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WO2015045961A1 - 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 - Google Patents

蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 Download PDF

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WO2015045961A1
WO2015045961A1 PCT/JP2014/074418 JP2014074418W WO2015045961A1 WO 2015045961 A1 WO2015045961 A1 WO 2015045961A1 JP 2014074418 W JP2014074418 W JP 2014074418W WO 2015045961 A1 WO2015045961 A1 WO 2015045961A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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immunostaining
fluorescent
phosphor
hydrophilic polymer
polymer chain
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2014/074418
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English (en)
French (fr)
Inventor
拓司 相宮
健作 高梨
古澤　直子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to JP2015539128A priority Critical patent/JP6424825B2/ja
Publication of WO2015045961A1 publication Critical patent/WO2015045961A1/ja
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    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent nanoparticle label, a multiple immunostaining kit containing the fluorescent nanoparticle label, and a multiple immunostaining method using the multiple immunostaining kit.
  • a technique for binding an antibody to which a dye or a coloring enzyme is bound to an antigen in a tissue sample by an antigen-antibody reaction and causing the color to develop and detecting the antigen is widely known as a technique by immunohistochemistry (IMUNOHITOSHEMISTRY; IHC). Yes.
  • immunohistochemical method is sometimes referred to as “immunostaining” because it involves a color development process that visualizes an antigen-antibody reaction that is inherently invisible. Immunostaining is widely used in the medical and life science fields for the purpose of detecting the location of biomolecules in tissue samples.
  • DAB staining which is an example of immunostaining
  • DAB Diaminobenzidine; diaminobenzidine
  • DAB Diaminobenzidine
  • a chemical reaction chemical color development
  • DAB molecules are polymerized by O 2 2 ⁇ generated by the decomposition, and the antigen portion is stained brown.
  • immunostaining targeting markers such as CD34 antigen
  • Patent Document 1 discloses semiconductor fine particles whose surface is modified with polyethylene glycol (PEG) having a molecular weight of 300 to 20000. It is also disclosed that a biomolecule is provided at the tip of PEG of the semiconductor fine particles.
  • PEG polyethylene glycol
  • the surface of the semiconductor fine particles is modified with PEG (molecular weight of 300 to 3000, etc.), and a functional group (amino group, etc.) is provided at the tip of the PEG farthest from the surface.
  • PEG molecular weight of 300 to 3000, etc.
  • a functional group amino group, etc.
  • a biomolecule fluorescent labeling agent in which another biomolecule (DNA or the like) that can specifically bind to a biomolecule to be stained is bound to a group, and an immunofluorescent staining method using the same are disclosed.
  • Patent Document 4 two or more types of antigens are detected on the same tissue section, and the location and amount of each antigen are evaluated. Furthermore, Patent Document 4 discloses that, as a colored substance or a luminescent substance for the detection, a substance that colors or emits light by reaction with a substrate of a labeling enzyme and a fluorescent dye are used in combination with an optical microscope. It is described that it is preferable from the viewpoint that a fluorescence microscope or a laser confocal microscope can be used.
  • the detection accuracy of biomolecules can be improved by performing multiple immunostaining on the same biomolecule using immunostaining that uses chemical coloration and fluorescence immunostaining that uses luminescence by a fluorescent dye. Disclosure.
  • the present inventors absorb insoluble precipitates generated by the reaction between an enzyme and a predetermined substrate, the excitation light that irradiates the phosphor and the fluorescence emitted by the phosphor. It was speculated that this was the cause of the problems specific to multiple immunostaining as described above.
  • fluorescent immunostaining phosphor-integrated nanoparticles having phosphors accumulated are used, and biomolecule recognition molecules are bound to the phosphor-aggregated nanoparticles via a hydrophilic polymer chain having a specific length.
  • fluorescent immunostaining of a predetermined biomolecule can avoid the above-mentioned problems, and fluorescence observation of the predetermined biomolecule can be performed at the same level as single staining that performs only fluorescent immunostaining.
  • the present invention has been completed.
  • the present inventors have compared the fluorescent dye as compared with the single staining in which only fluorescent immunostaining is performed. I noticed a problem that the luminescence intensity or the number of observed bright spots decreased.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and in the multiple immunostaining method using both immunostaining using chemical color development and fluorescent immunostaining using fluorescence of a fluorescent substance such as a fluorescent dye,
  • An object of the present invention is to suppress the decrease in emission intensity or the number of bright spots.
  • a fluorescent nanoparticle label reflecting one aspect of the present invention is bound to a phosphor-integrated nanoparticle having phosphors in an accumulated state and a surface of the phosphor-integrated nanoparticle.
  • a fluorescent nanoparticle label for multiple immunostaining comprising a hydrophilic polymer chain (A) having a number average molecular weight of 3000 or more and a biomolecule recognition molecule bonded to the end of the hydrophilic polymer chain.
  • a multiple immunostaining agent kit comprises a fluorescent immunostaining agent having the fluorescent nanoparticle label and a chemical immunostaining agent capable of bright field observation.
  • the multiple immunostaining method reflecting one aspect of the present invention includes fluorescent immunostaining using the fluorescent immunostaining agent having the fluorescent nanoparticle label and chemical immunity capable of bright field observation.
  • This is a multiple immunostaining method in which chemical immunostaining using a staining agent is performed on the same section.
  • the above structure reduces the emission intensity or the number of bright spots due to the insoluble precipitate generated by the chemical color development. Can be suppressed. As a result, the number of bright spots obtained when fluorescent immunostaining is performed alone can be ensured even in multiple immunostaining.
  • FIG. 1A is a diagram showing a conceptual diagram of a conventional multiple immunostaining method.
  • FIG. 1B is a diagram showing an example of the multiple immunostaining method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a fluorescent nanoparticle label according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing another example of the fluorescent nanoparticle label according to the present invention.
  • the fluorescent nanoparticle label according to the present invention is used for multiple immunostaining, and has phosphor integrated nanoparticles having fluorescent substances such as fluorescent dyes integrated therein, and the number average bonded to the surface of the fluorescent integrated nanoparticles. It has a hydrophilic polymer chain having a molecular weight of 3000 or more and a biomolecule recognition molecule bonded to the end of the hydrophilic polymer chain.
  • the fluorescent immunostaining agent having this fluorescent nanoparticle label can be used as a multiple immunostaining together with a chemical coloring stain.
  • the phosphor-integrated nanoparticles are those in which phosphors are accumulated, and are sometimes referred to as fluorescent nanoparticle labels. By using such phosphor-integrated nanoparticles, it is possible to increase the amount of fluorescence emitted per particle, that is, the brightness of a bright spot marking a predetermined biomolecule, compared to the phosphor itself.
  • the term “phosphor” refers to a general substance that emits light in a process from an excited state to a ground state by being excited by irradiation with external X-rays, ultraviolet rays, or visible rays. Therefore, the “phosphor” in the present invention is not limited to the transition mode when returning from the excited state to the ground state, but is a substance that emits narrowly defined fluorescence that is light emission accompanying deactivation from the excited singlet. It may be a substance that emits phosphorescence, which is light emission accompanying deactivation from a triplet. Further, the “phosphor” referred to in the present invention is not limited by the emission lifetime after the excitation light is blocked.
  • phosphorescent substance such as zinc sulfide or strontium aluminate.
  • phosphors can be broadly classified into organic phosphors (fluorescent dyes) and inorganic phosphors.
  • organic phosphors examples include fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen Corporation) dye molecules, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen Corporation) dyes Molecule, cascade (registered trademark, Invitrogen) dye molecule, coumarin dye molecule, NBD (registered trademark) dye molecule, pyrene dye molecule, Texas Red (registered trademark) dye molecule, cyanine dye molecule, perylene dye Examples thereof include substances known as organic fluorescent dyes, such as dye molecules and oxazine dye molecules.
  • inorganic phosphor examples include quantum dots containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or group IV elements as components ("II-VI group quantum dots", " Or III-V quantum dots ”or“ IV quantum dots ”). You may use individually or what mixed multiple types.
  • CdSe CdS, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge, but are not limited thereto.
  • a quantum dot having the above quantum dot as a core and a shell provided thereon.
  • the core is CdSe and the shell is ZnS
  • CdSe / ZnS when the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS.
  • CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , Ge / ZnS, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • Quantum dots may be subjected to surface treatment with an organic polymer or the like as necessary.
  • organic polymer or the like as necessary. Examples thereof include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen), CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • the method for producing the phosphor-integrated nanoparticles in which the phosphor is integrated is not particularly limited, and can be produced by a known method. In general, a production method can be used in which phosphors are gathered together using a resin or silica as a base material (the phosphors are immobilized inside or on the surface of the base material).
  • Examples of a method for producing phosphor-integrated nanoparticles using organic phosphors include a method of forming resin particles having a diameter of nanometer order by fixing a fluorescent dye, which is a phosphor, inside or on the surface of a matrix made of resin. Can do.
  • the method for preparing the phosphor-integrated nanoparticles is not particularly limited.
  • a (co) monomer for synthesizing a resin (thermoplastic resin or thermosetting resin) that forms the matrix of the phosphor-integrated nanoparticles While (co) polymerizing the phosphor, a method of adding the phosphor and incorporating the phosphor into the inside or the surface of the (co) polymer can be used.
  • thermoplastic resin for example, polystyrene, polyacrylonitrile, polyfuran, or a similar resin
  • thermosetting resin for example, polyxylene, polylactic acid, glycidyl methacrylate, polymelamine, polyurea, polybenzoguanamine, polyamide, phenol resin, polysaccharide or similar resin
  • Thermosetting resins, particularly melamine resins are preferred in that elution of the dye encapsulated in the dye resin can be suppressed by treatments such as dehydration, penetration, and encapsulation using an organic solvent such as xylene.
  • polystyrene nanoparticles encapsulating an organic fluorescent dye can be obtained by a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982), or US Pat. No. 5,326,692 (1992). ), And the method of impregnating polystyrene nanoparticles with a fluorescent organic dye is described.
  • silica nanoparticles in which an organic phosphor is immobilized inside or on the surface of a matrix made of silica can also be produced.
  • the method for synthesizing FITC-encapsulated silica particles described in Langmuir Vol. 8, Vol. 8, page 2921 (1992) can be referred to.
  • Various fluorescent dye-containing silica nanoparticles can be synthesized by using a desired fluorescent dye instead of FITC.
  • Examples of a method for producing phosphor-integrated nanoparticles using an inorganic phosphor include a method of forming silica nanoparticles in which quantum dots, which are phosphors, are fixed inside or on the surface of a matrix made of silica. This production method can be referred to the synthesis of CdTe-containing silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry Vol. 33, p. 561 (2009).
  • the silica beads are treated with a silane coupling agent to aminate the ends, and the semiconductor fine particles as phosphors having carboxyl group ends are amided on the surface of the silica beads.
  • a method for collecting phosphors to form phosphor-integrated nanoparticles is also exemplified.
  • a reverse micelle method and a mixture of organoalkoxysilane and alkoxide having an organic functional group with good adsorptivity to semiconductor nanoparticles at the molecular end as a glass precursor are used.
  • glass-like particles in which semiconductor nanoparticles are dispersed and fixed are formed to form phosphor-integrated nanoparticles.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • an aggregate in which an inorganic phosphor is immobilized inside or on the surface of a matrix made of resin can be made using the method of impregnating quantum nanoparticles into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology Vol. 19, p. 631 (2001).
  • the hydrophilic polymer chain used for the surface modification of the phosphor-integrated nanoparticles is a hydrophilic polymer having a predetermined number average molecular weight for linking the phosphor-integrated nanoparticles and a biomolecule recognition molecule described later ( A) and optionally a hydrophilic polymer (B) having a number average molecular weight other than the hydrophilic polymer (A) (usually smaller than the hydrophilic polymer (A)) are used (see FIG. 3 see PEG chain 1 and PEG chain 2 example).
  • hydrophilic polymers (A) and (B) include, but are not limited to, polyethylene glycol, ficoll, polyvinyl alcohol, styrene-maleic anhydride alternating copolymer, divinyl ether-maleic anhydride alternating copolymer, polyvinyl Pyrrolidone, polyvinyl methyl ether, polyvinyl methyl oxazoline, polyethyl oxazoline, polyhydroxypropyl oxazoline, polyhydroxypropyl methacrylamide, polymethacrylamide, polydimethylacrylamide, polyhydroxypropyl methacrylate, polyhydroxyethyl acrylate, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, Examples include polyaspartamide and synthetic polyamino acids.
  • hydrophilic polymer chains (A) and (B) one type or two or more types of hydrophilic polymers selected from the group formed by the exemplified hydrophilic polymers can be used.
  • hydrophilic polymers exemplified above polyethylene glycol (PEG) is preferable from the viewpoint of easy setting of the chain length depending on the number of oxyethylene units.
  • the number average molecular weight of the hydrophilic polymer chain (A) is 3000 or more, preferably 5000 or more, and preferably 20000 or less.
  • the number average molecular weight of this hydrophilic polymer chain (A) is compared with the case where fluorescent immunostaining is performed alone when multiple immunostaining is performed using immunostaining using chemical coloring and fluorescent immunostaining.
  • the number of bright spots resulting from the phosphor can be adjusted to be confirmed to the same extent.
  • the number of bright spots can be confirmed with a fluorescence microscope or the like as will be described later.
  • the number average molecular weight of the hydrophilic polymer chain (B) is usually less than 3000, preferably 300 or more.
  • the number average molecular weight of the hydrophilic polymer chain (B) can be adjusted in consideration of the effect of preventing aggregation of the phosphor-integrated nanoparticles.
  • the polymer structural unit contained in the chemical structure of the hydrophilic polymer is used. It is preferable to adjust by the number.
  • the hydrophilic polymer is PEG, it is preferably adjusted by the number (n) of oxyethylene units (—CH 2 —CH 2 —O).
  • the number average molecular weight of the phosphor-integrated nanoparticles is measured by a gel permeation chromatography (GPC) method using tetrahydrofuran (THF) as a column solvent. Specifically, 1 mL of THF is added to 1 mg of a measurement sample, and the mixture is sufficiently dissolved by stirring using a magnetic stirrer at room temperature. Next, after processing with a membrane filter having a pore size of 0.45 to 0.50 ⁇ m, it is injected into the GPC.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the measurement conditions of GPC are measured by stabilizing the column at 40 ° C., flowing THF at a flow rate of 1 mL / min, and injecting about 100 ⁇ L of a sample having a concentration of 1 mg / mL.
  • the column it is preferable to use a combination of commercially available polystyrene gel columns.
  • Shodex GPC KF-801, 802, 803, 804, 805, 806, 807 made by Showa Denko KK, TSKgel G1000H, G2000H, G3000H, G4000H, G5000H, G6000H, G7000H, TSK guard column made by Tosoh Corporation Combinations can be mentioned.
  • a refractive index detector (RI detector) is preferably used as the detector.
  • the molecular weight distribution of the sample is calculated using a calibration curve or the like created using monodisperse polystyrene standard particles. It is preferable to use about 10 points as polystyrene for preparing a calibration curve.
  • the bond between the hydrophilic polymer and the phosphor-integrated nanoparticles is not particularly limited, and may be bonded or bonded by an appropriate bonding mode such as a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, a coordination bond, a physical adsorption, or a chemical adsorption.
  • an amide bond, an ester bond, an imide bond, a covalent bond such as a bond using thiol addition to a maleimide group, or the like, or a biotin-avidin bond or a biotin-streptavidin bond is preferable.
  • biotin-avidin bond or biotin-streptavidin bond is more preferable from the viewpoint of strength of binding force and specificity of binding.
  • binding methods include biotin-avidin method, thiol group-maleimide group coupling reaction method, method using chemical linker, cross-linking agent (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), etc.) Examples of the crosslinking reaction method and ion binding method using
  • an amino group (NH 2 group) is present on the surface of the phosphor-integrated nanoparticle, for example, it is bound to biotin (biomolecule recognition molecule) as shown in [Chemical Formula 1] below.
  • a PEGylation reagent can be preferably used.
  • the N-hydroxysuccinimidyl ester group of the PEGylating reagent (the functional group at the left end of [Chemical Formula 1]) reacts with the amino group on the surface of the phosphor-integrated nanoparticle to form the phosphor-integrated nanoparticle.
  • a PEG chain and biotin are added (see FIG. 2).
  • a sulfhydryl group (SH group) is present on the surface of the phosphor-integrated nanoparticle, for example, it binds to biotin (biomolecule recognition molecule) as shown in [Chemical Formula 2] below.
  • a PEGylation reagent can be preferably used.
  • the maleimide group of the PEGylation reagent (functional group at the left end of [Chemical Formula 2]) reacts with the sulfhydryl group (SH group) on the surface of the phosphor-integrated nanoparticle, and the phosphor-aggregated nanoparticle has a PEG chain.
  • biotin will be added (not shown).
  • the number average molecular weight of the PEG chain moiety “— (CH 2 CH 2 O) n—” derived from PEG (hydrophilic polymer) is calculated. In order to make it 3000 or more, it is preferable to set to the number (n) of oxyethylene units.
  • the chain length of the portion derived from the hydrophilic polymer is designed to be equal to or more than the number average molecular weight of the PEG chain. And can be used as a material for fluorescent nanoparticle labels.
  • a PEGylation reagent having a predetermined molecular weight can be obtained, for example, by requesting synthesis from a synthesis manufacturer (for example, CreativePEGWorks).
  • a functional group necessary for binding may be introduced into the phosphor-integrated nanoparticles or the hydrophilic polymer chain in advance.
  • a functional group necessary for phosphor-collected nanoparticles in advance when producing phosphor-collected nanoparticles using a thermoplastic resin, copolymerization is performed using glycidyl methacrylate as a monomer together with styrene.
  • the number of hydrophilic polymers to be bonded per phosphor-integrated nanoparticle can be adjusted by the number of functional groups as described above required for bonding, reaction conditions with the hydrophilic polymer, or the like.
  • thermosetting dye resin particles when producing thermosetting dye resin particles, melamine resin dye resin particles having an amino group on the surface are copolymerized using a melamine resin raw material (for example, MX035 manufactured by Sanwa Chemical Co., Ltd.) as a monomer. Can also be reacted with the PEGylation reagent and the like.
  • a melamine resin raw material for example, MX035 manufactured by Sanwa Chemical Co., Ltd.
  • Biomolecule recognition molecule used in the present invention means a molecule that specifically binds to a biomolecule such as an antigen.
  • Biomolecule recognition molecules include a primary antibody that recognizes a specific biomolecule to be stained, a secondary (to nth) antibody that recognizes this antibody, and a specific antibody that binds to the secondary (to nth) antibody.
  • Examples of biomolecule recognition molecules include antibodies, biotin, and avidin (including analogs such as streptavidin).
  • antibody is used to include any antibody fragment or derivative, and includes Fab, Fab′2, CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (ScFv) and the like. Contains various antibodies.
  • the term “antigen” refers to a biological material, particularly a molecule or molecular fragment (polypeptide, oligopeptide, etc.) consisting of a protein, but any biological material capable of producing antibodies and immunostaining can be used.
  • a molecule or molecular fragment other than a protein such as a nucleic acid (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), etc., or nucleoside, It is also possible that nucleotides and their modified molecules) can be antigens.
  • Antibodies that are constituents of antibody drugs can be used as biomolecule recognition molecules.
  • Examples of antibody drugs include antibody drugs generally used for the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, malignant tumors such as cancer, and viral infections.
  • Biomolecular recognition molecules and hydrophilic polymer chain ends and bonds are covalent bonds, ionic bonds, hydrogen bonds, coordinate bonds, physical adsorption, as well as the bonds between phosphor-integrated nanoparticles and hydrophilic polymer chains. From the viewpoint of bonding by an appropriate bonding mode such as chemisorption and the strength of bonding force, a covalent bond such as an amide bond, an ester bond, an imide bond, and a bond using thiol addition to a maleimide group is preferable.
  • Specific binding methods for binding between the biomolecule recognition molecule and the end of the hydrophilic polymer chain include biotin-avidin method, thiol group-maleimide group coupling reaction method, method using existing chemical linker, crosslinking Examples thereof include a crosslinking reaction method using an agent (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and the like), an ionic bond method, and the like.
  • the biomolecules to be stained for chemical immunostaining and fluorescent immunostaining are not particularly limited, and may be the same or different.
  • staining targets for example, when the target of chemical immunostaining is CD34 antigen and the target of fluorescent immunostaining is VEGFR-2
  • multiple staining targets are to be detected separately by different staining methods
  • the binding mode of the biomolecule recognition molecule and the target to be stained in fluorescent immunostaining is different from the binding mode of the biomolecule recognition molecule and the target to be stained in chemical immunostaining to avoid unintentional binding and competition between molecules. Is appropriate.
  • the binding mode is such that a complex of antigen to be stained—primary antibody (mouse antibody) —enzyme-labeled secondary antibody (anti-mouse IgG antibody) is formed
  • primary antibody molecular antibody
  • anti-mouse IgG antibody enzyme-labeled secondary antibody
  • fluorescent immunostaining Is a binding mode that forms a complex of antigen-primary antibody to be stained (rabbit antibody) -biotinylated secondary antibody (anti-rabbit IgG antibody) -phosphor-integrated nanoparticles having avidin as a biomolecule recognition molecule It can be.
  • the multiple immunostaining method according to the present invention is a multiple immunostaining method that performs both staining using chemical color development and fluorescent immunostaining using fluorescent nanoparticle labels.
  • the target of staining in the multiple staining method according to the present invention is a biomolecule targeted by a general immunostaining method, and is a tumor marker, a signal transmitter, a hormone, a cancer growth regulator, a metastasis regulator, a growth regulator acceptance. Body, metastasis regulator receptor and the like.
  • Deparaffinization treatment step A pathological section is immersed in a container containing xylene to remove paraffin.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
  • the pathological section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Further, if necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Moreover, you may exchange water in the middle of immersion as needed.
  • Activation treatment step When immunohistochemical staining is performed as histochemical staining, it is preferable to perform activation treatment of a target biomolecule according to a known method.
  • the activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris
  • a heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, etc. can be used.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the heat treatment temperature for the activation treatment can be 50 to 130 ° C., and the heat treatment time can be 5 to 30 minutes.
  • the section after the activation treatment is immersed in a container containing PBS and washed.
  • the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, PBS may be replaced during the immersion.
  • Staining treatment step A for chemical immunostaining includes a binding step A in which an antibody linked to a coloring enzyme is bound to a specific biomolecule in a pathological section by an antigen-antibody reaction, and the like. And a color development step A in which a color development substrate is added to the reaction system and color is developed by the color development enzyme.
  • the above binding to the biomolecule can be performed by a known method.
  • a known blocking agent such as PBS containing BSA is preferably added dropwise and incubated at room temperature for a predetermined time (for example, 1 hour).
  • the coloring enzyme substrate and the coloring agent are added to the reaction system for chemical coloration.
  • the coloring agent that is the object of the present invention is to generate an insoluble precipitate in the coloring reaction, and Can be illustrated.
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB 3,3,5,5-tetramethylbenzidine
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • 4-chloro-1-naphthol, etc. are targeted It becomes.
  • an enzyme alkaline phosphatase is used as a color-developing enzyme, new fuchsin and the like are targeted.
  • color formers that generate unnecessary precipitates by chemical color development are targeted.
  • the staining process B for fluorescent immunostaining includes a binding process B for binding the biomolecule recognition molecule of the fluorescent nanoparticle label and the biomolecule.
  • the biomolecule here means an antigen to be stained by fluorescent immunostaining, a primary antibody specifically bound to the antigen, a secondary (n-order) antibody bound to the primary antibody, or the antigen or It means any of the other biomolecules bound to the 1st to nth antibodies. Further, there is no limitation on the order of binding between the aforementioned antigen, primary antibody, secondary (n-order) antibody, other biomolecules, and biomolecule recognition molecules.
  • a fluorescent nanoparticle labeled buffer (PBS or the like) dispersion is prepared, placed on a pathological section, and the fluorescent nanoparticle labeled biomolecule recognition molecule and the biomolecule Are combined.
  • the stained section is immersed in a container containing a buffer (PBS or the like) to remove unreacted fluorescent nanoparticle labels, antibodies having a coloring enzyme, and the like.
  • the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, the buffer (such as PBS) may be exchanged during the immersion.
  • the fixing treatment step is a step of immobilizing the color former and fluorescent nanoparticle label introduced in the tissue staining treatment step (1) on a tissue section.
  • fixing treatment solution examples include cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, and cell membrane permeants.
  • cross-linking agents such as formalin, paraformaldehyde, glutaraldehyde, acetone, ethanol, methanol, and cell membrane permeants.
  • the fixing process can be performed by a conventionally known method.
  • the fixation treatment can be performed by immersing the stained tissue section obtained by the histochemical staining step in the fixation treatment solution as described above.
  • it can be performed by immersing a stained tissue section obtained by the histochemical staining step in a dilute paraformaldehyde aqueous solution for about several minutes to several hours.
  • Observation step (5-1) Bright field observation step In the bright field observation step, the coloring agent dye deposited on the tissue section by applying illumination light to the tissue section stained in steps (1) to (4). And obtaining distribution information (number of coloring points, etc.) of the biomolecule A to be stained in the cell or tissue.
  • Bright field observation may be performed by a general method. For example, in bright-field observation when histological staining is performed as a biomolecule for staining VEGFR-2 protein in esophageal cancer cells, a 4 ⁇ objective lens of an optical microscope is used under irradiation with appropriate illumination light. Use to observe the VEGFR-2 protein positive staining image, the intensity of positive staining, and the positive cell rate of cancer cells in the specimen tissue. Next, the objective lens is switched to 10 times, it is confirmed whether the positive findings are localized in the cell membrane or the cytoplasm, and if necessary, further searching is performed with the objective lens 20 times.
  • the distribution information of the biomolecule A and the distribution information of the biomolecule B may be obtained from a microscope barrel so that rapid observation can be performed, or an image taken by a camera installed in the microscope is separately obtained. You may make it acquire by displaying on a display means (monitor etc.) and observing it.
  • the fluorescence observation step is a biomolecule based on the fluorescence emitted by the fluorescent nanoparticle labeled body in the tissue section stained in the above-described step by irradiating the fluorescent body with excitation light. This is a process of acquiring B distribution information (such as the number of bright spots).
  • the excitation light irradiates a suitable excitation light to the phosphor to excite the phosphor, and stains a biomolecule to be stained with fluorescence.
  • the excitation light irradiation means is not particularly limited.
  • a stained tissue section may be irradiated with excitation light having an appropriate wavelength and output from a laser light source included in a fluorescence microscope using a filter that selectively transmits a predetermined wavelength as necessary.
  • the excitation light is not particularly limited as long as the fluorescence emitted by the label can be identified in relation to the autofluorescence of the tissue section.
  • the excitation light is a substrate (for example, diamino) that allows visual observation of fluorescence and allows bright field observation. From the viewpoint of avoiding absorption by benzidine) and preventing the autofluorescence intensity from the tissue section from becoming too high, those having a wavelength of 450 nm to 700 nm are preferable.
  • the fluorescent substance constituting the fluorescent substance used as the fluorescent label a fluorescent substance that emits fluorescence having a peak in the range of 480 nm or more, preferably in the range of 580 to 690 nm by the excitation light is used (therefore, the emission wavelength in this region). ) To measure fluorescence.
  • the distribution information of the biomolecules A and B may be acquired from a (fluorescence) microscope barrel so that rapid observation can be performed, or a camera installed in the (fluorescence) microscope takes a picture.
  • the obtained image may be separately displayed on a display means (a monitor or the like) and acquired by observing it.
  • the biomolecule distribution information can be obtained from the image taken by the camera even if the biomolecule distribution information cannot be obtained sufficiently by visual observation from the microscope barrel. Sometimes it is possible to do.
  • Obtaining the distribution information of the biomolecules A and B includes, for example, measuring the number or density of biomolecules to be stained per cell based on the number of fluorescent luminescent spots or emission luminance.
  • an excitation light source and an optical filter for fluorescence detection corresponding to the absorption maximum wavelength and the fluorescence wavelength may be selected.
  • the measurement of the number of bright spots or emission luminance it is preferable to use commercially available image analysis software (for example, all bright spot automatic measurement software “G-Count” (manufactured by Zeonstrom)), but the measuring means is particularly limited. Is not to be done.
  • multiple immunostaining an example of multiple immunostaining for staining two types of biomolecules has been shown, but more biomolecules C can be obtained by changing the emission wavelength range of the color former or the phosphor. Multiple immunostaining may be used to detect.
  • the fluorescent nanoparticle label according to the present invention comprises a phosphor-integrated nanoparticle having a phosphor integrated state, and a hydrophilic polymer having a number average molecular weight of 3000 or more bonded to the surface of the phosphor-integrated nanoparticle.
  • a particle comprising a chain and a biomolecule recognition molecule bonded to the end of the hydrophilic polymer chain.
  • the fluorescent nanoparticle label according to the present invention is used for multiple immunostaining in which fluorescent immunostaining and chemical coloring are used for the purpose of detecting the same or different antigens
  • biomolecule recognition of the fluorescent nanoparticle label is first performed. Molecules bind to the antigen and biomolecules (antibodies, etc.) bound thereto, and the antigen is stained with fluorescence.
  • an antibody to which an enzyme for chemical color development is added to the same or different antigen as this antigen is bound, and a chemical color reaction occurs by adding a color former to stain the antigen.
  • the number average molecular weight of the hydrophilic polymer chain of the fluorescent nanoparticle labeling body is 3000 or more, it is physically separated from the insoluble precipitates (such as those obtained by polymerizing the color former) generated by the chemical color development.
  • the phosphor is arranged at the position, and the light emission from the phosphor is not easily inhibited by the insoluble precipitate (refer to FIGS. 1A and 1B for comparison). As a result, the same number of bright spots as when fluorescent immunostaining is performed alone can be secured, and the antigen detection accuracy in multiple immunostaining is improved.
  • hydrophilic polymer chain (A) and / or the hydrophilic polymer chain (B) is polyethylene glycol, unintended activation of biomolecules can be prevented.
  • biomolecule recognition molecule is avidin that can bind to biotin linked to a primary antibody that can specifically bind to the antigen to be stained or a secondary antibody that can bind to the primary antibody
  • biotin And avidin are used for the binding of fluorescent nanoparticle label and biomolecules, so the time from adding the fluorescent nanoparticle label to the reaction system to observing fluorescence is short. Thus, it is possible to suppress the influence of the decrease in the fluorescence intensity at the bright spot due to the fading of the phosphor.
  • Example 1A Synthesis of Labeling Agent A (Streptavidin-Linked Texas Red Dye Encapsulated Melamine Resin Nanoparticles with Polyethylene Glycol with Number Average Molecular Weight 3400) 2.5 mg of sulforhodamine 101 (“Sulforhodamine 101”, Sigma Aldrich, Texas Red dye) After dissolving in 5 mL, the solution was stirred for 20 minutes while maintaining the temperature of the solution at 70 ° C. with a hot stirrer. To the stirred solution, 1.5 g of melamine resin “Nicalak MX-035” (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) was added, and the mixture was further heated and stirred under the same conditions for 5 minutes.
  • melamine resin “Nicalak MX-035” manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.
  • the solution After adding 100 ⁇ L of formic acid to the stirred solution and stirring the solution for 20 minutes while maintaining the temperature of the solution at 60 ° C., the solution was left to cool to room temperature.
  • the cooled solution is dispensed into a plurality of centrifuge tubes, centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes, and Texas Red dye-encapsulated melamine resin nanoparticles (hereinafter abbreviated as Particle A) contained in the solution as a mixture. .) was precipitated and the supernatant was removed. Thereafter, the precipitated particles A were washed with ethanol and water.
  • the concentration of the particle A whose surface was aminated was adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), so that the final concentration of this solution was 10 mM.
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Maleimide-PEG-carboxylate-NHS (SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400 manufactured by NOF Corporation) was mixed and reacted for 1 hour at room temperature with stirring.
  • the reaction solution was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again under the same conditions. By performing washing by the same procedure three times, particles A whose surface was modified with a PEG chain having a maleimide group at the terminal were obtained.
  • streptavidin having a sulfhydryl group was produced as follows. First, 40 ⁇ L of streptavidin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted to 1 mg / mL, N-succinimidyl-S-acetylthioacetate (N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA, Pirce) adjusted to 64 mg / mL 70 ⁇ L) was reacted at room temperature for 1 hour. That is, a thiol group (—NH—CO—CH 2 —S—CO—CH 3 ) protected against the amino group of streptavidin was introduced.
  • a free thiol group (—SH) was generated from the protected thiol group by a known hydroxylamine treatment, and a treatment for adding a thiol group (—SH) to streptavidin was performed.
  • the streptavidin solution was desalted with a gel filtration column (Zaba Spin Desaling Columns: Funakoshi) to obtain streptavidin capable of binding to the melamine particles.
  • PEG-modified particles A and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM EDTA and allowed to react for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After concentrating the obtained solution with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification to obtain labeling agent A.
  • Example 1B Multiple immunostaining
  • vascular growth factor vascular endothelial growth factor receptor-2 VEGFR-2
  • esophagus vascular growth factor vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) and esophagus are as follows: Multiple immunostaining was performed to detect the surface antigen CD34 of cancer cells in cancer tissues.
  • Example 1A Synthesis of streptavidin-conjugated lexathread dye-encapsulated melamine resin nanoparticles having molecular weight of 528 polyethylene glycol
  • Example 1B instead of maleimide-PEG-carboxylate-NHS (SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400 manufactured by NOF Corporation) , except that MAL-dPEG-NHS Ester (QB10284a polyethylene glycol part molecular weight 528, manufactured by Quanta) was used, the labeling agent B was prepared, and multiple immunostaining was performed as in Example 1A. Observations for confirming the number of bright spots were performed. Table 1 shows the results of Example 1B and Comparative Example 1B.
  • Labeling agent C Synthesis of streptavidin-linked lexathread dye-encapsulated melamine resin nanoparticles with polyethylene glycol having molecular weights of 5000 and 352
  • Maleimide-PEG-carboxylate-NHS manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400
  • -PEG-carboxylate-NHS SUNBRIGHT MA-050TS average molecular weight 5000 manufactured by NOF Corporation
  • MAL-dPEG-NHS Ester Quanta QB10274a polyethylene glycol part molecular weight 352 have final concentrations of 1 mM and 10 mM, respectively.
  • the labeling agent C was synthesized in the same manner as the synthesis of the labeling agent A, except that a mixture of 1:10 (molar ratio) was used. Further, using this labeling agent C, multiple immunostaining and observation for confirming the number of bright spots were performed in the same manner as in Example 1A.
  • Labeling agent D Synthesis of streptavidin-linked lexathread dye-encapsulated melamine resin nanoparticles with polyethylene glycol having molecular weights of 20000 and 2000 Maleimide-PEG-carboxylate-NHS (NOF Corporation, SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400) instead of maleimide -PEG-carboxylate-NHS (NOF SUNBRIGHT MA-200TS average molecular weight 20000) and maleimide-PEG-carboxylate-NHS (NOF SUNBRIGHT MA-020TS average molecular weight 2000) each with a final concentration of 1 mM.
  • Maleimide-PEG-carboxylate-NHS NOF Corporation, SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400
  • maleimide-PEG-carboxylate-NHS NOF SUNBRIGHT MA-200TS average molecular weight 20000
  • maleimide-PEG-carboxylate-NHS NOF SU
  • the labeling agent D was synthesized in the same manner as the synthesis of the labeling agent A, except that the mixture was mixed at 1:10 (molar ratio) so as to be 10 mM. In addition, this labeling agent D was used for multiple immunostaining and observation for confirming the number of bright spots as in Example 1A.
  • Labeling agent E Synthesis of streptavidin-conjugated lexathread dye-encapsulated melamine resin nanoparticles with polyethylene glycol having molecular weights of 40000 and 528 Maleimide-PEG-carboxylate-NHS (manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT MA-034TS average molecular weight 3400) -PEG-carboxylate-NHS (SUNBRIGHT MA-400TS average molecular weight 40000 manufactured by NOF Corporation) and MAL-dPEG-NHS Ester (Quanta QB10284a polyethylene glycol part molecular weight 528) so that the final concentrations are 1 mM and 10 mM, respectively.
  • the labeling agent E was synthesized in the same manner as the synthesis of the labeling agent A except that a mixture of 1:10 (molar ratio) was used.
  • a mixture of 1:10 (molar ratio) was used.
  • multiple immunostaining and observation for confirming the number of bright spots were performed as in Example 1A.
  • the fluorescent nanoparticle label according to the present invention As described above, the fluorescent nanoparticle label according to the present invention, the multiple immunostaining containing the fluorescent nanoparticle label, and the multiple immunostaining method using the multiple immunostaining have been described based on the embodiments and examples. However, the present invention is not limited to these, and design changes are allowed without departing from the gist of the present invention.

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Abstract

　本発明は、化学発色を利用する免疫染色と、蛍光色素等の蛍光体の発光を利用する蛍光免疫染色とを併用した多重免疫染色法において、前記発光程度の低下を抑制することを目的とする。本発明では、蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖と、該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子とを備えた多重免疫染色用の蛍光ナノ粒子標識体とすることで上記目的が達成される。

Description

蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法
　本発明は、蛍光ナノ粒子標識体、該蛍光ナノ粒子標識体を含む多重免疫染色剤キットおよび該多重免疫染色剤キットを用いた多重免疫染色法に関する。
　色素または発色用の酵素が結合した抗体を、組織サンプル中の抗原に抗原抗体反応により結合し、発色させて抗原を検出する手法は、免疫組織化学（ＩＭＭＵＮＯＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ；ＩＨＣ）による手法として広く知られている。このような免疫組織化学的な手法は、本来不可視である抗原抗体反応を可視化する発色処理を伴うことから「免疫染色」と称されることがある。免疫染色は、組織サンプル中の生体分子の所在を検出する目的で、医学分野および生命科学の分野において広く用いられている。
　免疫染色の一例であるＤＡＢ染色では、ペルオキシダーゼを連結した抗体と抗原とを抗原抗体反応により結合させた後、発色処理として過酸化水素およびＤＡＢ（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ジアミノベンジジン）を添加する。これにより、過酸化水素がペルオキシダーゼにより分解され、分解で発生したＯ2 2-によりＤＡＢ分子同士が重合して発色する化学反応（化学発色）が生じ、抗原部分が茶色に染色される。この発色量を計測することで、発現した抗原の大体の量を調べることも可能である。また、免疫染色により細胞の種類や位置を特定することも可能であり、ある種の細胞に特異的に発現するマーカー（ＣＤ３４抗原等）を標的とする免疫染色は汎用技術として確立されている。
　上述した化学発色を利用する免疫染色とは別に、励起光が照射されて蛍光を発するナノ粒子（半導体微粒子等）と抗体とを連結し、該抗体を抗原抗体反応により抗原と結合させることで、抗原を蛍光染色する方法（蛍光免疫染色）が知られている（例えば、特許文献１～３参照）。
　特許文献１には、分子量３００～２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で表面修飾された半導体微粒子が開示されている。また、前記半導体微粒子のＰＥＧの先端に生体分子を設けることも開示されている。
　特許文献２および３には、半導体微粒子の表面をＰＥＧ（分子量３００～３０００等）で修飾し、該表面から最も離れた前記ＰＥＧの先端に官能基（アミノ基等）を設け、さらに、前記官能基に染色対象の生体分子と特異的に結合可能な他の生体分子（ＤＮＡ等）を結合した生体分子蛍光標識剤や、これを用いた免疫蛍光染色法が開示されている。
　さらに、上述した単独染色とは別に、２以上の異なる抗原を同時に検出する多重免疫染色法も知られている（例えば特許文献４参照）。
　特許文献４では、同一組織切片上で２種以上の抗原を検出し、それぞれの抗原が発現する場所や量を評価している。さらに、特許文献４には、前記検出をするための呈色物又は発光物として、標識酵素の基質との反応で呈色ないし発光する物質と、蛍光色素とを併用することが、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡又はレーザー共焦点顕微鏡を用いることができる観点から好ましいことが記載されている。
　さらに、同一の生体分子に対して、化学発色を利用する免疫染色と、蛍光色素による発光を利用する蛍光免疫染色とを併用する多重免疫染色を行うことで、生体分子の検出精度が高まることを開示している。
特開２００４－３００２５３号公報 国際公開ＷＯ２０１０/００４７７７号公報 国際公開ＷＯ２００７/０８６５０１号公報 特開２００５－１７１３３号公報
　本発明者らは、化学発色において所定の生体分子を染色するために、酵素と所定の基質との反応により生じる不溶性沈殿物が、蛍光体に照射する励起光および蛍光体が発する蛍光を吸収し、上記のような多重免疫染色特有の問題の原因となっているものと推測した。そして、蛍光免疫染色において蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子を用い、かつその蛍光体集積ナノ粒子に特定の長さの親水性高分子鎖を介して生体分子認識分子を結合させて、所定の生体分子を蛍光免疫染色するようにすると、上記のような問題を回避でき、蛍光免疫染色のみを行う単独染色と同等の水準で、所定の生体分子の蛍光観察を行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明者らは、化学発色を利用する免疫染色と、蛍光色素の発光を利用する蛍光免疫染色とを併用した多重免疫染色法において、蛍光免疫染色のみを行う単独染色と比べて、前記蛍光色素の発光強度ないし観察される輝点数が低下する問題に気付いた。
　すなわち本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、化学発色を利用する免疫染色と、蛍光色素等の蛍光体の発光を利用する蛍光免疫染色とを併用した多重免疫染色法において、上述したような発光強度ないし輝点数の低下を抑制することを目的とする。
　上述した目的を実現するために、本発明の一側面を反映した蛍光ナノ粒子標識体は、蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖（Ａ）と、該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子とを備えた多重免疫染色用の蛍光ナノ粒子標識体である。
　上述した目的を実現するために、本発明の一側面を反映した多重免疫染色剤キットは、上記蛍光ナノ粒子標識体を有する蛍光免疫染色剤と、明視野観察可能な化学免疫染色剤とを備えた、多重免疫染色剤キットである。
　上述した目的を実現するために、本発明の一側面を反映した多重免疫染色法は、上記蛍光ナノ粒子標識体を有する蛍光免疫染色剤を用いた蛍光免疫染色と、明視野観察可能な化学免疫染色剤を用いた化学免疫染色とを同一切片上で行う、多重免疫染色法である。
　本発明によれば、上記構成により、蛍光免疫染色と化学発色を利用する化学免疫染色とを併用する多重免疫染色において、前記化学発色で生成された不溶性沈殿物による発光強度ないし輝点数の低下を抑制することができる。この結果、蛍光免疫染色を単独で行った場合に得られる輝点数を多重免疫染色においても確保することができる。
図１（Ａ）は、従来の多重免疫染色法の概念図を示した図である。図１（Ｂ）は、本発明に係る多重免疫染色法の一例を示した図である。 図２は、本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体の一例を示す図である。 図３は、本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体の他の例を示す図である。
　以下、本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法について説明する。本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体は、多重免疫染色に用いられ、蛍光色素等の蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖と、該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子等とを有しているものである。この蛍光体ナノ粒子標識体を有する蛍光免疫染色剤は、化学発色の染色剤とともに多重免疫染色剤として用いることができる。
　［蛍光体集積ナノ粒子］
　蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光体を集積したものであり、蛍光ナノ粒子標識体と呼ばれることもある。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、１粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標記する輝点の輝度を高めることができる。
　＜蛍光体＞
　本明細書において「蛍光体」とは、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。また、本発明にいう「蛍光体」は、励起光を遮断してからの発光寿命によって限定されるものでもない。したがって、硫化亜鉛やアルミン酸ストロンチウム等の蓄光物質として知られている物質であってもよい。このような蛍光体は、有機蛍光体（蛍光色素）および無機蛍光体に大別することができる。
　〔有機蛍光体〕
　蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素分子、クマリン系色素分子、ＮＢＤ（登録商標）系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
　具体的には、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２'，４，４'，５'，７，７'－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２'，４，７，７'－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　〔無機蛍光体〕
　蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、II－VI族化合物、III－V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II－VI族量子ドット」、「III－V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
　具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。
　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
　＜蛍光体集積ナノ粒子の製造方法＞
　蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる（当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する）製造方法を用いることができる。
　<有機蛍光体の場合>
　有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂（熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂）を合成するための（コ）モノマーを（共）重合させながら、蛍光体を添加し、当該（共）重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
　上記の熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリフラン、または、これに類する樹脂を好適に用いることができる。上記の熱硬化性樹脂としては、例えば、ポリキシレン、ポリ乳酸、グリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリアミド、フェノール樹脂、多糖類またはこれに類する樹脂を好適に用いることができる。熱硬化性樹脂、特にメラミン樹脂は、キシレン等の有機溶媒を用いる脱水、透徹、封入などの処理によっても、色素樹脂に内包させた色素の溶出を抑制することができる点で好ましい。
　例えば、有機の蛍光色素（蛍光体）を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
　一方で、有機蛍光体をシリカからなる母体の内部または表面に固定化したシリカナノ粒子を製造することもできる。そのような製造方法としては、ラングミュア ８巻 ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成方法を参考にすることができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光色素を用いることで種々の蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
　<無機蛍光体の場合>
　無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー ３３巻 ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
　また、上記とは異なる蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、シリカビーズをシランカップリング剤で処理して末端をアミノ化し、カルボキシル基末端を有する蛍光体としての半導体微粒子をシリカビーズの表面にアミド結合により結合することで集積し、蛍光体集積ナノ粒子とする方法も挙げられる。
　さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、逆ミセル法と、ガラスの前駆体として分子の末端に半導体ナノ粒子への吸着性が良い有機官能基を有する有機アルコキシシランとアルコキシドの混合物を用いたゾル－ゲル法とを組み合わせることにより、半導体ナノ粒子を内部に分散固定したガラス状の粒子を形成し、蛍光体集積ナノ粒子とする例が挙げられる。
　さらに別の蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在化で、アミノ基末端の半導体ナノ粒子と、カルボキシル基末端の半導体ナノ粒子を混合し、半導体ナノ粒子間をアミド結合で介して結合することで半導体ナノ粒子を集積し、蛍光体集積ナノ粒子を製造する例が挙げられる。
　さらに、無機蛍光体を樹脂からなる母体の内部または表面に固定化した集積体を製造することもできる。たとえば、量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
　［親水性高分子鎖］
　蛍光体集積ナノ粒子の表面修飾に用いられる親水性高分子鎖としては、蛍光体集積ナノ粒子と後述の生体分子認識分子とを連結するための、所定の数平均分子量を有する親水性高分子（Ａ）と、必要に応じて親水性高分子（Ａ）以外の任意の（通常は親水性高分子（Ａ）より小さな）数平均分子量を有する親水性高分子（Ｂ）とが用いられる（図３のPEG鎖１と、PEG鎖２の例を参照）。
　親水性高分子（Ａ），（Ｂ）の例としては、特に限定されないがポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。親水性高分子鎖（Ａ），（Ｂ）は、上記例示された親水性高分子により形成される群から選択された１種類または２種以上の親水性高分子を用いることができる。前述の例示された親水性高分子の中では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい等の観点から好ましい。
　親水性高分子鎖（Ａ）の数平均分子量は、３０００以上、好ましくは５０００以上であり、また好ましくは２００００以下である。この親水性高分子鎖（Ａ）の数平均分子量は、化学発色を利用した免疫染色と、蛍光免疫染色とを行う多重免疫染色を行った場合に、蛍光免疫染色を単独で行った場合と比較して、前記蛍光体に起因した輝点数が同程度確認できるよう調整することができる。この輝点数の確認は、後述するように蛍光顕微鏡等で行うことができる。一方、親水性高分子鎖（Ｂ）の数平均分子量は、通常３０００未満であり、好ましくは３００以上である。この親水性高分子鎖（Ｂ）の数平均分子量は、蛍光体集積ナノ粒子同士の凝集を防止する効果などを考慮しながら調整することができる。
　なお、親水性高分子鎖（Ａ）、（Ｂ）については、その分子の長さを調節して本発明の効果を得る観点から、親水性高分子の化学構造中に含まれるポリマー構造単位の数により調節されることが好ましい。例えば親水性高分子がＰＥＧの場合は、オキシエチレン単位（－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ）の数（ｎ）により調節されていることが好ましい。
　（数平均分子量の測定）
　蛍光体集積ナノ粒子の数平均分子量は、テトラハイドロフラン（ＴＨＦ）をカラム溶剤として用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定する。
　具体的には、測定試料を１ｍｇに対してＴＨＦを１ｍＬ加え、室温下にてマグネチックスターラーを用いて撹拌を行い、充分に溶解させる。次いで、ポアサイズ０．４５～０．５０μｍのメンブランフィルターで処理した後に、ＧＰＣへ注入する。ＧＰＣの測定条件は、４０℃にてカラムを安定化させ、ＴＨＦを毎分１ｍＬの流速で流し、１ｍｇ／ｍＬの濃度の試料を約１００μＬ注入して測定する。カラムとしては、市販のポリスチレンジェルカラムを組合わせて使用することが好ましい。例えば、昭和電工社製のＳｈｏｄｅｘ ＧＰＣ ＫＦ－８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７の組合せや、東ソー社製のＴＳＫｇｅｌＧ１０００Ｈ、Ｇ２０００Ｈ、Ｇ３０００Ｈ、Ｇ４０００Ｈ、Ｇ５０００Ｈ、Ｇ６０００Ｈ、Ｇ７０００Ｈ、ＴＳＫ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎの組合せなどを挙げることができる。
　検出器としては、屈折率検出器（ＲＩ検出器）が好ましく用いられる。試料の分子量測定では、試料の有する分子量分布を単分散のポリスチレン標準粒子を用いて作成した検量線等を用いて算出する。検量線作成用のポリスチレン等としては１０点程度用いることが好ましい。
　親水性高分子と前記蛍光体集積ナノ粒子との結合は、特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合等、あるいは、ビオチン－アビジン結合またはビオチン－ストレプトアビジン結合が好ましい。特に、結合力の強さおよび結合の特異性の観点から、ビオチン－アビジン結合またはビオチン－ストレプトアビジン結合がより好ましい。
　結合方法の例として、ビオチン－アビジン法、チオール基－マレイミド基のカップリング反応法、化学リンカーを用いる方法、架橋剤（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができる。
　化学リンカーの具体例としては、蛍光体集積ナノ粒子の表面にアミノ基（ＮＨ2基）が存在する場合、例えば以下の[化１]に示すような、ビオチン（生体分子認識分子）と結合したＰＥＧ化試薬を好適に用いることができる。
　この場合、ＰＥＧ化試薬のＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル基（[化１]の左端部分の官能基）と蛍光体集積ナノ粒子の表面のアミノ基とが反応して、蛍光体集積ナノ粒子にＰＥＧ鎖とビオチンが付加されることとなる（図２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　また、上記の例とは異なり、蛍光体集積ナノ粒子の表面にスルフヒドリル基（ＳＨ基）が存在する場合、例えば以下の[化２]に示すような、ビオチン（生体分子認識分子）と結合したＰＥＧ化試薬を好適に用いることができる。この場合、ＰＥＧ化試薬のマレイミド基（[化２]の左端部分の官能基）と蛍光体集積ナノ粒子の表面のスルフヒドリル基（ＳＨ基）とが反応して、蛍光体集積ナノ粒子にＰＥＧ鎖とビオチンが付加されることとなる（不図示）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　[化１]および[化２]のいずれのＰＥＧ化試薬の例においても、ＰＥＧ（親水性高分子）に由来するＰＥＧ鎖部分「－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ－」の数平均分子量を３０００以上とするためにオキシエチレン単位の数（ｎ）に設定されることが好ましい。
　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の代わりに上述した親水性高分子を用いた場合については、親水性高分子由来の部分の鎖長は、上記ＰＥＧ鎖と同等またはそれ以上の数平均分子量となるように設計して製造し、蛍光ナノ粒子標識体の材料として用いることができる。このような所定の分子量のＰＥＧ化試薬等は、例えば、合成メーカー（例えば、CreativePEGWorks等）に合成を依頼して入手することができる。
　上記親水性高分子鎖を蛍光体集積ナノ粒子に結合させる前に、結合に必要な官能基をあらかじめ蛍光体集積ナノ粒子や親水性高分子鎖に導入してもよい。例えば、あらかじめ蛍光体集積ナノ粒子に必要な官能基を導入する例としては、熱可塑性樹脂を用いて蛍光体集積ナノ粒子を製造する場合に、スチレンと共にグリシジルメタクリレートをモノマーとして用いて共重合させることにより蛍光体集積ナノ粒子の表面にエポキシ基を導入し、さらにアミノ基導入試薬（ＡＰＳ等）を用いたアミノ基導入処理により前記エポキシ基をアミノ基に変換して上記ＰＥＧ化試薬等を反応させる例が挙げられる。蛍光体集積ナノ粒子１つあたりに結合させる親水性高分子の数は、結合に必要な上記のような官能基の数、あるいは親水性高分子との反応条件などにより調整することができる。
　一方、熱硬化性の色素樹脂粒子を製造する場合、メラミン樹脂原料（例えば三和ケミカル社製ＭＸ０３５）をモノマーとして用いて共重合させることにより、表面にアミノ基を有するメラミン系樹脂の色素樹脂粒子を製造し、上記ＰＥＧ化試薬等を反応させることもできる。
　＜生体分子認識分子＞
　本発明で用いられる生体分子認識分子とは、抗原等の生体分子に特異的に結合する分子を意味する。生体分子認識分子としては、染色対象である特定の生体分子を認識する１次抗体、この抗体を認識する２次（～ｎ次）抗体、該２次（～ｎ次）抗体に結合した特定の生体分子を認識またはこれに認識される分子等であり、生体分子認識分子の例としては、抗体やビオチンまたはアビジン（ストレプトアビジン等の類縁体を含む）が挙げられる。
　なお、本発明において、「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体を含む。
　本発明において、「抗原」という用語は、生体物質、特に、タンパク質からなる分子または分子断片（ポリペプチド、オリゴペプチド等）を指すが、抗体を作製することができ、免疫染色できる生体物質であれば、タンパク質以外からなる分子または分子断片、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）を抗原とすることができる可能性もある。
　生体分子認識分子として抗体医薬の構成成分である抗体を用いることができる。抗体医薬としては、例えば、関節リウマチなどの自己免疫疾患、がんなどの悪性腫瘍、ウィルス感染症等の治療に一般的に用いられている抗体医薬が挙げられる。
　生体分子認識分子と親水性高分子鎖の端部と結合は、蛍光体集積ナノ粒子と親水性高分子鎖との結合と同様、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着、化学吸着等の適当な結合様式による結合や、結合力の強さの観点から、アミド結合、エステル結合、イミド結合、マレイミド基へのチオール付加を利用した結合等の共有結合が好ましい。
　生体分子認識分子と親水性高分子鎖の端部との結合の具体的な結合方法としては、ビオチン－アビジン法、チオール基－マレイミド基のカップリング反応法、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができる。
　化学免疫染色と蛍光免疫染色それぞれの染色対象となる生体分子は特に限定されず、同一であっても異なっていてもよい。染色対象が２種以上の場合（例えば化学免疫染色の対象をＣＤ３４抗原、蛍光免疫染色の対象をＶＥＧＦＲ－２とする場合など）であって、複数の染色対象を異なる染色方法で別々に検出したい場合には、蛍光免疫染色における生体分子認識分子および染色対象の結合様式と、化学免疫染色における生体分子認識分子および染色対象の結合様式は、意図しない結合、分子同士の競合を避けるため、相違させることが適切である。たとえば、化学免疫染色においては、染色対象抗原－１次抗体（マウス抗体）－酵素標識化２次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）の複合体を形成させるような結合様式とする一方、蛍光免疫染色においては、染色対象抗原－１次抗体（ウサギ抗体）－ビオチン標識化２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）－生体分子認識分子としてアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の複合体を形成させるような結合様式とすることができる。
　　　　　　　　　　　　　＜多重免疫染色法＞
　本発明に係る多重免疫染色法は、化学発色を利用した染色と、蛍光ナノ粒子標識体を用いた蛍光免疫染色との双方を行う多重免疫染色法である。本発明に係る多重染色法の染色対象は一般的な免疫染色法で対象となる生体分子であり、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン、がんの増殖制御因子、転移制御因子、増殖制御因子受容体、転移制御因子受容体等を例示できる。
　以下、異なる生体分子Ａ，Ｂのそれぞれを、化学発色を利用した免疫染色と蛍光免疫染色とによりそれぞれ多重免疫染色する一実施態様を工程（１）～（５）の順に説明する。
　（１）脱パラフィン処理工程
　キシレンを入れた容器に、病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により、浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　ついで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させて、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　水を入れた容器に病理切片を浸漬させて、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
　（２）賦活化処理工程
　組織化学染色として免疫組織化学染色を行う場合、公知の方法にならい、目的とする生体分子の賦活化処理を行うことが好ましい。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器としては、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。賦活化処理の加熱処理の温度は５０～１３０℃、加熱処理の時間は５～３０分で行うことができる。
　ついでＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　（３－１）染色処理工程Ａ
　化学免疫染色のための染色処理工程Ａは、病理切片中の特定の生体分子に対して、発色用酵素が連結された抗体等を抗原抗体反応等により結合させる結合工程Ａと、該結合工程の後に発色基質を反応系に添加して前記発色用酵素により発色させる発色工程Ａとを含む。
　結合工程Ａにおいて、生体分子に対する上記結合は公知の方法により行うことができる。なお、この結合の前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤を滴下して室温で所定時間（例えば１時間）インキュベートしておくことが好ましい。
　発色工程Ａにおいて、前記発色用酵素の基質、発色剤を反応系に添加して化学発色させるが、本発明の対象となる発色剤は発色反応で不溶性沈殿物を生成するものであって、以下のものを例示することができる。
　発色用酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合、ＴＭＢ(３，３，５，５－テトラメチルベンジジン）、３，３'－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、4-クロロ-1-ナフトール等が対象となる。また、発色用酵素として酵素アルカリホスファターゼを用いる場合、ニューフクシン等が対象となる。その他、上述のように化学発色により不要性沈殿物が生じる発色剤が対象となる。
　（３－２）染色処理工程Ｂ
　蛍光免疫染色のための染色処理工程Ｂは、蛍光ナノ粒子標識体の生体分子認識分子と生体分子とを結合させる結合工程Ｂとを備える。ここでの生体分子とは、蛍光免疫染色の染色対象となる抗原、該抗原と特異的に結合した１次抗体、該１次抗体に結合した２次（ｎ次）抗体、または、前記抗原または前記１～ｎ次抗体に結合した他の生体分子のいずれかを意味する。
　また、前述した抗原、１次抗体、２次（ｎ次）抗体、他の生体分子、および生体分子認識分子の各分子間の結合の先後は問わない。
　結合工程Ｂの具体的手順の例としては、蛍光ナノ粒子標識体のバッファー（ＰＢＳ等）分散液を調製し、病理切片に載せて、蛍光ナノ粒子標識体の生体分子認識分子と前記生体分子とを結合させる。次に、バッファー（ＰＢＳ等）を入れた容器に染色後の切片を浸漬させて、未反応の蛍光ナノ粒子標識体や発色用酵素を有する抗体等を除去する。浸漬時間は３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でバッファー（ＰＢＳ等）を交換してもよい。
　（４）固定処理工程
　固定処理工程は、組織染色処理工程（１）により導入された上述の発色剤や蛍光ナノ粒子標識体を組織切片に固定化する工程である。
　固定処理溶液として、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤、細胞膜透過物質等が挙げられる。
　固定処理は、従来公知の手法により行うことができる。固定処理は、具体的には、上述したような固定処理溶液に、組織化学染色工程により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、稀パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
　（５）観察工程
　（５－１）明視野観察工程
　明視野観察工程は、前記工程（１）～（４）により染色された組織切片に照明光を当て、組織切片に沈着した発色剤の色素を観察し、細胞または組織内の染色対象とする生体分子Ａの分布情報（発色点数等）を取得する工程である。
　明視野観察は一般的な方法により行えばよい。例えば、食道がん細胞におけるＶＥＧＦＲ－２タンパク質を染色対象とする生体分子として組織化学染色を行なった場合の明視野観察においては、適切な照明光の照射下で、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、検体組織内の癌細胞のＶＥＧＦＲ－２タンパク陽性染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察する。次に対物レンズを１０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認し、必要に応じてさらに対物レンズ２０倍で検索する。
　本工程において生体分子Ａの分布情報および生体分子Ｂの分布情報は、迅速な観察が行えるよう顕微鏡の鏡筒から取得するようにしてもよいし、顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示し、それを観察することにより取得するようにしてもよい。
　（５－２）蛍光観察工程
　蛍光観察工程は、上記工程により染色された組織切片中の蛍光ナノ粒子標識体の蛍光体に励起光を照射することにより、該蛍光体の発する蛍光に基づく生体分子Ｂの分布情報（輝点数等）を取得する工程である。
　前記励起光は、前記蛍光体に対して適した励起光を照射して蛍光体を励起し、染色対象の生体分子を蛍光で染色する。また、励起光の照射手段も特に限定されるものではない。例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源から、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させるフィルターを用いて、適切な波長および出力の励起光を染色された組織切片に照射すればよい。
　前記励起光は、組織切片の自家蛍光との関係で標識体が発する蛍光が識別可能である限り特に限定されないものの、蛍光の目視観察が可能で、明視野観察可能な染色において用いる基質（例えばジアミノベンジジン）による吸収を避けるとともに、組織切片からの自家蛍光強度が高くなりすぎないようにする観点から、４５０ｎｍ～７００ｎｍの波長を有するものが好ましい。また、前記蛍光標識体として用いる蛍光体を構成する蛍光物質としては当該励起光により４８０ｎｍ以上の範囲、好ましくは５８０～６９０ｎｍの範囲にピークを有する蛍光を発するものを用いる（したがってこの領域の発光波長を有する蛍光を測定するようにする）。
　また、本工程において生体分子Ａ，Ｂの各分布情報は、迅速な観察が行えるよう（蛍光）顕微鏡の鏡筒から取得するようにしてもよいし、（蛍光）顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示し、それを観察することにより取得するようにしてもよい。標識体として用いる蛍光体を構成する蛍光物質によるが、顕微鏡の鏡筒からの目視により十分に生体分子分布情報を取得することができなくても、カメラが撮影した画像から生体分子分布情報を取得することが可能な場合もある。
　前記生体分子Ａ，Ｂの分布情報を取得することとしては、例えば、蛍光の輝点数または発光輝度を基に、一細胞あたりの染色対象の生体分子の数もしくは密度を計測することが挙げられる。蛍光ナノ粒子標識体の蛍光体の励起には、吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターを選択すればよい。輝点数または発光輝度の計測には、市販の画像解析ソフト（例えば、全輝点自動計測ソフト「Ｇ－Ｃｏｕｎｔ」（ジーオングストローム社製））を用いることが好適であるが、計測手段は特に限定されるものではない。
　上述した多重免疫染色の実施態様では、２種類の生体分子を染色する多重免疫染色の例を示したが、発色剤や蛍光体の発光波長域を変更してさらに多くの生体分子Ｃ・・・を検出する多重免疫染色としてもよい。
　以下、本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤および多重免疫染色法による作用・効果を説明する。
　（１）本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体は、蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖と、該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子とを備えた粒子である。
　本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体を、同一または異なる抗原を検出する目的で蛍光免疫染色と化学発色による免疫染色とを行う多重免疫染色に用いた場合、まず蛍光ナノ粒子標識体の生体分子認識分子が、前記抗原やこれに結合した生体分子（抗体等）と結合して抗原が蛍光で染色される。その一方で、この抗原と同一または別異の抗原に化学発色用の酵素を付加した抗体が結合し、発色剤の添加により化学発色の反応が起こり、該抗原が染色される。このときに、蛍光ナノ粒子標識体の親水性高分子鎖の数平均分子量３０００以上であることで、前記化学発色で生じた不溶性沈殿物（発色剤が重合したもの等）から物理的に離れた位置に蛍光体が配置され、不溶性沈殿物により蛍光体からの発光が阻害されにくくなくなる（図１（Ａ）と（Ｂ）を対比して参照）。この結果、蛍光免疫染色を単独で行った場合と同程度の輝点数を確保することができ、多重免疫染色における抗原の検出精度が向上する。
　（２）前記蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００未満の親水性高分子鎖（Ｂ）を備えることで、蛍光ナノ粒子標識体の他の分子への非特異的な結合を抑制することができる。
　（３）前記親水性高分子鎖（Ａ）および／または親水性高分子鎖（Ｂ）がポリエチレングリコールであることにより、意図しない生体分子の活性化を防ぐことができる。
　（４）前記生体分子認識分子が染色対象の抗原と特異的に結合可能な１次抗体もしくは当該１次抗体に結合可能な２次抗体に連結されたビオチンと結合可能なアビジンであれば、ビオチンとアビジンの非常に強固で特異的な結合を蛍光ナノ粒子標識体と生体分子との結合に用いることになるため、蛍光ナノ粒子標識体を反応系に添加してから蛍光観察までの時間が短くなり、蛍光体の退色に起因した輝点における蛍光強度の低下の影響を抑制することができる。
　[実施例１Ａ]
　標識剤Ａ（数平均分子量３４００ポリエチレングリコールもつストレプトアビジン結合テキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子）の合成
　スルホローダミン１０１（「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１」、シグマアルドリッチ社製、ＴｅｘａｓＲｅｄ色素）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。
　撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、該溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子（以下、粒子Ａと略称する。）を沈殿させて上澄みを除去した。その後、沈殿した粒子Ａの洗浄をエタノールと水で行った。
　洗浄後の粒子Ａ０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシランＬＳ－３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。
　表面がアミノ化された粒子Ａの濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようマレイミド‐ＰＥＧ‐カルボキシレート‐ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ－０３４ＴＳ　平均分子量３４００）を混合して、撹拌しながら室温で１時間反応した。
　反応液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された粒子Ａを得た。
　一方、スルフヒドリル基を有するストレプトアビジンの作製は以下のように行った。まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬに対して、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ，ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）７０μＬを室温で1時間反応させた。すなわち、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ2－Ｓ－ＣＯ－ＣＨ3）を導入した。
　その後、公知のヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（－ＳＨ）を生成して、ストレプトアビジンにチオール基（－ＳＨ）を付加する処理を行った。
　このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記メラミン系粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。
　ＰＥＧ修飾された上記粒子Ａとストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、標識剤Ａを得た。
　[実施例１Ｂ]（多重免疫染色）
　実施例１Ａで製造した標識剤Ａと一般的なＣＤ３４を免疫染色するＤＡＢ染色キットを用いて、以下のように、血管増殖因子血管内皮細胞増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）と食道がん組織の癌細胞の表面抗原ＣＤ３４とを検出する多重免疫染色を行った。
　（１）脱パラフィン処理工程
　食道がん組織を固定した組織アレイスライド（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社製Ｔ０２２）をキシレンに浸漬し、脱パラフィン処理した。
　（２）賦活化処理工程
　脱パラフィン処理した後、この組織アレイスライドをクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬して、オートクレーブ処理（１２１℃で１５分間）し、抗原の賦活化処理を行った。
　（３－１）染色処理工程Ａ
　賦活化処理を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、非特異的な結合を防ぐために１０％ヤギ血清（ニチレイ社製）を添加し、室温下１時間放置した。この組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄後、抗ＣＤ３４抗体（ニチレイ社製マウス抗体）を添加し、室温下３０分間放置した。再び組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、デキストランポリマーペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（ニチレイ社製）を添加し、室温下で３０分間放置した。ＤＡＢ基質キット（ニチレイ社製）を用いて、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を発色基質とする酵素を用いた免疫染色を行った。
　（３－２）染色処理工程Ｂ
　上記（３－１）の免疫染色後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、１０％ヤギ血清（ニチレイ社製）を添加し、室温下１時間放置した。この組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、抗ＶＥＧＦＲ-２抗体（アブカム社製ウサギ抗体）を添加し、室温下３０分間放置した。ＰＢＳで洗浄後、ビオチン標識抗ウサギ抗体（ニチレイ社製）を添加し、室温下で３０分間放置した。標識剤Ａを添加し、室温下２時間反応させた。
　（４）固定処理工程
　上記で得られた免疫組織化学染色切片をエタノール、キシレンの順にスライドを浸漬させ、次いで封入剤（メルク社エンテランニュー）を添加した後、カバーガラスを載せ、固定処理を行い、これを評価スライドとした。
　（５）観察
　上記（４）で固定処理した二重染色切片を、オリンパス社製汎用蛍光顕微鏡ＢＸ５３を用いて観察を行った。蛍光観察で輝点数を測定する際のテキサスレッド（蛍光体）の励起波長は５８０ｎｍ、測定波長は６３０ｎｍとした。
　[比較例１Ａ、１Ｂ]
　標識剤Ｂ　分子量５２８ポリエチレングリコールもつストレプトアビジン結合レキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の合成
　実施例１Ａにおいて、マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０３４ＴＳ　平均分子量３４００）の代わりに、ＭＡＬ-ｄＰＥＧ-ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ (Ｑｕａｎｔａ社製ＱＢ１０２８４ａ　ポリエチレングリコール部分子量５２８)を用いた以外は標識剤Ａの合成と同様にして行い、標識剤Ｂを作製し、実施例１Ａと同様に多重免疫染色および輝点数を確認する観察等を行った。[表１]に実施例１Ｂと比較例１Ｂの結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　[実施例２Ａ、２Ｂ]
　標識剤Ｃ　分子量５０００と３５２のポリエチレングリコールもつストレプトアビジン結合レキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の合成
　マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０３４ＴＳ　平均分子量３４００）の代わりに、マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０５０ＴＳ　平均分子量５０００）と、ＭＡＬ-ｄＰＥＧ-ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ (Ｑｕａｎｔａ社製ＱＢ１０２７４ａ　ポリエチレングリコール部分子量３５２)とを最終濃度がそれぞれ１ｍＭと１０ｍＭとなるようにして１：１０（モル比）で混合したものを用いたほかは標識剤Ａの合成と同様にして標識剤Ｃの合成を行った。また、この標識剤Ｃを用いて、実施例１Ａと同様に多重免疫染色および輝点数を確認する観察等を行った。
　[実施例３Ａ、３Ｂ]
　標識剤Ｄ　分子量２００００と２０００のポリエチレングリコールもつストレプトアビジン結合レキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の合成
　マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０３４ＴＳ　平均分子量３４００）の代わりに、マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-２００ＴＳ　平均分子量２００００）とマレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０２０ＴＳ　平均分子量２０００）とを最終濃度がそれぞれ１ｍＭと１０ｍＭとなるようにして１：１０（モル比）で混合したものを用いたほかは標識剤Ａの合成と同様にして標識剤Ｄの合成を行った。また、この標識剤Ｄを用いて、実施例１Ａと同様に多重免疫染色および輝点数を確認する観察等を行った。
　[実施例４Ａ、４Ｂ]
　標識剤Ｅ　分子量４００００と５２８のポリエチレングリコールもつストレプトアビジン結合レキサスレッド色素内包メラミン樹脂ナノ粒子の合成
　マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-０３４ＴＳ　平均分子量３４００）の代わりに、マレイミド－ＰＥＧ－カルボキシレート－ＮＨＳ（日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＡ-４００ＴＳ　平均分子量４００００）とＭＡＬ-ｄＰＥＧ-ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ (Ｑｕａｎｔａ社製ＱＢ１０２８４ａ　ポリエチレングリコール部分子量５２８)とを最終濃度がそれぞれ１ｍＭと１０ｍＭとなるようにして１：１０（モル比）で混合したものを用いたほかは標識剤Ａの合成と同様にして標識剤Ｅの合成を行った。また、この標識剤Ｅを用いて、実施例１Ａと同様に多重免疫染色および輝点数を確認する観察等を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上、本発明に係る蛍光ナノ粒子標識体、該蛍光ナノ粒子標識体を含む多重免疫染色剤および該多重免疫染色剤を用いた多重免疫染色法を実施の形態および実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれらに限定されず、本発明の要旨を逸脱しないかぎり、設計変更は許容される。

Claims (6)

  1. 　蛍光体を集積した状態で有する蛍光体集積ナノ粒子と、
    　該蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００以上の親水性高分子鎖（Ａ）と、
    　該親水性高分子鎖の末端に結合した生体分子認識分子と
    を備えた多重免疫染色用の蛍光ナノ粒子標識体。
  2. 　さらに、前記蛍光体集積ナノ粒子の表面に結合した数平均分子量３０００未満の親水性高分子鎖（Ｂ）を備えた、請求項１に記載の蛍光ナノ粒子標識体。
  3. 　前記親水性高分子鎖（Ａ）および／または親水性高分子鎖（Ｂ）がポリエチレングリコールである、請求項１または２に記載の蛍光ナノ粒子標識体。
  4. 　前記生体分子認識分子が染色対象の抗原と特異的に結合可能な１次抗体もしくは当該１次抗体に結合可能な２次抗体に連結されたビオチンと結合可能なアビジンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子標識体。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子標識体を有する蛍光免疫染色剤と、明視野観察可能な化学免疫染色剤とを備えた、多重免疫染色剤キット。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光ナノ粒子標識体を有する蛍光免疫染色剤を用いた蛍光免疫染色と、明視野観察可能な化学免疫染色剤を用いた化学免疫染色を同一切片上で行う、多重免疫染色法。
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