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WO2014196811A1 - 타가토스의 제조방법 - Google Patents

타가토스의 제조방법 Download PDF

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WO2014196811A1
WO2014196811A1 PCT/KR2014/004970 KR2014004970W WO2014196811A1 WO 2014196811 A1 WO2014196811 A1 WO 2014196811A1 KR 2014004970 W KR2014004970 W KR 2014004970W WO 2014196811 A1 WO2014196811 A1 WO 2014196811A1
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WO
WIPO (PCT)
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tagatose
fructose
coli
epimerase
strain
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2014/004970
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English (en)
French (fr)
Inventor
양성재
김양희
김성보
박승원
박일향
김민회
이영미
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
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Priority to CA2912540A priority patent/CA2912540C/en
Priority to DK14807891.8T priority patent/DK3006568T3/da
Priority to CN201480031914.2A priority patent/CN105431541B/zh
Priority to US14/892,710 priority patent/US10745720B2/en
Priority to EP14807891.8A priority patent/EP3006568B1/en
Priority to JP2016518272A priority patent/JP6171094B2/ja
Priority to MX2015016535A priority patent/MX374397B/es
Priority to BR112015029933A priority patent/BR112015029933B8/pt
Priority to ES14807891T priority patent/ES2751691T3/es
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C45/81—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by change in the physical state, e.g. crystallisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing tagatose from fructose, and more particularly, to a method for preparing tagatose by epimerizing the carbon position 4 of fructose.
  • Tagatose has a natural sweetness that is almost indistinguishable from sugar, and its physical properties are similar to sugar. However, ingested tagatose is not absorbed well in the small intestine and does not affect blood sugar levels, and calorie is a low-calorie sweetener, about 30% of the sugar. Tagatose also has a prebiotic effect that promotes the growth of beneficial lactic acid bacteria by fermentation by intestinal microorganisms.
  • Tagatose absorbs only about 20% of the intake from the small intestine, and the remaining 80% is transferred to the large intestine where the intestinal microflora lives, producing short-chain fatty acids by selectively promoting the production of lactic acid bacteria, especially butyric acid (which prevents colon cancer) butyrate) has a prebiotic property that produces large amounts (up to 50% of total short-chain fatty acids).
  • Tagatose is a low calorie natural sugar of 1.5 kcal / g, and is recognized as the General Recognized As Safe (GRAS) of the US FDA, and is used as a functional sweetener in foods, beverages, health foods, and dietary additives.
  • GRAS General Recognized As Safe
  • tagatose is not commonly present in nature but is a rare sugar contained in dairy products or some plants, a technique for mass production from inexpensive raw materials must be developed to be used as a low-calorie functional sweetener.
  • Korean Patent Publication No. 10-2009-0125004 discloses a method for producing galactose from glucose through epimerization
  • Korean Patent Publication No. 10-2006-0125971 discloses a C3-epimerization reaction of ketohexose.
  • Tagatose has been conventionally prepared using galactose that is degraded from lactose or lactose-containing products and other biological resources containing galactose.
  • raw materials that are commercialized or can be manufactured to this level are evaluated as lactose or lactose-containing products (whey, etc.).
  • lactose or lactose-containing products have a problem in that price fluctuations are severe and stable supply of tagatose is difficult as the price increases as the consumption of lactose is recently increased.
  • an object of the present invention is to provide a manufacturing method which is more stable and economical than the conventional tagatose manufacturing method and which has high production efficiency.
  • the present invention comprises the steps of epimerizing fructose with hexuronate C4-epimerase to obtain an epimerization reactant comprising tagatose; Purifying the epimerization reactant; And it provides a method for producing tagatose comprising the step of crystallizing the purified epimerized reactant.
  • fructose can be industrially manufactured from glucose or sugar, so the raw material of the process proposed in the present invention is used in the form of whole or part of fructose for cheaper production in addition to fructose. It can be extended to include. That is, the present invention includes the production of tagatose through enzymatic conversion from starch or raw sugar or sugar.
  • the present invention can produce tagatose using fructose to efficiently mass-produce tagatose, which has been spotlighted as an important food material today.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a process for producing tagatose according to an aspect of the present invention.
  • 2 to 5 are flowcharts showing a process of producing tagatose, respectively according to different embodiments.
  • FIG. 6 is an HPLC graph showing tagatose production by C4-epimerase reaction using fructose as a substrate.
  • FIG. 9 is a graph showing the degree of C4-epimerase activity according to the metal salt type.
  • 10 is a graph showing the degree of conversion to tagatose according to the change in the concentration of fructose as a substrate.
  • 11 is a graph showing the correlation between the conversion rate and the recovery rate of fructose and tagatose.
  • n-carbon position means a carbon position determined according to a carbon numbering rule defined by IUPAC, which may be expressed as Cn.
  • n is an integer of 1 or more.
  • epimerized at carbon position 4" may be referred to as "C4-epimerized”.
  • monosaccharides can be classified into aldohexose and ketohexose.
  • Aldohexose is an aldose consisting of six carbon atoms, which means that it has an aldehyde group at one end. Non-limiting examples include glucose, galactose, allose, and gulos. , Altrose, mannose, talos and idose.
  • ketohexose herein means a monosaccharide having six carbon atoms and having a ketone group, and non-limiting examples include fructose, tagatose, psicose, and sorbose. And preferably fructose.
  • the fructose and the tagatose refer to D-type fructose or D-type tagatose unless otherwise specified herein.
  • the fructose may be obtained from sugar or glucose.
  • the step of hydrolyzing sugar to obtain fructose may be additionally performed.
  • the enzyme used for the hydrolysis is ⁇ -D-fructosidase including ⁇ -fructofuranosidase, invertase, saccharase, and the like; It may be one or more selected from the group consisting of sucrase, ⁇ -glucosidase and ⁇ -D-glucohydrolase, but is not limited thereto.
  • isomerization of glucose may further perform the step of obtaining fructose.
  • the isomerization enzyme may be, but is not limited to, glucose isomerase or phosphoglucois isomerase.
  • thermotoga sp Hexuronate C4-epimerase that can be used herein is thermotoga sp. It may be a derived enzyme or variant thereof, and specifically, may be Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , or Thermotoga thermarum derived enzyme or variant thereof.
  • the hexuronic acid C4-epimerase for example, transformed to a strain such as E. coli with genomic DNA of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3, and cultured to obtain a culture,
  • the culture may be crushed and purified through a column or the like.
  • the strain for transformation include Escherichia . Coli , Corynebacterum glutamicum , Aspergillus oryzae , or Bacillus subtilis.
  • E. coli transformed strains include, for example, E. coli BL21 (DE3) pET21a-TM (deposited). No .: KCCM11542P), E.
  • E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN (Accession No .: KCCM11543P), or E. coli BL21 (DE3) pET28a-TN (m) strain (Accession No .: KCCM11544P).
  • the E. coli BL21 (DE3) pET21a-TM, E.coli BL21 (DE3) pET21a-TN, and E.coli BL21 (DE3) pET28a-TN (m) strains are Korean Cuture Center of Microorganisms, respectively.
  • the deposit strain E. coli BL21 (DE3) pET21a-TM (Accession No .: KCCM11542P), E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN (Accession No .: KCCM11543P), or E.coli
  • E. coli BL21 (DE3) pET21a-TN accesion No .: KCCM11543P
  • E.coli for each of the BL21 (DE3) pET28a-TN (m) strains (Accession No .: KCCM11544P).
  • the reaction for epimerizing the fructose with hexuronic acid C4-epimerase may be performed at pH 5-8, 60-90 ° C. temperature conditions, preferably pH 6-8 and 70-90 ° C. or 75-90 ° C. It can be made at high temperature conditions.
  • the enzyme reaction within the pH and temperature range, the reaction can be carried out at a relatively high temperature to minimize microbial contamination during the manufacturing process, increase the solubility of ketohexose used as a substrate and the reaction of the enzyme This can have the effect of maximizing speed and conversion rate.
  • the C4-epimerase activity increases as the temperature increases, but the enzyme activity can be sharply reduced at the 90 ° C boundary.
  • the effect of pH on enzyme activity generally tends to increase as the pH increases.
  • the pH range may vary depending on the type of buffer. For example, pH 5-9 may be the proper pH in phosphate buffer and pH 8.0-8.5 may be the proper pH in Tris buffer. However, it may be appropriate to lower the pH to 8 or less for subsequent processing.
  • the reaction to epimerize with the C4-epimerase can be carried out in the presence of a metal salt.
  • the metal salt may serve as a catalyst in the epimerization reaction, and examples thereof include NiSO 4 , NiCl 2 , CoCl 2 , MnCl 2 , or ZnSO 4 . Specifically, at least one NiSO 4 , NiCl 2 or CoCl 2 may be used.
  • the epimerase activity may vary depending on the type of metal salt, and the order of NiSO 4 , NiCl 2 , CoCl 2 , Mn Cl 2 , and ZnSO 4 , when arranged from low to high active metal salts, is determined. Able to know.
  • the concentration of the metal salt may be 0.001mM to 50mM. Specifically, the concentration of the metal salt may range from 0.01 mM to 25 mM.
  • Tagatose in the epimerization reactant may be included in 0.05 wt% or more, for example, 0.07 wt% or more, specifically 0.1 wt% or more, and the conversion rate of tagatose may be 5% or more, for example, 7% or more. have.
  • the purification method is not particularly limited and may be used a method commonly used in the art.
  • Non-limiting examples include ion purification, chromatography or fractional crystallization. Separation of sugars by chromatography may be performed by using a weak binding force between the sugar to be separated and the metal ions attached to the ionic resin.
  • the ionic resin may be a strong acid cation exchange resin to which K, Na, Ca, Mg residues are attached.
  • the chromatography may specifically be SMB (Simulated Moving Bed) chromatography.
  • decolorization, desalting, or both, before or after the purification step may be further effected. Specifically, before the purification step, decolorization, desalting or both may be carried out.
  • the discoloration may include adding and stirring activated carbon at 0.05 to 5.0 wt% based on the weight of the epimerization reactant. The stirring may be performed at a stirring speed of 10 to 1000 rpm, specifically, 10 to 100 rpm for 30 minutes to 3 hours.
  • the desalting may be carried out using a cation exchange resin, an anion exchange resin or both.
  • impurities such as a pigment material and an ionic material may be removed from the epimerization reactant.
  • the cation exchange resin is a polymer having an acid group, and can exchange cations such as hydrogen ions and metal ions.
  • the anion exchange resin is a polymer having a basic group, and an ammonium group is mainly an anion such as hydroxy ions or halogenated ions. Can be exchanged.
  • at least one of the cation exchange resin and the anion exchange resin may be used, and the cation exchange resin and the anion exchange resin may be used simultaneously for effective removal of the ionic material.
  • the ratio of the cation exchange resin and the anion exchange resin may be 1: 1 to 1: 3, specifically, 1: 1.5 to 1: 2.
  • the content of the ionic substance in the epimerization reactant after the ion purification may be 10 microsiemens per cm or less as measured by an electrical conductivity meter.
  • the epimerized reactants from which impurities such as tagatose separation, pigment material and ionic material are removed may optionally be further concentrated for the next reaction.
  • tagatose may be concentrated to a concentration of at least 40 Bx. Or it can be concentrated so that a tagatose concentration may be 50 Bx or more.
  • crystals may be grown by slowly cooling the temperature of the epimerized reactant.
  • the crystallization may be performed by gradually cooling the crystallization by 0.1 to 5 ° C per hour at a temperature of 40 to 90 ° C.
  • the obtained tagatose crystals can be further dehydrated and dried.
  • epimerization of fructose with hexuronic acid C4-epimerase yields an epimerization reactant including tagatose.
  • Purifying the epimerized reactant, concentrating the purified epimerized reactant and crystallizing it may yield tagatose crystals, which may be dehydrated and dried.
  • Tagatose produced by the manufacturing method according to one or other aspects of the invention has a purity of at least 80%, for example at least 90%, in particular at least 95%, more specifically at least 98% Can be.
  • the purity may be the purity measured after step b) and before step c). In another example, the purity may be purity measured after step c).
  • the unreacted fructose is reused in step a), or the mother liquor from which the crystals are separated after step c) is reused in step b), or both. It can be carried out.
  • the tagatose and fructose in the epimerization reactant are separated through the purification step, and the separated fructose may be reused as a substrate of the epimerization reaction in step a).
  • the crystal form of tagatose and crystals are separated into a separated mother liquor, and the separated mother liquor may include a predetermined amount of tagatose may be reused in the purification step.
  • FIG. 5 shows one aspect of the invention wherein reuse of the separated fructose into step a) and reuse of the separated mother liquor into step b) occur simultaneously.
  • the sugar solution obtained through hydrolysis of sugar, isomerization of glucose and / or hexuronic acid C4-epimerization contains at least one member selected from the group consisting of sugar, glucose, fructose and tagatose. It may be a sugar solution consisting of a mixed sugar, the sugar solution may be separated using a chromatography separation method.
  • the separation of the mixed sugar composed of the aldohexose and the ketohexose can be economically separated by chromatography using a resin having a cationic moiety.
  • a resin having a cationic moiety such as K and Na should be used as the structures are similar. This basically indicates that tagatose can be purely separated only by performing two separate chromatography in sequence.
  • metal ion residues that can be used for chromatographic separation include, but are not limited to, K, Na, Ca, Mg, and the like.
  • the chromatography may be preferably SMB (Simulated Moving Bed) chromatography. At this time, recycling of the unreacted material in the chromatography separation step may be arbitrarily selected according to the type of sugar solution.
  • SMB Simulated Moving Bed
  • the tagatose may be concentrated and then crystallized as necessary.
  • the sugar solution can be concentrated and recycled to the previous step of the epimerization step.
  • the sugar solution can be concentrated and recycled to the previous step of the isomerization step.
  • the sugar solution may be concentrated or crystallized, and then processed to be used as a sugar liquid or as another raw material for production.
  • Chromatographic operation conditions can produce various results depending on the composition ratio of the mother liquor (Feed) to be used, the type of separation resin, the target yield (tagatose) or the target purity of the target liquid in the separation liquid. Therefore, the composition of the reaction solution obtained in the enzymatic conversion of fructose to tagatose, that is, the conversion rate of fructose to tagatose (%), affects the yield result in chromatography.
  • the purity of tagatose in the separation solution which is a desirable result for the crystallization process, was set at 95% level, the change in chromatographic yield (%) value according to the composition ratio (%) of fructose and tagatose in the mother liquor (Feed) was changed. Was to be observed.
  • the recovery rate (%) of tagatose is particularly affected by the enzyme conversion rate (%) compared to fructose.
  • enzyme titer and process conditions must be established to obtain at least 15% of enzyme conversion (%).
  • recovery and purity of tagatose of 85% or higher are 95%.
  • at least 10% of enzyme conversion rate (%) must be secured. Therefore, it can be confirmed again that the enzyme conversion rate (%) is a very important factor in the efficiency of the manufacturing process to be configured in the present patent.
  • genomic DNA SEQ ID NO: 1 of Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / MSB8 / DSM 3109 / JCM 10099), a heat-resistant microorganism, was used as a template (5'-GGG CATATG ATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3 ') and reverse (5'-AAA CTCGAG).
  • PCR reaction was performed by adding primers of CCCCTCCAGCAGATCCACGTG-3 ').
  • PCR reaction was performed by adding genomic DNA (SEQ ID NO: 2) of thermotoga neapolitana (DSM 4359), a heat-resistant microorganism, with primers of forward (5'-GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3 ') and reverse (5'-AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3').
  • DSM 4359 thermotoga neapolitana
  • primers of forward 5'-GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3 '
  • reverse 5'-AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3'
  • PCR reaction conditions are shown in Tables 3 and 4 below.
  • E. coli was transformed to DH5 ⁇ strain, after confirming the nucleotide sequence of the gene insertion to remove the plasmid from which the protein expression strain E. coli BL21 for (DE3) was again transformed and used to produce ketohexose C4-epimerase.
  • E. coli BL21 for (DE3) was again transformed and used to produce ketohexose C4-epimerase.
  • coli BL21 (DE3) pET21a-TM (including Thermotoga maritima- derived enzyme expression gene) and E.coli BL21 (DE3) pET21a-TN (thermotoga neapolitana- derived enzyme expression gene to produce the ketohexose C4-epimerase Incubated for 2 hours in LB medium containing ampicillin at a concentration of 100 mg / ml. At this time, the culture process was performed at a culture temperature of 37 ° C. and a stirring speed of 180 rpm.
  • the optical density of the microorganism was measured at 600 nm, and when the value was in the range of 0.4 to 0.8, 0.25 mM IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was added thereto overnight under the same conditions ( overnight) to induce protein expression.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the recovered supernatant was passed to a column filled with Ni-NTA resin as a filler, and the volume in the column occupied a 50 mM NaH 2 PO 4 (pH8.0) buffer solution containing 20 mM imidazole and 300 mM NaCl. 10-fold volume of to remove non-specifically bound proteins.
  • a 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer solution containing the final 250 mM imidazole and 300 mM NaCl was eluted and purified to elute the ketohose C4-epimerase enzyme and removed to remove imidazole in the purified enzyme.
  • a few times of mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0) buffer solution was poured to make the concentration below 0.01 mM. Purified enzymes were quantified for protein using Bradford assay.
  • the purified enzyme was added to 1% by weight fructose, 0.01 mM ZnSO 4 , 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) and reacted at a reaction temperature of 60 ° C. for 3 hours. Was performed.
  • the concentration of tagatose converted by ketohexose C4-epimerase and the conversion rate from fructose to tagatose are shown in Table 5 below.
  • fructose and the product tagatose remaining after the reaction was quantified using HPLC.
  • the column used was Shodex Sugar SP0810, the column temperature was 80 ° C., water was flowed into the mobile phase at 0.5 ml / min, and the peaks resulting from the reaction of the enzyme based on fructose using HPLC chromatography in FIG. Detection was quantified.
  • Random mutations were performed using the T.neapolitana-derived gene as a template. Specifically, random mutations were induced for T.neapolitana using ClonTech's Diversify random mutagenesis kit, and E. coli BL21 was inserted into the pET-28a vector by amplifying the genes amplified by PCR reaction under the conditions of Tables 6 and 7 below. (DE3) strain was transformed. The subsequent steps were carried out in the same manner as in Example 2.
  • the variant strain has a genomic DNA base sequence of SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoding the enzyme produced by the variant strain is the same as SEQ ID NO: 4.
  • the mutant strain producing the ketohexose C4-epimerase is E. coli BL21 (DE3) pET28a-TN (m) (Accession No .: KCCM11544P).
  • the mutant strains were prepared in the same manner as in Examples 2 and 3 to prepare C4-epimerase.
  • the conversion rate according to temperature, pH, metal salt, and the like was evaluated in the same manner as described below.
  • the purified enzyme obtained in Example 5 was added to 10 wt% fructose, 0.3 mM ZnSO 4 , and 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) to carry out the reaction for 3 hours. It was. As shown in FIG. 7, enzyme activity was measured at different reaction temperatures from 37 ° C to 96 ° C.
  • Enzyme activity tended to increase with increasing temperature, but showed lower activity when reaction was over 90 °C.
  • the purified enzyme obtained in Example 5 was added to 10% by weight fructose, 0.01 mM NiSO 4 , phosphate buffer or Tris buffer, and the reaction was performed for 3 hours.
  • potassium phosphate buffer was used at pH 5 to pH 8.0
  • Tris buffer was used at pH 8.5 to pH 8.5.
  • enzyme activity was measured at different pHs. The results showed that the activity increased with increasing pH in both potassium phosphate buffer and Tris buffer. Tris buffer was used at the same pH.
  • the purified enzyme obtained in Example 5 was added to 10 wt% fructose and 50 mM phosphate buffer, and the reaction was performed for 3 hours. At this time, 13 different metal salts were added to the reaction at 1 mM.
  • the purified enzyme obtained in Example 5 was added to 10 wt% fructose, 0.3 mM NiSO 4 , 50 mM phosphate buffer, and the reaction was performed at 60 ° C. for 3 hours. In order to evaluate the marginal conversion rate in the enzyme reaction, the enzyme reaction was performed for 18 hours. Referring to Figure 10 it can be seen that the conversion rate of fructose to tagatose when using the improved enzyme used in this experiment is 30%.
  • the purified enzyme obtained in Example 5 was added to 10% by weight fructose, 0.01 mM NiSO 4 , 50 mM phosphate buffer, and the reaction was performed at 60 ° C. for 3 hours.
  • the obtained mixture of tagatose was added 0.1 to 0.5% (wt / v) of powder activated carbon, stirred at 10 to 100 rpm for 0.5 to 1 hour, and then filtered through a filter press to remove colored substances. It was.
  • fructose and tagatose In order to efficiently chromatographically separate fructose and tagatose from the mixture of fructose and tagatose from which the colored material has been removed, it is passed through a column filled with a cation exchange resin substituted with a hydrogen group and an anion exchange resin substituted with a hydroxyl group. The process of removing the ionic component in the solution was performed.
  • the strong acid cation exchange resin (Amberlite CR1310 Ca) filled with a calcium group was concentrated to 60% (g / g solution) of the tagatose mixture produced from fructose from which impurities such as colored substances and ionic components were removed by decoloring and desalting.
  • the advanced Simulated Moving-bed System (Organo, Japan) was used to fractionate and chromatize the solution to convert from purity, recovery yield and fructose of the components.
  • the ratio of tagatose mixed feed and water as mobile phase was measured.
  • Tagatose was crystallized using the solution recovered by the chromatographic separation of Example 7. It was crystallized by vacuum and heat-concentrating so that a tagatose sugar concentration might be 70 Bx, and gradually cooling the temperature from 60 degreeC to 30 degreeC by 0.7-1 degreeC per hour.
  • crystal recovery was performed using a centrifugal dehydrator, and dried for 1 hour using a 60 ° C fluidized bed dryer to measure purity and recovery of the product.
  • the continuous recycling production process of tagatose using the purified enzyme obtained in Example 5 was designed by the following method.
  • This continuous recycle production process is illustrated in a simplified schematic in FIGS. 2, 3, 4, 5.
  • the purification step may be carried out or excluded by separately adding a unit process for improving product quality, such as decolorization and desalting.
  • the solution containing fructose is passed through a hexuronate C4-epimerase reactor to produce tagatose, and an epimerized output composed of a mixed sugar of fructose and tagatose.
  • Chromatographic separation optionally inserting or excluding a concentration step according to the concentration of tagatose in the purified epimerization reaction, and concentrating the chromatography separation solution containing tagatose as a main component (90% or more) (if necessary) Crystallization to prepare tagatose, wherein the chromatographic residue containing fructose as a main component is recycled to the epimerization reactor and / or the amorphous mother liquor obtained in the crystallization step of tagatose is subjected to post-epomerization step. Can be recycled.

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Abstract

본 발명은 타가토스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

타가토스의 제조방법
본 발명은 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법, 더욱 구체적으로, 과당의 4번 탄소 위치를 에피머화시켜 타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
타가토스는 설탕과 거의 구별할 수 없는 천연의 단맛을 가지고 있으며, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 그러나 섭취한 타가토스는 소장에서 잘 흡수되지 않기 때문에 혈당치에 영향을 주지 않으며, 칼로리는 설탕의 약 30 %인 저칼로리 감미료이다. 또한 타가토스는 장내 미생물에 의하여 발효되어 유익한 유산균의 증식을 촉진시키는 전생물적 효과(prebiotic effect)를 가지고 있다.
타가토스는 섭취량의 20 % 정도 만이 소장에서 흡수되고, 나머지 80%는 장내 미생물이 서식하는 대장으로 이동되어 선택적으로 유산균 생성을 촉진함으로써 단쇄 지방산을 생성하며, 특히, 대장암을 예방하는 부티릭산(butyrate)를 다량으로 (전체 단쇄 지방산의 50 % 수준까지) 생성하는 프리바이오틱(prebiotic) 성질을 가지고 있다. 또한 타가토스는 1.5 kcal/g의 저칼로리 천연당으로서, 미국 FDA의 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어, 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 기능성 감미료로서 사용되고 있다.
그러나 타가토스는 자연계에 흔하게 존재하는 것이 아니라 유제품 또는 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당이므로, 저칼로리의 기능성 감미료로 사용되기 위해서는 저렴한 원료로부터 대량 생산할 수 있는 기술이 개발되어야 한다.
종래에는 타가토스의 제조는 갈락토스의 이성화 반응을 통하여 수행되어 왔으며, 갈락토스를 경제적으로 수득하기 위하여 갈락토스를 함유한 다양한 기초 원료 및 이로부터의 갈락토스의 수득 및 타가토스의 제조에 대한 연구가 선행되어 왔다. 가장 대표적인 기초 원료로는 유당을 사용하였으나, 유당 혹은 유당을 함유하고 있는 제품의 가격은 날씨에 따른 원유의 생산량, 분유의 수요, 제 3국에서의 유당 소비량 변화 등의 다양한 요인들에 의하여 상승과 하락을 반복하는 고유의 가격 패턴을 가져 시장에서의 가격의 불안정성이 존재하여 안정적인 타가토스의 생산 원료 수급을 어렵게 하는 문제가 있었다. 따라서, 보편화된 일반 원료(포도당, 설탕, 과당 등)를 사용하여 타가토스를 제조하는 신 공정개발이 필요하다.
이에, 대한민국 공개특허 제10-2009-0125004호에서는 에피머화를 통하여 포도당으로부터 갈락토스를 생산하는 방법을 개시할 뿐이고, 대한민국 공개특허 제10-2006-0125971호에서는 케토헥소오스의 C3-에피머화 반응을 개시하고 있으나, 상기 문헌 모두에서 C4-에피머화 반응을 이용한 과당으로부터 타가토스를 제조하는 방법은 개시하고 있지 않다.
종래에는 유당 또는 유당을 함유하고 있는 제품 및 기타 갈락토스를 함유한 다양한 생물자원으로부터 분해되는 갈락토스를 이용하여 타가토스를 제조하였다. 그러나 현재까지 원료의 안정적 수급 및 투자 효율성 등을 고려하여 현재까지 상업화되거나 그 수준까지 제조가 가능한 원료는 유당 혹은 유당을 함유하고 있는 제품 (유청 등)으로 평가되고 있다. 그러나, 유당 또는 유당을 함유하고 있는 제품은 가격의 변동이 심하고, 최근 유당의 소비량이 증가하면서 가격이 상승함에 따라 안정적인 타가토스의 공급이 어려운 문제가 있다.
또한, 종래 유당을 갈락토스로 전환하는 화학전환법은 에피머화에 한계가 있었고, 효소전환법은 여전히 갈락토스를 이용하는 한계가 있었다.
따라서, 종래 타가토스 제조법에 비해 안정적이고 경제적이면서도 생산 효율이 높은 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
이에, 본 발명은 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계; 및 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 가격 변동이 큰 유당이 아닌, 보편화된 원료인 과당을 사용하여 제조원가를 절감시킴으로서 경제적이면서도 높은 수율의 타가토스 제조방법을 제공할 수 있다.
보편적으로 과당은 포도당 혹은 설탕으로부터 공업적으로 제조 가능함은 매우 널리 알려져 있는 사실이므로, 본 발명에서 제시하는 공정의 원료는 과당 이외에 보다 저렴한 생산을 위하여 과당을 전체에 혹은 일부 함유한 형태로 사용하는 경우까지 확장하여 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 타가토스를 전분질 혹은 원당 혹은 설탕으로부터 효소적 전환을 통하여 생산하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 과당을 이용하여 타가토스를 제조하여 오늘날 중요한 식품 소재로 각광받고 있는 타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 양태에 따른 타가토스의 제조 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 2 내지 도 5는 각각 상이한 양태에 따른 타가토스의 제조 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 6은 과당을 기질로 하여 C4-에피머화 효소 반응에 의한 타가토스 생성을 보여주는 HPLC 그래프이다.
도 7은 반응 온도 변화에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 pH 변화에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 금속염 종류에 따른 C4-에피머화 효소 활성 정도를 보여주는 그래프이다.
도 10은 기질인 과당의 농도 변화에 따른 타가토스로의 전환율 정도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 과당과 타가토스의 전환율과 회수율 간의 상관성을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본원에서 상기 용어 "n번 탄소 위치"란, IUPAC에서 규정하는 탄소 번호를 매기는 규칙에 따라 정해진 탄소 위치를 의미하며, 이는 Cn으로 표현할 수 있다. 이 때, n은 1 이상인 정수를 말한다. 예를 들어, "4번 탄소 위치에서 에피머화"되는 것을 "C4-에피머화"로 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, a) 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; b) 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계; 및 c) 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법일 수 있다.
일반적으로, 단당류는 알도헥소오스(aldohexose)와 케토헥소오스(ketohexose)로 분류될 수 있다. 알도헥소오스란 탄소 원자 여섯 개로 이루어지진 알도스로, 한쪽 끝에 알데하이드기를 가지고 있는 것을 의미하고, 비제한적인 예로는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), 알로스(allose), 굴로스(gulose), 알트로스(altrose), 만노스(mannose), 탈로스(talose), 아이도스(idose)가 있다. 또한, 본원에서 케토헥소오스는 탄소 원자 여섯 개로 이루어지고 케톤기를 가진 단당류를 의미하고, 비제한적인 예로는 과당(fructose), 타가토스(tagatose), 사이코스(psicose) 및 소보스(sorbose)가 있으며, 바람직하게는 과당일 수 있다. 상기 과당 및 상기 타가토스는 본원에서 특별한 다른 언급이 없는 한 D-형 과당 또는 D-형 타가토스를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 과당은 설탕 또는 포도당으로부터 얻어질 수 있다. 이를 통해, 포도당, 과당, 설탕과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율의 타가토스를 제조하는 방법을 제공하여 타가토스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.
따라서, 상기 a) 단계 전, 설탕를 가수분해하여 과당을 얻는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 가수분해에 사용되는 효소는 β-프룩토푸라노시다아제, 인버타아제, 사카라제 등을 포함하는 β-D-프룩토시다아제; 수크라아제, α-글루코시다아제 및 α-D-글루코하이드롤라아제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 a) 단계 전, 포도당을 이성질화하여, 과당를 얻는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다. 상기 이성질화 효소로는 글루코스 아이소머라아제 또는 포스포글루코 아이소머라아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용될 수 있는 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)는 Thermotoga sp. 유래 효소 또는 그 변이체 일 수 있고, 구체적으로는 Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, 또는 Thermotoga thermarum 유래 효소 또는 그 변이체 일 수 있다.
또한, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소는, 예를 들어, 서열목록 번호 1 내지 서열목록 번호 3의 genomic DNA로 E. coli 등의 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 Escherichia.coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, 또는 Bacillus subtilis 등이 있으며, 상기 E. coli 형질전환된 균주로는 예를 들어, E.coli BL21(DE3)pET21a-TM (기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN (기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주 (기탁번호: KCCM11544P) 등이 있다. 상기 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM, E.coli BL21(DE3) pET21a-TN 및 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주는 각각 한국미생물보존센터(Korean Cuture Center of Microorganisms)(서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 소재)에 2014. 5.23.자로 기탁되었으며, 기탁번호는 각각 KCCM11542P, KCCM11543P, 및 KCCM11544P이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는, 상기 기탁 균주 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m) 균주(기탁번호: KCCM11544P) 각각에 대한 것이다.
상기 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소로 에피머화시키는 반응은 pH 5 내지 8, 60 내지 90 ℃ 온도 조건에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 pH 6 내지 8 및 70 내지 90 ℃ 또는 75 내지 90℃의 고온 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 pH 및 온도 범위 내에서 효소반응 시, 상대적으로 고온에서 반응을 진행시 킬 수 있어 제조공정 중 미생물 오염을 최소화할 수 있고, 기질로 사용되는 케토헥소오스의 용해도를 증가시킬 수 있으며 효소의 반응속도 및 전환율을 극대화할 수 있는 효과가 나타날 수 있다. 반응 온도가 효소 활성에 미치는 영향을 도 7을 참조하여 설명하면, 온도가 증가할수록 C4-에피머화 효소 활성이 증가하지만, 90℃를 경계로 하여 효소 활성이 급격히 저하될 수 있다.
또한, pH가 효소 활성에 미치는 영향은 도 8을 참조하면, 일반적으로 pH가 증가할수록 효소 활성이 증가하는 경향이 있다. 특히 완충액의 종류에 따라 적정 pH 영역이 달라질 수 있다. 예컨데, 인산염 완충액에서는 pH 5 내지 9이 적정 pH일 수 있으며, Tris 완충액에서는 pH 8.0 내지 8.5가 적정 pH일 수 있다. 다만, 후속 공정을 위해 pH를 8 이하로 하는 것이 적절할 수 있다.
일 예에서, 상기 C4-에피머화 효소로 에피머화시키는 반응은 금속염의 존재하에 실시할 수 있다. 상기 금속염은 상기 에피머화 반응에 있어서 촉매 역할을 할 수 있으며, 예를 들어, NiSO4, NiCl2, CoCl2, MnCl2, 또는 ZnSO4를 들 수 있다. 구체적으로, NiSO4, NiCl2 또는 CoCl2를 1종 이상 사용할 수 있다. 도 9를 참조하면, 금속염 종류에 따라 에피머화 효소 활성이 달라질 수 있으며, 활성도가 높은 금속염부터 낮은 순서대로 배열할 때, NiSO4, NiCl2, CoCl2, Mn Cl2, 및 ZnSO4의 순서임을 알 수 있다. 상기 금속염의 농도는 0.001mM 내지 50mM일 수 있다. 구체적으로 금속염의 농도는 0.01mM 내지 25mM의 범위일 수 있다.
상기 에피머화 반응물 중 타가토스는 0.05 중량% 이상, 예를 들어, 0.07 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상으로 포함될 수 있으며, 타가토스의 전환율은 5% 이상, 예를 들어, 7% 이상일 수 있다.
상기 정제 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본원 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 이온 정제, 크로마토그래피 또는 분별 결정 등을 들 수 있다. 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 이온 수지는 K, Na, Ca, Mg 잔기가 부착된 강산성 양이온 교환수지일 수 있다.
과당과 타가토스와 같은 동일한 케토헥소스 당일 경우, 구조가 유사함에 따라 K, Na 등과 같은 잔기를 가진 별도의 수지를 사용하여야 한다. 이는 기본적으로 두 개의 개별적인 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여야 타가토스를 순수 분리할 수 있음을 나타낸다. 상기 크로마토그래피 분리에 사용할 수 있는 금속 이온 잔기의 예로 K, Na, Ca, Mg 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 크로마토그래피는 구체적으로 SMB (Simulated Moving Bed) 크로마토그래피일 수 있다.
일 양태에서, 상기 정제 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 이 둘다를 추가로 실시할 수 있다. 구체적으로는 상기 정제 단계 전에, 탈색, 탈염 또는 이 둘 다를 실시할 수 있다. 상기 탈색은 활성탄을 에피머화 반응물의 중량을 기준으로 0.05 내지 5.0 중량%로 첨가하고 교반하는 것을 포함할 수 있다. 상기 교반은 30분 내지 3시간 동안 10 내지 1000 rpm, 구체적으로 10 내지 100 rpm의 교반 속도로 수행될 수 있다.
상기 탈염은 양이온 교환수지, 음이온 교환수지 또는 이 둘 다를 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 탈색 및 이온 정제 과정을 통해 에피머화 반응물 중 색소 물질 및 이온성 물질 등의 불순물이 제거될 수 있다.
상기 양이온 교환수지는 산기를 가지고 있는 중합체로, 수소 이온이나 금속 이온과 같은 양이온을 교환시킬 수 있으며, 상기 음이온 교환수지는 염기성기를 가지고 있는 중합체로, 암모늄기를 주로 히드록시 이온이나 할로겐화 이온과 같은 음이온을 교환시킬 수 있다. 본원 발명에서 상기 양이온 교환수지나 상기 음이온 교환수지를 1종 이상 사용할 수 있으며, 이온성 물질의 효과적 제거를 위해 양이온 교환수지와 음이온 교환수지를 동시에 사용할 수 있다. 이 경우 양이온 교환수지와 음이온 교환수지의 비율은 1:1 내지 1:3, 구체적으로, 1:1.5 내지 1:2일 수 있다. 상기 이온 정제 후 에피머화 반응물 중 이온성 물질의 함량은 전기 전도계로 측정시 단위 cm 당 10 마이크로 지맨스 이하일 수 있다.
상기 정제, 탈색 및/또는 탈염 공정을 거치면서 타가토스의 분리, 색소 물질 및 이온성 물질 등의 불순물이 제거된 에피머화 반응물은 임의로 다음 반응을 위해 추가 농축될 수 있다. 예를 들어, 타가토스가 농도가 40 Bx 이상이 되도록 농축할 수 있다. 또는 타가토스 농도가 50 Bx 이상이 되도록 농축할 수 있다.
상기 정제된 에피머화 반응물의 결정화 단계는, 에피머화 반응물의 온도를 서서히 냉각시켜 결정을 성장시킬 수 있다. 상기 결정화는 예를 들어, 40 내지 90℃의 온도에서 시간 당 0.1 내지 5 ℃씩 서서히 냉각시켜 결정화시키는 것을 들 수 있다. 상기 수득된 타가토스 결정은 추가로 탈수 및 건조될 수 있다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 다른 양태에 따른 타가토스의 제조 방법은, 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하고, 상기 에피머화 반응물을 정제하고, 상기 정제된 에피머화 반응물을 농축시키고, 이를 결정화하여 타가토스 결정을 수득하고, 이를 탈수 및 건조하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태 혹은 다른 양태들에 따른 제조 방법에 의해 제조된 타가토스는 80% 이상의 순도, 예를 들어, 90% 이상의 순도, 구체적으로 95% 이상의 순도, 보다 구체적으로 98% 이상의 순도를 가질 수 있다. 상기 순도는 b) 단계 후, c) 단계 전에 측정된 순도일 수 있다. 다른 예에서, 상기 순도는 c) 단계 후에 측정된 순도일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 b) 단계 후 미반응된 과당을 a) 단계에 재사용하거나, 상기 c) 단계 후 결정이 분리된 모액을 b) 단계에 재사용하거나, 또는 이 둘 다를 추가적으로 실시할 수 있다.
상기 예를 도 4를 참조하여 설명하면, 상기 정제 단계를 통해 에피머화 반응물 중 타가토스와 과당이 분리되며, 분리된 과당은 a) 단계인 에피머화 반응의 기질로 재사용될 수 있다. 또한, 도 3을 참조하면 상기 결정화 단계에서 결정 형태의 타가토스와 결정이 분리된 모액으로 분리되며, 상기 결정이 분리된 모액은 소정량의 타가토스를 포함할 수 있으므로 정제 단계에서 재사용될 수 있다. 도 5는 분리된 과당의 a) 단계로의 재사용 및 결정이 분리된 모액의 b) 단계로의 재사용이 동시에 이루지는 본 발명의 일 양태를 도시한다.
본 발명의 일 예에 따른 설탕의 가수분해, 포도당의 이성질화 및/또는 헥수론산 C4-에피머화를 통하여 수득된 당액은 설탕, 포도당, 과당 및 타가토스로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 함유하는 혼합당으로 이루어진 당액일 수 있으며, 상기 당액은 크로마토그래피 분리법을 이용하여 분리할 수 있다.
일반적으로 상기 알도헥소오스와 상기 케토헥소오스로 구성된 혼합당의 분리는 양이온 잔기를 가진 수지를 이용한 크로마토그래피로 경제적인 분리가 가능하다. 그러나, 동일한 형의 당일 경우, 구조가 유사함에 따라 K, Na와 같은 잔기를 가진 별도의 수지를 사용하여야 한다. 이는 기본적으로 두 개의 개별적인 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여야 타가토스를 순수 분리할 수 있음을 나타낸다. 상기 크로마토그래피 분리에 사용할 수 있는 금속 이온 잔기의 예로 K, Na, Ca, Mg 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 크로마토그래피는 바람직하게는 SMB (Simulated Moving Bed) 크로마토그래피일 수 있다. 이 때, 상기 크로마토그래피 분리 단계에서 미반응물의 재순환은 당액의 종류에 따라 다음과 같이 임의로 선택할 수 있다.
타가토스를 주성분(90% 이상)으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 타가토스를 농축한 후 필요에 따라 결정화하는 단계로 이루어질 수 있다.
과당을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축하여, 에피머화 단계의 전 단계로 재순환시킬 수 있다.
포도당을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축하여, 이성화 단계의 전 단계로 재순환시킬 수 있다.
설탕을 주성분으로 함유한 당액의 경우에는, 상기 당액을 농축 또는 결정화한 후, 가공처리하여 설탕액으로 사용하거나 다른 생산 원료로 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예들은 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1
효소 전환율에 따른 크로마토그래피 분리 특성 평가
혼합당(과당 및 타가토스)로부터 목적 물질(타가토스)를 고순도 분리 및 결정화를 수행하기 위하여는, 크로마토분리를 이용한 순수 분리 단계가 매우 중요하다. 일반적으로 결정 제품화를 목적으로 하는 당액의 순수분리는 목적물질(타가토스)의 함량이 얼마인가에 따라, 상이한 회수율(%)을 얻게 된다. 일반적으로 목적물질(타가토스)의 함량이 높아질수록, 이에 비례하여 높은 회수율(%)을 얻게 되며, 이에 따라 상대적으로 적은 제조 가공비로 최종 제품을 제조 가능하게 된다. 일반적으로 결정당을 효율적(고순도, 고수율)으로 제조하기 위하여는 모액 (Feed)에 함유되어 있는 목적물질(타가토스)의 순도가 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 에 이르는 것이 매우 중요하다.
크로마토그래피 운전 조건은 사용하는 모액 (Feed)의 조성비, 분리 수지의 종류, 분리액 내 목적물질(타가토스)의 목표 수율 혹은 목표 순도에 따라 다양한 결과를 얻을 수 있다. 따라서 과당의 타가토스로의 효소적 전환 공정에서 얻어지는 반응액의 조성, 즉 과당의 타가토스로의 전환율(%)은 크로마토그래피에서의 수율 결과에 영향을 미친다. 결정공정에 사용하기 위한 바람직한 결과인 분리액 내 타가토스의 순도를 95% 수준으로 고정하였을 때, 모액 (Feed) 내 과당 및 타가토스의 조성비(%)에 따른 크로마토분리 수율(%) 값의 변화를 관찰하고자 하였다.
당의 크로마토그래피 분리 효율성의 극대화하기 위하여는 크로마토그래피 분리에 사용되는 수지의 크기, 수식화된 금속 이온 잔기 종류 (예를 들어 K, Na, Ca, Mg 등)를 변경하여 일부 개선된 결과값을 얻을 수 있으나, 본 발명에서는 과당과 타가토스의 일반적인 분리 특성을 고려하여 Ca 잔기를 수식하고 있는 분리 수지를 사용하였다. 평가에 사용된 조건은 다음 표 1과 같다.
표 1
샘플 과당 및 타가토스의 혼합 단당 샘플
공급하는 샘플의 농도 Bx. 60%
흡착제 앰버라이트(Amberlite CR-1310; Ca-type)
컬럼 사이즈 20 mm x 1000 mm (314ml)
탈착제 H2O
공급 부피 15ml
유속 26 ml/min (LV5m/h)
온도 60℃
상기 조건을 적용하였을 때, 과당과 타가토스의 조성비(%)에 따른 SMB 크로마토그래피 분리 테스트 결과는 아래 표와 같다. 결정화 공정에 사용하기에 매우 바람직한 조건인 타가토스 순도 95% 수준을 유지하였을 때, 과당과 타가토스 조성비에 따른 타가토스 및 과당의 회수율 (%)을 측정한 결과, 아래의 표 2와 같은 결과를 얻었다.
표 2 과당과 타가토스의 조성비에 따른 크로마토그래피 분리 특성 분석 결과
Sample1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 Sample 7
Feed content (%) Tagatose 5 10 15 20 25 30 35
Fructose 95 90 85 80 75 70 65
Recovery yield (%) Tagatose 82.14 86.15 90.98 92.16 94.13 94.45 95.48
Fructose 99.99 99.56 99.44 99.02 98.49 98.12 97.53
Tagatose Purity (%) 95.46 95.76 95.85 95.63 95.39 95.48 95.62
상기 표 2의 결과 및 도 11을 참조하여 보면, 특히 과당에 비하여 타가토스의 회수율 (%)이 효소 전환율(%)에 민감하게 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 타가토스를 90% 이상의 회수율 및 순도 95% 수준으로 제조하기 위하여는 최소한 15% 이상의 효소전환율(%)을 얻을 수 있도록 효소 역가 및 공정 조건을 확립하여야 하며, 마찬가지로 타가토스 85% 이상의 회수율 및 순도 95% 제조를 위하여는 최소한 10% 이상의 효소전환율(%)을 확보하여야 함을 의미한다. 따라서 효소전환율(%)은 본 특허에서 구성하고자 하는 제조 공정의 효율성에 매우 중요한 요소임을 재차 확인할 수 있다.
실시예 2
케토헥소오스 C4-에피머화 효소의 제조
내열성 미생물인 Thermotoga maritima(strain ATCC 43589 / MSB8 / DSM 3109 / JCM 10099)의 genomic DNA(서열목록 1)를 주형으로, 정방향 (5'-GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG-3') 및 역방향 (5'-AAACTCGAGCCCCTCCAGCAGATCCACGTG-3')의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
내열성 미생물인 Thermotoga neapolitana (DSM 4359)의 genomic DNA(서열목록 2)를 주형으로, 정방향 (5'- GGGCATATGATGGTCTTGAAAGTGTTCAAAG -3') 및 역방향 (5'-AAACTCGAGTCACCCCTTCAACAGGTCTACGTG-3')의 프라이머를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응 조건은 하기의 표 3 및 4와 같다. PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자를 pET-21a 벡터에 삽입하였고, E. coli DH5α 균주에 형질전환하였으며, 이로부터 플라스미드를 분리하여 삽입된 유전자의 염기서열을 확인한 후 단백질 발현용 균주인 E. coli BL21(DE3)에 다시 형질전환하여 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하는데 이용하였다. 상기 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하기 위하여 E.coli BL21(DE3)pET21a-TM(Thermotoga maritima 유래 효소 발현 유전자 포함)및 E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(Thermotoga neapolitana 유래 효소 발현 유전자 포함)를 100 mg/ml 농도의 암피실린을 포함한 LB 배지에서 2시간 정도 배양하였으며, 이 때 배양온도 37 ℃, 교반속도 180 rpm에서 상기 배양과정을 수행하였다. 배양 후, 600 nm에서 미생물의 광학밀도(optical density)를 측정하여 그 값이 0.4 내지 0.8 범위에 들어오면, 0.25 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 동일 조건에서 하룻밤 동안(overnight) 배양하여, 단백질 발현을 유도하였다.
표 3
반응용액 조성 첨가량 (㎕)
PCR 완충액 (5X) 10
dNTPs (2.5 mM each) 1
PCR 주형 (T. maritime gDNA) 1
정방향 프라이머 (100pmol) 1
역방향 프라이머 (100pmol) 1
DNA 중합효소 (Phusion, NEB사) 0.5
멸균 증류수 35.5
표 4
단계 온도 (℃) 시간(초) 사이클
Initial Denaturation 98 30 1
Denaturation 98 10 35
Annealing 65.7 30
Extension 72 50
Final Extension 72 350 1
실시예 3
케토헥소오스 C4-에피머화 효소의 정제
미생물 내에 발현된 케토헥소오스 C4-에피머화 효소의 활성을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법을 이용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단백질 발현이 완료된 배양액을 8,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 균체를 수거한 후, 10 mM 이미다졸(imidazole)과 300 mM NaCl이 포함되어있는 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) 완충 용액에 재현탁하였다. 상기 현탁된 균체를 세포파쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄하였으며, 이를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상기 회수된 상등액을 충진제로서 Ni-NTA 수지가 충진되어 있는 컬럼에 통액하고, 20 mM 이미다졸 및 300mM NaCl을 함유하는 50 mM NaH2PO4 (pH8.0) 완충 용액을 컬럼안의 충진제가 차지하는 부피의 10배 부피로 흘려주어 비특이적으로 결합될 수 있는 단백질을 제거하였다. 최종 250 mM 이미다졸 및 300 mM NaCl이 포함된 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) 완충 용액을 흘려주어 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 용출 정제하였으며, 정제 효소 내의 이미다졸을 제거하기 위하여 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) 완충 용액을 수 회 흘려주어 그 농도가 0.01 mM 이하가 되도록 하였다. 정제된 효소는 브래드포드 법(Bradford assay)을 이용하여 단백질을 정량하였다.
실시예 4
과당으로부터 타가토스로의 전환
상기 실시예 2 및 3에서 얻어진 효소들의 활성을 측정하기 위하여 상기 정제된 효소를 1 중량% 과당, 0.01 mM ZnSO4, 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.0)에 넣어 반응온도 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 케토헥소오스 C4-에피머화 효소에 의해 전환된 타가토스의 농도 및 과당으로부터 타가토스로 전환된 전환율을 하기의 표 5에 나타내었다.
또한, 반응 후 남아있는 과당과 생성물인 타가토스는 HPLC를 이용하여 정량하였다. 사용한 컬럼은 Shodex Sugar SP0810이며, 컬럼 온도를 80 ℃로 하였고, 이동상으로 물을 0.5 ml/분으로 흘려주었고, 도 6에 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 과당을 기질로 하는 상기 효소의 반응으로 나타나는 피크를 검출하여 정량하였다.
표 5
타가토스 농도 (%) 전환율 (%)
T.maritima 0.093 9.3
T.neapolitana 0.080 8.0
상기 표 5 및 도 6를 참조하면, 과당을 첨가하지 않고, 상기 효소만을 인산염 완충용액에 넣어 전환반응을 시킨 경우(파쇄선; 의 경우), 과당 및 타가토스를 나타내는 피크가 전혀 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.
그러나, 과당과 상기 효소를 함께 첨가하여 에피머화 반응을 시킨 경우(실선; 의 경우)에는, 효소 반응 시작 후, 30분이 경과되기 이전에는 과당을 나타내는 피크만이 관찰된 반면, 시간이 지남에 따라, 약 30분 경과 후부터는 타가토스를 나타내는 피크가 관찰되었다.
따라서, 상기 표 5 및 도 6의 결과를 종합하면, 실시예 2 및 3에서 제조된 상기 효소를 이용하여 과당을 타가토스로 에피머화 전환할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5
개량주 제작 및 선별
T.neapolitana 유래 유전자를 주형으로 하여 무작위 돌연변이를 수행하였다. 구체적으로, ClonTech사의 Diversify random mutagenesis kit을 이용하여 T.neapolitana에 대해 무작위 돌연변이를 유도하였고, 아래 표 6 및 7의 조건의 PCR 반응을 통하여 증폭된 유전자를 pET-28a 벡터에 삽입하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 이후 단계는 실시예 2와 동일하게 실시하였다.
표 6
반응용액 조성 첨가량 (㎕)
PCR Grade Water 36
10X TITANIUM Taq Buffer 5
MnSO4 (8 mM) 4
dGTP (2 mM) 1
50X Diversify dNTP Mix 1
Primer mix 1
Template DNA 1
TITANIUM Taq Polym. 1
표 7
단계 온도 (℃) 시간(초) 사이클
Initial Denaturation 94 30 1
Denaturation 94 30 25
Annealing/ Extension 68 60
Final Extension 68 60 1
상기 무작위 돌연변이를 통하여 확보한 변이주 라이브러리로부터 고 활성 보유 후보 변이주를 선별하고 염기서열 분석하여 변위부위를 확인하였다. 총 5개의 아미노산 변이를 확인하였다. (S125D/V163A/D186N/F263I/D311G)
상기 변이주는 서열목록 번호 3의 genomic DNA 염기서열을 가지며, 상기 변이주에 의해 생산되는 효소를 인코딩하는 아미노산 서열은 서열목록 번호 4와 같다. 상기 케토헥소오스 C4-에피머화 효소를 생산하는 상기 변이주는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)이다. 상기 변이주에 대해 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 실시하여 C4-에피머화 효소를 제조하였다.
실시예 6
개량주 이용 과당으로부터 타가토스로의 한계 전환율 평가
상기 개량주 유래 효소를 사용하여 아래에 기재된 것과 같은 방법으로 온도, pH, 금속염 등에 따른 전환율을 평가하였다.
(1) 반응온도별 효소활성 비교평가
반응온도 변화에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.3 mM ZnSO4, 50 mM 인산염 완충용액 (pH 7.0)에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 37℃에서 96℃까지의 각각 상이한 반응 온도에서 효소 활성을 측정하였다.
온도가 증가할수록 효소활성 증가하는 경향 보이나 90℃이상 반응 시 활성 저하를 보였다.
(2) 반응 pH별 효소활성 비교평가
반응 pH 변화에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.01 mM NiSO4, 인산염 완충용액 또는 Tris 완충용액에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 구체적으로 pH 5에서 pH 8.0의 범위에서는 potassium phosphate buffer을, pH 8.0에서 pH 8.5 범위에서 Tris buffer를 이용하였다. 도 8에 도시된 바와 같이 각각 상이한 pH에서 효소 활성을 측정하였다. 결과는 potassium phosphate buffer 사용 시와 Tris buffer 사용시 모두에서 pH가 올라갈수록 활성 증가하는 경향을 보였으며, 동일 pH에서 Tris buffer를 사용한 경우가 활성이 저하되었다.
(3) 금속염 종류에 따른 효소활성 비교평가
금속염 종류에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를, 10 중량% 과당, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 3시간 동안 반응을 수행하였다. 이 때, 상기 반응에는 각각 상이한 13종의 금속염이 1mM로 첨가되었다.
결과는 NiSO4>NiCl2>CoCl2>MnCl2=ZnSO4 순으로 효소 활성에 있어 차이가 있었다(도 9 참조).
(4) 효소반응에 의한 한계 전환율 평가
기질 농도에 따른 효소 활성의 변화를 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를, 10 중량% 과당, 0.3mM NiSO4, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 효소반응에서의 한계전환율을 평가하기 위하여 18시간 동안 효소반응을 수행하였다. 도 10을 참조하면 본 실험에 사용한 개량효소 사용 시 과당에서 타가토스로의 전환율이 30%임을 알 수 있다.
실시예 7
과당과 타가토스의 크로마토그래피 분리
상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 10 중량% 과당, 0.01 mM NiSO4, 50mM 인산염 완충용액에 넣어 60 ℃에서 3시간 동안 반응을 수행하였다. 상기 얻어진 타가토스의 혼합액을 분말 활성탄(powder activated carbon) 0.1 내지 0.5%(wt/v)를 첨가하고 0.5 내지 1 시간 동안 10 내지 100 rpm으로 교반한 다음, 이를 필터프레스로 여과하여 유색 물질을 제거하였다.
상기 유색 물질이 제거된 과당과 타가토스의 혼합물로부터 과당과 타가토스를 효율적으로 크로마토그래피 분리해내기 위하여, 수소기로 치환된 양이온교환수지와 수산화기로 치환된 음이온교환수지가 충진된 컬럼에 통과시켜 상기 용액 중의 이온 성분을 제거하는 공정을 수행하였다.
상기 탈색 및 탈염으로 유색 물질 및 이온 성분 등의 불순물이 제거된 과당으로부터 생산된 타가토스 혼합액을 60% (g/g 용액)까지 농축하여 칼슘기로 치환시킨 강산성양이온교환수지 (Amberlite CR1310 Ca)가 충진된 개선된 시뮬레이티드 무빙-베드 시스템(Advanced Simulated Moving-bed System; Organo, Japan) 장비를 활용하여 용액을 분획, 크로마토분리하여 성분의 순도(purity), 회수율(recovery yield) 및 과당으로부터 전환된 타가토스 혼합 공급액과 이동상인 물의 비율(탈착제/공급 부피율)을 측정하였다.
표 8
조건 결과
과당으로부터 전환된 타가토스 혼합 공급액 비율(%) 과당 75.4%, 타가토스 24.6%
탈착제/공급 부피율 2.96
타가토스 순도 (%) 99.1
타가토스 회수율 (%) 94.4
과당 순도 (%) 92.9
과당 회수율 (%) 99.6
실시예 8
타가토스의 결정화
상기 실시예 7의 크로마토그래피 분리로 회수된 용액을 사용하여 타가토스의 결정화를 하였다. 타가토스 당농도가 70 Bx로 되도록 진공, 가열 농축하여 온도를 60℃에서 30℃로 시간당 0.7 내지 1℃ 씩 서서히 냉각하여 결정화시켰다.
결정화 종료 후 원심탈수기를 이용하여 결정회수를 진행하였고, 60℃ 유동층건조기를 사용하여 1시간 동안 건조하여, 제품의 순도 및 결정회수율을 측정하였다.
표 9 결정화 결과 요약
조건 결과
타가토스 결정 순도 (%) 99.9
타가토스 결정 회수율 (%) 40.2
실시예 9
크로마토그래피 분리 기술을 이용한 개량주 이용 과당으로부터 타가토스의 연속 재순환 생산 공정 설계
상기 실시예 5에서 얻어진 정제된 효소를 사용한 타가토스의 연속 재순환 생산 공정을 아래와 같은 방법으로 설계하였다.
이와 같은 연속 재순환 생산 공정은 도 2, 3, 4, 5에 간략한 도식으로 설명하였다. 당해 도식에서 정제 단계에서는 탈색, 탈염 등과 같은 제품 품질 향상을 위한 단위 공정을 별도로 필요에 따라 추가하여 실시하거나 배제할 수 있다.
상기 연속 재순환 생산 공정은 우선 과당을 주성분으로 함유한 액을 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 반응기를 통과하여 타가토스를 생산하고, 과당과 타가토스의 혼합당으로 구성된 에피머화 산출물을 크로마토그래피 분리하고, 정제된 에피머화 반응물 중 타가토승의 농도에 따라 선택적으로 농축 단계를 삽입 혹은 배제하고, 타가토스를 주성분 (90% 이상) 으로 함유한 크로마토그래피 분리액을 농축하고 (필요시) 결정화하여 타가토스를 제조하는 것을 포함하며, 여기서 과당을 주성분으로 함유한 크로마토그래피 잔여액을 에피머화 반응기 앞으로 재순환시키고/재순환시키거나 타가토스의 결정화 단계에서 수득되는 비결정 모액을 에피머화 후단계로 재순환시킬 수 있다.
Figure PCTKR2014004970-appb-I000001
Figure PCTKR2014004970-appb-I000002
Figure PCTKR2014004970-appb-I000003

Claims (17)

  1. a) 과당을 헥수론산 C4-에피머화 효소 (hexuronate C4-epimerase)로 에피머화시켜 타가토스를 포함하는 에피머화 반응물을 수득하는 단계; 및
    b) 상기 에피머화 반응물을 정제하는 단계;
    c) 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 포함하는 타가토스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소가 Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermotoga thermarum 또는 이의 변이주 유래 효소인, 타가토스의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소가 Escherichia.coli, Corynebacterum glutamicum, Aspergillus oryzae, 또는 Bacillus subtilis 균주로부터 생성된, 타가토스의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 생산 균주가, E.coli BL21(DE3) pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P), E.coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P), 또는 E.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)인 타가토스의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 에피머화 반응이, 60 내지 90℃의 온도, pH 5 내지 8에서 과당과 헥수론산 C4-에피머화 효소를 반응시키는 것을 포함하는 타가토스의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 에피머화 반응이 금속염 존재하에 실시되는, 타가토스의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 금속염이 NiSO4, NiCl2, CoCl2, MnCl2, 및 ZnSO4 중 1종 이상인 타가토스의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 에피머화 반응물 중 타가토스가 0.05 중량% 이상으로 포함된타가토스의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 과당이 설탕의 가수분해에 의해 제조되거나, 포도당을 이성질화하여 제조된, 타가토스의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 정제 단계가, 크로마토그래피, 분별 결정, 및 이온 정제 중 하나 이상을 실시하는, 타가토스의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 정제 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 이 둘 다를 실시하는, 타가토스의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 결정화하기 전에 상기 정제된 에피머화 반응물을 농축시키는 것을 포함하는, 타가토스의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계 후, 미반응된 과당을 a) 단계에 재사용하거나, 상기 c) 단계 후 결정이 분리된 모액을 b) 단계에 재사용하거나, 또는 이 둘 다를 실시하는 것을 특징으로 하는, 타가토스의 제조방법.
  14. Escherichia.coli BL21(DE3)pET21a-TM(기탁번호: KCCM11542P) 균주.
  15. Escherichia.coli BL21(DE3) pET21a-TN(기탁번호: KCCM11543P) 균주.
  16. Escherichia.coli BL21(DE3) pET28a-TN(m)(기탁번호: KCCM11544P)균주.
  17. 서열목록 번호 4의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
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