[go: up one dir, main page]

WO2015078997A1 - Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l'empreinte genetique d'un sujet - Google Patents

Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l'empreinte genetique d'un sujet Download PDF

Info

Publication number
WO2015078997A1
WO2015078997A1 PCT/EP2014/075866 EP2014075866W WO2015078997A1 WO 2015078997 A1 WO2015078997 A1 WO 2015078997A1 EP 2014075866 W EP2014075866 W EP 2014075866W WO 2015078997 A1 WO2015078997 A1 WO 2015078997A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
locus
group
alleles
str loci
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2014/075866
Other languages
English (en)
Inventor
Patricia BALARESQUE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Toulouse
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Toulouse III Paul Sabatier filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2015078997A1 publication Critical patent/WO2015078997A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for characterizing a DNA sample of a human subject or chimpanzee to determine the sex and / or genetic imprint of that subject.
  • a genetic profile is the specific combination of several markers that can identify an individual through their DNA. There are essentially two main types of markers for establishing a genetic profile: Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), and Short Tandem Repeats (STRs).
  • SNPs Single Nucleotide Polymorphisms
  • STRs Short Tandem Repeats
  • SNP corresponds to the change from one base to another at a location in the DNA sequence, for example a change from A to C. It thus comes in the form of 2 alleles. SNPs are characterized by a low mutation rate (2.1 x 10 "6 mutation / generation / locus) due to the low frequency of these mutations occur. These are excellent phylogenetic tools that tell us about the origin phylo- On the other hand, they are not discriminating enough to inform us about the relationships between closely related individuals, except when they are combined in large numbers (> 100 million to a million).
  • STRs are widely used in paternity research, rape and murder cases, and basic research to reconstruct the history of human settlement. They possess, a strong discriminating power, because of a high rate of mutation.
  • tandem-repeated units eg [CA] e ) that mutate by gain or loss of a repetition, and come in the form of multiple states.
  • a complete tool should be available, consisting of markers with a low mutation rate, able to give "phylogenetic" information on individuals, and markers with a medium or high mutation rate, able to discriminate even related individuals.
  • SNPs and STRs simply via the same technique, even in the context of next gen sequencing (NGS) sequencing, which rarely allows to extract very reliable STRs that remain relatively heavy to use routinely in a computer.
  • NGS next gen sequencing
  • this product does not respond well to the expectations of the various targeted clients because it contains few markers with a high mutation rate, essential in forensics to discriminate very close genetic profiles, as well as molecular genealogy and basic research.
  • the few markers with a high mutation rate that it contains two of them (DYS385a and b) are duplicated and therefore unusable without a thorough knowledge of the molecular mechanisms involved in their mutation.
  • the markers included in this kit do not allow correct large-scale exploratory studies (weakly related: evolutionary genetics on the continental scale), nor correct studies on a fine scale (eg strong related in molecular genealogy or forensic medicine).
  • the intrinsic characteristics of 5 of the remaining markers do not allow to consider modeling studies to provide reliable statistics on mutation rates.
  • the inventor has succeeded in designing a method for characterizing a DNA sample based on a set of genomic markers of the same type, which makes it possible to determine the high-resolution genetic fingerprint of a subject without presenting the aforementioned drawbacks.
  • the set of markers according to the invention is usable not only on perfect DNAs, but also on medium-quality DNAs (old DNA or serum).
  • a first aspect of the invention therefore relates to a method for characterizing a human or chimpanzee DNA sample comprising a step of:
  • the present invention also relates to a kit comprising means for determining the alleles of at least 10 STR loci, a sample of human or chimpanzee DNA, the loci being selected from the group M2, wherein:
  • DYS570 DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541, DYS576, DYS513, DYS458, DYS481, DYS612, DYS444 and DYS533.
  • allele refers to one of the different forms of a DNA sequence occupying the same locus.
  • locus refers to a specific position on a chromosome.
  • STR Short Tandem Repeat
  • Tandem repeat sequences or microsatellite refers to all sequences between 2 and 7 nucleotides that are repeated in tandem.
  • the present invention relates to a method for characterizing a sample of human or chimpanzee DNA comprising a step of: determination of the alleles of at least 10 STR loci of the DNA sample, the loci being chosen from the group M2,
  • DYS570 DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541, DYS576, DYS513, DYS458, DYS481, DYS612, DYS444 and DYS533.
  • the method according to the invention makes it possible to determine the genetic profile of a subject.
  • This method has the advantage of being both usable to determine the genetic profile of a man and that of a chimpanzee.
  • the STRs Group M2 have high mutation rates between 3,32x10 ⁇ 03 mut / locus / generation and 1 45x10 "02 mut locus / generation (see Table 1). Due to their high mutation rate, these markers allow discrimination of relatively similar profiles, ie individuals with a close common ancestor in the past, ie with profiles that are found on a small geographic scale (regional, national), and / or genealogically bound.
  • the method according to the invention further comprises the step of determining the alleles of at least 10 STR loci of the DNA sample, the loci being chosen from the M1 group,
  • Group 1 consists of:
  • STR M1 group have an intermediate transfer rates between 3,85x10 "04 mut / locus / generation and 3,21x10" 03 mut / locus / generation (see Table 1). Due to their lower mutation rate, compared to the existing markers included in the AmpFISTR®Yfiler, these markers allow discrimination of relatively divergent profiles, i.e. found on a large geographical scale (national, continental).
  • the determination of the alleles of the STR loci of the M1 group thus makes it possible to characterize individuals without direct family ties or kinships that are very far apart in time (evolutionary scale).
  • the combination of the determination of alleles of the M2 group with that of the M1 group makes it possible to discriminate both individuals with very similar genetic profiles which is essential in forensic medicine but also to provide phylogenetic information about the phylogeographic origin of 'an individual.
  • the method according to the invention comprises the determination of the alleles of 10 to 50 STR loci, preferably the alleles of 10 to 40 STR loci, more preferably the alleles of 10 to 32 STR loci.
  • the alleles of 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32 loci can be determined.
  • 14 markers in M2 may be used to characterize a DNA sample from each of these individuals.
  • Whether the method is used to discriminate individuals from different continents or to study the phylogeographic origin of individual markers of 1 and 10 of M2 may be used to characterize a DNA sample from each of these individuals.
  • the alleles of the 32 loci are determined.
  • STR loci depends on the desired use.
  • STR loci with a high mutation rate will be favored, which has a greater discriminating power.
  • the mutation rates of the different loci are described in Table 1 below and ranked in ascending order of their mutation rate in humans.
  • the molecular description of the STRs corresponding to these loci are given in Kayser et al. 2004 and Ballantyne et al. 2010.
  • allelic range Another criterion allowing the choice of the STR loci is the allelic range. These ranges are described in Tables 8A, 8B, 9A and 9B Plus the allelic ranges are large plus the STR loci potentially has significant discriminating power.
  • the 'pure' (eg (CA) n) patterns will be favored over the 'compound' motifs, ie the interrupted repeated motifs (eg CA3TGCT (CA) n).
  • the markers according to the invention are male markers. Indeed, the loci are located on the Y chromosome, making it possible to generate a specifically male genetic profile. Obtaining an optimal male genetic profile is a real challenge in many fields not only in forensic medicine, since more than 97% of assaults are perpetrated by men but also in the context of paternity testing, genetic genealogy and history of settlement in order to trace the history of male lines of homo-sapiens.
  • the method for characterizing a DNA sample can be performed on a sample whose sex has not been determined beforehand.
  • this method since this method is based on male markers, it will only give results if the sample comes from a male. Nevertheless, the presence of included sexing markers will make it possible to say whether this non-amplification is due to the presence of a female individual (amplified X marker only), or of a highly degraded DNA (no marker is amplified).
  • the DNA sample is a human DNA sample.
  • the genetic profile of a human being, particularly a human being, is determined for example for forensic purposes as well as for research purposes for molecular genealogy and stand history studies.
  • the DNA sample is a chimpanzee DNA sample, particularly a male chimpanzee.
  • obtaining a genetic profile can be used in particular to determine the relationships of kinships of individuals in the wild and understand the social organization of this species. It can also optimize mating strategies, avoid inbreeding and ensure the good fate of the species when the chimpanzee is in semi-captivity or captivity.
  • the method according to the invention comprises a step of providing a DNA sample.
  • the DNA sample can come from different sources.
  • sources of DNA in particular genomic DNA
  • genomic DNA are blood, sperm, hair, body hair, tissue, saliva, urine, faeces and mixtures of biological fluids.
  • the DNA sample may be fresh, old, dry or partially degraded.
  • the alleles of interest are determined.
  • the step of determining alleles comprises an amplification step such as PCR amplification.
  • Loci alleles can be determined individually or simultaneously. Preferably, this amplification is performed simultaneously for several loci. This type of amplification is called multiplex amplification. Multiplex amplification is a process for simultaneously amplifying several loci in a single reaction. These multiplex amplifications have been widely described in the literature (Duchenne Muscular Dystrophy (Chamberlain, JS, et al., 1988), "Deletion Screening of the Duchenne Muscular Dystrophy Loci via Multiplex DNA Amplification," orral, N. and Estivill, X.
  • Multiplex amplifications are generally performed by PCR. This is called multiplex PCR.
  • the amplification step may generally comprise one or more of the following steps: denaturation of the DNA so that it is in single-stranded form,
  • primer pairs for each of the STRs one primer of each pair being substantially complementary to one part of the sequence in the sense strand and the other primer of each pair being substantially complementary to a different part of the same sequence on the complementary antisense strand,
  • the amplification step comprises the addition of at least 10 pairs of primers adapted to amplify the STR loci according to the invention.
  • the amplification step comprises adding 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32 pairs of primers adapted to amplify the STR loci according to the invention.
  • the primer pairs have the nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • DYS632 19 cacagtttcagtcttgcatgg 20 tctgggcaacagaaggagac
  • the DNA sample is a chimpanzee DNA sample and the primer pairs have the nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • the PCR extension products can be detected by fluorescent markers conjugated to the PCR amplification primers (see for example WO2009 / 059049).
  • PCR products can also be detected by other techniques such as, for example, the staining of amplification products such as silver staining, radioisotopes, by chemiluminescence.
  • fluorescent markers are FAM (5-carboxyfluorescein, fluorescent in blue), VIC® (fluorescent in green, available from Life Techologies), NED TM (fluorescent in yolk available from Life Techologies) and PET® ( fluorescent in the red available from Life Techologies), TET (tetrachlorofluorescein, fluorescent in the green), and HEX (6-carboxy 2,4,7,4,7-hexachlorofluorescein, fluorescent in the yolk).
  • FAM fluorboxyfluorescein, fluorescent in blue
  • VIC® fluorescent in green, available from Life Techologies
  • NED TM fluorescent in yolk available from Life Techologies
  • PET® fluorescent in the red available from Life Techologies
  • TET tetrachlorofluorescein, fluorescent in the green
  • HEX 6-carboxy 2,4,7,4,7-hexachlorofluorescein, fluorescent in the yolk
  • the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of at least 15 STR loci selected from the M1 group.
  • M1 group STRs have a low to intermediate mutation rate.
  • Their mutation rate is between 3,85x10 ⁇ 04 mut / locus / generation and 3,21x10 "03 mut / locus / generation (see Table 1) Due to their relatively low mutation rate, compared to the main markers These markers, like those of the AmpFistr®Yfiler, allow for relatively divergent profile discrimination, ie that can be found on a large geographical scale, for example at the level of countries or continents.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of 15, 16, 17 or 18 STR loci selected from the M1 group. In a preferred embodiment, the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of the 18 STR loci of the M1 group.
  • the method for characterizing a sample comprises the step of determining the alleles of at least 11 STR loci selected in the M2 group.
  • STRs in the M2 group have a high mutation rate.
  • Their mutation rate is between 3.32x10 "03 mut / locus / generation and 1.45x10 " 02 mut / locus / generation (see Table 1). Due to their high mutation rate, these markers allow discrimination of relatively similar profiles, i.e. that can be found on a small geographical scale, for example on the scale of a region.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of 11, 12, 13 or 14 STR loci selected in the M2 group. In another preferred embodiment, the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of the 14 STR group M2 loci.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of the 14 STR loci in the M2 group only. In this embodiment, the method does not include determining alleles of STR loci other than those of the M2 group.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises a step of determining alleles:
  • the loci whose alleles are determined are at least DYS485, DYS588, DYS461, DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511 and DYS565 for the M1 group and / or at least DYS570, DYS510, DYS541. , DYS576, DYS458, DYS481, DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 and DYS444 for the M2 group.
  • the loci whose alleles are determined are at least DYS485, DYS588, DYS461, DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511, DYS565, DYS578, DYS556 and DYS538 for the M1 group and / or at least DYS570, DYS510. , DYS541, DYS576, DYS458, DYS481, DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 and DYS444 for the M2 group.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises a step of determining alleles:
  • the method for characterizing a DNA sample comprises a step of determining the alleles of the 18 M1 STR loci and the 14 M1 STR loci.
  • the method for characterizing a DNA sample comprises the step of determining the alleles of the 18 M1 STR loci and the 14 M1 STR loci only. In this embodiment, the method does not include determining alleles of STR loci other than those of groups M1 and M2.
  • the combination of the STR loci of the two sets M1 and M2 allows to obtain very informative genetic profiles, providing information as well on the links existing between individuals little as strongly related.
  • the method for characterizing a DNA sample can be performed on a sample whose sex has not been determined beforehand. In this case, since this method is based on male markers, it will only give results if the sample comes from a male.
  • the method for characterizing a DNA sample is used on a sample which is known to be from a male.
  • the method for characterizing a DNA sample may further comprise a step of determining the sex of the subject from which the DNA sample originates.
  • the step of determining the sex of a DNA sample which comprises a step of amplifying the SRY, UTY and UTX genes of the DNA sample.
  • the 3 markers having sizes of 81 (SRY), 91 (UTY) and 120 (UTX) bp when the sample comes from a man or a chimpanzee the decreasing amplification of these 3 markers informs us on the degree of fragmentation of the sample. This is particularly interesting when using this method of sex determination before determining the genetic profile of a subject further.
  • the step of amplifying the SRY, UTY and UTX genes comprises adding primer pairs having the nucleic sequences:
  • the present invention also relates to a kit comprising means for determining the alleles of at least 10 STR loci of a human or chimpanzee DNA sample, the loci being selected from the M1 group and / or the M2 group, wherein : the group M1 consists of:
  • DYS570 DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541, DYS576, DYS513, DYS458, DYS481, DYS612, DYS444 and DYS533.
  • the present invention also relates to a kit comprising means for determining the alleles of at least 10 STR loci of a human or chimpanzee DNA sample, the loci being selected from the group M2, wherein:
  • DYS570 DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541, DYS576, DYS513, DYS458, DYS481, DYS612, DYS444 and DYS533.
  • the kit may include means for determining alleles of STR loci other than those in the M2 group.
  • the alleles to be determined be limited.
  • the kit may include means for determining alleles of 10 to 50 STR loci, preferably alleles of 10 to 40 STR loci, more preferably alleles of 10 to 32 STR loci.
  • the kit comprises the means for determining the alleles of 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31 or 32 STR loci.
  • the kit comprises at least 10 pairs of primers adapted to amplify the STR loci, the loci being selected from Group 1 and / or the M2 group.
  • the kit comprises 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32 pairs of primers.
  • the DNA sample is a sample of human or chimpanzee DNA and the at least 10 primer pairs have the nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • the DNA sample is a chimpanzee DNA sample and the at least 10 primer pairs have the nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • the DNA sample is a sample of human or chimpanzee DNA and the kit comprises primer pairs having nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • the kit may comprise at least 10 pairs of primers adapted to amplify the STR loci and
  • primer pairs have nucleic sequences selected from the group consisting of:
  • the kit comprises means for determining the alleles of at least 15 STR loci selected from the M1 group.
  • the kit comprises means for determining the alleles of 15, 16, 17 or 18 loci selected from the M1 group.
  • the kit comprises means for determining the alleles of the 18 loci of the M 1 group.
  • the kit comprises means for determining the alleles of at least the DYS485, DYS588, DYS461, DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS51 1 and DYS565 loci, more preferably at least DYS485 loci, DYS588, DYS461, DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511, DYS565, DYS578, DYS556 and DYS538.
  • the kit comprises primer pairs having the nucleic sequences:
  • pairs of primers correspond to the primer pairs adapted to amplify the STR loci of the M1 group. They can be used for both a human DNA sample and a chimpanzee DNA sample. M1 group STRs have a low to intermediate mutation rate. These markers allow discrimination of relatively divergent profiles.
  • the kit comprises means for determining the alleles of at least 11 STR loci selected in the M2 group.
  • the kit comprises means for determining alleles of 1, 12, 13 or 14 loci selected from group 2.
  • the kit comprises means for determining the alleles of the 14 loci of the M2 group.
  • the kit comprises means for determining the alleles of the 14 loci of the M2 group only. In this embodiment, the method does not include determining alleles of STR loci other than those of group 2.
  • the kit comprises means for determining the alleles of at least the DYS570, DYS510, DYS541, DYS576, DYS458, DYS481, DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 and DYS444 loci.
  • the DNA sample is a sample of human or chimpanzee DNA and the kit comprises primer pairs having the nucleic sequences:
  • STRs in the M2 group have a high mutation rate. These markers allow discrimination of profiles on a smaller scale, for example at the scale of a region.
  • the DNA sample is a chimpanzee DNA sample and the kit comprises the primer pairs having the nucleic sequences:
  • the kit includes means for determining the alleles:
  • the kit comprises means for determining the alleles:
  • the kit comprises means for determining the 18 STR loci of the M1 group and the 14 STR loci of the M2 group.
  • the DNA sample is a sample of human or chimpanzee DNA and the kit comprises primer pairs having the nucleic sequences:
  • the DNA sample is a chimpanzee DNA sample and the kit comprises the primer pairs having the nucleic sequences:
  • the kit further comprises gender determination means, wherein the gender determination means comprises SRY, UTY and UTX gene amplification means.
  • the SRY, UTY and UTX gene amplification means comprise the primer pairs having the nucleic sequences:
  • the present invention also relates to the use of a kit as defined above for carrying out the method according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for determining the sex of a DNA sample.
  • the present invention also relates to a method for determining the sex of a DNA sample which comprises a step of amplifying the SRY, UTY and UTX genes of the DNA sample.
  • Amplification of UTX only in the absence of SRY and UTY indicates that the DNA sample is from a female subject.
  • the amplification of the 3 markers, UTY, SRY and UTX indicates that the DNA sample is from a male subject.
  • the amplification of 2 markers, SRY, and UTX, in the absence of UTY, indicates that the DNA sample is from a male subject, but that there is a mutation at the hybridization site of UTY primers, or a deletion of this gene, not allowing its amplification (frequent case which is often specific population).
  • the method of typing sex according to the invention is applicable to prevent misidentification of sex. In addition, it is easily applicable for a broad spectrum of DNA quality.
  • This method for determining the sex of a subject makes it possible, in addition to identifying the sex, to indirectly evaluate the degradation profile of the male DNA sample studied.
  • the 3 markers having respective sizes of 81 (SRY), 91 (UTY) and 120 (UTX) bp for the human and chimpanzee sexing tool and 91 (UTY), 120 (UTX) and 165 (SRY) ) for the all primate sexing tool, the decreasing amplification (if any) of these 3 markers tells us about the degree of fragmentation of the sample. This is particularly interesting when using this method of sex determination before determining the genetic profile of a subject further.
  • the step of amplifying the SRY, UTY, and UTX genes is the amplification of 80 to 250 base pair fragments of SRY, UTX, and UTY exon.
  • exons are coding parts, they are more likely to remain conserved over time in the same species but also between species.
  • the amplified fragment may especially be between 80 and 250 base pairs, 80 and 200 base pairs or 80 and 150 base pairs.
  • the present invention also relates to a kit for determining the sex of a DNA sample in which the sex determination means comprises SRY, UTY and UTX gene amplification means.
  • the DNA sample is a DNA sample belonging to the order of primates.
  • the DNA sample may for example come from a human (Homo sapiens), Pan sp., Gorilla sp., Pongo sp. Hylobates sp., Cercopithecus sp., Erythrocebus patas, Cercocebus torquatus, Mandrillus sphinx, Lophocebus albigena, Papio sp., Macaca sp., Alouatta caraya, Saimiri sciureus, Cebus apella, Aotus trivirgatus, Callithrix jacchus, Hapalemur sp., Eulemur sp. , Microcebus sp., Lepilemur sp., Avahi sp., Propithecus sp., Lemur sp., Indri indri.
  • the DNA sample may come from Homo sapiens, Pan troglodyte troglodytes, Pan paniscus, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus pygmaeus, Lar larob, Cercopithecus cephus, Cercopithecus nictitans, Erythrocebus patas, Cercocebus torquatus, Mandrillus sphinx, Lophocebus albigena , Macaca mulatta, Macaca sylvanus, Alouatta caraya, Aotus trivirgatus, Sirmiri sciureus, Cebus apella, Callithrix jacchus, Lepilemur dorsalis, Lepilemur sahamalazensis, Lepilemur ankaranensis, Lepilemur mittermeieri, Lepilemur ruficaudatus, Lepilemur aeeclis, Microcebus murinus, Hapalemur
  • the step of amplifying the SRY, UTY, and UTX genes is the amplification of 100 to 250 base pair fragments of an exon of SRY, UTX, and
  • the step of amplifying the genes comprises adding primer pairs having the nucleic sequences:
  • the kit is a kit for determining the sex of a primate DNA sample and the SRY, UTY, and UTX gene amplification means comprises the primer pairs having the nucleic sequences:
  • the primers hybridize under stringent conditions.
  • stringent conditions are a temperature of 55 ° C in buffer or 51 ° C in this same buffer for prosimian samples.
  • the buffer may for example be composed of Multiplex PCR Master mix 2X comprising optimized concentrations (it is they who say it!) Of HotStarTaq® Plus DNA Polymerase, MgCI2, and dNTPs Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP ultrapure quality ) and Multiplex PCR Plus Buffer (contains 6 mM MgCl2; pH 8.7), Q-solution 5X, CoralLoad Dye 10X, RNase-free water ultra-pure quality, PCR-grade as in the kit QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit (ref: 206152).
  • the DNA sample is a sample of human DNA or chimpanzee.
  • the DNA sample is from a human or a chimpanzee and the gene amplification step includes adding primer pairs selected from the group consisting of:
  • 295 and 2,655,340 preferably between bases 2655,300 and 2,655,325, more preferably between bases 2655,304 and 2,655,323 of the positive strand of the human Y chromosome
  • a primer meaning between 15 and 25 base pairs hybridizing between the bases 26 202 990 and 26 203 035, preferably between the bases 26 202 995 and 26 203 030, more preferably between the bases 26 203 002 and 26203023de the strand positive of the Chimpanzee Y chromosome and
  • an antisense primer between 15 and 25 base pairs hybridizing between the bases 206 203 055 and 26 203 105, preferably between the bases 26 203 060 and 26 203 095, more preferably between the bases 26 203 069 and 26,203,088 of the negative strand of the chimpanzee Y chromosome,
  • an antisense primer between 15 and 25 base pairs hybridizing between the bases 44 929 505 and 44 929 555, preferably between the bases 44 929 515 and 44 929 550, more preferably between the bases 44 929 521 and 44,929,541 from the negative strand of the human X chromosome,
  • an antisense primer between 15 and 25 base pairs that hybridizes between the bases 447 520 and 44 44 560, preferably between the bases 447 530 and 15 44 7 550, more preferably between the bases 447,533 and 15,447,553 of the positive strand of the human Y chromosome
  • an antisense primer between 15 and 25 base pairs hybridizing between the bases 860 185 and 20 860 235, preferably between the bases 860 195 and 20 860 225, more preferably between the bases 860 200 and 20,860,220 of the positive strand of the chimpanzee Y chromosome.
  • the primers hybridize under stringent conditions.
  • stringent conditions are a temperature of 55 ° C in buffer or 51 ° C in this same buffer for prosimian samples.
  • the buffer may for example be composed of Multiplex PCR Master mix 2X comprising optimized concentrations of HotStarTaq® Plus DNA Polymerase, MgCl2, and dNTPs Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP ultrapure quality) and Multiplex PCR Plus Buffer (contains 6 mM MgCl2 pH 8.7), Q-solution 5X, CoralLoad Dye 10X, RNase-free water ultra-pure quality, PCR-grade as in the kit QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit (ref: 206152).
  • the step of amplifying the genes comprises adding primer pairs having the nucleic sequences:
  • the step of amplifying the genes comprises adding primer pairs having the nucleic sequences:
  • This last embodiment of the sex typing method is only applicable to a limited number of primates but it allows to use amplicons of very small sizes (between 80 and 120 bp) and therefore to work on the DNA is highly degraded.
  • Figure 1 shows a comparison between the mutability and the discriminating power of existing multiplexes and those of the invention (CombYpIex).
  • Figure 2 shows an example of a human profile obtained from multiplex M1.
  • the horizontal axis represents the size of the DNA fragments: on the left the small sizes, on the right the largest sizes.
  • Each peak corresponds to a STR marker.
  • Each line corresponds to a fluorochrome.
  • the gray bar above each peak is named after the marker below, and its length reflects the spectrum of all expected alleles (polymorphism).
  • the place of each potentially amplified allele is represented as a gray bar.
  • Figure 3 shows an example of a human profile obtained from the multiplex M2 combined with a sexing tool.
  • the reading codes are the same as before.
  • FIG. 4 shows an example of a chimpanzee profile obtained from the multiplex M1.
  • the reading codes are the same as before.
  • Figure 5 shows an example of a chimpanzee profile obtained from multiplex 2 combined with a sexing tool.
  • the read codes are the same as before.
  • FIG. 6 represents an example of a male profile with a UTY peak, a UTX peak and an SRY peak (profile A).
  • Figure 7 shows an example of a male profile with a UTY peak, a UTX peak but no SRY peak (B profile).
  • Figure 8 shows an example of a male profile with a UTX peak and an SRY peak but no SRY peak (C profile).
  • Figure 9 shows an example of a female profile with only a UTX peak (profile D).
  • Figure 10 shows the results of the human / chimpanzee comparison tests as a dendogram.
  • Figure 11 shows the PCA of the comparative men / chimpanzee tests.
  • Figure 12 shows a dendrogram of the results obtained in the analysis of Feakes and its derivatives, Attenborough, Starbuck and Revis.
  • EXAMPLE 1 Determination of the genetic profile of a subject
  • markers A ranking of markers according to their mutation rates, molecular structure, quality of flanking regions, and others, has been achieved.
  • the selected markers were divided into 2 multiplexes: the M1, comprising the markers having a mean mutation rate (see Table 6A and 6B), and the 2, comprising the markers having a high mutation rate (see Table 7A and 7B).
  • Alignment of about 500 bp sequences around the human-chimpanzee marker was performed for each marker.
  • the primers were modified until the designated theoretical pattern was reached / obtained, and in the case where this was not possible, the theoretical scheme was modified until satisfied.
  • the markers were then labeled labeled ('hot'), and again amplification was performed using warm primers for a male and a female individual, for both humans and chimpanzees, to see if we were getting a band at the expected size, and especially if it was unique to avoid a-specificities and duplications.
  • the primers were remodified until they reached satisfaction.
  • each marker was sequenced in order to establish a correspondence between size of the amplicon by genotyping and the actual number of repetitions corresponding to this size.
  • Table 8A summarizes the information on the markers 18 1 multiplex M1 for human samples.
  • Table 8B summarizes the information on the markers 18 1 multiplex M1 for samples of chimpanzees.
  • Table 9A summarizes information on 14 markers of 2 nd multiplex 2 and for sex markers (SRY, UTY and UTX) for human samples.
  • Table 9B summarizes information on the 14 markers of the 2 nd multiplex M2 and for the sex markers (SRY, UTY and UTX) for chimpanzee samples.
  • Table 8A Information on the 18 markers of the Multiplex M1 for human samples.
  • Table 8B Information on the 18 markers of the M1 Multiplex for chimpanzee samples.
  • Table 9A Information on the 14 markers of the M2 multiplex and for SRY, UTY and UTX for human samples.
  • Table 9B Information on the 14 markers of the M2 multiplex for chimpanzee samples (NA for not available)
  • Test of M1 and M2 multiplexes on men and chimpanzees choice of samples to maximize the observed genetic variability.
  • a sample panel of 13 men and 11 chimpanzees were tested. They were genotyped with the 2 multiplexes in order to obtain an idea of the genetic variability detected (i.e. alleles) for the M1 and M2 multiplexes, for the men and the chimpanzees.
  • the degree of polymorphism (variability) of the markers included in the 2 multiplexes was estimated for the panel.
  • the results are given in Table 10 for M1, in Table 11 for M2 and in Table 12 for the sexing tool. It is observed that the number of alleles and the variance is in agreement with the mutation rates predicted for M1 and M2, ie a larger variance for M2 (high mutation rate) than for M1.
  • the CombYpIex assembly which includes the M1 and M2 multiplexes shows a very good reproducibility and robustness, both in the man and in the chimpanzee. It can amplify 30/31 markers with sizes always less than 350 bp, it allows to make moderately degraded DNA, as tested on individuals dating from the 16th century. Discriminant capacity of CombYplex compared to AmplYfiler: Individuals same last names:
  • the CombYplex tool makes it possible to group individuals with a common surname and having a common origin, but also to detect a non-congruence between family name and Y chromosome and is a valuable ally in genealogical / patronymic analyzes.
  • discriminant capacity no. of individuals / no. the different haplotypes observed
  • a panel of 177 DNA samples was used, including 1 16 human samples, and 61 non-human primate samples from 45 different species. Human samples were obtained from healthy volunteers and samples of non-human primates came from a collection.
  • DNA samples used were extracted from different substrates including saliva, serum, whole blood, tissue and cell culture.
  • the DNA extraction process depends on the type of sample.
  • the DNA was extracted from:
  • the quantity and quality of the extracted DNA was estimated using a NanoDrop spectrophotometer.
  • PCR primers for the amplification of the SRY fragment have been published previously (Fiore et al., 2005).
  • PCR primers for co-amplification of UTX and UTY homologous regions were designed from conserved UTX / UTY regions. Sequences available in libraries for different primate species were aligned using BioEdit v.7.0.5.3. The conserved regions for each gene were used for primer design using Primer3 software v.0.4.0 to allow co-amplification of relatively small UTX and UTY fragments from sample probably comprising degraded DNA.
  • 5'-labeled sense primers with a fluorescent FAM fluorochrome (InVitrogen) were used to allow detection by capillary electrophoresis. The sequences of the primers and the sizes of the amplicons are shown in Table 6.
  • Regions of UTX, UTY and / or SRY were simultaneously amplified in a final volume of 12.5 ⁇ l consisting of 1X of PCR buffer B (Fisher Bioblock), 1.5 mM of MgCl 2 , 200 ⁇ l of each dNTP, 0. , 2 to 0.4 ⁇ l of primers, 1 U of Taq DNA polymerase (Fisher Bioblock) and 15 to 25 ng of DNA sample.
  • concentrations of the primers for each primer are given in Table 6.
  • the PCR cycle conditions are a first denaturation step at 94 ° C for 5 min followed by 40 denaturation cycles at 94 ° C for 30 s, hybridization to 55 ° C for 30s and an elongation at 72 ° C for 30s with a final elongation step at 72 ° C for 5min. It is important to note the hybridization temperature was decreased to 51 ° C for prosimian samples.
  • PCR products were first visually assayed by agarose gel electrophoresis (140V, 40min) on 2% agarose gels using SYBR Safe staining (Invitrogen).
  • agarose gel electrophoresis 140V, 40min
  • SYBR Safe staining Invitrogen
  • 1 ⁇ l of 100-fold diluted PCR products were then mixed with 0.2 ⁇ internal standard GeneScan-600LIZ and 8.8 ⁇ formamide Hi-Di. After denaturation at 95 ° C for 5 min, the samples were separated on an ABI 3730 Genetic Analyzer using POP-7. The data was analyzed using GeneMapper v. 4.0.
  • UTX, UTY and SRY were separately amplified using the primer pairs in Table 6, as previously described.
  • Each PCR product was sequenced in two reactions using the sense and antisense PCR primers.
  • the sequencing reaction was performed with a Big Dye Terminator v3.1 sequencing kit (Applied Biosystems).
  • the PCR products were separated on an ABI 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosysems). The sequences were analyzed and assembled using Sequence Scanner v1.0 software (Applied Biosystems) and the BioEdit Sequence Alignment Editor.
  • Hylobatidae Hylobates sp. 2 2 0 0
  • Female samples were identified by a single signal corresponding to 125 bp specific UTX fragments (F profile, Figure 9). On the contrary, three different profiles were observed for male samples as illustrated in Figures 6 to 8. In fact, the male samples were identified either by three signals, which corresponded to the specific fragment of X and the two specific fragments of Y (Profile A) or occasionally by two signals which corresponded to the specific fragment of X and only to one of the two fragments of the Y chromosome that is to say either SRY (C profile) or UTY (B profile). The Results obtained for each sample are given in Table 5. A typical male profile (Profile A) with both SRY and UTY fragments was observed for most samples.
  • Profile A A typical male profile with both SRY and UTY fragments was observed for most samples.
  • the sex determined with the new test was always consistent with the morphological sex.
  • Amplifications with the second sets of primers were successful for all samples and the resulting amplicon sequencing revealed that the inability to amplify the locus with the first set of primers was due to mutations in the binding of the primers.
  • the newly developed method unambiguously allows the gender of all tested samples to be determined even in the presence of a mutation in the primer region.
  • the first and main advantage of this method is that it combines two UTX / UTY and SRY independent sexing tests in an assay for exact sex determination. Indeed, 11 male specimens that did not have UTY or SRY fragments that would previously have been considered female samples based on the UTX TUY or SRY locus alone were identified as males by this approach. . This shows the need for a sex determination test that includes at least 2 Y markers for primates, thereby preventing misidentification of sex due to high structural polymorphism on the Y chromosome or mutation at the binding site. the primer.
  • the negative effect of a mutation on the primer binding site or a deletion on an amplification can be minimized since a mutation and / or deletion on both loci is unlikely to occur.
  • the second advantage of this method is its wide spectrum of application in primates. Indeed, it works on all species tested especially through the work on the design of primers. The same method works on all the species tested, but a slight optimization by reducing the hybridization temperature is preferable for sexing the distant prosimic species. This method is accessible to molecular biology laboratories with basic equipment since the size difference between the three possible amplification products is large enough to be discerned by simple agarose gel electrophoresis and an automatic sequencer is not necessary. Finally, the small size of the amplification products ( ⁇ 200bp) makes them useful for sex identification of potentially degraded samples such as serum samples and also non-invasive samples such as hair or faeces.
  • Ballantyne KN Goedbloed M, Fang R, Schaap O, Lao O, Wollstein A, Choi Y, van Duijn K, Vermeulen M, Brauer S, Decorte R, Poetsch M, von Wurmb-Schwark N, Knijff P, Labuda D, Vezina H, Knoblauch H, Lessig R, Roewer L, Ploski R, Dobosz T, Henke L, Henke J, Furtado MR, Kayser M.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour caractériser un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé comprenant une étape de: détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M2, dans lequel: le groupe M2 consiste en : Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541, DYS576, DYS513, DYS458, DYS481, DYS612, DYS444 et DYS533.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION:
La présente invention concerne un procédé et un kit pour caractériser un échantillon d'ADN d'un sujet humain ou chimpanzé en vue de déterminer le sexe et/ou l'empreinte génétique de ce sujet.
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION:
Un profil génétique correspond à la combinaison spécifique de plusieurs marqueurs permettant d'identifier un individu grâce à son ADN. Il existe essentiellement deux grands types de marqueurs pour établir un profil génétique: les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), et les STR (Short Tandem Repeat ou microsatellites).
Un SNP correspond au changement d'une base en une autre à un endroit de la séquence ADN, par exemple un changement de A en C. Il se décline donc sous la forme de 2 allèles. Les SNP se caractérisent par un taux de mutation bas (2.1 x 10"6 mutation/génération/locus) en raison de la faible fréquence à laquelle surviennent ces mutations. Ce sont d'excellents outils phylogénétiques qui nous renseignent sur l'origine phylo-géographique d'un individu. Par contre, ils ne sont pas assez discriminants pour nous renseigner sur les relations existant entre des individus étroitement apparentés, excepté s'ils sont combinés en grand nombre (> 100aine de milliers au million).
Les STR sont quant à eux, très largement utilisés dans le cadre de recherche en paternité, d'affaires de viols ou de meurtres, et en recherche fondamentale afin de reconstruire l'histoire du peuplement humain. Ils possèdent, un fort pouvoir discriminant, en raison d'un taux de mutation élevé. Ce sont des unités répétées en tandem (ex. [CA]e) qui mutent par gain ou perte d'une répétition, et se déclinent sous la forme de multiples états. Leur taux de mutation est plus ou moins élevé en fonction de leur taille, par exemple un CA6 mutera moins rapidement qu'un CA Ces différences de taux de mutation observées en fonction des motifs explique le large spectre de mutation de ces marqueurs (1.38 x 10~5 et 6.54 x 10"2 mut/gén/locus) et leur capacité à discriminer des individus plus ou moins apparentés. Si l'extrême mutabilité de certains loci (>10 3) est très utile pour discriminer des individus proches génétiquement (frères, cousins), celle-ci ne permet pas d'obtenir une information robuste sur l'origine phylo- géographique d'un individu (comme il est possible de le faire avec des SNPs). De plus, cette hyper-mutabilité peut induire une « saturation mutationnelle » i.e. que lorsque un marqueur mute trop vite, les états intermédiaires de mutations ne sont pas toujours visibles - il en résulte un taux de mutation mal estimé et des indicateurs statistiques dérivés, approximatifs et peu robustes.
Idéalement, il faudrait pouvoir disposer, d'un outil complet, constitué de marqueurs ayant un taux de mutation faible, capables de donner une information « phylogénétique » sur les individus, et de marqueurs ayant un taux de mutation moyen ou élevé, capables de discriminer les individus même apparentés. Hors techniquement parlant, obtenir SNPs et STRs simplement via une même technique, même dans le cadre de séquençage NGS (next génération sequencing), qui permettent rarement d'extraire des emrpeintes STR très fiables et qui restent surtout relativement lourdes à utiliser en routine dans un laboratoire lambda. En médecine légale et en recherche fondamentale, il existe un produit phare servant à établir un profil génétique masculin: le AmpRSTR® Yfiler© un multiplex de 17 marqueurs STR distribué par Applied Biosystems (life technologies). Cependant, ce produit ne répond pas correctement aux attentes des différents clients ciblés car il contient peu de marqueurs ayant un taux de mutation élevé, indispensables en médecine légale pour discriminer des profils génétiques très proches, ainsi qu'en généalogie moléculaire et recherche fondamentale. De plus, parmi les quelques marqueurs ayant un taux de mutation élevé qu'il contient, deux d'entre eux (DYS385a et b) sont dupliqués et de ce fait inutilisables sans une connaissance approfondie des mécanismes moléculaires impliqués dans leur mutation. Les marqueurs inclus dans ce kit, ayant des taux et pouvoir discriminant très variables, ne permettent ni de correctes études exploratoires à large échelle (faible apparentement : génétique évolutive à l'échelle continentale), ni de correctes études à fine échelle (ex. fort apparentement en généalogie moléculaire ou médecine légale). Enfin, les caractéristiques intrinsèques de 5 des 15 marqueurs restants, ne permettent pas d'envisager des études de modélisation afin de fournir des statistiques fiables sur les taux de mutation.
Deux outils similaires ont été développé par des laboratoires publics: le 20-plex (Butler et al. 2002, Forensic Sci. Int) et le 14-plex (Parkin et al. 2006, Forensic Sci. Int) : ces 2 multiplex bien que publiés, il y a 10 et 6 ans respectivement, ne se sont pas imposés dans la communauté scientifique car utiliser ces outils dans un laboratoire demanderait un lourd investissement en temps, expertise et finances afin de mettre en place le protocole dans un laboratoire. L'investissement se justifie d'autant moins que 70% des marqueurs sont déjà inclus dans l'AmpFtSTR® Yfiler®; il n'existe donc aucune réelle plus-value à les utiliser. En 2014 est apparu sur le marché le PPY23 (Promega) qui comprend de très nombreux marqueurs déjà présents dans l'AmpFtSTR® Yfiler®, et comporte les mêmes limites. Il est à noter que tous ces outils sont humains -spécifiques, et qu'il n'existe aucun équivalent de ce type d'outil pour les chimpanzés, dont la gestion et la conservation dans les parcs et réserve, nécessite une connaissance pointue des relations généalogiques entre individus.
RESUME DE L'INVENTION:
L'inventeur a réussi à concevoir un procédé pour caractériser un échantillon d'ADN reposant sur un ensemble de marqueurs génomiques du même type, qui permet de déterminer l'empreinte génétique à haute résolution d'un sujet sans présenter les inconvénients précités. L'ensemble des marqueurs selon l'invention est utilisable non seulement sur des ADN parfaits, mais aussi sur des ADN de moyenne qualité (ADN ancien ou sérum).
En effet, ces marqueurs permettent de travailler sur des fragments de taille relativement courte. Ainsi, ces marqueurs peuvent être amplifiés avec des tailles toujours inférieures à 350bp. De plus, les marqueurs selon l'invention sont fiables/simples, i.e. qu'ils peuvent être utilisés sans une connaissance approfondie des structures moléculaires. En effet, il n'y a pas de duplications, de faux allèle, et peu de structure complexe, qui soient à considérer dans l'utilisation des taux ou mécanismes de mutation associés à ces marqueurs. Un premier aspect de l'invention concerne, par conséquent, un procédé pour caractériser un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé comprenant une étape de :
- détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M2, dans lequel :
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533. La présente invention concerne également un kit comprenant des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 10 loci STR un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé, les loci étant choisis dans le groupe M2, dans lequel:
-le groupe M2 consiste en:
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Le terme « allèle » désigne une des différentes formes d'une séquence d'ADN occupant le même locus.
Le terme « locus » désigne une position spécifique sur un chromosome.
Le terme « STR » ou « Short Tandem Repeat » ou « séquences répétées en tandem » ou microsatellite désigne toutes les séquences entre 2 et 7 nucléotides qui sont répétées en tandem.
Détermination du profil génétique d'un sujet
La présente invention concerne un procédé pour caractériser un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé comprenant une étape de :
- détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M1 et/ou le groupe M2,
dans lequel :
-le groupe M1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538 et
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533. La présente invention concerne un procédé pour caractériser un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé comprenant une étape de : - détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M2,
dans lequel :
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
Le procédé selon l'invention permet de déterminer le profil génétique d'un sujet.
Ce procédé présente l'avantage d'être à la fois utilisable pour déterminer le profil génétique d'un homme et celui d'un chimpanzé.
II permet de discriminer les profils d'homme et de chimpanzé, ce dernier n'ayant ni les STRs DYS481 et ni DYS533. Les STRs du groupe M2 ont des taux de mutation élevés, compris entre 3,32x10~03mut/locus/génération et 1 ,45x10"02mut locus/génération (cf. tableau 1 ). Du fait de leur taux de mutation élevé, ces marqueurs permettent une discrimination de profils relativement similaires, c.à.d. d'individus ayant un ancêtre commun proche dans le passé càd possédant des profils que l'on retrouve à fine échelle géographique (régionale, nationale), et/ou généalogiquement lié.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend, en outre, l'étape de détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M1 ,
dans lequel :
-le groupe 1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538. Les STR du groupe M1 ont un taux de mutation intermédiaire compris entre 3,85x10" 04mut/locus/génération et 3,21x10"03mut/locus/génération (cf. tableau 1 ). Du fait de leur taux de mutation plus faible, comparés aux marqueurs existants inclus dans l'AmpFISTR®Yfiler, ces marqueurs permettent une discrimination de profils relativement divergents, c.à.d. que l'on retrouve à large échelle géographique (nationale, continentale).
La détermination des allèles des loci STR du groupe M1 permet donc de caractériser des individus sans lien de parenté direct ou de parenté très éloignée dans le temps (échelle évolutive). La combinaison de la détermination des allèles du groupe M2 avec celle du groupe M1 permet de discriminer à la fois des individus ayant des profils génétiques très proches ce qui est indispensable en médecine légale mais aussi de donner une information phylogénétique sur sur l'origine phylogéographique d'un individu.
Afin d'éviter des analyses lourdes et coûteuses, il est préférable de déterminer un nombre limité d'allèles de loci STRs. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend la détermination des allèles de 10 à 50 loci STR, préférablement les allèles de 10 à 40 loci STR, plus préférablement les allèles de 10 à 32 loci STR.
Typiquement, les allèles de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 loci peuvent être déterminés.
Le choix du nombre de loci est fonction de l'utilisation souhaitée.
Si le procédé est utilisé pour discriminer des individus très fortement apparentés, 14 marqueurs dans M2 pourront être utilisés pour caractériser un échantillon d'ADN provenant de chacun de ces individus.
Si la méthode est utilisée pour discriminer des individus provenant de continents différents ou pour étudier l'origine phylo-géographique d'individus 10 marqueurs de 1 et 10 de M2 pourront être utilisés pour caractériser un échantillon d'ADN provenant de chacun de ces individus.
Dans un mode de réalisation préféré, les allèles des 32 loci sont déterminés.
De même le choix des loci STR est fonction de l'utilisation souhaitée.
De manière générale, on privilégiera les loci STR présentant un taux de mutation élevé qui présente donc un pouvoir discriminant plus important.
Les taux de mutations des différents loci sont décrits dans le tableau 1 ci-dessous et classés par ordre croissant de leur taux de mutation chez l'homme. La description moléculaire des STR correspondant à ces loci sont donnés dans Kayser et al. 2004 et Ballantyne et al. 2010.
Locus ID Détails de
Localisation de
(Kayser localisation détails Taux de
GBD ID Groupe bande
et al. (rétrotransposition, mutation
chromosomique
2004) gène...) médian
bayésien
LINE1 L
DYS502 1 Y3S60 Yq11.221 3,85E-04
NLGN4Y mRNA
DYS575 M1 Y4S49 Yp11.2 Alu L 3,91 E-04
DYS588 M1 Y5C23 Yq11.221 Alu R 3,92E-04
Aucune
DYS538 M1 Y4C32 Yq11.221 3,94E-04 retransposition
DYS632 M1 BV005731 Yq11.221 Alu R 3,97E-04
DYS640 M1 Y4S38 Yq11.221 Alu L etLINEI R 3,98E-04
DYS485 M1 Y3S1 Yq 11.222 Alu R et LINEI L 4,04E-04
DYS577 M1 Y4S54 Yq11.221 Alu R 4,11 E-04
DYS461/
M1 - Yq 11.222 L1 L famille LINE 9,89E-04 Y-GATA-A7.2
Alu L, LINE ERV1
DYS578 1 Y4S56 Yq 11.223 9,95E-04
R
DYS638 1 Y4S26 Yq11.221 Alu R 1 ,04E-03 Aucune
(mais proche
DYS511 M1 Y4C114 Yq11.221 1 ,52E-03 d'une autre
simple répétition)
DYS556 M1 Y4C75 Yq 11.223 LINE1 L et R 1 ,59E-03
DYS565 M1 Y4S18 Yq11.221 Alu L 2,09E-03
Aucune
DYS587 M1 Y5C22 Yq11.221 2,62E-03 retransposition
DYS508 M1 Y4C109 Yq11.221 Aucune 3,03E-03
DYS517 1 Y4C126 Yq11.221 Aucune 3,21 E-03
DYS643 M1 Y5C20 Yq11.221 LINE1 R 1 ,50E-03
Y-GATA-A10 2 - Yq11.221 Aucune 3,32E-03
DYS541 2 Y4C36 Yq11.221 LINE1 R 3,92E-03
DYS549 M2 Y4C52 Yq 11.222 LINE1 L et R 4,55E-03
DYS481 M2 Y3C59 Yp11.2 Aucune 4,97E-03
Aucune
DYS533 M2 Y4C215 Yq11.221 (proche d'un autre 5,01 E-03
Y-STR)
DYS444 M2 Y4C37 Yq11.221 Tigger2a DNA R 5,45E-03
Aucune
(mais proche
DYS510 M2 Y4C113 Yq11.221 5,99E-03 d'une autre simple
répétition)
DYS513 M2 Y4C116 Yq11.221 Aucune 6,09E-03
DYS460/ (L1 R famille
2 - Yq 11.222 6,22E-03 Y-GATA-A7.1 LINE)
DYS458 M2 - Yp11.2 Alu L et R 8,36E-03
DYS442 M2 - Y1 1q21 LINE1 L et R 9J8E-03
5'UTR du gène
DYS570 2 Y4S4 Yp11.2 TBL1 Y (codant 1 ,24E-02 pour une protéine)
DYS576 M2 Y4S5 Yp11.2 Alu L 1.43E-02
DYS612 M2 Y3C22 Yq11.221 Aucune 1 ,45E-02
Tableau 1
Dans un second temps, un autre critère permettant le choix des loci STR est la gamme allèlique. Ces gammes sont décrites aux tableaux 8A, 8B, 9A et 9B Plus les gammes alléliques sont grandes plus le loci STR a potentiellement un pouvoir discriminant important.
Enfin, on privilégiera les motifs 'purs' (ex. (CA)n) aux motifs 'composés' cad aux motifs répétés interrompus (ex. CA3TGCT(CA)n). Les marqueurs selon l'invention sont des marqueurs masculins. En effet, les loci sont situés sur le chromosome Y, permettant de générer un profil génétique spécifiquement masculin. L'obtention d'un profil génétique masculin optimal représente un réel enjeu dans de nombreux domaines non seulement en médecine légale car plus de 97% des agressions sont perpétrées par des hommes mais également dans le cadre de test de paternité, en généalogie génétique et en histoire du peuplement afin de retracer l'histoire des lignées masculines d'homo-sapiens. Le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN peut être réalisé sur un échantillon dont le sexe n'a pas été déterminé au préalable. Dans ce cas, étant donné que ce procédé est basé sur des marqueurs masculins, il ne donnera des résultats que si l'échantillon provient d'un mâle. Néanmoins, la présence de marqueurs de sexage inclus permettra de dire si cette non amplification est dûe à la présence d'un individu féminin (marqueur X amplifié uniquement), ou d'un ADN très dégradé (aucun marqueur n'est amplifié).
Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain. Le profil génétique d'un être humain, en particulier d'un homme, est déterminé par exemple à des fins de médecine légale mais aussi à des fins de recherche pour des études de généalogie moléculaire et d'histoire du peuplement.
Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN de chimpanzé, en particulier un chimpanzé mâle. Pour le chimpanzé, l'obtention d'un profil génétique peut notamment être utilisée afin de déterminer les relations de parentés des individus en milieu naturel et comprendre l'organisation sociale de cette espèce. Elle peut également permettre d'optimiser les stratégies d'accouplement, éviter la consanguinité et assurer le bon devenir de l'espèce lorsque le chimpanzé est en semi-captivité ou captivité. Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape de fourniture d'un échantillon d'ADN.
L'échantillon d'ADN peut provenir de différentes sources. Des exemples de sources d'ADN, en particulier d'ADN génomique, sont le sang, le sperme, les cheveux, les poils, les tissus, la salive, les urines, les fèces et des mélanges de fluides biologiques. L'échantillon d'ADN peut être frais, ancien, sec ou partiellement dégradé.
Les procédés de préparation d'un échantillon d'ADN en vue de déterminer les allèles de loci STR sont connus. Par exemple, de tels procédés sont décrits dans Patel, P. I., et al. (1984) "Organization of the HPRT gene and related séquences in the human génome," Somat Cell Mol Genêt 10: 483-493, and Gill, P., et al. (1985) "Forensic application of DNA 'fingerprints'," Nature 318: 577-579.
A partir de l'échantillon d'ADN, les allèles d'intérêt sont déterminés.
Différents procédés de détermination des allèles de loci STR sont connus. Des exemples de telles technologies comprennent le séquençage d'ADN ou des techniques d'amplification d'ADN telles que la PCR (« polymerase chain reaction » ou « réaction de polymérisation en chaîne »). Ces techniques qui peuvent être utilisées en combinaison avec des technologies de détection telles que l'électrophorèse, la spectrométrie de masse, etc.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape de détermination des allèles comprend une étape d'amplification telle qu'une amplification par PCR. Les allèles de loci peuvent être déterminés individuellement ou simultanément. De préférence, cette amplification est réalisée simultanément pour plusieurs loci. Ce type d'amplification est appelée amplification multiplex. L'amplification multiplex est un procédé pour amplifier simultanément plusieurs loci dans une seule réaction. Ces amplifications multiplex ont largement été décrites dans la littérature (Duchenne Muscular Dystrophy (Chamberlain, J. S., et al. (1988) "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification"; orral, N. and Estivill, X. (1992) "Multiplex PCR amplification of three STR within the CFTR gene," Genomics 51 : 1362- 1364); Kimpton, C. P., et al. (1993) "Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci," PCR Methods and Applications 3: 13-22; Hammond; Schumm, J. W. et al. (1994) "Development of nonisotopic multiplex amplification sets for analysis of polymorphic STR loci," in "The Fourth International Symposium on Human Identification 1993," pp. 177-187).
Les amplifications multiplex sont généralement réalisées par PCR. On parle alors de PCR multiplex.
L'étape d'amplification peut généralement comprendre une ou plusieurs des étapes suivantes : -la dénaturation de l'ADN afin qu'il soit sous forme simple brin,
-l'ajout de paires d'amorces spécifiques pour chacun des STR, une amorce de chaque paire étant substantiellement complémentaire d'une partie de la séquence dans le brin sens et l'autre amorce de chaque paire étant substantiellement complémentaire d'une partie différente de la même séquence sur le brin anti-sens complémentaire,
-l'hybridation des paires d'amorces à leur séquence complémentaire,
-l'élongation simultanée des amorces hybridées à partir de l'extrémité 3' de chaque amorce pour synthétiser un produit d'élongation complémentaire du brin hybridé à chaque amorce, dit produit d'élongation, lesdits produits d'élongation, après séparation de leur complément servent de matrices pour la synthèse d'un produit d'élongation pour l'autre amorce de chaque paire,
-la séparation des produits d'élongation des matrices pour produire des molécules simples brins,
-l'amplification des molécules simple brin en répétant au moins une fois les étapes d'hybridation, d'élongation et de séparation.
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification comprend l'ajout d'au moins 10 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification comprend l'ajout de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, les paires d'amorces ont les séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en:
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 , SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 1 1 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO 13 et SEQ ID NO 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO 21 et SEQ ID NO 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO 23 et SEQ ID NO 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO 25 et SEQ ID NO 26 pour le locus DYS51 1 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO 29 et SEQ ID NO 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO 31 et SEQ ID NO 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO 33 et SEQ ID NO 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO 35 et SEQ ID NO 36 pour le locus DYS538,
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO 57 et SEQ ID NO 58 pour le locus DYS481
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO 60 pour le locus DYS612,
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO 62 pour le locus DYS444 et
SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO 64 pour le locus DYS533.
Les séquences des amorces des différents modes de réalisation de l'invention dans lesquels l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé sont données dans le tableau 2 ci-dessous.
Amorce sens Amorce anti-sens
Marqueur SEQ SEQ ID
Séquence (5'-3') Séquence (5'-3') ID NO NO
catataacaaaattgaatgtgtactc
DYS485 1 2 agcctgggtgacaagagttatac
c
DYS588 3 gaatgcagaaccctcaagga 4 agcctgggtgacagaaacac
DYS502 5 cag caag ccaccataccata 6 Tgtgcttttggagtttggag DYS461 /
aatacataataaatgataggcaga
Y-GATA- 7 8 gagagctgaataagttgtatcaggtaa gga
A7.2
DYS638 9 ttctaatttcagtgctttcaattttc 10 Aggtgggtcatgaggtcagt
DYS643 1 1 aag ccatg cctggttaaactac 12 accaaacaccacccattcc
aaagtctgacaatgagaagggtttctaagtt
DYS587 13 cttctttggaaagtagcatttcat 14
cagg
DYS575 15 cagaggttccagtaagcttagatca 16 Cattgatgggctttaggttga
DYS578 17 gaggcggaactttcagtgag 18 cagaagtcccctgtgtttcaa
DYS632 19 cacagtttcagtcttgcatgg 20 tctgggcaacagaaggagac
DYS508 21 acaatgg caatcccaaattc 22 gaacaaataaggtgggatggat
DYS640 23 ggaaaaaccatgagatcctgtc 24 aag cccgttcatattttaaagac
DYS511 25 tggggtggatgtgtaggtaga 26 Tctggttgtgccttagatttga
DYS577 27 tttttctacgtgtgtatccactaacc 28 Gtgtccccagccctgtta
DYS556 29 tcaccaatgacattttacagca 30 ttggttagtgtaatgcatccag
DYS517 31 aactgaccagcaaaaatgttaaa 32 tgtctgagacctacaagattgc
DYS565 33 ccaggaagcagtgttgcat 34 Gcagttctctgcctgtatgg
DYS538 35 ttggggaaaacagatggtgt 36 ccaaatacccatcataggaagaa
Y-GATA-
37 cctg ccatctctatttatcttg catata 38 ataaatggagatagtgggtggatt
A10
DYS570 39 tgtgacatcaaggttatgaaacg 40 ggtgaaaattattcagcatagtcaag gaaaagaaaagtgtaagccaaac
DYS549 41 42 tttggtggcataagtggtaatg
c
DYS460 43 atcctctg cctatcatttattatgtat 44 gaataccagaggaatctgacacc
DYS442 45 tgcaaaatcacggaaccaa 46 Caag cca ctg caaatg tca
DYS510 47 tttttcctcccttaccacaga 48 tctggagaagacagaacttgtca
DYS541 49 catcattaattctatctgttcatccat 50 tggataaagaacacctttaagaagc
DYS576 51 ccaag caacatag caag acct 52 Aagcgtatttgtcttggctttt
tgttgtaaaaatgactactgtggtat
DYS513 53 54 ccacatcag cactattacttaactca g
DYS458 55 tgggtggtggaggttactgt 56 cccaaagttctggcattacaa
DYS481 57 aggaatgtggctaacgctgt 58 accagaaggttgcaagactca
DYS612 59 cccccatg ccag taagaata 60 tgagggaaggcaaaagaaaa
DYS444 61 catagaatgaaaggtgtgaacca 62 Tgccattcaaactcacgttg
DYS533 63 attcatctaacatctttgtcatctacc 64 Ttaacttg cctttttg catcc
Tableau 2 Notons cependant que le locus DYS481 est absent chez le chimpanzé, et que le locus DYS533, même s'il est théoriquement présent sur le génome assemblé du chimpanzé (XXX), il n'a jamais pu être amplifié en phase de test - il est donc considéré comme non amplifié en M2. Par conséquent, dans un mode réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN de chimpanzé et les paires d'amorces ont les séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en:
SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO 11 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS511 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538,
SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO : 41 et SEQ ID NO : 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO : 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO : 51 et SEQ ID NO : 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO : 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 60 pour le locus DYS612 et
SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 62 pour le locus DYS444.
Dans certains modes de réalisation, les produits d'élongation de la PCR peuvent être détectés grâce à des marqueurs fluorescents conjugués aux amorces d'amplification de la PCR (voir par exemple WO2009/059049). Les produits de PCR peuvent également être détectés par d'autres techniques comme par exemple la coloration des produits d'amplification telles que la coloration à l'argent, les radio- isotopes, par chimioluminescence.
Des exemples de marqueurs fluorescents sont FAM (5-carboxyfluorescéine, fluorescent dans le bleu), VIC® (fluorescent dans le vert, disponible auprès de Life Techologies), NED™ (fluorescent dans le jaune disponible auprès de Life Techologies) et PET® (fluorescent dans le rouge disponible auprès de Life Techologies), TET (tétrachlorofluorescéine, fluorescent dans le vert), et HEX (6-carboxy 2,4,7,4,7-hexachlorofluorescéine, fluorescent dans le jaune).
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles d'au moins 15 loci STR choisis dans le groupe M1.
Les STR du groupe M1 ont un taux de mutation bas à intermédiaire. Leur taux de mutation est compris entre 3,85x10~04mut/locus/génération et 3,21x10"03mut/locus/génération (cf. tableau 1 ). Du fait de leur taux de mutation relativement faible, par rapport aux principaux marqueurs existants comme ceux de l'AmpFISTR®Yfiler, ces marqueurs permettent une discrimination de profils relativement divergeant, c.à.d. que l'on retrouve à large échelle géographique, par exemple à l'échelle de pays ou de continents.
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles de 15, 16, 17 ou 18 loci STR choisis dans le groupe M1. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles des 18 loci STR du groupe M1.
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon comprend l'étape de détermination des allèles d'au moins 11 loci STR choisis dans le groupe M2
Les STR du groupe M2 ont un taux de mutation élevé. Leur taux de mutation est compris entre 3,32x10"03mut/locus/génération et 1 ,45x10"02mut/locus/génération (cf. tableau 1 ). Du fait de leur taux de mutation élevé, ces marqueurs permettent une discrimination de profils relativement similaires, c.à.d. que l'on retrouve à fine échelle géographique, par exemple à l'échelle d'une région.
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles de 11 , 12, 13 ou 14 loci STR choisis dans le groupe M2. Dans un autre mode de réalisation préféré, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles des 14 loci STR du groupe M2.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles des 14 loci STR du groupe M2 seulement. Dans ce mode de réalisation, le procédé ne comprend pas la détermination d'allèles de loci STR autres que ceux du groupe M2.
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend une étape de détermination des allèles :
-d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe 1 ,
et/ou
-d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M2. Dans un mode de réalisation préféré, les loci dont les allèles sont déterminés sont au moins DYS485, DYS588, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511 et DYS565 pour le groupe M1 et/ou au moins DYS570, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 et DYS444 pour le groupe M2.
Plus préférablement, les loci dont les allèles sont déterminés sont au moins DYS485, DYS588, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511 , DYS565, DYS578, DYS556 et DYS538 pour le groupe M1 et/ou au moins DYS570, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 et DYS444 pour le groupe M2.
Dans un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend une étape de détermination des allèles :
-de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 loci STR choisis dans le groupe M1 ,
et/ou
-de 10, 1 1 , 12, 13 ou 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend une étape de détermination des allèles des 18 loci STR du groupe M1 et des 14 loci STR du groupe M2.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN comprend l'étape de détermination des allèles des 18 loci STR du groupe M1 et des 14 loci STR du groupe M2 seulement. Dans ce mode de réalisation le procédé ne comprend pas la détermination d'allèles de loci STR autres que ceux des groupes M1 et M2.
La combinaison des loci STR des deux ensembles M1 et M2 permet d'obtenir des profils génétiques très informatifs, renseignant aussi bien sur les liens existants entre individus peu comme fortement apparentés.
Il est également intéressant d'utiliser l'ensemble des loci des groupes M1 et 2 dans des populations à faible diversité génétique.
Par exemple, chez les chimpanzés, cette espèce ayant subi d'importantes réductions d'effectifs, sa diversité génétique s'est grandement affaiblie. Par conséquent, l'utilisation de l'ensemble des marqueurs permettra une discrimination maximale très utile sur ce type de population à faible diversité génétique.
Le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN peut être réalisé sur un échantillon dont le sexe n'a pas été déterminé au préalable. Dans ce cas, étant donné que ce procédé est basé sur des marqueurs masculins, il ne donnera des résultats que si l'échantillon provient d'un mâle.
De préférence, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN est utilisé sur un échantillon dont il est connu qu'il provient d'un mâle.
Selon un mode de réalisation, le procédé pour caractériser un échantillon d'ADN peut comprendre en outre une étape de détermination du sexe du sujet dont provient l'échantillon d'ADN.
Des procédés de détermination du sexe d'un sujet sont connus. La plupart de ces procédés reposent sur l'amplification du gène de l'amélogénine sur X et Y (cf. Sullivan et al. 1993, Ensminger et Hoffman 2002). De tels procédés sont disponibles dans le commerce via des kits tels que le PowerPlex16 (Promega) et l'AmpF/STR Identifiler (Life technologies). Plus rares, il existe également des procédés de détermination du sexe reposant sur l'amplification de deux loci distincts sur les chromosomes sexuels (i.e. DXS8378, DXS6803 sur le chromosome X et SRY sur le chromosome Y).
Selon un mode de réalisation, l'étape de détermination du sexe d'un échantillon d'ADN qui comprend une étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX de l'échantillon d'ADN. Ce procédé pour déterminer le sexe d'un sujet permet, outre l'identification du sexe, d'évaluer indirectement le profil de dégradation de l'échantillon d'ADN masculin étudié.
En effet, les 3 marqueurs ayant des tailles de 81 (SRY), 91 (UTY) et 120 (UTX) bp lorsque l'échantillon provient d'un homme ou d'un chimpanzé, l'amplification décroissante de ces 3 marqueurs nous renseigne sur le degré de fragmentation de l'échantillon. Ceci est particulièrement intéressant lorsqu'on utilise ce procédé de détermination du sexe avant de déterminer le profil génétique d'un sujet de manière plus poussée.
Ainsi, en procédant au préalable à cette étape, on peut rapidement évaluer si l'échantillon est apte à être analysé ou pas.
De plus, parfois, le sexage d'un échantillon préalable à la détermination d'un profil génétique d'un individu échoue. Ainsi, certains échantillons identifiés comme féminins, sont, en fait, des échantillons masculins pour lesquels le sexage a échoué. Combiner la détermination d'un profil génétique d'un individu avec un outil de sexage permet de valider le sexage effectué préalablement à la détermination de l'empreinte génétique.
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX comprend l'ajout de paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
Figure imgf000015_0001
Tableau 3
Kit pour caractériser un échantillon d'ADN
La présente invention concerne également un kit comprenant des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 10 loci STR d'un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé, les loci étant choisis dans le groupe M1 et/ou le groupe M2, dans lequel : -le groupe M1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538 et
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
La présente invention concerne également un kit comprenant des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 10 loci STR d'un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé, les loci étant choisis dans le groupe M2, dans lequel :
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
Le kit peut comprendre des moyens pour déterminer les allèles de loci STR autre que ceux du groupe M2.
Pour des raisons de coûts et de facilité d'utilisation, il est préférable que les allèles à déterminer soient limités.
Ainsi, le kit peut comprendre des moyens pour déterminer les allèles de 10 à 50 loci STR, préférablement les allèles de 10 à 40 loci STR, plus préférablement les allèles de 10 à 32 loci STR.
Typiquement, le kit comprend les moyens pour déterminer les allèles de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 loci STR.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend au moins 10 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR, les loci étant choisis dans le groupe 1 et/ou le groupe M2.
Typiquement, le kit comprend 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 paires d'amorces.
Dans un mode de réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé et les au moins 10 paires d'amorces ont les séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en :
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 1 1 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : : 26 pour le locus DYS511 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : : 36 pour le locus DYS538,
SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : : 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : : 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO : 41 et SEQ ID NO : : 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : : 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : : 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : : 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO : 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO : 51 et SEQ ID NO : : 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : : 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO : 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : : 58 pour le locus DYS481
SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : : 60 pour le locus DYS612,
SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : : 62 pour le locus DYS444 et
SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : : 64 pour le locus DYS533.
Dans un mode de réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN de chimpanzé et les au moins 10 paires d'amorces ont les séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en :
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 1 1 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS511 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538, SEQ ID NO : : 37 et SEQ ID NO : 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO : : 39 et SEQ ID NO : 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO : : 41 et SEQ ID NO : 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO : : 43 et SEQ ID NO : 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO : : 45 et SEQ ID NO : 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO : : 47 et SEQ ID NO : 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO : : 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO : : 51 et SEQ ID NO : 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO : : 53 et SEQ ID NO : 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO : : 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO : : 59 et SEQ ID NO : 60 pour le locus DYS612 et
SEQ ID NO : : 61 et SEQ ID NO : 62 pour le locus DYS444.
Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé et le kit comprend les paires d'amorces ayant des séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en:
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 57 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO
SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO
Dans un mode de réalisation préféré, le
les allèles d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M1 ,
dans lequel :
-le groupe M1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538.
Selon ce mode de réalisation préféré, le kit peut comprendre au moins 10 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR et
dans lequel les paires d'amorces ont des séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en :
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO 11 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS51 1 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538,
SECTION M1 Dans un mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 15 loci STR choisis dans le groupe M1.
Dans ce mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles de 15, 16, 17 ou 18 loci choisis dans le groupe M1.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles des 18 loci du groupe M 1.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles d'au moins les loci DYS485, DYS588, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS51 1 et DYS565, plus préférablement d'au moins les loci DYS485, DYS588, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS517, DYS508, DYS511 , DYS565, DYS578, DYS556 et DYS538.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques :
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575, SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS51 1 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565 et
SEQ ID NO 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538.
Ces paires d'amorces correspondent aux paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR du groupe M1. Elles peuvent être utilisées tant pour un échantillon d'ADN humain que pour un échantillon d'ADN de chimpanzé. Les STR du groupe M1 ont un taux de mutation bas à intermédiaire. Ces marqueurs permettent une discrimination de profils relativement divergeant.
SECTION M2
Dans un mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 11 loci STR choisis dans le groupe M2.
Dans ce mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles de 1 1 , 12, 13 ou 14 loci choisis dans le groupe 2.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles des 14 loci du groupe M2.
Dans un autre mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles des 14 loci du groupe M2 seulement. Dans ce mode de réalisation, le procédé ne comprend pas la détermination d'allèles de loci STR autres que ceux du groupe 2.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles d'au moins les loci DYS570, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS460, DYS442, DYS513 et DYS444.
Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé et le kit comprend les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO 56 pour le locus DYS458, SEQ ID NO 57 et SEQ ID NO : 58 pour le locus DYS481
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO : 60 pour le locus DYS612,
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO : 62 pour le locus DYS444 et
SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO : 64 pour le locus DYS533.
Les STRs du groupe M2 ont un taux de mutation élevé. Ces marqueurs permettent une discrimination de profils à plus fine échelle, par exemple à l'échelle d'une région.
Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN de chimpanzé et le kit comprend les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO 60 pour le locus DYS612 et
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO 62 pour le locus DYS444.
SECTION M1 et M2
Dans un mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles :
- d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M1
et
- d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M2.
Dans ce mode de réalisation, le kit comprend des moyens pour déterminer les allèles:
- de 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 loci STR choisis dans le groupe 1
et
- de 10, 1 1 , 12, 13 ou 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des moyens pour déterminer les 18 loci STR du groupe M1 et les 14 loci STR du groupe M2.
Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé et le kit comprend les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO I et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO I I et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643, SEQ ID NO 13 et SEQ ID NO : 14 pour le ocus DYS587,
SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO : 16 pour le ocus DYS575,
SEQ ID NO 17 et SEQ ID NO : 18 pour le ocus DYS578,
SEQ ID NO 19 et SEQ ID NO : 20 pour le ocus DYS632,
SEQ ID NO 21 et SEQ ID NO : 22 pour le ocus DYS508,
SEQ ID NO 23 et SEQ ID NO : 24 pour le ocus DYS640,
SEQ ID NO 25 et SEQ ID NO : 26 pour le ocus DYS51 1 ,
SEQ ID NO 27 et SEQ ID NO 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO 29 et SEQ ID NO 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO 31 et SEQ ID NO 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO 33 et SEQ ID NO 34 pour le ocus DYS565,
SEQ ID NO 35 et SEQ ID NO 36 pour le locus DYS538,
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO 38 pour le ocus Y-GATA-A10
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO 46 pour le ocus DYS442
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO : 50 poui • le locus DYS541 ,
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 54 pour le ocus DYS513,
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO : 56 pou ir le locus DYS458,
SEQ ID NO 57 et SEQ ID NO 58 pou iir le ocus DYS481
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO 60 i pour le locus DYS612,
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO 62 ! pour le ocus DYS444 et
SEQ ID NO 63 et SEQ ID NO 64■ pour le ocus DYS533.
Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN de chimpanzé et le kit comprend les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 1 1 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508, SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS511 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538,
SEQ ID NO 37 et SEQ ID NO 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO 39 et SEQ ID NO 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO 41 et SEQ ID NO 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO 43 et SEQ ID NO 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO 45 et SEQ ID NO 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO 47 et SEQ ID NO 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO 51 et SEQ ID NO 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO 53 et SEQ ID NO 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO 59 et SEQ ID NO 60 pour le locus DYS612 et
SEQ ID NO 61 et SEQ ID NO 62 pour le locus DYS444.
Dans un mode réalisation, le kit comprend, en outre, des moyens de détermination du sexe, dans lequel les moyens de détermination du sexe consistent en des moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX.
Dans un mode de réalisation, les moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX comprennent les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques :
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un kit tel que défini précédemment pour la réalisation du procédé selon l'invention.
Outil de sexaqe:
La présente invention concerne également un procédé pour déterminer le sexe d'un échantillon d'ADN.
Le 1er outil moléculaire développé chez les humains pour l'identification du sexe est le test de l'amélogénine. Ce test repose sur l'utilisation d'une seule paire d'amorces PCR capable de co-amplifier des fragments d'ADN à la fois sur les gènes d'amélogénine des chromosomes X et Y, qui chez les humains différent de 6 bp dans l'intron 1. Cette différence de taille est généralement résolue par électrophorèse capillaire, révélant un seul pic pour les femelles (XX) et un double pic pour les mâles (XY). Cette méthode est aujourd'hui le standard utilisé pour la détermination du sexe en médecine légale et en génétique des populations ; ce test est inclus dans 2 kits notamment PowerPlex16 (Promega) et l'AmpF/STR Indentifiler (Life technologies). Néanmoins, malgré son utilisation sur le long terme, cet essai de typage du sexe n'est pas entièrement fiable. Beaucoup d'études ont reporté une détermination du sexe erronée car le locus AMELY n'a pas pu être amplifié. Deux causes sont impliquées : une mutation dans le site de liaison de l'amorce et/ou la délétion du locus, spécialement chez les populations chinoises. Le système AMELX/AMELY a aussi été modifié pour réaliser une détermination du sexe chez des primates non humains. Il a été appliqué avec succès chez des primates de parenté proche de l'humain mais ne fonctionne pas sur des espèces de parenté lointaine comme les orangs outangs ou les babouins. A cause de l'impossibilité de généraliser l'utilisation d'amélogénine chez les primates non humains, plusieurs méthodes alternatives ont été développées. Pour la plupart d'entre elles des fragments liés au X et Y ont été inclus en plus du test AMELX/AMELY. Cependant la plupart de ces procédés de typage ont été basés sur des références humaines et malgré une amplification positive chez les grands singes grâce leur proche parenté, ils ne fonctionnent pas chez des espèces de primates plus éloignées.
En dehors des essais AMELX/AMELY, une récente étude a identifié le locus UTX/UTY comme un meilleur système candidat pour un marqueur de sexage universel des primates en comparant les données génomiques de plusieurs mammifères. Ce test de sexage donne des résultats positifs sur les babouins et les orangs-outans. Cependant, il présente un risque d'erreur dû aux importantes variations structurales existant sur le chromosome Y et à la probabilité associée d'une amplification nulle de l'allèle Y. Lorsque un locus cible Y ne peut pas être amplifié, cela peut entraîner une mauvaise identification du sexe.
La présente invention concerne également un procédé pour déterminer le sexe d'un échantillon d'ADN qui comprend une étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX de l'échantillon d'ADN.
L'amplification d'UTX uniquement, en l'absence de SRY et UTY indique que l'échantillon d'ADN provient d'un sujet de sexe féminin.
L'amplification des 3 marqueurs, UTY, SRY et UTX indique que l'échantillon d'ADN provient d'un sujet de sexe masculin.
L'amplification de 2 marqueurs, UTY, et UTX, en l'absence de SRY, indique que l'échantillon d'ADN provient d'un sujet de sexe masculin, mais qu'il existe une mutation sur le site d'hybridation des amorces SRY, ou une délétion de ce gène, ne permettant pas son amplification (cas fréquent qui est souvent population spécifique').
L'amplification de 2 marqueurs, SRY, et UTX, en l'absence de UTY, indique que l'échantillon d'ADN provient d'un sujet de sexe masculin, mais qu'il existe une mutation sur le site d'hybridation des amorces UTY, ou une délétion de ce gène, ne permettant pas son amplification (cas fréquent qui est souvent population spécifique'). Le procédé de typage du sexe selon l'invention, est applicable permet d'empêcher les mauvaises identifications du sexe. De plus, il est facilement applicable pour un large spectre de qualité d'ADN.
Ce procédé pour déterminer le sexe d'un sujet permet, outre l'identification du sexe, d'évaluer indirectement le profil de dégradation de l'échantillon d'ADN masculin étudié.
En effet, les 3 marqueurs ayant des tailles respectives de 81 (SRY), 91 (UTY) et 120 (UTX) bp pour l'outil de sexage humains et chimpanzés et de 91 (UTY), 120 (UTX) et 165 (SRY) pour l'outil de sexage tous primates, l'amplification décroissante (voire nulle) de ces 3 marqueurs nous renseigne sur le degré de fragmentation de l'échantillon. Ceci est particulièrement intéressant lorsqu'on utilise ce procédé de détermination du sexe avant de déterminer le profil génétique d'un sujet de manière plus poussée.
Ainsi, en procédant au préalable à cette étape, on peut rapidement évaluer si l'échantillon est apte à être analysé ou pas.
Dans un mode de réalisation préféré, l'étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX est l'amplification de fragments de 80 à 250 paires de bases d'un exon de SRY, de UTX et de UTY.
Les exons étant des parties codantes, il y a plus de chance qu'elles restent conservées à travers le temps chez la même espèce mais aussi entre espèces.
Le fragment amplifié peut notamment être compris entre 80 et 250 paires de bases, 80 et 200 paires de bases ou 80 et 150 paires de bases.
La présente invention concerne également un kit pour déterminer le sexe d'un échantillon d'ADN dans lequel les moyens de détermination du sexe comprennent des moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX. Outil de sexage de 'Tous Primates':
Selon un mode de réalisation de ce procédé, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN appartenant à l'ordre des primates.
L'échantillon d'ADN peut par exemple provenir d'un humain (Homo sapiens), de Pan sp., Gorilla sp., Pongo sp. Hylobates sp.,Cercopithecus sp.,Erythrocebus patas, Cercocebus torquatus, Mandrillus sphinx, Lophocebus albigena, Papio sp., Macaca sp., Alouatta caraya, Saïmiri sciureus, Cebus apella, Aotus trivirgatus, Callithrix jacchus, Hapalemur sp., Eulemur sp., Microcebus sp., Lepilemur sp., Avahi sp., Propithecus sp., Lemur sp., Indri indri.
En particulier, l'échantillon d'ADN peut provenir de Homo sapiens, Pan troglodytes troglodytes,, Pan paniscus, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus pygmaeus, Hylobates lar, Cercopithecus cephus, Cercopithecus nictitans, Erythrocebus patas, Cercocebus torquatus, Mandrillus sphinx, Lophocebus albigena, Macaca mulatta, Macaca sylvanus, Alouatta caraya, Aotus trivirgatus, Saïmiri sciureus, Cebus apella, Callithrix jacchus, Lepilemur dorsalis, Lepilemur sahamalazensis, Lepilemur ankaranensis, Lepilemur mittermeieri, Lepilemur ruficaudatus, Lepilemur aeeclis, Microcebus murinus, Hapalemur griseus ranomafanensis, Hapalemur griseus meridionalis, Hapalemur griseus occidentalis, Hapalemur griseus griseus, Hapalemur aureus, Hapalemur simus, Eulemur macaco macaco, Eulemur macaco flavifrons, Lemur catta, Propithecus diademma edwardsi, Propithecus tattersalli, Propithecus verreauxi coquerelli, Propithecus verreauxi verreauxi, Propithecus verreauxi deckeni, Propithecus diademma diademma, Avahi laniger, Avahi occidentalis, Avahi cleesei, Indri indri.
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX est l'amplification de fragments de 100 à 250 paires de bases d'un exon de SRY, de UTX et de
UTY.
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification des gènes comprend l'ajout de paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO: 70 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
Les séquences des amorces des différents modes de réalisation préférés du procédé de détermination du sexe sont données dans le tableau 4 ci-dessous.
Figure imgf000026_0001
Tableau 4
Dans un mode de réalisation, le kit est un kit pour déterminer le sexe d'un échantillon d'ADN de primate et les moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX comprennent les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO: 70 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
Typiquement, les amorces s'hybrident dans des conditions stringentes. Par exemple, pour des amorces de 15 à 25 bp, des conditions stringentes sont une température de 55°C dans du tampon ou de 51 °C dans ce même tampon pour des échantillons de prosimiens. Le tampon peut par exemple être composé de Multiplex PCR Master mix 2X comprenant des concentrations optimisées (c'est eux qui le disent !!) de HotStarTaq® Plus DNA Polymerase, MgCI2, et dNTPs Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP ultrapure quality) et Multiplex PCR Plus Buffer (contains 6 mM MgCI2; pH 8.7), Q-solution 5X, CoralLoad Dye 10X, RNase-free water ultra-pure quality, PCR-grade comme dans le kit QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit (réf : 206152).
Outil de sexaqe humains et chimpanzés :
Selon un mode de réalisation de ce procédé, l'échantillon d'ADN est un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé.
Selon un mode de réalisation de ce procédé pour déterminer le sexe d'un échantillon d'ADN, l'échantillon d'ADN provient d'un humain ou d'un chimpanzé et l'étape d'amplification des gènes comprend l'ajout de paires d'amorces choisies dans le groupe consistant en:
- pour SRY :
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 2 655 350 et 2 655 400, de préférence entre les bases 2 655 365 et 2 655 395, de manière plus préférée entre les bases 2 655 369 et 2 655 390 du brin négatif du chromosome Y humain et
-une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 2655
295 et 2 655 340 de préférence entre les bases 2655 300 et 2 655 325, de manière plus préférée entre les bases 2655 304 et 2 655 323 du brin positif du chromosome Y humain,
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 26 202 990et 26 203 035, de préférence entre les bases 26 202 995 et 26 203 030, de manière plus préférée entre les bases 26 203 002 et 26203023du brin positif du chromosome Y de chimpanzé et
-une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 26 203 055 et 26 203 105 de préférence entre les bases 26 203 060 et 26 203 095, de manière plus préférée entre les bases 26 203 069 et 26 203 088 du brin négatif du chromosome Y de chimpanzé,
-pour UTX :
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 44 929 400 et 44 929 450, de préférence entre les bases 44 929 415 et 44 929 440, de manière plus préférée entre les bases 44 929 417 et 44 929 437 du brin positif du chromosome X humain et
-une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 44 929 505 et 44 929 555, de préférence entre les bases 44 929 515 et 44 929 550, de manière plus préférée entre les bases 44 929 521 et 44 929 541du brin négatif du chromosome X humain,
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 45 534 530 et 45 534 580, de préférence entre les bases 45 534 535 et 45 534 570, de manière plus préférée entre les bases 45 534 544 et 45 534 564 du brin positif du chromosome X de chimpanzé et -une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 45 534 630 et 45 534 800, de préférence entre les bases 45 534 535 et 45 534 575, de manière plus préférée entre les bases 45 534 648 et 45 534 668 du brin négatif du chromosome X de chimpanzé,
et
-pour UTY :
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 15 447 590 et 15 447 645, de préférence entre les bases 15 447 600 et 15 447 635, de manière plus préférée entre les bases 15 447 608 et 15 447 628 du brin négatif du chromosome Y humain et
-une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 15 447 520 et 15 44 7 560, de préférence entre les bases 15 447 530 et 15 44 7 550, de manière plus préférée entre les bases 15 447 533 et 15 447 553 du brin positif du chromosome Y humain
-une amorce sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 20 860 260 et 20 860 310, de préférence entre les bases 20 860 270 et 20 860 300, de manière plus préférée entre les bases 20 860 275 et 20 860 295 du brin négatif du chromosome Y de chimpanzé et
-une amorce anti-sens entre 15 et 25 paires de bases s'hybridant entre les bases 20 860 185 et 20 860 235, de préférence entre les bases 20 860 195 et 20 860 225, de manière plus préférée entre les bases 20 860 200 et 20 860 220 du brin positif du chromosome Y de chimpanzé.
Typiquement, les amorces s'hybrident dans des conditions stringentes. Par exemple, pour des amorces de 15 à 25 bp, des conditions stringentes sont une température de 55°C dans du tampon ou de 51 °C dans ce même tampon pour des échantillons de prosimiens. Le tampon peut par exemple être composé de Multiplex PCR Master mix 2X comprenant des concentrations optimisées de HotStarTaq® Plus DNA Polymerase, MgCI2, et dNTPs Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP ultrapure quality) et Multiplex PCR Plus Buffer (contains 6 mM MgCI2; pH 8.7), Q-solution 5X, CoralLoad Dye 10X, RNase-free water ultra-pure quality, PCR- grade comme dans le kit QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit (réf : 206152).
Dans un mode de réalisation, l'étape d'amplification des gènes comprend l'ajout de paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO: 70 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
ou
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
Dans un mode de réalisation préféré, l'étape d'amplification des gènes comprend l'ajout de paires d'amorces ayant les séquences nucléiques:
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
Les séquences des amorces de ce mode de réalisation préféré sont données dans le tableau 5 ci-dessous.
Figure imgf000029_0001
Tableau 5
Ce dernier mode de réalisation du procédé de typage du sexe n'est applicable qu'à un nombre limité de primates mais elle permet d'utiliser des amplicons de très petites tailles (entre 80 et 120 bp) et donc de travailler sur de l'ADN est hautement dégradé.
L'invention sera illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, étant présentés à titre illustratif, ces exemples et figures ne devraient pas être interprétés de manière à limiter la portée de la présente invention. FIGURES
La Figure 1 montre une comparaison entre la mutabilité et le pouvoir discriminant des multiplex existants et ceux de l'invention (CombYpIex).
La Figure 2 montre un exemple de profil d'homme obtenu à partir du multiplex M1.
Pour chacun des profils, l'axe horizontal représente la taille des fragments d'ADN: à gauche les petites tailles, à droite les plus larges tailles. Chaque pic correspond à un marqueur STR.
Chaque ligne correspond à un fluorochrome. La barre grise au-dessus de chaque pic porte le nom du marqueur situé au-dessous, et sa longueur reflète le spectre de tous les allèles attendus (polymorphisme). La place de chaque allèle potentiellement amplifié est représentée sous forme de barre grisée.
La Figure 3 montre un exemple de profil d'homme obtenu à partir du multiplex M2 combiné à un outil de sexage. Les codes de lecture sont les mêmes que précédemment.
La Figure 4 montre un exemple de profil de chimpanzé obtenu à partir du multiplex M1. Les codes de lecture sont les mêmes que précédemment. La Figure 5 montre un exemple de profil de chimpanzé obtenu à partir du multiplex 2 combiné à un outil de sexage. Les codes de lecture sont les mêmes que précédemment La Figure 6 représente un exemple de profil mâle avec un pic UTY, un pic UTX et un pic SRY (profil A).
La Figure 7 représente un exemple de profil mâle avec un pic UTY, un pic UTX mais pas de pic SRY (profil B).
La Figure 8 représente un exemple de profil mâle avec un pic UTX et un pic SRY mais pas de pic SRY (profil C).
La Figure 9 représente un exemple de profil femelle avec uniquement un pic UTX (profil D). La Figure 10 représente les résultats des tests comparatifs hommes/chimpanzés sous forme de dendogramme.
La Figure 11 représente la PCA des tests comparatifs hommes/chimpanzés.
La Figure 12 représente un dendogramme des résultats obtenus lors de l'analyse des groupes patronymiques Feakes et ses dérivés, Attenborough, Starbuck et Revis.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Détermination du profil génétique d'un sujet
Développement de séquences de référence
Une liste exhaustive des marqueurs STR du chromosome Y humain a été établie sur la base des publications disponibles à ce sujet (Goedbloed et al. 2009 ; Hanson et al. 2007 ; Ballantyne et al. 2010 ; Vermeulen et al. 2009 ; Maybruck et al. 2009; Hanson et al. 2012 ; Kayser et al. 2004). et complété d'un travail avec utilisation des banques de données types ncbi, ucsc, ensembl.
A partir de cette liste, une étude a été menée afin de recueillir l'ensemble des informations relatives à chaque marqueur listé, qui seraient susceptibles de renseigner sur leur potentiel discriminant (structure moléculaire, taux de mutation, localisation dans le génome, évidence de duplications, etc.).
Ces mêmes informations ont été collectées pour le chimpanzé et les marqueurs absents chez cette espèce, ou qui ne convenaient pas pour le chimpanzé, ont été éliminés.
Un classement des marqueurs en fonction de leurs taux de mutation, structure moléculaire, qualité des régions flanquantes, et autres, a été réalisé. Les marqueurs sélectionnés ont été répartis en 2 multiplexes : le M1 , comprenant les marqueurs ayant un taux de mutation moyen (cf. Tableau 6A et 6B), et le 2, comprenant les marqueurs ayant un taux de mutation élevé (cf. Tableau 7A et 7B).
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Tableau 6A
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Tableau 6B
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Tableau 7A
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Tableau 7B
Conception des amorces des multiplexes.
Le schéma théorique des 2 multiplexes a été réalisé, en organisant les marqueurs par ligne (1 ligne = 1 fluorochrome) en fonction de leurs tailles afin d'assurer une bonne distribution des marqueurs sur le range de taille fixé (de 80 à 350 bp).
L'alignement des séquences d'environ 500 bp autour du marqueur homme-chimpanzé a été réalisé pour chaque marqueur. Un couple d'amorces capables d'amplifier le marqueur STR pour les 2 espèces, et pour une taille donnée (proche) a été sélectionné. Les amorces ont été modifiées jusqu'à ce que le schéma théorique désigné soit atteint/obtenu, et dans le cas où ce n'était pas possible, le schéma théorique a été modifié jusqu'à obtenir satisfaction.
Pour chaque marqueur, une amplification a été réalisée en utilisant les amorces froides pour un individu mâle et un individu femelle, pour l'homme et le chimpanzé, afin de voir si une bande à la taille attendue était obtenue, et surtout si celle-ci était unique afin d'éviter les a- spécificités et duplications qui n'auraient pas été reportées ou détectées jusque-là. Les amorces ont été remodifiées jusqu'à atteindre satisfaction.
Une fois tous les marqueurs testés indépendamment, ils ont été multiplexés par ligne (c.à.d. par fluorochrome) afin de détecter des interactions potentielles.
Les marqueurs ont ensuite été testés marqués ('chauds'), et à nouveau une amplification a été réalisée en utilisant les amorces chaudes pour un individu mâle et un individu femelle, pour l'homme et le chimpanzé, afin de voir si nous obtenions une bande à la taille attendue, et surtout si celle-ci était unique afin d'éviter les a-spécificités et duplications. Les amorces ont été remodifiées jusqu'à atteindre satisfaction.
Un multiplexage final a été réalisé, incluant la totalité des marqueurs et les concentrations ont été ajustées jusqu'à obtenir un multiplex équilibré.
La même opération a été répétée pour le deuxième multiplex.
En parallèle, chaque marqueur a été séquencé afin d'établir une correspondance entre taille de l'amplicon par génotypage et le nombre réel de répétitions correspondant à cette taille.
Le tableau 8A ci-dessous récapitule les informations sur les 18 marqueurs du 1er multiplex M1 pour des échantillons humains.
Le tableau 8B ci-dessous récapitule les informations sur les 18 marqueurs du 1er multiplex M1 pour des échantillons de chimpanzés.
Le tableau 9A ci-dessous récapitule les informations sur les 14 marqueurs du 2nd multiplex 2 et pour les marqueurs de sexage (SRY, UTY et UTX) pour des échantillons humains.
Le tableau 9B ci-dessous récapitule les informations sur les 14 marqueurs du 2nd multiplex M2 et pour les marqueurs de sexage (SRY, UTY et UTX) pour des échantillons de chimpanzés.
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Tableau 8A : informations sur les 18 marqueurs du Multiplex M1 pour des échantillons humains.
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Tableau 8B : Informations sur les 18 marqueurs du Multiplex M1 pour des échantillons de chimpanzés.
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Tableau 9A : Informations sur les 14 marqueurs du multiplex M2 et pour SRY, UTY et UTX pour des échantillons humains.
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000047_0001
Tableau 9B : Informations sur les 14 marqueurs du multiplex M2 pour des échantillons de chimpanzés (NA pour non disponible)
Test des multiplexes M1 et M2 sur hommes et chimpanzés: choix des échantillons afin de maximiser la variabilité génétique observée.
Un panel d'échantillons de 13 hommes et de 11 chimpanzés ont été testés. Ils ont été génotypés avec les 2 multiplexes afin d'obtenir une idée de la variabilité génétique détectée (i.e. allèles) pour les multiplexes M1 et M2, pour les hommes et les chimpanzés.
Les hommes proviennent de différents pays et sont donc susceptibles de présenter profils génétiques très différents - ceci devrait permettre d'obtenir une variabilité génétique maximale et d'avoir une idée des gammes d'allèles attendus. Les chimpanzés proviennent eux de divers zoos et collections, afin d'éviter les effets de consanguinité, et de la même façon, de maximiser nos chances d'obtenir des profils différents.
Résultats:
Le degré de polymorphisme (variabilité) des marqueurs inclus dans les 2 multiplexes, a été estimé pour le panel. Les résultats sont donnés dans le tableau 10 pour M1 , dans le tableau 11 pour M2 et dans le tableau 12 pour l'outil de sexage. On observe bien que le nombre d'allèles et la variance est en accord avec les taux de mutations prédits pour M1 et M2, à savoir une variance plus importante pour M2 (fort taux de mutation) que pour M1.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Tableau 10
M2 Y GATA A10 DYS570 DYS549 DYS460 DYS442
Echantillons Allèle Taille Allèle Taille Allèle Taille Allèle Taille Allèle Taille
Hum_FX 13 163,55 18 229,95 12 299,49 12 1 3,52 12 181 ,39
Hum_20FT 12 159,45 15 217,57 12 299,49 10 105,19 1 1 177,4
Hum_21 PF 14 167,59 20 238,12 12 299,56 11 109,41 13 185,44
Hum_28IT 12 159,45 18 229,93 12 299,56 10 105,18 13 185,48
Hum_29AH 13 163,56 18 229,88 13 303,43 10 105,23 1 1 177,4
Hum_310L 13 163,6 17 225,85 13 303,47 10 105,28 12 181 ,45
Hum_34AHB 13 163,53 16 221 ,7 12 299,49 11 109,39 13 185,44
Hum_35JN 12 159,46 18 229,83 13 303,47 10 105,29 1 1 177,27
Hum_38ME 12 159,46 16 221 ,77 12 299,42 11 109,42 1 1 177,36
Hum_39TB 13 163,52 18 229,84 12 299,63 11 109,29 12 181 ,41
Hum_40EH 12 159,44 17 225,8 12 299,63 11 109,33 12 181 ,42
Hum_43PF 12 159,36 19 233,99 12 299,7 11 109,36 12 181 ,49
Hum_45AMB 12 159,44 22 246,47 1 1 295,64 11 109,34 12 181 ,42
Hum César 13 163,63 18 229,95 13 303,46 10 105,17 12 181 ,43
Chimp 103 4 130,85 4 176,18 8 283,6 10 105,08 1 1 189,51
Chimp_211 4 130,8 4 176,06 10 291 ,54 10 105,05 1 1 189,48
Chimp 253 4 130,79 4 176,11 8 283,53 9 100,82 1 1 189,53
Chimp_273 4 130,75 4 176,16 8 283,55 11 109,15 1 1 189,47
Chimp_295 4 130,83 4 176,17 8 283,56 10 105,01 1 1 189,54
Chimp_367 4 130,84 4 176,19 9 287,58 10 104,98 1 1 189,47
Chimp_61A 4 130,84 4 176,11 8 283,61 11 109,18 10 185,5
Chimp_Sg229 4 130,73 4 176,18 8 283,62 10 105,03 1 1 189,51
Chimp_Sg369 4 130,82 4 176,19 10 291 ,66 10 104,99 1 1 189,55
Chimp SgCI 4 130,85 4 176,19 8 283,59 11 109,13 12 193,61
Chimp_202
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (femelle/contrôle)
Nb allèles Ho 3 7 3 3 3
Gamme allélique 12-14 15-22 11-13 10-12 11-13
Nb allèles Chz 1 1 2 3 3
Gamme allélique (4) (4) 8-10 9-11 10-12
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Tableau 1 1
2 SRY UTX UTY
Sam pies Allèle Taille Allèle Taille Allèle Taille
Hum_FX 1 81,56 1 120,61 1 91,36
Hum_20FT 1 81,57 1 120,61 1 91,4
Hum_21PF 1 81,67 1 120,62 1 91,44
Hum_28IT 1 81,57 1 120,61 1 91,4
Hum_29AH 1 81,56 1 120,62 1 91,36
Hum_310L 1 81,63 1 120,68 1 91,43
Hum_34AHB 1 81,57 1 120,61 1 91,45
Hum_35JN 1 81,56 1 120,61 1 91,4
Hum_38ME 1 81,54 1 120,6 1 91,38
Hum_39TB 1 81,58 1 120,62 1 91,42
Hum_40EH 1 81,67 1 120,62 1 91,38
Hum_43PF 1 81,6 1 120,62 1 91,43
Hum_45AMB 1 81,6 1 120,63 1 91,4
Hum_Cesar 1 81,64 1 120,61 1 91,45
Chimp_103 1 81,59 1 120,7 1 91,34
Chimp_211 1 81,57 1 120,62 1 91,28
Chimp_253 1 81,56 1 120,61 1 91,36
Chimp_273 1 81,68 1 120,63 1 91,35
Chimp_295 1 81,6 1 120,71 1 91,31
Chimp_367 1 81,59 1 120,7 1 91,3
Chimp_61A 1 81,59 1 120,7 1 91,34
Chimp_Sg229 1 81,59 1 120,63 1 91,34
Chimp_Sg369 1 81,59 1 120,62 1 91,3
Chimp SgCI 1 81,67 1 120,62 1 91,39
Chimp_202_Fem 0 1 120,7 0
Nb allèles Ho 1 1 1
Nb allèles Chz 1 1 1
Tableau 12
Ces tableaux résument l'ensemble des variations génétiques (appelées aussi allèles) observées chez les individus, et pour chaque marqueur. On voit rapidement que chaque marqueur présente plusieurs allèles chez l'homme et un peu moins chez le chimpanzé - résultat parfaitement compatible avec l'histoire démographique de ces 2 espèces. Ces résultats qui portent uniquement sur 13 et 11 individus, se révèlent déjà plus efficace que ce qui est publié jusque-là chez le chimpanzé. C'est donc très révélateur du pouvoir de discrimination de cet outil.
Ces résultats représentés sous forme de dendrogramme à la figure 10 et analysés par PCA à la figure 11 montrent que Combyplex permet une discrimination sans ambiguïté des deux espèces.
L'ensemble CombYpIex qui comprend les multiplex M1 et M2 montre une très bonne reproductibilité et robustesse, à la fois chez le l'homme et chez le chimpanzé. Il permet d'amplifier 30/31 marqueurs avec des tailles toujours inférieures à 350 bp, il permet de faire de l'ADN moyennement dégradé, comme testé sur des individus datant du 16ème siècle. Capacité discriminante du CombYplex comparée à l'AmplYfiler : individus même noms de famille :
CombYplex a été utilisés sur des individus ayant le même nom de famille ou des dérivés de ce nom (Feakes et dérivés, Attenborough, Starbuck et Revis) afin de tester si cet outil permet de discriminer des individus ayant a priori une origine commune récente (établissement des noms de famille vers 15sc). Les résultats de cette étude sont présentés sous forme de dendogramme à la figure 12.
Ces résultats montrent que les empreintes CombYplex, permettent sans ambiguïté de discriminer les individus portant les mêmes patronymes: les individus se distribuent distinctement en 4 groupes (4 branches du dendrogramme) correspondant aux 4 patronymes étudiés. Ceci indique un lien direct entre chromosome Y et patronyme; Dans ce cas précis, cela indique également que les variants patronymiques des 4 patronymes choisis, sont récents et d'origines multiples puisqu'ils sont distribués aléatoirement au sein des groupes patronymiques, mais ne forment pas de sous-groupes distincts qui auraient pu suggérer une origine commune. Deux individus sont exclus de l'arbre indiquant clairement une incompatibilité entre le nom et le chromosome Y en question, puisqu'ils ne se placent dans aucune des 4 branches probable - ceci est le cas entre une nom paternité ou un cas d'adoption ; le taux variant de 2 à 4% en Angleterre, cette observation est parfaitement compatible avec les statistiques sur le sujet.
L'outil CombYplex permet donc de regrouper les individus portant un patronyme commun et ayant une origine commune, mais également de détecter une non-congruence entre nom de famille et chromosome Y et se trouve être un allié précieux dans les analyses généalogiques/patronymiques.
Statistiques descriptives :
Les formules suivantes ont été utilisées : (1 ) capacité discriminante = no. d' individus/no. des différents haplotypes observés; (2) diversité des gènes (h), équivalent à la fréquence attendue des fréquences hétérozygotes avec des loci diploïdes autosomiques a été calculé ainsi (η/(η-1 ))·(1-∑ρ,2), où pi = fréquence de l'allèle au ième .
EXEMPLE 2: Outil de sexa e
Matériels et méthodes
Echantillons de primates humains et non humains.
Un panel de 177 échantillons d'ADN a été utilisé, incluant 1 16 échantillons humains, et 61 échantillons de primates non humains à partir de 45 espèces distinctes. Des échantillons humains ont été obtenus à partir de volontaires en bonne santé et les échantillons de primates non humains provenaient d'une collection.
Une liste de ces échantillons, incluant le groupe taxonomique, le nom commun de l'espèce et mes informations sur le sexe obtenues préalablement est donné au tableau 13. Les échantillons d'ADN utilisés ont été extraits de différents substrats incluant la salive, le sérum, le sang total, du tissu et une culture cellulaire.
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Tableau 13
Extraction d'ADN
Le procédé d'extraction d'ADN dépend du type d'échantillon.
L'ADN a été extrait de :
-(i) sang total en utilisant le mini-kit QiaAmp DNA Blood mini-kit (Qiagen),
- (ii) sérum en utilisant le mini-kit i-genomic DNA Blood mini-kit (Euromedex)
- (iii) salive en utilisant le kit OG-300 Oragene DNA Self-Collection Kit (DNA Genotek),
- (iv) culture cellulaire en utilisant le mini kit Blood & Cell Culture DNA (Qiagen), selon les instructions du fabricant pour chacun des kits utilisés.
La quantité et la qualité de l'ADN extrait ont été estimées en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop.
Conception des amorces de PCR
Les amorces de PCR pour l'amplification du fragment SRY ont été publiées précédemment (Fiore et al. 2005). Les amorces de PCR pour la co-amplification des régions homologues de UTX et UTY ont été conçues à partir de régions conservées UTX/UTY. Les séquences disponibles dans les banques pour les différentes espèces de primates ont été alignées à l'aide de BioEdit v.7.0.5.3. Les régions conservées pour chaque gène ont été utilisées pour le design d'amorces en utilisant le logiciel Primer3 v.0.4.0 afin de permettre la co-amplification des fragments d'UTX et d'UTY de tailles relativement petites, à partir d'échantillon comprenant probablement de l'ADN dégradé. Des amorces sens marquées en 5' avec un fluorochrome FAM fluorescent (InVitrogen) ont été utilisées pour permettre la détection par électrophorèse capillaire. Les séquences des amorces et les tailles des amplicons sont montrées au tableau 6.
Amorce sens Amorce anti-sens Longueur
Marqueur SEQ ID SEQ ID amplifiée
Séquence (5'-3') Séquence (5'-3')
NO NO (bp)
tgtgcctcctggaagaatgg
SRY 70 agtgaagcgacccatgaacg
66 165
UTY cagtgttaccag ccttaacag ggcaggtctacttttgtagag 91
67 68
UTX
tctgtggactaggtttgtggt 120
69
Figure imgf000063_0001
Tableau 6
Amplification par PCR multiplex
Des régions d'UTX, UTY et/ou SRY ont été amplifiées simultanément dans un volume final de 12,5 μΙ consistant à 1X du tampon B de PCR (Fisher Bioblock), 1 ,5mM de MgCI2, 200μΜ de chaque dNTP, 0,2 à 0,4 μΜ d'amorces, 1 U d'ADN polymérase Taq (Fisher Bioblock) et 15 à 25 ng d'échantillon d'ADN. Les concentrations des amorces pour chaque amorce sont données dans le tableau 6. Les conditions du cycle de PCR sont une première étape de dénaturation à 94°C pendant 5 min suivie de 40 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30s, l'hybridation à 55°C pendant 30s et une élongation à 72°C pendant 30s avec une étape d'élongation finale à 72°C pendant 5min. Il est important de noter la température d'hybridation a été diminuée à 51 °C pour les échantillons prosimiens.
Détection par électrophorèse
Les produits de PCR ont été d'abord testés visuellement par électrophorèse sur gel d'agarose (140V, 40min) sur des gels à 2% d'agarose en utilisant une coloration SYBR Safe (Invitrogen). Pour la préparation des échantillons pour la détection par électrophorèse capillaire, 1 μΙ de produits de PCR dilué 100 fois a été alors mélangé avec 0,2μΙ de standard interne de taille GeneScan-600LIZ et 8,8μΙ formamide Hi-Di . Après dénaturation à 95°C pendant 5 min, les échantillons ont été séparés sur un Genetic Analyzer ABI 3730 en utilisant POP-7 . Les données ont été analysées en utilisant un logiciel GeneMapper v. 4.0 .
Séquençaqe
UTX, UTY et SRY ont été amplifiés séparément en utilisant les paires d'amorces dans le tableau 6, comme précédemment décrit. Chaque produit de PCR a été séquencé dans deux réactions en utilisant les amorces PCR sens et anti-sens. La réaction de séquençage a été réalisée avec un kit de séquençage Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Les produits de PCR ont été séparés sur un Genetic Analyzer ABI 3730 (Applied Biosysems). Les séquences ont été analysées et assemblées en utilisant le logiciel Séquence Scanner v1.0 (Applied Biosystems) et l'éditeur d'alignement de séquence BioEdit.
Résultats
Les PCR multiplexs développés incluant à la fois les amorces UTX UTY et SRY permettent une détermination du sexe pour chaque échantillon d'ADN testé. Les résultats sont donnés au tableau 7.
Femelle Mâle
Profil F "Profil A Profil B Profil C
Hominidae Homo sapiens 2 2 0 0 Pan sp. 2 3 0 0
Gorilla sp. 1 2 0 0
Pongo sp. 1 2 0 0
Hylobatidae Hylobates sp. 2 2 0 0
Cercopithecidae Cercopithecus 1 1 0 0 sp.
Erythrocebus 1 0 0 0 patas
Cercocebus 0 1 0 0 torquatus
Mandrillus 0 1 0 0 sphinx
Lophocebus 1 0 0 0 albigena
Papio sp. 1 1 0 0
Macaca sp. 1 2 0 0
Atelidae Alouatta 0 1 0 0 caraya
Cebidae Saïmiri 0 0 0 3 sciureus
Cebus apella 1 0 0 1
Aotus 0 1 0 0 trivirgatus
Callithrix 0 1 0 0 jacchus
Lemuridae Hapalemur 6 7 0 0 sp.
Eulemur sp. 0 3 0 1
Lepilemuridae Lepilemur sp. 2 4 2 0
Indriidae Avahi sp. 3 1 1 0
Propithecus 4 2 0 0 sp.
Indri indri 0 0 0 1
Tableau 7
Des échantillons femelles ont été identifiés par un seul signal correspondant à des fragments spécifiques d'UTX de 125 bp (profil F, figure 9). Au contraire, trois profils différents ont été observés pour des échantillons mâles comme illustré aux figures 6 à 8. En effet, les échantillons mâles ont été identifiés soit par trois signaux, qui correspondaient au fragment spécifique de X et aux deux fragments spécifiques d'Y (profil A) ou occasionnellement par deux signaux qui correspondaient au fragment spécifique de X et seulement à un des deux fragments du chromosome Y c'est-à-dire soit à SRY (profil C) soit à UTY (profil B). Les résultats obtenus pour chaque échantillon sont donnés au tableau 5. Un profil typique de mâle (profil A) présentant à la fois des fragments SRY et UTY a été observé pour la plupart des échantillons. Les six échantillons qui ne présentaient pas de fragments UTY mais qui montraient clairement un signal spécifique de SRY appartiennent aux espèces de singes du Nouveau Monde (Saïmri sciureus (n=3) et Cebus apella (n=1 )) et aux deux espèces de prosimiens (Indri Indri (n=1 ) et Eulemur macaco flavifrons (n=1 )) Les cinq échantillons qui ne présentaient pas de fragment SRY mais montraient un signal spécifique d'UTY clair appartenaient aux espèces de singes de l'ancien Monde (Lophocebus albigena) et quatre espèces de prosimiens.
Pour les 54 échantillons testés dont le sexe était déjà connu, le sexe déterminé avec le nouveau test a toujours été concordant avec le sexe morphologique. Afin de chercher si un échec de l'amplification du locus UTY ou SRY était dû à une mutation dans le site de liaison de l'amorce ou à une délétion de nouveaux sets d'amorces UTRY et SRY ont été conçus. Les amplifications avec les seconds sets d'amorces ont été réussies pour tous les échantillons et le séquençage des amplicons en résultant a révélé que l'impossibilité d'amplifier le locus avec le premier set d'amorces était du à des mutations dans les sites de liaison des amorces.
Ainsi, le nouveau procédé développé permet de manière non ambiguë de déterminer le genre de tous les échantillons testés même en présence d'une mutation dans la région de l'amorce. Le premier et principal avantage de ce procédé est qu'il combine deux tests de sexage indépendant UTX/UTY et SRY dans un essai permettant une détermination exacte du sexe. En effet, 11 échantillons mâles qui n'avaient pas de fragments UTY ou SRY qui auraient été précédemment considérés comme des échantillons femelles sur la base de la seule analyse du locus UTX TUY ou SRY, ont été identifiés comme étant des mâles par la présente approche. Ceci montre le besoin d'un test de détermination du sexe qui inclut au moins 2 marqueurs Y pour les primates, empêchant alors une mauvaise identification du sexe dues à un polymorphisme structurel élevé sur le chromosome Y ou à une mutation sur le site de liaison de l'amorce.
En utilisant deux fragments spécifiques de Y, l'effet négatif d'une mutation sur le site de liaison de l'amorce ou d'une délétion sur une amplification peut être minimisée étant donné qu'une mutation et/ou une délétion sur les deux loci a peu de risque de se produire. Le second avantage de ce procédé est son large spectre d'application chez le primate. En effet, il fonctionne sur toutes les espèces testées notamment grâce au travail sur la conception des amorces. Le même procédé fonctionne sur toutes les espèces testées mais une légère optimisation en réduisant la température d'hybridation est préférable pour sexer les espèces prosimiennes éloignées. Ce procédé est accessible aux laboratoires de biologie moléculaire avec un équipement basique étant donné que la différence de taille entre les trois produits d'amplification possibles est suffisamment importante pour être discernée par simple électrophorèse sur gel d'agarose et qu'un séquenceur automatique n'est pas nécessaire. Finalement, la petite taille des produits d'amplification (<200bp) les rend utile pour l'identification du sexe d'échantillons potentiellement dégradés tels que les échantillons de sérum et également les échantillons non invasifs tels que les cheveux ou les fèces.
REFERENCES
Au cours de cette demande, différentes références décrivent l'état de la technique de l'invention. Les descriptions de ces références sont ici incorporées par référence dans la présente description.
Butler JM, Schoske R, Vallone PM, Kline MC, Redd AJ, Hammer MF. A novel multiplex for simultaneous amplification of 20 Y chromosome STR markers. Forensic Sci Int. 2002 Sep 10; 129(1 ):10-24.
Parkin EJ, Kraayenbrink T, Opgenort JR, van Driem GL, Tuladhar NM, de Knijff P, Jobling MA. Diversity of 26-locus Y-STR haplotypes in a Nepalese population sample: isolation and drift in the Himalayas. Forensic Sci Int. 2007 Mar 2; 166(2-3): 176-81. Epub 2006 Jun 15.
Patel, P. I., et al. (1984) "Organization of the HPRT gene and related séquences in the human génome," Somat Cell Mol Genêt 10: 483-493, and Gill, P., et al. (1985) "Forensic application of DNA 'fingerprintsy Nature 318: 577-579.
Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9; 16(23):11 141-56. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.
Morral N, Estivill X. Multiplex PCR amplification of three microsatellites within the CFTR gene. Genomics. 1992 Aug; 13(4): 1362-4.
Ensminger AL, Hoffman SM. Sex identification assay useful in great apes is not diagnostic in a range of other primate species. Am J Primatol. 2002 Feb;56(2): 129-34.
Kimpton CP, Gill P, Walton A, Urquhart A, Millican ES, Adams M. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 1993 Aug;3(1 ):13-22.
Hammond; Schumm, J. W. et al. (1994) "Development of nonisotopic multiplex amplification sets for analysis of polymorphic STR loci," in "The Fourth International Symposium on Human Identification 1993," pp. 177-187
Goedbloed M, Vermeulen M, Fang RN, Lembring M, Wollstein A, Ballantyne K, Lao O, Brauer S, Krûger C, Roewer L, Lessig R, Ploski R, Dobosz T, Henke L, Henke J, Furtado MR, Kayser M. Comprehensive mutation analysis of 17 Y-chromosomal short tandem repeat polymorphisme included in the AmpFISTR Yfiler PCR amplification kit. Int J Légal Med. 2009 Nov;123(6):471-
Hanson EK, Ballantyne J. An ultra-high discrimination Y chromosome short tandem repeat multiplex DNA typing system. PLoS One. 2007 Aug 1 ;2(8):e688.
Ballantyne KN, Goedbloed M, Fang R, Schaap O, Lao O, Wollstein A, Choi Y, van Duijn K, Vermeulen M, Brauer S, Decorte R, Poetsch M, von Wurmb-Schwark N, de Knijff P, Labuda D, Vézina H, Knoblauch H, Lessig R, Roewer L, Ploski R, Dobosz T, Henke L, Henke J, Furtado MR, Kayser M.
Mutability of Y-chromosomal microsatellites: rates, characteristics, molecular bases, and forensic implications. Am J Hum Genêt. 2010 Sep 10;87(3):341-53. doi: 10.1016/j.ajhg.2010.08.006.
Vermeulen M, Wollstein A, van der Gaag K, Lao O, Xue Y, Wang Q, Roewer L, Knoblauch H, Tyler-Smith C, de Knijff P, Kayser M. Improving global and régional resolution of maie lineage differentiation by simple single-copy Y-chromosomal short tandem repeat polymorphisms. Forensic Sci Int Genêt. 2009 Sep;3(4):205-13. doi: 10.1016/j.fsigen.2009.01.009. Epub 2009 Feb 23.
Maybruck JL, Hanson E, Ballantyne J, Budowle B, Fuerst PA. A comparative analysis of two différent sets of Y-chromosome short tandem repeats (Y-STRs) on a common population panel. Forensic Sci Int Genêt. 2009 Dec;4(1 ): 1 1-20. doi: 10.1016/j.fsigen.2009.03.004. Epub 2009 May 17.
Hanson E, Maybruck JL, Ballantyne J, Fuerst PA. Performance évaluation and optimization of multiplex PCRs for the highly discriminating OSU 10-locus set Y-STRs. J Forensic Sci. 2012 Jan;57(1 ):52-9. doi: 10.11 1 1/j.1556-4029.2011.0 910.x. Epub 201 1 Sep 21.
Kayser M, Kittler R, Erler A, Hedman M, Lee AC, Mohyuddin A, Mehdi SQ, Rosser Z, Stoneking M, Jobling MA, Sajantila A, Tyler-Smith C. A comprehensive survey of human Y- chromosomal microsatellites. Am J Hum Genêt. 2004 Jun;74(6): 1183-97.
SULLIVAN KM, MANNUCCI A, KIMPTON CP, GILL P. A rapid and quantitative dna sex test: fluorescence-based pcr analysis of x-y homologous gene amelogenin. Biotechniques. 1993 oct;15(4):636-8, 640-1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé comprenant une étape de :
-détermination des allèles d'au moins 10 loci STR de l'échantillon d'ADN, les loci étant choisis dans le groupe M2,
dans lequel :
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
2. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon la revendication 1 comprenant en outre l'étape de détermination des allèles d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M1 ,
dans lequel :
-le groupe M1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538.
3. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon la revendication 1 ou 2 comprenant la détermination des allèles de 10 à 50 loci STR, préférablement les allèles de 10 à 40 loci STR, plus préférablement les allèles de 10 à 32 loci STR.
4. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comprenant l'étape de détermination des allèles de 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
5. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprenant la détermination des allèles :
-de 18 loci STR choisis dans le groupe M1
et
-de 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
6. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 comprenant une étape de détermination du sexe dans lequel la détermination du sexe comprend l'étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX de l'échantillon d'ADN.
7. Procédé pour caractériser un échantillon d'ADN selon la revendication 6 dans lequel l'étape d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX comprend l'ajout de paires d'amorces ayant les séquences nucléiques :
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
8. Kit comprenant des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 10 loci STR d'un échantillon d'ADN humain ou de chimpanzé, les loci étant choisis dans le groupe M2, dans lequel :
-le groupe M2 consiste en :
Y-GATA-A10, DYS570, DYS549, DYS460, DYS442, DYS510, DYS541 , DYS576, DYS513, DYS458, DYS481 , DYS612, DYS444 et DYS533.
9. Kit selon la revendication 8 comprenant au moins 10 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR et
dans lequel les paires d'amorces ont des séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en :
SEQ ID NO : 37 et SEQ ID NO : 38 pour le locus Y-GATA-A10
SEQ ID NO : 39 et SEQ ID NO : 40 pour le locus DYS570,
SEQ ID NO : 41 et SEQ ID NO : 42 pour le locus DYS549,
SEQ ID NO : 43 et SEQ ID NO : 44 pour le locus DYS460,
SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : 46 pour le locus DYS442
SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 48 pour le locus DYS510,
SEQ ID NO : 49 et SEQ ID NO : 50 pour le locus DYS541 ,
SEQ ID NO : 51 et SEQ ID NO : 52 pour le locus DYS576,
SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 54 pour le locus DYS513,
SEQ ID NO : 55 et SEQ ID NO : 56 pour le locus DYS458,
SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 58 pour le locus DYS481
SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 60 pour le locus DYS612,
SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 62 pour le locus DYS444 et
SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : 64 pour le locus DYS533.
10. Kit selon la revendication 8 ou 9 comprenant, en outre, des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 10 loci STR choisis dans le groupe M1 ,
dans lequel :
-le groupe M1 consiste en :
DYS485, DYS588, DYS502, DYS461 , DYS638, DYS643, DYS587, DYS575, DYS578, DYS632, DYS508, DYS640, DYS511 , DYS577, DYS556, DYS517, DYS565 et DYS538.
1 1. Kit selon la revendication 10 comprenant au moins 10 paires d'amorces adaptées pour amplifier les loci STR et
dans lequel les paires d'amorces ont des séquences nucléiques choisies dans le groupe consistant en :
SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 pour le locus DYS485,
SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4 pour le locus DYS588,
SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6 pour le locus DYS502,
SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 pour le locus DYS461 ,
SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 pour le locus DYS638,
SEQ ID NO : 1 1 et SEQ ID NO : 12 pour le locus DYS643,
SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14 pour le locus DYS587,
SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16 pour le locus DYS575,
SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18 pour le locus DYS578,
SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20 pour le locus DYS632,
SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22 pour le locus DYS508,
SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24 pour le locus DYS640,
SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26 pour le locus DYS511 ,
SEQ ID NO: 27 et SEQ ID NO : 28 pour le locus DYS577,
SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30 pour le locus DYS556,
SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32 pour le locus DYS517,
SEQ ID NO : 33 et SEQ ID NO : 34 pour le locus DYS565,
SEQ ID NO : 35 et SEQ ID NO : 36 pour le locus DYS538.
12. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 comprenant des moyens pour déterminer les allèles de 10 à 50 loci STR, préférablement les allèles de 10 à 40 loci STR, plus préférablement les allèles de 10 à 32 loci STR.
13 Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 12 comprenant des moyens pour déterminer les allèles d'au moins 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
14. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 13 comprenant des moyens pour déterminer les allèles :
-de 18 loci STR choisis dans le groupe M1
et
-de 14 loci STR choisis dans le groupe M2.
15. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 comprenant des moyens de détermination du sexe, dans lequel les moyens de détermination du sexe consistent en des moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX.
16. Kit selon la revendication 15 dans lequel les moyens d'amplification des gènes SRY, UTY et UTX comprennent les paires d'amorces ayant les séquences nucléiques :
SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 pour SRY,
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 68 pour UTY
et
SEQ ID NO: 67 et SEQ ID NO: 69 pour UTX.
PCT/EP2014/075866 2013-11-27 2014-11-27 Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l'empreinte genetique d'un sujet Ceased WO2015078997A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1361715 2013-11-27
FR1361715A FR3013733A1 (fr) 2013-11-27 2013-11-27 Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l'empreinte genetique d'un sujet

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015078997A1 true WO2015078997A1 (fr) 2015-06-04

Family

ID=50482928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2014/075866 Ceased WO2015078997A1 (fr) 2013-11-27 2014-11-27 Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l'empreinte genetique d'un sujet

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3013733A1 (fr)
WO (1) WO2015078997A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112746096A (zh) * 2020-12-31 2021-05-04 郑州高新生物技术有限公司 一种基于二代测序的人类y-str检测方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155084A1 (fr) * 2011-05-12 2012-11-15 Netbio, Inc. Procédés et compositions destinés à l'amplification multiplex rapide de loci de séquences courtes répétées en tandem

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012155084A1 (fr) * 2011-05-12 2012-11-15 Netbio, Inc. Procédés et compositions destinés à l'amplification multiplex rapide de loci de séquences courtes répétées en tandem

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A GREENFIELD ET AL: "The UTX gene escapes X inactivation in mice and humans", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 7, no. 4, 1 April 1998 (1998-04-01), pages 737 - 742, XP055127629, DOI: 10.1093/hmg/7.4.737 *
AXEL ERLER ET AL: "Development of Y-chromosomal microsatellite markers for nonhuman primates", MOLECULAR ECOLOGY, vol. 13, no. 10, 14 October 2004 (2004-10-14), pages 2921 - 2930, XP055127332, ISSN: 0962-1083, DOI: 10.1111/j.1365-294X.2004.02304.x *
BUTLER J M ET AL: "Allele frequencies for 27 Y-STR loci with U.S. Caucasian, African American, and Hispanic samples", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHERS IRELAND LTD, IE, vol. 156, no. 2-3, 27 January 2006 (2006-01-27), pages 250 - 260, XP027939878, ISSN: 0379-0738, [retrieved on 20060127] *
ERIN HANSON ET AL: "Performance Evaluation and Optimization of Multiplex PCRs for the Highly Discriminating OSU 10-Locus Set Y-STRs*,+", JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES, vol. 57, no. 1, 21 September 2011 (2011-09-21), pages 52 - 59, XP055127616, ISSN: 0022-1198, DOI: 10.1111/j.1556-4029.2011.01910.x *
ERIN K. HANSON ET AL: "An Ultra-High Discrimination Y Chromosome Short Tandem Repeat Multiplex DNA Typing System", PLOS ONE, vol. 2, no. 8, 1 August 2007 (2007-08-01), pages e688, XP055062352, DOI: 10.1371/journal.pone.0000688 *
GUSMAO L ET AL: "DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics (ISFG): An update of the recommendations on the use of Y-STRs in forensic analysis", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHERS IRELAND LTD, IE, vol. 157, no. 2-3, 10 March 2006 (2006-03-10), pages 187 - 197, XP027939835, ISSN: 0379-0738, [retrieved on 20060310] *
HANSON E K ET AL: "Population data for 48 'Non-Core' Y chromosome STR loci", LEGAL MEDICNE, JAPANESE SOCIETY OF LEGAL MEDICINE, TOKYO, JP, vol. 9, no. 4, 1 July 2007 (2007-07-01), pages 221 - 231, XP025321576, ISSN: 1344-6223, [retrieved on 20070530], DOI: 10.1016/J.LEGALMED.2006.12.002 *
KAYE N. BALLANTYNE ET AL: "Mutability of Y-Chromosomal Microsatellites: Rates, Characteristics, Molecular Bases, and Forensic Implications", THE AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 87, no. 3, 1 September 2010 (2010-09-01), pages 341 - 353, XP055079876, ISSN: 0002-9297, DOI: 10.1016/j.ajhg.2010.08.006 *
KAYSER ET AL: "Relating two deep-rooted pedigrees from Central Germany by high-resolution Y-STR haplotyping", 20070601, vol. 1, no. 2, 1 June 2007 (2007-06-01), pages 125 - 128, XP022122482 *
MAYBRUCK J L ET AL: "A comparative analysis of two different sets of Y-chromosome short tandem repeats (Y-STRs) on a common population panel", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS, ELSEVIER BV, NETHERLANDS, vol. 4, no. 1, 1 December 2009 (2009-12-01), pages 11 - 20, XP026789909, ISSN: 1872-4973, [retrieved on 20090517], DOI: 10.1016/J.FSIGEN.2009.03.004 *
MIRIAM GOEDBLOED ET AL: "Comprehensive mutation analysis of 17 Y-chromosomal short tandem repeat polymorphisms included in the AmpFlSTR TM Yfiler TM PCR amplification kit", INTERNATIONAL JOURNAL OF LEGAL MEDICINE, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 123, no. 6, 26 March 2009 (2009-03-26), pages 471 - 482, XP019760116, ISSN: 1437-1596, DOI: 10.1007/S00414-009-0342-Y *
RODIG ET AL: "Evaluation of haplotype discrimination capacity of 35 Y-chromosomal short tandem repeat loci", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL, ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHERS IRELAND LTD, IE, vol. 174, no. 2-3, 8 January 2008 (2008-01-08), pages 182 - 188, XP022413310, ISSN: 0379-0738, DOI: 10.1016/J.FORSCIINT.2007.04.223 *
VERMEULEN M ET AL: "Improving global and regional resolution of male lineage differentiation by simple single-copy Y-chromosomal short tandem repeat polymorphisms", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL: GENETICS, ELSEVIER BV, NETHERLANDS, vol. 3, no. 4, 1 September 2009 (2009-09-01), pages 205 - 213, XP026396384, ISSN: 1872-4973, [retrieved on 20090223], DOI: 10.1016/J.FSIGEN.2009.01.009 *
VILLESEN PALLE ET AL: "Fast and non-invasive PCR sexing of primates: apes, Old World monkeys, New World monkeys and Strepsirrhines", BMC ECOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD., LONDON, GB, vol. 6, no. 1, 8 June 2006 (2006-06-08), pages 8, XP021017110, ISSN: 1472-6785, DOI: 10.1186/1472-6785-6-8 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112746096A (zh) * 2020-12-31 2021-05-04 郑州高新生物技术有限公司 一种基于二代测序的人类y-str检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
FR3013733A1 (fr) 2015-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1601798B1 (fr) Biopuces a sondes et leurs methodes d&#39;utilisation
KR101923647B1 (ko) 쥬빌리 타입 또는 크림슨 타입 수박 품종 판별용 snp 마커
FI112093B (fi) Menetelmä ja testipakkaus geneettisen identiteetin osoittamiseksi
EP2922969B1 (fr) Marqueurs moléculaires et méthodes pour l&#39;identification des génotypes de palmier dattier
JP2004529618A (ja) 核酸の分析の方法
EP2982762B1 (fr) Procédé d&#39;amplification d&#39;acide nucléique utilisant une amorce réactive allèle-spécifique
CN114891900B (zh) 一种棕点石斑鱼微卫星标记及其引物
Wendt et al. Analysis of short tandem repeat and single nucleotide polymorphism loci from single-source samples using a custom HaloPlex target enrichment system panel
CN108559782B (zh) 短体副鳅微卫星位点及其引物和应用
CN101294218B (zh) 三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术
EP1917365A2 (fr) Procede pour le diagnostic du cancer du sein
Miller et al. Whole blood RNA offers a rapid, comprehensive approach to genetic diagnosis of cardiovascular diseases
WO2015078997A1 (fr) Procede et kit pour determiner le sexe et/ou l&#39;empreinte genetique d&#39;un sujet
FR2842534A1 (fr) Amplification multiplex quantitative a l&#39;echelle d&#39;un genome, et applications a la detection de remaniements genomiques
KR20160138856A (ko) 로드아일랜드레드 닭 품종 판단용 snp 마커 및 이의 용도
KR102083675B1 (ko) 단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법
EP1802773B1 (fr) Procédé pour le diagnostic d&#39;une intolérance à l&#39;aspirine
WO2021152257A1 (fr) Procede de genotypage hla simple et rapide
EP1944380A1 (fr) Méthode d&#39;obtention d&#39;un profil génétique spécifique d&#39;une variété d&#39;orge à l&#39;aide de couples d&#39;amorces
CN113215278A (zh) 一种绵羊h-fabp基因单倍型检测方法
KR102575912B1 (ko) 시니그린 저함량 양배추 판별용 snp 마커 및 이의 용도
CN113136436B (zh) 大鼠遗传背景相关snp及其用途
KR20250064058A (ko) 북극식물 담자리꽃나무 판별용 snp 마커 및 이의 용도
EP1478780B1 (fr) Procede de detection in vitro des cancers par la mise en evidence de desequilibres alleliques de marqueurs d insertion-deleti on
KR101700623B1 (ko) 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준 판단용 snp 마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14821520

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14821520

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1