-glucoside) is used for modification of flower color by expressing it constitutively or tissue-specifically in plants.
  • a process for producing a flavone in which a sugar is added to the hydroxyl group at the 7-position particularly a flavone in which a sugar is added to both the 4′-position and the 7-position hydroxyl group, and a composition comprising the flavone obtained by the process.
  • the obtained suspension was centrifuged (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and ammonium sulfate was added to the collected supernatant to a saturation concentration of 30%. After stirring at 4 ° C. for 1 hour, the supernatant was collected by centrifugation (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes). Ammonium sulfate was added to the resulting supernatant to a saturation concentration of 70%, stirred at 4 ° C. for 1 hour, and then centrifuged (10000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to obtain a precipitate.
  • ⁇ Enzyme activity measurement using Nemophila petal extract Mix 40 ⁇ l of petal extract, 2 ⁇ l of 50 mM UDP-glucose, 20 ⁇ l of 1M TrisHCl (pH 7.5), 5 ⁇ l of 1 mM apigenin (dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA), and reaction volume with water The reaction solution adjusted to 200 ⁇ l on ice was kept at 30 ° C. for 20 minutes. Thereafter, 200 ⁇ l of stop buffer (90% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA) was added to stop the reaction, and the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)).
  • the detector used Shimadzu PDA SPD-M10AVP to detect flavones at 330 nm.
  • Shim-Pack ODS 150 mm * 4.6 mm (Shimadzu Corporation) was used.
  • liquid A (0.1% TFA aqueous solution
  • liquid B 90% methanol aqueous solution containing 0.1% TFA
  • the flow rate was 0.6 ml / min.
  • Example 2 Determination of retention time and absorption maximum of apigenin 4′-glucoside
  • apigenin 4′-glucoside and apigenin 7-glucoside are biosynthesized as intermediate adults during the process of apigenin 4 ′, 7-diglucoside biosynthesis. Is expected (see FIG. 2). From this, it was determined that the flavone showing the retention time close to that of apigenin 7-glucoside detected in Example 1 was apigenin 4′-glucoside (see FIG. 1). The retention time and absorption maximum of apigenin 4′-glucoside could be determined.
  • nemophila petals have proteins having an activity to transfer sugars to the 4′-position and 7-position hydroxyl groups of flavones depending on UDP-glucose.
  • a flavone 4 ′, 7-diglucoside biosynthetic pathway a pathway in which one enzyme performs glycosylation of the hydroxyl groups at the 4′-position and the 7-position of flavone, 7 after glycosylation of the hydroxyl group at the 4′-position of flavone is performed.
  • NmGT3 and NmGT4 have been proposed as genes encoding proteins having the activity of transferring sugars to the 4′-position and / or the 7-position hydroxyl group of flavone.
  • NmGT8 Patent Document 11, SEQ ID NO: 3 has been obtained as a gene that encodes a protein having a translocation activity.
  • RNA was isolated from petals of Nemophila stage 1 and 2 using Plant RNAeasy Kit (QIAGEN) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • RNAeasy Kit Plant RNAeasy Kit (QIAGEN) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • cDNA derived from petals of Nemophila> After reverse transcription reaction of 30 ⁇ g of Nemophila petal-derived total RNA, a homogenized cDNA library was prepared.
  • the prepared library was amplified for each clone by emulsion PCR, and then the nucleotide sequence was determined by genome sequencer FLX (Roche Diagnostics Japan Co., Ltd.). From the obtained sequence data, a sequence showing identity with the gene sequence of gentian anthocyanin 3′-glycosyltransferase was extracted. By translating these sequences into amino acid sequences and assembling them, candidate genes encoding glycosyltransferases were obtained.
  • Example 4 Obtaining a full-length cDNA sequence of a candidate gene of a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 7-position hydroxyl group of flavone 4'-glucoside]
  • 30 types of glycosyltransferase candidate gene sequences were obtained.
  • An experiment was conducted to obtain full-length cDNA sequences for 20 genes (NmGT10 to 29).
  • the full-length cDNA sequence was obtained using GeneRacer Kit (Invitrogen) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • a region specific to the clone was selected from the cDNA partial sequence obtained in Example 3, a primer for RACE was designed based on the sequence of this region, and the 5 ′ and 3 ′ terminal sequences were determined by RACE PCR. Obtained. Based on this sequence, a primer for amplifying a full-length cDNA sequence is designed, and nemophila cDNA is used as a template, using KOD-plus polymerase (TOYOBO) according to the protocol recommended by the manufacturer. The PCR reaction was carried out with a reaction volume of 50 ⁇ l (held at 94 ° C. for 2 minutes, repeated for 30 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C.
  • TOYOBO KOD-plus polymerase
  • Nemophila cDNA was synthesized according to the protocol recommended by the manufacturer using SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen), using the total RNA isolated in Example 2 as a template.
  • a plasmid pET SUMO-NmGT10-29
  • pET SUMO TA Cloning Kit invitrogen
  • the nucleotide sequence inserted into the plasmid was analyzed, and a full-length cDNA sequence was selected from candidate genes (NmGT10 to 29) encoding a protein having an activity of transferring sugar to the 7-position hydroxyl group of flavone 4'-glucoside. I got it.
  • pET SUMO-NmGT10-29 is utilized as an E. coli expression construct in Example 5 and below.
  • Example 5 Experiment for measuring enzyme activity of candidate protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at 7-position of flavone 4'-glucoside (when using crude enzyme)] ⁇ Expression of glycosyltransferase in E. coli> pET SUMO-NmGT10-29 was introduced into E. coli strain BL2 using One Shot BL21 (DE3) (invitrogen) according to the protocol recommended by the manufacturer to obtain transformed E. coli. This Escherichia coli was cultured using an Overnight Express Autoinduction System 1 (Novagen) according to the protocol recommended by the manufacturer. In 2 ml of the prepared culture solution, transformed E. coli was cultured at 37 ° C.
  • This Escherichia coli solution was added as a preculture solution to 50 ml of the culture solution, followed by main culture at 25 ° C. overnight. The Escherichia coli solution cultured overnight was centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 15 minutes), and the collected cells were mixed with 5 ml of sonic buffer (composition: TrisHCl (pH 7.0): 2.5 mM, dithiothreitol (DTT). ): 1 mM, amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF): 10 ⁇ M), pulverized E.
  • sonic buffer composition: TrisHCl (pH 7.0): 2.5 mM, dithiothreitol (DTT).
  • APIMSF amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride
  • the detector used Shimadzu PDA SPD-M10AVP to detect flavones at 330 nm.
  • Shim-Pack ODS 150 mm * 4.6 mm (Shimadzu Corporation) was used.
  • liquid A (0.1% TFA aqueous solution
  • liquid B 90% methanol aqueous solution containing 0.1% TFA
  • the flow rate was 0.6 ml / min.
  • NmGT22 SEQ ID NO: 1
  • NmGT22-II SEQ ID NO: 5
  • Example 6 Experiment for measuring enzyme activity of protein having activity of transferring sugar to hydroxyl group at position 7 of flavone 4′-glucoside (when protein with added His-Tag is purified)] ⁇ Expression of glycosyltransferase in E. coli and protein purification>
  • the Escherichia coli strain BL2 into which pET SUMO-NmGT22 described in Example 5 was introduced was cultured using the Overnight Express System 1 (Novagen) according to the protocol recommended by the manufacturer. In 8 ml of the prepared culture solution, the transformed Escherichia coli was cultured at 37 ° C. until the OD600 value reached 0.5 (about 4 hours).
  • This Escherichia coli solution was added as a preculture solution to 200 ml of the culture solution, and main culture was performed overnight at 25 ° C.
  • the Escherichia coli solution which was cultured overnight, was centrifuged (1000 ⁇ g, 4 ° C., 10 minutes), and the collected cells were extracted into 20 ml of an extract (composition: buffer (KCl: 300 mM, KH 2 PO 4 : 50 mM, Suspension in imidazole: 5 mM) (pH 8.0), amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF): 10 ⁇ M) and pulverization of E.
  • composition composition: buffer (KCl: 300 mM, KH 2 PO 4 : 50 mM, Suspension in imidazole: 5 mM) (pH 8.0), amidinophanylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF): 10
  • ⁇ Enzyme activity measurement> Mix 10 ⁇ l protein solution, 2 ⁇ l 50 mM UDP-glucose, 10 ⁇ l 1 M TrisHCl (pH 7.5), 1 ⁇ l 2 mM apigenin 4′-glucoside (dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA), and with water
  • the reaction solution prepared on ice so as to have a reaction volume of 100 ⁇ l was kept at 30 ° C. for 20 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of stop buffer (90% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA) was added to stop the reaction, and the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)).
  • the detector used Shimadzu PDA SPD-M10AVP to detect flavones at 330 nm.
  • Shim-Pack ODS 150 mm * 4.6 mm (Shimadzu Corporation) was used.
  • liquid A (0.1% TFA aqueous solution
  • liquid B 90% methanol aqueous solution containing 0.1% TFA
  • the flow rate was 0.6 ml / min.
  • the reaction rate was 99.07% (FIG. 6). Furthermore, when the substrate was 2 mM apigenin 7-glucoside (dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA) under the same reaction conditions, only a small amount of apigenin 4 ′, 7-diglucoside was synthesized, and the reaction The rate was only 2.69% (see FIGS. 5 and 6). Similarly, when the substrate is 2 mM luteolin 7-glucoside (dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA) under the same reaction conditions, only a trace amount of luteolin 4 ′, 7-diglucoside is synthesized, The reaction rate was 16.10% (FIG. 6).
  • NmGT22 protein is selective for the 7th position of flavones such as apigenin 4′-glucoside, luteolin 4′-glucoside, apigenin, luteolin. It was revealed that the substrate specificity was high. It was also clarified that the activity was strongest when a flavone in which a sugar was transferred to the 4'-position hydroxyl group was used as a substrate (see FIG. 6).
  • NmGT22 and NmGT8 were analyzed. Compared to the same nemophila-derived glycosyltransferase as NmGT22, the amino acid sequence identity between NmGT22 and NmGT3, and between NmGT22 and NmGT4 and between NmGT22 and NmGT8 is 24% and 25%, respectively. And 24%.
  • NmGT22 exhibits a function different from that of known glycosyltransferases in plants.
  • NmGT3 and NmGT4 do not have an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group at the 4′-position and / or the 7-position of flavone in plants.
  • NmGT8 transfers sugar to the 4′-position hydroxyl group of flavone, but has no activity to transfer sugar to the 7-position hydroxyl group.
  • VvgGT2 has a function of adding a sugar to the hydroxybenzoic acid and cinnamic acid of grape, but unlike NmGT22, it does not have an activity to transfer sugar specifically to the hydroxyl group at the 7-position of flavone.
  • PcF7GT has an activity to transfer sugar to the hydroxyl group at the 7-position of eriodictyol, a kind of flavonoid, but pear does not contain flavone, and also has sugar transfer activity to flavone 4′-glucoside Also not known about. Therefore, it is considered that the substrate specificity is clearly different from NmGT22, which exhibits a particularly selective activity for flavone 4′-glucoside.
  • NmGT22 also has an activity of specifically transferring a sugar to the hydroxyl group at the 5-position of anthocyanin 3-glucoside (see FIG. 6), but PcF7GT does not have a function of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 5-position of a flavonoid. (Non-patent Document 12).
  • FIG. 8 shows a phylogenetic tree indicating the relationship between the NmGT22 of the present invention and the various enzymes described above.
  • Example 7 Expression of NmGT22 gene in tobacco cultured cell BY-2
  • tobacco cultured cells (BY) co-expressed with NmGT22 and NmGT8 The presence or absence of glycosylation of the 4′-position and the 7-position hydroxyl group of flavone in 2) is evaluated.
  • a binary vector pSPB6261 for co-expressing NmGT22 and NmGT8 in plants was constructed and introduced into BY-2.
  • pBINPLUS vanEngel et al., Transgenic Research 4, p288
  • El235S promoter Mittsuhara et al., 1996) Plat Plat as a promoter for expressing the NmGT22 gene and the NmGT8 gene. , P49
  • HSP terminator Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332
  • BY-2 was added to 100 ml of BY-2 culture liquid medium (composition: inorganic 10 species (NH 4 NO 3 : 1.65 g / L, KNO 3 : 1.9 g / L, KH 2 PO 4 : 170 mg / L , H 3 BO 3 : 6.2 mg / L, MnSO 4 .4H 2 0: 22.3 mg / L, ZnSO 4 .7H 2 O: 8.6 mg / L, Kl: 0.83 mg / L, Na 2 MoO 4 2H 2 0 :, 0.25 mg / LCuSO 4 .5H 2 O: 0.025 mg / L, CoCl 2 .6H 2 O: 0.025 mg / L), CaCl 2 .H 2 O: 440 mg / L, MgSO 4 7H 2 O: 370 mg / L, Fe-EDTA: 42.1 mg / L, Sucrose: 30 g / L, Myo-inositol: 100 mg
  • the co-culture solution of BY-2 and Agrobacterium cultured for two and a half days was centrifuged (800 rpm, 15 ° C., 1 minute), and 10 ml of washing medium (composition: inorganic 10 species (NH) was added to the cell layer from which the supernatant was removed.
  • composition: inorganic 10 species (NH) was added to the cell layer from which the supernatant was removed.
  • RNA isolation was obtained by the method described in Example 3, and cDNA synthesis was performed by the method described in Example 4.
  • the reverse transcription PCR reaction was performed using ExTaq polymerase (Takara) with cDNA as a template according to the protocol recommended by the manufacturer in a reaction volume of 30 ⁇ l (maintained at 94 ° C. for 2 minutes, 1 at 94 ° C.). Min, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 2 minutes, repeated 25 cycles, then held at 4 ° C.).
  • Primers (forward primer: ATGGAATGCAAAAATCCAGATTC, reverse primer: CTAGGTAATAAATCTGAAATTATTG) were designed to specifically amplify the full length cDNA of NmGT22.
  • a 1432b band corresponding to the full-length cDNA was detected, confirming that the NmGT22 gene was transcribed in BY-2.
  • Recombinant BY-2 was cultured in 100 ml of BY-2 culture liquid medium and cultured at 27 ° C. until the OD550 value was 1.1 (about 3 days).
  • BY-2 culture solution 130 ⁇ l of 3 mM apigenin (dissolved in 50% acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA) was added, and further cultured at 27 ° C. for two and a half days.
  • apigenin addition experiment was similarly conducted for BY-2 into which no gene was introduced and BY-2 in which only the NmGT8 gene was introduced as a gene encoding a protein having an activity of transferring sugar to the hydroxyl group of flavone. .
  • the cell layer obtained by centrifuging the BY-2 culture solution (3000 rpm, 15 ° C., 15 minutes) was ground in a mortar in liquid nitrogen, and 2 ml of extraction buffer (composition: methanol containing 1% HCl) was added. Left at room temperature overnight.
  • the supernatant collected by centrifuging the cell extract (3000 rpm, 15 ° C., 15 minutes) was concentrated to 200 ⁇ l using a desiccator.
  • himacCF16RX rotor: T4SS31
  • the cell extract was further centrifuged (15000 rpm, 15 ° C., 15 minutes), and the collected supernatant was passed through a 0.22 ⁇ l filter and analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)).
  • MX-205 rotor: AR015-24
  • TOMY Shimadzu PDA SPD-M10AVP was used as a high-performance liquid chromatography detector to detect flavones at 330 nm.
  • Shim-Pack ODS 150 mm * 4.6 mm was used as the column.
  • liquid A (0.1% TFA aqueous solution) and liquid B (90% methanol aqueous solution containing 0.1% TFA) were used.
  • the flow rate was 0.6 ml / min.
  • apigenin addition experiment was similarly performed for BY-2 into which no gene was introduced and recombinant BY-2 into which only NmGT8 was introduced as a gene encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group of flavone.
  • the cell extract was analyzed ( Figure 9).
  • apigenin 4 ′, 7-diglucoside accounted for 0.10% of the biosynthesized flavone compound, and no apigenin 4′-glucoside was detected. .
  • apigenin 4 ′, 7-diglucoside and apigenin 4′-glucoside were 10.99% of the biosynthesized flavone compounds, and 31. It was found to account for 65%.
  • apigenin 4 ', 7-diglucoside accounts for 26.35% of the biosynthesized flavone compound, and apigenin 4'-glucoside was not detected. Since the remaining 73.65% is a flavone compound contained in the cell extract obtained from the control BY-2, apigenin diglucoside and flavone 7-glucoside biosynthesized by BY-2 intrinsic activity are used. (FIG. 9).
  • NmGT22 functions as a protein having an activity of transferring sugar to the 7-position hydroxyl group of apigenin 4′-glucoside using apigenin 4′-glucoside biosynthesized in BY-2 by NmGT8 as a substrate. It was suggested that By co-expressing NmGT22 and NmGT8, flavone 4 ′, 7-diglucoside can be biosynthesized in the plant.
  • Example 8 Expression of NmGT22 gene in rose
  • the NmGT22 gene of the present invention encodes a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone 4′-glucoside in a plant
  • flavone 4 in roses in which NmGT22 and NmGT8 were co-expressed The presence or absence of glycosylation of the hydroxyl group at the 'position and the 7th position is evaluated. Since rose originally does not biosynthesize flavones, torenia flavone synthase was also expressed.
  • a binary vector pSPB6269 for co-expressing NmGT22, NmGT8 and Torenia flavone synthase in plants was constructed and introduced into roses (variety Ritapahumera).
  • the introduced construct pSPB6269 uses the binary vector pBINPLUS (vanEngel et al., Transgenic Research 4, p288) as a basic skeleton, and has expression cassettes for the torenia flavone synthase gene, the NmGT22 gene, and the NmGT8 gene.
  • the El235S promoter (Mittsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37, p49) was used as a promoter for expressing each gene.
  • Petal pigment analysis was performed on the rose strains in which transcripts were confirmed for the full-length cDNA torenia flavone synthase, full-length cDNA NmGT8 and full-length cDNA NmGT22 thus obtained. Freeze dried petals of 0.2 g of fully bloomed flowers for more than 24 hours, pulverize with a spatula, add 4 ml of extraction buffer (composition: 50% acetonitrile in water containing 0.1% TFA), and over 20 minutes Processed under sonic.
  • extraction buffer composition: 50% acetonitrile in water containing 0.1% TFA
  • the petal extract was further centrifuged (15000 rpm, 15 ° C., 15 minutes), and the collected supernatant was passed through a 0.22 ⁇ l filter and analyzed by high performance liquid chromatography (Prominence (Shimadzu Corporation)).
  • MX-205 rotor: AR015-24
  • TOMY Shimadzu PDA SPD-M10AVP was used as a high-performance liquid chromatography detector to detect flavones at 330 nm.
  • Shim-Pack ODS 150 mm * 4.6 mm was used as the column.
  • liquid A (0.1% TFA aqueous solution) and liquid B (90% methanol aqueous solution containing 0.1% TFA) were used.
  • a 90-minute linear concentration gradient from the 8: 2 mixture to the 0:10 mixture was followed by elution with a 0:10 mixture for 5 minutes.
  • the flow rate was 0.6 ml / min.
  • petal pigment analysis was performed in the same manner for roses into which genes were not introduced and recombinant roses into which only torenia flavone synthase and NmGT8 were introduced (FIG. 10).
  • Flavon 4 ', 7-diglucoside was found to account for 6.20% of the biosynthesized flavone flavonol compound. Since the remaining 93.80% is a flavone flavonol compound obtained from a control rose, flavone 7-glucoside and flavone 4 biosynthesized by rose intrinsic activity, introduced torenia flavone synthase and NmGT8. It was suggested to be '-glucoside (FIG. 10).
  • Example 9 Acquisition of NmGT22-II and measurement of enzyme activity
  • a sequence (NmGT22-II (SEQ ID NO: 5)) showing 98% identity in base sequence with NmGT22 was obtained.
  • PET SUMO-NmGT22-II was prepared by the method described in Example 4, and the enzyme activity was measured by the method described in Example 6.
  • NmGT22-II is a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl group at the 7-position of flavone 4′-glucoside, like NmGT22.
  • NmGT22-II showed the same tendency as NmGT22 in terms of substrate specificity for flavones.
  • NmGT22-II was also very close to NmGT22 in the phylogenetic tree, and the amino acid sequence identity between NmGT22-II and NmGT22 was 99% (FIGS. 8 and 11).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

　フラボン、特にフラボン４'－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの提供。　（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；等からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。

Description

新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
　本発明は、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその使用に関する。
　花産業において、新しい形質を持つ花は常に珍重される。特に、花の最も重要な形質である「色」を変化させた植物の開発は産業上重要視され、これまで、古典的な方法である交配による品種改良によってさまざまな色の花が開発されてきた。交配は有効な品種改良方法であるものの、植物に固有の遺伝的制限があるため、交配可能な近縁種が持つ遺伝子資源しか利用することができないという欠点がある。例えば、長年の交配育種にもかかわらず、バラ、カーネーション、キク、ユリには紫色～青色、リンドウ、アイリスには鮮やかな赤色、ゼラニウム、アサガオには黄色の品種は、これまで作出されていない。
　花の色は、フラボノイド、カロテノイド、クロロフィル、ベタレインの４種類の色素に起因する。この中で、フラボノイドは黄、赤、紫、青といった多様な色を呈する。赤、紫、青色を呈する１グループはアントシアニンと総称され、アントシアニンの構造の多彩さが花の色が多彩である原因の１つである。アントシアニンはその生合成経路を考慮するとアグリコンの構造に依り、大きく３つのグループに分類することができる。カーネーションやゼラニウムのような鮮やかな赤色の花にはペラルゴニジン型アントシアニンが、青色や紫色の花にはデルフィニジン型アントシアニンが含まれることが多い。バラ、カーネーション、キク、ユリに青や紫色の品種が存在しないのは、これらの植物がデルフィニジン型アントシアニンを合成する能力がないことが原因である。
　花色が青くなるためにはデルフィニジンが蓄積することに加え、（ｉ）アントシアニンが１つ又は複数の芳香族アシル基により修飾されること、（ｉｉ）アントシアニンがフラボンやフラボノールなどのコピグメントと共存すること、（ｉｉｉ）鉄イオンやアルミニウムイオンがアントシアニンと共存すること、（ｉｖ）アントシアニンが局在する液胞のｐＨが中性から弱アルカリ性に上昇すること、又は（ｖ）アントシアニン、コピグメント、金属イオンが錯体を形成すること（このようなアントシアニンはメタロアントシアニンと呼ばれる）のいずれかが必要であると考えられている（以下、非特許文献１）。
　フラボノイドやアントシアニン生合成はよく研究され、関連する生合成酵素やそれをコードする遺伝子が同定されている（以下、非特許文献２参照）。例えば、デルフィニジンの生合成に必要なフラボノイドのＢ環を水酸化するフラボノイド３’，５’－水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）の遺伝子は多くの植物から得られている。また、これらのＦ３’５’Ｈ遺伝子をカーネーション（以下、特許文献１参照）、バラ（以下、非特許文献３、特許文献２、３参照）、キク（以下、特許文献４参照）に導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積し、花の色が青く変化した遺伝子組換え植物も作出されている（以下、非特許文献４参照）。このようなカーネーションとバラは市販されている。
　フラボン（flavone）は、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量２２２．２４の化合物、２，３－ジデヒドロフラバン－４－オン（2,3-didehydroflavan-4-one）を指す。広義にはフラボン類に属する誘導体を「フラボン」と称する。広義のフラボン（フラボン類）はフラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。代表的な「フラボン」としてはアピゲニン（apigenin; 4',5,7-trihydroxyflavone）やルテオリン（luteolin; 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone）が挙げられる。本願明細書中、用語「フラボン」とは、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体を意味する。
　フラボンの生合成に必要なフラボン合成酵素（ＦＮＳ）の遺伝子も多くの植物から得られている。フラボンは、アントシアニンと共存するとアントシアニンの色を青く濃くする効果があることが知られており、これらのＦＮＳ遺伝子は花色改変において注目されていた。Ｆ３’５’Ｈと共にＦＮＳ遺伝子を、フラボンを合成する能力がないバラへ導入することにより、花弁でデルフィニジンを蓄積すると同時に、フラボンも蓄積し、花の色がより一層青く変化した（以下、特許文献５参照）。また、フラボンは、花色青色化以外に、紫外線を吸収することから、植物を紫外線から守ったり、虫媒花では昆虫の視覚へのシグナルとして機能する。また、フラボンは植物と土壌微生物との相互作用にも関係している。さらに、フラボンは健康によい成分として食品や化粧品の素材としても用いられている。例えば、フラボンは抗癌作用を有するといわれており、フラボンを多く含む食材を摂取することによって、ガンの治療や予防になることも実証されている。
　また、アントシアニンやフラボンを修飾する遺伝子も多くの植物から得られている。糖転移酵素、アシル基転移酵素、メチル基転移酵素などがあるが、ここでは配糖化反応を触媒する糖転移酵素（ＧＴ）について記載する。例えば、アントシアニンの３位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、シソ、ペチュニア、バラ、キンギョソウなどから単離されている（以下、非特許文献４～６、特許文献６参照）。アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シソ、ペチュニア、リンドウ、バーベナ、トレニアなどから単離されている（以下、非特許文献５～７、特許文献７参照）。フラボンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、シロイヌナズナから単離されている（以下、非特許文献８参照）。バイカレンの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がコガネバナから単離されており、この遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質がフラボノイドの７位の水酸基にグルコースを転移する活性を示す反応を触媒することも報告されている（以下、非特許文献９参照）。アントシアニンの３’位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、リンドウ、チョウマメ、サイネリアから単離されている（以下、特許文献８参照）。また、アントシアニンのＡ環とＣ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がバラで単離されている（以下、特許文献９参照）。アントシアニンのＢ環の異なる２箇所の水酸基に逐次的にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がチョウマメで単離されている（以下、特許文献１０参照）。
　前記した糖転移酵素は、ＵＤＰ－グルコースを糖供与体としているが、最近、アシルグルコースを糖供与体とする糖転移酵素も同定されている。アントシアニジン３-グルコシドの５位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がカーネーションから、７位の水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がデルフィニウムから単離されている（以下、非特許文献１０・１３参照）。さらに、リビングストンデージー由来の糖転移酵素遺伝子を大腸菌で発現させたタンパク質が、in vitro においてフラボノイドの４’位又は７位のいずれか一方の水酸基にグルコースを転移する活性を示すことが報告されている（以下、非特許文献１１参照）。また、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがネモフィラから単離されている（以下、特許文献１１参照）。
　このように糖転移酵素としては様々な水酸基にグルコースを転移する活性を有するタンパク質が多数存在しているが、その機能が同定されていない糖転移酵素も未だ多数残っていると考えられている。したがって、植物内で機能し、花色の改変に有用な糖転移酵素の取得が依然として必要とされている。
国際公開第ＷＯ２００６／１０５５９８号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１０／１２２８４９号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００５／０１７１４７号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００９／０６２２５３号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００８／１５６２１１号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００７／０９４５２１号パンフレット 国際公開第ＷＯ９９／０５２８７号パンフレット 国際公開第ＷＯ０１／０９２５０９号パンフレット 特開２００６－１４９２９３号公報 特開２００５－９５００５号公報 国際公開第ＷＯ２０１３／１０８７９４号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１２／０９６３０７号パンフレット
Natural Product Reports (2009), 26, 884-915 Biosci. Biotechnol. Biochem (2010), 74(9), 1760-1769 Plant Cell Physiol (2007), 48(11), 1589-1600 Plant Cell Physiol (1996), 37(5), 711-716 J. Biol. Chem (1999), 274(11), 7405-7411 Plant Molecular Biology (2002), 48, 401-411 Journal of Experimental Botany (2008), 59(6), 1241-1252 Biosci. Biotechnol. Biochem (2006), 70(6), 1471-1477 Planta (2000), 210, 1006-1013 Plant Cell (2010), 22(10), 3374-89 The Plant Journal (1999), 19(5), 509-519 Threes (2007), 21, 521-529 Plant Cell（2013），25(10)，4150-65
　フラボンの物性を変えることは、花の色を変えることや、食品、医薬品、化粧品の素材の開発に必要である。例えば、デルフィニジンを蓄積しているカーネーション、バラ、キクの色は青紫色であるが、この色をさらに青くする研究が行われている。
　ツユクサ、ヤグルマギク、サルビア、ネモフィラの色素に代表されるメタロアントシアニンは、アントシアニン６分子、フラボン６分子、及び金属イオン２原子からなり、各成分が集合して安定な青色色素を形成している。例えば、ネモフィラのメタロアントシアニンは、ネモフィリン、マロニルアピゲニン４’，７－ジグルコシド、Ｍｇ2+、及びＦｅ3+から形成されている。サルビアのメタロアントシアニンは、シアノサルビアニン、アピゲニン４’，７－ジグルコシド、及びＭｇ2+から形成されている。これまでの研究によって、メタロアントシアニンを形成する青い花はすべて、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを生合成しており、そのフラボンに付加されている糖が、メタロアントシアニン形成における分子認識において、重要な役割を担っていることが分かっている。フラボンの４’位に配位されている糖が形成時の分子認識に重要であり、７位の糖はその安定性に寄与することが示されている（非特許文献１）。これら２つの糖がフラボンに付加されてはじめて、メタロアントシアニンが形成され、美しい青色が発現する。
　かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとその使用を提供することである。
　上記課題を解決すべく、本願発明者は鋭意検討し、実験を重ねた結果、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離し、これを使用することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］以下の（ａ）～（ｅ）：
　（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
　［２］配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［３］配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［４］配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［５］配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記［１］に記載のポリヌクレオチド。
　［６］前記［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
　［７］前記［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
　［８］さらに、以下の（ｆ）～（ｉ）：
　（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有する、前記［７］に記載のベクター。
　［９］前記［７］又は［８］に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
　［１０］前記［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの７位の水酸基に糖を付加する方法。
　［１１］前記フラボンがフラボン４’－グルコシドである、前記［１０］に記載の方法。
　［１２］前記［１］～［５］のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
　［１３］さらに、以下の（ｆ）～（ｉ）：
　（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドが導入された、前記［１２］に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
　［１４］切花である、前記［１２］又は［１３］に記載の植物の部分。
　［１５］前記［１４］に記載の切花を用いた切花加工品。
　［１６］以下の工程：
　前記［９］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
　該非ヒト宿主からフラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
を含む、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
　［１７］前記フラボンがフラボン４’－グルコシドである、前記［１６］に記載の方法。
　［１８］以下の工程：
　前記［９］に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
　該非ヒト宿主から、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
を含む、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。
　［１９］前記フラボンの４’位の水酸基にも糖が付加されている、前記［１８］に記載の方法。
　［２０］前記［１９］に記載の製造方法により製造された４’位及び７位の水酸基に糖が付加されフラボンを含有する組成物。
　本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。
　フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を植物へ導入することにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンを容易に生成することができる。好ましくは、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質と共に植物内で発現させることにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンが生成する。
　また、本発明により、７位の水酸基に糖が付加したフラボン、特に４’位及び７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られたフラボンを含む組成物も提供される。
花弁抽出液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 アピゲニン４’，７－ジグルコシドの生合成経路を説明する図である。 ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニンを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニン４‘－グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液とアピゲニン７－グルコシドを酵素反応させた液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ２２タンパク質の各種フラボノイド基質に対する反応性をまとめた図である。 ＮｍＧＴ２２とブドウのヒドロキシ安息香酸やケイ皮酸に糖を付加する酵素（ＶｖｇＧＴ２）のアミノ酸配列を比較するアライメント図である。 本発明のＮｍＧＴ２２及びそのホモログ（ＮｍＧＴ２２－II）と前記述した諸酵素との関係を指標する系統樹である。 ＮｍＧＴ２２を導入した組換えＢＹ２の抽出液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラの花弁抽出液の高速液体クロマトグラムである。 ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ２２－IIのアミノ酸配列を比較するアライメントである。
　本発明は、（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｅ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。
　本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、好ましくは６００～９００ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
　上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
　また、本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
　本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
　また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。
　本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
　生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
　あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
　また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物であるフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いてもフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。
　本発明は、前記したポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された宿主にも関する。
　宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。
　酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
　本発明の発現ベクターは、さらに、以下の（ｆ）～（ｊ）：
　（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｊ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有してもよい。これらのポリヌクレオチドは、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするものであり、国際公開第ＷＯ２０１３／１０８７９４（特許文献１１）に詳しく記載されている。
　また、本発明の発現ベクターは、それらを導入する宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。
　植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
　発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
　前記発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培又は生育させ、培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。
　本明細書では、ネモフィラ由来のフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明に係るポリヌクレオチドは、ネモフィラ由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。
　本発明は、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを植物に導入し、これを該植物内に含有させることにより得られる、植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織にも関する。該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。本発明に係るフラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、フラボン、特にフラボン４’－グルコシドの７位を配糖化したり、そのような配糖化を抑制することができ、その結果として植物における花色を変更することができる。
　さらに、本発明のポリヌクレオチドに加え、上述のフラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物に導入してもよい。これにより、４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されているフラボンを植物内で効率的に生合成させることが可能となる。
　現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　本発明は、上記切花を用いた加工品（切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　また、本発明の製造方法により製造された７位の水酸基に糖が付加されたフラボン、特に４’位と７位の両方の水酸基に糖が付加されたフラボンは、食品、医薬品、化粧品の製造方法などの用途に使用することができる。
　本発明においては、アンチセンス法、コサプレッション法、ＲＮＡｉ法などによって、植物内で目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。目的の遺伝子の発現を抑制する方法は、当業者に公知の方法に従って行なうことができるが、例えば、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術［バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992) 、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等が挙げられる。例えば、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。このような方法はアンチセンス法として知られている。アンチセンス法では、発現を抑制したい遺伝子に相補的な配列をもつＲＮＡを高レベルで発現させることにより、標的遺伝子の発現が抑制される。この方法では、本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５～１００ヌクレオチド、より好ましくは５～５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０～２０ヌクレオチドとされる。
　遺伝子の発現の抑制は、本発明に係る遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる一本鎖核酸分子を用いて行なわれる。すなわち、このセンス一本鎖核酸は、上記のアンチセンス一本鎖核酸と同様に、本発明による遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。この方法では、本発明による遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の全部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることができる。また、上記の方法では、遺伝子のセンス鎖と同一のヌクレオチド配列の一部を含んでなる一本鎖ＲＮＡを用いることもできる。このような部分的な一本鎖ＲＮＡは本発明による遺伝子の発現を抑制しうるものであればよく、当業者であれば適宜設計することができるが、好ましくは本発明による遺伝子に特異的なものとされ、その鎖長は、好ましくは５～１００ヌクレオチド、より好ましくは５～５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１０～２０ヌクレオチドとされる。
　さらに、遺伝子の発現の抑制は、本発明による遺伝子と同一のヌクレオチド配列の全部又は一部を含んでなる二本鎖核酸分子を用いて行なわれる。例えば、この二本鎖核酸分子を用いることにより、被子植物において本発明による遺伝子のアンチセンス又はセンス一本鎖核酸を発現させることができる。本発明による二本鎖核酸分子は、好ましくはＤＮＡとされ、その鎖長及び具体的なヌクレオチド配列は、目的とする一本鎖核酸分子の鎖長およびヌクレオチド配列に対応するものとされる。例えば、上記アンチセンス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のアンチセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。また、上記センス一本鎖核酸を発現させる場合には、本発明による二本鎖核酸分子は、本発明による遺伝子のセンス鎖をコード鎖として含むものとされる。
　二本鎖核酸分子は、当業者に公知の方法を用いて植物中で発現させることができる。例えば、プロモーター、本発明による二本鎖核酸分子、及び転写ターミネーター等を含む発現ベクター、目的とする植物中に導入し、得られた植物体を栽培することにより、二本鎖核酸分子を発現させることができる。植物への発現ベクターの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　本発明による核酸分子を用いた遺伝子発現の抑制法の他の例としては、コサプレッション法が挙げられる。この方法では、本発明による遺伝子の全ヌクレオチド配列を有するセンス二本鎖ＤＮＡが目的の植物中に導入される。これにより、本発明によるセンス一本鎖ＲＮＡが発現され、このＲＮＡにより該遺伝子の発現が極端に抑制される（Plant Cell 9: 1357-1368, 1997）。
　本発明により、フラボン（特にフラボン４’－グルコシド）の７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする新規なポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、フラボン（特にフラボン４’－グルコシド）の７位の水酸基に特異的に糖を転移する活性を有するタンパク質を製造することが可能となる。本発明により、フラボン（特にフラボン４’－グルコシド）の７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を、植物内で、構成的又は組織特異的に発現させることで、花色の改変に利用することができる。また、本発明により、７位の水酸基に糖が付加したフラボン、特に４’位及び７位の両方の水酸基に糖が付加したフラボンの製法、及び該製法によって得られたフラボンを含む組成物が提供される。
　以下、実施例に従って発明を具体的に説明する。
［実施例１：ネモフィラ花弁におけるフラボンの４’位と７位の水酸基に糖を転移する活性の検出］
　ネモフィラ（Nemophila menziesii)の花弁を、以下のように定義した発達段階に分けて採取し、液体窒素で凍らせ、－８０℃冷凍庫で保存した：
　ステージ１：色が付いていない堅く閉じたつぼみ（約２－５ｍｍ）；
　ステージ２：有色の堅く閉じたつぼみ（約２－５ｍｍ）；
　ステージ３：有色の閉じたつぼみ、がく片がちょうど開こうとしているつぼみ（約５－１０ｍｍ）；
　ステージ４：花弁が開こうとしているつぼみ（約１０－１５ｍｍ）
　ステージ５：完全にひらいた花
＜ネモフィラ花弁抽出液の調製＞
　アントシアニンが生合成される前の花弁のステージ１と２で、フラボン糖転移酵素活性が検出されることが期待される。そこで、ステージ１と２の花弁を用いて、花弁抽出液を調製した。２５０ｍｇの花弁サンプル（－８０℃で保存していたステージ１と２のサンプル１２５ｍｇずつ)を液体窒素中で乳鉢ですりつぶし、２．０ｍｌの抽出バッファー（組成；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、ポリビニルピロリドン４０：５０ｍｇ／ｍｌ、スクロース：１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて、縣濁した。得られた縣濁物を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３０％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を５００μｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２．５ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ－５Ｃｏｌｕｍｓ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５　ＤＮＡ　Ｇｒａｄｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて脱塩することにより、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁抽出液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜ネモフィラ花弁抽出液を用いた酵素活性測定＞
　４０μｌの花弁抽出液、２μｌの５０ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、２０μｌの１Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５μｌの１ｍＭ アピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積２００μｌになるように氷上で調整した反応液を、３０℃で２０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、花弁抽出液を１００℃２０分で熱処理した花弁抽出液を用いて同じ条件下で酵素反応させた反応液を用いた。
　その結果、アピゲニン４’，７－ジグルコシド精製品やアピゲニン７－グルコシド標品と同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンに加え、アピゲニン７－グルコシドと近い保持時間を示すフラボンが生合成された（図１参照）。ＵＤＰ－グルコースを加えずに酵素反応させたときには、アピゲニン以外のピークは検出されなかった。
［実施例２：アピゲニン４’－グルコシドの保持時間・吸収極大の決定］
　ネモフィラ花弁におけるアピゲニン４’，７－ジグルコシドの生合成経路を考慮すると、アピゲニン４’，７－ジグルコシドが生合成される過程で、アピゲニン４’－グルコシドとアピゲニン７－グルコシドが中間成生物として生合成されることが期待される（図２参照）。このことから、実施例１において検出されたアピゲニン７－グルコシドと近い保持時間を示すフラボンは、アピゲニン４’－グルコシドであると判断された（図１参照）。アピゲニン４’－グルコシドの保持時間・吸収極大を決定することができた。
　これらの結果より、ネモフィラ花弁には、ＵＤＰ－グルコースに依存したフラボンの４’位と７位の水酸基にそれぞれ糖を転移する活性を有するタンパク質が存在することが明らかとなった。フラボン４’，７－ジグルコシド生合成経路として、１つの酵素によってフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化が行われる経路、フラボンの４’位の水酸基の配糖化が行われた後に７位の水酸基の配糖化が行われる経路、そしてフラボンの７位の水酸基の配糖化が行われた後に４’位の水酸基の配糖化が行われる経路が存在する可能性が考えられる（図２参照）。これまでに、フラボンの４’位及び／又は７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ３及びＮｍＧＴ４（特許文献１２）が、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８（特許文献１１、配列番号３）が取得されている。
［実施例３：フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの単離＞
　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡｅａｓｙ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者に推奨されているプロトコールに従い、ネモフィラのステージ１と２の花弁からｔｏｔａｌＲＮＡを単離した。
＜ネモフィラの花弁由来のｃＤＮＡの発現解析＞
　３０μｇのネモフィラの花弁由来ｔｏｔａｌＲＮＡの逆転写反応を行った後、均一化ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーをエマルジョンＰＣＲによって、クローンごと増幅した後、ゲノムシークエンサーＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｊａｐａｎ株式会社）により塩基配列の決定を行った。その得られた配列データの中からリンドウのアントシアニン３’－糖転移酵素の遺伝子配列と同一性を示す配列を抽出した。これらの配列をアミノ酸配列に翻訳してアセンブルすることによって、糖転移酵素をコードする候補遺伝子を得た。
［実施例４：フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列の取得］
　実施例３では糖転移酵素候補遺伝子の配列が３０種得られた。その内２０個の遺伝子（ＮｍＧＴ１０～２９）について完全長ｃＤＮＡ配列を取得するための実験を行った。
　完全長ｃＤＮＡ配列の取得は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。実施例３で得られたｃＤＮＡ部分配列の中からそのクローンに特異的な領域を選び、この領域の配列をもとにしてＲＡＣＥ用プライマーを設計し、ＲＡＣＥ　ＰＣＲによって５’，３’末端配列を得た。この配列をもとに、完全長ｃＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーを設計し、ネモフィラｃＤＮＡを鋳型にして、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社） を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、反応体積５０μｌでＰＣＲ反応を行った（９４℃で２分間保持し、９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ネモフィラのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、実施例２で単離したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型にして、製造者に推奨されているプロトコールに従って合成した。このＰＣＲ生成物を用いて、ｐＥＴ　ＳＵＭＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、ＮｍＧＴ遺伝子の完全長を含むプラスミド（ｐＥＴ　ＳＵＭＯ－ＮｍＧＴ１０～２９）を取得した。プラスミドに挿入された塩基配列を解析し、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子（ＮｍＧＴ１０～２９）の中から完全長ｃＤＮＡ配列を取得した。ｐＥＴ　ＳＵＭＯ－ＮｍＧＴ１０～２９は、実施例５以下で大腸菌発現コンストラクトとして活用する。
［実施例５：フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（粗酵素を用いた場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現＞
　ｐＥＴ　ＳＵＭＯ－ＮｍＧＴ１０～２９を、Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
　一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を粗酵素液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
　８０μｌの粗酵素液、２μｌの５０ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、２０μｌの１Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの２ｍＭのアピゲニン４’－グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積２００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で３０分間保持した。その後、２００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴ　ＳＵＭＯベクターを導入した大腸菌の粗酵素液を用いて同じ条件化で酵素反応させた反応液を用いた。
　その結果、ＮｍＧＴ２２について、基質以外のピークがみられた。
　実施例６以降は、ＮｍＧＴ２２（配列番号１）又はそのホモログであるＮｍＧＴ２２－II（配列番号５）について記載する。
［実施例６：フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の酵素活性測定実験（Ｈｉｓ－Ｔａｇを付加したタンパク質を精製した場合）］
＜糖転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
　実施例５で記載したｐＥＴ　ＳＵＭＯ－ＮｍＧＴ２２を導入した大腸菌株ＢＬ２をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
　一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの抽出液（組成；緩衝液（ＫＣl：３００ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4：５０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ）（ｐＨ８．０）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ－Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「ＮｍＧＴ２２タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
　１０μｌのタンパク質溶液、２μｌの５０ｍＭ　ＵＤＰ－グルコース、１０μｌの１ＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μｌの２ｍＭアピゲニン４’－グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で反応体積１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
　その結果、アピゲニン４’，７－ジグルコシドと同じ保持時間・吸収極大を示すフラボンが合成されていた。反応率（基質が変換された割合）は１００％であった（図４、図６参照）。同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン４’－グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）として酵素反応を行った場合には、ルテオリン４’，７－ジグルコシドが合成された。反応率は９９．６８％であった（図６）。一方、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）にした場合にはアピゲニン４’，７－ジグルコシドは合成されず、アピゲニン７－グルコシドが合成された。反応率は７７．１６％であった（図３、図６参照）。同様に、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合も、ルテオリン４’，７－ジグルコシドは合成されず、ルテオリン７－グルコシドが合成された。反応率は９９．０７％であった（図６）。さらに、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのアピゲニン７－グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合は、アピゲニン４’，７－ジグルコシドは微量しか合成されず、反応率は２．６９％にとどまった（図５、図６参照）。同様に、同じ反応条件下で基質を２ｍＭのルテオリン７－グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）とした場合も、ルテオリン４’，７－ジグルコシドは微量しか合成されず、反応率は１６．１０％であった（図６）。さらに、図６に記載の各種フラボノイド化合物（ペラルゴニジン、ペラルゴニジン３－グルコシド、シアニジン、シアニジン３－グルコシド、デルフィニジン、デルフィニジン３－グルコシド、ペオニジン、ペチュニジン、マルビジン、トリセチン、ケンフェロール、ケンフェロール３－グルコシド、ケルセチン、ケルセチン３－グルコシド、ミリセチン、イソビテキシン）、及びベタニジンに対する反応性を調べたところ、ＮｍＧＴ２２タンパク質は、アピゲニン４’－グルコシド、ルテオリン４’－グルコシド、アピゲニン、ルテオリンのようなフラボンの７位を選択的に配糖化し、基質特異性が高いことが明らかとなった。そして、４’位の水酸基に糖が転移されたフラボンを基質としたときの活性がもっとも強いことも明らかとなった（図６参照）。
　また、ＮｍＧＴ２２と既知の糖転移酵素における塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を解析した。ＮｍＧＴ２２と同じネモフィラ由来の糖転移酵素と比較すると、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ３の間の、及びＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ４の間の、及びＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８の間のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ、２４％、及び２５％、及び２４％であった。また、ＮｍＧＴ２２と洋ナシ由来の糖転移酵素であるＰｃＦ７ＧＴの間のアミノ酸配列の同一性は３２％であった（表１参照）。既に同定されている糖転移酵素の中で、ＮｍＧＴ２２と最も同一性が高いアミノ酸配列は、ＶｖｇＧＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＪＮ１６４６８０）であったが、アミノ酸配列の同一性は僅かに６２％であった（表１、図７参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　かかる結果からも、ＮｍＧＴ２２は植物内において既知の糖転移酵素とは異なる機能を示すものと推定される。実際に、ＮｍＧＴ３及びＮｍＧＴ４は、フラボンの４’位及び／又は７位の水酸基に糖を転移する活性を植物では有していない。ＮｍＧＴ８は、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移するものの、７位の水酸基に糖を転移する活性を有していない。ＶｖｇＧＴ２は、ブドウのヒドロキシ安息香酸やケイ皮酸に糖を付加する機能を有するが、ＮｍＧＴ２２のように、フラボンの７位の水酸基に糖を特異的に転移する活性を有してはいない。ＰｃＦ７ＧＴは、フラボノイドの一種であるエリオジクチオールの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するが、洋ナシにはフラボンは含まれておらず、また、フラボン４’－グルコシドへの糖転移活性についても知られていない。よって、フラボン４’－グルコシドに対して特に選択的な活性を示すＮｍＧＴ２２とは明確に異なる基質特異性を有するものと考えられる。さらに、ＮｍＧＴ２２は、アントシアニン３－グルコシドの５位の水酸基に糖を特異的に転移する活性も有するが（図６参照）、ＰｃＦ７ＧＴはフラボノイドの５位の水酸基に糖を転移する機能を有さないことが報告されている（非特許文献１２）。
　また、図８に、本発明のＮｍＧＴ２２と前記した諸酵素との関係を指標する系統樹を示す。
［実施例７：ＮｍＧＴ２２遺伝子のタバコ培養細胞ＢＹ―２における発現］
　本発明のＮｍＧＴ２２遺伝子が、植物内でフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させたタバコ培養細胞（ＢＹ―２）におけるフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化の有無を評価する。
　ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を植物で共発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ６２６１を構築し、ＢＹ－２へ導入した。
　導入したコンストラクトｐＳＰＢ６２６１では、基本骨格としてｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　４，ｐ２８８）を、ＮｍＧＴ２２遺伝子とＮｍＧＴ８遺伝子を発現させるプロモーターとしてＥｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）を、ターミネーターとしてＨＳＰターミネーター（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０１０）５１，３２８－３３２）を使用した。
　ＢＹ－２の形質転換は下記の方法で行った。まず、ＢＹ－２を、１００ｍｌのＢＹ－２培養液体培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ－ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ－ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４－シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／Ｌ）（ｐＨ５．７）で培養し、ＯＤ５５０値が１．３になるまで２７℃で培養した（約３日間）。このＢＹ－２培養液３ｍｌに５ｍｌのＹＥＰ培地（組成；BactoTM　Yeast Extract：１０ｇ/L、BactoTM Peptone：１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）（ｐＨ７．０）で、ＯＤ５５０値が１．７になるまで２８℃で培養したｐＳＰＢ６２６１を導入したアグロバクテリウム溶液５０μｌと１．５μｌの２０ｍＭアセトシリンゴンを加えて、さらに２日半２７℃で培養した。２日半培養したＢＹ－２とアグロバクテリウムの共培養液を遠心分離（８００ｒｐｍ、１５℃、１分）し、上澄み液を除去した細胞層に１０ｍｌの洗浄培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ－ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ－ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４－シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／Ｌ、カルベニシリンニナトリウム）（ｐＨ５．７）を加えて懸濁した。この懸濁作業を５回繰り返し、ＢＹ－２とアグロバクテリウムの共培養液からアグロバクテリウムを除去した。遠心分離には、ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ（ローター：Ｔ４ＳＳ３１）を使用した（ＨＩＴＡＣＨＩ社）。このＢＹ－２培養液１ｍｌを、カナマイシンを含んだ選択培地（組成；無機十種（ＮＨ4ＮＯ3：１．６５ｇ／Ｌ、ＫＮＯ3：１．９ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4：１７０ｍｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3：６．２ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2０：２２．３ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：８．６ｍｇ／Ｌ、Ｋｌ：０．８３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2０：、０．２５ｍｇ／ＬＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．０２５ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ：４４０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：３７０ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ－ＥＤＴＡ：４２．１ｍｇ／Ｌ、Ｓｕｃｒｏｓｅ：３０ｇ／Ｌ、Ｍｙｏ－ｉｎｏｓｉｔｏｌ：１００ｍｇ／Ｌ、Ｔｈｉａｍｉｎ－ＨＣｌ：１ｍｇ／Ｌ、２，４－シクロロフェノキシン酢酸：０．２ｍｇ／Ｌ、カルベニシリンニナトリウム、カナマイシン：１００ｍｇ/L）（ｐＨ５．７）にまき、ＮｍＧＴ２２及びＮｍＧＴ８が導入された組換えＢＹ－２を選抜した。
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のＢＹ－２における発現解析＞
　選抜されたＢＹ－２の細胞塊を用いて、ＮｍＧＴ２２遺伝子の発現解析を行った。ｔｏｔａｌＲＮＡ単離は実施例３に記載した方法で取得し、ｃＤＮＡ合成は実施例４に記載した方法で行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、反応体積３０μｌで行った（９４℃で２分間保持し、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分間保持のサイクルを２５サイクル繰り返した後、４℃で保持した）。ＮｍＧＴ２２の完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマー（フォワードプライマー：ATGGAATGCAAAAATCCAGATTC、リバースプライマー：CTAGGTAATAAATCTGAAATTATTG）を設計した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、完全長ｃＤＮＡに相当する１４３２ｂのバンドが検出されたことから、ＢＹ－２においてＮｍＧＴ２２遺伝子が転写されていることが確認された。
＜ＢＹ－２におけるＮｍＧＴ２２の機能解析＞
　完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が合成されたＢＹ―２系統を選抜するため、さらにＮｍＧＴ８についても同様の発現解析を行った（フォワードプライマー：ATGGAGAAAAAAACTATT、リバースプライマー：CTATTTCCAACCATCCAG、完全長ｃＤＮＡ：１４２５ｂ）。こうして得られた完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が確認されたＢＹ―２系統について、ＮｍＧＴ８及びＮｍＧＴ２２の基質であるアピゲニンを付与する実験を行った。
　組換えＢＹ－２を、１００ｍｌのＢＹ－２培養液体培地で培養し、ＯＤ５５０値が１．１になるまで２７℃で培養した（約３日間）。このＢＹ－２培養液に、３ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液で溶解）を１３０μｌ加えて、さらに２日半２７℃で培養した。
　対照として、遺伝子を導入していないＢＹ－２、フラボンの水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８遺伝子のみを導入したＢＹ―２についても同様にしてアピゲニン付与実験を行った。そのＢＹ－２培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して取り出した細胞層を液体窒素中で乳鉢ですりつぶし、２ｍｌの抽出バッファー（組成；１％ＨＣｌを含むメタノール）を加えて、１晩常温で放置した。その細胞抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して回収した上清を、デシケーターを用いて２００μｌまで濃縮した。遠心分離には、ｈｉｍａｃＣＦ１６ＲＸ（ローター：Ｔ４ＳＳ３１）を使用した（ＨＩＴＡＣＨＩ社）。その細胞抽出液を、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して、回収した上清を０．２２μｌフィルターに通して、高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。遠心分離には、ＭＸ－２０５（ローター：ＡＲ０１５－２４）を使用した（TOMY社）。高速液体クロマトグラフィーの検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間３：７の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、遺伝子を導入していないＢＹ－２、フラボンの水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてＮｍＧＴ８のみを導入した組換えＢＹ－２についても同様にして、アピゲニン付与実験を行い、細胞抽出液の分析を行った（図９）。
　非組換えＢＹ－２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７－ジグルコシドが０．１０％を占めており、アピゲニン４’－グルコシドは検出されなかった。ＮｍＧＴ８のみを導入した組換えＢＹ―２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７－ジグルコシド、及びアピゲニン４’－グルコシドが１０．９９％、及び３１．６５％を占めていることが分かった。ＮｍＧＴ８とＮｍＧ２２を導入した組換えＢＹ－２から得た細胞抽出液においては、生合成されたフラボン化合物のうちアピゲニン４’,７－ジグルコシドが２６．３５％を占めており、アピゲニン４’－グルコシドは検出されなかった。残りの７３．６５％は、対照のＢＹ－２から得た細胞抽出液にも含まれるフラボン化合物であることから、ＢＹ－２内在活性によって生合成された、アピゲニンージグルコシドやフラボン７―グルコシドなどであることが示唆された（図９）。
　ＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えＢＹ－２から得た細胞抽出液において、ＮｍＧＴ８のみを導入したＢＹ－２から得た細胞抽出液において検出されたアピゲニン４’－グルコシドが検出されなかった。このことから、ＮｍＧＴ２２は、ＮｍＧＴ８によってＢＹ－２内で生合成されたアピゲニン４’－グルコシドを基質にして、アピゲニン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質として機能していることが示唆された。ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させることによって、植物内にフラボン４’,７－ジグルコシドを生合成させることが可能となる。
［実施例８：ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現］
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現用コンストラクトの作製＞
　本発明のＮｍＧＴ２２遺伝子が、植物内でフラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させたバラにおけるフラボンの４’位及び７位の水酸基の配糖化の有無を評価する。バラは元来フラボンを生合成しないため、トレニアフラボン合成酵素も共に発現させた。
　ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８とトレニアフラボン合成酵素を植物で共発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ６２６９を構築し、バラ（品種リタパヒューメラ）へ導入した。導入したコンストラクトｐＳＰＢ６２６９は、バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　４，ｐ２８８）を基本骨格とし、トレニアフラボン合成酵素遺伝子、ＮｍＧＴ２２遺伝子、及びＮｍＧＴ８遺伝子それぞれの発現カセットを有する。各遺伝子を発現させるプロモーターとして、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）を用いた。
＜ＮｍＧＴ２２遺伝子のバラにおける発現解析＞
　カナマイシンを含む選択培地でシュートを形成し、発根が見られた個体を馴化し、組換えバラの葉を用いて、実施例７に記載した方法と同様にして、遺伝子発現解析を行った。その結果、バラにおいてＮｍＧＴ２２遺伝子が転写されていることが確認された。
＜バラにおけるＮｍＧＴ２２の機能解析＞
　完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が合成されたバラ系統を選抜するため、さらにトレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８についても同様の発現解析を行った（トレニアフラボン合成酵素：フォワードプライマー：ATGGACACAGTCTTAATCAC、リバースプライマー：TCAAGCACCCGATATTGTG、完全長ｃＤＮＡ：１５３９ｂ。ＮｍＧＴ８フォワードプライマー：ATGGAGAAAAAAACTATT、リバースプライマー：CTATTTCCAACCATCCAG、完全長ｃＤＮＡ：１４２５ｂ）。こうして得られた完全長ｃＤＮＡトレニアフラボン合成酵素と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ８と完全長ｃＤＮＡＮｍＧＴ２２について転写産物が確認されたバラ系統について、花弁の色素分析を行った。０．２ｇの完全にひらいた花の花弁を２４時間以上凍結乾燥させ、スパチュラで細かく砕き、４ｍｌの抽出バッファー（組成；０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液）を加えて、２０分間超音波下で処理した。その花弁抽出液を、さらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５℃、１５分）して、回収した上清を０．２２μｌフィルターに通して、高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。遠心分離には、ＭＸ－２０５（ローター：ＡＲ０１５－２４）を使用した（TOMY社）。高速液体クロマトグラフィーの検出器は島津ＰＤＡ　ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　１５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの９０分間の直線濃度勾配とそれにつづく５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、遺伝子を導入していないバラ、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラについても同様にして、花弁の色素分析を行った（図１０）。
　トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラにおいては、フラボン４’－グルコシド（アピゲニン４’－グルコシド、トリセチン４’－グルコシド）が検出されたが、フラボン４’,７－ジグルコシドは検出されなかった（図１０）。一方で、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラでは、アピゲニン４’,７－ジグルコシドとトリセチン４’,７－ジグルコシドが検出された（図１０）。フラボン４’,７－ジグルコシドは、生合成されたフラボン・フラボノール化合物のうち６．２０％を占めていることが分かった。残りの９３．８０％は、対照のバラからも得られたフラボン・フラボノール化合物であることから、バラ内在活性、導入したトレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８によって生合成された、フラボン７－グルコシドやフラボン４’―グルコシドなどであることが示唆された（図１０）。
　トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８とＮｍＧＴ２２を導入した組換えバラにおいて、トレニアフラボン合成酵素とＮｍＧＴ８のみを導入した組換えバラから検出されなかったフラボン４’,７－ジグルコシドが検出されたことから、ＮｍＧＴ２２は、ＮｍＧＴ８によってバラ花弁内で生合成されたフラボン４’－グルコシドを基質にして、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質として機能していることが示唆された。ＮｍＧＴ２２とＮｍＧＴ８を共発現させることによって、植物内にフラボン４’,７－ジグルコシドを生合成させることが可能となる。
［実施例９：ＮｍＧＴ２２－IIの取得および酵素活性測定実験］
　実施例３、実施例４と同様にして、ＮｍＧＴ２２と塩基配列において９８％の同一性を示す配列（ＮｍＧＴ２２－II（配列番号５））を取得した。
　実施例４に記載した方法で、ｐＥＴ　ＳＵＭＯ－ＮｍＧＴ２２－IIを作製し、実施例６に記載した方法で酵素活性測定を行った。その結果、ＮｍＧＴ２２－IIは、ＮｍＧＴ２２と同様、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質であることが明らかとなった。また、フラボンに対する基質特異性についても、ＮｍＧＴ２２－IIは、ＮｍＧＴ２２と同じ傾向を示した。ＮｍＧＴ２２－IIは系統樹においてもＮｍＧＴ２２と非常に近い位置にあり、ＮｍＧＴ２２－IIとＮｍＧＴ２２の間のアミノ酸配列の同一性は９９％であった（図８、図１１）。

Claims (20)

  1. 　以下の（ａ）～（ｅ）：
    　（ａ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｄ）配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
  2. 　配列番号１又は配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号１又は配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  6. 　配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン４’－グルコシドの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  9. 　さらに、以下の（ｆ）～（ｉ）：
    　（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含有する、請求項７に記載のベクター。
  10. 　請求項７又は８に記載のベクターが導入された非ヒト宿主。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いてフラボンの７位の水酸基に糖を付加する方法。
  12. 　前記フラボンがフラボン４’－グルコシドである、請求項１０に記載の方法。
  13. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された、植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
  14. 　さらに、以下の（ｆ）～（ｊ）：
    　（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（ｇ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｈ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（ｊ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンの４’位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチドが導入された、請求項１２に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
  15. 　切花である、請求項１２又は１３に記載の植物の部分。
  16. 　請求項１４に記載の切花を用いた切花加工品。
  17. 　以下の工程：
    　請求項９に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
    　該非ヒト宿主からフラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取する、
    を含む、フラボンの７位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質の製造方法。
  18. 　前記フラボンがフラボン４’－グルコシドである、請求項１６に記載の方法。
  19. 　以下の工程：
    　請求項９に記載の非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして
    　該非ヒト宿主から、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンを採取する、
    を含む、７位の水酸基に糖が付加されたフラボンの製造方法。
  20. 　前記フラボンが４’位の水酸基にも糖が付加されている、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2015/063140 2014-05-02 2015-05-01 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用 Ceased WO2015167016A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15786355.6A EP3138908A4 (en) 2014-05-02 2015-05-01 Novel glycosyltransferase gene and use thereof
CA2947540A CA2947540C (en) 2014-05-02 2015-05-01 Nemophila menziesii glycosyltransferease gene and use thereof
US15/308,117 US10087427B2 (en) 2014-05-02 2015-05-01 Glycosyltransferase gene and use thereof
RU2016147263A RU2016147263A (ru) 2014-05-02 2015-05-01 Новый ген гликозилтрансферазы и его применение
JP2016516426A JP6602291B2 (ja) 2014-05-02 2015-05-01 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014095243 2014-05-02
JP2014-095243 2014-05-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2015167016A1 true WO2015167016A1 (ja) 2015-11-05
WO2015167016A9 WO2015167016A9 (ja) 2016-01-21

Family

ID=54358737

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/063140 Ceased WO2015167016A1 (ja) 2014-05-02 2015-05-01 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10087427B2 (ja)
EP (1) EP3138908A4 (ja)
JP (1) JP6602291B2 (ja)
CA (1) CA2947540C (ja)
RU (1) RU2016147263A (ja)
WO (1) WO2015167016A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
WO2019069946A1 (ja) * 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3068398A1 (en) * 2017-07-03 2019-01-10 Suntory Holdings Limited Use of malonyltransferase gene
CN113322243B (zh) * 2021-06-22 2022-10-18 中国中医科学院中药研究所 蛋白质ugt236及其编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012096307A1 (ja) * 2011-01-14 2012-07-19 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
WO2013108794A1 (ja) * 2012-01-17 2013-07-25 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012096307A1 (ja) * 2011-01-14 2012-07-19 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
WO2013108794A1 (ja) * 2012-01-17 2013-07-25 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROTANI M ET AL.: "Cloning and expression of UDP-glucose: flavonoid 7-O-glucosyltransferase from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis.", PLANTA, vol. 210, no. 6, 2000, pages 1006 - 1013, XP055234245 *
ISAYENKOVA J ET AL.: "Cloning and functional characterisation of two regioselective flavonoid glucosyltransferases from Beta vulgaris.", PHYTOCHEMISTRY, vol. 67, no. 15, 2006, pages 1598 - 1612, XP028059859 *
KIM JH ET AL.: "Characterization of flavonoid 7- O-glucosyltransferase from Arabidopsis thaliana.", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 70, no. 6, 2006, pages 1471 - 1477, XP055234241 *
KO JAE HYUNG ET AL.: "Four glucosyltransferases from rice: cDNA cloning, expression, and characterization", JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, vol. 165, no. 4, 2008, pages 435 - 444, XP022491956 *
NOGUCHI A ET AL.: "Local differentiation of sugar donor specificity of flavonoid glycosyltransferase in Lamiales.", THE PLANT CELL, vol. 21, no. 5, 2009, pages 1556 - 1572, XP055080762 *
See also references of EP3138908A4 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
JPWO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2018-10-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
CN108777947A (zh) * 2016-03-31 2018-11-09 三得利控股株式会社 具有蓝色系花色的植物及其制作方法
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor
CN108777947B (zh) * 2016-03-31 2022-11-11 三得利控股株式会社 具有蓝色系花色的植物及其制作方法
WO2019069946A1 (ja) * 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2947540C (en) 2023-08-01
CA2947540A1 (en) 2015-11-05
JPWO2015167016A1 (ja) 2017-04-20
US20170058269A1 (en) 2017-03-02
RU2016147263A (ru) 2018-06-05
JP6602291B2 (ja) 2019-11-06
WO2015167016A9 (ja) 2016-01-21
EP3138908A1 (en) 2017-03-08
US10087427B2 (en) 2018-10-02
EP3138908A4 (en) 2017-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6147195B2 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
JP6602291B2 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
JP5936553B2 (ja) 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
CA2585767C (en) A method of adding aromatic acyl groups to sugars at both the 3' and 5 positions of anthocyanins
JP4691720B2 (ja) 新規アントシアニジングルコシル基転移酵素遺伝子
JP7146754B2 (ja) マロニル基転移酵素遺伝子の使用
WO2024135619A1 (ja) フラバノン２－水酸化酵素遺伝子及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15786355

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016516426

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2947540

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15308117

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2016/0004801

Country of ref document: CO

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015786355

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015786355

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016147263

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A