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WO2015001521A1 - Méthode d'induction d'une recombinaison méiotique ciblée - Google Patents

Méthode d'induction d'une recombinaison méiotique ciblée Download PDF

Info

Publication number
WO2015001521A1
WO2015001521A1 PCT/IB2014/062856 IB2014062856W WO2015001521A1 WO 2015001521 A1 WO2015001521 A1 WO 2015001521A1 IB 2014062856 W IB2014062856 W IB 2014062856W WO 2015001521 A1 WO2015001521 A1 WO 2015001521A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
module
domain
spoll
effector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/IB2014/062856
Other languages
English (en)
Inventor
Denis Pompon
Romy HONORINE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA, Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2015001521A1 publication Critical patent/WO2015001521A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing targeted meiotic recombination, and to means for implementing this method.
  • Meiotic recombination is a DNA exchange between homologous chromosomes during meiosis; it is initiated by the formation of double-strand breaks (CDBs) in one or the other of the homologous chromatids, followed by the repair of these breaks, using as a matrix a chromatid of the homologous chromosome.
  • CDBs double-strand breaks
  • the CDBs that initiate meiotic recombination are catalyzed by the Spoll protein, which is related to the catalytic subunit (A) of a topoisomerase type II (TopoVI) present in archaebacteria (BERGERAT et al., Nature, 386, 414-7, 1997 KEENEY et al., Cell, 88, 375-84, 1997).
  • Spoll is active as a dimer consisting of 2 Spoll subunits, each of which cleaves a strand of DNA.
  • CBD formation also requires the presence of other partners ⁇ KEENEY, Genome Dyn Stab, 2, 81-123, 2008; KEENEY & NEALE, Biochem Soc Trans, 34, 523-5, 2006).
  • yeast S. cerevisiae these include proteins Ski8, Recl02, Recl04, Recl4, Mer2, Mei4, Mrell, RadSO, and Xrs2.
  • Spoll is highly conserved, and homologues of this protein have been found in all eukaryotes. Functional homologues of Spoll's partners have also been identified, both in the animal kingdom and in the plant kingdom (COLE et al., Genes Dev, 24, 1201-7, 2010).
  • the proteins Prd1, Prd2, Prd3, and Psh1 were identified as involved in the formation of CDBs (EDLINGER & SCHLOGELHOFER, J Exp Bot, 62, 1545-63, 2011).
  • Meiotic recombination causes a reassortment of paternal and maternal alleles in the genome, which helps to generate diversity genetic. It is therefore of particular interest in breeding programs and genetic engineering.
  • a major application is the generation of new varieties of microorganisms, plants and mammals, derived from natural variants and / or resulting from genetic modifications.
  • CDB sites are heterogeneously distributed on chromosomes, defining "hot” chromosome regions (hot spots) where CBDs frequently occur, and "cold” chromosomal regions, where CBDs are rare. or nonexistent.
  • hot spots hot spots
  • cold chromosomal regions where CBDs are rare. or nonexistent.
  • the determinants that determine the choice of CBD sites by Spoll and its partners are still poorly known at present.
  • Controlling the formation of CDBs can be used to modulate meiotic recombination, and thus facilitate the positional cloning of genes of interest, while limiting the mixing of genes with unknown effects on targeted properties of interest. It can also make it possible to associate or dissociate genetic traits that recombine only very little naturally.
  • the present invention proposes a new targeting system for the formation of CDBs, and therefore of meiotic recombination, making it possible to overcome the limitations of the Gal4-Spoll system known in the prior art.
  • the function of forming the CDBs and the targeting function of these breaks to one or more site (s) of the cellular DNA are provided by two distinct protein modules, respectively referred to below as the effector module. (ME) and targeting module (MC). When co-expressed in the same cell under appropriate conditions, these two modules can interact with each other to form a non-covalent complex whose effector module is capable of catalyzing the formation of CDBs near the site (s). ) recognized by the targeting module.
  • ME effector module
  • MC targeting module
  • the effector module ME is a chimeric protein comprising an effector domain (DE) capable of inducing the formation of double-strand breaks in the DNA during meiotic recombination, which is fused directly or via a peptide linker, with an interaction domain (DU) consisting of a first partner of a protein-protein selective affinity pair.
  • the targeting module MC is a chimeric protein comprising an interaction domain (DI2) constituted by the second partner of said protein-protein selective affinity pair, fused directly or via a peptide linker, with a domain of DC targeting capable of selectively binding to a target sequence present in the DNA of the host cell where the ME and MC modules are to be expressed.
  • the subject of the present invention is in particular a method for causing a targeted meiotic recombination in a eukaryotic cell, characterized in that it comprises the co-expression in said cell:
  • an effector module ME consisting of a chimeric protein comprising: i) an effector domain DE capable of inducing the formation of double-strand breaks in the DNA during meiotic recombination;
  • a targeting module MC consisting of a chimeric protein comprising:
  • said co-expression being performed under conditions allowing the formation of a non-covalent complex between the module ME and the module MC by interaction between the DU and DI2 domains.
  • the effector domain DE consists of a protein capable of inducing, directly or in combination with other proteins present in the host cell, the formation of double-strand breaks in the DNA during meiotic recombination. It is preferably a Spoll protein, and advantageously a Spoll protein originating from the same species as the host cell in which the ME and MC modules will be expressed; however, it may be a Spoll protein from another species, provided that it is capable of complementing the endogenous Spoll protein functionally. It can also be constituted by one of the proteins that participate with Spoll in the formation of CBDs. For example, in the yeast S.
  • the DE domain may consist of Spoll or, if appropriate, at least one of the Ski8, Rec102, Rec104, Rec114, Mer2, Mei4, Mrell, RadSO, and Xrs2 proteins; in A. thaliana, it may consist of Spoll-1 or Spoll-2, or if appropriate by at least one of the proteins Prd1, Prd2, Prd3, and Pshl.
  • the interaction domain DI1 of the module ME and the interaction domain DI2 of the module C together form a pair of protein-protein selective affinity. They are therefore able to bind with each other, but do not bind significantly to any endogenous component (including protein or nucleic acid) of the host cell.
  • the affinity between two binding partners is selective, if the equilibrium dissociation constant (Ka) of the complex formed between these two partners is at least 5-fold lower, preferably at least 20-fold lower, and most preferably at least 100-fold lower than the equilibrium dissociation constant of a complex possibly formed between one or other of the two partners and any endogenous component of the host cell.
  • the equilibrium dissociation constant (K d ) of the complex formed between these two partners must generally be less than 10 ⁇ l, preferably between 1 ⁇ l and In, and the equilibrium dissociation constant of a complex possibly formed between one or the other of the two partners and any endogenous component of the host cell must generally be greater than 50 ⁇ l.
  • the size of the DU and DI2 domains will be less than 20 kDa, preferably less than 10 kDa.
  • a large number of pairs of protein-protein selective affinity meeting these criteria and therefore usable in the context of the present invention for constituting the DU and DI2 domains are known per se.
  • an affinity pair consisting of the paratope of an antibody and the corresponding peptide epitope can be used; in this case, a camelide antibody, whose paratope consisting only of the three hypervariable regions of the heavy chain is of a smaller size than that of the conventional antibodies, which involves the hypervariable regions of the heavy chain and those of the light chain.
  • affinity pair constituted by a "non-immunoglobulin" protein framework containing a binding domain capable of specifically recognizing a ligand chosen a priori, and the corresponding peptide ligand.
  • affinity pairs of this type are available at this time.
  • Nonlimiting examples include: nanobodies, affibodies, maxibodies, tetranectins, iMabs, adnectins, evibodies, microbodies, anticalines, avimers, DARpins, Kunitz domains, PTZ domains, knottines, peptide aptamers, repetitive pattern proteins such as LRR proteins, associated with their respective peptide ligands, (for review see eg (HEY et al., Trends Biotechnol, 23, 514-22, 2005, GRONWALL & STAHL, J Biotechnol, 140, 254-69, 2009, BOERS A & PLUCKTHUN, Curr Opin Biotechnol, 22, 849-57, 2011.
  • a preferred affinity pair is a dockerin / bacterial cohesin couple.
  • Dockerines and cohesins are constituents of the cellulosome, which is a multienzyme complex located on the surface of certain cellulolytic bacteria.
  • the cellulosome consists of catalytic subunits anchored to a proteinaceous framework through the specific interaction between the dockerin domains, carried by these catalytic subunits, and the cohesin domains present on the protein framework (BAYER et al. , Annu Rev Microbiol, 58, 521-54, 2004).
  • the size of the cohesin and dockerin domains is generally approximately 15 kDa and 8 kDa respectively, and the affinity of the dockerine / cohesin interaction, which is dependent on calcium ions, is very high (Kd of 10 ⁇ 7 10 "9 M to the calcium ion concentration, and the origin of the areas in question).
  • Kd 10 ⁇ 7 10 "9 M to the calcium ion concentration, and the origin of the areas in question.
  • dockerine areas interact with cohesin domains from the same bacterial species, but not with those of different species.
  • the use of a dockerine / cohesin couple to form the DU and DI2 interaction domains (the DU domain can be constituted by dockerine and the DI2 domain by cohesin or vice versa), present, in addition to the advantages resulting from the high affinity and the specificity of this interaction, that of being able, if necessary, to modulate, if desired, the association between these two domains of interaction, and thus the formation of the heterodimer between the ME and MC modules, by varying the concentration of calcium ions.
  • the DC targeting domain may be any DNA binding protein domain capable of binding specifically to a target DNA sequence of the host cell. This may be, for example, the DNA binding domain of a transcription factor.
  • a DNA binding domain is generally preferred, the binding specificity of which can be predefined according to the targeted target.
  • Different types of DNA binding domains fulfilling this criterion are known per se and are currently increasingly used in genetic engineering, most often in combination with a nuclease domain (TZFIRA et al. Plant Biotechnol J, 10, 373-89, 2012, CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012, GAJ et al., Trends Biotechnol, 2013).
  • ZFIRA et al. Plant Biotechnol J, 10, 373-89, 2012, CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012, GAJ et al., Trends Biotechnol, 2013 mention may in particular be made of:
  • the DNA binding domains of the TALE effectors (for Transcription Activator-Like Effector) which consist of structural modules each recognizing a single base of the DNA, and which can be assembled to recognize specifically any sequence of DNA, according to the order of this assembly (JOUNG & SANDER, Nat Rev Mol Cell Biol, 14, 49-55, 2013; STREUBEL et al., Nat Biotechnol, 30, 593-5, 2012; ZHANG et al., Plant Physiol, 161, 20-7, 2013); of course, a person skilled in the art, wishing to target a particular region to induce an increase in the meiotic recombination frequency, can use the available knowledge relating to TALE effectors.
  • TALE effectors for Transcription Activator-Like Effector
  • zinc finger peptides consisting of a modular assembly of zinc finger motifs of known specificities (CARROLL, Genetics, 188, 773-82, 2011, ISALA, Nat Methods, 9, 32-4, 2012; MILLER et al., Nat Biotechnol, 25, 778-85, 2007 ⁇ ;
  • the DNA binding domain used instead of being associated with a nuclease domain, is associated with an interaction domain as defined above.
  • the domain DE can be positioned in N-terminal, or in C-terminal in relation to the DU domain; likewise, the DC domain can be positioned in N-terminal, or in C-terminal with respect to the domain DI2.
  • the DE domain and the DU domain of the effector module ME, as well as the DC domain and the DI2 domain of the targeting module MC, can be directly linked to each other if necessary. However, they are preferably linked via a peptide linker, in order to promote a correct folding of the chimeric protein, and / or avoiding steric hindrances and / or interdomain interactions that could interfere with the functionality of one and / or the other domain.
  • the size and the sequence of the peptide linkers used will be chosen according to the nature of the domains to be linked together.
  • the principles on which this choice can be made are known per se (see, for example, ARAI et al., Protein Eng, 14, 529-32, 2001, WALDO et al., Nat Biotechnol, 17, 691). -5, 1999).
  • polypeptides used as peptide linkers in the construction of multidomain chimeric proteins are generally mainly composed of small and uncharged amino acids (alanine, glycine, and serine). polypeptides ranges from about 5 to about 30 amino acids, most often 10 to 20 amino acids.
  • one of the DE or DU domains of the ME module, or one of the DI2 or DC domains of the MC module is itself derived from a protein containing several domains linked by peptide linkers
  • one of these linkers can be used in the construction of the module where the domain in question will be incorporated.
  • the effector module and / or the targeting module further comprise a sequence allowing the nuclear addressing of the corresponding module.
  • the effector module comprises two nuclear addressing sequences, which may be identical or different.
  • One of these nuclear addressing sequences may be that naturally present in the effector domain DE if it contains one (this is the case for example if the DE domain is a Spoll protein).
  • the nuclear addressing sequence (or at least one of the nuclear addressing sequences if the module contains 2) will be placed in close proximity to the N-terminal end of the module concerned.
  • the target sequence at which CBDs will be induced may be any DNA sequence present in the host cell. It may be an endogenous sequence of said cell, or an exogenous sequence that has been introduced therein. It can be located on the chromosomal DNA of the cell, on an extrachromosomal replicon.
  • the formation of CDBs at the target sequence occurs only if the ME module and the MC module form a complex, which presupposes: i) that the two modules are present at the same time in the cell; ii) the conditions of the intracellular medium allow interaction between the DU and DI2 domains.
  • the expression of the modules has no consequence on the endogenous mechanism of formation of existing CDBs in the host cell.
  • the host cell used is a cell in which the endogenous mechanism of CBD formation is defective because the endogenous protein homologous to that which constitutes the effector domain DE is absent or inactive
  • the expression of the ME module allows to complement the missing function, even in the absence of interaction with the MC module.
  • the complex formed can interact, via the ME module, with the endogenous proteins of the host cell involved in the formation of the CDBs, and redirect it to the site targeted by the MC module.
  • the effector domain DE is a Spoll protein
  • the effector module ME expressed in a host cell can either associate with another effector module to form a homodimer (ME / ME), or associate with an endogenous Spoll protein of the host cell to form a heterodimer (ME / Spoll). Both of these dimers possess the CDB induction functionality of the Spoll / Spoll natural homodimer.
  • a quaternary complex (MC / ME / ME / MC) comprising two targeting modules
  • a ternary complex (MC / ME / Spoll) comprising a single targeting module.
  • the level of targeting and its specificity can be adjusted by acting on the expression levels of the ME and / or MC modules and / or if appropriate on that of the endogenous Spoll protein.
  • the endogenous Spoll protein of the host cell can be inactivated; in this case, when the effector module ME is expressed, only the ME / ME homodimer (which complements the function of the endogenous Spoll / Spoll homodimer) is formed, and in the presence of the MC module only the quaternary complex MC / ME / ME / MC is formed.
  • the present invention also relates to tools for implementing a method according to one invention.
  • These tools include a combination of expression cassettes comprising:
  • an expression cassette comprising a sequence coding for an effector module ME as defined above, placed under transcriptional control of an appropriate promoter;
  • an expression cassette comprising a sequence coding for a targeting module MC as defined above, placed under transcriptional control of an appropriate promoter.
  • promoters can be used identical. Generally, however, it will be preferred to use different promoters.
  • constitutive promoters include constitutive promoters, namely promoters that are active in most tissues and cells and under most environmental conditions, as well as tissue-specific or cell-specific or growth-specific promoters, which are active only or mainly in certain tissues, certain cell types or cell states, and inducible promoters that are activated or repressed by exogenous physical or chemical stimuli.
  • constitutive promoters for plants include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, CmYLCV (Cestrum Yellow Leaf Curling Virus) promoter, Agrobacterium promoters of nopaline synthase.
  • nos octopine synthase and mannopine synthase
  • mas the promoters of opines
  • plant ubiquitin Ubi
  • Act-1 rice actin-1
  • Alcohol dehydrogenase 1 corn Adh-1
  • tissue-specific promoter is the phospho-enolpyruvate (PEP) carboxylase promoter which exclusively induces the expression of genes present in cells actively involved in photosynthesis.
  • PEP phospho-enolpyruvate
  • tissue-or cell-specific promoters in particular promoters specific for meiosis (that is to say exclusively or preferentially active in cells in meiosis) and / or promoters. inducible.
  • one of the promoters used is a meiosis specific promoter, and the other is an inducible promoter, activated or repressed by an exogenous stimulus.
  • the meiosis specific promoter will be used for the expression of the ME module and the inducible promoter for the expression of the MC module.
  • Meiosis-specific promoters that may be used in the context of the present invention are in particular the endogenous Spoll promoter (or that of one of its partners for the formation of CDBs).
  • endogenous Spoll promoter or that of one of its partners for the formation of CDBs.
  • other promoters specific to meiosis can be used; by way of non-limiting examples, mention may be made of:
  • inducible promoters that can be used in the context of the present invention are, by way of nonlimiting examples:
  • the estradiol promoter (CARLILE & AMON, Cell, 133, 280-91, 2008; SOURIRAJAN & LICHTEN, Genes Dev, 22, 2627-32, 2008; DAYANI et al., PLoS Genet, 7, el002083, 2011), or the methionine promoter (MET3) (Care et al, Molecular Microb, 34, 792-798, 1999, Mao et al, Current Microb, 45, 37-40 , 2002).
  • CARLILE & AMON Cell, 133, 280-91, 2008
  • SOURIRAJAN & LICHTEN Genes Dev, 22, 2627-32, 2008
  • DAYANI et al. PLoS Genet, 7, el002083, 2011
  • methionine promoter (MET3) (Care et al, Molecular Microb, 34, 792-798, 1999, Mao et al, Current Microb, 45, 37-40 , 2002).
  • the heat-inducible HSP18.2 promoter (TAKAHASHI & KOMEDA, Mol Gen Genet, 219, 365-72, 1989), the ethanol-inducible alcA promoter (ROSLAN et al., Plant J, 28, 225-35, 2001), the GAV system (GAL-4 / VP16-GR) - UAS, inducible by glucocorticoids (Aoyama & Chua, Plant J, 11, 605-12, 1997), the XVE system (LexA / VP1 6 / ER).
  • the expression cassettes of the invention further comprise the usual sequences in this type of construction, such as transcriptional terminators. and optionally other transcriptional regulatory elements such as amplifiers.
  • the expression cassettes according to the invention may be inserted into the chromosomal DNA of the host cell, and / or carried by one or more extra-chromosomal replicon (s).
  • the subject of the present invention is also a eukaryotic host cell, preferably a yeast cell, a unicellular microalga, a plant cell, or an animal cell, containing a combination of expression cassettes according to the invention, and a multicellular organism, in particular a plant or a non-human animal, preferably a plant, of which at least one cell contains a combination of expression cassettes according to the invention.
  • a eukaryotic host cell preferably a yeast cell, a unicellular microalga, a plant cell, or an animal cell, containing a combination of expression cassettes according to the invention, and a multicellular organism, in particular a plant or a non-human animal, preferably a plant, of which at least one cell contains a combination of expression cassettes according to the invention.
  • the present invention can be used in all applications where it is desirable to improve and control meiotic recombination, for example in the applications shown in PCT Application WO 2004016795 for the Gal4-Spoll system.
  • the present invention has the advantage of allowing access to a wider choice of recombination sites and thus of improving the targeting, of allowing better control of the level of recombination, and also of better control over time of recombination events.
  • EXAMPLE 1 CONSTRUCTION OF AN EFFECT MODULE AND A TARGETING MODULE
  • Targeting module GIBSON et al., Natethods, 6, 343-5, 2009.
  • the target sequence chosen for this module is that of the APT gene of Arabidopsis thaliana. This target sequence is located, in Arabidopsis thaliana, in an area placed in a centromeric interval, a region where naturally there is very little crossing-over.
  • TALE skeleton targeting this sequence was determined in silico using TAL Effector-Nucleotide Targeter 2.0 software (http: // boglab.pl.iastate.edu/TALENT/).
  • This backbone consists of 17 repeats of amino acid sequences comprising a polymorphism of two residues at positions 12 and 13 of each repetition, specific to the chosen target sequence.
  • GSAGSAAGSGEF flexible protein linker
  • This synthetic sequence is 5'-endowed with the C-ter end of the TALE module (ranging from +3180 to 3323bp of the TALE ATG with respect to pTAL3-TAL1) while its 3 'end is provided with a sequence homologous at the 5 'end of the Cycl terminator.
  • This plasmid contains the complete sequence coding for the targeting module, under the control of the pC 185 ptet 0ff promoter.
  • Variants of pRH042, in which a coding sequence for either a 3HA or 3FLAG tag at the 3 'end of the dockerin coding sequence were also constructed. These variants are respectively called pRH041 and pRH040.
  • the promoter sequence (-522; -1) of SPO11, as well as the SPO11 ORF provided with its terrnlnator (+1; +1597) were amplified from the genomic DNA of the SKI strain of Saccharomyces cerevisiae.
  • This synthetic fragment has the 3 'end of the SPO11 promoter (-146 to -1 relative to the SPOII ATG) followed by a nuclear localization signal (NLS sequence of SV40) and an HA tag at its end. 5 'end. While in 3 'of the cohesin, the +1 to +77 region of SPO11 is fused to the coding sequence for the peptide linker of cohesin.
  • This synthetic gene, cloned into Psil / Avall of the plasmid pUC57 then constitutes the plasmid pRH004.
  • the two amplification fragments respectively containing the SPO11 promoter sequence and its ORF flanked by its terminator, and the psil / Avall restriction fragment of pRH004, containing the sequence coding for cohesin preceded by the nuclear localization signal and the label HA, followed by its peptide linker, are assembled by the Gibson method and the resulting sequence is introduced into the vector pFL36 (ATCC 77202) previously digested with BamRI / HindIII to give the plasmid pRH021.
  • the cohesion-Spoll fusion protein could complement a homozygous deletion of the native S. cerevisiae Spoll protein, and that it is therefore functional, and on the other hand that the level of expression of the TAL-dockerin fusion protein, placed under the control of the Ptet off promoter, could be modulated by the presence or absence of doxycycline in the medium. It has also been shown that once induced vegetatively, the TAL-dockerin fusion protein continued to be present at a detectable level for several hours after induction of meiosis by changing the culture medium, thus achieving the necessary conditions to an interaction with cohesion-Spoll fusion.
  • FIG. 2 illustrates the different variants of the targeting protein TAL-Doc (TDp) constructed by the inventors.
  • the maximum size of this protein is 1217 amino acids.
  • the realized constructions are as follows: TDW: "normal" targeting module.
  • DcTDW variant with C-terminal deletion
  • DcDn variant with N & C-terminal deletions.
  • TDF, DcTDF and DcDnTDF corresponding constructs with labels. The different elements of these constructions are described below.
  • NLS2 nuclear transport sequence: MASS PKKKRKVS ⁇ SEQ ID No: 1) (in bold sequence corresponding to the sequence ncbi: BAO05316 aa 11-22)
  • Linker2 (spacer): Amino acid sequence: WKDASGSRMHA (SEQ ID No: 2, synthetic sequence)
  • Tal targeting sequence (SEQ ID No: 4, see below).
  • TalC aa: 603-756 of the TAL reference effector AvrBs3 / PthA [Xanthomonas oryzae pv. oryzae PX099A] ref
  • GSAGSAAGSGEF SEQ ID NO: 6
  • Tag2 Tag sequence (Flag tag x3):
  • the 781 aa TalM module (SEQ ID No: 4) comprises 140 aa fixed + 17 repeats (HD, HD, NG, NI, NG, NG, NN, HD, NN, NG, NG, NN, NN variants).
  • the 17 amino acid variant pairs can be changed according to the rules widely described in the literature to adapt the TALE module to recognize target DNA sequences different from those of this example.
  • FIG. 4 illustrates the different constructions carried out for the effector module: NlsCoeSpo: effector module as described in example 1 under the reference Coeh-spoll; CoeSpo: Inactive variant of the effector module.
  • Spo Spoll native protein.
  • the second part of the figure shows the mode of insertion into the genome on chromosome VIII. Note that although the Spoll protein has a nuclear targeting sequence, a second NLS1 sequence is essential for the construction according to the invention to be active.
  • NLS1 Nuclear targeting sequence derived from SV40 virus protein: aa: MPPKKKRKVAS (SEQ ID No: 9).
  • TAG1 Label HA: sequence in aa: YPYDVPDYA (SEQ ID No: 10).
  • Linker 1 synthetic spacer sequence aa: SRTS (SEQ ID No: 11).
  • thermocellum A chain cohesin pdb 10HZ1A (aa 3-162) (SEQ ID NO: 12).
  • Spac1 Sequence in aa SATATPTRPSVPTNTPTNTPANT: Fragment of cohesin (cellulosome anchoring domain cohesin C. thermocellum region WP-003519340.1 (aa-341-363); (SEQ ID NO: 13).
  • NLS-SPO S. cerevisiae Spollp protein including its own nuclear targeting sequence: spoll (aa-1-398) gb ⁇ EGA86585.1 (SEQ ID NO: 14).
  • EXAMPLE 3 CONSTRUCTION OF MODIFIED STRAINS FOR TESTING THE CONSTRUCTIONS
  • constructs described herein do not represent an indispensable element for the implementation of the invention provided that the amino acid sequence of the TALE sub-module of the targeting protein is chosen to recognize an existing or synthetic genomic target according to the rules. described in the examples that follow. This example represents a simple exemplification of the implementation of these rules.
  • Figure 5 shows the detailed structure of the test locus.
  • This engineering carried by chromosome 12, corresponds to an artificial synthetic target used for the exemplifications.
  • the indications "pos " specify the position on the yeast chromosomes.
  • the figures on the diagram of chromosome 12 indicate the size of the segments, in base pairs. Top construction: CH12_target; Bottom construction: CH12_nat_hph_gal2bst_lacz__middle.
  • each table corresponds to one of the two alleles of the diploid strains used in the examples which follow.
  • the point of integration (substitution of the endogenous sequence) in the genome (chromosome XII) of each allele is that which coincides with both ends of the sequences described. Due to the ambiguity of assigning one or sometimes two bases at the ends of the segments to one or the other of the blocks of sequences (the sequences can be similar between blocks on some bases), and without this In practice, slight differences ⁇ 3 bases) may appear between the sizes of each segment in Tables II and III and the sizes shown in Figure 5.
  • Table II Assembled DNA fragments to obtain the CH1 2_nat_hph gal2bst_lacz_middle construct.
  • Table III Assembled DNA fragments to obtain the CHl2_target construct.
  • the three constructs T1D4, T1D25 & 1 10 differ only in segment 4 of "CH12_target” as shown below.
  • the numbering above relates to the construction of the target variant T1D45.
  • T1D45 (SEQ ID No: 15): TCCTATTGCGTTGGCTATCCGAGTGGATCCAGCGAATTGGTGCCACCATAGCGGTATCGCC TAATAGCCAACGCAATAGGA.
  • FIG. 6 illustrates the complete engineering of the SKI strain (diploid).
  • EXAMPLE 4 PROCEDURE FOR EVALUATING THE RATES OF RE COMBINAI SOUND
  • FIG. 8 shows a reconstructed theoretical structure of the recombination complex according to the invention.
  • the structure of the domains Table is derived from the structures of the PDB, that of the Spollp dimer of a structural modeling calculation carried out on the basis of the known structure of topoisomerases.
  • the structure of the cohesive and dockerine domains are deduced from the PDB.
  • the freehand lines correspond to areas of unknown structures.
  • the spatial organization of the complex is consistent with all known or calculated elements. This scheme served as the basis for the determination of the optimal distance of the inverted repeats of the DNA target sequence.
  • Figures 9 and 10 illustrate a sequence that can be used to implement the invention. Indeed, most promoters, in particular those conventionally used for the expression of heterologous proteins, are extinguished during meiosis. One way to obtain the simultaneous presence of the targeting module and the effector module is therefore to accumulate the targeting module before the meiosis phase.
  • EXAMPLE 5 INFLUENCE OF THE GENE ASSAY OF SPOII AND NLS-COEH-SPOII
  • Table IV illustrates the fraction in% of viable spores for different gene assays of the native SPOll gene (wild), inactivated by disruption (deletion), replaced at the native locus and under native transcriptional promoter and terminator for the Nls-Coehsin construct.
  • SPO11 NlsCoeSpo
  • Locus 1 and 2 refer to the two genomic alleles of the diploid strain.
  • a viable spore rate between 90 and 100% is considered equivalent, some spores can be lost or damaged during the dissection micromanipulator.
  • the statistics are for 20 tetrads (80 spores) for each condition.
  • the recombination rate giving rise to a cross-over between two distant markers of 16156 bp on chromosome 12 of S. cerevisiae was measured. The percentages are for counts of 500-2000 spores each (without tetrad isolation.) For reasons of statistical accuracy, the values represent the average of the cumulative observations for the 3 variants (normal, and N- and C-terminal deletions).
  • control recombination frequencies relate to a distance between markers of 16 kbp sequence identity introducing a significant natural background noise that would be attenuated upon recombination of closer markers
  • the increase in recombination rate induced by the invention relates to a sequence identity region of 0.26 kbp to the left of the target locus and 0.45 kbp to the right of the target locus bordered by non-homologous regions of sequences. base therefore represents a factor of about 30 by classically assuming the probability of recombination proportional to the physical distance between the markers.
  • the effect on the 1D25 target is similar to Talen-induced recombination recognizing the same target.
  • Talen a protein frequently used to induce non-meiotic recombination, is used here as a reference. It recognizes little or no targets 1M10 (non-palindromic sequence) and 1D45 (too large space between palindromes).
  • the absence of cross-over induced between markers of Coh-Spoll + Tal-Doc targeting on the 1M10 target does not mean the absence of event, events of different types that can occur (see Example 6).
  • Table V recombination rate giving rise to cross-over between two distant markers of 16156 bp on modified chromosome 12 of S. cerevisiae, according to the targeted motif (1M10, 1D25, 1D45) and the effector (TD *: invention or Talen) in cells.
  • Cross-over separating two distant markers represent only one type of recombination event. Other events leading to double cross-over, conversions or other more complex events, also of interest in terms of genome engineering, are not detected by the first approach.
  • the frequency of recombination events of various kinds was deduced from the analysis of the combination of the distribution of 3 markers (Hph, Nat, Gai, one of which (Gai phenotype) is close to the target region), considering the spore set of each tetrad analyzed individually.
  • the counts are divided into three classes: no detectable event (TPS), crossover or conversion (CO-CV), complex or uninterpretable event (incomplete tetrad for example) without additional data (UR).
  • Table VI GST: non-recombinant parental types; CO-CV: recombination event compatible with cross-over or conversion; UR: Uncommon complex event of reassociation of the three markers or insufficient data to characterize the event.
  • Targeting modules E: none; TL: Talens complete nucleus with a target recognition pattern; TD: Tal-Doc module according to the invention; CTD: Tal ⁇ Doc module comprising a C-terminal truncation of the Tal domain according to the invention; NTD: Tal-Doc module comprising an M-terminal truncation of the Tal domain according to the invention.
  • 1M10, 1D25, 1D45 refer to three types of target sequence according to the invention.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé pour induire une recombinaison méiotique ciblée dans une cellule-hôte eucaryote, par co-expression dans ladite cellule d'une première protéine chimérique ME comprenant un domaine effecteur DE capable d' induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique et un domaine d'interaction DI1 constitué par le premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine- protéine, et d'une seconde protéine chimérique comprenant un domaine d' interaction DI2 constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine et un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule-hôte. L'interaction protéine-protéine entre les domaines DI1 et DI2 permet la formation d'un complexe non-covalent entre le module ME et le module MC, et l'induction de cassures double brin par le domaine effecteur DE à proximité de la séquence ciblée par le domaine de ciblage DC.

Description

MÉTHODE D ' INDUCTION D ' UNE RECOMBINAI SON MÉIOTIQUE CIBLÉE
La présente invention est relative à une méthode pour induire une recombinaison méiotique ciblée, et aux moyens de mise en œuvre de cette méthode.
La recombinaison méiotique est un échange d'ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle est initiée par la formation de cassures double-brin (CDBs) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, suivie de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.
Les CDBs qui initient la recombinaison méiotique sont catalysées par la protéine Spoll, qui est apparentée à la sous-unité catalytique (A) d'une topo-isomérase de type II (TopoVI) présente chez les archaebactéries (BERGERAT et al., Nature, 386, 414-7, 1997; KEENEY et al., Cell, 88, 375-84, 1997). Spoll est active sous forme d'un dimère formé de 2 sous-unités Spoll, dont chacune clive un brin de l'ADN.
Bien que l'activité de Spoll soit essentielle, la formation des CDBs nécessite également la présence d'autres partenaires {KEENEY, Génome Dyn Stab, 2, 81-123, 2008; KEENEY & NEALE, Biochem Soc Trans, 34, 523-5, 2006). Chez la levure S. cerevisiae, il s'agit notamment des protéines Ski8, Recl02, Recl04, Recll4, Mer2, Mei4, Mrell, RadSO, et Xrs2.
Spoll est très conservée, et des homologues de cette protéine ont été trouvés chez tous les eucaryotes. Des homologues fonctionnels des partenaires de Spoll ont également été identifiés, aussi bien dans le règne animal que dans le règne végétal {COLE et al., Gènes Dev, 24, 1201-7, 2010) . Par exemple, chez la plante modèle Arabidopsis thaliana , outre les deux paralogues de Spoll (Spoll-1 et Spoll-2, qui forment un hétérodimère Spoll-l/Spoll-2 } , les protéines Prdl, Prd2 , Prd3, et Pshl ont été identifiées comme impliquées dans la formation de CDBs (EDLINGER & SCHLOGELHOFER, J Exp Bot, 62, 1545-63, 2011).
La recombinaison méiotique provoque un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la diversité génétique. Elle présente donc un intérêt particulier dans les programmes d'amélioration et d'ingénierie génétique.
Une application majeure est la génération de nouvelles variétés de micro-organismes, plantes et mammifères, provenant de variants naturels et/ou résultant de modifications génétiques.
Cependant un obstacle majeur à l'exploitation du potentiel de la recombinaison méiotique est son caractère aléatoire et non-uniforme. Il est en effet connu que les sites des CDBs sont distribués de manière hétérogène sur les chromosomes, définissant des régions chromosomiques « chaudes » (hot spots) où se produisent fréquemment des CDBs, et des régions chromosomiques « froides », où les CDBs sont rares, voire inexistants. Les déterminants qui conditionnent le choix des sites de CDBs par Spoll et ses partenaires sont encore très mal connus à l'heure actuelle.
Le contrôle de la formation des CDBs peut permettre de moduler la recombinaison méiotique, et ainsi faciliter le clonage positionnel de gènes d'intérêt, tout en limitant le brassage des gènes ayant des effets inconnus sur les propriétés d'intérêt ciblées. Il peut permettre aussi d'associer ou de dissocier des traits génétiques ne se recombinant que très peu naturellement.
Il a été montré qu'il était possible de modifier les sites de formation de CDBs, en fusionnant Spoll avec le domaine de liaison à l'ADN de l'activateur de transcription Gal4 (Demande PCT WO 2004016795 (PECINA et al., Cell, 111, 173-84, 2002; NICOLAS, Methods Mol Biol, 557, 27-33, 2009). La protéine de fusion Gal4-Spoll introduit des cassures double-brin non seulement dans les régions de recombinaison habituelles, mais également dans des régions chromosomiques froides, à proximité des sites naturels de liaison de Gal4 à 1 " ADN .
Toutefois, bien que cette approche permette de redistribuer les sites disponibles pour l'introduction de CDBs, le nombre et l'emplacement de ceux-ci restent conditionnés par la présence de sites de liaison de Gal4. La présente invention propose un nouveau système de ciblage de la formation des CDBs, et donc de la recombinaison méiotique, permettant de s'affranchir des limitations du système Gal4-Spoll connu dans l'art antérieur.
Dans le système de la présente invention, la fonction de formation des CDBs et la fonction de ciblage de ces cassures vers un ou plusieurs site (s) de l'ADN cellulaire sont assurées par deux modules protéiques distincts, respectivement dénommés ci-après module effecteur (ME) et module de ciblage (MC) . Lorsqu'ils sont co-exprimés dans la même cellule dans des conditions appropriées, ces deux modules peuvent interagir entre eux pour former un complexe non-covalent dont le module effecteur est capable de catalyser la formation de CDBs à proximité du ou des site (s) reconnu (s) par le module de ciblage.
Plus spécifiquement, le module effecteur ME est une protéine chimérique comprenant un domaine effecteur (DE) capable d' induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique, qui est fusionné, directement ou par l'intermédiaire d'un lieur peptidique, avec un domaine d'interaction (DU) constitué par un premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine- protéine. Le module de ciblage MC est une protéine chimérique comprenant un domaine d'interaction (DI2) constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine- protéine, fusionné directement ou par l'intermédiaire d'un lieur peptidique, avec un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de la cellule-hôte où les modules ME et MC sont destinés à être exprimés.
La structure des deux modules ME et MC est schématisée sur la Figure 1.
La présente invention a notamment pour objet un procédé pour provoquer une recombinaison méiotique ciblée dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend la co-expression dans ladite cellule :
- d' un module effecteur ME constitué par une protéine chimérique comprenant : i) un domaine effecteur DE capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique ;
ii} un domaine d'interaction DU constitué par le premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine- protéine ; et
- d'un module de ciblage MC constitué par une protéine chimérique comprenant :
iii) un domaine d'interaction DI2 constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine
iv} un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule ;
ladite co-expression étant effectuée dans des conditions permettant la formation d' un complexe non covalent entre le module ME et le module MC par interaction entre les domaines DU et DI2.
Le domaine effecteur DE est constitué par une protéine capable d'induire, directement ou en combinaison avec d'autres protéines présentes dans la cellule hôte, la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique. Il s'agit de préférence d'une protéine Spoll, et avantageusement d'une protéine Spoll originaire de la même espèce que la cellule-hôte dans laquelle les modules ME et MC seront exprimés ; il peut toutefois s'agir d'une protéine Spoll provenant d'une autre espèce, à condition que celle-ci soit capable de complémenter fonctionnellement la protéine Spoll endogène. Il peut également être constitué par l'une des protéines qui participent avec Spoll à la formation des CDBs . Par exemple, chez la levure S. cerevisiae, le domaine DE peut être constitué par Spoll, ou le cas échéant par au moins l'une des protéines Ski8, Recl02, Recl04, Recll4, Mer2, Mei4, Mrell, RadSO, et Xrs2 ; chez A. thaliana, il peut être constitué par Spoll-1 ou Spoll-2, ou le cas échéant par au moins l'une des protéines Prdl, Prd2, Prd3, et Pshl . Le domaine d'interaction DIl du module ME et le domaine d' interaction DI2 du module C forment ensemble un couple d'affinité sélective protéine-protéine. Ils sont donc capables de se lier l'un avec l'autre, mais ne se lient de manière significative à aucun composant endogène (notamment protéine ou acide nucléique) de la cellule-hôte. On considérera que l'affinité entre deux partenaires de liaison est sélective, si la constante de dissociation à l'équilibre (Ka) du complexe formé entre ces deux partenaires est au moins 5 fois plus faible, de préférence au moins 20 fois plus faible, et de manière tout à fait préférée au moins 100 fois plus faible que la constante de dissociation à l'équilibre d'un complexe éventuellement formé entre l'un ou l'autre des deux partenaires et un quelconque composant endogène de la cellule-hôte. A titre indicatif, la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) du complexe formé entre ces deux partenaires doit être généralement inférieure à 10 μΜ, de préférence comprise entre 1 μΜ et In , et la constante de dissociation à l'équilibre d'un complexe éventuellement formé entre l'un ou l'autre des deux partenaires et un quelconque composant endogène de la cellule-hôte doit être généralement supérieure à 50 μΜ.
Avantageusement, pour des raisons d' encombrement stérique, la taille des domaines DU et DI2 sera inférieure à 20 kDa, de préférence inférieure à 10 kDa.
Un grand nombre de couples d'affinité sélective protéine-protéine répondant à ces critères et donc utilisables dans le cadre de la présente invention pour constituer les domaines DU et DI2 sont connus en eux-mêmes. On peut utiliser par exemple d'un couple d'affinité constitué par le paratope d'un anticorps et l'épitope peptidique correspondant ; dans ce cas on choisira de préférence un anticorps de camélidé, dont le paratope, qui n'est constitué que des trois régions hypervariables de la chaîne lourde est de taille moindre que celui des anticorps classiques, qui implique les régions hypervariables de la chaîne lourde et celles de la chaîne légère. On peut utiliser également un couple d'affinité constitué par une ossature protéique « non immunoglobuline » contenant un domaine de liaison capable de reconnaître spécifiquement un ligand choisi a priori, et le ligand peptidique correspondant. Une grande variété de couples d'affinités de ce type est disponible à l'heure actuelle.
A titre d'exemples non-limitatifs on citera notamment : les nanobodies, les affibodies, les maxibodies, les tetranectines , les iMabs, les adnectines, les evibodies, les microbodies, les anticalines, les avimères, les DARpins, les domaines Kunitz, les domaines PTZ, les knottines, les aptamères peptidiques, les protéines à motifs répétés telles que les protéines LRR, associés avec leurs ligands peptidiques respectifs, (pour revue cf. par exemple (HEY et al., Trends Biotechnol, 23, 514-22, 2005; GRONWALL & STAHL, J Biotechnol, 140, 254-69, 2009; BOERS A & PLUCKTHUN, Curr Opin Biotechnol, 22, 849-57, 2011; FORRER et al., FEBS Lett, 539, 2-6, 2003; LOFBLOM et al., FEBS Lett, 584, 2670-80, 2010; LOFBLOM et al., Curr Opin Biotechnol, 22, 843-8, 2011).
Un couple d'affinité préféré est un couple dockerine/cohésine bactériennes.
Les dockerines et les cohésines sont des constituants du cellulosome, qui est un complexe multienzymatique localisé à la surface de certaines bactéries cellulolytiques . Le cellulosome est constitué de sous-unités catalytiques ancrées à une charpente protéique par l'intermédiaire de l'interaction spécifique entre les domaines dockerine, portés par ces sous-unités catalytiques, et les domaines cohésine présents sur la charpente protéique (BAYER et al., Annu Rev Microbiol, 58, 521-54, 2004). La taille des domaines cohésine et dockérine est généralement respectivement de l'ordre de 15 kDa et 8 kDa environ, et l'affinité de l'interaction dockerine/cohésine, qui est dépendante des ions calcium, est très élevée (Kd de 10~7 à 10"9 M selon la concentration en ions calcium, et l'origine des domaines en question) . Il existe une variété de domaines dockerine et cohésine provenant de différentes espèces bactériennes. Généralement, les domaines dockerine interagissent avec les domaines cohésine provenant de la même espèce bactérienne, mais pas avec ceux d'espèces différentes. Les propriétés du couple d'affinité dockerine/cohésine ont conduit à proposer son utilisation dans diverses applications, parmi lesquelles notamment la chromatographie d'affinité ( ARPOL et al., J Mol Recognit, 22, 91-8, 2009), la création de cellulosomes artificiels (FIEROBE et al., J Biol Chem, 280, 16325-34, 2005), ou l'exposition de protéines d'intérêt à la surface de cellules de S. cerevisiae (HAN et al., Appl Environ icrobiol, 78, 3249-55, 2012).
Dans le cadre de la présente invention, l'utilisation d'un couple dockerine/cohésine pour constituer les domaines d'interaction DU et DI2 (le domaine DU pouvant être constitué par la dockerine et le domaine DI2 par la cohésine ou vice versa) , présente, outre les avantages résultant de l'affinité élevée et de la spécificité de cette interaction, celui de pouvoir le cas échéant permettre de moduler, si on le souhaite, l'association entre ces deux domaines d'interaction, et donc la formation de l' hétérodimère entre les modules ME et MC, en faisant varier la concentration en ions calcium.
Le domaine de ciblage DC peut être n'importe quel domaine protéique de liaison à l'ADN capable de se lier spécifiquement à une séquence-cible d'ADN de la cellule-hôte. Il peut s'agir par exemple du domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription.
Afin de pouvoir disposer d'un large choix de sites de formation des CDBs, on préférera généralement un domaine de liaison à l'ADN dont la spécificité de liaison peut être pré-définie en fonction de la cible visée. Différents types de domaines de liaison à l'ADN remplissant ce critère sont connus en eux-mêmes et sont à l'heure actuelle de plus en plus fréquemment utilisés en génie génétique, le plus souvent en association avec un domaine nucléase (TZFIRA et al., Plant Biotechnol J, 10, 373-89, 2012; CURTIN et al., Plant Gen., 5, 42-50, 2012; GAJ et al., Trends Biotechnol, 2013) . A titres d'exemples non limitatifs, on peut citer notamment :
- les domaines de liaison à l'ADN des effecteurs TALE (pour Transcription Activator-Like Effector) gui sont constitués de modules structuraux reconnaissant chacun une seule base de l'ADN, et pouvant être assemblés pour reconnaître spécifiquement n'importe quelle séquence d'ADN, selon l'ordre de cet assemblage {JOUNG & SANDER, Nat Rev Mol Cell Biol, 14, 49-55, 2013; STREUBEL et al., Nat Biotechnol, 30, 593-5, 2012; ZHANG et al-, Plant Physiol, 161, 20-7, 2013) ; bien entendu, l'homme du métier, souhaitant cibler une région particulière pour y induire une augmentation de la fréquence de recombinaison méiotique, peut utiliser les connaissances disponibles relatives aux effecteurs TALE.
- des peptides à doigts de zinc, constitués d'un assemblage modulaire de motifs à doigts de zinc de spécificités connues (CARROLL, Genetics, 188, 773-82, 2011; ISALA , Nat Methods, 9, 32-4, 2012; MILLER et al., Nat Biotechnol, 25, 778-85, 2007} ;
- les domaines de liaison à l'ADN de méganucléases (GRIZOT et al., Nucleic Acids Res, 38, 2006-18, 2010; HAFEZ & HAUSNER, Génome, 55, 553-69, 2012; FONFARA et al., Nucleic Acids Res, 40, 847-60, 2012).
Dans le cadre de la présente invention, le domaine de liaison à l'ADN utilisé, au lieu d'être associé à un domaine nucléase, est associé à un domaine d'interaction tel que défini ci-dessus.
L'ordre des domaines DE et DU dans le module effecteur ME, ainsi que celui des domaines DC et DI2 dans le module de ciblage MC n'est pas critique : le domaine DE peut être positionné en N-terminal, ou en C-terminal par rapport au domaine DU ; de même, le domaine DC peut être positionné en N-terminal, ou en C-terminal par rapport au domaine DI2.
Le domaine DE et le domaine DU du module effecteur ME, de même que le domaine DC et le domaine DI2 du module de ciblage MC, peuvent le cas échéant être directement liés entre eux. Toutefois, ils sont de préférence reliés par l'intermédiaire d'un lieur peptidique, afin de favoriser un repliement correct de la protéine chimérique, et /ou d'éviter des encombrements stériques et/ou des interactions interdomaines qui pourraient interférer avec la fonctionnalité de l'un et/ou de l'autre des domaines.
La taille et la séquence des lieurs peptidiques utilisés seront choisies en fonction de la nature des domaines à relier entre eux. Les principes sur la base desquels peut s'effectuer ce choix sont connus en eux-mêmes (cf. par exemple ARAI et al., Protein Eng, 14, 529-32, 2001; WALDO et al., Nat Biotechnol, 17, 691-5, 1999).
A titre indicatif, des polypeptides utilisés en tant que lieurs peptidiques dans la construction de protéines chimériques multidomaines sont en général principalement constitués d'acides aminés de petite taille et non-chargés (alanine, glycine, et sérine} . Généralement, la taille de ces polypeptides varie d'environ 5 à environ 30 acides aminés ; elle est le plus souvent de 10 à 20 acides aminés.
Le cas échéant, dans le cas où l'un des domaines DE ou DU du module ME, ou l'un des domaines DI2 ou DC du module MC est lui-même issu d'une protéine contenant plusieurs domaines reliés par des lieurs peptidiques, l'un de ces lieurs {de préférence immédiatement adjacent au domaine concerné dans la protéine d'origine) peut être utilisé dans la construction du module où sera incorporé le domaine en question.
Généralement, le module effecteur et/ou le module de ciblage comprennent en outre une séquence permettant l'adressage nucléaire du module correspondant. De manière préférentielle, le module effecteur comprend deux séquences d'adressage nucléaire, qui peuvent être identiques ou différentes. L'une de ces séquences d'adressage nucléaire peut le cas échéant être celle naturellement présente dans le domaine effecteur DE s'il en contient une (tel est le cas par exemple si le domaine DE est une protéine Spoll). Très préférentiellement , la séquence d'adressage nucléaire {ou au moins l'une des séquences d'adressage nucléaire si le module en contient 2) sera placée à proximité immédiate de l'extrémité N-terminale du module concerné. La séquence cible au niveau de laquelle seront induites les CDBs peut être n'importe quelle séquence d'ADN présente dans la cellule-hôte. Il peut s'agir d'une séquence endogène de ladite cellule, ou d'une séquence d'origine exogène qui y a été introduite. Elle peut être située sur l'ADN chromosomique de la cellule, sur un réplicon extrachromosomique .
Lors de la mise en œuvre du procédé de la présente invention, la formation de CDBs au niveau de la séquence cible n'intervient que si le module ME et le module MC forment un complexe, ce qui présuppose : i) que les deux modules soient présents en même temps dans la cellule ; ii) que les conditions du milieu intracellulaire permettent l'interaction entre les domaines DU et DI2.
Si ces conditions ne sont pas réunies, par exemple si un seul des deux modules est exprimé, ou si les deux modules sont exprimés mais les domaines DU et DI2 n' interagissent pas, l'expression des modules est sans conséquence sur le mécanisme endogène de formation des CDBs existant dans la cellule hôte. Dans le cas particulier où la cellule hôte utilisée est une cellule dans laquelle le mécanisme endogène de formation des CDBs est défectueux du fait que la protéine endogène homologue de celle qui constitue le domaine effecteur DE est absente ou inactive, l'expression du module ME permet de complémenter la fonction manquante, même en l'absence d'interaction avec le module MC.
Si les conditions de formation du complexe ME/MC sont réunies, le complexe formé peut interagir, par l'intermédiaire du module ME, avec les protéines endogènes de la cellule-hôte intervenant dans la formation des CDBs, et rediriger celle-ci vers le site ciblé par le module MC .
Ces caractéristiques permettent de réguler le ciblage des CDBs en agissant sur les niveaux d'expression des modules ME et MC, et/ou le moment de l'induction de cette expression, ce qui permet de contrôler la proportion relative des deux modules, et/ou sur les conditions d'interaction entre les domaines DU et DI2. A titre d'illustration, lorsque le domaine effecteur DE est une protéine Spoll, le module effecteur ME exprimé dans une cellule-hôte peut soit s'associer avec un autre module effecteur pour former un homodimère (ME/ME) , soit s'associer avec une protéine Spoll endogène de la cellule-hôte pour former un hétérodimère (ME/Spoll) . L'un comme l'autre de ces dimères possède la fonctionnalité d'induction des CDBs de l' homodimère naturel Spoll/Spoll. En présence du module MC, deux types de complexe peuvent être formés : un complexe quaternaire (MC/ME/ME/MC ) comprenant deux modules de ciblage, et un complexe ternaire (MC/ME/Spoll) comprenant un seul module de ciblage. Le niveau de ciblage et sa spécificité peuvent être ajustés en agissant sur les niveaux d'expression des modules ME et/ou MC et/ou le cas échéant sur celui de la protéine Spoll endogène.
Par exemple, si l'on souhaite obtenir un niveau de ciblage très élevé, on peut inactiver la protéine Spoll endogène de la cellule-hôte ; dans ce cas, lorsque le module effecteur ME est exprimé, seul l' homodimère ME/ME (qui complémente la fonction de l' homodimère endogène Spoll/Spoll) est formé, et en présence du module MC seul le complexe quaternaire MC/ME/ME/MC est formé.
La présente invention a également pour objet des outils pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à 1 ' invention .
Ces outils comprennent notamment une combinaison de cassettes d'expression comprenant :
une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module effecteur ME tel que défini ci-dessus, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et
une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module de ciblage MC tel que défini ci-dessus, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
On peut utiliser le cas échéant, pour l'expression du module ME et du module MC, des promoteurs identiques. Généralement, on préférera toutefois utiliser des promoteurs différents.
Le choix des promoteurs appropriés dépend d'une part de la cellule-hôte utilisée (ils doivent être fonctionnels dans celle-ci) et d'autre part de la manière dont on souhaite réguler l'induction de l'expression des modules ME et MC .
Une large variété de promoteurs utilisables pour l'expression de gènes d'intérêt dans des cellules ou des organismes hôtes est disponible dans l'art.
Ils incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule-spécifiques ou spécifiques à certaines étapes de croissance, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus, certains types de cellules ou certains états cellulaires, et des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes. Les promoteurs constitutifs les plus couramment utilisés pour les plantes incluent entre autres le promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) 35S, le promoteur du CmYLCV (Cestrum Yellow Leaf Curling Virus) , les promoteurs d'Agrobacterium de la nopaline synthase (nos), de l'octopine synthase et de mannopine synthase (mas), les promoteurs des opines, de l'ubiquitine végétale (Ubi) , de l'actine-1 du riz (Act-1) et de l'alcool déshydrogénase 1 du maïs (Adh-1).
Un exemple de promoteur spécifique de tissu est le promoteur phospho-énolpyruvate (PEP) carboxylase qui induit exclusivement l'expression des gènes présents dans les cellules activement impliquées dans la photosynthèse.
Dans le cadre de la présente invention, on utilisera préférentiellement des promoteurs tissu- ou cellule-spécifiques, notamment des promoteurs spécifiques de la méiose (c'est-à-dire actifs exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose) et/ou des promoteurs inductibles. De manière particulièrement préférée, l'un des promoteurs utilisés est un promoteur spécifique de la méiose, et l'autre est un promoteur inductible, activé ou réprimé par un stimulus exogène. Avantageusement, on utilisera le promoteur spécifique de la méiose pour l'expression du module ME et le promoteur inductible pour l'expression du module MC .
Des promoteurs spécifiques de la méiose utilisables dans le cadre de la présente invention sont notamment le promoteur endogène de Spoll (ou celui de l'un de ses partenaires pour la formation des CDBs) . On peut toutefois utiliser d'autres promoteurs spécifiques de la méiose ; à titre d'exemples non limitatifs on citera :
- chez la levure, le promoteur Rec8 (MURAKAMI & NICOLAS, Mol Cell Biol, 29, 3500-16, 2009), ou le promoteur Spol3 (MALKOVA et al, Genetics, 143, 741-754, 1996) ;
- chez les plantes, le promoteur DMC1 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997), ainsi que les promoteurs des gènes SOLO DANCERS et S ITCH1 (VAN EX et al., Plant Cell Rep, 28, 1509-20, 2009) .
Des promoteurs inductibles utilisables dans le cadre de la présente invention sont, à titre d'exemples non limitatifs :
- chez la levure le promoteur estradiol {CARLILE & AMON, Cell, 133, 280-91, 2008 ; SOURIRAJAN & LICHTEN, Gènes Dev, 22, 2627-32, 2008 ; DAYANI et al., PLoS Genêt, 7, el002083, 2011), ou le promoteur méthionine (MET3) (Care et al, Molecular Microb, 34, 792-798, 1999 ; Mao et al, Current Microb, 45, 37-40, 2002) .
chez les plantes, le promoteur HSP18.2 inductible par la chaleur (TAKAHASHI & KOMEDA, Mol Gen Genêt, 219, 365-72, 1989} ; le promoteur alcA inductible par l'éthanol (ROSLAN et al., Plant J, 28, 225-35, 2001) ; le système GVG (GAL-4/VP16-GR) - UAS, inductible par les glucocorticoïdes (AOYAMA & CHUA, Plant J, 11, 605-12, 1997), le système XVE (LexA/VPl 6/ER) .
Les cassettes d'expression de l'invention comprennent en outre les séquences usuelles dans ce type de construction, telles que des terminateurs transcriptionnels , et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs.
Les cassettes d'expression conformes à l'invention peuvent être insérées dans l'ADN chromosomique de la cellule-hôte, et/ou portées par un ou plusieurs réplicon(s) extra-chromosomique.
La présente invention a également pour objet une cellule-hôte eucaryote, de préférence une cellule de levure, une micro-algue unicellulaire, une cellule de plante, ou une cellule animale, contenant une combinaison de cassettes d'expression conforme à l'invention, ainsi qu'un organisme pluricellulaire, notamment une plante ou un animal non humain, de préférence une plante, dont au moins une cellule contient une combinaison de cassettes d'expression conforme à 1 ' invention .
La présente invention peut être utilisée dans toutes les applications où il est souhaitable d'améliorer et de contrôler la recombinaison méiotique, par exemple dans les applications indiquées dans la Demande PCT WO 2004016795 pour le système Gal4-Spoll.
Par rapport à ce système Gal4-Spoll la présente invention possède l'avantage de permettre l'accès à un choix plus étendu de sites de recombinaison et donc d'améliorer le ciblage, de permettre un meilleur contrôle du niveau de recombinaison, et également un meilleur contrôle dans le temps des événements de recombinaison.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant la construction de modules effecteurs et de modules de ciblage conforme à l'invention, ainsi que leur mise en œuvre.
EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION D'UN MODULE EFFECTEUR ET D'UN MODULE DE CIBLAGE
Les constructions ont été effectuées en utilisant la méthode d'assemblage de GIBSON (GIBSON et al., Nat ethods, 6, 343-5, 2009) . Module de ciblage :
La séquence cible choisie pour ce module est celle du gène APT d'Arabidopsis thaliana. Cette séquence cible est située, chez Arabidopsis thaliana , dans une zone placée dans un intervalle centromérique, région où n'interviennent naturellement que très peu de crossing-over .
Un squelette TALE ciblant cette séquence a été déterminé in silico grâce au logiciel TAL Effector-Nucleotide Targeter 2.0 (http : //boglab . pl . iastate . edu/TALENT/) .
Ce squelette est constitué de 17 répétitions de séquences d'acides aminés comportant un polymorphisme de deux résidus en position 12 et 13 de chaque répétition, spécifiques de la séquence cible choisie.
La séquence synthétique codant pour ce squelette est clonée dans le plasmide pTAL3 pour générer le plasmide PTAL3-TAL1 (CERMAK et al., Nucleic Acids Res, 39, e82, 2011).
Un gène codant pour la dockérine de type I de Clostridium thermocellum CelS, flanquée en N-terminal d'un lieur protéique flexible (GSAGSAAGSGEF) (LILLY et al., FE S Yeast Res, 9, 1236-49, 2009), et dont la séquence nucléotidique est optimisée pour l'expression chez Saccharomyces cerevisiae, a été synthétisé puis cloné dans le plasmide pUC57 (GenBank: Y14837.1) pour générer le pRH003. Cette séquence synthétique est dotée en 5' de l'extrémité C-ter du module TALE (allant de +3180 à 3323pb de l'ATG du TALE par rapport au pTAL3-TALl) tandis que son extrémité 3' est pourvue d'une séquence homologue à l'extrémité 5' du terminateur Cycl.
La séquence codant pour le module TAL complet (fragment BamHI) obtenue à partir de pTAL3~TALl , et la séquence codant pour la dockérine précédée du lieur flexible, ont été assemblées, et la séquence résultante a été introduite au site BamHI/ StuI du plasmide pCM185 (ATCC 87659), pour donner le plasmide pRH042.
Ce plasmide contient la séquence complète codant pour le module de ciblage, sous contrôle du promoteur ptet0ff de pC 185. Des variants de pRH042, dans lesquels une séquence codant soit pour une étiquette 3HA ou 3FLAG à l'extrémité 3' de la séquence codant pour la dockerine ont également été construits. Ces variants sont respectivement dénommés pRH041 et pRH040.
Module effecteur :
La séquence promotrice (-522 ; -1) de SPOll, ainsi que l'ORF SPOll pourvue de son terrnlnateur ( +1 ; +1597) ont été amplifiées à partir de l'ADN génomique de la souche SKI de Saccharomyces cerevisiae .
Une séquence codant pour la cohésine en deuxième position de la chaîne polypeptidique CIPA (pour Cellulosomal scaffoldlng Protein A) de Clostridium thermocellum CelS, flanquée en C-terminal de son lieur protéique naturel, et optimisée pour l'expression chez Saccharomyces cerevisiae, a été synthétisée. Ce fragment de synthèse possède L'extrémité 3' du promoteur SPOll (-146 à -1 par rapport à l'ATG de SPOll) suivie d'un signal de localisation nucléaire (séquence NLS de SV40) et d'une étiquette HA à son extrémité 5'. Tandis qu'en 3' de la cohésine, la région +1 à +77 de SPOll est fusionnée à la séquence codant pour le lieur peptidique de la cohésine. Ce gène synthétique, cloné en Psil/Avall du plasmide pUC57 constitue alors le plasmide pRH004.
Les deux fragments d'amplification contenant respectivement la séquence promotrice de SPOll et son ORF flanquée de son terminateur , et le fragment de restriction psil/Avall de pRH004, contenant la séquence codant pour la cohésine précédée du signal de localisation nucléaire et de l'étiquette HA, et suivie de son lieur peptidique, sont assemblés par la méthode Gibson et la séquence résultante est introduite dans le vecteur pFL36 (ATCC 77202) préalablement digéré par BamRI /Hindlll pour donner le plasmide pRH021.
Le Tableau I ci-dessous récapitule les constructions effectuées. Tableau I
Figure imgf000018_0001
essais d'expression du module effecteur
PsPoii~NLS . HA-Coh-Spoll, et du module de ciblage Ptetoff. TAL- Doc (flanqué d'une étiquette HA ou FLAG) chez S. cerevisiae ont été effectués.
Ces essais ont montré d'une part que la protéine de fusion cohésine-Spoll pouvait complémenter une délétion homozygote de la protéine Spoll native de S. cerevisiae, et qu'elle est donc fonctionnelle, et d'autre part que le niveau d'expression de la protéine de fusion TAL-dockérine, placée sous contrôle du promoteur Ptetoff, pouvait être modulé par la présence ou l'absence de doxycycline dans le milieu. Il a par ailleurs été montré qu'une fois induite en condition végétative, la protéine de fusion TAL-dockérine continuait à être présente à un niveau détectable pendant plusieurs heures après induction de la méiose par changement du milieu de culture, réalisant ainsi les conditions nécessaires à une interaction avec la fusion cohésine-Spoll.
EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DE PLUSIEURS VARIANTES DU MODULE DE CIBLAGE ET DU MODULE EFFECTEUR
Structures du module de ciblage et de ses variantes
La figure 2 illustre les différentes variantes de la protéine de ciblage TAL-Doc (TDp) construites par les inventeurs. La taille maximale de cette protéine est de 1217 acides aminés. Les constructions réalisées sont les suivantes : TDW : module de ciblage "normal". DcTDW : variante avec délétion C~terminale, DcDn : variante avec délétions N & C-terminales . TDF, DcTDF et DcDnTDF : constructions correspondantes avec étiquettes. Les différents éléments de ces constructions sont décrits ci-dessous.
NLS2 (séquence de transport nucléaire) : MASS PKKKRKVS {SEQ ID No : 1) (séquence en gras correspondant à la séquence ncbi: BAO05316 aa 11-22)
Linker2 (espaceur) : séquence en acides aminés : WKDASGSRMHA (SEQ ID No : 2, séquence synthétique)
TalN: séquence synthétique adaptatrice "WSRMHA" jointe à son C-terminal aux aa: 2-148 de la référence « TAL effector protein Tallc (AvrBs3 and PthA family of transcription activator-like effector proteins) [Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256] ref | YP_005626862.1 | » ; (SEQ ID No : 3.
Tal : séquence de ciblage (SEQ ID No : 4, voir ci-dessous ) .
TalC: aa: 603-756 de la référence TAL effector AvrBs3/PthA [Xanthomonas oryzae pv. oryzae PX099A] ref |YP_001913182.1; (SEQ ID No : 5) .
Linker 3: séquence synthétique adaptatrice
GSAGSAAGSGEF (SEQ ID No : 6) .
Doc: domaine dockérine : aa 670 à 744 (75-aa) de la référence Clostrïdium thermocellu DSM1313 ( YP_005689182 ) (SEQ ID No : 7) .
Tag2 : Séquence étiquette (Flag tag x3) :
DY DDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK (SEQ ID No : 8).
Le module TalM (SEQ ID No : 4), de 781 aa, comprend 140 aa fixes + 17 répétitions (Variantes HD, HD, NG, NI, NG, NG, NN, HD, NN, NG, NG, NN, NN, HD, NG, NI , NG} de 34 aa + 63 aa fixes:
N.b. : Les 17 paires d'acides aminés variantes peuvent être changées selon les règles largement décrites dans la littérature pour adapter le module TALE à reconnaître des séquences d'ADN cible différentes de celles de cet exemple. AAQVDLRTLG YSQQQQEKIK PKVRSTVAQH HEALVGHGFT HAHIVALSQH PAALGTVAVT
YQHIITALPE ATHEDIVGVG KQWSGARALE ALLTDAGELR GPPLQLDTGQ LVKIAKRGGV
TAMEAVHASR NALTGAPLET
LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAI SNNGGKQALETVQRLL VLCQDHG
LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHG L PDQVVAI SHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG LTPDQ VAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHG
AVSNDHLVAL ACLGGRPAMD AVKKGLPHAP ELIRRVNRRI GERTSHRVAD YAQVVRVLEF FQC
Une immuno-détection du module de ciblage a été réalisée, démontrant la formation d'une protéine unique, stable et de taille attendue incluant l'ensemble des modules fonctionnels (Figure 3) .
Structure Module effecteur (Coeh-Spoll) et ses variantes
La figure 4 illustre les différentes constructions effectuées pour le module effecteur : NlsCoeSpo : Module effecteur tel que décrit à l'exemple 1 sous la référence Coeh-spoll ; CoeSpo : Variante inactive du module effecteur. Spo : Protéine native Spoll. La seconde partie de la figure montre le mode d' insertion dans le génome sur le chromosome VIII. A noter bien que la protéine Spoll présente une séquence de ciblage nucléaire, une seconde séquence NLS1 est indispensable pour que la construction selon l'invention soit active.
Les différents éléments de ces constructions sont décrits ci-dessous.
NLS1 : séquence de ciblage nucléaire dérivée de la protéine du virus SV40: aa : MPPKKKRKVAS (SEQ ID No : 9).
TAG1 : Etiquette HA: séquence en aa : YPYDVPDYA (SEQ ID No : 10) .
Linker 1: espaceur synthétique séquence aa: SRTS (SEQ ID No : 11} .
Coeh: cohésine chaîne A de C. Thermocellum pdb 10HZ1A (aa 3-162} ; (SEQ ID No : 12) .
Spacl: Séquence en aa SATATPTRPSVPTNTPTNTPANT : Fragment de la cohésine (cellulosome anchoring domain cohesin région C. thermocellum WP-003519340.1 (aa-341-363) ; (SEQ ID No : 13) . NLS-SPO: protéine Spollp de S. cerevisiae incluant sa propre séquence de ciblage nucléaire : spoll (aa-1-398) gb~EGA86585.1 (SEQ ID No : 14). EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DE SOUCHES MODIFIÉES POUR TESTER LES CONSTRUCTIONS
N.b. : les constructions décrites ici ne représente pas un élément indispensable à la mise en œuvre de l'invention pourvu que la séquence en acide aminés du sous- module TALE de la protéine de ciblage soit choisi pour reconnaître une cible génomique existante ou synthétique selon les règles décrites dans les exemples qui suivent. Le présent exemple représente une simple exemplification de mise œuvre de ces règles.
La figure 5 présente la structure détaillée du locus testeur. Cette ingénierie, portée par le chromosome 12, correspond à une cible synthétique artificielle utilisée pour les exemplifications . Les indications « pos= » précisent la position sur les chromosomes de levure. Les chiffres sur le schéma du chromosome 12 indiquent la taille des segments, en paires de bases. Construction du haut : CH12_target ; Construction du bas : CH12_nat_hph_gal2bst_lacz__middle .
Les constructions génétiques correspondantes ont été obtenues par l'assemblage des fragments décrits dans les tableaux II et III ci-dessous. Chaque table correspond à un des deux allèles des souches diploïdes utilisées dans les exemples qui suivent. Le point d'intégration (substitution de la séquence endogène) dans le génome {chromosome XII) de chaque allèle est celui qui coïncide avec les deux extrémités des séquences décrites. Du fait de l'ambiguïté d'attribution d'une ou parfois de deux bases aux extrémités des segments à l'un ou l'autre des blocs de séquences {les séquences peuvent être semblables entre blocs sur quelques bases), et sans que cela ait la moindre importance en pratique, de très légères différences {<3 bases) peuvent apparaître entre les tailles de chaque segment dans les tableaux II et III et les tailles indiquée sur la figure 5.
Figure imgf000022_0001
Tableau II : fragments d'ADN assemblés pour obtenir la construction CHl2_nat_hph gal2bst_lacz_middle .
Figure imgf000023_0001
Tableau III : fragments d'ADN assemblés pour obtenir la construction CHl2_target. Les trois constructions T1D4, T1D25 &1 10 diffèrent uniquement par le segment 4 de "CH12_target " comme indiqué ci-dessous. La numérotation ci-dessus est relative à la construction de la variante de cible T1D45.
Segment 4 de T1D45 (SEQ ID No : 15} : TCCTATTGCGTTGGCTATCCGAGTGGATCCAGCGAATTGGTGCCACCATAGCGGTATCGCC TAATAGCCAACGCAATAGGA .
Segment 4 de T1D25 (SEQ ID No : 16) : TCCTATTGCGTTGGCTATCCGAGTGGATCCAGCGAATTGGTGCATAGCCAACGCAATAGGA
Segment 4 de 1M10 {SEQ ID No : 17) : TCCTATTGCGTTGGCTATCCGAGTGGAT .
La figure 6 illustre l'ingénierie complète de la souche SKI (diploïde) .
EXEMPLE 4 : PROCÉDURE D ' EVALUATION DES TAUX DE RE COMBINAI SON
La figure 7 présente un schéma synthétique de
1' invention .
La figure 8 montre une structure théorique reconstruite du complexe de recombinaison selon l'invention. La structure des domaines Taie est issue des structures de la PDB, celle du dimère Spollp d'un calcul de modélisation structurale effectué sur la base de la structure connue des topoisomérases . La structure des domaines cohésines et dockérines sont déduites de la PDB. Les traits à main levée correspondent à des zones de structures inconnues. L'organisation spatiale du complexe est cohérente avec l'ensemble des éléments connus ou calculés. Ce schéma a servi de base dans l'invention pour la détermination de la distance optimale des répétitions inversées de la séquence cible ADN.
Les figures 9 et 10 illustrent une séquence utilisable pour mettre en œuvre l'invention. En effet, la plupart des promoteurs, en particulier ceux utilisés classiquement pour l'expression des protéines hétérologues , sont éteints au cours de la méiose. Une façon d'obtenir la présence simultanée du module de ciblage et du module effecteur est donc d'accumuler le module de ciblage avant la phase de méiose. EXEMPLE 5 : INFLUENCE DU DOSAGE GENIQUE DE SPOll ET NLS-COEH- SPOll
Le tableau IV ci-dessous illustre la fraction en % de spores viables pour différents dosages géniques du gène SPOll natif (sauvage) , inactivé par disruption (délétion) , remplacé au locus natif et sous promoteur et terminateur transcriptionnels natifs pour la construction Nls-Coehsine- SPOll (NlsCoeSpo) décrite dans l'invention (Locusl, locus 2, NlsCoeSpo) ou le même ensemble (promoteur natif/ NlsCoeSpo /terminateur) , mais porté en élément épisomique sur un plasmide monocopie (ARS-CEN ) . Locus 1 et 2 se rapportent aux deux allèles génomiques de la souche diploïde. Un taux de spores viables compris entre 90 et 100 % est considéré comme équivalent, quelques spores pouvant être perdus ou abimés lors de la dissection au micromanipulateur. Les statistiques portent sur 20 tétrades (80 spores) pour chaque condition.
On constate que la disruption du gène SPOll (sur les deux allèles), létale à 99 %, est complémentée par une seule copie du gène sauvage ou par au moins 3 copies du gène Nls-Coeh-Spol 1 , avec un très fort effet de dosage génique : 1 copie ne complémente pas, 2 copies génomiques (3%), 1 génomique et 1 plasmidique (15%), 3 copies (69%). Le gène modifie associé à un gène sauvage (ciblage partiel) ne conduit à aucune perte de viabilité.
Ainsi, avec un niveau d'expression de l'ordre de
150% du niveau naturel (à ce niveau, la protéine est indétectable par Western blot), une complémentation à presque 70% est observée, ce qui montre que le procédé de l'invention est beaucoup plus proche du procédé naturel que les fusions GAL4-SP011 décrites dans la littérature, qui ne complémentent que sous le contrôle de promoteurs beaucoup plus forts que le promoteur natif et se révèlent donc moins efficaces. Locus 1 Locus 2 Copie % de spore génomique génomique épisorrtique viable
Sauvage Sauvage ~ 90
Deletion Sauvage -90
Deletion Deletion 1
Sauvage Coeh-Spoll 76
Deletion Coeh-Spoll 1
Coeh-Spoll Coeh-Spoll 3
Deletion Coeh-Spoll Coeh-Spoll 15
Coeh-Spoll Coeh-Spoll Coeh-Spoll 69
Tableau IV : complémentation de la disruption du gène Spoll.
EXEMPLE 5 : EFFICACITÉ DU SYSTÈME POUR LA RECOMBINAISON CIBLÉE
Le taux de recombinaison donnant lieu à un cross- over entre deux marqueurs distants de 16156 bp sur le chromosome 12 de S. cerevisiae (analyse en masse sur 3 marqueurs Hph, Nat, Gai) a été mesuré. Les pourcentages portent sur des comptages de 500-2000 spores chacun (sans isolement des tétrades} . Pour des raisons de précision statistique, les valeurs représentent la moyenne des observations cumulées pour les 3 variantes (normale, et délétions N- et C-terminales ) de structures du domaine Tal dans les modules de ciblage Tal-Doc et peuvent donc s'avérer inférieures au résultat optimal résultant d'une construction spécifique. On notera que les fréquences de recombinaison contrôle (Wt-Spoll) portent sur une distance entre marqueurs de 16 kbp d'identité de séquence introduisant un bruit de fond naturel significatif qui serait atténué lors de la recombinaison de marqueurs plus proches. L'accroissement du taux de recombinaison induit par l'invention porte sur une région d'identité de séquence de 0.26 kbp à gauche du locus cible et de 0.45 kbp à droite du locus cible bordés de zones non homologues de séquences. L'effet rapporté à la distance calculée sur cette base représente donc environ un facteur 30 en supposant classiquement la probabilité de recombinaison proportionnelle à la distance physique entre les marqueurs. L'effet sur la cible 1D25 est similaire à la recombinaison induite par une Talen reconnaissant la même cible. La Talen, protéine fréquemment utilisée pour induire des recombinaisons non méiotiques, est ici utilisée comme référence. Elle reconnaît peu ou pas les cibles 1M10 (séquence non palindromique) et 1D45 (espace trop large entre palindromes) . L'absence de cross-over induit entre marqueurs du ciblage Coh-Spoll+Tal-Doc sur la cible 1M10 ne signifie pas l'absence d'événement, des événements de types différents pouvant se produire (voir exemple 6).
Figure imgf000027_0001
Tableau V : taux de recombinaison donnant lieu à cross-over entre deux marqueurs distants de 16156 bp sur le chromosome 12 modifié de S. cerevisiae, en fonction du motif ciblé (1M10, 1D25, 1D45) et de l'effecteur (TD* : invention ou Talen) dans les cellules.
EXEMPLE 6 : ANALYSE PLUS FINE DES EVENEMENTS DE RECOMBINAISON
Les cross-over séparant deux marqueurs distants (exemple 5) ne représentent qu'un seul type d'événement de recombinaison. D'autres événements conduisant à des doubles cross-over, des conversions ou d'autres événements plus complexes, aussi d'intérêt en terme d'ingénierie des génomes, ne sont pas détectés par la première approche. La fréquence des événements de recombinaison de nature variée a été déduite de l'analyse de la combinaison de la répartition de 3 marqueurs (Hph, Nat, Gai, dont l'un (phénotype Gai) est proche de la région cible), en considérant l'ensemble des spores de chaque tétrade analysée individuellement. Les comptages sont répartis en trois classes : absence d'événement détectable (TPS), cross-over ou conversion (CO-CV) , événement complexe ou ininterprétable (tétrades incomplètes par exemple) sans donnés supplémentaires (UR) .
Le résultat des analyses figure dans le tableau VI ci-dessous.
Figure imgf000028_0001
Tableau VI : TPS : types parentaux non recombinés ; CO-CV : événement de recombinaison compatible avec une cross-over ou une conversion ; UR : événement complexe non caractérisé de réassociation des trois marqueurs ou donnés insuffisantes pour caractériser l'événement. Modules de ciblage : E : aucun ; TL : Nucléase Talens complète portant un motif de reconnaissance de la cible ; TD : module Tal-Doc selon l'invention ; CTD : module Tal~Doc comportant une troncation C-terminale du domaine Tal selon l'invention ; NTD : module Tal-Doc comportant une troncation M-terminale du domaine Tal selon l'invention. 1M10, 1D25, 1D45 réfèrent à trois types de séquence cibles selon l'invention.
§ nombre de tétrades {et non de spores) analysées concernées ; * trop peu de spores pour permettre une analyse statistique ; ** valeurs indicatives (nombreuses tétrades incomplètes ne pouvant être interprétées} .
Sur la base des résultats présentés : aucun événement classifiable de recombinaison n'est observé dans les témoins (E) . L'invention induit des événements avec une fréquence de 20 à 50% dans une majorité des configurations, souvent dépassant en efficacité le témoin de recombinaison induite par la nucléase Talen.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour provoquer une recombinaison méiotique ciblée dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend la co-expression dans ladite cellule :
a) d'un module effecteur ME constitué par une protéine chimérique comprenant :
1) un domaine effecteur DE capable d'induire la formation de cassures double-brin dans l'ADN lors de la recombinaison méiotique ;
ii) un domaine d'interaction DU constitué par le premier partenaire d'un couple d'affinité sélective protéine- protéine ; et
b) d'un module de ciblage MC constitué par une protéine chimérique comprenant :
iii) un domaine d'interaction DI2 constitué par le second partenaire dudit couple d'affinité sélective protéine-protéine ;
iv) un domaine de ciblage DC capable de se lier sélectivement à une séquence cible présente dans l'ADN de ladite cellule ;
ladite co-expression étant effectuée dans des conditions permettant la formation d'un complexe non-covalent entre le module ME et le module MC par interaction entre les domaines DU et DI2.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine effecteur DE est constitué par une protéine Spoll.
3} Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le couple d'affinité sélective protéine-protéine est un couple dockerine/cohésine bactériennes.
4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine de ciblage est un domaine de liaison à l'ADN d'un effecteur TALE. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le module ME est placé sous contrôle du promoteur du gène spoll.
6} Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le module MC est placé sous contrôle d'un promoteur inductible.
7) Combinaison de cassettes d'expression pour la mise en œuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend : une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module effecteur ME tel que défini dans lesdites revendications, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié et une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour un module de ciblage MC tel que défini dans lesdites revendications, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
8) Cellule eucaryote contenant une combinaison de cassettes d'expression selon la revendication 7.
9) Cellule eucaryote selon la revendication 8 , caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure ou de micro-algue .
10} Organisme multicellulaire contenant au moins une cellule selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les plantes et les animaux non-humains.
PCT/IB2014/062856 2013-07-05 2014-07-04 Méthode d'induction d'une recombinaison méiotique ciblée Ceased WO2015001521A1 (fr)

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