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WO2015001160A1 - Nanopartícula lipídica de polimixina - Google Patents

Nanopartícula lipídica de polimixina Download PDF

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Publication number
WO2015001160A1
WO2015001160A1 PCT/ES2014/070538 ES2014070538W WO2015001160A1 WO 2015001160 A1 WO2015001160 A1 WO 2015001160A1 ES 2014070538 W ES2014070538 W ES 2014070538W WO 2015001160 A1 WO2015001160 A1 WO 2015001160A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid
lipid nanoparticle
nanoparticles
antibiotic
approximately
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2014/070538
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eusebio Gainza Lafuente
Angel DEL POZO PEREZ
Garazi Gainza Lucea
Oihane Ibarrola Moreno
Silvia VILLULLAS RINCON
Raúl FERNANDEZ PLAGARO
Daniel BACHILLER PEREZ
José Luis Pedraz Muñoz
Amaya ESQUISABEL ALEGRIA
Marta Pastor Navarro
Ester FUSTE DOMINGUEZ
Eulalia SANS SERRAMIT JANA
Iraida GIL MARTIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOPRAXIS RESEARCH AIE
Euskal Herriko Unibertsitatea
Universitat de Barcelona UB
Praxis Pharmaceutical SA
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Original Assignee
BIOPRAXIS RESEARCH AIE
Euskal Herriko Unibertsitatea
Universitat de Barcelona UB
Praxis Pharmaceutical SA
Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOPRAXIS RESEARCH AIE, Euskal Herriko Unibertsitatea, Universitat de Barcelona UB, Praxis Pharmaceutical SA, Fundacio dInvestigacio Sanitaria de les Illes Balears IDISBA filed Critical BIOPRAXIS RESEARCH AIE
Priority to BR112015033065-7A priority Critical patent/BR112015033065B1/pt
Priority to RU2016103313A priority patent/RU2016103313A/ru
Priority to ES14744883T priority patent/ES2726849T3/es
Priority to EP14744883.1A priority patent/EP3017823B1/en
Priority to CN201480040913.4A priority patent/CN105517560A/zh
Priority to JP2016522671A priority patent/JP2016525506A/ja
Publication of WO2015001160A1 publication Critical patent/WO2015001160A1/es
Priority to US14/985,532 priority patent/US9919027B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars

Definitions

  • the present invention relates to a lipid nanoparticle comprising at least one antibiotic of the polymyxin family, a pharmaceutical composition comprising said nanoparticle and the use of the nanoparticle in the prevention and / or treatment of respiratory tree infections.
  • cystic fibrosis One of the diseases in which chronic and recurrent infections by gram-negative multi-resistant bacteria (BGN-MR) have the greatest impact, for example, by Pseudomonas aeruginosa, is cystic fibrosis.
  • BGN-MR gram-negative multi-resistant bacteria
  • the persistence of this bacterium is associated, among other causes, with its growth in a biofilm, which consists of a collective structure of bacteria that adheres to surfaces, covered by a protective layer that secrete the bacteria themselves, and that provides the capacity to resist biocides and antibiotics more effectively, withstanding significantly higher doses of antibacterial products, and causing a deterioration of lung function.
  • the direct administration of antibiotics to the lower airways through the administration of aerosols and dry powder has potential advantages such as the higher local concentration that can be achieved by deposition in the alveolar location where the infection is, and, therefore, inhaled drugs can reduce the appearance of systemic adverse effects by reducing the dose administered.
  • Polymyxins are a family of antibiotics that were marketed in the 1950s and 1960s but subsequently fell into disuse due to their adverse effects and the appearance of other antibiotics against gram-negative bacteria (Lights and shadows in the use of colistin: a lot is missing to know Infectious Diseases and Clinical Microbiology, 201 1, Volume 29, Issue 4).
  • BGN-MR bacteria due to the increase in infections caused by BGN-MR bacteria together with the absence of therapeutic alternatives, there has been a resurgence in the use of antibiotics of the polymyxin family.
  • the few clinical efficacy and safety data available make it difficult to ensure whether the dosage regimens currently used are the most appropriate.
  • the inventors have developed lipid nanoparticles that comprise at least one antibiotic from the family of polymyxins that are able to adhere to or interact with the mucous layer of the respiratory tract or the biofilm generated by the bacteria themselves, favoring that at a lower therapeutic dose of Antibiotic optimal results of minimum inhibitory concentration are obtained.
  • the nanoparticles of the invention are protected against premature degradation and also have a sustained release of the antibiotic in the alveolar and bronchial epithelium.
  • one aspect of the invention is to provide a lipid nanoparticle comprising at least one antibiotic of the polymyxin family, a lipid fraction comprising one or more lipids selected from the group consisting of monoglycerides and / or diglycerides and / or triglycerides and / or fatty acids and / or mixtures thereof.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticles defined above together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or carriers.
  • Another aspect of the invention relates to a method of preparing the lipid nanoparticles defined above comprising the following steps:
  • Another aspect of the invention relates to a method of preparing the lipid nanoparticles defined above comprising the following steps: a) Prepare a mixture of the lipids and at least one antibiotic by heating at a temperature slightly higher than the melting point of the solid lipid .
  • the lipid nanoparticles of the invention may be useful in the treatment of infections, in particular infections in the respiratory tree. Therefore, another aspect of the invention is directed to the lipid nanoparticle defined above, for use as a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the lipid nanoparticle defined above, for use in the treatment and / or prevention of infections in the respiratory tree.
  • this aspect refers to the use of the lipid nanoparticle defined above to prepare a medicament for the treatment and / or prevention of an infection, preferably in the respiratory tree, preferably caused by P. aeruginosa and / or related species and / or microorganisms sensitive to polymyxins.
  • Another aspect of the invention is directed to a method of treatment and / or prevention of an infection, preferably in the respiratory tree, preferably caused by P.
  • aeruginosa and / or related species and / or microorganisms sensitive to polymyxins which comprises administering a therapeutically effective amount of the lipid nanoparticle defined above, together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers, in a subject in need of such treatment and / or prevention, including a human.
  • Figure 1 Graphical representation of the lipid nanoparticles loaded with the antibiotic in which the lipid fraction comprises solid lipids at room temperature.
  • Figure 2. Graphical representation of the lipid nanoparticles loaded with the antibiotic in which the lipid fraction comprises a mixture of solid lipids at room temperature and liquid lipids at room temperature.
  • Figure 4. Antibiotic release curve over time of lipid nanoparticles.
  • Figure 5. Image of the pulmonary distribution of fluorescent microspheres after administration to a CD1 mouse.
  • the lipid nanoparticle that the inventors have developed comprises at least one antibiotic of the polymyxin family, a lipid fraction comprising one or more lipids selected from the group consisting of monoglycerides and / or diglycerides and / or triglycerides and / or fatty acids and / or mixtures thereof and one or more surfactants.
  • lipid nanoparticle refers to a matrix comprising a core of a lipid and / or lipophilic nature, preferably solidified lipid, which could comprise nanocompartments containing the liquid lipid, surrounded by a hydrophilic phase that encapsulates the nucleus.
  • nanoparticles comprising solid lipids at room temperature, also known as solid lipid nanoparticles and nanostructured lipids, those comprising a mixture of solid lipids and liquids at room temperature.
  • the nanoparticles of the invention are characterized by having an average size, approximately, between 10 nm and approximately 1000 nm, preferably between approximately 100 nm and approximately 500 nm.
  • average size is meant the average diameter of the population of lipid nanoparticles of the present invention.
  • the average size can be measured by standard procedures known to the person skilled in the art, and which are described, for example, in the part of the examples below.
  • the particle size is one of the factors that determines the sustained release of the antibiotic.
  • the antibiotic located on the surface of the nanoparticle is the first to be released.
  • the nanoparticles have a surface charge (measured by the Z potential), the magnitude of which can vary from approximately -30 mV to approximately -5 mV and preferably between -30 mV and -16 mV.
  • surface loading is one of the parameters that affect the stability of lipid nanoparticles. The fact that they are negatively or positively charged will favor the repulsion forces between nanoparticles avoid agglomerations presenting better dispersion properties.
  • the negative surface charge of the nanoparticles of the present invention favors the nanoparticle-bacterium junction, optimizing retention and adhesion of the nanoparticle in the place of action, favoring a sustained and therapeutic effect of the antibiotic better.
  • the nanoparticles of the invention have polydispersion index (PDI) values equal to or less than 0.5.
  • PDI polydispersion index
  • Both the average size, and the potential Z, as well as the PDI value of the nanoparticles are mainly influenced by the amount of the lipid component, by the amount of surfactants and by the parameters of the preparation procedure, such as the power and type of agitation , the temperature of both phases or the duration of the mixing phase.
  • the lipid nanoparticle of the present invention comprises as a lipid fraction at least one solid lipid at room temperature that is part of the nanoparticle core.
  • the ambient temperature is 20-25 ° C.
  • solid lipid at room temperature means that lipid that is solidly maintained below 45 ° C, which can be saturated or unsaturated.
  • Said definition may include, without limitation, triglycerides (for example, trytearin), and / or mono or diglycerides (for example derivatives and mixtures of mono and diglycerides) and / or fatty acids (for example stearic acid) or their derivatives and / or their mixtures, spheroids (for example cholesterol) and waxes (for example cetyl palmitate).
  • Each fatty acid of these glycerides, as well as the separate fatty acids are usually characterized by having chains of between 10 and 28 carbon atoms.
  • the definition of fatty acid derivatives includes those fatty acids, their esters or their amides that have hydroxyl groups as substituents of the hydrocarbon chain.
  • the lipid fraction comprises a mixture of monoglycerides, diglycerides and / or triglycerides. In a preferred embodiment, the lipid fraction comprises a mixture of monoglycerides, diglycerides and triglycerides of glyceryl palmostearate (for example, Precirol ® ATO 5).
  • glyceryl palmostearate for example, Precirol ® ATO 5
  • the lipid fraction of the nanoparticle comprises a mixture of one or more solid lipids at room temperature and one or more liquid lipids at room temperature.
  • liquid lipid at room temperature means that lipid that is kept in liquid form below 45 ° C, which can be saturated or unsaturated.
  • Said definition may include, without limitation, oils, and / or triglycerides, and / or monoglycerides and / or diglycerics and / or fatty acids and / or esters of fatty acids and / or mixtures thereof.
  • Each fatty acid of these glycerides, as well as the separate fatty acids are usually characterized by having chains of less than 10 carbon atoms.
  • the liquid lipid fraction comprises triglycerides.
  • a triglyceride of caprylic acid and of capric acid (for example Mygliol 812) is used as a liquid lipid.
  • the liquid lipid provides a less orderly structure increasing the carrying capacity of the antibiotic in the nucleus of the nanoparticle.
  • Figures 1 and 2 provide a graphic representation of particular examples of lipid nanoparticles where the first figure comprises solid lipids 1 together with antibiotic 2, and the second comprises a mixture 3 of solid and liquid lipids together with antibiotic 2.
  • the weight (weight / weight) ratio of liquid lipid to solid lipid is between approximately 0.5: 10 and approximately 5: 10.
  • the weight (weight / weight) ratio of liquid lipid to solid lipid is approximately 1: 10.
  • the nanoparticles with an antibiotic-rich shell have an important initial release while the nanoparticles with a drug-rich nucleus allow a sustained release thereof.
  • the nanoparticles of the invention comprise one or more surfactants.
  • the hydrophilic phase of the nanoparticles surrounding the lipophilic core comprises a surfactant.
  • a surfactant is an emulsifier or emulsifier that reduces the surface tension of the different phases that are required for the manufacture of the nanoparticles, achieving a better interposition of them and thus, the formation of the nanoparticles.
  • the surfactants can be cationic, ionic or non-ionic and their classification will depend on the charge of the surface part.
  • cationic surfactants include, without limitation, cetrimide and / or cetylpyridinium chloride;
  • anionic surfactants include, without limitation, sodium docusate, phospholipids and / or sodium lauryl sulfate.
  • non-ionic surfactant means a compound without any net charge, which has a hydrophobic part and a hydrophilic part.
  • the nanoparticle comprises at least one non-ionic surfactant whose main functions are to control the particle size and confer stability avoiding the formation of aggregates.
  • nonionic surfactants include, without limitation, polysorbates, polyethylene glycol copolymers and / or polypropylene glycol copolymers.
  • the nonionic surfactants are polysorbate 80 and / or poloxamer.
  • the proportion of non-ionic surfactant is between 0.5% and 2% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle, preferably 1%.
  • Antibiotic An antibiotic or antimicrobial is an agent that acts against bacterial infections either by inhibiting the growth of the bacteria or giving rise to a chain of biochemical events that will lead to the lysis of the bacteria.
  • the lipid nanoparticle comprises at least one antibiotic of the polymyxin family such as polymyxin A, polymyxin B, polymyxin C, polymyxin D and polymyxin E.
  • the lipid nanoparticle comprises at least one antibiotic of the colistin or sodium colistimethate type.
  • Antibiotic release as well as antibacterial action can be regulated by the weight ratio of the antibiotic to the lipid fraction.
  • the weight ratio of the antibiotic to the lipid fraction is from about 0.25: 10 to about 4: 10, preferably about 1: 10.
  • the antibacterial action of an antibiotic can be measured by the minimum inhibitory concentration, which consists in the concentration of the antibiotic required to prevent bacterial growth from the incubation of 10 4-5 bacteria in rapid growth phase, in a free medium of proteins with pH 7.2, aerobic, during an overnight incubation period. This term is used to determine bacterial sensitivity to a specific antibiotic agent.
  • the term sensitive in the context of infection means an inhibition of the growth of the microorganism and / or death of the microorganism, in the case of a therapeutic dose treatment.
  • the weight ratios of antibiotic-lipid fraction of the different embodiments of the present invention have demonstrated a minimum inhibitory concentration lower than the free antibiotic. This fact, in addition to being a cost advantage since a smaller amount of antibiotic is required for the same therapeutic effect, favors a lower probability of acquired bacterial resistance.
  • bacterial resistance acquired in the context of the invention is understood that resistance acquired by the bacterium through the acquisition of resistance genes from other bacteria and / or by mutation processes. Bacterial resistance is directly related, among other causes, to the use of inadequate dose or duration of antibacterial therapy.
  • the lipid nanoparticles of the present invention can be prepared by the solvent emulsification / evaporation technique or by heat fusion homogenization technique.
  • the first technique comprises the following stages:
  • the lipid fraction is dissolved in an organic solution between 1 and 10% (weight / volume), preferably between 3 and 7% and most preferably 5% together with at least one antibiotic.
  • an aqueous solution of at least one surfactant is prepared.
  • the aqueous phase is added on the oil and the mixture is emulsified by sonication for a certain time.
  • the size, polydispersion rate and encapsulation efficiency of the nanoparticles will depend on the sonication power and the sonication time.
  • it is sonic between 10W and 30W and most preferably between 15W and 25W for between 15 seconds and 40 seconds, preferably between 25 seconds and 35 seconds and most preferably between 29 seconds and 31 seconds.
  • the solvent is allowed to evaporate under magnetic stirring for two hours at room temperature. After evaporation, the nanoparticles obtained are washed by centrifuging and filtering between 1 and 10 times, preferably between 2 and 5 times and most preferably 3 times.
  • the second technique comprises the following stages:
  • a) Prepare a mixture of lipids and at least one antibiotic by heating at a temperature slightly higher than the melting point of the solid lipid. b) Prepare an aqueous solution with one or more surfactants.
  • solid and / or liquid lipids and antibiotics are mixed on the one hand and heated at a temperature slightly higher than the melting point of the solid lipid.
  • an aqueous solution of at least one surfactant is prepared. The oily solution and the aqueous solution are heated to the same temperature, and once both phases reach the same temperature the aqueous solution is added over the oily one.
  • the mixture is emulsified by sonication
  • the size, polydispersion index and encapsulation efficiency of the nanoparticles depend on the sonication power and the sonication time.
  • it is sonic between 10W and 30W and most preferably between 15W and 25W for between 10 seconds and 30 seconds, preferably between 12 seconds and 16 seconds and most preferably between 14 seconds and 15 seconds.
  • the emulsion obtained is stored at least between 5 hours and 30 hours, preferably between 10 hours and 20 hours and most preferably between 11 hours and 13 hours, most preferably 12 hours between 1 ° C and 10 ° C, preferably between 2 ° C and 6 ° C and most preferably between 3 ° C and 5 ° C.
  • lipids are recrystallized forming the nanoparticles.
  • they are washed by centrifuging and filtering between 1 and 10 times, preferably between 2 and 5 times and most preferably 3 times, between 1000 rpm and 3500 rpm, preferably at 2000 rpm and 3000 rpm and most preferably above 2500 rpm for between 10 minutes and 30 minutes, preferably between 12 minutes and 16 minutes and most preferably between 14 minutes and 15 minutes.
  • One of the advantages of this method is that organic solvents are not used, thus avoiding the need to carry out trace tests for organic solvents prior to the commercialization of nanoparticles for human consumption.
  • One aspect of this invention is directed to the product obtainable by the techniques described above.
  • the lipid nanoparticle is a lyophilized nanoparticle. Lyophilization allows a dry powder to be obtained from the lipid nanoparticles, which gives it greater stability than the lipid nanoparticles in suspension, since it prevents the degradation of the nanoparticle and the early release of the antibiotic to the solution in which the nanoparticles are suspended .
  • the lipid nanoparticle of the present invention comprises a cryoprotectant.
  • the cryoprotectant favors the stabilization of the nanoparticles during the freeze-drying process.
  • This cryoprotectant may be selected without limitation among colloidal Si0 2, glycine, lactose, mannitol, trehalose, raffinose, sodium bicarbonate and sodium borate.
  • the nanoparticle comprises trehalose as a cryoprotectant.
  • the lipid nanoparticle comprises between about 5% and about 20% of cryoprotectant by weight relative to the weight of the lipid nanoparticle, preferably between 5% and 15%.
  • One aspect of the invention is directed to the lipid nanoparticle of the invention, for use in the treatment and / or prevention of infection, preferably of an infection in the respiratory tree.
  • Another aspect of the invention is directed to the use of the lipid nanoparticle of the invention, to prepare a medicament for the treatment and / or prevention of infection, preferably of an infection in the respiratory tree.
  • Another aspect of the invention is directed to a method of treatment or prevention of an infection, preferably of an infection in the respiratory tree, which comprises administering a therapeutically effective amount of the lipid nanoparticle defined above, together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers, in a subject in need of such treatment and / or prevention, including a human.
  • infection includes any infection by gram-negative bacteria and / or bacteria or microorganisms sensitive to antibiotics of the polymyxin family.
  • respiratory tree includes the nasal cavity, pharynx, larynx, trachea, primary bronchus and lungs.
  • prevention or treatment in the context of the specification means the administration of the nanoparticles according to the invention to preserve health in a patient who suffers or is at risk of suffering a bacterial infection described above. Such terms also include the administration of the nanoparticles according to the invention to prevent, improve, alleviate or eliminate one or more symptoms associated with the bacterial infection.
  • improved in the context of this invention is understood to mean any improvement in the situation of the treated patient, either subjective (sensation of or in the patient) or objectively (measured parameters).
  • the infection in the respiratory tree is due to Pseudomonas aeruginosa.
  • the nanoparticle of the invention has demonstrated its ability to adhere to the biofilm generated by the bacteria or the mucus of the respiratory tree tissue itself.
  • the invention is directed to the use of the lipid nanoparticle of the invention to lung infection associated with cystic fibrosis and / or bronchiectasis.
  • the lipid nanoparticles of the present invention may be part of a pharmaceutical composition.
  • Such pharmaceutical compositions include any solid, semi-solid or liquid composition for application via digestive (enteral, sublingual or rectal), topically (transdermal or ophthalmic), parenteral (intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal) or direct administration in the respiratory tree.
  • the pharmaceutical composition comprises the lipid nanoparticle together with pharmaceutically acceptable excipients or carriers, in a subject in need of such treatment and / or prevention, including a human.
  • pharmaceutically acceptable excipients or carriers in a subject in need of such treatment and / or prevention, including a human.
  • the person skilled in the art can determine which additional components can be used and if necessary, many of them being commonly used in pharmaceutical compositions.
  • the term "therapeutically effective amount" in the context of this invention refers to the amount of composition that once administered is sufficient to prevent or treat one or more symptoms derived from bacterial infection.
  • the particular dose administered according to the present invention will be determined according to the particular circumstances surrounding the case, including the compound administered, the route of administration, the particular condition being treated and similar considerations.
  • pharmaceutically acceptable excipients or carriers refers to pharmaceutically acceptable materials, composition or vehicles. Each component must be pharmaceutically acceptable in the sense of being compatible with the other ingredients of the pharmaceutical composition. It must also be suitable for use in contact with human and animal tissues or organs without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity or other problems or complications consistent with a reasonable benefit / risk ratio.
  • the pharmaceutical composition may comprise other ingredients such as viscosity modulators, preservatives, solubilizers, which include, without limitation, cyclodextrins, lecithins and / or glycerol monostearate, antifloculants, which includes, without limitation, leucine, and / or stabilizers, which include, without limitation, alginates, alginic acid and / or trehalose. These components will be added to the lipophilic or hydrophilic phase depending on their nature.
  • the pharmaceutical composition comprises the polymyxin lipid nanoparticles, a cryoprotectant, an anti-caking agent and other excipients.
  • the pharmaceutical presentation can be a powder to be nebulized in solution or in dry powder for direct administration. In a preferred embodiment, it is administered in the respiratory tract, by inhalation.
  • These administrations by inhalation are liquid or solid preparations containing the nanoparticle and / or pharmaceutical composition and / or medicament of the invention alone or together with more drugs.
  • the size of the particles intended for To be inhaled should be adjusted to locate its distribution in the lower part of the respiratory tree and controlled by appropriate methods for the determination of particle size.
  • the person skilled in the art can determine which processes and / or devices can be applied for optimal administration by vapors or aerosols or powders.
  • the inhaled particle size is between 1 ⁇ and 10 ⁇ , preferably between 2 ⁇ and 8 ⁇ and more preferably between 3 ⁇ and 5 ⁇ .
  • These sizes allow perfect alveolar deposition and pulmonary retention of the therapeutically effective amount.
  • these sizes are achieved by adding the nanoparticles, in the case of their application as dry powder, or by generating an aerosol with the appropriate carrier in the case of being administered by nebulization.
  • Example 1 Preparation of lipid nanoparticles with antibiotic by solvent emulsification / evaporation technique
  • Example 1a Preparation of lipid nanoparticles with antibiotic by solvent emulsification / evaporation technique
  • an aqueous solution of the surfactants was prepared (Poloxamer 188 and 1% Polysorbate 80 each).
  • the aqueous phase was added over the oil phase, and the mixture was emulsified by sonication at 20 W for 30 seconds. Subsequently, it was left under magnetic stirring for two hours to evaporate the solvent.
  • Example 1b After evaporation the obtained nanoparticles were washed by centrifuging 3 times at 2500 rpm for 15 minutes using Amicon ® Ultra filters (Millipore).
  • Example 1b
  • nanoparticles were lyophilized by subjecting them to the following stages: a) Addition of 15% trehalose with respect to the total weight of the lipid fraction. b) Freezing at -20 ° C and then at -80 ° C.
  • Example 2 Preparation of lipid nanoparticles with antibiotic by heat fusion homogenization technique.
  • a mixture of 1000 mg of Precirol ® ATO 5 and Miglyol ® 812 was prepared in a 10: 1 ratio together with 100 mg of sodium colistimethate, at a temperature slightly higher than the solid lipid melting point.
  • an aqueous surfactant solution was prepared (0.6% Poloxamer 188 and 1.3% Polysorbate 80).
  • the lipid and aqueous solution were heated at the same temperature (approximately, at a temperature between 5 ° C and 10 ° C higher than the lipid melting temperature).
  • the aqueous phase was added over the oil phase, and the mixture was emulsified by sonication at 20W for 15 seconds.
  • the emulsion obtained was stored for 12 hours at 4 ° C so that the lipids could recrystallize and form the nanoparticles.
  • Example 2b The nanoparticles obtained were washed by centrifuging 3 times at 2500 rpm for 15 minutes using Amicon ® Ultra filters (Millipore).
  • Example 2b The nanoparticles obtained were washed by centrifuging 3 times at 2500 rpm for 15 minutes using Amicon ® Ultra filters (Millipore).
  • Example 2b The nanoparticles obtained were washed by centrifuging 3 times at 2500 rpm for 15 minutes using Amicon ® Ultra filters (Millipore).
  • nanoparticles were lyophilized by subjecting them to the steps mentioned in example 1b.
  • Example 3 (reference example): Preparation of lipid nanoparticles without antibiotic
  • lipid nanoparticles were prepared without antibiotics, with different weight ratios of liquid lipid versus solid lipid according to the method described in example 2. The ratios were as follows: 0.5: 10; 1: 10; 2,5: 10 and 5: 10.
  • Example 5 Efficiency of encapsulation.
  • the antibiotic encapsulation efficacy was determined by determining the amount of antibiotic present in the supernatant after the washing process described in Example 1 and 2.
  • the antibiotic present in the supernatant was analyzed by HPLC using a Waters 1525 HPLC Binary Pump (Waters Corp ., Milford, USA), a Waters 2487 ultraviolet detector and a Waters 717 plus automatic injector.
  • the system was controlled by the Empower software.
  • the selected column was Novapak C 18 x 150 mm with a pore size of 4 ⁇ .
  • the mobile phase consisted of a 77% aqueous solution and 23% acetonitrile.
  • the aqueous phase was prepared by dissolving (7.1 g) sodium sulfate, (0.6 g) acetic acid and (2.2 g) phosphoric acid and adjusted to pH 2.5 with triethylamine for 1 liter of aqueous solution.
  • Sodium colistimethate was detected at a wavelength of 206 nm.
  • the flow rate was 1.5 ml / min for a Socratic elution. 50 ⁇ of sample dissolved in water was injected. The test was found to be linear at 100-800 ⁇ g / ml with no interference detected.
  • the encapsulation efficiency was determined by the following formula:
  • EE (%) 100 * (initial amount of antibiotic - amount of non-encapsulated antibiotic) / initial amount of antibiotic).
  • the lots manufactured according to the manufacturing method described in example 1 gave average values of 80 ⁇ 7%, and the lots manufactured according to the method described in example 2 of 95 ⁇ 4%. These values are indicative that the effectiveness of the preparation procedure is around 100%, ensuring maximum use of the antibiotic added to the manufacturing process.
  • Example 6 In vitro assays for the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC). 100 ⁇ of a concentration of 10 4 Colony forming units (CFU) / ml of 31 strains of P. aeruginosa obtained from 31 patients with cystic fibrosis, of which 13 strains were mucosal producers, were incubated for 24 hours at 37 ° C in a medium Mueller Hinton Broth with adjusted concentration of cations (MHBCA), corresponding between 20 mg and 25 mg per liter of Calcium and between 10 mg and 12.5 mg per liter of magnesium, which ensured the reproducibility of results for P.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • aeruginosa in the presence of sodium colistimethate, and nanoparticles obtained according to example 1 b and 2b, in different concentrations (less than 0.25, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 and 32 vg / m ⁇ ).
  • a MIC of 2 ⁇ g / ml was obtained, for 25% a MIC of 1 ⁇ g / ml and for 16% a MIC of 0.5 ⁇ g / ml.
  • the rest obtained a MIC of 4 ⁇ g / ml.
  • a MIC of 1 ⁇ g / ml was obtained, for 23% a MIC of 0.5 ⁇ g / ml was obtained, for 10% obtained a MIC of 0.25 ⁇ g / ml, for 3% a MIC less than 0.25 ⁇ g / ml, for a 16% MIC of 2 ⁇ g / ml and for the remainder, a MIC greater than 4 ⁇ g / ml.
  • Example 8 In vivo toxicity and distribution assays in CD1 mice of nanoparticles manufactured according to example 1b and 2b
  • 1.2 mg of nanoparticles in 50 microliters of PBS (optimal amount to avoid excessive density of the mixture) were administered to a group of 16 CD1 mice, in addition to establishing the corresponding control groups (5 mice) to which no He administered any product.
  • All mice exhibited standard behavior, responding to stimuli and moving normally.
  • the mice were sacrificed and a bronchoalveolar lavage was performed as well as the collection and preparation of lung samples for analysis for anatomopathological study.
  • He Study of the samples revealed no inflammation or damage to the tissues studied that may have been caused by the nanoparticles of the present invention.
  • microspheres were administered at 50 ⁇ (equivalent to those used to induce infection) loaded with a fluorescent reagent or fluorophore (excitation wave: 630-660 nm and emission wave 670-720 nm, face to be able to ensure that the administration technique was effective and that they are actually deposited mostly in the lung.
  • a fluorescent reagent or fluorophore excitation wave: 630-660 nm and emission wave 670-720 nm
  • microspheres (AlignFlow TM polystyrene microspheres 6.0 ⁇ in diameter, Aex: 630-660 nm, Aem: 670-720 nm, Invitrogen) were resuspended in 50 ⁇ _ of PBS. It was carried out with a Pearl-lmpulse recording system (LI-COR Biosciences, USA) The image shows the homogeneous distribution of fluorescent reagent 2 in all from lung 1 of the rodent.
  • Example 9 In vivo tests of efficacy in CD1 mice of nanoparticles manufactured according to example 1b and 2b Five mice were used as control group and 64 mice infected with the inoculation of the bacteria from a strain of P. aeruginosa mucosa producing, at a concentration of 2.4 x 10 7 CFU, as explained in example 8. Infected animals were divided into 4 groups of eight, administered on the third day after inoculation, intratracheal, medium (PBS), the antibiotic (sodium colistimethate) free, nanoparticles manufactured according to example 3 and the amount of equivalent antibiotic in the form of nanoparticles manufactured according to example 1 and example 2b respectively.
  • PBS medium
  • antibiotic sodium colistimethate
  • mice The amounts were calculated by adjusting the recommended dose in humans in relation to the weight of the mice (3000 Ul, equivalent to 0.24 mg of free sodium colistimethate, equivalent to 2.88 mg of the nanoparticles according to example 1b and 2.52 mg of nanoparticles according to example 2b).
  • the treatment was prolonged for three days, administered once a day to avoid excessive damage to the mice by the successive administration of anesthesia and intratracheal administration. After this time the animals were sacrificed, the lungs were removed, homogenized and proceeded to perform an agar culture to be able to carry out a bacterial count of P. aeruginosa. From the results obtained, a greater bactericidal effect of the nanoparticles of the present invention was concluded, with a significantly lower count than that corresponding to the free colistimethate.
  • the following table details the results obtained for each case:
  • Example 10 Assays for the determination of Inhibitory Concentration 50 (IC50) of nanoparticles manufactured according to examples 1b and 2b in human cells
  • the value of the inhibitory concentration 50 refers to the necessary concentration of the sample to be tested for the inhibition of the growth of a cell population.
  • the IC50 value has been considered as an indicator of toxicity, since the test has been carried out on human cells (on cell lines A549 and H441, two immortalized lines derived from epithelial cells of human adenocarcinomas.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • MEM-NEAA non-essential amino acid complement
  • Cellular was determined by "Cell Counting kit 8", CCK-8, after a washing step. For this, 10% of the CCK-8 reagent was added to each well and incubated with the cells for 4 hours at 37 ⁇ 2 ° C and 5% C0 2 . Subsequently, the absorbance at 450 nm was read using the 650 nm reading as a reference. The absorbance was directly proportional to the number of living cells in the sample. The results are expressed as the concentration capable of inhibiting the growth of 50% of the cells. The test was performed in triplicate. The results showed that nanoencapsulation of the antibiotic resulted in a decrease in the IC50 value, making it a less toxic formulation. Also, these values are above 1 to 2 ⁇ g / ml recognized as MIC. The following table details the results obtained for each case:

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Abstract

La presente invención se relaciona con una nanopartícula lipídica que comprende al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas, una fracción lipídica y uno o más tensioactivos,y el uso de la nanopartícula en la prevención y/o tratamiento de infecciones del árbol respiratorio.

Description

D E S C R I P C I Ó N
"NANOPARTÍCULA LIPÍDICA DE POLIMIXINA" SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con una nanopartícula lipídica que comprende al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas, una composición farmacéutica que comprende dicha nanopartícula y el uso de la nanopartícula en la prevención y/o tratamiento de infecciones del árbol respiratorio.
ESTADO ANTERIOR DE LA TÉCNICA Una de las enfermedades en la que mayor repercusión tienen las infecciones crónicas y recurrentes por bacterias gram negativas multi-resistentes (BGN-MR), por ejemplo, por la Pseudomonas aeruginosa, es la fibrosis quística. La persistencia de esta bacteria se asocia, entre otras causas, con su crecimiento en una biopelícula, la cual consiste en una estructura colectiva de bacterias que se adhiere a superficies, revestida por una capa protectora que segregan las propias bacterias, y que aporta la capacidad de resistir de un modo más eficaz a biocidas y antibióticos, soportando dosis considerablemente mayores de productos antibacterianos, y provocando un deterioro de la función pulmonar. Algunos antibióticos para el tratamiento de estas infecciones presentan efectos adversos por lo que la utilización de microsistemas o nanosistemas para administrar dichos antibióticos presentan un interés particular. En la literatura se describen diferentes usos de estos sistemas que comprenden alguno de estos antibióticos, como es el caso del documento US2009169635, en el que se describen unas nanopartículas de polímeros biodegradables de tipo poliéster para su administración vía sistémica.
Debido a que la concentración local en el pulmón de agentes antimicrobianos o antibióticos es uno de los factores más importantes para la erradicación con éxito de las bacterias, el epitelio alveolar y bronquial parece el lugar más interesante para la liberación de fármacos.
La administración directa de antibióticos a las vías aéreas inferiores mediante la administración de aerosoles y polvo seco presenta ventajas potenciales como la mayor concentración local que puede lograrse mediante deposición en la localización alveolar donde está la infección, y, por tanto, los fármacos inhalados pueden reducir la aparición de efectos adversos sistémicos al reducir la dosis administrada.
Las polimixinas son una familia de antibióticos que se comercializaron en las décadas de 1950 y 1960 pero cayeron posteriormente en desuso debido a sus efectos adversos y a la aparición de otros antibióticos frente a bacterias gram negativas (Luces y sombras en el uso de colistina: falta mucho por conocer. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 201 1 , Volume 29, Issue 4). En los últimos años, debido al incremento de las infecciones producidas por bacterias BGN-MR junto con la ausencia de alternativas terapéuticas se ha dado lugar al resurgimiento del uso de los antibióticos de la familia de las polimixinas. No obstante, los pocos datos clínicos de eficacia y de seguridad de los que se dispone dificultan asegurar si los regímenes de dosificación utilizados en la actualidad son los más adecuados.
A la vista de estos datos, existe, por tanto, una necesidad de desarrollar medicamentos para el tratamiento de infecciones en el árbol respiratorio que superen los inconvenientes del estado de la técnica.
EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han desarrollado nanopartículas lipídicas que comprenden al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas que son capaces de adherirse en o interactuar con la capa mucosa del tracto respiratorio o la biopelícula generada por las propias bacterias, favoreciendo que a una menor dosis terapéutica de antibiótico se obtengan unos resultados de concentración mínima inhibitoria óptimos. Las nanopartículas de la invención están protegidas frente a una degradación prematura y presentan además una liberación sostenida del antibiótico en el epitelio alveolar y bronquial. Por tanto, un aspecto de la invención es el de proporcionar una nanopartícula lipídica que comprende al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas, una fracción lipídica que comprende uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en monoglicéridos y/o diglicéridos y/o triglicéridos y/o ácidos grasos y/o mezclas de los mismos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas lipídicas definidas anteriormente junto con uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de las nanopartículas lipídicas definidas anteriormente que comprende las siguientes etapas:
a) Preparar una solución/mezcla con la fracción lipídica junto con al menos un antibiótico en un disolvente orgánico.
b) Preparar una solución acuosa con uno o más tensioactivos.
c) Mezclar la fase oleosa a) y la fase acuosa b) para obtener una emulsión. d) Dejar evaporar el solvente.
e) Lavar las nanopartículas obtenidas mediante centrifugación y/o ultrafiltración. Otro aspecto de la invención se refiere a la nanopartícula lipídica definida anteriormente, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de las nanopartículas lipídicas definidas anteriormente que comprende las siguientes etapas: a) Preparar una mezcla de los lípidos y al menos un antibiótico calentando a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión del lípido sólido.
b) Preparar una solución acuosa con uno o más tensioactivos.
c) Calentar la solución acuosa b) a la misma temperatura que la fase oleosa a). d) Añadir la fase acuosa b) sobre la fase oleosa a) y mezclar para obtener una emulsión.
e) Mantener a una temperatura 5°C±3°C hasta que los lípidos recristalicen dando lugar a las nanopartículas.
f) Lavar las nanopartículas obtenidas mediante centrifugación y/o ultrafiltración.
Las nanopartículas lipídicas de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de infecciones, en particular infecciones en el árbol respiratorio. Por tanto, otro aspecto de la invención se dirige a la nanopartícula lipídica definida anteriormente, para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a la nanopartícula lipídica definida anteriormente, para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones en el árbol respiratorio. Así, este aspecto se refiere al uso de la nanopartícula lipídica definida anteriormente para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una infección, preferentemente en el árbol respiratorio, preferentemente causadas por P. aeruginosa y/o especies afines y/o microorganismos sensibles a las polimixinas. Otro aspecto de la invención se dirige a un método de tratamiento y/o prevención de una infección, preferentemente en el árbol respiratorio, preferentemente causadas por P. aeruginosa y/o especies afines y/o microorganismos sensibles a las polimixinas, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la nanopartícula lipídica definida anteriormente, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, en un sujeto en necesidad de ese tratamiento y/o prevención, incluyendo un humano.
En este sentido, los estudios realizados por los inventores han demostrado la capacidad de estas nanopartículas lipídicas, así como las composiciones farmacéuticas y/o los medicamentos que comprenden estas nanopartículas, para: obtener una nanopartícula lipídica estable y con efecto de liberación sostenida y/o regulada del antibiótico,
proteger el antibiótico de una degradación prematura,
obtener un tamaño de partícula adecuado para su administración en el tracto respiratorio, tener la capacidad para penetrar en la biopelícula generada por las propias bacterias, y
obtener unos mejores valores de seguridad y eficacia que el antibiótico libre. Estas y otras ventajas y características de la invención se harán evidentes a la vista de las figuras y de la descripción detallada de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Representación gráfica de las nanopartículas lipídicas cargadas con el antibiótico en el que la fracción lipídica comprende lípidos sólidos a temperatura ambiente. Figura 2. Representación gráfica de las nanopartículas lipídicas cargadas con el antibiótico en el que la fracción lipídica comprende una mezcla de lípidos sólidos a temperatura ambiente y lípidos líquidos a temperatura ambiente.
Figura 3. Fotografía microscópica de una realización de las nanopartículas lipídicas de la presente invención.
Figura 4. Curva de liberación de antibiótico en el tiempo de las nanopartículas lipídicas. Figura 5. Imagen de la distribución pulmonar de microesferas fluorescentes tras su administración a un ratón CD1.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La nanopartícula lipídica que han desarrollado los inventores comprende al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas, una fracción lipídica que comprende uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en monoglicéridos y/o diglicéridos y/o triglicéridos y/o ácidos grasos y/o mezclas de los mismos y uno o más tensioactivos. En el contexto de la presente invención, el término "nanopartícula lipídica" se refiere a una matriz que comprende un núcleo de naturaleza lipídica y/o lipofílica, preferentemente, lípido solidificado, que podría comprender nanocompartimentos conteniendo el lípido en estado líquido, rodeado por una fase hidrofílica que encapsula el núcleo.
En el alcance de la invención se incluyen las nanopartículas que comprenden los lípidos sólidos a temperatura ambiente, también conocidas como nanopartículas lipídicas sólidas y los lípidos nanoestructurados, aquellas que comprenden una mezcla de lípidos sólidos y de líquidos a temperatura ambiente.
En una realización particular, las nanopartículas de la invención se caracterizan por presentar un tamaño promedio, aproximadamente, entre 10nm y, aproximadamente, 1000 nm, preferentemente, entre, aproximadamente, 100 nm y, aproximadamente, 500 nm.
Por "tamaño promedio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas lipídicas de la presente invención. El tamaño promedio se puede medir por procedimientos estándar conocidos por el experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en la parte de los ejemplos más adelante.
El tamaño de la partícula es uno de los factores que determina la liberación sostenida del antibiótico. En general, el antibiótico situado en la superficie de la nanopartícula es el primero en liberarse. A menor tamaño de nanopartícula, mayor superficie específica de interacción, por lo que habrá una mayor liberación inicial de antibiótico.
En otra realización, las nanopartículas presentan una carga superficial (medida mediante el potencial Z), cuya magnitud puede variar desde, aproximadamente, -30 mV a, aproximadamente, -5 mV y preferentemente entre -30 mV y -16 mV. Generalmente, la carga superficial es uno de los parámetros que afectan a la estabilidad de las nanopartículas lipídicas. El hecho de que estén cargadas negativamente o positivamente favorecerá que las fuerzas de repulsión entre las nanopartículas eviten las aglomeraciones presentando mejores propiedades de dispersión.
Considerando la carga positiva de los lipopolisacáridos de las membranas bacterianas presentes en la biopelícula generada por las propias bacterias y/o presentes en la mucosa pulmonar, la carga superficial negativa de las nanopartículas de la presente invención favorecen la unión nanopartícula- bacteria, optimizando la retención y adhesión de la nanopartícula en el lugar de acción, favoreciendo un efecto sostenido y terapéutico del antibiótico mejor.
En otra realización, las nanopartículas de la invención presentan unos valores de índice de polidispersión (PDI) iguales o inferiores a 0.5. Este índice nos da una idea de la diversidad de tamaños de nanopartícula existentes en una mezcla. Cuanto más próximo esté a cero más homogéneas serán las nanopartículas, indicativo de una distribución homogénea de tamaño de los lotes de fabricación.
Tanto el tamaño medio, como el potencial Z, como el valor PDI de las nanopartículas se ve influenciado principalmente por la cantidad del componente lipídico, por la cantidad de tensioactivos y por los parámetros del procedimiento de preparación, tal como la potencia y tipo de agitación, la temperatura de ambas fases o la duración de la fase de mezclado.
Fracción lipídica En una realización particular, la nanopartícula lipídica de la presente invención comprende como fracción lipídica al menos un lípido sólido a temperatura ambiente que forma parte del núcleo de la nanopartícula.
Para los fines de la invención, la temperatura ambiente es de 20-25 °C. No obstante, en el contexto de la presente invención, se entiende por "lípido sólido a temperatura ambiente" aquel lípido que se mantiene en forma sólida por debajo de 45 °C, pudiendo ser saturado o insaturado. En dicha definición, se pueden incluir, sin limitación, triglicéridos (por ejemplo triestearina), y/o mono o diglicéridos (por ejemplo derivados y mezclas de mono y diglicéridos) y/o ácidos grasos (por ejemplo ácido esteárico) o sus derivados y/o sus mezclas, esferoides (por ejemplo colesterol) y ceras (por ejemplo cetil palmitato). Cada ácido graso de estos glicéridos, así como los ácidos grasos por separado se suelen caracterizar por tener cadenas de entre 10 y 28 átomos de carbono. En la definición de derivados de ácidos grasos se incluyen aquellos ácidos grasos, sus ésteres o sus amidas que presentan grupos hidroxilo como sustituyentes de la cadena hidrocarbonada.
En una realización particular, la fracción lipídica comprende una mezcla de monoglicéridos, diglicéridos y/o triglicéridos. En una realización preferente, la fracción lipídica comprende una mezcla de monoglicéridos, diglicéridos y trigliclicéridos de palmitoestearato de glicerilo (por ejemplo, Precirol® ATO 5).
En otra realización particular, la fracción lipídica de la nanopartícula comprende una mezcla de uno o más lípidos sólidos a temperatura ambiente y uno o más lípidos líquidos a temperatura ambiente.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "lípido líquido a temperatura ambiente" aquel lípido que se mantiene en forma líquida por debajo de 45 °C, pudiendo ser saturado o insaturado. En dicha definición, se pueden incluir, sin limitación, aceites, y/o triglicéridos, y/o monoglicéridos y/o diglicéricos y/o los ácidos grasos y/o ésteres de ácidos grasos y/o sus mezclas. Cada ácido graso de estos glicéridos, así como los ácidos grasos por separado se suelen caracterizar por tener cadenas de menos de 10 átomos de carbono.
En una realización particular, la fracción lipídica líquida comprende triglicéridos.
En una realización preferente, se emplea como lípido líquido un triglicérido de ácido caprílico y de ácido cáprico (por ejemplo Mygliol 812).
El lípido líquido aporta una estructura menos ordenada aumentando la capacidad de carga del antibiótico en el núcleo de la nanopartícula.
Las figuras 1 y 2 ofrecen una representación gráfica de ejemplos particulares de las nanopartículas lipídicas donde la primera figura comprende lípidos sólidos 1 junto con el antibiótico 2, y la segunda comprende una mezcla 3 de lípidos sólidos y líquidos junto con el antibiótico 2.
En una realización de la invención, la relación en peso (peso/peso) de lípido líquido respecto al lípido sólido está comprendida, aproximadamente, entre 0.5: 10 y, aproximadamente, 5: 10.
En una realización de la invención, la relación en peso (peso/peso) de lípido líquido respecto al lípido sólido es de aproximadamente 1 : 10.
El uso de los lípidos sólidos y líquidos aportan las siguientes ventajas a la nanopartícula:
tolerancia en el organismo y tejidos mejorada debido a la utilización de lípidos aceptados fisiológicamente,
- posibilidad de encapsular tanto fármacos lipófilos como hidrófilos, utilizando diferentes métodos de preparación,
no muestran toxicidad biológica, y
es posible modular la liberación del antibiótico según la necesidad. Las nanopartículas con una cubierta rica en antibiótico presentan una importante liberación inicial mientras que las nanopartículas con un núcleo rico en fármaco permiten una liberación sostenida del mismo.
Tensioactivo Como se ha dicho anteriormente, las nanopartículas de la invención comprenden uno o más tensioactivos. En una realización particular, la fase hidrofílica de las nanopartículas que rodea al núcleo lipofílico comprende un tensioactivo. En el contexto de esta invención, un tensioactivo es un emulgente o emulsionante que reduce la tensión superficial de las diferentes fases que se requieren para la fabricación de las nanopartículas consiguiendo una mejor interposición de las mismas y así, la formación de las nanopartículas.
Los tensioactivos pueden ser catiónicos, iónicos o no iónicos y su clasificación dependerá de la carga que posea la parte de la superficie. Ejemplos de tensioactivos catiónicos incluyen, sin limitación, cetrimida y/o cloruro de cetilpiridinio; ejemplos de tensioactivos aniónicos incluyen, sin limitación, docusato sódico, fosfolípidos y/o lauril sulfato sódico
Por el término "tensioactivo no iónico" se entiende aquél compuesto sin ninguna carga neta, que presenta una parte hidrófoba y una parte hidrofílica.
En una realización preferente, la nanopartícula comprende al menos un tensioactivo no iónico cuyas funciones principales son controlar el tamaño de partícula y conferir estabilidad evitando la formación de agregados. Ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen, sin limitación, polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol y/o copolímeros de polipropilenglicol. En una realización preferida, los tensioactivos no iónicos son polisorbato 80 y/o poloxamer.
En una realización particular, la proporción de tensioactivo no iónico está comprendida entre 0,5% y 2% en peso respecto al peso total de la nanopartícula, preferentemente 1 %.
Antibiótico Un antibiótico o antimicrobiano es un agente que actúa contra infecciones bacterianas bien inhibiendo el crecimiento de la bacteria o dando lugar una cadena de acontecimientos bioquímicos que desembocarán en la lisis de la bacteria.
En la presente invención, la nanopartícula lipídica comprende al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas como son la polimixina A, polimixina B, polimixina C, polimixina D y polimixina E.
En una realización preferente, la nanopartícula lipídica comprende al menos un antibiótico del tipo de colistina o colistimetato sódico.
La liberación del antibiótico así como la acción antibacteriana se pueden regular mediante la relación en peso del antibiótico respecto a la fracción lipídica. En una realización particular, la relación en peso del antibiótico respecto a la fracción lipídica es desde, aproximadamente, 0,25: 10, hasta aproximadamente, 4: 10 siendo preferentemente de aproximadamente 1 : 10. La acción antibacteriana de un antibiótico se puede medir mediante la concentración inhibitoria mínima, la cual consiste en la concentración del antibiótico requerida para impedir el crecimiento bacteriano a partir de la incubación de 10 4-5 bacterias en fase de crecimiento rápido, en un medio libre de proteínas con pH 7,2, aerobio, durante un periodo de incubación de una noche. Este término se utiliza para determinar la sensibilidad bacteriana a un agente antibiótico específico.
El término sensible en el contexto de la infección significa una inhibición del crecimiento del microorganismo y/o muerte del microorganismo, en el caso de un tratamiento a la dosis terapéutica.
Las relaciones en peso de antibiótico-fracción lipídica de las diferentes realizaciones de la presente invención han demostrado una concentración inhibitoria mínima menor que el antibiótico libre. Este hecho además de ser una ventaja de costes puesto que se requiere una menor cantidad de antibiótico para un mismo efecto terapéutico, favorece una menor probabilidad de resistencias bacterianas adquiridas. Por el término resistencia bacteriana adquirida en el contexto de la invención se entiende aquella resistencia adquirida por la bacteria a través de la adquisición de genes de resistencia de otras bacterias y/o por procesos de mutación. La resistencia bacteriana está directamente relacionada, entre otras causas, con el uso de dosis o duración inadecuada de la terapia antibacteriana.
Procedimiento de preparación
Las nanopartículas lipídicas de la presente invención se pueden preparar mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente o mediante la técnica de homogenización por fusión por calor.
La primera técnica comprende las siguientes etapas:
a) Preparar una solución/mezcla con la fracción lipídica junto con al menos un antibiótico en un disolvente orgánico.
b) Preparar una solución acuosa con uno o más tensioactivos. c) Mezclar la fase oleosa a) y la fase acuosa b) para obtener una emulsión. d) Dejar evaporar el solvente.
e) Lavar las nanopartículas obtenidas mediante centrifugación.
En una realización particular, la fracción lipídica se disuelve en una solución orgánica entre el 1 y el 10% (peso/volumen), preferentemente entre 3 y 7 % y muy preferentemente al 5% junto con al menos un antibiótico. Por otro lado, se prepara una solución acuosa de al menos un tensioactivo. Se añade la fase acuosa sobre la oleosa y la mezcla se emulsiona mediante sonicación durante un tiempo determinado. El tamaño, el índice de polidispersión y la eficiencia de encapsulación de las nanopartículas dependerán de la potencia de sonicación y del tiempo de sonicación. Preferentemente se sónica entre 10W y 30W y muy preferentemente entre 15 W y 25W durante entre 15 segundos y 40 segundos, preferentemente entre 25 segundos y 35 segundos y muy preferentemente entre 29 segundos y 31 segundos. Una vez obtenida la emulsión se deja evaporar el solvente bajo agitación magnética durante dos horas a temperatura ambiente. Tras la evaporación, las nanopartículas obtenidas se lavan centrifugando y filtrando entre 1 y 10 veces, preferentemente entre 2 y 5 veces y muy preferentemente 3 veces. La segunda técnica comprende las siguientes etapas:
a) Preparar una mezcla de los lípidos y al menos un antibiótico calentando a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión del lípido sólido. b) Preparar una solución acuosa con uno o más tensioactivos.
c) Calentar la solución acuosa b) a la misma temperatura que la fase oleosa a). d) Añadir la fase acuosa b) sobre la fase oleosa a) y mezclar para obtener una emulsión.
e) Mantener a una temperatura 5°C±3°C hasta que los lípidos recristalicen. f) Lavar las nanopartículas obtenidas mediante centrifugación/ultrafiltración. En una realización particular, por una parte se mezclan los lípidos sólidos y/o líquidos y los antibióticos, y se calientan a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión del lípido sólido. Por otro parte, se prepara una solución acuosa de al menos un tensioactivo. La solución oleosa y la solución acuosa se calientan a la misma temperatura, y una vez que ambas fases alcanzan la misma temperatura se añade la solución acuosa sobre la oleosa. La mezcla se emulsiona mediante sonicación. Al igual que en el método anterior, el tamaño, el índice de polidispersión y la eficiencia de encapsulacion de las nanopartículas dependen de la potencia de sonicación y el tiempo de sonicación. Preferentemente se sónica entre 10W y 30W y muy preferentemente entre 15W y 25W durante entre 10 segundos y 30 segundos, preferentemente entre 12 segundos y 16 segundos y muy preferentemente entre 14 segundos y 15 segundos. La emulsión obtenida se almacena como mínimo, entre 5 horas y 30 horas, preferentemente entre 10 horas y 20 horas y muy preferentemente entre 11 horas y 13 horas, muy preferentemente 12 horas entre 1°C y 10°C, preferentemente entre 2°C y 6°C y muy preferentemente entre 3°C y 5°C. En este periodo, los lípidos se recristalizan formando las nanopartículas. Pasado el tiempo, se lavan centrifugando y filtrando entre 1 y 10 veces, preferentemente entre 2 y 5 veces y muy preferentemente 3 veces, entre 1000 rpm y 3500 rpm, preferentemente a 2000 rpm y 3000 rpm y muy preferentemente sobre 2500 rpm durante entre 10 minutos y 30 minutos, preferentemente entre 12 minutos y 16 minutos y muy preferentemente entre 14 minutos y 15 minutos. Una de las ventajas de este método es que no se emplean solventes orgánicos, evitando así la necesidad de realizar ensayos de determinación de trazas de solventes orgánicos previo a la comercialización de las nanopartículas para consumo humano. Un aspecto de esta invención se dirige al producto obtenible por las técnicas descritas anteriormente.
Liofilización En una realización particular, la nanopartícula lipídica es una nanopartícula liofilizada. La liofilización permite obtener un polvo seco de las nanopartículas lipídicas, el cual le aporta una mayor estabilidad que las nanopartículas lipídicas en suspensión, ya que evita la degradación de la nanopartícula y la liberación anticipada del antibiótico a la solución en el que las nanopartículas están suspendidas.
La liofilización se puede realizar por procedimientos estándar conocidos del experto en la materia, y que se describen, por ejemplo, en la parte de los ejemplos más adelante. En una realización, la nanopartícula lipídica de la presente invención comprende un crioprotector. El crioprotector favorece la estabilización de las nanopartículas durante el proceso de congelamiento del proceso de liofilización. Este crioprotector se puede seleccionar, sin limitación, entre Si02 coloidal, glicina, lactosa, manitol, trehalosa, rafinosa, bicarbonato sódico y borato sódico.
En una realización preferente, la nanopartícula comprende la trehalosa como crioprotector. En una realización, la nanopartícula lipídica comprende entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 20% de crioprotector en peso respecto al peso de la nanopartícula lipídica, preferentemente entre un 5% y 15%.
Infección
Un aspecto de la invención se dirige a la nanopartícula lipídica de la invención, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la infección, preferentemente de una infección en el árbol respiratorio. Otro aspecto de la invención se dirige al uso de la nanopartícula lipídica de la invención, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la infección, preferentemente de una infección en el árbol respiratorio.
Otro aspecto de la invención se dirige a un método de tratamiento o prevención de una infección, preferentemente de una infección en el árbol respiratorio, que comprende en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la nanopartícula lipídica definida anteriormente, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, en un sujeto en necesidad de ese tratamiento y/o prevención, incluyendo un humano.
El término infección incluye cualquier infección por bacterias gram negativas y/o bacterias o microorganismos sensibles a los antibióticos de la familia de las polimixinas. El término árbol respiratorio incluye a la cavidad nasal, faringe, laringe, tráquea, bronquio primario y pulmones.
El término "prevención o tratamiento" en el contexto de la especificación significa la administración de las nanopartículas según la invención para preservar la salud en un paciente que sufre o está en riesgo de sufrir una infección bacteriana anteriormente descrita. Dichos términos también incluyen la administración de las nanopartículas según la invención para prevenir, mejorar, aliviar o eliminar uno o más síntomas asociados a la infección bacteriana. El término "mejorar" en el contexto de esta invención se entiende que significa cualquier mejora en la situación del paciente tratado, o bien subjetiva (sensación de o en el paciente) o bien objetivamente (parámetros medidos).
En una realización particular, la infección en el árbol respiratorio se debe a la Pseudomonas aeruginosa.
La nanopartícula de la invención ha demostrado su capacidad de adherirse a la biopelícula generada por la bacteria o la propia mucosidad del tejido del árbol respiratorio. Así, en una realización particular, la invención se dirige al uso de la nanopartícula lipídica de la invención a la infección pulmonar asociada a la fibrosis quística y/o la bronquiectasia.
Las nanopartículas lipídicas de la presente invención, pueden estar formando parte de una composición farmacéutica. Dichas composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida, semi-sólida o líquida para aplicación por vía digestiva (enteral, sublingual o rectal), por vía tópica (transdérmica u oftálmica), por vía parenteral (intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intraperitoneal) o administración directa en el árbol respiratorio.
La composición farmacéutica comprende la nanopartícula lipídica junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, en un sujeto en necesidad de ese tratamiento y/o prevención, incluyendo un humano. El experto en la materia puede determinar qué componentes adicionales se pueden utilizar y si son necesarios, siendo muchos de ellos de uso común en composiciones farmacéuticas. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" en el contexto de esta invención se refiere a la cantidad de composición que una vez administrado, es suficiente para prevenir o tratar uno o más síntomas derivadas de la infección bacteriana. La dosis particular administrada según la presente invención será determinada según las circunstancias particulares que rodean al caso, incluyendo el compuesto administrado, la ruta de administración, la condición particular que se trata y las consideraciones similares.
La expresión "excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composición o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. Debe también ser adecuado para su uso en contacto con los tejidos u órganos humanos y animales sin una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones acorde con una relación beneficio/ riesgo razonable.
La composición farmacéutica puede comprender otros ingredientes como moduladores de la viscosidad, conservantes, solubilizantes, en el que se incluyen, sin limitación, ciclodextrinas, lecitinas y/o monoestearato de glicerina, antifloculantes, en el que se incluye, sin limitación, leucina, y/o estabilizantes, en el que se incluyen, sin limitación, alginatos, ácido algínico y/o trehalosa. Estos componentes serán adicionados a la fase lipofílica o hidrofílica dependiendo de la naturaleza de los mismos. En una realización particular, la composición farmacéutica comprende las nanopartículas lipídicas de polimixina, un crioprotector, un agente antiaglomerante y otros excipientes. La presentación farmacéutica puede ser un polvo para ser nebulizado en solución o en polvo seco para su administración directa. En una realización preferente, se administra en el tracto respiratorio, mediante la inhalación.
Estas administraciones mediante inhalación son preparaciones líquidas o sólidas que contienen la nanopartícula y/o composición farmacéutica y/o medicamento de la invención sola o junto con más fármacos. El tamaño de las partículas destinadas a ser inhaladas debe ser ajustado para localizar su repartición en la parte inferior del árbol respiratorio y controlado por métodos apropiados para la determinación del tamaño de las partículas. El experto en la materia puede determinar que procesos y/o dispositivos pueden aplicarse para una administración óptima mediante vapores o aerosoles o polvos.
En otro aspecto de la invención, el tamaño de partícula inhalada está comprendida entre 1 μηι y 10 μηι, preferentemente entre 2 μηι y 8 μηι y más preferentemente entre 3 μηι y 5 μηι. Estos tamaños permiten una perfecta deposición alveolar y retención pulmonar de la cantidad terapéuticamente efectiva. En una realización particular estos tamaños se logran agregando las nanopartículas, en el caso de su aplicación como polvo seco, o generando un aerosol con el portador apropiado en el caso de ser administradas mediante nebulización. A continuación, se describen algunos ejemplos ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas de la invención, no obstante, no se deben interpretar como limitativos del objeto de la invención tal como está definido en las reivindicaciones. Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de nanopartículas lipídicas con antibiótico mediante la técnica de emulsificación/evaporación del solvente Ejemplo 1a:
Se mezclaron 10 mg de Colistimetato sódico en una disolución de 100 mg de diesterato de glicerilo, (por ejemplo Precirol® ATO 5) al 5% en diclorometano (volumen final 2 ml_).
Por otro lado, se preparó una solución acuosa de los tensioactivos (Poloxamer 188 y Polisorbato 80 al 1 % cada uno). Se añadió la fase acuosa sobre la fase oleosa, y la mezcla fue emulsionada mediante sonicación a 20 W durante 30 segundos. Posteriormente se dejó bajo agitación magnética durante dos horas para que evaporara el solvente.
Tras la evaporación las nanopartículas obtenidas se lavaron centrifugando 3 veces a 2500 rpm durante 15 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore). Ejemplo 1 b:
Una parte de estas nanopartículas fueron liofilizadas sometiéndolas a las siguientes etapas: a) Adición de un 15% de trehalosa respecto al peso total de la fracción lipídica. b) Congelación a -20°C y posteriormente a -80°C.
c) Congelación a -50°C, a 10000 mbar de presión durante 3 horas.
d) Vacio a -50°C hasta obtener una presión de 0.20 mbar.
e) Secado a -50°C a 0.20 mbar de presión durante 5 horas.
f) Secado a 20°C a 0.20 mbar de presión durante 7 horas.
g) Secado a 20°C a presión ambiental durante 24 horas.
Ejemplo 2: Preparación de nanopartículas lipídicas con antibiótico mediante la técnica de homogenización por fusión por calor.
Ejemplo 2a:
Se preparó una mezcla de 1000 mg de Precirol® ATO 5 y Miglyol® 812 en una relación 10: 1 junto con 100 mg de colistimetato sódico, a una temperatura ligeramente superior al punto de fusión del lípido sólido.
Por otro lado, se preparó una solución acuosa del tensioactivo (Poloxamer 188 al 0,6 % y Polisorbato 80 al 1 ,3%).
La solución lipídica y la acuosa fueron calentadas a la misma temperatura (aproximadamente, a una temperatura entre 5°C y 10°C superior a la temperatura de fusión de los lípidos).
Se añadió la fase acuosa sobre la fase oleosa, y la mezcla fue emulsionada mediante sonicación a 20W durante 15 segundos. La emulsión obtenida fue almacenada durante 12 horas a 4°C para que los lípidos pudieran recristalizarse y formar las nanopartículas.
Las nanopartículas obtenidas se lavaron centrifugando 3 veces a 2500 rpm durante 15 minutos utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore). Ejemplo 2b:
Una parte de estas nanopartículas fueron liofilizadas sometiéndolas a las etapas citadas en el ejemplo 1 b.
Ejemplo 3 (ejemplo de referencia): Preparación de nanopartículas lipídicas sin antibiótico
Se prepararon varios lotes de nanopartículas lipídicas sin antibiótico, con diferentes relaciones en peso de lípido líquido respecto a lípido sólido según el método descrito en el ejemplo 2. Las relaciones fueron las siguientes: 0,5: 10; 1 :10; 2,5: 10 y 5: 10.
Ejemplo 4 Caracterización de las nanopartículas
Se caracterizaron el tamaño de la partícula y el potencial zeta mediante un Zetasizer Nano ZS. En la siguiente tabla se describen los resultados medios obtenidos con los lotes fabricados según los ejemplos 1 ,2 y 3:
Figure imgf000021_0001
De esta tabla se puede observar que se han obtenido nanopartículas con un tamaño, potencial Z y PDI óptimos para una buena estabilidad y homogeneidad de las nanopartículas. Ejemplo 5: Eficacia de encapsulación. Se determinó la eficacia de encapsulación del antibiótico determinando la cantidad de antibiótico presente en el sobrenadante tras el proceso de lavado descritos en el ejemplo 1 y 2. El antibiótico presente en el sobrenadante fue analizado por HPLC utilizando un Waters 1525 HPLC Binary Pump (Waters Corp., Milford, USA), un detector ultravioleta Waters 2487 e un inyector automático Waters 717 plus. El sistema se controlaba por el software Empower. La columna seleccionada fue Novapak C 18 x 150 mm con un tamaño de poro de 4 μηι.
La fase móvil estaba constituida de una solución acuosa al 77% y de acetonitrilo al 23%. La fase acuosa fue preparada disolviendo (7, 1 g) sulfato de sodio, (0,6 g) ácido acético y (2,2 g) ácido fosfórico y ajustado a un pH 2,5 con trietilamina para 1 litro de solución acuosa. El colistimetato sódico se detectó a una longitud de onda de 206 nm. El flujo era de 1 ,5 ml/min para una elución ¡socrática. Se inyectaron 50 μΙ de muestra disuelta en agua. Se vio que el ensayo era linear para 100-800 μg/ml no detectándose ninguna interferencia.
La eficacia de encapsulación fue determinada por la siguiente fórmula:
EE(%)= 100 * (cantidad inicial de antibiótico- cantidad de antibiótico no encapsulado)/ cantidad inicial de antibiótico).
Los lotes fabricados según el método de fabricación descrito en el ejemplo 1 dieron valores medios de 80±7%, y los lotes fabricados según el método descrito en el ejemplo 2 de 95±4%. Estos valores son indicativos de que la efectividad del procedimiento de preparación está en unos valores próximos al 100%, asegurando un aprovechamiento máximo del antibiótico añadido al proceso de fabricación.
Ejemplo 6: Ensayos in vitro para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC). 100 μΙ de una concentración de 104 Unidades formadoras de Colonias (CFU) /mi de 31 cepas de P. aeruginosa obtenidas de 31 pacientes con fibrosis quística, de las cuales, 13 cepas eran productoras de mucosa, fueron incubadas durante 24h a 37°C en un medio Caldo Mueller Hinton con concentración ajustada de cationes (MHBCA), correspondientes entre 20 mg y 25 mg por litro de Calcio y entre 10 mg y 12,5 mg por litro de magnésico, que aseguraban la reproducibilidad de los resultados para P.aeruginosa, en presencia de Colistimetato sódico, y nanopartículas obtenidas según el ejemplo 1 b y 2b, en diferentes concentraciones (menos de 0,25, 0,25, 0,5, 1 , 2, 4, 8 y 32 vg/m\). Para el colistimetato sódico, para el 48% de las cepas se obtuvo una MIC de 2 μg/ml, para el 25% una MIC de 1 μg/ml y para el 16% una MIC de 0,5 μg/ml. El restante obtuvo una MIC de 4 μg/ml.
En el caso de las nanopartículas obtenidas según el ejemplo 1 b, para el 52% de las cepas se obtuvo una MIC de 2 μg/ml, para el 25% se obtuvo una MIC de 1 μg/ml, para el 13% se obtuvo una MIC de 0,5 μg/ml y para el 3% una MIC menor a 0,25 μg/ml. Para el restante de las cepas se obtuvo una MIC de 4 μg/ml.
En el caso de las nanopartículas obtenidas según el ejemplo 2b, para el 42% de las cepas se obtuvo una MIC de 1 μg/ml, para el 23% se obtuvo una MIC de 0,5 μg/ml, para el 10% se obtuvo una MIC de 0,25 μg/ml, para el 3% una MIC menor a 0,25 μg/ml, para un 16% MIC de 2 μg/ml y para el restante, una MIC superior a 4 μg/ml.
Estos resultados demuestran que las nanopartículas de la presente invención presentan un mejor valor de MIC que el antibiótico libre.
Ejemplo 7: Estudios de liberación
Se incubaron por un lado una muestra de 25 mg de nanopartículas preparadas según el método descrito en el ejemplo 1 b y por el otro, una muestra de 25 mg de nanopartículas preparadas según el método descrito en el ejemplo 2b, en 5 mi de PBS cada una. En tiempos preestablecidos las muestras fueron centrifugadas utilizando filtros Amicon® Ultra (Millipore) durante 15 minutos. El antibiótico presente en el sobrenadante fue analizado por HPLC según el ejemplo 5. El PBS retirado en la centrifugación fue reemplazado por PBS nuevo. En la figura 4 se expresa el porcentaje de antibiótico liberado respecto a la cantidad total de antibiótico encapsulado en la nanopartícula para cada tipo de nanopartícula en el tiempo (horas). Las nanopartículas lipídicas presentan una gran superficie específica dado a su tamaño. Cuando se ponen en contacto con el PBS, primeramente se libera el fármaco asociado a la superficie o muy cercano a la superficie de nanopartícula. A esta primera fase de liberación rápida se le denomina "burst". En una segunda fase, el principio activo se libera por degradación/erosión o hinchamiento de núcleo de la partícula, dando lugar a la fase de liberación sostenida. En el caso de la terapia antimicrobiana, los niveles de antibiótico han resultado ser óptimos para inhibir el crecimiento in vitro de las bacterias P. aeruginosa. Ejemplo 8: Ensayos in vivo de toxicidad y distribución en ratones CD1 de las nanopartículas fabricadas según el ejemplo 1b y 2b
Para llevar a cabo los ensayos in vivo de toxicidad y eficacia de las nanopartículas de la presente invención fue necesario establecer un modelo de infección de los roedores. Se llevó a cabo una administración intratraqueal de diferentes concentraciones de P. aeruginosa productora de mucosa dispuesta en microesferas. (Concentración 1 : 5x104 CFU, Concentración 2: 2,4x 107 CFU y Concentración 3: 3,89x1010) obtenida de un paciente con fibrosis quística, suspendida en PBS, en ratones CD1 , administrando una concentración distinta a cada roedor, para establecer la concentración óptima para generar una adecuada infección pulmonar, capaz de enfermar a los roedores sin provocar su muerte inmediata. Se concluyó que la concentración óptima era de 2,4x 107 CFU ya que se consigue la supervivencia de los ratones más de tres días, y se comprueba tras su sacrificio que presentan una infección pulmonar.
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad de las nanopartículas fabricadas según el ejemplo 1 b y el ejemplo 2b, administradas por vía intratraqueal. Se administraron 1 ,2 mg de nanopartículas en 50 microlitros de PBS (cantidad óptima para evitar una excesiva densidad de la mezcla) a un grupo de 16 ratones CD1 , además de establecerse los correspondientes grupos de control (5 ratones) a los que no se les administró producto alguno. Hasta tres días después de la administración, todos los ratones presentaron un comportamiento estándar, respondiendo a estímulos y moviéndose con normalidad. Transcurridos esos tres días, se sacrificaron los ratones y se realizó tanto un lavado broncoalveolar como la obtención y preparación de muestras del pulmón para su análisis para su estudio anatomo-patológico. El estudio de las muestras no reveló inflamación o daños en los tejidos estudiados que puedan haber sido causados por las nanopartículas de la presente invención.
Adicionalmente, se administraron microesferas de 6 μηι en 50 μΙ (equivalentes a las que se emplean para inducir la infección) cargadas con un reactivo fluorescente o fluoróforo (onda de excitación : 630-660 nm y onda de emisión 670-720 nm, de cara a poder garantizar que la técnica de administración era efectiva y que efectivamente se depositan mayoritariamente en el pulmón. En la figura 5, se presenta una imagen de los pulmones de un ratón CD1 después de la administración intratraqueal de 1 x106 microesferas fluorescentes. El animal se sacrificó 5 minutos después de la administración de las microesferas. Las microesferas (AlignFlow™ polystyrene microspheres 6.0μηι de diámetro, Aex: 630-660 nm, Aem: 670-720 nm, Invitrogen) se administraron resuspendidas en 50 μΙ_ de PBS. La localización se realizó con un sistema de registro Pearl-lmpulse (LI-COR Biosciences, USA). En la imagen se observa la distribución homogénea del reactivo fluorescente 2 en la totalidad del pulmón 1 del roedor.
Ejemplo 9: Ensayos in vivo de eficacia en ratones CD1 de las nanopartículas fabricadas según el ejemplo 1b y 2b Se emplearon cinco ratones como grupo de control y 64 ratones infectados con la inoculación de las bacterias de una cepa de P. aeruginosa productora de mucosa, a una concentración de 2,4x 107 CFU, tal y como se explica en el ejemplo 8. Los animales infectados se dividieron en 4 grupos de ocho, administrándoles al tercer día tras la inoculación, vía intratraqueal, medio (PBS), el antibiótico (colistimetato sódico) libre, nanopartículas fabricadas según el ejemplo 3 y la cantidad de antibiótico equivalente en forma de nanopartículas fabricadas según el ejemplo 1 b y ejemplo 2b respectivamente. Las cantidades se calcularon ajusfando la dosis recomendada en humanos en relación al peso de los ratones (3000 Ul, equivalente a 0,24 mg de colistimetato sódico libre, equivalente a 2,88 mg de las nanopartículas según el ejemplo 1b y 2,52 mg de nanopartículas según el ejemplo 2b).
El tratamiento se prolongó por tres días administrándose una vez al día para evitar un daño excesivo a los ratones por la sucesiva administración de anestesia y administración intratraqueal. Una vez transcurrido este tiempo los animales se sacrificaron, se extrajeron los pulmones, se homogeneizaron y se procedió a realizar un cultivo en agar para poder llevar a cabo un recuento de bacterias de P. aeruginosa. De los resultados obtenidos, se concluyó un mayor efecto bactericida de las nanopartículas de la presente invención, al obtenerse un recuento significativamente menor que el correspondiente al colistimetato libre. En la siguiente tabla se detallan los resultados obtenidos para cada caso:
Figure imgf000026_0001
Ejemplo 10: Ensayos para la determinación de la Concentración Inhibitoria 50 (IC50) de las nanopartículas fabricadas según los ejemplos 1b y 2b en células humanas
El valor de la concentración inhibitoria 50 (IC50) hace referencia a la concentración necesaria de la muestra a ensayar para la inhibición del crecimiento de una población celular. En este caso el valor IC50 ha sido considerado como un indicador de toxicidad, ya que el ensayo ha sido realizado sobre células humanas (en las líneas celulares A549 y H441 , dos líneas inmortalizadas derivadas de células epiteliales de adenocarcinomas humanas. Las células (a una densidad de 12000 células por pocilio en una placa de 96 pocilios) fueron cultivadas en un medio "Dulbecco's Modified Eagle Médium" (DMEM) al que se le añadieron 10% de suero bovino fetal, 1 % de L-Glutamina, 1 % de una solución de penicilina/estreptomicina y 1 % un complemento de aminoácidos no esenciales (MEM-NEAA), a 37°C y a 5% de C02 durante 24 horas. Se añadieron concentraciones decrecientes de nanopartículas 1 b y 2b y colistimetato sódico libre diluidas en DMEM, con 0.5% de suero bovino fetal, empezando en 10 mg/ml y alcanzando 0.07812 mg/ml incubándose posteriormente a 37°±2°C y 5% de C02 durante 24 horas. La viabilidad celular se determinó mediante el "Cell Counting kit 8", CCK-8, tras una etapa de lavado. Para ello, se añadió un 10% del reactivo CCK-8 a cada pocilio y se incubaron con las células durante 4horas a 37 ±2°C y 5% de C02. Posteriormente se leyó la absorbancia a 450nm empleado la lectura de 650nm como referencia. La absorbancia era directamente proporcional al número de células vivas en la muestra. Los resultados se expresan como la concentración capaz de inhibir el crecimiento del 50% de las células. El ensayo se realizó por triplicado. Los resultados mostraron que la nanoencapsulacion del antibiótico dio lugar a una disminución del valor IC50, por lo que es una formulación menos tóxica. Asimismo, esto valores están por encima del 1 a 2 μg/ml reconocidos como MIC. En la siguiente tabla se detallan los resultados obtenidos para cada caso:
Línea celular H441 Línea celular A549
Ejemplo 1 b 358,49±73,86 ig/m\ 1309,97±318,69 ig/m\
Ejemplo 2b 1087, 14±197,43 ig/m\ 2821 ,57±877,09 ig/m\
Colistimetato 6,58±0,72 g/ml 101 ,27±14,44 ig/m\
sódico libre

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Nanopartícula lipídica que comprende:
al menos un antibiótico de la familia de las polimixinas, - una fracción lipídica que comprende uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en monoglicéridos y/o diglicéridos y/o triglicéridos, y/o ácidos grasos y/o mezclas de los mismos, y
uno o más tensioactivos.
2. Nanopartícula lipídica según la reivindicación 1 , en donde la fracción lipídica comprende uno o más lípidos sólidos a temperatura ambiente.
3. Nanopartícula lipídica según la reivindicación 1 , en donde la fracción lipídica comprende mezclas de uno o más lípidos sólidos a temperatura ambiente y uno o más lípidos líquidos a temperatura ambiente.
4. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la relación en peso del antibiótico con respecto a la fracción lipídica está comprendida entre, aproximadamente, 0.25: 10 y, aproximadamente, 4: 10 siendo preferentemente de aproximadamente 1 :10.
5. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la relación en peso de lípido líquido con respecto al lípido sólido está comprendida entre, aproximadamente, 0.5: 10 y, aproximadamente, 5:10 siendo preferentemente, 1 : 10.
6. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proporción en peso de tensioactivo respecto al peso total de la nanopartícula está comprendida entre, aproximadamente, 0,5% y, aproximadamente, 2%, siendo preferentemente, aproximadamente, al 1 %.
7. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los tensioactivos son no iónicos.
8. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antibiótico de la familia de las polimixinas se selecciona entre la colistina y el colistimetato sódico.
9. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un crioprotector.
10. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está liofilizada.
1 1. Composición farmacéutica que comprende la nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores junto con uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
12. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como medicamento.
13. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento y/o prevención de infecciones en el árbol respiratorio.
14. Nanopartícula lipídica para uso según la reivindicación 13, donde las infecciones en el árbol respiratorio son causadas por Pseudomona aeruginosa y/o microorganismos sensibles a las polimixinas.
15. Nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores la cual se administra mediante inhalación en el tracto respiratorio, en forma de vapores o aerosoles o polvos, en donde la partícula inhalada tiene un tamaño entre, aproximadamente, 1 μηι y, aproximadamente, 10 μηι, preferentemente entre 1 ,5 μηι y 5 μηι y más preferentemente entre 2 μηι y 4 μηι.
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