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WO2015019658A1 - 核酸増幅法 - Google Patents

核酸増幅法 Download PDF

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WO2015019658A1
WO2015019658A1 PCT/JP2014/058309 JP2014058309W WO2015019658A1 WO 2015019658 A1 WO2015019658 A1 WO 2015019658A1 JP 2014058309 W JP2014058309 W JP 2014058309W WO 2015019658 A1 WO2015019658 A1 WO 2015019658A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
nucleic acid
dna polymerase
amino acid
pcna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/058309
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
哲大 小林
弘嵩 松本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyobo Co Ltd
Original Assignee
Toyobo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyobo Co Ltd filed Critical Toyobo Co Ltd
Publication of WO2015019658A1 publication Critical patent/WO2015019658A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification method by PCR.
  • the present invention can be used not only for research but also for clinical diagnosis and environmental examination.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA denaturation by heat treatment dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA
  • primer annealing of primer to template single-stranded DNA
  • DNA polymerase This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating the cycle with three steps of extension of the primer using.
  • Target nucleic acids can be amplified hundreds of thousands of times even from a small amount of sample such as several copies. It has come to be used.
  • PCR is a very sensitive detection method, false positives caused by carry-over of previously performed PCR amplification products become a problem. Accordingly, PCR is performed using a substrate containing dUTP instead of dTTP, uracil base is incorporated into the amplification product, and uracil-N-glycosylase (UNG) treatment is performed in the next PCR, thereby allowing contamination (carrying).
  • dUTP / UDG contamination removal method has been taken (Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 PCR is easily affected by contaminants such as pigments, proteins, and sugars, and the contaminants inhibit the reaction.
  • a gene in a biological sample is amplified, purification of DNA is required.
  • purification of DNA is complicated and requires time, and contamination occurs during the operation. There is a risk.
  • the target nucleic acid content in the sample is small, it may not be recovered. Therefore, there has been a demand for a method for amplifying a target nucleic acid by bringing a biological sample into a PCR reaction solution containing dUTP without going through a purification step.
  • Patent 4395377 Special table 2006-507012
  • an object of the present invention is to provide an efficient method for amplifying a target nucleic acid in PCR containing dUTP as a substrate. More specifically, the present invention provides a nucleic acid amplification method capable of performing PCR amplification even in the presence of a large amount of contaminants derived from biological samples in PCR containing dUTP as a substrate. Furthermore, the other object of this invention is to provide the reagent kit suitable for said objective. In summary, an object of the present invention is to provide a PCR improvement method and a PCR reaction reagent suitable for amplification of genes present in animal and plant tissues and body fluids in the presence of dUTP.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention for achieving the above object uses the DNA polymerase belonging to Family B to amplify DNA in a biological sample in the presence of dUTP without going through a purification step. This is a nucleic acid amplification method.
  • the present inventor uses a DNA polymerase belonging to family B in a nucleic acid amplification method in which a biological sample itself and a gene amplification reaction solution are mixed and reacted, so that even if a large amount of biological contaminants exist, Found that PCR is possible even when a biological sample such as blood or oral mucosa is directly added to the PCR reaction solution, and the present invention has been achieved.
  • the representative invention of the present application is as follows.
  • [1] A method of amplifying a target nucleic acid in a biological sample by adding a biological sample that has not undergone a purification step to a nucleic acid amplification reaction solution, wherein the enzyme used for the amplification is a DNA polymerase belonging to Family B, and deoxyuridine (dUTP ) In the reaction solution.
  • [2] The nucleic acid amplification method according to [1], wherein the biological sample is any of animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, and viruses.
  • nucleic acid amplification method according to [1] or [2], wherein the enzyme used for nucleic acid amplification is an archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity.
  • nucleic acid amplification method according to [3] or [4], wherein the archaeal DNA polymerase mutant is any one of the following (a) to (c): (A) at least one amino acid among the amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 (corresponding to the wild type sequence of Pfu) It is an amino acid sequence having the following modification. (B) A reduced base analog in which at least one amino acid is further modified in the amino acid sequence shown in (a), the amino acid sequence is 80% or more identical to the amino acid sequence shown in (a), and reduced An amino acid sequence encoding a DNA polymerase having detection activity.
  • At least one amino acid is further modified in the amino acid sequence represented by (a), and one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by (a). And an amino acid sequence encoding a DNA polymerase having reduced base analog detection activity.
  • the mutant of archaebacterial DNA polymerase has at least one amino acid modification among amino acids corresponding to positions 36 and 93 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, according to any of [3] to [5] Nucleic acid amplification method.
  • the archaeal DNA polymerase variant is any one of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, wherein Y7A / V93K, Y7A / V93R, Y7A / V93Q, Y7A / P36H, Y7A / P36R, P36H / V93K, P36K, P36R or P36H
  • the nucleic acid amplification method according to any one of [3] to [6], wherein [8] The nucleic acid amplification according to any one of [3] to [7], wherein the archaebacterial DNA polymerase mutant has any one of Y7A / V93K, Y7A / P36H, and P36H in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the modification to the 3′-5 ′ exonuclease active region of DNA polymerase belonging to family B is any one of D141A / E143A, I142R, H147E, H147D, N210D or Y311F in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 [1 ]
  • PCNA nucleic acid amplification method according to any one of [1] to [13], wherein PCNA is a mutant that is loaded alone into DNA.
  • PCNA is (a) N-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 82, 84 and 109 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, and (b) amino acids corresponding to positions 139, 143 and 147
  • [16] PCNA modified amino acid corresponding to position 143 in SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 to basic amino acid, or modified from both amino acids corresponding to positions 82 and 143 to neutral amino acid, equivalent to position 147
  • Nucleic acid amplification method [17] [1] A reagent for carrying out the nucleic acid amplification method according to any one of [16]. [18] [1] A kit comprising a reagent for performing the nucleic acid amplification method according to any one of [16].
  • the present invention eliminates the risk of loss and carryover during DNA purification, and further reduces time and cost. Also, in order to prevent contamination by the dUTP / UDG contamination removal method, not only in the research field, but also in the clinical field or forensic field such as genetic diagnosis in which the same sample is amplified many times, or in the microbiological examination in foods and the environment, etc. Can also be widely used
  • PCNA PCR enhancement factor
  • mutant type in the case of “mutant PCNA” means that it has an amino acid sequence different from the conventionally known PCNA, and it is due to artificial mutation or due to mutation in nature. There is no distinction.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a method of amplifying a target nucleic acid in a biological sample by adding a biological sample that has not undergone a purification step to a nucleic acid amplification reaction solution, and the enzyme used for amplification is a polymerase belonging to family B. And deoxyuridine (dUTP) is contained in the reaction solution.
  • dUTP deoxyuridine
  • nucleic acid in a biological sample that has not undergone a purification step is amplified without purification.
  • Purification is a method for separating contaminants such as tissues and cell walls of biological samples from DNA in biological samples. Methods for separating DNA using phenol or phenol / chloroform, ion exchange resins, glass filters, etc. Alternatively, there is a method of separating DNA with a reagent having a protein aggregation action.
  • nucleic acids to be amplified such as organs and cells are present in the tissue of the sample
  • an act of destroying the tissue to extract the nucleic acid does not correspond to the purification referred to in the present invention.
  • the act of diluting the sample obtained by the above method or the biological sample with a buffer solution does not correspond to the purification referred to in the present invention.
  • the nucleic acid amplification method in the present invention is a method in which a biological sample is added to a nucleic acid amplification reaction solution and amplified without taking these purification methods.
  • the “biological sample that has not undergone the purification step” means that the biological sample itself, or a liquid biological sample diluted with a solvent such as water, or a solid biological sample is added to a solvent such as water and heated. However, it is not limited to these as long as it has not undergone a purification process.
  • blood resistance means that even when blood is present in a nucleic acid amplification reaction solution, it resists inhibition.
  • the biological sample applied to the nucleic acid amplification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample collected from a living body.
  • it refers to animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, viruses and the like.
  • Body fluid includes blood and saliva, and cells include, but are not limited to, leukocytes separated from blood.
  • the reaction solution contains dUTP.
  • the route for obtaining dUTP is not particularly limited, but commercially available products can be used.
  • the concentration of dUTP in the reaction solution is not particularly limited, but the preferable lower limit is 0.5 ⁇ M or more, more preferably 50 ⁇ M or more, and more preferably 0.1 mM or more from the viewpoint of the removal efficiency of contamination. From the viewpoint of PCR efficiency, dUTP may be contained at a high concentration.
  • a preferable upper limit is 1 mM or less, more preferably 0.6 mM or less.
  • dTTP and dUTP may be mixed from the viewpoint of PCR efficiency.
  • the ratio of dTTP to dUTP is preferably 100: 1 to 1: 100. More preferably, it is 10: 1 to 1:10, and further preferably 1: 1, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid applied to the nucleic acid amplification method of the present invention is not limited by the difference in length, sequence, GC content, etc., but since dUTP is incorporated during amplification, the nucleic acid must contain T. It is preferable that 10 or more T is contained.
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention is a DNA polymerase belonging to family B.
  • the DNA polymerase belonging to the family B is preferably an archaea-derived DNA polymerase.
  • DNA polymerases derived from archaea belonging to family B include DNA polymerases isolated from bacteria of the genera Pyrococcus and Thermococcus.
  • DNA polymerase derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus and Pyrococcus sp. Including, but not limited to, DNA polymerases isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • DNA polymerases derived from the genus Thermococcus include Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. Including, but not limited to, DNA polymerase isolated from KS-1, Thermococcus celler, or Thermococcus sicili.
  • PCR enzymes using these DNA polymerases are commercially available, Pfu (Staragene), KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England) , Tgo (Roche), Pwo (Roche).
  • KOD DNA polymerase excellent in extensibility and thermal stability is preferable.
  • the DNA polymerase belonging to family B used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a mutant having reduced base analog detection activity.
  • Base analogs refer to bases other than adenine, cytosine, guanine, and thymine, and include uracil and inosine.
  • a DNA polymerase belonging to Family B binds strongly when a base analog such as uracil or inosine is detected, and inhibits the polymerase function.
  • the base analog detection activity refers to an activity that strongly binds to a base analog and inhibits the polymerase function.
  • a DNA polymerase mutant belonging to family B having reduced base analog detection activity is a DNA polymerase mutant belonging to family B characterized by low binding ability to uracil and inosine.
  • An example of such a mutant having a decreased base analog detection activity of a DNA polymerase belonging to Family B is an archaeal DNA polymerase mutant.
  • the amino acid sequence (uracil-binding pocket) relating to the binding of uracil formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130 is modified, and compared to wild-type DNA polymerase, uracil and inosine An archaeal DNA polymerase variant characterized by low binding ability.
  • the DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention preferably has a higher DNA synthesis rate than the wild type (WT).
  • the wild-type polymerase belonging to family B has high accuracy. This is to amplify while confirming whether the incorporated base is correct. Examples of bases that cause errors include uracil that is generated by thermal decomposition of cytosine and paired with alanine. Polymerases belonging to Family B have a pocket that binds strongly to uracil, and amplify the nucleic acid to be amplified while checking for the presence of this uracil one by one.
  • this pocket interacts strongly with uracil and slows (or stops) the reaction. This interaction is thought to extend to bases such as cytosine that are somewhat similar in structure, and thus the DNA synthesis rate may be suppressed.
  • the DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention is modified to the uracil-binding pocket, it will not interact with not only uracil but also cytosine, etc. Conceivable.
  • the extent to which the synthesis rate is increased by modifying the pocket that strongly binds to uracil is higher when the mutant that modified the exo region is further modified than when the wild type is modified.
  • the DNA polymerase belonging to the family B or the DNA polymerase derived from archaea desirably has a DNA synthesis rate of 30 bases / second or more by the following measurement method.
  • PCR is inhibited by strong binding between dUTP and polymerase.
  • a polymerase having a higher DNA synthesis rate is less likely to cause dUTP binding and is less susceptible to dUTP in the presence of dUTP.
  • the synthesis rate of the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method is measured as follows. If the enzyme activity is strong, samples should be stored in storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) Mix 2.5 ⁇ l of the following A liquid, 2.5 ⁇ l of B liquid, 1.5 ⁇ l of C liquid, 4.8 ⁇ l of D liquid, and 4 ⁇ l of E liquid, 10 minutes at 95 ° C., 10 minutes at 37 ° C. Place and create substrate.
  • storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • the DNA synthesis rate can be further increased by adding a PCR enhancing factor (for example, PCNA) described later.
  • a PCR enhancing factor for example, PCNA
  • a DNA polymerase having a DNA synthesis rate of 50 bases / second or more is preferable, but not limited thereto.
  • Thermococcus gorgonarius (SEQ ID NO: 3), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 5), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp. JDF-3 (SEQ ID NO: 6), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp. KS-1 (SEQ ID NO: 8), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 9), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130.
  • Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 10), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • DNA polymerase mutant for use in the nucleic acid amplification method of the present invention is the seventh, thirty-six, thirty-seven, thirty-nine, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-seventh, ninety-nineth, thirty-seventh, ninety-nineth, thirty-seventh, thirty-seventh, ninety-nineth, thirty-seventh, ninety-nineth, thirty-seventh, ninety-nineth, thirty-seventh, ninety-seventh, thirty-seventh, ninety-seventh, thirty-seventh, ninety-nine
  • the archaeal DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (b).
  • BLAST Basic local alignment search tool
  • NCBI National Institute of Biotechnology Information
  • ncbi. nlm. nih The amino acid sequence identity is calculated by using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /.
  • the archaeal DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (c).
  • “several” is not limited as long as “decreased base analog detection activity” is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably less than about 15%. It is a corresponding number, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 160, preferably 2 to 120, more preferably 2 to 80, still more preferably 2 to 40, and even more. The number is preferably 2-5.
  • amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are amino acid sequences that are not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a position (order) on SEQ ID NO: 1 and a corresponding position are when the primary structure of the sequence is compared (alignment) , A position corresponding to the position of SEQ ID NO: 1.
  • Various methods are known as methods for comparing the primary structures of sequences. For example, it can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet).
  • the archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention is more preferably selected from amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Having at least one amino acid modification.
  • Y7 means a tyrosine (Y) residue that is the seventh amino acid, and one letter of the alphabet represents an abbreviation of a commonly used amino acid.
  • the Y7 amino acid has tyrosine (Y) substituted with a nonpolar amino acid, specifically selected from the group consisting of Y7A, Y7G, Y7V, Y7L, Y7I, Y7P, Y7F, Y7M, Y7W, and Y7C. Amino acid substitution.
  • the P36 amino acid is a proline (P) substituted with a positively charged polar amino acid, specifically a P36H, P36K, or P36R amino acid substitution.
  • the V93 amino acid is a valine (V) having a positive charge and substituted with a polar amine acid, specifically an amino acid substitution of V93H, V93K, or V93R. More preferably, it is V93K.
  • the modification is at least one amino acid modification selected from the group consisting of Y7A, P36H, P36K, P36R, V93Q, V93K, and V93R. More preferably, it is P36K, P36R or P36H. More preferably, it is P36H.
  • the archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity in the present invention modifies two or more amino acids selected from amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. What you did is fine. Specific examples include Y7A / V93K, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, Y7A / V93Q or P36H / V93K, and preferred examples include Y7A / P36H or Y7A / V93K. It is not limited to.
  • Patent Document 1 or 2 any of the amino acids 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 assumed to be directly related to the interaction with uracil is modified.
  • Several archaeal DNA polymerase mutants are exemplified, but not all variants have good properties to meet the challenges of the present application, some of which have lost activity .
  • the base analog detection activity in the present invention can be evaluated by PCR.
  • the base analog is typically uracil.
  • a dUTP solution is added at a final concentration of 0.5 ⁇ M to 200 ⁇ M to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and a DNA polymerase to be evaluated, and thermal cycling is performed. .
  • the presence or absence of a PCR product can be confirmed by ethidium bromide-stained agarose electrophoresis, and the detection activity of uracil can be evaluated by the allowable dUTP concentration.
  • a DNA polymerase having a high uracil detection activity inhibits the extension reaction by adding a little dUTP, and the PCR product cannot be confirmed.
  • DNA polymerase with low uracil detection activity can confirm gene amplification by PCR without problems even when a high concentration of dUTP is added.
  • An archaeal DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity is a result of optimal thermal cycling using any primer and DNA as a template in an enzyme optimal reaction buffer. Compared with the wild-type without DNA, it means a DNA polymerase in which the extension reaction is not inhibited even when a high concentration of dUTP is added, and the PCR product can be confirmed. However, if it is difficult to compare with the wild type, the archaeal DNA polymerase mutant that can amplify PCR even when dUTP is added at a concentration of 0.5 ⁇ M is reduced compared to the wild type. It is presumed to have the activity of detecting a base analog.
  • the evaluation of the base analog detection activity in the present invention follows the following method. KOD -Plus- Ver. 2 (Toyobo) attached 10 ⁇ PCR Buffer or Pfu DNA Polymerase (Agilent) attached 10 ⁇ PCR Buffer, 1 ⁇ PCR Buffer, 1.5 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 pmol of the primer according to SEQ ID NOS: 13 and 14, which amplifies about 1.3 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche), and 1 U of each enzyme in a 50 ⁇ l reaction solution containing dUTP ( Roche) to a final concentration of 0.5, 5, 50, 100, 200 ⁇ M.
  • PCR is performed with a schedule of repeating 30 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • 5 ⁇ l of the reaction solution is subjected to agarose electrophoresis, ethidium bromide staining, and an amplified DNA fragment of about 1.3 kb is confirmed under ultraviolet irradiation to evaluate whether the base analog detection activity is reduced. .
  • dUTP concentration at which PCR can be amplified the lower the base analog detection activity. In this specification, this is also expressed as “dUTP resistance is higher” as the dUTP concentration at which PCR can be amplified is higher.
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention measures the activity as follows. If the enzyme activity is strong, samples should be stored in storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) 25 ⁇ l of the following solution A, 5 ⁇ l of solution B, 5 ⁇ l of solution C, 10 ⁇ l of sterilized water, and 5 ⁇ l of enzyme solution are added to a microtube and reacted at 75 ° C. for 10 minutes.
  • storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • A 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 ⁇ g / mL BSA (bovine serum albumin) B: 1.5 ⁇ g / ⁇ l activated calf thymus DNA C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP) D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate) E: 1 mg / mL calf thymus DNA
  • the modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention may further contain at least one amino acid modification in any of the amino acids constituting the 3′-5 ′ exonuclease active region.
  • the 3′-5 ′ exoase activity refers to the ability to remove the incorporated nucleotide from the 3 ′ end of the DNA polymer, and the above 3′-5 ′ exonuclease region is a DNA polymerase belonging to family B and highly DNA polymerase (SEQ ID NO: 1) derived from Thermococcus kodakaraensis, DNA polymerase (SEQ ID NO: 2) derived from Pyrococcus furiosus, DNA derived from Thermococcus gorgonarius Polymerase (SEQ ID NO: 3), DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), DNA polymerase derived from Pyrococcus sp.
  • SEQ ID NO: 1 derived from Thermococcus kodakaraensis
  • SEQ ID NO: 2 DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus
  • SEQ ID NO: 3 DNA polymerase derived from Therm
  • GB-D (SEQ ID NO: 5), derived from Thermococcus sp. JDF-3 DNA polymerase (SEQ ID NO: 6), Thermoco DNA polymerase derived from Cass SP 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), DNA polymerase derived from Thermococcus sp KS-1 (SEQ ID NO: 8), DNA polymerase derived from Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 10 the amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 are used.
  • the present invention is also applicable to DNA polymerases other than the DNA polymerase specifically presenting the sequence.
  • the 3′- consisting of amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1 The region corresponding to the 5 ′ exonuclease region is shown.
  • amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 shown in SEQ ID NO: 1 are DNA polymerases having an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An expression comprising amino acid sequences corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1.
  • the modification to the 3'-5 'exonuclease region can consist of substitutions, deletions or additions. Modifications to amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in SEQ ID NO: 1 are shown.
  • DNA polymerase in which the 3′-5 ′ exonuclease active region is modified one in which at least one of amino acids corresponding to positions 141, 142, 143, 210, 311 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is modified is preferable.
  • These modified DNA polymerases are deficient in 3′-5 ′ exonuclease activity. More preferably, it is a DNA polymerase deficient in 3′-5 ′ exonuclease activity, wherein the amino acid modification is any one selected from D141A, E143A, D141A / E143A, I142R, N210D, or Y311F.
  • 3'-5 'exonuclease activity-deficient (exo (-)) DNA polymerase includes a complete lack of activity, for example, 0.03%, 0.05% compared to the parent enzyme , 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, or a maximum of 50% or less exonuclease activity.
  • DNA polymerase in which the 3'-5 'exonuclease active region has been modified is one in which the amino acid corresponding to position 147 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 has been modified. More preferably, it is any one selected from H147E and H147D. These modified DNA polymerases have improved PCR efficiency while maintaining exonuclease activity.
  • mutants can be considered as the modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention.
  • examples of such mutants include, but are not limited to, archaeal DNA polymerase mutants having any of the following modifications (1) to (4).
  • Amino acid modification introduction method A method for producing a DNA polymerase in which the 3'-5 'exonuclease active region is modified and a method for analyzing the 3'-5' exonuclease activity are known. This is disclosed in Japanese Patent No. 6946273.
  • a DNA polymerase with improved PCR efficiency refers to a modified DNA polymerase in which the amount of PCR product is increased compared to the parent enzyme.
  • a method for analyzing whether the amount of the PCR product is increased as compared with the parent enzyme is described in Japanese Patent No. 3891330.
  • a method for modifying the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention has already been established in the art. Therefore, it can modify
  • a site-specific mutagenesis method based on the Inverse PCR method can be used.
  • KOD-Plus-Mutageness Kit manufactured by Toyobo
  • the modified DNA polymerase gene is transferred to an expression vector as necessary, and, for example, E. coli as a host is transformed with the expression vector, and then applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form colonies.
  • the colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 ⁇ YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
  • a vector derived from pBluescript is preferable. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells. For example, ultrasonic treatment, a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • the crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured.
  • any method may be used as a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method, for example, the following method.
  • the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods.
  • the obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the DNA polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by heparin sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation.
  • the purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows almost a single band.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention is a method of adding a biological sample that has not undergone a purification step to a nucleic acid amplification reaction solution to amplify a target nucleic acid in the biological sample. It is not particularly limited except that it is a DNA polymerase belonging to family B and contains deoxyuridine (dUTP) in the reaction solution.
  • dUTP deoxyuridine
  • a typical example of a method that can be amplified by a DNA polymerase is PCR.
  • PCR DNA polymerase
  • DNA is used as a template, and one primer, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) is reacted.
  • dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
  • a primer extension method, a sequencing method, a conventional method that does not perform temperature cycling, and a cycle sequence method are included.
  • Amplification target DNA obtained from an unpurified biological sample, (A) an archaeal DNA polymerase variant having reduced base analog detection activity (b) DNA synthesis comprising a pair of primers (c) dUTP in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer A substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)) and (D) mixing a buffer solution containing magnesium ions, ammonium ions and / or potassium ions, By raising or lowering the temperature of the reaction solution using a thermal cycler or the like, a specific DNA fragment is amplified by repeating thermal cycles of (1) DNA denaturation, (2) primer annealing, and (3) primer extension.
  • a PCR enhancing factor (described later), BSA, a nonionic surfactant, and the like may be further used as necessary.
  • an antibody having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3'-5 'exonuclease activity of the thermostable DNA polymerase may be used.
  • the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. This reaction composition is particularly effective for increasing the sensitivity of PCR and reducing nonspecific amplification.
  • the nucleic acid amplification reaction in the present invention may contain a PCR enhancing factor.
  • the enhancement factor refers to a complex or protein having polynucleotide polymerase enhancing activity, such as PEF, dUTPase, ssb, PCNA, RFC, helicase, etc. (Hogrefe et al., 1997, Strategies 10: 93-96; and US Pat. 6,183,997 etc.).
  • PCR enhancing factors also include non-protein factors such as DMSO and betaine.
  • the PCR enhancing factor used in the nucleic acid amplification method of the present invention is not limited to these, but PCNA is particularly preferred.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention is desirably heat-resistant to withstand the thermal cycle of PCR, and preferably remains active after PCR. More preferably, it is soluble even after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes, and the activity remains at 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention more preferably includes PCNA isolated from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus.
  • PCNAs derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus, Pyrococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • PCNAs derived from the genus Thermococcus include Thermococcus kodakaraensis (SEQ ID NO: 21), Thermococcus gorgonaris, Thermococcus literalis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from KS-1, Thermococcus celer, or Thermococcus siculi.
  • PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a modified methionine corresponding to position 73 of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 in order to increase the expression level. More preferably, it is modified to M73L, but is not limited thereto.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification method of the present invention may be a mutant that is loaded alone into DNA.
  • PCNA usually forms a multimer and has a ring-like structure. Loading to DNA indicates that the DNA is allowed to pass inside the ring structure of the PCNA multimer, and PCNA can be loaded into DNA only in combination with a factor usually called RFC.
  • Mutants that load DNA alone are those that modify the sites involved in PCNA multimer formation and destabilize multimer formation, making it easier to pass DNA into PCNA multimers without RFC. Show.
  • PCNA The site where PCNA is related to multimer formation is PCNA (SEQ ID NO: 21) derived from Thermococcus kodakaraensis, and PCNA of Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 22) is an N consisting of amino acids 82, 84 and 109. Examples thereof include a terminal region and a C-terminal region consisting of amino acids 139, 143 and 147. The N-terminal region is positively charged, the C-terminal region is negatively charged, and multimers are formed by interaction.
  • the PCNA variant that is loaded into DNA alone is more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22, which is involved in PCNA multimer formation.
  • SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22 which is involved in PCNA multimer formation.
  • C-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 139, 143 and 147, having at least one modification and no RFC Both include mutants that load into DNA and promote the elongation reaction of DNA polymerase.
  • the amino acid corresponding to the 143rd position of SEQ ID NO: 21 is changed to a basic amino acid
  • the 82nd and 143rd positions are both changed to neutral amino acids
  • the 147th position is changed to a neutral amino acid, or 109 And the like, in which both the 145th and 143rd are modified to neutral amino acids.
  • neutral amino acids of the present invention include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine.
  • alanine has the least influence on the three-dimensional structure of the peripheral site of the substitution site.
  • Examples of basic amino acids include arginine, histidine and lysine as long as they are natural. Arginine is preferable.
  • a sequence in which the 147th amino acid residue is replaced with alanine (D147A), the 82nd and 143rd amino acid residues are alanine.
  • 109th and 143rd amino acid residues changed to alanine SEQ ID NO: 22
  • R109A / D143A, or R109A / E143A in the case of SEQ ID NO: 21 and the like, but is not limited thereto.
  • Whether a PCNA variant can be loaded into DNA alone can be evaluated by PCR.
  • PCR For example, to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and DNA polymerase belonging to Family B, PCNA to be evaluated is added, PCNA is not added, and wild-type PCNA is added
  • the amount of amplification with that of DNA it can be confirmed whether it can be loaded into DNA alone (whether it has amplification enhancing activity). Even if wild-type PCNA or other PCNA that cannot be loaded into DNA alone is added, the PCR amplification amount does not change, but rather the amplification amount tends to decrease.
  • a mutant that can be loaded into DNA alone can obtain an amplification amount superior to that without PCNA addition or with wild-type PCNA addition.
  • the evaluation of “whether the PCNA mutant can be loaded into DNA alone (whether it has amplification enhancing activity)” is based on an archaeal DNA polymerase having reduced base analog detection activity in a reaction system containing dUTP. Evaluate using mutants. Specifically, the following “method for evaluating amplification enhancing activity” is followed. "Evaluation method of amplification enhancing activity” In this specification, (I) PCR KOD -Plus- Ver.
  • PCR is performed on a schedule of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 60 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds repeated 35 cycles.
  • (Ii) After completion of the PCR product analysis reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and under ultraviolet irradiation, the amplified DNA fragment was compared with the one not added with PCNA alone. Whether it can be loaded into DNA (whether it has amplification enhancing activity) can be evaluated. PCNA that can be loaded into DNA alone (high amplification enhancing activity) increases the amount of amplification upon addition.
  • kit Reagent for carrying out nucleic acid amplification method of the present invention kit comprises DNA polymerase belonging to family B and deoxyuridine (dUTP) in the reaction solution
  • dUTP deoxyuridine
  • Other configurations are not particularly limited.
  • the applied nucleic acid amplification method is not particularly limited.
  • examples of the reagent and kit of the present invention include the following configurations (a) to (d), but are not limited thereto.
  • the reagent and kit may further use other reagents, for example, a PCR enhancing factor, BSA, a nonionic surfactant and the like, if necessary.
  • a PCR enhancing factor for example, BSA, a nonionic surfactant and the like, if necessary.
  • Example 1 Production of KOD mutant A plasmid containing a modified thermostable DNA polymerase gene derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain was produced.
  • a DNA template used for mutagenesis a modified thermostable DNA polymerase gene (SEQ ID NO: 11) (pKOD) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 2 Preparation of Pfu mutant A plasmid containing a modified thermostable DNA polymerase gene derived from Pyrococcus furiosus was prepared.
  • a modified thermostable DNA polymerase gene SEQ ID NO: 12
  • pPfu modified thermostable DNA polymerase gene derived from Pyrococcus furiosus cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • pKOD SEQ ID NO: 11 pKOD Y7A 19th to 21st TAC of SEQ ID NO: 11 is replaced with GCC pKOD P36H 106th to 108th CCC of SEQ ID NO: 11 is replaced with CAC pKOD P36K 106th to 108th CCC of SEQ ID NO: 11 is replaced with AAA pKOD P36R PCOD V93Q Replaces C277 at 106-108 in SEQ ID NO: 11 with CGT pKOD V93Q Replaces GTC at 277-279 in SEQ ID NO: 11 with CAG pKOD V93K Replaces GTC at 277-279 in SEQ ID NO: 11 with AAA pKOD V93R SEQ ID NO: 11 277 to 279th GTC was replaced with CGT pKOD P115 ⁇ 343 to 345th CCC of SEQ ID NO: 11 was deleted pKOD
  • PKOD P36H / D141A / E143A 106th-108th CCC of SEQ ID NO: 11 is replaced with CAC And 42 Replace 423rd to 423rd GAC with GCC and replace 427th to 429th GAA with GCA pKOD P36R / D141A / E143A
  • Replace 106th to 108th CCC of SEQ ID NO: 11 with CGT, 421st to 423rd GAC with GCC, 427 ⁇ 429th GAA is replaced with GCA pKOD Y7A / P36H / D141A / E143A 19th to 21st TAC of SEQ ID NO: 11 to GCC
  • 421st to 423rd GAC to GCC 427 to 429th GAA is replaced with GCA pKOD Y7A / P36R / D141A / E143A 19th to 21st TAC of SEQ ID
  • Example 3 Production of modified thermostable DNA polymerase The cells obtained in Example 1 and Example 2 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. Coli JM109 (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Further, nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and heparin sepharose chromatography were performed.
  • thermostable DNA polymerase 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • Example 3-2 Evaluation of the reduced base analog detection activity of the modified thermostable DNA polymerase The uracil detection activity was carried out according to the “Method for evaluating base analog detection activity” described in (10) above.
  • FIG. 1 shows a reaction system using a total of 8 types of wild type (KOD) and 7 types of KOD variants of Y7A, P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H.
  • KOD wild type
  • FIG. 1 shows a reaction system using a total of 8 types of wild type (KOD) and 7 types of KOD variants of Y7A, P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H.
  • amplification products were confirmed in the seven mutants when dUTP having a final concentration of 0.5 ⁇ M was added. Among them, amplification products were confirmed in 6 ranges of P36K, P36R, Y7A / P36K, Y7A / P36R, P36H, V93Q, and Y7A / P36H in the entire dUTP concentration range of 0.5 to 200 ⁇ M.
  • FIG. 2 shows that wild type (KOD), 3′-5 ′ exonuclease deleted by mutation of N210D, KOD (KOD N210D) and I142R deleted by 3′-5 ′ exonuclease were deleted.
  • KOD I142R Three types of KOD (KOD I142R) are prepared, and each of KOD and KOD N210D is added with any of the mutations of V93K, V93R, V93Q, Y7A (8 types in total), and KOD I142R of V93K, Y7A Those with any mutation were prepared (two types).
  • mutations in Y7, P36 or V93 to the uracil-binding pocket tend to increase dUTP resistance levels, and further to mutants carrying 3′-5 ′ exonucleases such as H147E (exo (+))
  • the dUTP resistance concentration is higher when mutation is further added to a mutant lacking 3′-5 ′ exonuclease such as N210D, I142R or D141A / E143A (exo ( ⁇ )).
  • N210D, I142R or D141A / E143A exo ( ⁇ )
  • Table 2 shows both amino acid mutations in the exo region and amino acid mutations related to uracil bonds. Regarding amino acid mutations in the exo region, exo (+) is a mutation that retains 3'-5 'exonuclease, including wild type, and exo (-) is missing 3'-5' exonuclease. It shows that it is a lost mutation.
  • PCR For PCR, KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which 2 mM dTTP is replaced with dUTP, 15 pmol primer (1.3 kbp)
  • dNTPs dATP, dUTP, dCTP, dGTP
  • 15 pmol primer 15 pmol primer
  • PCR was performed with PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem) on a schedule of 35 cycles of 3 minutes for amplification of 3.6 kbp and 4 minutes for amplification.
  • Taq DNA polymerase was manufactured by Toyobo and mixed with Anti-Taq High (manufactured by Toyobo). Reaction is 1 ⁇ BlendTaq with attached Buffer, 2 mM dTTP with dUTP (dATP, dUTP, dCTP, dGTP), 10 pmol primer (same as above), 10 ng human genomic DNA (Roche), mixed with antibody 50 ⁇ l of the reaction solution containing 2.5 U of the enzyme was added at 94 ° C.
  • FIG. 3 shows that the wild type (KOD), V93K, Y7A / V93K, P36R, Y7A / P36R, P36H, Y7A / P36H, P36R / V93K, Y7A / P36R / V93K, P36H / V93K, Y7A / P36H / V93K
  • PCR reaction was performed on human ⁇ -globin DNAs of different lengths in a reaction system containing 0.2 mM final concentration of dUTP (Roche) instead of dTTP. This is a result of electrophoresis of the obtained product.
  • dUTP dUTP
  • FIG. 4 shows that any of the mutations H147E, N210D, I142R, D141A / E143A was first added to the wild type (KOD) exo region, and V93K, Y7A / V93K, P36R, Y7A / P36R, P36H, Y7A were added to each.
  • / P36H to which any of the mutations (total 24 types) were prepared, and these mutants were used to lengthen the reaction system containing 0.2 mM final concentration of dUTP (Roche) instead of dTTP.
  • the results are obtained by performing a PCR reaction on different human ⁇ -globin DNAs and electrophoresing the obtained products.
  • 1.3 kbp is Lane 1
  • 2.8 kbp is Lane 2
  • 3.6 kbp is Lane 3.
  • wild-type DNA polymerases having mutations such as V93K and P36H and exo ( ⁇ ) mutants N210D, I142R and D141A / E143A are mutants such as V93K and P36H.
  • the amount of amplification was larger when the exo ( ⁇ ) DNA polymerase was mutated.
  • mutations such as V93K and P36H are performed on wild-type DNA polymerase, and mutations such as V93K and P36H are performed on H147E which is an exo (+) mutant that improves PCR efficiency.
  • the exo (+) H147E mutant resulted in a larger amount of amplification.
  • the evaluation results of the KOD mutant are summarized in Table 3.
  • Table 3 the 11-step evaluation for dUTP resistance indicates that the closer to 0, the stronger the base analog detection activity, and the closer to 10, the lower the base analog detection activity.
  • ⁇ indicates that the signal is sufficiently amplified
  • ⁇ indicates that the signal is amplified to some extent
  • ⁇ indicates that the signal is not amplified.
  • Example 3-4 Comparison of synthesis rate
  • the synthesis rate was determined according to ⁇ DNA polymerase synthesis rate measurement method> described in (8) above.
  • FIG. 5 shows a total of 8 types of wild type (WT) and 7 types of KOD variants including Y7A / V93K, P36H, Y7A / P36H, Y7A / V93K / N210D, P36H / N210D, Y7A / P36H / N210D, and N210D.
  • WT wild type
  • “30” indicates that the PCR reaction was performed for 30 seconds.
  • FIG. 5 shows that the longer the amplification product is detected at the top of the electrophoresis photograph, the longer the amplification product is taken and the faster the synthesis rate.
  • 7000 bp and 3000 bp amplification products are detected at the respective arrows.
  • the numbers shown at the bottom of the photograph are the synthesis rates of each DNA polymerase calculated based on the results.
  • the Y7A / V93K, P36H, and Y7A / P36H mutants showed faster synthesis rates than the wild type (WT).
  • the N210D mutant in which the exo region is modified has a faster synthesis rate than the wild type
  • the mutant in which the N210D mutant is modified with Y7A / V93K, P36H, Y7A / P36H, etc. has a higher synthesis rate. It was confirmed to be faster.
  • Example 3-5 Amplification from blood in PCR in the presence of dUTP Blood resistance was evaluated by changing the amount of blood added to the reaction solution.
  • Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase (Toyobo) mixed with KOD (wild type), KOD Y7A / V93K mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant, and antibody mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per 1U.
  • Anti-Taq High Toyobo
  • 482 bp PCR of HBg was performed to compare the differences in amplification.
  • KOD PCR was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) attached Buffer, using MgSO 4, 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4, 15 pmol of primer (SEQ ID NO: 19 and 20 in the amplification of 482 bp), each enzyme 1U mixed with antibody Of normal dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) added in 0.2 mM, and dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which dTTP is replaced with dUTP in 0.2 mM Each of these was added to be used, and blood itself and blood diluted with water were used as templates.
  • dNTPs dATP, dTTP, dCTP, dGTP
  • PCR system GeneAmp 9700 (Applied) with a schedule that repeats 35 cycles of 94 ° C., 2 minutes pre-reaction, 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute per 1 bp (1 minute for 482 bp amplification) PCR was performed using Biosystem).
  • Taq DNA polymerase PCR was performed by adding ordinary dNTPs (in a 50 ⁇ l reaction solution containing Buffer (Toyobo product) attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), 2.5 U enzyme mixed with antibody.
  • dATP, dTTP, dCTP, dGTP added at 0.2 mM
  • dNTPs with dTTP replaced by dUTP dATP, dUTP, dCTP, dGTP
  • Blood itself and blood diluted with water were used.
  • PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem) with a schedule of 94 cycles at 94 ° C for 2 minutes followed by 35 cycles of 94 ° C, 30 seconds ⁇ 65 ° C, 30 seconds ⁇ 68 ° C, 1 minute per 1 bp (same as above) PCR was performed using After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 6 shows various DNA polymerases prepared by using blood as a sample and adjusting the reaction solution so that the proportion of blood in the reaction solution is 10, 5, 2, 0.2, 0.02, 0.002%.
  • the result of having performed PCR reaction by and electrophoresis of the obtained product is shown.
  • the DNA polymerases used are 4 types in total: Taq, KOD (wild type), and 2 types of KOD variants (Y7A / V93K, Y7A / P36H / N210D).
  • the left side of each photograph uses dTTP, and the right side uses dUTP.
  • Lane 1 is the case where the proportion of blood in the reaction solution is 10%, and the following 2-6 lanes are for 5%, 2%, 0.2%, 0.02% and 0.002%, respectively.
  • KOD KOD
  • Example 4 Preparation of KOD-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain was prepared.
  • the DNA template used for mutagenesis was PCNA (SEQ ID NO: 23) (pKODPCNA) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned into pBluescript. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 4-2 Preparation of Pfu-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Pyrococcus furiosus was prepared.
  • PCNA SEQ ID NO: 24
  • pPfuPCNA derived from Pyrococcus furiosus cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • pKOD PCNA SEQ ID NO: 23 pKOD PCNA M73L 217 to 219th ATG in SEQ ID NO: 23 is replaced with CTG pKOD PCNA M73L / E143A 217 to 219th ATG in SEQ ID NO: 23 is replaced with CTG 427 to 429th GAG is replaced with GCC pKOD PCNA M73L / E143F Substitution of 217-219th ATG of SEQ ID NO: 23 with CTG and 427-429th GAG with TTC pKOD PCNA M73L / E143R 217-219th ATG of SEQ ID NO: 23 with CTG, 427-429th GAG PKOD PCNA M73L / D147A pGOD PCNA M73L / R82A / E143A pKOD PCNA M73L / R82A / E143A of SEQ ID NO: 23:
  • Example 4-3 Production of modified heat-resistant PCNA
  • the cells obtained in Example 4-1 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated for 16 hours at 37 ° C. in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. E. coli DH5 ⁇ (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, the nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and Q sepharose chromatography were performed.
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 .1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 .1% Tween 20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin
  • PCNA PCR enhancement factor
  • FIG. 7 shows the results of electrophoresis of the products obtained by adding 250 ng of various PCNA mutants and performing PCR reaction.
  • the PCNA mutants used were M73L, M73L / E143R, M73L / E143A, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, and M73L / E143F.
  • no PCNA was added
  • the KOD-PCNA M73L mutant was used as the PCNA (lane 1)
  • only a small band was found, but other KOD PCNA mutants were not detected.
  • the amount of amplification increased and a clearer band was confirmed.
  • PCNA forms a multimer and promotes a nucleic acid synthesis reaction. Usually, however, the reaction cannot proceed without loading into DNA without the action of RFC. M73L / E143R, M73L / E143A, M73L / R109A / E143A, M73L / D147A, M73L / R82A / E143A, and M73L / E143F are changes to sites involved in multimer formation, and multimer formation is moderately weakened. Therefore, it is conceivable that PCNA could be loaded onto DNA and the amount of PCR amplification was improved (FIG. 7). PCNA has also been reported to increase the synthesis rate and shorten the elongation time. However, the improvement in the synthesis rate shortens the time for the interaction between uracil and the binding pocket, and weakens the detection activity of uracil. It is possible.
  • Example 4-5 Comparison of synthesis rate by adding PCNA
  • KOD V93K was diluted with a storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin).
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • 250 ng of PCNA mutant was added to each reaction system, and the synthesis rate was measured. Reagents and methods were performed according to ⁇ DNA polymerase synthesis rate measurement method> described in (8) above.
  • FIG. 8 shows the results of electrophoresis of products obtained by adding various PCNA mutants to the V93K mutant, performing PCR reaction for 30 seconds, 60 seconds, and 120 seconds.
  • the PCNA mutant a PCNA mutant derived from KOD (D147A, E143R, R109A / E143A) was used.
  • “30” indicates that the PCR reaction was performed for 30 seconds. The same applies to 60 and 120.
  • FIG. 8 shows that the longer the amplified product is detected at the top of the electrophoretic photograph, the longer the amplified product is taken and the faster the synthesis rate.
  • 7000 bp and 3000 bp amplification products are detected at the respective arrows.
  • the numbers shown at the bottom of the photograph are the synthesis rates of each DNA polymerase calculated based on the results.
  • Example 4-6 Effects of amplification from blood and addition of PCNA in PCR in the presence of dUTP PCNA was added to the evaluation of blood resistance to confirm the influence.
  • Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase (Toyobo) mixed with KOD (wild type), KOD Y7A / V93K mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant, and antibody mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per 1U.
  • PCA D147A mutant was added in an amount of 250 ng, and HBg 482 bp PCR was performed to compare the differences in the amplification using a mixture of equal amounts of Anti-Taq High (manufactured by Toyobo)).
  • KOD PCR was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), using the attached Buffer, MgSO 4 , 50 ⁇ l containing 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , 15 pmol primer (SEQ ID NOs: 19 and 20), 1 U of each enzyme mixed with the antibody
  • 0.2 mM of normal dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) and dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which dTTP is replaced with dUTP are added to 0.2 mM.
  • KOD-PCNA M73L / D147A mutant 250 ng of KOD-PCNA M73L / D147A mutant was added to each reaction solution.
  • As the mold blood itself and blood diluted with water were used.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 2 minutes and 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute.
  • Taq DNA polymerase PCR was performed by adding ordinary dNTPs (in a 50 ⁇ l reaction solution containing Buffer (Toyobo product) attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), 2.5 U enzyme mixed with antibody.
  • dATP, dTTP, dCTP, dGTP added at 0.2 mM
  • dNTPs with dTTP replaced by dUTP dATP, dUTP, dCTP, dGTP
  • Blood itself and blood diluted with water were used.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 30 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute after 35 minutes at 94 ° C. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 9 shows various DNA polymerases prepared by using blood as a sample and adjusting the reaction solution so that the proportion of blood in the reaction solution is 10, 5, 2, 0.2, 0.02, 0.002%.
  • 2 shows the result of electrophoresis of the product obtained by performing the PCR reaction in the presence of KOD-derived PCNA mutant (D147A).
  • the DNA polymerases used are 4 types in total: Taq, KOD (wild type), and 2 types of KOD variants (Y7A / V93K, Y7A / P36H / N210D).
  • the left side of each photograph uses dTTP, and the right side uses dUTP.
  • Lane 1 is the case where the proportion of blood in the reaction solution is 10%, and the following 2-6 lanes are for 5%, 2%, 0.2%, 0.02% and 0.002%, respectively.
  • PCNA binds to a site called PIP motif of polymerase belonging to family B. Since polymerases belonging to family A such as Taq have no PIP motif, no effect was seen even when PCNA was added (FIG. 9).
  • the amount of amplification of KOD Y7A / P36H / N210D to which PCNA was added and KOD Y7A / V93K to which PCNA was added increased in order of increasing synthesis rate, and the synthesis rate is also considered important for PCR in the presence of dUTP.
  • KOD KOD
  • PCNA is also a variant of KOD-PCNA M73L / E143R, M73L / R82A / E143A, M73L / R109A / E143A, Pfu-PCNA M73L / D143R, M73L / D147A, M73L / R82A / D143A, M73L / R109A / D143A.
  • the same reaction was carried out, amplification was confirmed from the addition of 10% blood, and a solid band could be confirmed even in the presence of dUTP.
  • Example 4-7 PCR from body tissues (nail, hair, oral mucosa) in the presence of dUTP
  • body tissues nail, hair, oral mucosa
  • PCR can be performed in the presence of dUTP using nails, hair, and oral mucosa as templates.
  • a piece of nail cut with a nail clipper and one piece of hair were added to 180 ⁇ l of 50 mM NaOH, crushed by heat treatment at 95 ° C. for 10 minutes, and then neutralized by adding 20 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 8.0). The supernatant was used as a template.
  • the oral mucosa was obtained by suspending mucosa collected with a cotton swab in 200 ⁇ l of water as a template.
  • the enzyme includes Taq DNA polymerase (Taq DNA polymerase (Toyobo), which is a mixture of KOD (wild type), KOD Y7A / V93K mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant, and antibody mixed with 0.8 ⁇ g of KOD antibody per 1 U.
  • Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase (Toyobo)
  • Toyobo Taq DNA polymerase
  • HBg 482 bp PCR was carried out using a mixture of equal amounts of (manufactured) and Anti-Taq High (manufactured by Toyobo)) to compare the differences in amplification.
  • KOD PCR was performed using KOD-Plus-Ver.
  • Each reaction solution was also added with 250 ng of KOD-PCNA E143R mutant, which is a PCR enhancing factor.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 2 minutes and 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute.
  • Taq DNA polymerase PCR was performed by adding ordinary dNTPs (in a 50 ⁇ l reaction solution containing Buffer (Toyobo product) attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), 2.5 U enzyme mixed with antibody.
  • PCR was performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles of 94 ° C., 30 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute after 35 minutes at 94 ° C. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 10 shows the results of electrophoresis of products obtained by performing PCR reaction with various DNA polymerases in the presence of KOD-derived PCNA mutant (E143R) using nail, hair and oral mucus as samples.
  • the DNA polymerases used are 4 types in total: Taq, KOD (wild type), and 2 types of KOD variants (Y7A / V93K, Y7A / P36H / N210D).
  • the left side of each photograph uses dTTP, and the right side uses dUTP.
  • 1 lane is a nail sample
  • 2 lane is hair
  • 3 lane is oral mucosa.
  • the respective “+” lanes indicate the presence of KOD-derived PCNA mutant (E143R) and “ ⁇ ” indicates no PCNA.
  • KOD KOD
  • Example 4-8 Amplification from plant lysate Amplification from plant lysate was performed in a PCR reaction system containing dUTP. For comparison, KOD Y7A / P36H / N210D mutant and Taq polymerase were used, and the difference in amplification amount of rbcL 1.3 kb was compared. The KOD Y7A / P36H / N210D mutant was also added with KOD-PCNA M73L / D147A added as a PCR enhancing factor.
  • a rice leaf 3 mm square was added to 100 ⁇ l of Buffer A (100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA) and heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes, and used as a lysate.
  • Buffer A 100 mM Tris-HCl (pH 9.5), 1 M KCl, 10 mM EDTA
  • the PCR of KOD Y7A / P36H / N210D was performed using KOD-Plus-Ver.
  • Taq DNA polymerase was manufactured by Toyobo and mixed with Anti-Taq High (manufactured by Toyobo). The reaction consists of Buffer attached to 1 ⁇ BlendTaq, 10 pmol primer (same as above), dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) in which 2 mM dTTP is replaced by dUTP, and 50 ⁇ l of 2.5 U enzyme mixed with antibody.
  • Plant lysate was added to the reaction solution so as to be 2% of the reaction solution, and after 94 ° C. for 2 minutes, 94 ° C., 30 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C.
  • the PCR was performed using a PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 35 cycles of minutes. After completion of the reaction, 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 11 shows that plant lysate was used as a sample, and the reaction solution was prepared so that the ratio of lysate in the reaction solution was 2%, and KOD Y7A / P36H / N210D mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant were subjected to KOD.
  • KOD Y7A / P36H / N210D mutant KOD Y7A / P36H / N210D mutant
  • KOD Y7A / V93K, P36H, P36K, P36R, V93K, V93R, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, P36H / H147E, P36K / H147E, P36R / H147E, V93K / H147E, V93K / R147E / H147E, Y7A / P36H / H147E, Y7A / P36R / H147E, Y7A / V93K / H147E, Y7A / V93R / H147E, P36H / N210D, P36K / N210D, P36R / N210D, V93K / N210D, V93R7 / N210D, Y7A / V93K / N210D, Y7A / V93R / N210D, P36H / N
  • PCNA is also a variant of KOD-PCNA M73L / E143R, M73L / R82A / E143A, M73L / R109A / E143A, Pfu-PCNA M73L / D143R, M73L / D147A, M73L / R82A / D143A, M73L / R109A / D143A.
  • the same reaction was carried out, and it was confirmed that the amplification amount was improved as compared with the case where PCNA was not added.
  • Example 4-9 It was evaluated whether amplified dUTP from stool and gene amplification can be performed in the presence of stool.
  • As the enzyme KOD Y7A / P36H / N210D mutant and Taq polymerase were used, and the difference in amplification of about 700 bp of Salmonella invA gene was compared by real-time PCR using SYBR GREEN I and melting curves.
  • the KOD Y7A / P36H / N210D mutant was also added with KOD-PCNA M73L / D147A added as a PCR enhancing factor.
  • a 10% fecal suspension was heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes.
  • a buffer attached to KOD Dash manufactured by Toyobo
  • stool was added to the reaction solution at 0, 0.
  • the reaction is as follows: Buffer attached to 1 ⁇ Taq (Mg attachment type), 50 copies of Salmonella genome, 4 pmol primer (same as above), dNTPs with 2 mM dTTP replaced with dUTP (dATP, dUTP, dCTP, dGTP), 4 mM In 20 ⁇ l of a reaction solution containing 1 U of enzyme mixed with MgSO 4 , 1/30000 SYBR GREEN I, antibody, feces were added to the reaction solution at 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0. , 1.5, 2.0, 2.5%, 95 ° C., 30 seconds pre-reaction, 98 ° C., 10 seconds ⁇ 60 ° C. 10 seconds ⁇ 68 ° C., 30 seconds repeated 50 cycles
  • the schedule was performed using LightCycler 2.0 (Roche). After completion of the reaction, a target peak appearing in the latter half of 80 ° C. was confirmed by melting curve analysis.
  • Table 5 shows the Cq value of Example 4-9.
  • Table 5 shows Cq values (default settings of LightCycler 2.0) of real-time PCR performed in the presence of dUTP and feces.
  • N. D. Indicates that no amplification was observed and no Cq value was obtained. As a result, amplification was not observed when 0.5% stool was added to Taq polymerase, but amplification was confirmed even when 2.5% stool was added to KOD Y7A / P36H / N210D. Further, comparing the presence or absence of PCNA, it was found that the one with PCNA added had a smaller Cq value and showed excellent PCR efficiency.
  • FIG. 12 shows the results of melting curve analysis of the obtained amplification product using PCR in the presence of dUTP and feces.
  • the total number of polymerases used was KOD Y7A / P36H / N210D mutant, KOD Y7A / P36H / N210D mutant with KOD-PCNA M73L / D147A added, and Taq polymerase.
  • 1 shows the result of KOD Y7A / P36H / N210D
  • 2 shows the result of adding KOD-PCNA M73L / D147A to KOD Y7A / P36H / N210D
  • 3 shows the result of Taq polymerase.
  • KOD Y7A / V93K, P36H, P36K, P36R, V93K, V93R, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, P36H / H147E, P36K / H147E, P36R / H147E, V93K / H147E, V93K / R147E / H147E, Y7A / P36H / H147E, Y7A / P36R / H147E, Y7A / V93K / H147E, Y7A / V93R / H147E, P36H / N210D, P36K / N210D, P36R / N210D, V93K / N210D, V93R7 / N210D, Y7A / V93K / N210D, Y7A / V93R / N210D, P36H / N
  • PCNA is also a variant of KOD-PCNA M73L / E143R, M73L / R82A / E143A, M73L / R109A / E143A, Pfu-PCNA M73L / D143R, M73L / D147A, M73L / R82A / D143A, M73L / R109A / D143A.
  • the same reaction was performed, and it was confirmed that the PCR efficiency was improved as compared with the case where PCNA was not added.
  • Example 4-10 Amplification from blood by addition of PCNA using reaction solution containing dUTP
  • reaction solution containing dUTP As the enzyme, KOD Y7A / P36H / N210D and Taq polymerase were used, and the difference in the amount of amplification of 1.3 kb of HBg was compared.
  • the KOD mutant was also added with Pfu-PCNA M73L / D147A.
  • PCR for KOD mutants was performed using KOD-Plus-Ver. 2 (manufactured by Toyobo), using Buffer, MgSO 4 attached, 1 ⁇ PCR Buffer, and 1.5 mM MgSO 4 , 15 pmol primer (SEQ ID NO: 13 and 14), dNTPs (dATP, dUTP in which 2 mM dTTP was replaced with dUTP) , DCTP, dGTP), and 50 ⁇ l of the reaction solution containing 1 U of each enzyme mixed with KOD antibody, blood was added to 2% of the reaction solution, and 250 ng of Pfu-PCNA M73L / D147A without PCNA was added. The additions were compared.
  • Taq DNA polymerase PCR was mixed with 1 ⁇ BlendTaq attached Buffer (Toyobo product), 10 pmol primer (same as above), dNTPs (dATP, dUTP, dCTP, dGTP) with 2 mM dTTP replaced with dUTP, and antibody.
  • a 50 ⁇ l reaction solution containing 2.5 U of enzyme was used by adding 2% of blood to the reaction solution.
  • the reaction was carried out using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule of repeating 94 cycles at 94 ° C. for 2 minutes followed by 35 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1.5 minutes. It was.
  • 5 ⁇ l of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 13 shows a reaction solution containing 2% blood prepared by adding Pfu-PCNA M73L / D147A to KOD Y7A / P36H / N210D mutant and KOD Y7A / P36H / N210D mutant with Taq polymerase.
  • the result of carrying out PCR reaction and electrophoresis of the obtained product is shown.
  • -indicates no PCNA, and + indicates that PCNA was added.
  • it was shown that even a relatively long amplification of 1.3 kb can be amplified from crude conditions including blood components.
  • a solid band was confirmed in the case where the PCNA mutant was added compared to the case where the PCNA mutant was not added (FIG. 13).
  • KOD P36H / N210D, P36K / N210D, P36R / N210D, V93K / N210D, V93R / N210D, Y7A / P36R / N210D, Y7A / V93K / N210D, Y7A / V93R / N210D, P36H / I142R, P36R / I142R, V93K / I142R, V93R / I142R, Y7A / P36H / I142R, Y7A / P36R / I142R, P36H / D141A / E143A, P36R / D141A / E143A, V93K / D141A / E143A, V93R / D141A / E / D141A / E143A, Y7A / P36R / D141A / E143A) under the same reaction conditions, the
  • PCNA is also KOD-PCNA M73L / D147A, M73L / E143R, M73L / R82A / E143A, M73L / R109A / E143A, Pfu-PCNA M73L / D143R, M73L / R82A / D143A, M73L / R109A / D143A variants
  • the same reaction was carried out, and it was confirmed that the amplification amount was improved as compared with the case where PCNA was not added.
  • the present invention eliminates the risk of loss and carryover during DNA purification, and further reduces time and cost. Also, in order to prevent contamination by the dUTP / UDG contamination removal method, not only in the research field, but also in the clinical field or forensic field such as genetic diagnosis in which the same sample is amplified many times, or in the microbiological examination in foods and the environment, etc. Can also be widely used

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Abstract

【課題】ｄＵＴＰを基質として含むＰＣＲにおいて、生体試料由来の夾雑物が多量に存在しても、ＰＣＲ増幅が可能な核酸増幅法を提供する。 【解決手段】精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、増幅に用いられる酵素がファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであり、かつデオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。

Description

核酸増幅法
本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
一方、ＰＣＲは非常に高感度な検出方法であるため、以前に行ったＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性が問題となる。そこで、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含む基質を用いてＰＣＲを行い、増幅産物にウラシル塩基を取り込ませ、次のＰＣＲを行う際にＵｒａｃｉｌ－Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）処理することで、コンタミネーション（キャリーオーバー）した増幅産物を分解する手法（ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法）がとられている（非特許文献１）。
しかしながら、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法において、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを基質としてＰＣＲを行うと、反応効率が低下し、増幅産物の量が減少することが問題となっていた。
また、ＰＣＲは、色素やタンパク質、糖類などの夾雑物の影響を受けやすく、夾雑物が反応を阻害することも知られている（非特許文献２）。通常、生体試料中の遺伝子を増幅する場合は、ＤＮＡの精製が必要とされているが、ＤＮＡの精製は、精製の操作は煩雑で、かつ、時間を要し、操作中にコンタミネーションを生じる危険性がある。また、試料中の目的核酸含量が少ない場合には、回収することができない場合もあった。これらのことから、生体試料を、精製工程を経ることなく、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応液へ持込み、標的核酸を増幅する方法が求められていた。
特許４３９５３７７ 特表２００６－５０７０１２
Ｇｅｎｅ，　Ｖｏｌ．９３（１），　１２５–１２８　（１９９０） Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,　Ｖｏｌ．３９,　Ｎｏ．２，　ｐ４８５－４９３（２００１）
そこで、本発明はｄＵＴＰを基質として含むＰＣＲにおいて、標的核酸の効率的な増幅法を提供することを目的とする。より詳細にはｄＵＴＰを基質として含むＰＣＲにおいて、生体試料由来の夾雑物が多量に存在しても、ＰＣＲ増幅が可能な核酸増幅法を提供する。
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。要約すれば本発明の目的は、ｄＵＴＰ存在下で動植物組織や体液に存在する遺伝子の増幅に適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
前記目的を達成するための本発明の核酸増幅方法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用い、生体試料中のＤＮＡを、精製工程を経ることなく、ｄＵＴＰ存在下で増幅することを特徴とする前記核酸増幅方法である。
すなわち、本発明者は生体由来試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し反応させる核酸増幅法において、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や口腔粘膜のような生体試料をＰＣＲ反応液に直接添加しても、ＰＣＲが可能になることを見いだし、本発明を成すに至った。
なお、通常のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼはウラシルと強く結合するため、ｄＵＴＰを基質として含むＰＣＲでは増幅ができないとされていた。そのため、ｄＵＴＰを基質として含むＰＣＲにおいて、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用い、生体試料中のＤＮＡを、精製工程を経ることなく増幅した例は報告されていない。
代表的な本願発明は以下の通りである。
［１］
精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、増幅に用いられる酵素がファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであり、かつデオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
［２］
生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである［１］に記載の核酸増幅法。
［３］
核酸増幅に用いられる酵素が、減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である、［１］または［２］に記載の核酸増幅法。
［４］
核酸増幅に用いられる酵素が、３０塩基/秒以上のＤＮＡ合成速度を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［５］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかで示されるものであることを特徴とする、［３］または［４］に記載の核酸増幅法。
（ａ）配列番号１または配列番号２（Ｐｆｕの野生型配列に相当）で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列である。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
［６］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、［３］～［５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［７］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈのいずれかの改変を有する、［３］～［６］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［８］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＰ３６Ｈのいずれかの改変を有する、［３］～［７］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［９］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、［１］～［８］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１０］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号１または配列番号２における、Ｄ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、［１］～［９］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１１］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号１または配列番号２における、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｈ１４７Ｅ、Ｈ１４７Ｄ、Ｎ２１０ＤまたはＹ３１１Ｆのいずれかである［１］～［１０］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１２］
古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する、［３］～［１１］のいずれかに記載の核酸増幅法。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか
［１３］
さらにＰＣＮＡを前記反応液に含む［１］～［１２］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１４］
ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である、［１］～［１３］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１５］
ＰＣＮＡが、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列の（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１６］
ＰＣＮＡが配列番号２１または配列番号２２における１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、［１］～［１５］のいずれかに記載の核酸増幅法。
［１７］
［１］～［１６］のいずれかに記載の核酸増幅法を実行するための試薬。
［１８］
［１］～［１６］のいずれかに記載の核酸増幅法を実行するための試薬を含むキット。
本発明によって、ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。また、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼの長鎖ＤＮＡ増幅の評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼの長鎖ＤＮＡ増幅の評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼの合成速度の比較。 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた血液からの増幅評価 ＰＣＲ増強因子（ＰＣＮＡ）の評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼのＰＣＮＡ添加による合成速度の比較 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた体組織（爪、髪、口腔粘膜）からの増幅評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた植物ライセートからの増幅評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを用いた糞便存在下からの増幅評価 本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼとＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価 ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図である。
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
（１）［本発明の特徴］
本発明における核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、増幅に用いられる酵素がファミリーＢに属するポリメラーゼであり、かつデオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含んでいることを特徴とする。
（２）［精製工程を経ないこと］
本発明における核酸増幅法においては、精製工程を経ていない生体試料内の核酸を精製することなく増幅する。精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法がある。
臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。
本発明における核酸増幅法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、核酸増幅反応液に添加し増幅する方法である。本発明において「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられるが、精製工程を経ていなければ、これらに限定されるものではない。
本明細書では「血液耐性」という言葉を用いるが、これは、核酸増幅反応液に血液が存在していても阻害に耐えることを言う。増幅可能な血液濃度が高いほど「血液耐性が高い」と表現する。
（３）［生体試料］
本発明の核酸増幅法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
（４）［デオキシウリジン（ｄＵＴＰ）］
本発明の核酸増幅法においては、反応液にｄＵＴＰを含む。ｄＵＴＰの入手経路は特に限定されないが、市販のものを使用することができる。
反応液中のｄＵＴＰの濃度は特に限定されないが、コンタミネーション除去の効率の観点から、好ましい下限は０．５μＭ以上、より好ましくは５０μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上である。またＰＣＲ効率の観点から、ｄＵＴＰは高濃度で含まれていてもよい。好ましい上限は１ｍＭ以下、より好ましくは０．６ｍＭ以下である。
また、ＰＣＲ効率の観点からｄＴＴＰとｄＵＴＰが混在していてもよい。ｄＴＴＰとｄＵＴＰの比率は１００：１～１：１００が好ましい。より好ましくは１０：１～１：１０であり、さらに好ましくは１：１であるが、これらに限定されない。
本発明の核酸増幅法に適用される核酸は、その長さや配列、ＧＣ含量の違いなどに制約を受けないが、増幅時にｄＵＴＰを取り込ませるので、核酸にＴが含まれることが必要であり、Ｔが１０個以上含まれていることが好ましい。
（５）［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
（６）［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。
なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
（７）［減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体］
本発明の核酸増幅法に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
このようなファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性を有する変異体としては、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示できる。
具体的には、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。ウラシルやイノシンへの結合能力が低い古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
（８）［ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度］
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異型は、野生型（ＷＴ）と比べてＤＮＡ合成速度が速いものであることが好ましい。
野生型の、ファミリーＢに属するポリメラーゼは高い正確性を持つ。これは取り込まれた塩基が間違っていないかを確認しながら増幅するためである。間違いの原因となる塩基については、シトシンの熱分解により生じアラニンと対合するウラシルが挙げられる。ファミリーＢに属するポリメラーゼはウラシルと強く結合するポケットを有し、増幅する核酸にこのウラシルがないかを一つ一つ確認しながら増幅していく。
一方で、このポケットはウラシルと強く相互作用し反応を遅くする（あるいは止める）働きを持つ。この相互作用は、多少なりとも構造の類似するシトシンなどの塩基にも及ぶことが考えられ、そのためＤＮＡ合成速度が抑えられていた可能性がある。本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異型は、ウラシル結合ポケットへ改変を行うことで、ウラシルのみならずシトシンなどとも相互作用しなくなり、合成速度が上がると考えられる。
ウラシルと強く結合するポケットの改変により合成速度が速くなる程度は、野生型を改変するより、エキソ領域を改変した変異体をさらに改変する方がより高い。
前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、または、古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは、下記の測定法で、３０塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有することが望ましい。
ｄＵＴＰ存在下ではｄＵＴＰとポリメラーゼが強く結合することでＰＣＲの阻害が生じる。ＤＮＡの合成速度が高いポリメラーゼの方が、ｄＵＴＰとの結合を起しにくく、ｄＵＴＰ存在下でｄＵＴＰの影響を受けにくい。
＜ＤＮＡポリメラーゼ合成速度測定法＞
本発明において、核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼの合成速度は以下のように測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２．５μｌ、Ｂ液２．５μｌ、Ｃ液１．５μｌ、Ｄ液４．８μｌ、およびＥ液４μｌを混合し、９５℃にて１０分、３７℃にて１０分置き、基質を作成する。
（２）、７５℃にて３０秒、インキュベートさせた基質に０．６４ｎｇ／μｌ酵素溶液５μｌを加えて７５℃にて３０秒、６０秒、１２０秒反応する。その後氷冷し、Ｆ液３５μｌを加えて、よく攪拌する。
（３）この液を１０μｌ、１％のアルカリアガロースゲルに供し、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ２－Ｌｏｇ ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ (０．１－1０ ｋｂ)(ＮＥＢ製）をマーカーとし電気泳動する。
（４）Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋へブロッテリングし、ＮＥＢのＰｈｏｔｏｔｏｐｅ－Ｓｔａｒ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔの取説に従い、ビオチンを検出する。１秒当たりに伸長した鎖の長さを合成速度とする。
Ａ：１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ   －Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）
Ｂ：２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ製）
Ｃ：２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４
Ｄ：２００ｎｇ／μｌ　Ｍ１３　ｓｓＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）
Ｅ：１００μＭ　Ｂｉｏｔｉｎ化Ｐ７プライマー（配列：Ｂｉｏｔｉｎ－ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）
Ｆ：５９ｍＭ　ＮａＯＨ、５９ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＢＰＢ　３０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
ＤＮＡ合成速度は、後述のＰＣＲ増強因子（たとえばＰＣＮＡ）の添加によりさらに早くすることができる。５０塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これらに限定されない。
（９）［古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体］
前記「減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体」について、さらに具体的に説明する。
ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７（配列番号７）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ－１（配列番号８）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１～４０、およびアミノ酸７８～１３０によって形成される。
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、すなわち、（ａ）配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列で示される古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一（好ましくは８５％以上同一であり、さらに好ましくは９０％以上同一であり、さらに好ましくは９５％以上同一であり、さらに好ましくは９８％以上同一であり、さらに好ましくは９９％以上同一である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１６０個、好ましくは２～１２０個、より好ましくは２～８０個、更に好ましくは２～４０個であり、より更に好ましくは２～５個である。
なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。
本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。
ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。
別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。さらに好ましくはＶ９３Ｋである。
より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。
本発明における減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１または配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
なお、特許文献１または２には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、および１１２～１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
（１０）［塩基類似体検出活性の評価方法］
本発明における塩基類似体検出活性はＰＣＲによって評価できる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ～２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。
減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、および鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲの増幅ができる古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１３及び１４に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。
ＰＣＲの増幅ができるｄＵＴＰ濃度が高いほど、塩基類似体検出活性が減少している。本明細書では、このことを、ＰＣＲの増幅ができるｄＵＴＰ濃度が高いほど、「ｄＵＴＰ耐性が高い」とも表現する。
（１１）［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼは以下のように活性を測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ　塩酸およびエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ　塩化マグネシウム１５
ｍＭ　ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ　［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％　トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
（１２）［３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変］
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３‘－５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ－１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目のアミノ酸である。本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１～１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目のアミノ酸からなる３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
なお、「配列番号１に示される１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。
上記の３‘－５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７～１４７、２０６～２２２、および３０８～３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号１または配列番号２における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。
なお、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（－））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号１または配列番号２における１４７番目に対応するアミノ酸を改変したものである。より好ましくは、Ｈ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。
上記（９）および（１２）に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとして、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるわけではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか
（１３）アミノ酸改変の導入方法
なお、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３‘－５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は公知であり、例えば、米国特許第６９４６２７３号に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法は、特許第３８９１３３０号等に記載されている。
本発明の核酸増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼを、改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。　この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
（１４）核酸増幅法
本発明の核酸増幅法は、精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、増幅に用いられる酵素がファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであり、かつデオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含んでいることを除いて、特に限定されない。
ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能な方法としては、典型的にはＰＣＲが挙げられるが、本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
本発明の方法において、ＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示すが、これに限定されるものではない。
精製していない生体試料から得た増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ｄＵＴＰを含むＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））および、
（ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液
を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＰＣＲ増強因子（後述）、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。
（１５）［ＰＣＲ増強因子］
さらに本発明における核酸増幅反応には、ＰＣＲ増強因子が含まれていてもよい。その増強因子とは、ポリヌクレオチドポリメラーゼ増強活性、例えばＰＥＦ、ｄＵＴＰａｓｅ、ｓｓｂ、ＰＣＮＡ、ＲＦＣ、ヘリカーゼ等を有する複合体または蛋白を指す（Ｈｏｇｒｅｆｅら、１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ １０：９３－９６；および米国特許第６，１８３，９９７号などを参照）。また、ＰＣＲ増強因子には非蛋白因子、例えばＤＭＳＯおよびベタインも包含される。本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＲ増強因子は、これらに限定されるものではないが、ＰＣＮＡが特に好ましい。
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。さらに好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０%以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。
本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡとしては、さらに好ましくはパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号２１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
また、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは発現量を増やすため、配列番号２１または配列番号２２の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものがあげられるが、これに限定されない。
さらに、本発明の核酸増幅法に用いるＰＣＮＡは単独でＤＮＡにロードする変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。
ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（配列番号２１）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（配列番号２２）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。
上記および下記において、配列番号２１または配列番号２２を例にして説明したことは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図１４で示したように配列番号２１および２２に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号２１の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。
単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列の、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、または
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくともひとつの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を促進する変異体があげられる。
たとえば、配列番号２１の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、または、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。
本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リシンが挙げられる。好ましくはアルギニンである。
より好ましくは、ＷＯ２００７／００４６５４に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに換えた配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（配列番号２２の場合Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくは、配列番号２１の場合Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、および第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに変えた配列（配列番号２２の場合Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくは、配列番号２１の場合Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか（増幅増強活性があるかどうか）は、ＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるか（増幅増強活性があるかどうか）を確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲの増幅量は変化せず、むしろ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものと比べて優れた増幅量を得ることができる。
本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか（増幅増強活性があるかどうか）」の評価は、ｄＵＴＰを含んだ反応系で減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いて評価する。
具体的には以下の「増幅増強活性の評価方法」に従う。
 
「増幅増強活性の評価方法」
本明細書においては、
（ｉ）ＰＣＲ
ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ添付を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、
ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、
１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂの増幅には配列番号１３及び１４）、
１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、
０．８μｇのＫＯＤ抗体を混合した１Ｕ　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ　Ｖ９３Ｋ変異体　（減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体）を含む
５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで単独でＤＮＡにロードできるかどうか(増幅増強活性があるかどうか)を評価することができる。単独でＤＮＡにロードできる（増幅増強活性の高い）ＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。
（１６）核酸増幅法を実行するための試薬、キット
本発明の核酸増幅法を実行するための試薬、キットは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、および、デオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含み、それ以外の構成は特に限定されない。適用する核酸増幅法も特に限定されない。
核酸増幅法としてＰＣＲを行う場合、本発明の試薬、キットとして、以下の（ａ）～（ｄ）を含む構成が例示できるが、これに限定されない。
（ａ）減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体
（ｂ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｃ）ｄＵＴＰを含むＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））および、
（ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液
前記試薬、キットは、必要に応じて、さらに、その他の試薬類、たとえばＰＣＲ増強因子、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤などを用いてもよい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
（実施例１）
ＫＯＤ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１１）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例２）
Ｐｆｕ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１２）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１および表２に示す。
［表１］
ｐＫＯＤ          配列番号１１
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ        配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ     配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｋ     配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ     配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｑ     配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ     配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｒ     配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ１１５Δ  　配列番号１１の３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ   配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ   配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ   配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ           配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換、３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ           配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ           配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ          配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ          配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｈ１４７Ｅ           配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｑ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＡＧに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＧＴに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ１１５Δ／Ｈ１４７Ｅ     配列番号１１の３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ／Ｈ１４７Ｅ  配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換、３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ  配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ  配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ  配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ  配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４３９～４４１番目のＣＡＴをＧＡＧに置換
［表２］
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｎ２１０Ｄ           配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＡＡＡに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｑ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＡＧに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＣＧＴに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ１１５Δ／Ｎ２１０Ｄ     配列番号１１の３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ／Ｎ２１０Ｄ  配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換、３４３～３４５番目のＣＣＣを欠損、６２８～６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｉ１４２Ｒ           配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ        配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ        配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ      配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４２４～４２６番目のＡＡＴをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ   配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ           配列番号１１の２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ          配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ           配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ           配列番号１１の１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ          配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ          配列番号１１の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、４２１～４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換
ｐＰｆｕ          配列番号１２
ｐＰｆｕ　Ｙ７Ａ        配列番号１２の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換
ｐＰｆｕ　Ｐ３６Ｈ     配列番号１２の１０６～１０８番目のＣＣＡをＣＡＣに置換
ｐＰｆｕ　Ｖ９３Ｒ     配列番号１２の２７７～２７９番目のＧＴＴをＣＧＴに置換
ｐＰｆｕ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ   配列番号１２の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、１０６～１０８番目のＣＣＡをＣＡＣに置換
ｐＰｆｕ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ   配列番号１２の１９～２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、２７７～２７９番目のＧＴＴをＡＡＡに置換
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例３）
実施例３－１
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
　実施例１および実施例２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。
実施例３－２
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの減少した塩基類似体検出活性の評価
ウラシルの検出活性は、前述の（１０）に記載の「塩基類似体検出活性の評価方法」に従い実施した。
　結果、サーモコッカス・コダカラエンシス（ＫＯＤ）の野生型のＤＮＡポリメラーゼでは０．５μＭのｄＵＴＰの添加で阻害がかかり、ＰＣＲ産物が確認できないところ、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒのウラシル結合ポケットへの変異体では、多少のｄＵＴＰを添加してもＰＣＲ産物の確認が出来た。またＰ３６ＫとＰ３６Ｋ／Ｙ７ＡやＰ３６ＲとＰ３６Ｒ／Ｙ７Ａなどを比較すると、単変異に比べ２重変異を入れたものの方が、高濃度のｄＵＴＰ添加に寛容で、増幅量が多い結果となった（図１、図２）。
図１は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの７種のＫＯＤ変異体の計８種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２－６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、７種の変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。中でも、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの６種については、ｄＵＴＰ終濃度０．５－２００μＭのすべての範囲で増幅産物が確認された。
図２は、まず、野生型（ＫＯＤ）、Ｎ２１０Ｄの変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ　Ｎ２１０Ｄ）およびＩ１４２Ｒの変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤ（ＫＯＤ　Ｉ１４２Ｒ）の３種を用意し、さらに、ＫＯＤおよびＫＯＤ　Ｎ２１０ＤのそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（計８種）、ＫＯＤ　Ｉ１４２ＲにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。また、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの二重変異により３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させたＫＯＤに、さらに、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えたもの（２種）を作製した。これらの計１５種を用いて、反応系に水または終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭとなるよう調製したｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。
野生型ではｄＵＴＰを添加した場合はＰＣＲ産物が確認できず（レーン２－６）、ｄＵＴＰ無添加の場合（レーン１）のみ増幅産物が確認された。これに対し、ＫＯＤにＶ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えた変異型では、終濃度０．５μＭのｄＵＴＰを添加した際にも増幅産物が確認された。特にＶ９３Ｋ、Ｖ９３ＲではｄＵＴＰの濃度を２００μＭに、Ｖ９３Ｑでは１００μＭに、それぞれ上げても増幅産物が確認された。
ＫＯＤにＶ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａのいずれかの変異を加えてｄＵＴＰ耐性を高める効果は、野生型ＫＯＤに変異を加えるよりも、３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠損（Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２ＲまたはＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）させたＫＯＤに変異を加える方が、高いことが示された。これらのことから、ウラシル結合ポケットへの変異に加え、３‘－５’エキソヌクレアーゼに欠損を与える変異を加えるとｄＵＴＰの耐性能が向上することがわかる。
その他のＫＯＤ変異体でも同様の実験を行い、表３のｄＵＴＰ耐性の欄に増幅が見られたｄＵＴＰ濃度をまとめた。０は０．５μＭのｄＵＴＰでＰＣＲができなかったことを示し、同様に０．５や５、１００は、それぞれ０．５、５、１００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られたが、それぞれ１段階高い５、１００、２００μＭのｄＵＴＰでは増幅が見られなかったことを示す。＞２００は２００μＭを添加しても増幅が見られたことを示す。
結果、Ｙ７、Ｐ３６またはＶ９３のウラシル結合ポケットへの変異はｄＵＴＰ耐性濃度を高くする傾向があり、Ｈ１４７Ｅなどの３‘－５’エキソヌクレアーゼを保持している変異体（エキソ（＋））にさらに変異を加える場合に比べ、Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２ＲまたはＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａなどの３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠質させた変異体（エキソ（－））にさらに変異を加える方が、ｄＵＴＰ耐性濃度が高くなる傾向が確認された。
［表３］
下記の各行は、左から、ウラシル結合に関するアミノ酸の改変箇所、ｄＵＴＰ耐性（１１段階評価）、ｄＵＴＰ耐性（μＭ）、４８２ｂｐ・１．３ｋｂｐ・２．８ｋｂｐおよび３．６ｋｂｐをそれぞれｄＵＴＰ存在下でＰＣＲしたときの結果を示す。記号の意味は、○は「増幅する」、△は「増幅する（バンドは薄め）」、×は「増幅しない」である。
 
エキソ領域のアミノ酸を改変していないもの
－（ＷＴ）　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ　２　０．５　×　×　×　×
Ｐ３６Ｈ　５　＞２００　○　△　△　×
Ｐ３６Ｋ　３　１００　○　△　△　△
Ｐ３６Ｒ　５　＞２００　○　△　△　△
Ｖ９３Ｑ　３　１００　○　×　×　×
Ｖ９３Ｋ　６　＞２００　○　△　△　△
Ｖ９３Ｒ　５　＞２００　○　△　△　△
Ｐ１１５Δ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ　７　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ　  ０　０　×　×　×　×
Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ　７　＞２００　○　○　○　×
Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
 
エキソ領域を改変したもの（Ｈ１４７Ｅ）
Ｙ７Ａ　２　０．５　×　×　×　×
Ｐ３６Ｈ　６　＞２００　○　△　△　×
Ｐ３６Ｋ　４　１００　○　△　△　△
Ｐ３６Ｒ　６　＞２００　○　△　△　△
Ｖ９３Ｑ　４　１００　○　×　×　×
Ｖ９３Ｋ　６　＞２００　○　△　△　△
Ｖ９３Ｒ　６　＞２００　○　△　△　△
Ｐ１１５Δ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ　８　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　○　△
Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ　０　０　×　×　×　×
Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　○　×
Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ　０　０　×　×　×　×
 
エキソ領域を改変したもの（Ｎ２１０Ｄ）
Ｙ７Ａ　２　５　×　×　×　×
Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｋ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｒ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｖ９３Ｑ　６　＞２００　○　×　×　×
Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　△　△
Ｖ９３Ｒ　８　＞２００　○　○　△　△
Ｐ１１５Δ　０　０　×　×　×　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ　０　０　×　×　×　×
 
エキソ領域を改変したもの（Ｉ１４２Ｒ）
Ｙ７Ａ　２　５　×　×　×　×
Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　△　△
Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｒ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　×
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ　８　＞２００　○　○　○　△
 
エキソ領域を改変したもの（Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）
Ｙ７Ａ　２　５　×　×　×　×
Ｖ９３Ｋ　８　＞２００　○　○　△　△
Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｈ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｐ３６Ｒ　８　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ　１０　＞２００　○　○　○　○
Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ　１０　＞２００　○　○　○　○
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方増幅量が多いといった同様の結果が得られた。
実施例３－３
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた長鎖ＤＮＡ増幅の評価
表２に記載のＫＯＤ変異体を用いて、ｄＴＴＰなしのｄＵＴＰのみの条件でも、１．３ｋＢを超える長鎖ＤＮＡが増幅するかどうか調べた。表２ではエキソ領域のアミノ酸変異と、ウラシル結合に関するアミノ酸変異の両方が示されている。エキソ領域のアミノ酸変異に関して、エキソ（＋）とあるのは野生型を含め３‘－５’エキソヌクレアーゼを保持している変異、エキソ（－）とあるのは３‘－５’エキソヌクレアーゼを欠失させた変異であることをそれぞれ示す。
ｄＵＴＰを含むＰＣＲにおいてＨｕｍａｎ　β－グロビンの１．３ｋｂｐおよび、２．８ｋｂｐ、３．６ｋｂｐの増幅を比較した。この際、各酵素は、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ変異体を用いた。
ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂｐの増幅では配列番号１３及び１４、２．８ｋｂｐの増幅では配列番号１５および１６、３．６ｋｂｐの増幅では配列番号１７および１８）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行った。
またコントロールとして、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼでの増幅も行った。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。
それぞれ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図３は、野生型（ＫＯＤ）と、Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの１０種のＫＯＤ変異体との計１１種を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ　β－グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図３において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。さらに対照として、Ｔａｑで同様の検討を行った。また、野生型ＫＯＤを用いて、通常のｄＴＴＰでＰＣＲを行った結果も合わせて示す。
図４は、まず野生型（ＫＯＤ）のエキソ領域に、Ｈ１４７Ｅ、Ｎ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａのいずれかの変異を加え、さらにそれぞれにＶ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈのいずれかの変異を加えたもの（計２４種）を作製し、これらの変異体を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭ含む反応系で長さの異なるＨｕｍａｎ　β－グロビンＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図４において、１．３ｋｂｐがレーン１、２．８ｋｂｐがレーン２、３．６ｋｂｐがレーン３である。
図３において、Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒのそれぞれの増幅量を比較した結果、Ｖ９３Ｋより、Ｐ３６位へ変異を加えた変異体（Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ）の方が、増幅量が多く、長いターゲットまで増幅できることが確認された。
次に、Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒと、それぞれにさらにＹ７Ａの変異を加えた二重変異体の増幅量を比較した結果、単変異のものよりウラシル結合ポケットへ二重変異を入れたものの方が、増幅量が多くなった。これらの変異体はＴａｑでは増幅できないような長鎖長を増幅することが可能となっていた。
一方で、上記で効果のあったＶ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｒについて組み合わせた種々の多重変異体についてさらに検討したところ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋでは相乗効果が見られたが、Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋでは増幅が認められなかった。
図３と図４において、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３ＫやＰ３６Ｈなどの変異を施したものとエキソ（－）の変異体であるＮ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異体に、Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈなどの変異を施したものを比較した結果、エキソ（－）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果となった。
さらに、図３と図４において、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３ＫやＰ３６Ｈなどの変異を施したものと、ＰＣＲ効率が向上するエキソ（＋）の変異体であるＨ１４７ＥにＶ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈなどの変異を施したものとを比較した結果、エキソ（＋）のＨ１４７Ｅ変異体の方が、増幅量が多い結果となった。
ＫＯＤ変異体の評価結果を表３にまとめた。表３において、ｄＵＴＰ耐性における１１段階評価は、０に近いほど塩基類似体検出活性が強く、１０に近いほど塩基類似体検出活性が低いことを表す。また表３中、○は十分に増幅した、△はある程度増幅した、×は増幅しないことを表している。
ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方が増幅量が多いといった同様の結果が得られた。
実施例３－４
合成速度の比較
合成速度は、前述の（８）に記載の＜ＤＮＡポリメラーゼ合成速度測定法＞に従い実施した。
図５は、野生型（ＷＴ）と、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｎ２１０Ｄの７種のＫＯＤ変異体との計８種について、Ｂｉｏｔｉｎ化Ｐ７プライマーを用いてＰＣＲ反応を３０秒、６０秒、１２０秒行い、それぞれで得られた産物を電気泳動した結果である。図５において、３０とあるのはＰＣＲ反応を３０秒行ったことを示す。６０、１２０についても同様である。図５では、増幅産物が電気泳動写真の上部で検出されるほど、長い増幅産物が取れ合成速度が速いことが示される。写真の左側には、７０００ｂｐ、３０００ｂｐの増幅産物がそれぞれの矢印のところで検出されることを示す。写真の下部に示されている数字は、その結果に基づいて計算された各ＤＮＡポリメラーゼの合成速度である。
図５において、野生型（ＷＴ）と比べて、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＰ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの変異体の方が合成速度が早い結果となった。
またエキソ領域を改変したＮ２１０Ｄ変異体は、野生型より、合成速度が速く、さらに前記Ｎ２１０Ｄ変異体に、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＰ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈなどの改変を行った変異体は、より合成速度が速くなることが確認された。
実施例３－５
ｄＵＴＰ存在下のＰＣＲにおける血液からの増幅
反応液に添加する血液量を変えて、血液耐性を評価した。比較には、１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（４８２ｂｐの増幅では配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液そのもの、および血液を水で希釈したものを用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（４８２ｂｐの増幅では１分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液そのもの、および血液を水で希釈したものを用いた。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（上記と同様）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図６は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を１０、５、２、０．２、０．０２、０．００２％になるよう反応液を調整して、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計４種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは反応液に占める血液の割合１０％の場合、以下２－６レーンは順にそれぞれ５％、２％、０．２％、０．０２％、０．００２％の場合である。
結果、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、野生型のＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰ存在下で増幅が確認されないところ、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではｄＵＴＰ存在下でもしっかりしたバンドが確認された。
ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体より合成速度の速いＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体の方が血液耐性が高く、血液１０％添加でも増幅が確認できた。
ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、血液５％添加から増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様の反応条件で、血液５％添加から増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
（実施例４）
実施例４－１
ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号２３）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例４－２
Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号２４）（ｐＰｆｕＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例４－１および実施例４－２で作製したプラスミドを表４に示す。
［表４］
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ     配列番号２３
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ           配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ  配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４２７～４２９番目のＧＡＧをＧＣＣに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ  配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４２７～４２９番目のＧＡＧをＴＴＣに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ  配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４２７～４２９番目のＧＡＧをＣＧＴに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ  配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４３９～４４１番目のＧＡＣをＧＣＣに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ          配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、２４４～２４６番目のＣＧＣをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＧをＧＣＣに置換
ｐＫＯＤ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ      配列番号２３の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、３２５～３２７番目のＡＧＧをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＧをＧＣＣに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ     配列番号２４
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ           配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ  配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４２７～４２９番目のＧＡＴをＧＣＣに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ  配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４２７～４２９番目のＧＡＴをＣＧＴに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ  配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、４３９～４４１番目のＧＡＴをＧＣＣに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ          配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、２４４～２４６番目のＡＧＡをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＴをＧＣＣに置換
ｐＰｆｕ　ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ      配列番号２４の２１７～２１９番目のＡＴＧをＣＴＧに、３２５～３２７番目のＡＧＡをＧＣＣに、４２７～４２９番目のＧＡＴをＧＣＣに置換
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例４－３
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
実施例４－１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
実施例４－４
ＰＣＲ増強因子（ＰＣＮＡ）の評価
ＰＣＮＡの効果を確認するため、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ）を用いて『増幅増強活性の測定方法』に従い、ｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、Ｈｕｍａｎ　β－グロビンの１．３ｋｂを増幅することで比較した。
図７は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの計７種である。
ＰＣＮＡの添加がない場合（レーン８）やＰＣＮＡとしてＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ変異体を用いた場合（レーン１）では、バンドがわずかに見出されたに過ぎなかったが、他のＫＯＤ　ＰＣＮＡ変異体を添加した場合は、増幅量が多くなり、より明確なバンドが確認された。
 
ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｆの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡがＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる（図７）。
またＰＣＮＡは合成速度を向上させ伸長時間を短縮する作用が以前報告されていたが、合成速度の向上は、ウラシルと結合ポケットが相互作用する時間を短くし、ウラシルの検出活性を弱める働きがあることが考えられる。
Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、他のＰｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ）の添加でしっかりとしたバンドが確認された。
実施例４－５
ＰＣＮＡ添加による合成速度の比較
ＫＯＤ　Ｖ９３Ｋ変異体に様々なＰＣＮＡ変異体を添加し、合成速度を測定した。ＫＯＤ　Ｖ９３Ｋは、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）で希釈し用いた。また、ＰＣＮＡ変異体は各反応系に２５０ｎｇ添加し、合成速度を測定した。
試薬・方法は、前述の（８）に記載の＜ＤＮＡポリメラーゼ合成速度測定法＞に従い実施した。
図８は、Ｖ９３Ｋ変異体に様々なＰＣＮＡ変異体を添加してＰＣＲ反応を３０秒、６０秒、１２０秒行い、それぞれで得られた産物を電気泳動した結果である。ＰＣＮＡ変異体としては、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｄ１４７Ａ、Ｅ１４３Ｒ、Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）を用いた。図８において、３０とあるのはＰＣＲ反応を３０秒行ったことを示す。６０、１２０についても同様である。図８では、増幅産物が電気泳動写真の上部で検出されるほど、長い増幅産物が取れ合成速度が速いことが示される。写真の左側には、７０００ｂｐ、３０００ｂｐの増幅産物がそれぞれの矢印のところで検出されることを示す。写真の下部に示されている数字は、その結果に基づいて計算された各ＤＮＡポリメラーゼの合成速度である。
結果、ＰＣＮＡを添加すると、合成速度が大幅に増加することが確認できた（図８）。これはＰＣＮＡがクランプの働きを行い、ＤＮＡとポリメラーゼをしっかり結合させたことによると考えられる。
実施例４－６
ｄＵＴＰ存在下のＰＣＲにおける血液からの増幅、ＰＣＮＡ添加の影響
血液耐性の評価にＰＣＮＡを加えて影響を確認した。比較には、１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＰＣＮＡ　Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加し、ＨＢｇの４８２ｂｐのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、各反応液にＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加した。鋳型には血液そのもの、および血液を水で希釈したものを用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液そのもの、および血液を水で希釈したものを用いた。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図９は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を１０、５、２、０．２、０．０２、０．００２％になるよう反応液を調整して、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｄ１４７Ａ）の存在下で行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計４種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは反応液に占める血液の割合１０％の場合、以下２－６レーンは順にそれぞれ５％、２％、０．２％、０．０２％、０．００２％の場合である。
結果、ＰＣＮＡはファミリーＢに属するポリメラーゼのＰＩＰモチーフとよばれる部位に結合することが知られている。ＴａｑなどのファミリーＡに属するポリメラーゼはＰＩＰモチーフを持たないため、ＰＣＮＡを添加しても影響は見られなかった（図９）。
一方、減少した塩基類似体検出活性を有するＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではＰＣＮＡを添加するとより濃い血液まで反応が起こることがわかった。
またＰＣＮＡを添加したＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、ＰＣＮＡを添加したＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの合成速度が高い順に増幅量が向上しており、やはり合成速度がｄＵＴＰ存在下でのＰＣＲでは重要と考えられる。
ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、血液１０％添加から増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
またＰＣＮＡも、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、血液１０％添加から増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様の反応条件で、血液１０％添加から増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
実施例４－７
ｄＵＴＰ存在下で体組織（爪、髪、口腔粘膜）からのＰＣＲ
爪や髪、口腔粘膜を鋳型に、ｄＵＴＰ存在下でＰＣＲができるかを検討した。爪は爪きりで切断した一片を、髪は１本を、５０ｍＭ　ＮａＯＨ１８０μｌに添加し、９５℃１０分の熱処理で破砕を行い、その後、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０μｌを加え中和した上清を鋳型として用いた。口腔粘膜は綿棒で採取した粘膜を２００μｌの水に懸濁したものを鋳型として用いた。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ（野生型）とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１９および２０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル１μｌを用いた。また、各反応液にＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には上記サンプル１μｌを用いた。また、各反応液にＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図１０は、試料として爪、髪、口腔粘液を用い、種々のＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４３Ｒ）の存在下で行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、ＫＯＤ（野生型）、ＫＯＤの変異体２種（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の計４種である。各写真の左側がｄＴＴＰを用いた場合、右側がｄＵＴＰを用いた場合である。１レーンは爪を試料とした場合、２レーンは髪、３レーンは口腔粘膜である。それそれの「＋」レーンは、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４３Ｒ）の存在下であり、「－」はＰＣＮＡなしであることを示す。
結果、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、野生型のＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰ存在下でほとんど増幅が確認されないところ、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＫやＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体ではｄＵＴＰ存在下でもしっかりしたバンドが確認された（図１０）。またＰＣＮＡを添加した反応液の方が増幅量が多い結果となった。
ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、体組織（爪、髪、口腔粘膜）からの増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。またこれらに、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ）を添加すると、上記と同様、増幅量の向上が確認できた。
実施例４－８
植物ライセートからの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で植物ライセートからの増幅を実施した。
比較には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ　１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。
鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２５および２６）、 ２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％になるように加え、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃　３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に２５０ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、 ２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％になるように加え、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。 
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図１１は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２％になるよう反応液を調製して、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種でＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。
各写真の１はＴａｑポリメラーゼの結果を、２はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、３はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を示す。
結果、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは未精製の植物ライセートからでも増幅が確認された。さらにＰＣＮＡの変異体を添加したものは、添加なしのものより増幅量が多いしっかりしたバンドが確認された。
一方、Ｔａｑポリメラーゼでは植物ライセートから直接増幅することはできなかった（図１１）。
ＫＯＤの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、植物ライセートから増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
またＰＣＮＡも、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べ増幅量の向上が確認できた。
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様の反応条件で、植物ライセートから増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
実施例４－９
糞便からの増幅
ｄＵＴＰ、糞便存在下で遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子約７００ｂｐの増幅の違いをＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲ、および融解曲線で比較した。ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。
阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２７および２８）、 ２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、１／３００００　ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、ＫＯＤ抗体と混合した０．４Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃　１０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に１００ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ－Ｔａｑ　Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×Ｔａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ別添タイプ）、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、 ２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１／３００００　ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃　１０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。
実施例４－９のＣｑ値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
表５はｄＵＴＰ、糞便存在下で行ったリアルタイムＰＣＲのＣｑ値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０のデフォルト設定）を示す。Ｎ．Ｄ．は増幅が見られず、Ｃｑ値が求められなかったことを示す。
結果、Ｔａｑポリメラーゼでは０．５％の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは２．５％の糞便を添加しても増幅が確認された。また、ＰＣＮＡありなしを比較すると、ＰＣＮＡを添加したものの方が、Ｃｑ値が小さく、優れたＰＣＲ効率を示していることがわかった。
図１２は、ｄＵＴＰ、糞便存在下でＰＣＲを用い、得られた増幅産物の融解曲線解析の結果を示す。用いたポリメラーゼはＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種である。
１はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、２はＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を、３はＴａｑポリメラーゼの結果を示す。
結果、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤではｄＵＴＰ、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、２．５％を添加しても、目的ピークを確認することができた。ＰＣＮＡを添加したものでも同様に、２．５％の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Ｔａｑポリメラーゼでは０．２５％の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された（図１２）。
ＫＯＤの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
またＰＣＮＡも、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べＰＣＲ効率の向上が確認できた。
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異体で、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
（実施例４－１０）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
図９と同様、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ＨＢｇの１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＫＯＤ変異体にはＰｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ添加したものも実施した。
ＫＯＤ変異体のＰＣＲは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３および１４）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して２％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＰｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、２ｍＭ　ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して２％になるように加えたものを用いた。
反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図１３は、２％血液を含有する反応液を調製して、ＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、およびＫＯＤ　Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＰｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、ＴａｑポリメラーゼでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の－はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、本発明のポリメラーゼを用いれば、１．３ｋｂと比較的長い増幅でも血液成分が含まれるクルードな条件から増幅できることが示された。またＰＣＮＡの変異体を添加したものは添加していないものと比べしっかりしたバンドが確認された（図１３）。
ＫＯＤの他の変異体（Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）でも同様の反応条件で、から増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
またＰＣＮＡも、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａの変異体で、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べ増幅量の向上が確認できた。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本発明によって、ＤＮＡ精製の際のロスやキャリーオーバーの危険性をなくし、さらに時間・コストを削減することができる。また、ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法によるコンタミネーションを防げるため、研究分野だけでなく、同じサンプルを何度も増幅する遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる

Claims (18)

  1. 精製工程を経ていない生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法であって、増幅に用いられる酵素がファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであり、かつデオキシウリジン（ｄＵＴＰ）を反応液中に含んでいることを特徴とする核酸増幅法。
  2. 生体試料が、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルスのいずれかである請求項１に記載の核酸増幅法。
  3. 核酸増幅に用いられる酵素が、減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１または２に記載の核酸増幅法。
  4. 核酸増幅に用いられる酵素が、３０塩基/秒以上のＤＮＡ合成速度を有する、請求項１～３のいずれかに記載の核酸増幅法。
  5. 古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体が、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかで示されるものであることを特徴とする、請求項３または４に記載の核酸増幅法。
    （ａ）配列番号１または配列番号２（Ｐｆｕの野生型配列に相当）で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７および１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列である。
    （ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列と８０％以上同一であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
    （ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列が（ａ）で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列である。
  6. 古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、３６、９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、請求項３～５のいずれかに記載の核酸増幅法。
  7. 古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈのいずれかの改変を有する、請求項３～６のいずれかに記載の核酸増幅法。
  8. 古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＰ３６Ｈのいずれかの改変を有する、請求項３～７のいずれかに記載の核酸増幅法。
  9. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがさらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、請求項１～８のいずれかに記載の核酸増幅法。
  10. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号１または配列番号２における、Ｄ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、請求項１～９のいずれかに記載の核酸増幅法。
  11. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域への改変が、配列番号１または配列番号２における、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｈ１４７Ｅ、Ｈ１４７Ｄ、Ｎ２１０ＤまたはＹ３１１Ｆのいずれかである請求項１～１０のいずれかに記載の核酸増幅法。
  12. 古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が、配列番号１または配列番号２において、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する、請求項３～１１のいずれかに記載の核酸増幅法。
    （１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
    （２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３ＫまたはＶ９３Ｒのいずれか
    （３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＲまたはＶ９３Ｑのいずれか
    （４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨまたはＶ９３Ｋのいずれか
  13. さらにＰＣＮＡを前記反応液に含む請求項１～１２のいずれかに記載の核酸増幅法。
  14. ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードする変異体である、請求項１～１３のいずれかに記載の核酸増幅法。
  15. ＰＣＮＡが、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列の（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、および（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域のうち、少なくともひとつの改変を有する変異体である、請求項１～１４のいずれかに記載の核酸増幅法。
  16. ＰＣＮＡが配列番号２１または配列番号２２における１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、または、８２番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸に改変したもの、１０９番目と１４３番目に相当するアミノ酸を共に中性アミノ酸に改変したもののいずれかの変異体である、請求項１～１５のいずれかに記載の核酸増幅法。
  17. 請求項１～１６のいずれかに記載の核酸増幅法を実行するための試薬。
  18. 請求項１～１６のいずれかに記載の核酸増幅法を実行するための試薬を含むキット。
     
     
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