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WO2015030149A1 - 細胞のアンチエイジングに関連する生体分子群 - Google Patents

細胞のアンチエイジングに関連する生体分子群 Download PDF

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WO2015030149A1
WO2015030149A1 PCT/JP2014/072661 JP2014072661W WO2015030149A1 WO 2015030149 A1 WO2015030149 A1 WO 2015030149A1 JP 2014072661 W JP2014072661 W JP 2014072661W WO 2015030149 A1 WO2015030149 A1 WO 2015030149A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
cells
muse
elavl2
gatad2b
Prior art date
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Application number
PCT/JP2014/072661
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English (en)
French (fr)
Inventor
典正 三浦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tottori University NUC
Original Assignee
Tottori University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Tottori University NUC filed Critical Tottori University NUC
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Priority to EP14840797.6A priority patent/EP3040414B1/en
Priority to US14/914,788 priority patent/US10265347B2/en
Priority to JP2015534314A priority patent/JPWO2015030149A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing Muse cell-like cells or a method for extending the life of a cell population.
  • Patent Document 1 describes that as a result of introducing four genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc) into a cell, the cell has become a pluripotent stem cell. ing.
  • Patent Document 2 introduces three genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2) and one miRNA (hsa-miR-372, etc.) into cells. It is described that pluripotent stem cells were produced.
  • Non-Patent Document 1 shows that the efficiency of producing pluripotent stem cells increased when the p53 gene of the cells to be pluripotent stem cells was deleted when the above four or three genes were introduced. Is described. Patent Documents 3 and 4 describe that pluripotent stem cells were prepared by introducing specific RNA strands (such as miR-520d-5p) into cells.
  • Patent Document 5 reports that a cell fraction containing Muse cells has been isolated. This Patent Document 5 describes that the Muse cell of Patent Document 5 can be differentiated into any tissue, is useful as a source of iPS cells (iPS cell creation efficiency is high), and does not undergo gene introduction. It is described that it is separable.
  • pluripotent stem cells there are examples of successful production of pluripotent stem cells, but there are no products that have been approved by the authorities for therapeutic use. This is due to the fact that research in this field has not made any progress due to limited methods for producing pluripotent stem cells. Except for a few of the few methods that have confirmed obvious side effects (for example, canceration in the early stage of culture by c-Myc), the effective methods are further limited.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel method for producing Muse cell-like cells or a method for extending the life of a cell population.
  • Muse cell-like cells appear when the expression of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B is inhibited, as described in Examples below, and has completed the present invention. Also at this time, the life of the cell preparation was surprisingly extended.
  • a method for producing Muse cell-like cells which comprises a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • a Muse cell-like cell or a Muse cell-like cell population obtained through the above production method.
  • a regenerative medical material obtained by culturing Muse cell-like cells obtained through the above production method.
  • a therapeutic agent or a cosmetic comprising the Muse cell-like cell or the Muse cell-like cell population.
  • a Muse cell-like cell inducer, therapeutic agent, cosmetic, or cell life extension agent comprising an inhibitor for ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • a method for extending the life of a cell or a cell population comprising a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B
  • a method for producing CD105 mRNA high-expressing cells, a method for producing fibroblast-producing cells, or a method for activating Muse cell-like cells is provided.
  • Muse cell-like cells can be produced by a novel method. Or according to this invention, the lifetime of a cell or a cell population can be extended significantly.
  • FIG. 1 is a photograph when fibroblasts are cultured.
  • FIG. 2 is a photograph of fibroblasts on day 0 of culture.
  • FIG. 3 is a photograph of fibroblasts in the first month of culture.
  • FIG. 4 is a photograph of fibroblasts at 1 month and 3 weeks of culture.
  • FIG. 5 is a photograph when the lentivirus is introduced into the fibroblasts in the first month of culture and then cultured for 3 weeks.
  • FIG. 6 is a photograph when the cell population of FIG. 5 is further cultured in ReproStem medium for one week.
  • FIG. 7 is a photograph when the Muse cell-like cells of FIG. 6 were further cultured in ReproStem medium for 4 days.
  • FIG. 8 is a photograph when the cell population of FIG.
  • FIG. 5 is further cultured in FBM + FGM-2 medium for one week.
  • FIG. 9 is a photograph when the cell population of FIG. 8 is further cultured in FBM + FGM-2 medium for 4 days.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the expression level of CD105 mRNA for cells with or without siETG introduction.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the expression level of CD105 mRNA over time.
  • FIG. 12 shows the results of measuring the hTERTTER mRNA expression level over time.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the Oct4 mRNA expression level over time.
  • FIG. 14 shows the results of measuring the expression level of SIRT1 mRNA over time.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the expression level of P53 mRNA over time.
  • FIG. 16 shows the results of measuring the expression level of Nanog mRNA over time.
  • FIG. 17 shows the results of measuring collagen production ability over time.
  • FIG. 18 shows the result of introducing hsa-miR-520d-5
  • One embodiment of the present invention is a method for producing a novel Muse cell-like cell.
  • This production method is, for example, a method for producing a Muse cell-like cell, which comprises a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. According to this production method, a Muse cell-like cell or a Muse cell-like cell population can be easily produced.
  • This production method does not necessarily require complicated operations, and is excellent in terms of efficiency and cost.
  • This production method includes a step of introducing an RNA strand that inhibits ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B expression into a cell population, and a step of recovering a Muse cell-like cell from the cell population into which the RNA strand has been introduced. You may go out.
  • the recovery may be performed using cell morphology or gene expression as an index.
  • the recovery includes an operation of separating or isolating.
  • the Muse cell-like cells may highly express endogenous hTERT and SIRT1. Since hTERT and SIRT1 are genes that are highly expressed in young cells, Muse cell-like cells that highly express hTERT and SIRT1 can be said to be youthful cells that are relatively unaged. Further, the Muse cell-like cell may highly express endogenous p53. Since p53 is a gene classified as a malignant tumor suppressor gene, it can be said that Muse cell-like cells that highly express p53 have a low risk of malignant tumor formation.
  • the Muse cell-like cell may be CD105, SIRT1, hTERT, P53, Oct4, Nanog, SSEA-3 positive.
  • the expression level of CD105, SIRT1, hTERT, P53, Oct4, Nanog, SSEA-3 (hereinafter sometimes referred to as “CD105 etc.”) of Muse cell-like cells is, for example, a control sample (eg, hiPSC (HPS0002 253G1)) It is preferable that the expression level is significantly higher than the expression level of CD105 or the like of CD105 or the like, a normal cell, a non-pluripotent cell, or a sample derived therefrom.
  • the expression level of CD105 and the like is, for example, 1.1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10, 20, 30, 40, 50, It may be 100, 500, or 1000 times or more.
  • the method for measuring the expression level of CD105 and the like is preferably real-time PCR from the viewpoint of measurement accuracy and simplicity.
  • Muse cell-like cells may be judged using as an index that the cells are in the shape of eyeballs (black eyes and white eyes). Muse cell-like cells may also be adherent or buoyant. In addition, the Muse cell-like cell may change into an elongated fibroblast-like form after becoming an eyeball-like form, and may further change to an eyeball-like form thereafter.
  • the Muse cell-like cell includes the Muse cell described in Patent Document 5 or a cell having substantially the same properties as the Muse cell. Whether or not it is a Muse cell-like cell may be evaluated by, for example, morphological comparison with the Muse cell of Patent Document 5 or gene expression level comparison.
  • the Muse cell-like cell obtained through the production method of the present embodiment is preferably a younger cell in which hTERT is highly expressed as compared to the Muse cell described in Patent Document 5. Whether or not it is a Muse cell-like cell may be evaluated by, for example, the high expression of one or more of CD105 or the like relative to the control cell.
  • the Muse cell-like cells may have a diameter of 1, 5, 10, 20, 50, 75, or 100 ⁇ m or more, and may be in the range of any two of them. From the viewpoint of efficiently separating Muse cell-like cells from the cell population, the diameter is preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more.
  • HGNC HEL-N1 or HuB.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing a material for regenerative medicine, including a step of culturing the Muse cell-like cell.
  • the regenerative medical material is, for example, a regenerative medical organ.
  • Another embodiment is a regenerative medical material obtained by culturing the Muse cell-like cell.
  • Another embodiment is a method for treating damaged tissue, comprising the step of introducing the Muse cell-like cell or the Muse cell-like cell population into the damaged site.
  • Another embodiment is a therapeutic agent for treating damaged tissue comprising the Muse cell-like cell or the Muse cell-like cell population.
  • Another embodiment is an anti-aging method comprising the step of introducing the Muse cell-like cell or the Muse cell-like cell population into a tissue.
  • Another embodiment is a cosmetic for anti-aging comprising the Muse cell-like cell or the Muse cell-like cell population.
  • One embodiment of the present invention is a Muse cell-like cell inducer comprising an inhibitor against ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. If this inducer is used, Muse cells can be induced from the cells. Further, if this Muse cell-like cell inducer is applied to malignant tumor cells, malignant tumors can be treated. It can also be used as an additive for assisting animal growth in livestock through effects such as suppression of malignant tumors.
  • One embodiment of the present invention is a method for treating damaged tissue, comprising a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B in cells of the damaged tissue. At this time, cells in the damaged tissue are transformed into Muse cells and further differentiated, whereby the damaged tissue is repaired. Yet another embodiment is a therapeutic agent comprising an inhibitor to ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • One embodiment of the present invention is a tissue anti-aging method comprising a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B in a tissue cell. At this time, cells in the tissue are transformed into Muse cells and further differentiated, whereby the tissue is reconstructed.
  • an anti-aging agent or anti-aging cosmetic comprising an inhibitor for ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • One embodiment of the present invention is a method for extending the life span of a cell or a cell population, which comprises the step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • a life extension agent for a cell or cell population comprising an inhibitor to ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • the extended period may be 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, or 30 weeks or more, and may be in the range of any two of them.
  • the extended cell life may be 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 20, 25, 30, or 40 weeks or more, and is within the range of any two of them. Also good.
  • Normal cells form tissues by repeating division.
  • This cell division is generally referred to as cell aging.
  • Cell aging is considered to cause a decrease in tissue function and human aging. This cell aging can be actually observed in an in vitro experiment. Normally, when subculture of normal cells is repeated, the cells do not proliferate after a certain time. This places a limit on the availability of research cells, and is one factor that hinders the progress of research in the field of cell engineering. On the other hand, if the method according to the above-described embodiment is used, the lifetime of a cell or a cell population can be extended.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing a cell or a cell population having an extended life span, which comprises a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. According to this production method, a cell or a cell population with a long life can be produced easily. The obtained cells or cell populations are useful in applications such as research or regenerative medicine because of their extended life span.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing a CD105CD mRNA high-expressing cell, which comprises the step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. According to this production method, CD105 mRNA high-expressing cells can be easily produced. The obtained CD105CD mRNA high-expressing cells can be used for the same applications as the above-mentioned Muse cell-like cells.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing fibroblast-producing cells, which comprises a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. According to this production method, fibroblast-producing cells can be produced easily. The obtained fibroblast-producing cells can be used for the same applications as the above-mentioned Muse cell-like cells.
  • One embodiment of the present invention is a method of activating a Muse cell-like cell, which comprises the step of inhibiting ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B expression or function.
  • Muse cell-like cells can be easily activated.
  • activation includes an increase in cell size. The cell size at this time may be increased to 2, 5, or 10 times or more.
  • the activated Muse cell-like cell can be used for the same use as the above-mentioned Muse cell-like cell.
  • Another embodiment is a Muse cell-like cell activator comprising an inhibitor against ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • One embodiment of the present invention is a method for treating malignant tumors, which comprises a step of inhibiting the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • Another embodiment is a therapeutic agent for a malignant tumor comprising an inhibitor against ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • a conventional therapeutic agent composed of a low molecular weight compound treats a malignant tumor by inducing apoptosis, but the therapeutic method, therapeutic agent, or inducer of the present embodiment converts a malignant tumor cell into a Muse cell-like cell. The therapeutic effect can be exerted by guiding to
  • Each method according to the above embodiment further includes (a) a step of introducing an inhibitor against ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B into the cell, or (b) a step of culturing or growing the cell into which the inhibitor has been introduced. May be included.
  • One embodiment of the present invention is a method for increasing the proportion of Muse cell-like cells in a cell population, comprising the step of bringing an inhibitor against ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B into contact with the cell population.
  • Yet another embodiment is a method of producing a cell population with an increased proportion of Muse cell-like cells comprising the step of contacting the cell population with an inhibitor of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • kits containing the inhibitor described above.
  • This kit may be, for example, a Muse cell-like cell preparation, artificial organ preparation, cell or cell population life extension, anti-aging kit, or therapeutic kit.
  • the kit may further include, for example, a buffer solution, a package insert describing information on active ingredients, a container for containing the active ingredients, or a package.
  • One embodiment of the present invention includes a step of selecting a test substance that decreases the expression or function of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B, a Muse cell-like cell inducer, a cell or cell population life-extension agent, a Muse cell-like agent, It is a screening method for cell activators, anti-aging agents, cosmetics for anti-aging, or therapeutic agents. According to this method, a Muse cell-like cell inducer or the like can be obtained. This method may include a step of introducing a test substance into a cell and a step of measuring the expression or functional amount of ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B.
  • the “cell” used in one embodiment of the present invention may be a somatic cell.
  • somatic cells are other cells excluding germ cells, and include skin cells, fibroblasts, and the like. Somatic cells usually have limited or disappeared pluripotency.
  • the cells may be cells derived from skin, heart, lung, stomach, intestine, kidney, uterus, aortic outer membrane, or mesenchymal tissue.
  • the cell may be a malignant tumor cell.
  • Malignant tumors include, for example, tumors that arise when normal cells are mutated. Malignant tumors can arise from all organs and tissues throughout the body, and when malignant tumor cells proliferate, they are known to clump together and invade and destroy surrounding normal tissues.
  • This malignant tumor is, for example, carcinoma, sarcoma, hematological malignancy, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, adrenal cancer, biliary tract cancer, breast cancer, colon cancer, small intestine cancer, cervical cancer, uterus Body cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, ureteral cancer, renal pelvic cancer, ureteral cancer, penile cancer, testicular cancer, brain tumor, cancer of central nervous system, cancer of peripheral nervous system, head and neck cancer (oral cancer, Pharyngeal cancer, laryngeal cancer, nasal cavity / sinus cancer, salivary gland cancer, thyroid cancer, etc.), glioma, glioblastoma multiforme, skin cancer, melanoma, thyroid cancer, salivary gland cancer, or malignant lymphoma.
  • endogenous means that the test substance is derived from the internal mechanism of the cell.
  • a protein that is constitutively expressed in a cell is endogenously contained only in the expressed protein.
  • “inhibiting gene expression” includes, for example, inhibiting a transcription mechanism from a gene to mRNA, or inhibiting a translation mechanism from mRNA to protein or polypeptide. In addition, for example, it includes inhibiting by inducing the degradation of a gene, mRNA, or protein.
  • the role of a gene includes, for example, producing mRNA derived from the gene, producing a protein derived from the gene, and causing the protein derived from the gene to exhibit activity. Therefore, in one embodiment of the present invention, “inhibiting gene function” includes a decrease in the amount of mRNA or protein produced as a result of inhibiting gene expression.
  • “inhibiting the function of a gene” includes reducing the activity of mRNA derived from the gene or protein derived from the gene.
  • the “state in which expression is inhibited” includes a state in which the expression level is significantly reduced as compared with the normal state.
  • the above “significantly reduced” may be, for example, a state where the expression level is reduced to 0.35, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, or 0 times or less, and the range of any two values thereof It may be in a state of decreasing to the inside. From the viewpoint of stably inducing Muse cell-like cells, or from the viewpoint of more stably extending the life of the cell or cell population, it is preferably 0.2 times or less, more preferably 0.1 times or less.
  • the expression level may be determined using the mRNA level or protein level as an index.
  • “significantly” may include a case where, for example, statistical significance is evaluated using Student's t test (one-sided or two-sided) and p ⁇ 0.05. Or the state in which the difference has arisen substantially is included.
  • the inhibitory strength in the “state in which the function is inhibited” is the same as in the embodiment of the inhibitory strength of expression inhibition.
  • the “inhibitor form” is not particularly limited, and may be, for example, an RNA chain, a DNA chain, a low molecular organic compound, an antibody, or a polypeptide.
  • RNA strand for example, an RNA strand having an RNAi action on ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B (for example, siRNA, shRNA, or small RNA) can be used.
  • DNA strand a DNA strand encoding the RNA strand can be used.
  • the form of this DNA strand may be, for example, a vector.
  • the low molecular organic compound can be obtained by utilizing combinatorial chemistry or HTS (High Throughput Screening).
  • an automatic synthesizer L-COS series (Shoko Scientific Co., Ltd.) may be used.
  • an Octet system (ForteBio) may be used for HTS.
  • the above antibody may be produced by a known antibody production method (for example, the method described in Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628.), Or a contract company (for example, EVEC, Inc.). At this time, it is preferable to prepare an antibody library and select one having a high inhibitory activity.
  • the polypeptide can be purchased from a trust company (for example, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the inhibitor includes a substance that inhibits the expression of the subject or a substance that inhibits the function.
  • the inhibitor is preferably a substance having low cytotoxicity or substantially no cytotoxicity.
  • side effects can be suppressed when the inhibitor is administered in vivo.
  • inhibitors inhibit RNAi action. It is preferably a DNA strand having an RNA strand or a DNA sequence encoding the RNA strand.
  • hsa-miR-520d-5p a nucleic acid containing its guide strand, a nucleic acid substantially equivalent to them, or a nucleic acid that expresses them may be excluded from the form of the inhibitor.
  • RNAi is a function of a target gene, mRNA, or the like by one or more of siRNA, shRNA, miRNA, short or long one or multiple strand RNA, or a modification thereof. Including the phenomenon that is suppressed or silenced. In general, the suppression mechanism by RNAi is sequence-specific and exists in various biological species. The mechanism of RNAi in a typical mammal when siRNA or shRNA is used is as follows. First, a vector capable of expressing siRNA or shRNA is introduced into cells. Then, after siRNA or shRNA is expressed in the cell, siRNA or shRNA becomes single-stranded, and then RISC (RNA-induced Silencing Complex) is formed.
  • RISC RNA-induced Silencing Complex
  • RISC uses the incorporated single-stranded RNA as a guide molecule and recognizes a target RNA strand having a sequence highly complementary to this single-stranded RNA.
  • the target RNA strand is cleaved by an enzyme such as AGO2 in RISC. Thereafter, the cleaved target RNA strand is degraded.
  • AGO2 enzyme
  • a plurality of RNA strands having RNAi action or DNA strands encoding the RNA strands may be co-introduced into the cell, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, or 20 or more may be introduced, and a number within the range of any two of them may be introduced.
  • the RNA strand having RNAi action is preferably a single strand or a double strand from the viewpoint of more stably suppressing the function of the target gene or mRNA.
  • RNAi designer (Invitrogen) or siDirect 2.0 (Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30; 10: 392.) Can be used for designing RNA strands having RNAi action. Alternatively, it may be entrusted to a trust company (for example, GeneCopoeia, Thermo Scientific, etc.). The RNAi action can be confirmed by quantifying the expression level of the RNA strand by real-time RT-PCR. Alternatively, it can also be performed by methods such as analysis of RNA strand expression level by Northern blot, analysis of protein amount by Western blot, and observation of phenotype. In particular, the method using real-time RT-PCR is efficient.
  • siRNA includes an RNA strand capable of inducing RNAi.
  • the duplex of siRNA can be divided into a guide strand and a passenger strand, and the guide strand is incorporated into RISC.
  • the guide strand incorporated into RISC is used to recognize the target RNA.
  • Artificially produced RNAi research is mainly used in RNAi research, but some that exist endogenously in the living body are also known.
  • the guide strand may be composed of RNA having 15 or more bases. If it is 15 bases or more, the possibility of binding to the target polynucleotide with high accuracy increases.
  • the guide strand may be composed of RNA having 40 bases or less. If it is 40 bases or less, the risk that disadvantageous phenomena such as interferon response occur will be lower.
  • shRNA includes a single-stranded RNA strand that can induce RNAi and can form a hairpin-like structure (hairpin-like structure).
  • shRNA is cleaved by Dicer in the cell, and siRNA is excised. It is known that target RNA is cleaved by this siRNA.
  • the shRNA may be composed of 35 or more nucleotides. If it is 35 or more, the possibility that a hairpin-like structure peculiar to shRNA can be formed with high accuracy increases.
  • the shRNA may be composed of RNA of 100 bases or less. If it is 100 bases or less, the risk that disadvantageous phenomena such as interferon response occur will be reduced.
  • the length of shRNA is not necessarily 100 bases or less. However, it is thought that it can function as shRNA.
  • miRNA includes an RNA strand having a function similar to that of siRNA, and is known to suppress or degrade the translation of a target RNA strand.
  • the difference between miRNA and siRNA generally lies in the production pathway and detailed mechanism.
  • small RNA refers to a relatively small RNA strand, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, antisense RNA, and single- or multiple-stranded small RNA. , But not limited to them. When small RNA is used, disadvantageous phenomena such as interferon response can be suppressed.
  • the RNA strand may contain an overhang consisting of 1 to 5 bases at the 5 ′ end or 3 ′ end. In this case, it is considered that the efficiency of RNAi increases. This number may be, for example, 5, 4, 3, 2, or 1 base, and may be within the range of any two of them.
  • the overhang can be, for example, ac, c, uc, ag, aa, or uu. From the viewpoint of stably exhibiting an RNAi action, the overhang is preferably ac, c or uc at the 3 ′ end.
  • the number may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 10 or less, and may be in the range of any two of them.
  • the RNA strand may include a hairpin loop, and the number of bases of the hairpin loop may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, or 3 bases, and any two values thereof. It may be within the range.
  • the base sequence of the hairpin loop may be, for example, gugcuc or cucuuga. As long as this base sequence has a desired effect, one or a plurality of base sequences may be deleted, substituted, inserted, or added. In addition, the notation of each base sequence is the 5 ′ end on the left side and the 3 ′ end on the right side.
  • the length of the RNA strand is, for example, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34. , 40, 50, 60, 80, 100, 200, or 500 bases, or any of these two values. If this number is 15 or more, the possibility of being able to bind to the target polynucleotide with high accuracy increases. Further, if this number is 100 or less, the risk of adverse phenomena such as interferon response occurring when RNA strands are administered in vivo is reduced. Interferon response is generally known as a phenomenon in which cells enter an antiviral state by sensing dsRNA.
  • the “RNA strand” includes those in which a plurality of RNAs or equivalents thereof are combined.
  • the “DNA strand” includes those in which a plurality of DNAs or their equivalents are combined.
  • This RNA strand or DNA strand includes an RNA strand or a DNA strand in the form of a single strand or a plurality of strands (for example, a double strand).
  • the RNA strand or DNA strand may be a cell uptake promoting substance (eg, PEG or a derivative thereof), a label tag (eg, a fluorescent label tag), a linker (eg, a nucleotide linker), or a chemotherapeutic agent (eg, an anti-malignant).
  • a tumor substance or the like The RNA strand or DNA strand can be synthesized using a nucleic acid synthesizer. In addition, it can also be purchased from a trust company (for example, Invitrogen). In vivo RNA strands or DNA strands may form salts or solvates. In addition, RNA strands or DNA strands in vivo may be subjected to chemical modification.
  • RNA strand or DNA strand includes, for example, an RNA strand or DNA strand that forms a salt or solvate, or an RNA strand or DNA strand that has undergone chemical modification.
  • the RNA strand or DNA strand may be an RNA strand analog or a DNA strand analog.
  • the “salt” is not particularly limited, but includes, for example, an anion salt formed with any acidic (eg, carboxyl) group, or a cation salt formed with any basic (eg, amino) group.
  • the salts include inorganic salts or organic salts, for example, salts described in “Berge” et al., “J. Pharm. Sci.,” 1977, 66, 1-19.
  • the “solvate” is a compound formed by a solute and a solvent.
  • the solvent is water, the solvate formed is a hydrate.
  • This solvent is preferably one that does not interfere with the biological activity of the solute. Examples of such preferred solvents include, but are not limited to, water or various buffers.
  • the “chemical modification” include modification with PEG or a derivative thereof, fluorescein modification, or biotin modification.
  • the RNA strand preferably includes a base sequence complementary to a part of the base sequence of mRNA derived from the target gene.
  • the “part” is, for example, 5, 10, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, or 50 bases or more. It may be within the range of any two of these values.
  • Plasmids that generate siRNA or shRNA against a specific gene can be purchased from, for example, a trust company (eg, GeneCopoeia, Thermo Scientific, etc.).
  • a validated shRNA clone set was purchased from GeneCopoeia and used.
  • the validated shRNA clone set used in Example 1 described later includes 4 plasmids that can generate ELAVL2 siRNA, 4 plasmids that can generate TEAD1 siRNA, and 4 plasmids that can generate GATAD2B siRNA. ing.
  • the base sequences of the four plasmids capable of generating ELAVL2 siRNA used in Example 1 described later are SEQ ID NO: 25, 26, 27, or 28.
  • the eight plasmids capable of generating TEAD1 siRNA or GATAD2B siRNA used in Example 1 described below are those in which DNA sequences encoding TEAD1 shRNA or GATAD2B shRNA are mounted on the psiLv-U6 TM vector, respectively.
  • shRNAs containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, 6, 7, or 8 are respectively generated from the four plasmids that can generate ELAVL2 siRNA used in Example 1 described later. These shRNAs are thought to be cleaved by enzymes in cells to generate siRNA. These siRNAs contain the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 (uuauugguguuaaagucacgg), 2 (aauacgagaaguaauaaugcg), 3 (uuguuugucuuaaaggag), or 4 (auuugcaucucugauagaagc), respectively.
  • This base sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4 is a base sequence that is complementary to a part of ELAVL2 mRNA, and is considered to be a part that functions as a guide strand.
  • shRNAs containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 13, 14, 15, or 16 are generated from the four plasmids that can generate TEAD1 siRNA used in Example 1 described later. These shRNAs are thought to be cleaved by enzymes in cells to generate siRNA. These siRNAs contain the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 (uuggcuuaucugcagaguc), 10 (gcuuguuaugaauggcag), 11 (guaagaaugguuggcaugc), or 12 (aguuccuuuaagccaccuu), respectively.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12 is a base sequence complementary to a part of TEAD1EAD mRNA, and is considered to be a part that functions as a guide strand.
  • shRNAs containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 21, 22, 23, or 24 are generated from the four plasmids that can generate GATAD2B siRNA used in Example 1 described later. These shRNAs are thought to be cleaved by enzymes in cells to generate siRNA. These siRNAs contain the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 17 (caacagauucaagcgaaga), 18 (caauagaugcugcauucug), 19 (caucaacauguguggaagg), or 20 (aggauguuguacgcugaca), respectively.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 17, 18, 19, or 20 is a base sequence that is complementary to a part of GATAD2B mRNA, and is considered to be a part that functions as a guide strand.
  • ELAVL2 siRNA is a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4 (for example, the base sequence at positions 1 to 21 of the base sequence of SEQ ID NO: 5, the sequence The base sequence at positions 1-21 of the base sequence of No. 6, the base sequence at positions 1-19 of the base sequence of SEQ ID NO: 7, or the base sequence of positions 1-21 of the base sequence of SEQ ID NO: 8) Good.
  • TEAD1 siRNA is a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12 (for example, the base sequence at positions 1-19 of the base sequence of SEQ ID NO: 13, sequence The base sequence at positions 1-18 of the base sequence of number 14, the base sequence at positions 1-19 of the base sequence of sequence number 15, or the base sequence at positions 1-19 of the base sequence of sequence number 16) Good.
  • GATAD2B siRNA is a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, 18, 19, or 20 (for example, 1- 1 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, 22, 23, or 24). 19-base sequence).
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 40 have a desired effect, (c) one or a plurality of base sequences is deleted or substituted in any base sequence, Inserted or added base sequence, (d) a base sequence having 90% or more homology with any base sequence, (e) a polymorphic base sequence complementary to any base sequence It may be one or more base sequences selected from the group consisting of a base sequence encoded by a polynucleotide that specifically hybridizes to a nucleotide under stringent conditions.
  • the “complementary base sequence” is a base sequence possessed by another highly complementary polynucleotide capable of hybridizing to one polynucleotide.
  • Hybridization refers to the property that a base pair can be formed by hydrogen bonding between bases between a plurality of polynucleotides. Base pairs can occur in Watson-Crick base pairs, Hoogsteen base pairs, or any other sequence specific form. A state in which two single strands are hybridized is called a double strand.
  • the “plurality” may be, for example, 10, 8, 6, 5, 4, 3, or 2, or may be less than any of these values. From the viewpoint of stably inducing Muse cell-like cells, or from the viewpoint of more stably extending the life of cells or cell populations, the smaller the number, the better. It is known to those skilled in the art that an RNA strand that has undergone deletion, addition, insertion, or substitution of one or more bases maintains its biological activity.
  • the above “90% or more” may be, for example, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more, and may be in the range of any two of them. From the viewpoint of stably inducing Muse cell-like cells, or from the viewpoint of more stably extending the life of a cell or a cell population, a larger number is preferable.
  • the above-mentioned “homology” may be calculated according to a method known in the art in the ratio of bases that are homologous in two or more base sequences. Before calculating the ratio, the bases of the base sequence groups to be compared are aligned, and a gap is introduced into a part of the base sequence if necessary to maximize the ratio of the same bases.
  • the following conditions can be adopted as the “stringent conditions”.
  • Use low ionic strength and high temperature for washing e.g., 0.015M sodium chloride / 0.0015M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate at 50 ° C
  • a denaturing agent such as formamide (for example, at 42 ° C., 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, And 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), or (3) 20% formamide, 5 ⁇ SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / ml denaturation Incubate overnight at 37 ° C.
  • the introduction of the inhibitor into cells and the method for culturing the cells can be performed according to methods known in the art.
  • introduction into cells for example, infection introduction using a viral vector, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, or microinjection can be used.
  • only introduced cells can be selected using drug resistance, cell sorter or the like.
  • the medium is, for example, a medium for maintaining undifferentiation (for example, a medium for pluripotent stem cells, ReproStem, a medium for primate ES cells (Cosmo Bio)), or a medium for normal human cells (for example, DMEM or RPMI). Base medium) and the like.
  • the cells may be cultured in a ReproStem under conditions of 37 ° C., 5% CO 2 and 10% FBS.
  • This numerical value may be moved back and forth within a range of, for example, plus or minus 10, 20, or 30%. It may be established or cultured in the absence of feeder cells.
  • the number of days for culturing when establishing Muse cell-like cells is not particularly limited. For example, it may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 30, 60, or 100 days or more. Well, any two of them may be within the range of values.
  • the cell into which the inhibitor is introduced is preferably a fibroblast.
  • a plurality of RNA chains may be introduced into the cell.
  • a plurality of DNA strands may be introduced into the cell.
  • “a plurality of RNA strands” or “a plurality of DNA strands” may be 2, 3, 4, 5, 10, or 20 or more RNA strands or DNA strands.
  • the “vector” refers to a viral (eg, lentivirus, adenovirus, retrovirus, or HIV) vector, a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110).
  • a viral vector eg, lentivirus, adenovirus, retrovirus, or HIV
  • a plasmid derived from E. coli eg, pBR322
  • Bacillus subtilis eg, pUB110
  • Yeast-derived plasmids eg, pSH19
  • bacteriophages such as ⁇ phage, psiCHECK-2, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, pSUPER (OligoEngine), BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector (Invitrogen), pRNATin-H1.4 / Lenti (GenScript, corp., NJ, USA) and the like can be used.
  • the vector may contain components necessary for the expression of a DNA strand, such as a promoter, a replication origin, or an antibiotic resistance gene.
  • the vector may be a so-called expression vector.
  • the “cell population” is a population including a plurality of cells.
  • This cell population may be, for example, a population containing substantially uniform cells.
  • the cell population may also be a cell preparation.
  • a cell preparation may contain, for example, cells and buffer or media components.
  • Muse cell-like cell clusters may contain, for example, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% or more of Muse cell-like cells, and any of these two values are included. It may be.
  • treatment includes the ability to exert a symptom improving effect or a preventive effect on a subject's disease or one or more symptoms associated with the disease.
  • a “therapeutic agent” may be a pharmaceutical composition comprising one or more pharmacologically acceptable carriers.
  • the pharmaceutical composition can be produced by any method known in the technical field of pharmaceutics, for example, by mixing the active ingredient and the carrier.
  • the form of use of the therapeutic agent is not limited as long as it is a substance used for treatment, and it may be an active ingredient alone or a mixture of an active ingredient and an arbitrary ingredient.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, a solid or a liquid (for example, a buffer solution).
  • the therapeutic agent of a malignant tumor contains the drug (preventive agent) used for the prevention of a malignant tumor, the benign improvement inducer of normal malignant tumor, or a normal stem cell induction agent.
  • the administration route of the therapeutic agent is preferably one that is effective in the treatment, and may be, for example, intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or oral administration.
  • the administration form may be, for example, an injection, capsule, tablet, granule or the like.
  • An aqueous solution for injection may be stored in, for example, a vial or a stainless steel container.
  • the aqueous solution for injection may contain, for example, physiological saline, sugar (for example, trehalose), NaCl, or NaOH.
  • the therapeutic agent may contain, for example, a buffer (for example, phosphate buffer), a stabilizer and the like.
  • the dose is not particularly limited, but may be, for example, 0.0001 mg to 1000 mg / kg body weight per dose.
  • the dosing interval is not particularly limited, but may be administered once every 1 to 10 days, for example.
  • the dose, administration interval, and administration method can be appropriately selected depending on the age, weight, symptom, target organ, etc. of the subject. It may also be administered in combination with other appropriate chemotherapeutic drugs.
  • the therapeutic agent preferably contains a therapeutically effective amount or an effective amount of an active ingredient that exhibits a desired action. If the malignant tumor marker decreases after administration, it may be determined that there was a therapeutic effect.
  • a “subject” is a human or non-human mammal (eg, mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, cat, dog, marmoset. , Monkey or chimpanzee).
  • a human or non-human mammal eg, mouse, guinea pig, hamster, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, goat, cow, horse, cat, dog, marmoset. , Monkey or chimpanzee.
  • one embodiment of the present invention is a method for producing a Muse cell-like cell, or a method for extending the lifetime of a cell or cell population, comprising inhibiting the activity of an RNA strand or protein derived from ELAVL2, TEAD1, or GATAD2B. It is.
  • Example 1 Culture of fibroblasts Human adult fibroblasts (NHDF-Ad, TakaraBio) were purchased and cultured in FBM + FGM-2 medium (Ronza) at 37 ° C for 4 weeks. As a result, cell senescence was observed (FIG. 1).
  • FIG. 1 (a) is an image of the 0th day after purchasing NHDF-Ad.
  • FIG. 1 (b) is an image when the cells of FIG. 1 (a) are cultured for 4 weeks.
  • FIG. 1 (c) shows cells that were once stored for about 1 month after the start of culture and re-cultured for NHDF-Ad.
  • FIG. 1 (d) is an image when the cells of FIG. 1 (c) are cultured for 4 weeks.
  • Plasmid DNA (validated shRNA clone set) that generates ELAVL2 siRNA, TEAD1 siRNA, or GATAD2B siRNA was purchased from GeneCopoeia. These plasmid DNAs are introduced into a human kidney mesangial cell line (293FT cells) together with Virapower (used to increase introduction efficiency, Invitrogen), and the particles produced in the culture solution (supernatant) as lentivirus are obtained by ultracentrifugation. Separated as a pellet.
  • the titer was measured using miR-X lenti titeration kit (TakaraBio), and human adult fibroblasts (NHDF-Ad, TakaraBio) were infected with a lentivirus for the purpose of introducing one copy of each cell. Then, the transformed cells were evaluated for cell morphology change, gene expression (Muse cell markers such as CD105, Oct4, Sirt1, hTERT, Nanog, pluripotency markers, longevity markers, aging markers, etc.) and collagen production ability. .
  • the above results will be described in the following (1) to (3).
  • FIG. 2 is a photograph of cells on day 0 of culture.
  • Fig. 3 is a photograph of cells in the first month of culture. It can be seen that the number of cells has decreased and cell senescence has occurred. In addition, 4-5 subcultures were performed during 1 month of culture.
  • Fig. 4 is a photograph of cells at 1 month and 3 weeks of culture. It can be seen that the number of cells is smaller than that in FIG.
  • Fig. 5 is a photograph of cells cultured for 3 weeks after infection with lentivirus in cells in the first month of culture (corresponding to Fig. 3). As shown on the right side of the photograph, a dense cell population was observed. This means that the progression of cell senescence is suppressed and young cells are generated.
  • FIG. 6 is a photograph of the cell population of FIG. 5 when cultured in ReproStem medium (Reprocell Co., Ltd.) for another week. As shown in the center of the photograph, round Muse cell-like cells were observed.
  • FIG. 7 is a photograph of the Muse cell-like cells of FIG. 6 when cultured in ReproStem medium for an additional 4 days. From the Muse cell-like cells in the center of the photograph, it can be seen that many young fibroblasts are generated one after another in a radial pattern. Moreover, this Muse cell-like cell had a form like the eyeball (black eye and white eye) specifically seen in the Muse cell.
  • this Muse cell-like cell survived even after 18 weeks of culture, and continuously produced fibroblasts. If the fibroblasts that have been marketed in the past are simply cultured, they will age in about one month. It was therefore surprising that the cells survived for 18 weeks.
  • FIG. 8 is a photograph when the cell population of FIG. 5 is further cultured in FBM + FGM-2 medium (Ronza) for one week. In this case, no Muse cell-like cells were found.
  • FIG. 9 is a photograph when the cell population of FIG. 8 is further cultured in FBM + FGM-2 medium for 4 days.
  • the fibroblasts were sharper and more young and energetic.
  • NHDF-Ad without siETG did not express CD105 mRNA (2W and 5W in Fig. 10).
  • CD105 mRNA was expressed by siETG introduction (7W in Fig. 10).
  • a very high concentration of CD105 mRNA was expressed (right end of Fig. 10).
  • the Muse cell-like cells of this Example highly expressed CD105, hTERT, Oct4, SIRT1, P53, and Nanog mRNA.
  • the measurement results are shown in FIGS.
  • CD105 is a marker for muse cells.
  • hTERT and SIRT1 are genes that are highly expressed in young cells.
  • Oct4 and Nanog are pluripotency markers.
  • p53 is a gene classified as a malignant tumor suppressor gene.
  • the muse cell-like cells of this Example not only CD105 but also SIRT1, hTERT, P53, Oct4, and Nanog were highly expressed synchronously. That is, the muse cell-like cells obtained in this example were young normal cells having pluripotency. In addition, since p53 mRNA was highly expressed, it can be said that the muse cell-like cell of this Example has a low risk of malignant tumor formation.
  • “W” in the sample name means the culture period (week).
  • the sample name “siETG” in the figure means that the sample has siETG introduced.
  • the sample names “-1” and “-2” in the figure mean that two samples were tested.
  • the transufection in the figure means that siETG has been introduced.
  • Senescence in the figure means that natural death of cells was observed.
  • “10W-siETG-1” in the 9th row from the left in the figure shows the result when reintroducing siETG into “10W-siETG-1” in the 6th row, culturing for 3 days, and collecting and measuring the cells Means the result.
  • 10W-siETG-2 in the 8th row from the left is reintroduced with siETG in the 5th row of “8W-siETG-2” and cultured for 3 days, and then the cells are collected. It means the result when the mRNA expression level is measured.
  • “Muse” in the 10th column from the left in the figure selectively picks one colony containing Muse cell-like cells observed after culturing “10W-siETG-2” in the 8th column from the left for 1 week. It means the result when the mRNA expression level is measured.
  • “19W-siETG” in the figure is the result after further culturing “16W-siETG-2” in the 12th row from the left for 3 weeks.
  • Collagen production ability was measured for the transformed cells.
  • a human collagen type I ELISA kit (ACEL) was used. After gene transfer, fibroblasts were activated and produced more collagen (FIG. 17). This figure is only an example, and some cells were activated by gene transfer because aging was induced around 6 weeks.
  • Hsa-miR-520d-5p (SEQ ID NO: 32) was introduced into 293FT cells and the cell morphology was observed. Specifically, plasmid DNA was first generated using pMIR-520d-5p / GFP from S & B.
  • plasmid DNA was introduced into 293FT cells, virus particles were collected, titered, and then introduced into TIG-1-20 cells.
  • Muse cell-like cells were observed (FIG. 18).
  • the TIG-1-20 cells proliferated radially.
  • the cell was large and the outline of the cell was not sharp. That is, cell aging was advanced as compared with Example 1.

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Abstract

　新規のMuse細胞様細胞の生産方法、又は細胞集団の寿命を延長する方法を明らかにする。　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞の生産方法を用いる。このとき、siRNA又はshRNAによってELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害してもよい。

Description

細胞のアンチエイジングに関連する生体分子群
　本発明は、Muse細胞様細胞の生産方法、又は細胞集団の寿命を延長する方法等に関する。
　2012年のノーベル生理学・医学賞は、iPS細胞を初めて作成した山中伸弥教授と、その作成技術の基となる研究を行ったジョン・ガードン博士に贈られた。このiPS細胞は、これまでになかった全く新しい治療戦略を医療業界にもたらすことが期待されている。
　このiPS細胞に関する技術としては、例えば、特許文献1に、4つの遺伝子（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）を細胞に導入した結果、細胞が多能性幹細胞化したことが記載されている。その他、多能性幹細胞に関する技術としては、例えば、特許文献2に、3つの遺伝子（Oct3/4、Klf4、Sox2）と、1つのmiRNA（hsa-miR-372等）を細胞に導入することで多能性幹細胞を作製したことが記載されている。また、非特許文献1には、上記の4つまたは3つの遺伝子を導入する場合に多能性幹細胞化させる細胞のp53遺伝子を欠損させておくと、多能性幹細胞の作製効率が上昇したことが記載されている。また、特許文献3及び4には、特定のRNA鎖（miR-520d-5p等）を細胞に導入することで多能性幹細胞を作製したことが記載されている。
　一方で、iPS細胞を実際の医療に応用するためには、癌化制御や、分化制御の点で改善の余地がある。そのような中、多能性幹細胞に関する新しいアプローチとして、特許文献5において、Muse細胞を含む細胞画分を分離したことが報告されている。この特許文献5には、特許文献5のMuse細胞が、あらゆる組織へと分化可能なこと、iPS細胞のソースとして有用なこと（iPS細胞の作成効率が高いこと）、遺伝子の導入を経ずに分離可能なこと、が記載されている。
国際公開第2007/069666号 国際公開第2009/075119号 国際公開第2012/008301号 国際公開第2012/008302号 特許第5185443号公報
'Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.' Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5. Epub 2009 Aug 9.
　しかしながら、上記のように多能性幹細胞の作製に成功した事例は存在するが、治療用途として当局から製造販売承認を得た製品は存在しない。これは、多能性幹細胞の作製手法が限られているために、この分野の研究がなかなか前進しないことに起因している。なお、数少ない手法の中から明らかな副作用（例えば、c-Mycによる培養初期の癌化等）が確認されたものを除くと、有効な手法はさらに限られてくる。
　上述の通り、Muse細胞による新しいアプローチも報告されている。しかしながら、特許文献5のMuse細胞は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であることを指標に分離する必要があり、原料の調整及びMuse細胞分離のために、複雑な操作と、コストが発生していた。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規のMuse細胞様細胞の生産方法、又は細胞集団の寿命を延長する方法等を提供することを目的とする。
　本願発明者は、後述する実施例に記載のように、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現を阻害すると、Muse細胞様細胞が出現することを見いだし、本発明を完成させるに至った。またこのとき、驚くべきことに細胞調製物の寿命が延長していた。
　即ち、本発明の一態様によれば、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞の生産方法が提供される。
　また本発明の一態様によれば、上記生産方法を経て得られる、Muse細胞様細胞又はそのMuse細胞様細胞集団が提供される。
　また本発明の一態様によれば、上記生産方法を経て得られるMuse細胞様細胞を培養して得られる、再生医療用材料が提供される。
　また本発明の一態様によれば、上記Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を含む、治療薬又は化粧料が提供される。
　また本発明の一態様によれば、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、Muse細胞様細胞誘導剤、治療薬、化粧料、又は細胞集団の寿命延長剤が提供される。
　また本発明の一態様によれば、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、細胞又は細胞集団の寿命を延長する方法、寿命が延長された細胞又は細胞集団の生産方法、CD105 mRNA高発現細胞の生産方法、線維芽細胞産生細胞の生産方法、又はMuse細胞様細胞を活性化する方法が提供される。
　本発明によれば、新規の方法でMuse細胞様細胞を生産することができる。又は、本発明によれば、細胞又は細胞集団の寿命を大幅に延長することができる。
図1は、線維芽細胞を培養したときの写真である。 図2は、培養0日目の線維芽細胞の写真である。 図3は、培養1ヵ月目の線維芽細胞の写真である。 図4は、培養1ヵ月と3週間目の線維芽細胞の写真である。 図5は、培養1ヵ月目の線維芽細胞にレンチウイルスを感染導入させた後、3週間培養したときの写真である。 図6は、図5の細胞集団を、さらに1週間、ReproStem培地で培養したときの写真である。 図7は、図6のMuse細胞様細胞を、さらに4日間、ReproStem培地で培養したときの写真である。 図8は、図5の細胞集団を、さらに1週間、FBM+FGM-2培地で培養したときの写真である。 図9は、図8の細胞集団を、さらに4日間、FBM+FGM-2培地で培養したときの写真である。 図10は、siETG導入又は未導入の細胞について、CD105 mRNA発現量を測定した結果である。 図11は、CD105 mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図12は、hTERT mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図13は、Oct4 mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図14は、SIRT1 mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図15は、P53 mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図16は、Nanog mRNA発現量を経時的に測定した結果である。 図17は、コラーゲン産生能を経時的に測定した結果である。 図18は、293FT細胞にhsa-miR-520d-5pを導入した結果である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。
　本発明の一実施形態は、新規のMuse細胞様細胞を生産方法である。この生産方法は、例えば、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞の生産方法である。この生産方法によれば、簡便にMuse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を生産することができる。この生産方法は、複雑な操作を必ずしも必要とせず、効率、及びコストの面から優れている。
　この生産方法は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現を阻害するRNA鎖を細胞集団に導入する工程と、上記RNA鎖が導入された細胞集団から、Muse細胞様細胞を回収する工程と、を含んでいてもよい。上記回収は、細胞形態、又は遺伝子発現を指標にして回収してもよい。上記回収は、分離又は単離する操作を含む。
　上記Muse細胞様細胞は、内在性のhTERT及びSIRT1を高発現していてもよい。hTERT及びSIRT1は若い細胞で発現量が高い遺伝子であるため、hTERT及びSIRT1を高発現しているMuse細胞様細胞は、老化が比較的進んでいない、若々しい細胞といえる。また上記Muse細胞様細胞は、内在性のp53を高発現していてもよい。p53は悪性腫瘍抑制遺伝子に分類される遺伝子であるため、p53を高発現しているMuse細胞様細胞は悪性腫瘍化のリスクが低いといえる。
　上記Muse細胞様細胞は、CD105、SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanog、SSEA-3陽性であってもよい。Muse細胞様細胞のCD105、SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanog、SSEA-3（以下、「CD105等」と称することもある）の発現量は、例えば、コントロール試料（例えば、hiPSC（HPS0002 253G1）、CD105等ノックアウト細胞、正常細胞、非多能性細胞、またはそれらに由来する試料等）のCD105等発現量に対して、有意に高発現していることが好ましい。またこのCD105等の発現量は、例えば、コントロール試料のCD105等発現量に対して、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、100、500、又は1000倍以上であってもよい。CD105等の発現量の測定方法は、測定精度及び簡便性の面からリアルタイムPCRが好ましい。
　Muse細胞様細胞の存在は、細胞が目玉（黒目と白目）のような形態をしていることを指標にして、判断してもよい。またMuse細胞様細胞は、接着性又は浮遊性であってもよい。またMuse細胞様細胞は、目玉様の形態になった後、細長い線維芽細胞様の形態に変化してもよく、さらにその後目玉様の形態に変化してもよい。またMuse細胞様細胞は、上記特許文献5に記載のMuse細胞、又はそのMuse細胞に実質的に同等の性質の細胞を含む。Muse細胞様細胞であるかどうかは、例えば、上記特許文献5のMuse細胞との形態比較、又は遺伝子発現量比較等によって評価してもよい。但し、本実施形態の生産方法を経て得られるMuse細胞様細胞は、上記特許文献5に記載のMuse細胞に比べて、hTERTが高発現した、より若い細胞であることが好ましい。またMuse細胞様細胞であるかどうかは、例えば、コントロール細胞に対してCD105等の1つ以上が高発現していることによって評価してもよい。
　上記Muse細胞様細胞は、直径が1、5、10、20、50、75、又は100μm以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。細胞集団中からMuse細胞様細胞を効率よく分離する観点からは、直径は5μm以上が好ましく、10μm以上がより好ましい。
　なお、ELAVL2等に関する塩基配列等の詳細はHGNC(HUGO Gene Nomenclature Committee)又はNCBI（National Center for Biotechnology Information）のWEBサイトから見ることができる。HGNCに記載されているHGNC IDは、ELAVL2がHGNC:3313、TEAD1がHGNC:11714、GATAD2BがHGNC:30778である。ELAVL2 mRNAは、配列番号29の塩基配列を含んでいてもよい。TEAD1 mRNAは、配列番号30の塩基配列を含んでいてもよい。GATAD2B mRNAは、配列番号31の塩基配列を含んでいてもよい。なお、各遺伝子は別の呼び方をされることがあり、別の呼称はHGNCのWEBサイトに記載されている。そのため、各遺伝子は別の呼称で呼ばれることがあってもよい。例えば、ELAVL2は、HEL-N1又はHuBと呼ばれる遺伝子を含む。
　本発明の一実施形態は、上記Muse細胞様細胞を培養する工程を含む、再生医療用材料の生産方法である。再生医療用材料は、例えば、再生医療用臓器である。また別の実施形態は、上記Muse細胞様細胞を培養して得られる、再生医療用材料である。また別の実施形態は、上記Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を損傷部位に導入する工程を含む、損傷組織の治療方法である。また別の実施形態は、上記Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を含む、損傷組織を治療するための治療薬である。また別の実施形態は、上記Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を組織に導入する工程を含む、アンチエイジング方法である。また別の実施形態は、上記Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を含む、アンチエイジングのための化粧料である。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、Muse細胞様細胞誘導剤である。この誘導剤を用いれば、細胞からMuse細胞を誘導することができる。また、このMuse細胞様細胞誘導剤を悪性腫瘍細胞に適用すれば、悪性腫瘍を治療することができる。また、悪性腫瘍の抑制等の効果を通して、畜産における動物の成育を補助するための添加剤等にも使用できる。
　本発明の一実施形態は、損傷組織の細胞におけるELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、損傷組織の治療方法である。このとき、損傷組織中の細胞がMuse細胞に形質転換し、さらに分化することによって、損傷組織が修復される。また別の実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、治療薬である。
　本発明の一実施形態は、組織の細胞におけるELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、組織のアンチエイジング方法である。このとき、組織中の細胞がMuse細胞に形質転換し、さらに分化することによって、組織が再構成される。また別の実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、アンチエイジング剤又はアンチエイジングのための化粧料である。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、細胞又は細胞集団の寿命を延長する方法である。この方法によれば、細胞又は細胞集団の寿命を延長できるため、研究用の細胞を長期間培養することができる。また、アンチエイジングに利用することができる。また別の実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、細胞又は細胞集団の寿命延長剤である。延長する期間は、1、2、3、4、5、10、15、20、25、又は30週以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。延長された細胞の寿命は、6、7、8、9、10、15、18、20、25、30、又は40週以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
　正常細胞は、分裂を繰り返すことで、組織を形成する。その一方で、分裂の回数には限界があり、通常、細胞はあるときを境に分裂を停止することが知られている。この細胞分裂が停止状態に向かうことを、一般的に、細胞老化という。細胞老化は、組織の機能低下や、ヒトの老化の原因となると考えられている。この細胞老化は、in vitro実験で実際に観察することができ、通常、正常細胞の継代培養を繰り返すと、あるときを境に細胞が増殖しなくなる。このことは、研究用細胞の利用性に限界を設けることとなり、細胞工学分野の研究の進展を阻害する一因となっている。一方で、上記実施形態に係る方法を用いれば、細胞又は細胞集団の寿命を延長することができる。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、寿命が延長された細胞又は細胞集団の生産方法である。この生産方法によれば、簡便に寿命が延長された細胞又は細胞集団を生産できる。得られる細胞又は細胞集団は、寿命が延長されているため、例えば、研究又は再生医療等の用途において有用である。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、CD105 mRNA高発現細胞の生産方法である。この生産方法によれば、簡便にCD105 mRNA高発現細胞を生産できる。また、得られたCD105 mRNA高発現細胞は、上述のMuse細胞様細胞と同様の用途に使用できる。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、線維芽細胞産生細胞の生産方法である。この生産方法によれば、簡便に線維芽細胞産生細胞を生産できる。また、得られた線維芽細胞産生細胞は、上述のMuse細胞様細胞と同様の用途に使用できる。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞を活性化する方法である。この生産方法によれば、簡便にMuse細胞様細胞を活性化できる。ここで、「活性化」は、細胞サイズが大きくなることを含む。このときの細胞サイズは、2、5、又は10倍以上に大きくなってもよい。活性化したMuse細胞様細胞は、上述のMuse細胞様細胞と同様の用途に使用できる。また別の実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、Muse細胞様細胞活性化剤である。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、悪性腫瘍の治療方法である。また別の実施形態はELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、悪性腫瘍の治療薬である。従来の低分子化合物からなる治療薬は、アポトーシスを誘導して悪性腫瘍を治療するものであったが、本実施形態の治療方法、治療薬、又は誘導剤は、悪性腫瘍細胞をMuse細胞様細胞へ誘導することによって治療効果を発揮することができる。
　上記の実施形態に係る各方法は、さらに（a）細胞にELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を導入する工程、又は（b）上記阻害剤が導入された細胞を培養もしくは増殖させる工程、を含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、細胞集団中のMuse細胞様細胞の割合を増加させる方法である。また別の実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を、細胞集団に接触させる工程を含む、Muse細胞様細胞の割合が増加した細胞集団の生産方法である。
　本発明の一実施形態は、上記の阻害剤を含む、研究用又は医療用キットである。このキットは、例えば、Muse細胞様細胞作成用、人工臓器作成用、細胞又は細胞集団の寿命延長用、アンチエイジング用、又は治療用のキットであってもよい。このキットは、例えば、緩衝液、有効成分情報を記載した添付文書、有効成分を収容するための容器、又はパッケージ等をさらに含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を低下させる被検物質を選抜する工程を含む、Muse細胞様細胞誘導剤、細胞又は細胞集団の寿命延長剤、Muse細胞様細胞活性化剤、アンチエイジング剤、アンチエイジングのための化粧料、又は治療薬のスクリーニング方法である。この方法によれば、Muse細胞様細胞誘導剤等を得ることができる。この方法は、細胞に被検物質を導入する工程と、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能量を測定する工程と、を含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において用いられる「細胞」は、体細胞であってもよい。この体細胞は、生殖細胞を除いた他の細胞のことで、皮膚細胞、又は線維芽細胞等が含まれる。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。また上記細胞は、皮膚、心臓、肺、胃、腸、腎臓、子宮、大動脈外膜、又は間葉系組織由来の細胞であってもよい。又は、上記細胞は、悪性腫瘍細胞であってもよい。悪性腫瘍は、例えば、正常な細胞が突然変異を起こして発生する腫瘍を含む。悪性腫瘍は全身のあらゆる臓器や組織から生じ得、悪性腫瘍細胞が増殖すると、かたまりとなって周囲の正常な組織に侵入し破壊することが知られている。この悪性腫瘍は、例えば、癌腫、肉腫、血液悪性腫瘍、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、小腸癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、尿管癌、腎盂癌、尿管癌、陰茎癌、精巣癌、脳腫瘍、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、頭頸部癌（口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、鼻腔・副鼻腔癌、唾液腺癌、甲状腺癌等）、グリオーマ、多形性膠芽腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、唾液腺癌、又は悪性リンパ腫等を含む。
　本発明の一実施形態において「内在性」とは、被検物質が細胞の内部のメカニズムに由来して存在していることを表している。例えば、細胞内で恒常的に発現している蛋白質は、その発現した蛋白質に限っては内在性に含まれる。
　本発明の一実施形態において「遺伝子の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からmRNAへの転写機構を阻害、又はmRNAから蛋白質もしくはポリペプチドへの翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、mRNA、蛋白質の分解を誘導することで阻害することを含む。また生化学分野において、遺伝子の役目は、例えば、その遺伝子由来のmRNAを生成すること、その遺伝子由来の蛋白質を生成すること、その遺伝子由来の蛋白質に活性を発揮させることが挙げられる。そのため、本発明の一実施形態において「遺伝子の機能を阻害すること」は、遺伝子の発現を阻害した結果、mRNA又は蛋白質の生成量が低下することを含む。又は、「遺伝子の機能を阻害すること」は、その遺伝子由来のmRNA、又はその遺伝子由来の蛋白質の有する活性を低下させることを含む。
　本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。上記「有意に減少」とは、例えば、発現量が0.35、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、又は0倍以下に減少している状態であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内まで減少している状態であってもよい。Muse細胞様細胞を安定的に誘導する観点、又は細胞もしくは細胞集団の寿命をより安定的に延長させる観点からは、0.2倍以下が好ましく、0.1倍以下がさらに好ましい。なお発現量はmRNA量、又は蛋白質量を指標としてもよい。また本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのt検定(片側又は両側)を使用して評価し、p<0.05であるときを含んでいてもよい。又は、実質的に差異が生じている状態を含む。なお、「機能が阻害されている状態」の阻害強度についても、発現阻害の阻害強度の実施形態と同様のことがいえる。
　本発明の一実施形態において「阻害剤の形態」は特に限定されず、例えば、RNA鎖、DNA鎖、低分子有機化合物、抗体、又はポリペプチドであってもよい。上記RNA鎖は、例えば、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対するRNAi作用を有するRNA鎖（例えば、siRNA、shRNA、又はsmall RNA等）を使用できる。上記DNA鎖としては、上記RNA鎖をコードするDNA鎖を使用できる。このDNA鎖の形態は、例えば、ベクターであってもよい。上記低分子有機化合物は、コンビナトリアルケミストリーやHTS（ハイスループットスクリーニング）を活用することで、得ることができる。コンビナトリアルケミストリーには、例えば、自動合成装置L-COSシリーズ（昭光サイエンティフィック社）を使用してもよい。HTSには、例えば、Octetシステム（ForteBio社）を使用してもよい。上記抗体は、公知の抗体作製法（例えば、Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-628.に記載の方法）により作製してもよいし、受託会社（例えば、EVEC, Inc.）から購入してもよい。このとき、抗体ライブラリを作製し、阻害活性の高いものを選択することが好ましい。上記ポリペプチドは、受託会社（例えば、Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）から購入することができる。また、阻害剤は、対象の発現を阻害する物質、又は機能を阻害する物質を含む。阻害剤は、細胞毒性が低い、又は実質的に細胞毒性を有さない物質であることが好ましい。この場合、阻害剤を生体内に投与したときに、副作用を抑えることができる。細胞毒性又は副作用を抑え且つMuse細胞様細胞を安定的に誘導する観点、又は細胞毒性又は副作用を抑え且つ細胞もしくは細胞集団の寿命をより安定的に延長させる観点からは、阻害剤はRNAi作用を有するRNA鎖、又はそのRNA鎖をコードするDNA配列を有するDNA鎖であることが好ましい。なお、特に指定した場合には、阻害剤の形態からhsa-miR-520d-5p、そのガイド鎖を含む核酸、それらに実質的に同等な核酸、又はそれらを発現する核酸を除いてもよい。
　本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、miRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは複数本鎖RNA、又はそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、又はサイレンシングされる現象を含む。一般的に、RNAiによる抑制機構は配列特異的であり、様々な生物種に存在する。siRNA又はshRNAを用いた場合の、典型的な哺乳類におけるRNAiのメカニズムは以下の通りである。まず、siRNA又はshRNAを発現可能なベクターを細胞に導入する。その後、細胞内でsiRNA又はshRNAが発現した後、siRNA又はshRNAの一本鎖化が起こり、その後RISC（RNA-induced Silencing Complex）を形成する。RISCは取り込まれた1本鎖RNAをガイド分子として、この1本鎖RNAと相補性の高い配列を持つ標的RNA鎖を認識する。標的RNA鎖は、RISC内のAGO2等の酵素によって切断される。その後、切断された標的RNA鎖は分解される。以上がメカニズムの一例である。なお、RNAi作用を有するRNA鎖、又はそのRNA鎖をコードするDNA鎖は、細胞に複数個共導入してもよく、例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、又は20個以上導入してもよく、それらいずれか2つの値の範囲内の数を導入してもよい。また、RNAi作用を有するRNA鎖は、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能をより安定的に抑制する観点からは、1本鎖又は2本鎖が好ましい。
　RNAi作用を有するRNA鎖のデザインには、Stealth RNAi designer（Invitrogen）やsiDirect 2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等を使用できる。また、受託会社（例えば、GeneCopoeia社、Thermo Scientific社等）に委託してもよい。RNAi作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。特にリアルタイムRT-PCRによる方法が効率的である。
　本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。上記ガイド鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、そのガイド鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。
　本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。
　本発明の一実施形態において「miRNA」は、siRNAと類似の機能を有しているRNA鎖を含み、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。
　本発明の一実施形態において「small RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、1または複数本鎖の低分子RNAなどを挙げることができるが、それらに限定されない。small RNAを用いた場合、インターフェロン応答等の不利益な現象を抑えることができる。
　上記RNA鎖は、5'末端又は3'末端に1～5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。オーバーハングは、例えば、ac、c、uc、ag、aa、又はuu であってもよ。オーバーハングは、安定的にRNAi作用を発揮する観点からは、3'末端のac、c、ucが好ましい。また上記RNA鎖が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、又は10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また上記RNA鎖は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、又は3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。ヘアピンループの塩基配列は、例えば、gugcuc、又はcucuugaであってもよい。この塩基配列は、所望の効果を有する限り、1又は複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加していてもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5'末端、右側が3'末端である。
　また上記RNA鎖の長さは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、40、50、60、80、100、200、又は500塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数が15以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、この数が100以下であれば、RNA鎖を生体内に投与した場合に、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。インターフェロン応答とは、一般的に細胞がdsRNAを感知することによって抗ウイルス状態になる現象として知られている。
　本発明の一実施形態において「RNA鎖」は、RNA又はその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。また本発明の一実施形態において「DNA鎖」は、DNA又はその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。このRNA鎖又はDNA鎖は、1本鎖又は複数本鎖（例えば、2本鎖）の形態のRNA鎖又はDNA鎖を含む。RNA鎖又はDNA鎖は、細胞取込促進物質（例えば、PEG又はその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、リンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）、又は化学療法剤（例えば、抗悪性腫瘍物質等）等と結合していてもよい。RNA鎖又はDNA鎖は、核酸合成装置を用いて合成可能である。その他、受託会社(例えば、インビトロジェン社等)から購入することもできる。生体内のRNA鎖又はDNA鎖は、塩又は溶媒和物を形成することがある。また、生体内のRNA鎖又はDNA鎖は、化学修飾を受けることがある。RNA鎖又はDNA鎖の用語は、例えば、塩もしくは溶媒和物を形成しているRNA鎖もしくはDNA鎖、又は化学修飾を受けているRNA鎖もしくはDNA鎖等を含む。またRNA鎖又はDNA鎖は、RNA鎖のアナログ、又はDNA鎖のアナログであってもよい。上記「塩」は、特に限定されないが、例えば任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、又は任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩又は有機塩を含み、例えば、 Berge et al., J.Pharm.Sci., 1977, 66, 1-19に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。上記「溶媒和物」は、溶質及び溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、J.Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650 (1953)を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、又は各種バッファーが挙げられる。上記「化学修飾」としては、例えば、PEGもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、又はビオチン修飾等が挙げられる。
　また、上記RNA鎖は、安定的にRNAi作用を発揮する観点からは、標的遺伝子由来のmRNAの塩基配列の一部に対して、相補的な塩基配列を含むことが好ましい。上記「一部」は、例えば、5、10、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、又は50塩基以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。
　特定の遺伝子に対するsiRNA又はshRNAを生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、GeneCopoeia社、Thermo Scientific社等）から購入することができる。後述する実施例では、GeneCopoeia社からvalidated shRNA clone setを購入して使用した。後述する実施例1で使用したvalidated shRNA clone setには、ELAVL2 siRNAを生成可能なプラスミドが4つ、TEAD1 siRNAを生成可能なプラスミドが4つ、及びGATAD2B siRNAを生成可能なプラスミドが4つ含まれている。後述する実施例1で使用したELAVL2 siRNAを生成可能な4つのプラスミドの塩基配列は、配列番号25、26、27、又は28である。後述する実施例1で使用したTEAD1 siRNA又はGATAD2B siRNAを生成可能な8つのプラスミドは、psiLv-U6TMベクターにTEAD1 shRNA又はGATAD2B shRNAをコードするDNA配列がそれぞれ搭載されたものである。
　また後述する実施例1で使用したELAVL2 siRNAを生成可能な4つのプラスミドからは、配列番号5、6、7、又は8の塩基配列を含むshRNAがそれぞれ生成される。これらのshRNAは、細胞内で酵素により切断され、siRNAが生じると考えられる。これらのsiRNAは、配列番号1 (uuauugguguuaaagucacgg)、2 (aauacgagaaguaauaaugcg)、3 (uuuguuugucuuaaaggag)、又は4 (auuugcaucucugauagaagc)の塩基配列をそれぞれ含む。この配列番号1、2、3、又は4の塩基配列は、ELAVL2 mRNAの一部に相補的な塩基配列であり、ガイド鎖としての機能を担う部分であると考えられる。
　また後述する実施例1で使用したTEAD1 siRNAを生成可能な4つのプラスミドからは、配列番号13、14、15、又は16の塩基配列を含むshRNAがそれぞれ生成される。これらのshRNAは、細胞内で酵素により切断され、siRNAが生じると考えられる。これらのsiRNAは、配列番号9 (uuggcuuaucugcagaguc)、10 (gcuuguuaugaauggcag)、11 (guaagaaugguuggcaugc)、又は12 (aguuccuuuaagccaccuu)の塩基配列をそれぞれ含む。この配列番号9、10、11、又は12の塩基配列は、TEAD1 mRNAの一部に相補的な塩基配列であり、ガイド鎖としての機能を担う部分であると考えられる。
　また後述する実施例1で使用したGATAD2B siRNAを生成可能な4つのプラスミドからは、配列番号21、22、23、又は24の塩基配列を含むshRNAがそれぞれ生成される。これらのshRNAは、細胞内で酵素により切断され、siRNAが生じると考えられる。これらのsiRNAは、配列番号17 (caacagauucaagcgaaga)、18 (caauagaugcugcauucug)、19 (caucaacauguguggaagg)、又は20 (aggauguuguacgcugaca)の塩基配列をそれぞれ含む。この配列番号17、18、19、又は20の塩基配列は、GATAD2B mRNAの一部に相補的な塩基配列であり、ガイド鎖としての機能を担う部分であると考えられる。
　本発明の一実施形態において、ELAVL2 siRNAは、配列番号1、2、3、又は4の塩基配列に相補的な塩基配列（例えば、配列番号5の塩基配列の1-21位の塩基配列、配列番号6の塩基配列の1-21位の塩基配列、配列番号7の塩基配列の1-19位の塩基配列、又は配列番号8の塩基配列の1-21位の塩基配列）を含んでいてもよい。本発明の一実施形態において、TEAD1 siRNAは、配列番号9、10、11、又は12の塩基配列に相補的な塩基配列（例えば、配列番号13の塩基配列の1-19位の塩基配列、配列番号14の塩基配列の1-18位の塩基配列、配列番号15の塩基配列の1-19位の塩基配列、又は配列番号16の塩基配列の1-19位の塩基配列）を含んでいてもよい。本発明の一実施形態において、GATAD2B siRNAは、配列番号17、18、19、又は20の塩基配列に相補的な塩基配列（例えば、配列番号21、22、23、又は24の塩基配列の1-19位の塩基配列）を含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において、配列番号1～40で示される塩基配列は、所望の効果を有する限り、（c）いずれかの塩基配列において、1又は複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加している塩基配列、（d）いずれかの塩基配列に対して、90％以上の相同性を有する塩基配列、（e）いずれかの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードする塩基配列、からなる群から選ばれる1つ以上の塩基配列であってもよい。本発明の一実施形態において「相補的な塩基配列」とは、一つのポリヌクレオチドに対して、ハイブリダイズすることが可能な相補性の高い他のポリヌクレオチドが有している塩基配列である。ハイブリダイズとは、複数のポリヌクレオチド間において、塩基間の水素結合等によって塩基対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、又は任意の他の配列特異的な形で生じうる。2つの1本鎖がハイブリダイズした状態は2本鎖と呼ばれる。
　上記「複数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、又は2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。Muse細胞様細胞を安定的に誘導する観点、又は細胞もしくは細胞集団の寿命をより安定的に延長させる観点からは、この数は少ないほど好ましい。なお、1又は複数個の塩基の欠失、付加、挿入、又は置換を受けたRNA鎖が、その生物学的活性を維持することは当業者に知られている。
　上記「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、又は100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。Muse細胞様細胞を安定的に誘導する観点、又は細胞もしくは細胞集団の寿命をより安定的に延長させる観点からは、この数は大きいほど好ましい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間の塩基配列において相同な塩基の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基を整列させ、同一塩基の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTで塩基配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastnをデフォルト設定で使用できる。
　上記「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、又は(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、及び20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％又はそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、又はそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照することができる。
　上記阻害剤の細胞への導入、及びその細胞の培養方法は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。細胞への導入は、例えば、ウイルスベクターを用いた感染導入、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、又はマイクロインジェクションなどを使用できる。また薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。培地は、例えば、未分化維持用培地（例えば、多能性幹細胞用培地、ReproStem、霊長類ES細胞用培地（コスモ・バイオ社））、又は通常のヒト細胞用の培地（例えば、DMEMやRPMIベースの培地）等を使用できる。例えば、ReproStemで37℃、5％ CO2、10％ FBSの条件で培養可能してもよい。この数値は、例えば、プラスマイナス10、20、又は30％の範囲で前後させてもよい。フィーダー細胞の非存在下で樹立、又は培養してもよい。Muse細胞様細胞を樹立するときの培養の日数は特に限定されないが、例えば、1、2、3、4、5、6、8、10、15、30、60、又は100日以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。なお、Muse細胞様細胞をより安定的に樹立できる観点、又は細胞もしくは細胞集団の寿命を安定的に延長できる観点からは、阻害剤を導入する細胞は線維芽細胞であることが好ましい。また、上記RNA鎖を細胞に導入する場合、複数のRNA鎖を細胞に併用導入してもよい。また、上記DNA鎖を細胞に導入する場合、複数のDNA鎖を細胞に導入してもよい。ここで、「複数のRNA鎖」又は「複数のDNA鎖」は、2、3、4、5、10、又は20個以上のRNA鎖又はDNA鎖であってもよい。
　本発明の一実施形態において「ベクター」は、ウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、又はHIV等）ベクター、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110）、酵母由来プラスミド（例、pSH19）、λファージなどのバクテリオファージ、psiCHECK-2、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPER（OligoEngine社）、BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector（インビトロジェン社）、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp., NJ, USA)などを用いることができる。上記ベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、DNA鎖の発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。上記ベクターはいわゆる発現ベクターであってもよい。
　本発明の一実施形態において「細胞集団」は、複数の細胞を含む集団である。この細胞集団は、例えば、実質的に均一な細胞を含む集団であってもよい。また細胞集団は、細胞調製物であってもよい。細胞調製物は、例えば、細胞と、緩衝液又は培地成分とを含んでいてもよい。Muse細胞様細胞細団は、Muse細胞様細胞を、例えば、80、90、95、96、97、98、99、又は100％以上含んでいてもよく、それらいずれか2つの値の範囲内含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において「治療」は、被験者の疾患、又は疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。本発明の一実施形態において「治療薬」は、薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体又は液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なお悪性腫瘍の治療薬は、悪性腫瘍の予防のために用いられる薬物（予防薬）、又は悪性腫瘍の良性化誘導剤もしくは正常幹細胞化誘導剤を含む。
　治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。ポリヌクレオチドを投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、又はステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖(例えばトレハロース)、NaCl、又はNaOH等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液)、安定剤等を配合してもよい。
　投与量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.0001mg～1000mg/kg体重であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、1～10日に1回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、被験者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択することが可能である。また、他の適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。また治療薬は、治療有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍のマーカーが、投与後に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。
　本発明の一実施形態において「被験者」は、ヒト、又はヒトを除く哺乳動物(例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、又はチンパンジー等の1種以上)を含む。
　なお、以上のELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bを阻害したときの種々の実施形態は、ELAVL2等の1種以上由来のRNA鎖又は蛋白質の活性を阻害する場合にも適用可能である（但し、遺伝子の機能に特異的な実施形態を除く）。そのような場合の実施形態も、本発明の一実施形態に含まれる。例えば、本発明の一実施形態は、ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2B由来のRNA鎖又は蛋白質の活性を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞の生産方法、又は細胞又は細胞集団の寿命を延長する方法である。
　本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
　以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜実験例1＞線維芽細胞の培養
　ヒト成人線維芽細胞（NHDF-Ad、TakaraBio社）を購入後、FBM+FGM-2培地（Ronza社）で37℃で4週間培養した。その結果、細胞老化が観察された（図1）。
　図1(a)は、NHDF-Adを購入後、0日目の画像である。図1(b)は、図1(a)の細胞を4週間培養した時の画像である。図1(c)は、NHDF-Adを培養開始約1か月後に一旦保存され、再度培養目的でおこされた細胞である。図1(d)は、図1(c)の細胞を4週間培養した時の画像である。
　＜実施例1＞
　ELAVL2 siRNA、TEAD1 siRNA、又はGATAD2B siRNAを生成するプラスミドDNA（validated shRNA clone set）をそれぞれGeneCopoeia社から購入した。これらのプラスミドDNAをヒト腎メサンギウム細胞株（293FT細胞）へVirapower（導入効率を上げるため使用、Invitrogen社）とともに導入し、レンチウイルスとして培養液（上清）に産生される粒子を超遠心操作でペレットとして分離した。miR-X lenti titeration kit (TakaraBio社)を用いて力価を測定し、1細胞1コピーの導入を目標にヒト成人線維芽細胞（NHDF-Ad、TakaraBio社）へレンチウイルスを感染導入させた。その後、形質転換した細胞について、細胞の形態変化、遺伝子発現（CD105、Oct4、Sirt1、hTERT、Nanog等のMuse細胞マーカー、多能性マーカー、長寿マーカー、老化マーカー等）、コラーゲン産生能を評価した。以上の結果を、下記(1)～(3)で説明する。
　(1) 細胞の形態変化
　細胞形態は、倒立電子顕微鏡を用いて観察し、導入細胞の確認としてGFPの発現を蛍光顕微鏡（キーエンス社）で観察した。図2は、培養0日目の細胞の写真である。
　図3は、培養1ヵ月目の細胞の写真である。細胞数が減少しており、細胞老化が生じていることがわかる。なお、培養1ヵ月の間に4～5回の継代培養をした。
　図4は、培養1ヵ月と3週間目の細胞の写真である。細胞数が図3よりも減少しており、細胞老化がより進んでいることがわかる。
　図5は、培養1ヵ月目の細胞（図3に相当）にレンチウイルスを感染導入させた後、3週間培養したときの写真である。写真右側に示されるように、密度の高い細胞集団が観察された。これは、細胞老化の進行が抑制され、若い細胞が生成されたことを意味している。
　図6は、図5の細胞集団を、さらに1週間、ReproStem培地 (株式会社リプロセル)で培養したときの写真である。写真中央に示されるように、丸形状のMuse細胞様細胞が観察された。
　図7は、図6のMuse細胞様細胞を、さらに4日間、ReproStem培地で培養したときの写真である。写真中央のMuse細胞様細胞から、多数の若い線維芽細胞が次々と放射線状に生成していることがわかる。またこのMuse細胞様細胞は、Muse細胞において特異的に見られる目玉（黒目と白目）のような形態をしていた。
　またこのMuse細胞様細胞は、培養18週間が経過した時点でも生存しており、継続的に線維芽細胞を作り出していた。従来市販されている線維芽細胞を単に培養すると、1ヵ月程度で細胞老化する。そのため、上記細胞が18週間生存したことは驚くべきことであった。
　図8は、図5の細胞集団を、さらに1週間、FBM+FGM-2培地（Ronza社）で培養したときの写真である。この場合、Muse細胞様細胞は見られなかった。
　図9は、図8の細胞集団を、さらに4日間、FBM+FGM-2培地で培養したときの写真である。この線維芽細胞は、輪郭がシャープであり、より若々しく元気な細胞であった。
　(2) 遺伝子発現の評価
　(2-1) CD105発現の評価
　経時的にトリプシン-EDTA（Gibco社）で細胞を剥離し、RNA抽出した。その後、RT-PCR（OneStep RT-PCR kit、QIAGEN社）で、CD105の発現量を測定した（CD105はmuse細胞のマーカーである）。このとき、一律RNA25ngを用いて、サーマルサイクラー（LineGene、Bioflux社）で測定したCt値をβ-actinに対して標準化し、CD105の発現量を2-ΔΔ法で算出した。
　その結果を図10に示す。siETG（ELAVL2 siRNA、TEAD1 siRNA、及びGATAD2B siRNA）未導入のNHDF-Adは、CD105 mRNAを発現していなかった（図10の2W及び5W）。一方で、siETG導入によって、CD105 mRNAが発現した（図10の7W）。さらに、Muse細胞様細胞が形成された段階では、非常に高濃度のCD105 mRNAが発現していた（図10の右端）。
　(2-2) 各遺伝子発現の評価
　経時的にトリプシン-EDTAで細胞を剥離し、RNA抽出した。その後、RT-PCRで、各遺伝子の発現量を測定した。このとき、一律RNA 25ngを用いて、サーマルサイクラーで測定したCt値をβ-actinに対して標準化し、各遺伝子の発現量を2-ΔΔ法で算出した。グラフ化に当たっては、NHDF-Adを4週間培養したときの検出量を1とし、その倍数(fold)で表記した。なお、老化誘導した状態の細胞、または死滅寸前の細胞には、siETGを1細胞1コピーの目安で感染導入し、その後の変化を同様に検討した。
　その結果、本実施例のMuse細胞様細胞は、CD105、hTERT、Oct4、SIRT1、P53、及びNanog mRNAを高発現していた。測定結果を図10～16に示す。CD105はmuse細胞のマーカーである。hTERT及びSIRT1は、若い細胞で発現量が高い遺伝子である。Oct4及びNanogは、多能性マーカーである。p53は、悪性腫瘍抑制遺伝子に分類される遺伝子である。
　本実施例のmuse細胞様細胞は、CD105だけでなく、SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanogが同期して高発現していた。即ち、本実施例で得られたmuse細胞様細胞は、多能性を有する若い正常細胞になっていた。また、p53 mRNAを高発現していたことから、本実施例のmuse細胞様細胞は、悪性腫瘍化のリスクが低いといえる。
　図中のサンプル名の「W」は、培養した期間（週）を意味している。図中のサンプル名の「siETG」は、siETGを導入したサンプルであることを意味している。図中のサンプル名の「-1」と「-2」は、2つのサンプルが試験されたことを意味している。図中のtransufectionは、siETGを導入したことを意味している。図中のsenescenceは、細胞の自然死がみられたことを意味している。図中の左から9列目の「10W-siETG-1」は、6列目の「10W-siETG-1」にsiETGを再導入後、3日培養し、細胞を回収して測定したときの結果を意味している。図中の左から8列目の「10W-siETG-2」は、5列目の「8W-siETG-2」をさらに2ヵ月培養時点でsiETGを再導入後、3日培養し、細胞を回収してmRNA発現量を測定したときの結果を意味している。図中の左から10列目の「Muse」は、左から8列目の「10W-siETG-2」を1週間培養後に見られたMuse細胞様細胞を含むコロニーを、1つ選択的に取り上げて、mRNA発現量を測定したときの結果を意味している。図中の「19W-siETG」は、左から12列目の「16W-siETG-2」をさらに3週間培養した後の結果である。
　なお、上記の実験とは別に行ったタイムラプス撮影によれば、導入細胞のすべてが、少なくとも一時的にはMuse細胞様細胞に変化していた。これは、CD105が測定した全ての導入細胞で陽性であったこととも一致している。また、NHDF-AdはsiRNAが導入されるとその形態とは無関係にCD105陽性になり、Muse細胞様細胞になった。特に、ストレスがかかった時（培地交換で薄まきの状態など）に目玉様になる様子がみられた。Muse細胞様細胞は、浮いているものもあれば、接着しているものもあった。接着しているMuse細胞様細胞から新しい線維芽細胞が生み出されている様子が観察された。また、そのような固定していない場所に線維芽細胞が現れることもあった。
　(3) コラーゲン産生能
　形質転換した細胞について、コラーゲン産生能を測定した。この測定には、ヒトコラーゲンタイプI ELISAキット（ACEL社）を使用した。遺伝子導入後、線維芽細胞は活性化され、コラーゲンをより多く産生した（図17）。なお、この図は1例であり、6週頃老化誘導したため、遺伝子導入をし、活性化した細胞群もある。
　＜実施例2＞
　293FT細胞にhsa-miR-520d-5p（配列番号32）を導入し、細胞形態を観察した。具体的には、まずS&B社のpMIR-520d-5p/GFPを用いてプラスミドDNAを生成した。上記と同様の手順で、プラスミドDNAを293FT細胞へ導入し、ウイルス粒子を収集し、タイター測定したあとTIG-1-20細胞へ感染導入させた。その結果、Muse細胞様細胞が観察された（図18）。また、このMuse細胞を培養した結果、TIG-1-20細胞の放射線状に増殖した。但し、実施例1の場合に比べて、細胞が大きく、且つ細胞の輪郭はシャープではなかった。即ち、実施例1に比べて細胞老化が進んでいた。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (19)

  1. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞の生産方法。
  2. 　前記阻害は、siRNA又はshRNAによる阻害である、請求項1に記載の生産方法。
  3. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現を阻害するRNA鎖を細胞集団に導入する工程と、
    　前記RNA鎖が導入された細胞集団から、Muse細胞様細胞を回収する工程と、
    　を含む、請求項1又は2に記載の生産方法。
  4. 　前記Muse細胞様細胞は、CD105陽性である、請求項1～3いずれかに記載の生産方法。
  5. 　前記Muse細胞様細胞は、直径が5μm以上である、請求項1～4いずれかに記載の生産方法。
  6. 　請求項1～5いずれかに記載の生産方法を経て得られる、Muse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団。
  7. 　hTERT陽性である、請求項6に記載のMuse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団。
  8. 　請求項1～5いずれかに記載の生産方法を経て得られるMuse細胞様細胞を培養して得られる、再生医療用材料。
  9. 　請求項6又は7に記載のMuse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を含む、治療薬。
  10. 　請求項6又は7に記載のMuse細胞様細胞又はMuse細胞様細胞集団を含む、化粧料。
  11. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、Muse細胞様細胞誘導剤。
  12. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、治療薬。
  13. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、化粧料。
  14. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、細胞又は細胞集団の寿命を延長する方法。
  15. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bに対する阻害剤を含む、細胞又は細胞集団の寿命延長剤。
  16. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、寿命が延長された細胞又は細胞集団の生産方法。
  17. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、CD105 mRNA高発現細胞の生産方法。
  18. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、線維芽細胞産生細胞の生産方法。
  19. 　ELAVL2、TEAD1、又はGATAD2Bの発現又は機能を阻害する工程を含む、Muse細胞様細胞を活性化する方法。
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