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WO2014017491A1 - Ｃｅｐ５５遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子 - Google Patents

Ｃｅｐ５５遺伝子とｒｅｔ遺伝子との融合遺伝子 Download PDF

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WO2014017491A1
WO2014017491A1 PCT/JP2013/069929 JP2013069929W WO2014017491A1 WO 2014017491 A1 WO2014017491 A1 WO 2014017491A1 JP 2013069929 W JP2013069929 W JP 2013069929W WO 2014017491 A1 WO2014017491 A1 WO 2014017491A1
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WO
WIPO (PCT)
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ret
polynucleotide
cep55
protein
gene
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PCT/JP2013/069929
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English (en)
French (fr)
Inventor
龍弘 柴田
文恵 細田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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Publication date
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Priority to CN201380039589.XA priority patent/CN104619841A/zh
Priority to JP2014526941A priority patent/JPWO2014017491A1/ja
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a fusion gene between a CEP55 gene and a RET gene, and more specifically, a polynucleotide encoding a fusion polypeptide of a CEP55 protein or a part thereof and a RET protein or a part thereof, and the polynucleotide encodes
  • the present invention relates to a polypeptide and a method for detecting the polynucleotide or the polypeptide.
  • the present invention also relates to a method for determining the effectiveness of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor targeting the polynucleotide or the polypeptide.
  • the present invention relates to a cancer treatment method using this determination of effectiveness.
  • the present invention also relates to agents for use in these methods.
  • Gastric cancer is the second most common cancer in the world and one of the most common cancers in East Asia. Advances in early diagnosis technologies such as endoscopes have improved the prognosis, especially in Japan, but treatment of advanced cancer and recurrent cases remains difficult, and 5-year survival rates in many countries, including the West Is 30% or less.
  • Gastric cancer is largely classified into two types, that is, histopathologically, intestinal type (difference-type) (Lauren classification). The latter is more common among young people, is prone to peritoneal dissemination and lymph node metastasis, and has a poor prognosis.
  • Surgery is basically used as a treatment for gastric cancer, but it is easy to metastasize to peritoneal dissemination and other organs, and it is possible to treat diffuse gastric cancer with a high recurrence rate by surgery. Difficult to do.
  • no effective anticancer agent has been developed for gastric cancer including diffuse type, and no effective treatment has been established for gastric cancer, particularly diffuse type gastric cancer.
  • Non-patent Document 1 a PTC-RET fusion gene has been reported as a genomic abnormality characteristic of thyroid cancer (Non-Patent Document 2), and its presence has recently been confirmed in lung cancer (Non-Patent Document 3). Furthermore, the presence of the KIF5B-RET fusion gene has been clarified as a genomic abnormality in lung adenocarcinoma (Non-Patent Documents 3 to 5).
  • low molecular weight inhibitors for RET are known such as vandatinib, motesanib, sorafenib, unitinib, XL-184, and some of them are currently undergoing clinical development research as anticancer agents. Yes.
  • tyrosine kinase inhibitors targeting EGFR and ALK proteins have been shown to be particularly effective in the treatment of lung adenocarcinoma with EGFR mutation and ALK fusion.
  • a method for detecting fusion of the ALK tyrosine kinase gene present in 4 to 5% of lung cancers has been developed as a method for selecting an inhibitor application example for an ALK protein tyrosine kinase, and clinical trials are ongoing.
  • the CEP55 gene is a microtubule-binding molecule and has been found to play an important role in cell division (Non-patent Document 6).
  • this protein has a plurality of coiled coil regions including the N-terminal and can form a dimer.
  • the CEP55 protein is widely highly expressed in cancer cells, but on the other hand, it is low in normal tissues and highly expressed only in the testis.
  • the CEP55 protein is known as so-called cancer-testis antigen and has been studied as a target for cancer vaccine therapy (Non-patent Document 7).
  • fusion genes in cancers including gastric cancer are still not sufficient, contributing greatly to the development of new cancer treatment methods and cancer testing methods, and predicting the effectiveness of drug treatments At present, it is desired to identify a fusion gene or the like that can be used as an index for the determination.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to identify a gene that can be an index for predicting the effectiveness of treatment with a drug in gastric cancer or the like. Another object of the present invention is to provide a novel method for predicting the effectiveness of treatment with a drug by targeting the gene or its expression product. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for treating gastric cancer or the like based on prediction of the effectiveness of treatment with a drug targeting the gene or its expression product. A further object of the present invention is to provide an agent for use in the detection of the gene and its expression product in these methods.
  • the present inventors have conducted in-frame fusion transcripts of CEP55 gene and RET gene by transcriptome sequencing of 13 cases of diffuse gastric cancer.
  • the fusion gene of CEP55 gene and RET gene (CEP55-RET fusion gene) is caused by reciprocal translocation between human chromosomes 10 or by cleavage and recombination within human chromosome 10.
  • CEP55-RET fusion gene is caused by reciprocal translocation between human chromosomes 10 or by cleavage and recombination within human chromosome 10.
  • a fusion example caused by cleavage and recombination within human chromosome 10 was found.
  • RET protein kinases activation of such RET protein kinases, phosphorylation of AKT, etc., anchorage-independent colony forming ability, in-vivo tumorigenicity can be achieved by RET tyrosine kinase inhibitors or CEP55-RET fusion polypeptide kinases. It was also confirmed that it was significantly suppressed by domain inactivation.
  • the present inventors can predict the effectiveness of treatment with a drug targeting the gene fusion in diffuse gastric cancer and the like, and further, the treatment with the drug is effective in this prediction. It has been found that if the drug is administered to a patient determined to be present, the treatment can be efficiently performed, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a fusion polypeptide of CEP55 protein or a part thereof and RET protein or a part thereof, a polypeptide encoded by the polynucleotide, a method for detecting this polynucleotide or polypeptide, A method for determining the effectiveness of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor using the presence of the polynucleotide or the polypeptide as an indicator, a method for treating cancer using the determination of effectiveness, and a method for these methods More specifically, the following inventions are provided with respect to the drugs to be used.
  • a method for detecting the presence or absence of the polynucleotide according to [1] or the polypeptide according to [2] in a sample (A) contacting the sample with an agent for specifically detecting the presence or absence of the polynucleotide or the polypeptide in the sample; and (b) the presence or absence of the polynucleotide or the polypeptide. Detecting the presence, Including methods.
  • Polynucleotide (d) which is a pair of designed primers
  • a method for determining the efficacy of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor comprising the presence of the polynucleotide according to [1] or the polypeptide according to [2] in a sample isolated from a patient, A method comprising a step of detecting non-existence, wherein if the presence of the polynucleotide or the polypeptide is detected, it is determined that the cancer treatment with the RET inhibitor is highly effective in the patient.
  • a drug for determining the efficacy of cancer treatment with a RET inhibitor by the method according to [5], wherein the drug has a chain length of at least 15 bases (1) A probe that hybridizes to a polynucleotide that encodes a CEP55 protein and a probe that hybridizes to a polynucleotide that encodes a RET protein Polynucleotide (b) which is at least one probe selected from the group consisting of (b) Polynucleotide (c) which is a probe which hybridizes to the fusion point of a polynucleotide encoding CEP55 protein and a polynucleotide encoding RET protein (c) CEP55 A polynucleotide encoding the protein and Polynucleotide (d) CEP55 protein RET antibody protein to bind to polypeptide fused are a pair of primers designed so as to sandwich the fusion point of a polynucleotide encoding
  • a method for treating cancer wherein the RET tyrosine kinase inhibitor is administered to a patient who has been judged to be highly effective in treating cancer with a RET tyrosine kinase inhibitor by the method described in [5].
  • a method comprising the step of: [8] A therapeutic agent for cancer comprising a RET tyrosine kinase inhibitor as an active ingredient, wherein the patient is judged to have high cancer treatment effectiveness with a RET tyrosine kinase inhibitor by the method described in [5].
  • the therapeutic agent to be administered.
  • the present invention it becomes possible to efficiently detect a fusion gene of CEP55 gene and RET gene and its expression product. Further, according to the present invention, it is possible to predict the effectiveness of treatment for cancer by detecting the fusion gene and its expression product, in particular, the effectiveness of cancer treatment using a RET tyrosine kinase inhibitor. It becomes. As a result, it is possible to avoid administration of a drug to a cancer patient who is considered to be ineffective to administer the drug, so that efficient cancer treatment can be realized.
  • FIG. 10 It is the schematic which shows the aspect of fusion with a CEP55 gene and a RET gene.
  • the left side of the figure shows an example of fusion between the CEP55 gene and the RET gene caused by reciprocal translocation between human chromosomes 10, and the right side of the figure shows an example of fusion caused by cleavage and recombination within human chromosome 10.
  • a polynucleotide encoding a fusion polypeptide of the CEP55 protein and the RET protein is detected. It is the schematic which shows that it is possible. It is the schematic which shows the method of detecting the fusion gene of this invention by ISH method. That is, for the CEP55-RET fusion gene, the CEP55-RET fusion gene generated by reciprocal translocation between human chromosome 10 is designed by designing probes for ISH on the CEP55 gene 5 ′ side and 3 ′ side of the RET gene, respectively. It is the schematic which shows that presence of can be detected.
  • a black circle indicates a probe that hybridizes to the 5 'side of the CEP55 gene
  • a white circle indicates a probe that hybridizes to the 3' side of the RET gene (the probe notation is the same in FIG. 4).
  • ISH method shows the method of detecting the fusion gene of this invention by ISH method. That is, for the CEP55-RET fusion gene, the CEP55-RET fusion gene generated by cleavage and recombination in human chromosome 10 is designed by designing probes for ISH on the CEP55 gene 5 ′ side and 3 ′ side of the RET gene, respectively. It is the schematic which shows that the presence of a gene can be detected.
  • CEP55-RET indicates the result of a cell line expressing a wild-type CEP55-RET fusion polypeptide
  • CEP55-RET-KD expresses a mutant CEP55-RET fusion polypeptide
  • KIF5B-RET shows the results of the cell line expressing the wild type KIF5B-RET fusion polypeptide
  • KIF5B-RET-KD shows the mutant KIF5B-RET.
  • the results for cell lines expressing the fusion polypeptide are shown. Each bar indicates 100 ⁇ m.
  • a soft agar medium supplemented with a RET tyrosine kinase inhibitor (Vandetanib or XL184) was seeded with a mouse normal fibroblast cell line stably expressing a wild type RET fusion polypeptide, and anchorage-independent colonies of these cell lines It is a graph which shows the result of having analyzed formation ability.
  • “CEP55-RET” shows the result of a cell line expressing a wild type CEP55-RET fusion polypeptide
  • KIF5B-RET expresses a wild type KIF5B-RET fusion polypeptide.
  • the cell line results are shown.
  • VD indicates the result of colony formation in the presence of Vandetanib (concentration of Vandetanib in the medium: 0.2 ⁇ M)
  • XL indicates colony formation in the presence of XL184 (concentration of XL184 in the medium: 0.2 ⁇ M).
  • the results are shown, and “non-added” indicates the result of colony formation in the absence of the RET tyrosine kinase inhibitor.
  • the vertical axis represents the relative value when the number of colonies formed by a cell line expressing each wild type RET fusion polypeptide in the absence of a RET tyrosine kinase inhibitor is defined as 100.
  • Each mouse normal fibroblast cell line stably expressing the RET fusion polypeptide was serum-starved and then cultured in the presence of a RET tyrosine kinase inhibitor (Vandetanib or XL184). It is a photograph which shows the result of having analyzed phosphorylation by Western blotting.
  • “CEP55-RET” indicates the result of the cell line expressing the CEP55-RET fusion polypeptide
  • KIF5B-RET indicates the result of the cell line expressing the KIF5B-RET fusion polypeptide.
  • Lanes marked with “W” show the results of culturing a wild-type RET fusion polypeptide-expressing cell line in the absence of a RET tyrosine kinase inhibitor, and lanes marked with “V” are in the presence of Vandetanib. The results of culturing a wild-type RET fusion polypeptide-expressing cell line in Vandetanib in the medium (concentration: 1 ⁇ M) are shown. Lanes marked with “X” indicate the presence of XL184 (concentration of XL184 in the medium: 1 ⁇ M).
  • AKT and p-AKT show the results of detecting AKT and phosphorylated AKT, respectively.
  • MAPK and “p-MAPK (T202 / Y204)” show the results of detecting MAPK and phosphorylated MAPK, respectively.
  • ⁇ -actin indicates that the protein amount in each lane is aligned as an internal standard. It is a photograph which shows the result of having transplanted the mouse
  • CEP55-RET is a photograph of a cell line expressing a wild type CEP55-RET fusion polypeptide transplanted subcutaneously into an immunodeficient mouse and observed 18 days later.
  • KIF5B-RET is a photograph in which a cell line expressing a wild-type KIF5B-RET fusion polypeptide was transplanted subcutaneously into an immunodeficient mouse, and the mouse was observed 18 days later.
  • Triangles indicate formed tumors, and “8/8” indicates that the cells were transplanted into 4 mice at 2 sites, 8 sites in total, and tumor formation was observed in all 8 sites.
  • CEP55-RET-KD is a photograph of a cell line expressing a mutant CEP55-RET fusion polypeptide transplanted subcutaneously into an immunodeficient mouse and observed 18 days later. “0/6” indicates that the cells were transplanted into 3 mice at 2 sites, 6 sites in total, and no tumor formation was observed in all 6 sites.
  • the present invention relates to a polynucleotide (hereinafter, referred to as “CEP55-RET fusion polypeptide”) that encodes a CEP55 protein or a part thereof and a fusion polypeptide of the RET protein or a part thereof (hereinafter also referred to as “CEP55-RET fusion polypeptide”).
  • CEP55-RET fusion polypeptide a polynucleotide that encodes a CEP55 protein or a part thereof and a fusion polypeptide of the RET protein or a part thereof.
  • CEP55-RET fusion polypeptide of the present invention means a polypeptide in which the full length of the CEP55 protein or a part thereof and the full length of the RET protein or a part thereof are fused.
  • the “CEP55-RET fusion polynucleotide” of the present invention is a fusion of a polynucleotide encoding the full length of CEP55 protein or a part thereof and a polynucleotide encoding the full length of RET protein or a part thereof. Means polynucleotide.
  • the “CEP55 protein (centrosome protein 55KDa)” is a protein encoded by a gene seated on the long arm of chromosome 10 (10q23.3) in humans.
  • the “CEP55 protein” typically includes a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 as long as it is derived from human.
  • the polynucleotide encoding the protein is typically a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the “RET (rearranged during transfection, rearranged transfusion) protein” is also referred to as a RET tyrosine kinase protein or a RET receptor tyrosine kinase protein, and is a gene that sits on 10q11.2 in humans. It is the encoded protein.
  • the “RET protein” is typically a protein derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (RET51, RET isoform a) and SEQ ID NO: 6 as long as it is derived from human. And a protein having the amino acid sequence (RET9, RET isoform c).
  • the polynucleotide encoding the protein typically consists of a polynucleotide (RET transcript variant 2) having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • Polynucleotide (RET transcript variant 4) As shown in FIG. 2, the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (RET51) and the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (RET9) are from the methionine residue at position 1 to 1063 The amino acid sequence is identical up to the glycine residue, but the sequence and length of the C-terminal part are different.
  • the CEP55-RET fusion polynucleotide is typically a polynucleotide encoding a polypeptide in which the N-terminal part of the CEP55 protein and the C-terminal part of the RET protein are fused.
  • the “N-terminal portion of CEP55 protein” typically includes a region consisting of a methionine residue at position 1 to a glutamine residue at position 153 of the CEP55 protein.
  • the “C-terminal portion of the RET protein” typically includes the tyrosine kinase domain of the RET protein (see FIG. 2).
  • polynucleotide encoding a polypeptide in which the N-terminal portion of the CEP55 protein and the C-terminal portion of the RET protein are fused is typically as shown in FIGS. It is caused by reciprocal translocation between chromosomes 10 or by cleavage and recombination within chromosome 10. More specifically, a polypeptide region encoded by exons 1 to 3 of the CEP55 protein and a polypeptide region encoded by exons 12 to 19b or exons 12 to 20 of the RET protein are fused. Which encodes a polypeptide (for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or 10). Such a polynucleotide is, for example, a polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 9.
  • amino acid sequences of the “CEP55 protein” and “RET protein” according to the present invention and the base sequence of the gene encoding these proteins can be mutated in nature (ie, non-artificially). Accordingly, the amino acid sequence of “CEP55-RET fusion polypeptide” and the base sequence of “CEP55-RET fusion polynucleotide” can also be mutated in nature (ie, non-artificially). In addition, these amino acid sequences and base sequences can be artificially modified. Such variants are also included in the present invention.
  • variant of the CEP55-RET fusion polypeptide is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or 10.
  • examples include proteins.
  • the term “plurality” usually refers to within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, more preferably within 10 amino acids, and particularly preferably within several amino acids (for example, within 5 amino acids, within 3 amino acids, within 2 amino acids, Amino acid).
  • mutant of the CEP55-RET fusion polypeptide a polypeptide encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 9 can be mentioned.
  • the high stringency hybridization conditions include, for example, 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • the low stringency hybridization conditions include, for example, 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • Still another embodiment of the variant of CEP55-RET fusion polypeptide is an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 and 80% or more (eg, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% or more). Examples thereof include polypeptides consisting of amino acid sequences having homology.
  • sequence homology can be determined using a BLASTX or BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990).
  • the program is based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) by Karlin and Altschul. Yes.
  • the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
  • Examples of the mutant of CEP55-RET fusion polynucleotide include a polynucleotide encoding a mutant of the above CEP55-RET fusion polypeptide and a polynucleotide encoding a degenerate mutant without amino acid mutation.
  • CEP55-RET fusion polynucleotide includes mRNA, cDNA, genomic DNA and the like.
  • a “CEP55-RET fusion polynucleotide” is known to those skilled in the art from a cDNA library or a genomic DNA library prepared from a diffuse gastric cancer or the like holding a fusion gene of the CEP55 gene and the RET gene. It can be isolated using hybridization techniques. Moreover, it can also amplify and prepare by utilizing well-known gene amplification technique (PCR) using mRNA, cDNA, or genomic DNA prepared from the said diffuse gastric cancer etc. as a template.
  • PCR gene amplification technique
  • a CEP55-RET fusion polypeptide can be prepared by introducing the vector into an appropriate cell (eg, E. coli, yeast, insect cell, animal cell) and culturing the resulting transformant.
  • an appropriate cell eg, E. coli, yeast, insect cell, animal cell
  • CEP55-RET fusion polypeptide and “CEP55-RET fusion polynucleotide” of the present invention have a natural type sequence (including those in which a mutation has occurred in nature) in a broad sense. And artificially modified sequences.
  • a natural type sequence including those in which a mutation has occurred in nature
  • CEP55-RET fusion polypeptide and “CEP55-RET fusion polynucleotide” as detection targets described later, mainly those having a natural type sequence (mutation occurs in nature). Note that this also means
  • the present invention also provides a method for detecting the presence or absence of a CEP55-RET fusion polynucleotide or CEP55-RET fusion polypeptide in a sample.
  • the detection method of the present invention comprises (a) a step of bringing a sample into contact with an agent for specifically detecting the presence or absence of the polynucleotide or the polypeptide in a sample, and (b) the polynucleotide or Detecting the presence or absence of the polypeptide.
  • sample refers not only to biological samples (eg, cells, tissues, organs, body fluids (blood, lymph, etc.), digestive fluid, sputum, alveolar / bronchial lavage fluid, urine, stool), but also these living organisms. Also included are nucleic acid extracts (genomic DNA extracts, mRNA extracts, cDNA preparations prepared from mRNA extracts, cRNA preparations, etc.) and protein extracts obtained from samples.
  • the sample may be subjected to formalin fixing treatment, alcohol fixing treatment, freezing treatment, or paraffin embedding treatment.
  • genomic DNA, mRNA, cDNA or protein can be prepared by those skilled in the art by selecting a known method suitable for the sample in consideration of the type and state of the sample.
  • CEP55-RET fusion polynucleotide or CEP55-RET fusion polypeptide refers to genomic DNA encoding the fusion polypeptide, transcript from the genomic DNA, transcript from the transcript. Can be performed on translation products.
  • the genomic DNA encoding the CEP55-RET fusion polypeptide is formed by reciprocal translocation between human chromosomes 10 or by cleavage and recombination within chromosome 10.
  • this phenomenon of reciprocal translocation may be detected (see FIGS. 1 and 3).
  • the detection of such reciprocal translocation for example, the coding region of exon 3 of the CEP55 gene and the upstream region 5 ′ side of the coding region, the coding region of exon 4 of the CEP55 gene, and the 3 ′ side of the coding region.
  • the coding region of exon 11 of the RET gene and the upstream region 5 ′ from the coding region the coding region of exon 12 of the RET gene, and the coding region.
  • separation from the downstream region on the 3 ′ side may be detected.
  • a known technique can be used.
  • targeting “genomic DNA encoding the fusion polypeptide” for example, in situ hybridization (ISH) using fluorescence or the like, genomic PCR method, direct sequencing, Southern blotting, genomic microarray analysis is used. be able to.
  • ISH in situ hybridization
  • genomic PCR method direct sequencing
  • Southern blotting genomic microarray analysis
  • RT-PCR direct sequencing
  • Northern blotting dot blotting
  • cDNA microarray analysis can be used.
  • genomic DNA encoding a CEP55-RET fusion polypeptide is obtained by contacting the biological sample with a polynucleotide according to (a) or (b) below having a chain length of at least 15 bases: Can be detected.
  • A a polynucleotide that is at least one probe selected from the group consisting of a probe that hybridizes to a polynucleotide that encodes a CEP55 protein and a probe that hybridizes to a polynucleotide that encodes a RET protein
  • b encodes a CEP55 protein
  • the polynucleotide encoding the CEP55-RET protein according to the present invention is typically identified by RefSeq ID: NC — 000010.10.
  • the gene consisting of the 95256369 to 95288849th DNA sequence (CEP55 gene).
  • the polynucleotide encoding the RET protein according to the present invention is derived from a human, it is typically derived from the 4357517-43625799th DNA sequence in the genome sequence specified by RefSeq ID: NC — 01000.10. Gene (RET gene).
  • DNA sequence of a gene can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to its mutation or the like. Therefore, such natural mutants can also be the subject of the present invention (hereinafter the same).
  • the polynucleotide according to (a) of the present invention hybridizes to the polynucleotide encoding the CEP55 protein or the polynucleotide encoding the RET protein, which is the target base sequence of the polynucleotide, so that CEP55 in the biological sample is obtained.
  • Any polynucleotide can be used as long as it can detect the presence of genomic DNA encoding a -RET fusion polypeptide, and is preferably a polynucleotide described in (a1) to (a3) below.
  • A1 a polynucleotide that hybridizes to the coding region of exon 3 of the CEP55 gene and an upstream region 5 ′ to the coding region (hereinafter also referred to as “5′CEP55 probe”), and the coding of exon 12 of the RET gene
  • a combination of a 5 ′ CEP55 probe and exon 4 of the CEP55 gene (a2) a combination of a region and a polynucleotide that hybridizes to a downstream region 3 ′ from the coding region (hereinafter also referred to as “3′RET probe”)
  • a combination with a region and a polynucleotide that hybridizes to a downstream region 3 'from the coding region (hereinafter also referred to as "3'CEP55 probe”)
  • (a3) From the coding region of exon 11 of the RET gene and the coding region Polynucleotide that hybridizes to the upstream region on the 5 'side (hereinafter referred
  • the region (target base sequence) to which the polynucleotide described in (a1) used for in situ hybridization hybridizes is CEP55 protein from the viewpoint of specificity to the target base sequence and sensitivity of detection.
  • the polynucleotide described in (b) used for in situ hybridization includes a polynucleotide encoding the CEP55 protein and a polynucleotide encoding the RET protein, which are target nucleotide sequences of the polynucleotide.
  • a typical example is described in SEQ ID NO: 7 or 9.
  • Hybridizing to a fusion point of a polynucleotide that hybridizes to a genomic DNA encoding a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of, for example, a polynucleotide encoding a CEP55 protein and a polynucleotide encoding a RET protein That is a polynucleotide.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is the entire target base sequence from the viewpoint of further improving the specificity to the target base sequence and the sensitivity of detection. It is preferable that the group consists of a plurality of types of polynucleotides capable of covering the above. In such a case, the length of the polynucleotide constituting the population is at least 15 bases, preferably 100 to 1000 bases.
  • the polynucleotide described in (a) or (b) used for in situ hybridization is preferably labeled with a fluorescent dye or the like for detection.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, DEAC, FITC, R6G, TexRed, and Cy5.
  • the polynucleotide may be labeled with a dye such as DAB or silver based on enzymatic metal deposition.
  • the probe for the polynucleotide encoding the CEP55 protein and the probe for the polynucleotide encoding the RET protein are preferably labeled with different dyes.
  • in situ hybridization is performed using a combination of the above probes (a1) labeled with different dyes and signal overlap generated by the labeling of each probe is observed, genomic DNA encoding the CEP55-RET fusion polypeptide Can be determined (see FIGS. 3 and 4).
  • CEP55- it can be determined that the genomic DNA encoding the RET fusion polypeptide could be detected.
  • labeling of the polynucleotide can be performed by a known technique.
  • the polynucleotide can be labeled by incorporating a substrate base labeled with a fluorescent dye or the like into the polynucleotide by a nick translation method or a random prime method.
  • the conditions for bringing the polynucleotide described in (a) or (b) into contact with the biological sample may vary depending on various factors such as the length of the polynucleotide.
  • An example of the gentious condition is a condition of 0.2 ⁇ SSC and 65 ° C.
  • an example of the low stringency condition is a condition of 2.0 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • a person skilled in the art appropriately selects various conditions such as the concentration of surfactant (NP-40, etc.), the concentration of formamide, pH, etc. in addition to the salt concentration (SSC dilution ratio, etc.) and temperature.
  • stringent conditions similar to the above conditions can be realized.
  • Examples of a method for detecting genomic DNA encoding a CEP55-RET fusion polypeptide using the polynucleotide described in (a) or (b) include Southern blotting, Northern blotting, and dot in addition to the in situ hybridization. Blotting can be mentioned.
  • the fusion gene is detected by hybridizing the polynucleotide described in (a) or (b) to a membrane to which a nucleic acid extract obtained from the biological sample is transferred.
  • the same band in which the polynucleotide hybridizing to the polynucleotide encoding CEP55 protein and the polynucleotide hybridizing to the polynucleotide encoding RET protein are developed on the membrane. Can be determined that the genomic DNA encoding the CEP55-RET fusion polypeptide could be detected.
  • Examples of the method for detecting genomic DNA encoding the CEP55-RET fusion polypeptide using the polynucleotide (b) include genomic microarray analysis and DNA microarray analysis. In these methods, an array in which the polynucleotide (b) is immobilized on a substrate is prepared, and the genomic DNA is detected by bringing the biological sample into contact with the polynucleotide on the array.
  • PCR and sequencing in order to specifically amplify a part or all of the CEP55-RET fusion polynucleotide using DNA (genomic DNA, cDNA) or RNA prepared from the biological sample as a template, the following (c) Polynucleotides can be used.
  • C A polynucleotide that is a pair of primers designed to sandwich a fusion point between a polynucleotide encoding CEP55 protein and a polynucleotide encoding RET protein.
  • the “polynucleotide as a pair of primers” is a primer set in which one primer hybridizes to the CEP55 gene region and the other primer hybridizes to the RET gene region in the target fusion polynucleotide or the like.
  • the length of these polynucleotides is usually 15 to 100 bases, preferably 17 to 30 bases.
  • the polynucleotide described in (c) of the present invention is within 5000 bases from the fusion point of the polynucleotide encoding the CEP55 protein and the polynucleotide encoding the RET protein from the viewpoint of the accuracy and sensitivity of detection by PCR. It is preferable that the sequence is complementary to the base sequence of the fusion polynucleotide.
  • the “polynucleotide as a pair of primers” can be appropriately designed by a known method based on the base sequence of the target CEP55-RET fusion polynucleotide or the like.
  • a known method for example, a method using Primer Express software (registered trademark, manufactured by ABI) can be mentioned.
  • a preferable example of “a polynucleotide that is a pair of primers” is preferably the polynucleotide described in (c1) below.
  • C1 the coding region of exon 3 of the CEP55 gene and a polynucleotide hybridizing to the upstream region 5 ′ from the coding region
  • 5′CEP55 primer the coding of exon 12 of the RET gene
  • 3′RET primer a polynucleotide that hybridizes to the nucleotide sequence of the region and the downstream region 3 ′ from the coding region
  • a primer is designed for exon 2 containing the start codon of the CEP55 gene and exon 14 in the kinase region of the RET gene, whereby the tyrosine kinase region of the RET protein is changed.
  • a fusion gene of all the variants including the CEP55 gene can be detected (see FIG. 2).
  • examples of the method for detecting the translation product of the CEP55-RET fusion polynucleotide include immunostaining, Western blotting, ELISA, flow cytometry, immunoprecipitation, and antibody array analysis.
  • an antibody that binds to the CEP55-RET fusion polypeptide is used.
  • examples of such an antibody include an antibody specific for a polypeptide containing a fusion point of CEP55 protein and RET protein (hereinafter, also referred to as “fusion point-specific antibody”), and an N-terminal side of the fusion point of CEP55 protein.
  • CEP55-N-terminal antibody An antibody that binds to a polypeptide comprising a region
  • RET protein an antibody that binds to a polypeptide comprising a region located on the C-terminal side from the fusion point of the RET protein
  • RET protein also referred to as “C-terminal antibody”.
  • the “fusion-point-specific antibody” specifically binds to the polypeptide containing the fusion point, and includes any of wild-type (normal) CEP55 protein and wild-type (normal) RET protein. Also means an antibody that does not bind.
  • the CEP55-RET fusion polypeptide can be detected by the fusion point-specific antibody or by a combination of the CEP55-N end antibody and the RET protein-C end antibody.
  • “An antibody that binds to a CEP55-RET fusion polypeptide” can be prepared by a person skilled in the art by appropriately selecting a known method. Such known methods include inoculating an immunized animal with a polypeptide comprising the C-terminal part of the RET protein, a CEP55-RET fusion polypeptide, a polypeptide comprising the N-terminal part of the CEP55 protein, and the like. And a method for recovering the animal serum (polyclonal antibody) and a method for producing a monoclonal antibody such as a hybridoma method, a recombinant DNA method, and a phage display method.
  • the target protein can be directly detected by detecting the label.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can bind to an antibody and can be detected, and examples thereof include peroxidase, ⁇ -D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isoform. Examples include thiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin and radioactive substances.
  • a method for indirectly detecting a target protein using a secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can also be used.
  • RET tyrosine kinase inhibitor ⁇ Method for determining efficacy of cancer treatment with RET tyrosine kinase inhibitor>
  • the fusion of the CEP55 gene and the RET gene is considered to bring about the activation of the RET protein and contribute to the malignant transformation of cancer. Therefore, cancer patients in which such fusion is detected have a high probability that treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor is effective.
  • the present invention is a method for determining the effectiveness of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor, comprising the presence or absence of a CEP55-RET fusion polynucleotide or CEP55-RET fusion polypeptide in a sample isolated from a patient.
  • the “patient” may be not only a human suffering from cancer but also a human suspected of suffering from cancer.
  • the “cancer” to which the method of the present invention is applied is not particularly limited as long as the CEP55-RET fusion gene is expressed.
  • a diffuse stomach cancer is preferable. Collection of a biological sample from a patient can be performed by a known method according to the type of the biological sample.
  • the “RET tyrosine kinase inhibitor” to be evaluated for the effectiveness of cancer treatment is not particularly limited as long as it is a substance that can directly or indirectly suppress the function of RET protein.
  • Known RET tyrosine kinase inhibitors applicable to the present invention include 4- (4-bromo-2-fluoroanilino) -6-methoxy-7- (1-methylpiperidin-4-ylmethoxy) quinazoline (generic name) : Vandetanib; compounds targeting VEGFR, EGFR and RET), 4- [4- [3- [4-chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl] ureido] phenoxy] -N-methylpyridine- 2-Carboamide (generic name: sorafenib; a compound targeting BRAF and RET), N- [2- (diethylamino) ethyl] -5-[(Z)-(5-fluoro-2-ox
  • sample The definition of “sample”, the method for extracting DNA, RNA, etc. from the sample, the method for detecting the presence or absence of CEP55-RET fusion polynucleotide and CEP55-RET fusion polypeptide, etc. are as described above.
  • CEP55-RET fusion polynucleotide or CEP55-RET fusion polypeptide When the presence of CEP55-RET fusion polynucleotide or CEP55-RET fusion polypeptide is detected in a sample isolated from a patient according to the method of the present invention, the patient is effective in treating cancer with a RET tyrosine kinase inhibitor. On the other hand, if the presence of the polynucleotide or the polypeptide is not detected, the patient is determined to be less effective for cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor.
  • a polynucleotide having a chain length of at least 15 bases and any of the following (a) to (c) should be suitably used for detecting the presence or absence of a CEP55-RET fusion polynucleotide: Can do. Therefore, it can also be suitably used to determine the effectiveness of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor.
  • polynucleotides have a base sequence complementary to a specific base sequence of the target gene.
  • “complementary” does not need to be completely complementary as long as it hybridizes.
  • These polynucleotides usually have a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 100% with respect to the specific base sequence.
  • the polynucleotides (a) to (c) may be DNA or RNA, and in part or in whole, PNA (polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid), LNA (registered trademark, locked) Nucleic acid, Bridged Nucleic Acid, cross-linked nucleic acid), ENA (registered trademark, 2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acid), GNA (Glycerol nucleic acid, glycerol nucleic acid), TNAThre, Nucleotides may be substituted with artificial nucleic acids such as (threose nucleic acid).
  • PNA polyamide nucleic acid, peptide nucleic acid
  • LNA registered trademark, locked Nucleic acid, Bridged Nucleic Acid, cross-linked nucleic acid
  • ENA registered trademark, 2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acid
  • GNA Glycerol nucleic acid, glycerol
  • an antibody that binds to a CEP55-RET fusion polypeptide can be suitably used for detection of a translation product of a CEP55-RET fusion polynucleotide (CEP55-RET fusion polypeptide).
  • the drug of the present invention can contain other pharmacologically acceptable components in addition to the substances (polynucleotides and antibodies) as active ingredients.
  • examples of such other components include a buffer, an emulsifier, a suspending agent, a stabilizer, a preservative, and physiological saline. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • As the suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • propylene glycol diethylin sulfite, ascorbic acid or the like
  • sodium azide sodium azide
  • benzalkonium chloride sodium azide
  • paraoxybenzoic acid sodium azide
  • chlorobutanol sodium azide
  • kits for use in the method of the present invention can also be prepared by combining samples such as a buffer used for dilution and washing.
  • the kit can include instructions for using the kit.
  • the present invention also provides a kit for use in the method of the present invention.
  • the present invention provides a method for treating cancer, wherein the RET tyrosine kinase inhibitor is administered to a patient who has been judged to be highly effective in treating cancer with a RET tyrosine kinase inhibitor by the method of the present invention.
  • a method comprising the step of administering is provided.
  • the present invention is a cancer therapeutic agent comprising a RET tyrosine kinase inhibitor as an active ingredient, and a patient who has been determined to have high cancer treatment effectiveness with a RET tyrosine kinase inhibitor by the method of the present invention.
  • a therapeutic agent to be administered is provided.
  • RET tyrosine kinase inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that can directly or indirectly suppress the function of the RET protein as described above.
  • Examples of known RET tyrosine kinase inhibitors that can be applied to the present invention are as described above.
  • the method of administering the RET tyrosine kinase inhibitor to the patient is appropriately selected according to the type of the inhibitor, the type of cancer, and the like.
  • oral, intravenous, intraperitoneal, transdermal, intramuscular, Administration forms such as intraductal (aerosol), rectal, and intravaginal can be employed.
  • RNA extraction> The tumor tissue that had been cryopreserved in liquid nitrogen was pulverized with a cryoprep (product name: CP02, manufactured by Kovalis). Next, total RNA was extracted from the crushed tumor tissue using a total RNA purification kit (product name: RNAeasy, manufactured by Qiagen).
  • RNA sequence> Using 2 ⁇ g of the total RNA prepared above, a library was synthesized using an mRNA seq sample preparation kit (manufactured by Illumina). That is, first, 2 ⁇ g of total RNA was treated at 94 ° C. for 5 minutes for fragmentation, and then cDNA synthesis was performed. Next, adapters for sequencing were bound to both ends of the obtained cDNA, then migrated to an agarose gel and purified. Then, PCR was performed using the purified cDNA as a template to prepare a library having a length of 300 bases. The prepared cDNA library was sequence-decoded using a high-speed sequencer (GA2X, manufactured by Illumina) at both ends of 50 bp.
  • GA2X high-speed sequencer
  • CDNA was newly synthesized from the same total RNA used for RNA sequencing using reverse transcriptase (Superscript III first (1st) -strand synthesis system, manufactured by Invitrogen).
  • PCR primers were synthesized based on the obtained sequence, PCR was performed using ExTaq HS (manufactured by Takara), and then the PCR product was confirmed by electrophoresis.
  • the PCR product was extracted from the agarose gel and subjected to sequencing analysis by the Sanger method using the same primer, Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and ABI 3730 sequencer. And from the obtained result, the fusion point and reading frame of the fusion gene were confirmed.
  • the conditions for the transcription reaction and the PCR reaction are as follows.
  • ⁇ Reverse transcription reaction> 1 ⁇ L of random hexamers primer (50 ng / ⁇ L) and 1 ⁇ L of 10 mM dNTP mix were mixed with 5 ⁇ g (8 ⁇ L) of the total RNA, reacted at 65 ° C. for 5 minutes, and rapidly cooled on ice.
  • 2 ⁇ L of 10 ⁇ RT buffer, 4 ⁇ L of 25 mM MgCl 2, 2 ⁇ L of 0.1 M DTT, 1 ⁇ L of RNaseOUT (40 U / ⁇ L), and 1 ⁇ L of Superscript IIIRT (200 U / ⁇ L) were added in order. Then, the reverse transcription reaction was performed under the conditions of 25 ° C. for 10 minutes, 50 ° C.
  • Example 1 [Identification of novel kinase fusion genes by RNA sequencing] From the 13 cases of diffuse gastric cancer clinical specimens, a pair of base sequences of 8.0 ⁇ 10 7 or more were obtained after excluding duplicate clones by PCR. As a result of referring to them in an existing gene database, as shown in FIG. 2, candidate gene for fusion of CEP55 gene and RET gene (polynucleotide encoding polypeptide in which CEP55 protein and RET9 protein are fused, CEP55 protein and A polynucleotide encoding a polypeptide fused with the RET51 protein (hereinafter also referred to as “CEP55-RET fusion gene”) was detected in one example.
  • CEP55-RET fusion gene polynucleotide encoding polypeptide in which CEP55 protein and RET9 protein are fused, CEP55 protein and A polynucleotide encoding a polypeptide fused with the RET51 protein
  • exon 3 of CEP55 SEQ ID NOs: 1, 7 Or a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in positions 488 to 763 of 9
  • exon 12 of the RET gene a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in positions 2327 to 2474 of SEQ ID NO: 3 or 5
  • Example 2 [Analysis of the function of CEP55-RET fusion polypeptide and the effectiveness of a RET tyrosine kinase inhibitor against cancer cells expressing the polypeptide]
  • the gene fusion described above is considered to bring about the activation of the RET protein, and further, the downstream signal is also activated by the activation, and the cell is considered to be cancerous. Therefore, RET tyrosine kinase inhibitors are considered to be effective in treatment for patients with such activation. Therefore, in order to confirm these points, the CEP55-RET fusion gene was analyzed according to a conventional method as appropriate as shown below.
  • a FLAG epitope tag is placed on the 5 ′ side of cDNA of a CEP55-RET fusion gene (polynucleotide encoding a polypeptide in which CEP55 protein and RET51 protein are fused) obtained from a cancer tissue derived from an undifferentiated gastric cancer patient.
  • the cDNA coding for was ligated together in the translation reading frame and cloned into the pMXs retroviral vector.
  • a vector encoding a kinase activity mutant (KD mutant CEP55-RET fusion polypeptide: K758M) in which a site-specific mutation was introduced into this vector and one amino acid in the RET kinase site was substituted was also produced.
  • the retrovirus vector thus prepared is infected with a mouse normal fibroblast cell line NIH-3T3 cells, and the wild-type or mutant CEP55-RET fusion polypeptide is stably expressed. A cell line was obtained.
  • RET fusion gene KIF5B gene and RET gene fusion gene, hereinafter also referred to as “KIF5B-RET fusion gene”
  • a retroviral vector encoding the gene is used as described above. Produced. Furthermore, a retroviral vector encoding a mutant mutant of kinase activity in which lysine in the RET kinase site was substituted with methionine as described above was also prepared. Furthermore, NIH-3T3 cells were each infected with these retroviral vectors to prepare cell lines that stably express wild-type or mutant KIF5B-RET fusion polypeptides. And this cell line was used for the experiment shown below as a control group.
  • KIF5B-RET fusion gene Kohno T.W. Et al., Nature Medicine, published online on February 12, 2012, Vol. 18, No. 3, pages 375-377.
  • KIF5B-RET fusion gene used as a control in this example is “KIF5B-RET fusion variant 1” described in this document.
  • CEP55-RET fusion gene and KIF5B-RET fusion gene are also collectively referred to as “RET fusion gene (or RET fusion polypeptide)”.
  • the cell line stably expressing wild type or mutant type RET fusion polypeptide is seeded in a soft agar medium (concentration of agar in the medium: 4 mg / mL, the same applies hereinafter), and these cell lines do not depend on anchorage.
  • the transformation ability of the RET fusion polypeptide was examined by evaluating the colony forming ability. The obtained results are shown in FIG.
  • each of the cell lines stably expressing the wild type RET fusion polypeptide is seeded in a soft agar medium supplemented with a low molecular weight RET tyrosine kinase inhibitor (Vandetanib or XL184), and the anchorage of these cell lines is independent
  • RET tyrosine kinase inhibitors on transformation with RET fusion polypeptides was examined by evaluating sex colony forming ability. The obtained result is shown in FIG.
  • each of the cell lines that stably express the wild type or mutant type RET fusion polypeptide is cultured in a liquid medium, subjected to serum starvation treatment, and then added with a RET tyrosine kinase inhibitor (Vandetanib or XL184).
  • the liquid medium was replaced with a new one and cultured.
  • by extracting proteins from each cell line thus obtained and performing Western blot analysis using antibodies against various phosphorylated proteins or non-phosphorylated proteins signals downstream of the polypeptide to RET fusion are obtained. Analysis was performed. The obtained results are shown in FIG.
  • the cell line stably expressing wild-type or mutant CEP55-RET fusion polypeptide or the cell line stably expressing wild-type KIF5B-RET fusion polypeptide is treated with an immunodeficient mouse (BALB / c -Nu / nu) were implanted subcutaneously at 1 ⁇ 10 6 cells per site, and the in vivo tumorigenicity of cells expressing these RET fusion polypeptides was examined. The obtained result is shown in FIG.
  • NIH-3T3 cells showed anchorage-independent colony formation due to the expression of the CEP55-RET fusion polypeptide.
  • anchoring-independent colony forming ability by CEP55-RET fusion polypeptide was remarkably suppressed by inactivating the kinase activity of RET protein.
  • AKT phosphorylation was strongly caused by the CEP55-RET fusion polypeptide (see the lane labeled “W” in “p-AKT (S473)” in FIG. 7). Furthermore, it was also clarified that phosphorylation of STAT3 and MAPK is also enhanced by the fusion peptide (“W” in “p-STAT3 (Y705)” and “p-MAPK (T202 / Y204705)” in FIG. 7). (See the attached lane).
  • NIH-3T3 cells expressing wild-type CEP55-RET fusion polypeptide were transplanted subcutaneously into immunodeficient mice, and tumor formation was observed within 14 days after the transplantation. .
  • tumor formation is completely confirmed by observation up to 30 days after the transplantation. could not.
  • the CEP55-RET fusion gene has a transformation ability and functions as an oncogene, and that the transformation requires activation of RET kinase activity.
  • the ability of the CEP55-RET fusion polypeptide to transform is that the RET tyrosine kinase inhibitor inhibits the activation of RET tyrosine kinase and the downstream signal, such as AKT, in the fusion polypeptide. It became clear that it was suppressed.
  • the present invention it is possible to detect a polynucleotide encoding a fusion polypeptide of a CEP55 protein or a part thereof and a RET protein or a part thereof, or an expression product thereof.
  • This detection makes it possible to predict the effectiveness of cancer treatment with a RET tyrosine kinase inhibitor.
  • This fusion leads to activation of the RET protein, which in turn leads to cancerous cells.
  • RET activation and canceration can be significantly suppressed by RET tyrosine kinase inhibitors. Therefore, since the fusion of the CEP55 gene and the RET gene can be a target of a RET tyrosine kinase inhibitor, the present invention is extremely useful in increasing the efficiency of cancer treatment.

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Description

ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子
　本発明は、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子に関し、より詳しくは、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、及び、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを検出する方法に関する。また、本発明は、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを標的としたＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法に関する。さらに、本発明は、この有効性の判定を利用したがんの治療方法に関する。また、本発明は、これらの方法に用いるための薬剤にも関する。
　胃がんは世界で２番目に死亡者数の多いがんであり、東アジアにおいて患者の多いがんの一つである。内視鏡を始めとする早期診断技術の進歩により、とりわけ日本においてその予後は改善しているが、進行がんや再発症例の治療は依然として難しく、欧米を含む多くの国において、５年生存率は３０％以下である。
　胃がんは、病理組織学的に大きく腸型（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ－ｔｙｐｅ）とびまん型（ｄｉｆｆｕｓｅ－ｔｙｐｅ）との２つに分類される（Ｌａｕｒｅｎ分類）。後者は、若年者に多く、腹膜播種やリンパ節転移を起こし易く、予後不良のがんである。また、胃がんの治療法として、基本的に外科手術が採用されているが、腹膜播種や他臓器等への転移が生じ易く、再発率の高いびまん型胃がんに対しては、外科手術にて対応することが難しい。さらに、びまん型含め、胃がんに対しては、有効な抗がん剤が開発されておらず、胃がん、特にびまん型胃がんに対しては有効な治療法が確立していないのが現状である。
　また、胃がんにおいては、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＭＥＴ、ＥＲＢＢ２、ＭＹＣ遺伝子の増幅やＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＨ１遺伝子の突然変異等が報告されている。そして、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＥＲＢＢ２等を対象として、現在胃がんに対する様々な分子標的治療の検討が進められている。このように、胃がんを含め、がんにおいて、これらの発生に関与する変異遺伝子（変異タンパク質）や融合遺伝子（融合タンパク質）等のがん遺伝子を同定することは、これら遺伝子を標的とした新規ながん治療方法やがん検査方法の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。
　また、他のがんに関し、ＲＥＴ遺伝子の活性型変異は、家族性及び孤発性の甲状腺がん、一部の大腸がん、褐色細胞腫において生じていることが報告されている。さらに、ＲＥＴ遺伝子は、多発性内分泌腫瘍症候群（ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ）の原因遺伝子であることも明らかになっている（非特許文献１）。また、甲状腺がんに特徴的なゲノム異常として、ＰＴＣ－ＲＥＴ融合遺伝子が報告されており（非特許文献２）、最近肺がんにおいてもその存在が確認されている（非特許文献３）。さらにまた、肺腺がんにおけるゲノム異常として、ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子の存在も明らかになっている（非特許文献３～５）。
　また、ＲＥＴに対する低分子阻害剤には、ｖａｎｄａｔｉｎｉｂ、ｍｏｔｅｓａｎｉｂ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＸＬ－１８４といったものが知られており、現在そのいくつかについては、抗がん剤としての臨床開発研究が進められている。
　さらに、かかる阻害剤のがんに対する治療効果を予測するために、前述の変異遺伝子や融合遺伝子を指標として用いることが検討されている。例えば、ＥＧＦＲやＡＬＫタンパク質を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤はＥＧＦＲ変異やＡＬＫ融合を持つ肺腺がんの治療に特に有効であることが明らかになっている。さらに、肺がんの４～５％に存在するＡＬＫチロシンキナーゼ遺伝子の融合を検出する手法がＡＬＫタンパク質のチロシンキナーゼに対する阻害薬適応例の選出法として開発され、臨床試験が進行している。
　一方、ＣＥＰ５５遺伝子は微小管結合分子であり、細胞分裂において重要な役割を果たすことが明らかになっている（非特許文献６）。また、このタンパク質は、Ｎ末を含め複数のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ　ｃｏｉｌ）領域を有し、二量体を形成しうることが推測されている。さらに、ＣＥＰ５５タンパク質は、広くがん細胞で高発現しているが、他方正常組織では発現が低く、精巣のみで高発現している。このように、ＣＥＰ５５タンパク質は、いわゆるｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎとして知られ、がんワクチン療法の標的として検討されている（非特許文献７）。
　しかしながら、胃がんを含めたがんにおける融合遺伝子等の解明はいまだ十分とはいえず、新規ながん治療方法やがん検査方法の開発に大きく寄与し、さらには薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる融合遺伝子等の同定が望まれているのが現状である。
Ｋｏｕｖａｒａｋｉ　ＭＡ.ら、Ｔｈｙｒｏｉｄ。２００５年、１５巻、５３１～５４４ページ Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ　ＹＥ.ら、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２０１１年、７巻、５６９～５８０ページ Ｔａｋｅｕｃｈｉ　Ｋ．ら、Ｎａｔ　Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３７８～３８１ページ Ｋｏｈｎｏ　Ｔ.ら、Ｎａｔ　Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３７５～３７７ページ Ｌｉｐｓｏｎ　Ｄ.ら、Ｎａｔ　Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３８２～３８４ページ Ｚｈａｏ　ＷＭ.ら、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｌ．、２００６年、１７巻、３８８１～３８９６ページ Ｉｎｏｄａ　Ｓ.ら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００９年、３２巻、４７４～４８５ページ
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、胃がん等において薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定することにある。また、当該遺伝子やその発現産物を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該遺伝子やその発現産物を標的とした薬剤による治療の有効性の予測に基づいて、胃がん等を治療する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、これら方法において当該遺伝子やその発現産物の検出に用いるための薬剤を提供することにある。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、１３症例のびまん型胃がんのトランスクリプトームシークエンシングにより、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子とのインフレーム（Ｉｎ－ｆｌａｍｅ）融合転写産物を同定した。したがって、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子（ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子）は、ヒト第１０番染色体間の相互転座又はヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じることが考えられる。実際、ゲノム融合部位の塩基配列を確認したところ、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じた融合例が見出された。
　そこで、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子を正常細胞に導入したところ、この細胞は足場非依存性のコロニー形成能を獲得し、すなわちがん化することが確認された。また、かかる細胞においては、ＲＥＴタンパク質キナーゼの活性化が認められ、さらにはその下流シグナルであるＡＫＴ等のリン酸化も亢進していることが明らかになった。
　また、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子を発現している細胞をヌードマウスの皮下に移植したところ、該細胞はｉｎ－ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を有していることが確認された。
　一方、かかるＲＥＴタンパク質キナーゼの活性化、ＡＫＴ等のリン酸化、足場非依存性のコロニー形成能、ｉｎ－ｖｉｖｏにおける造腫瘍能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤により、若しくはＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドのキナーゼドメインの不活化により顕著に抑制されることも確認された。
　以上の点に基づき、本発明者らは、びまん型胃がん等において、当該遺伝子融合を標的として薬剤による治療の有効性を予測することが可能であり、さらに、この予測において薬剤による治療が有効であると判定された患者に当該薬剤を投与すれば、効率的に治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部とＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このポリヌクレオチドやポリペプチドの検出方法、当該ポリヌクレオチドや当該ポリペプチドの存在を指標としたＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法、この有効性の判定を利用したがんの治療方法、並びに、これらの方法に用いるための薬剤に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
[１]　ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[２]　[１]に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
[３]　試料中における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
を含む方法。
[４]　[３]に記載の方法により、試料中における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）～（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
[５]　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
[６]　[５]に記載の方法によりＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）～（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
[７]　がんを治療する方法であって、[５]に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
[８]　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、[５]に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
　本発明によれば、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子やその発現産物を効率的に検出することが可能となる。また、本発明によれば、当該融合遺伝子やその発現産物の検出により、がんに対する治療の有効性を予測すること、特にＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。そして、これにより、薬剤を投与することが有効ではないと考えられるがん患者への薬剤の投与を回避することができるため、効率的ながん治療を実現することが可能となる。
ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合の態様を示す概略図である。図中左側は、ヒト第１０番染色体間の相互転座によって生じるＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合例を示し、図中右側は、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じる融合例を示す。 ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むＣ末端部分とが融合していることを示す概略図である。また、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン２と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１４とに、ハイブリダイズするＲＴ－ＰＣＲ用のプライマーを利用することにより、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出することができることを示す概略図である。 ＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子については、ＣＥＰ５５遺伝子５’側及びＲＥＴ遺伝子の３’側にそれぞれＩＳＨ用プローブを設計することで、ヒト第１０番染色体間の相互転座によって生じるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。図中、黒丸は、ＣＥＰ５５遺伝子５’側にハイブリダイズするプローブを示し、白丸は、ＲＥＴ遺伝子の３’側にハイブリダイズするプローブを示す（プローブの表記に関し、図４においても同じ）。 ＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子については、ＣＥＰ５５遺伝子５’側及びＲＥＴ遺伝子の３’側にそれぞれＩＳＨ用プローブを設計することで、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。 野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株をソフトアガー培地に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成を顕微鏡下にて観察した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ」は野生型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ－ＫＤ」は変異型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ」は野生型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ－ＫＤ」は変異型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。また、各バーは１００μｍであることを示す。 ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株を播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を解析した結果を示すグラフである。図中、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ」は野生型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ」は野生型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。「ＶＤ」はＶａｎｄｅｔａｎｉｂ存在下（培地中のＶａｎｄｅｔａｎｉｂの濃度：０．２μＭ）におけるコロニー形成の結果を示し、「ＸＬ」はＸＬ１８４存在下（培地中のＸＬ１８４の濃度：０．２μＭ）におけるコロニー形成の結果を示し、「非添加」はＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下におけるコロニー形成の結果を示す。また縦軸は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下において、野性型の各ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株が形成したコロニーの数を１００とした際の相対値を示す。 ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株に血清飢餓処理を各々施した後、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）の存在下にて培養し、これら細胞における各種タンパク質のリン酸化を、ウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ」はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ」はＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。「Ｗ」が付記されているレーンは、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「Ｖ」が付記されているレーンは、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ存在下（培地中のＶａｎｄｅｔａｎｉｂの濃度：１μＭ）における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「Ｘ」が付記されているレーンは、ＸＬ１８４存在下（培地中のＸＬ１８４の濃度：１μＭ）における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「ＫＤ」が付記されているレーンは、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下における変異型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示す。また、各融合ポリペプチドはＦＬＡＧタグを更に結合させ、細胞内にて発現させているため、図中「ＦＬＡＧ　ｔａｇ」は、該タグを通して各融合ポリペプチドを検出した結果を示す。「ｐ－ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」は、リン酸化されたＲＥＴを検出した結果を示す。「ＳＴＡＴ３」及び「ｐ－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」は、ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３を検出した結果を各々示す。「ＡＫＴ」及び「ｐ－ＡＫＴ（Ｓ４７３）」は、ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴを検出した結果を各々示す。「ＭＡＰＫ」及び「ｐ－ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）」は、ＭＡＰＫ及びリン酸化ＭＡＰＫを検出した結果を各々示す。「β－ａｃｔｉｎ」は、内部標準として各レーンにおけるタンパク質量が揃っていることを示す。 ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているマウス正常繊維芽細胞株を、免疫不全マウスの皮下に移植した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ」は、野生型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ」は、野生型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。三角は形成された腫瘍を示し、「８／８」は当該細胞を４匹のマウスに２箇所ずつ計８箇所に移植し、その８箇所全てにおいて腫瘍の形成が認められたことを示す。「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ－ＫＤ」は、変異型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。「０／６」は当該細胞を３匹のマウスに２箇所ずつ計６箇所に移植し、その６箇所全ておいて腫瘍の形成が認められなかったことを示す。
　＜ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド＞
　後述の実施例において示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合例が本発明において初めて明らかになった。したがって、本発明は、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチド（以下、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド」とも称する）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
　本発明の「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド」とは、ＣＥＰ５５タンパク質の全長又はその一部と、ＲＥＴタンパク質の全長又はその一部とが融合しているポリペプチドを意味する。また、本発明の「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」とは、ＣＥＰ５５タンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドと、ＲＥＴタンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドとが融合しているポリヌクレオチドを意味する。
　本発明にかかる「ＣＥＰ５５タンパク質（中心体タンパク質５５ＫＤａ）」は、ヒトにおいては１０番染色体長腕部（１０ｑ２３．３）に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＣＥＰ５５タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明にかかる「ＲＥＴ（トランスフェクション中の再構成、ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＤ　ＤＵＲＩＮＧ　ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ）タンパク質」は、ＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質又はＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼタンパク質とも称され、ヒトにおいて１０ｑ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＲＥＴタンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ５１、ＲＥＴアイソフォームａ）及び配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ９、ＲＥＴアイソフォームｃ）が挙げられる。また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には各々、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＲＥＴ転写産物変異体２）及び配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＲＥＴ転写産物変異体４）である。なお、図２に示す通り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ５１）と配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ９）とは、１位のメチオニン残基から１０６３位のグリシン残基まではアミノ酸配列が一致しているが、Ｃ末端部分の配列及び長さが相違する。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドは、典型的には、ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
　本発明において、「ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分」とは、典型的には、前記ＣＥＰ５５タンパク質の１位のメチオニン残基～１５３位のグルタミン残基からなる領域を含むものである。また、「ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分」とは、典型的には、前記ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むものである（図２参照）。
　本発明の「ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、典型的には、図１～４において示す通り、ヒト第１０番染色体間の相互転座又は１０番染色体内の切断及び再結合によって生じるものである。より具体的には、前記ＣＥＰ５５タンパク質のうち、エクソン１～３によりコードされるポリペプチド領域と前記ＲＥＴタンパク質のうち、エクソン１２～１９ｂ又はエクソン１２～２０によりコードされるポリペプチド領域とが融合しているポリペプチド（例えば、配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　本発明にかかる「ＣＥＰ５５タンパク質」及び「ＲＥＴタンパク質」のアミノ酸配列、並びにこれらタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド」のアミノ酸配列及び「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」の塩基配列も、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。また、これらアミノ酸配列や塩基配列は、人工的に改変することもできる。本発明には、このような変異体も含まれる。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体の一態様としては、配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　ここで「複数」とは、通常５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体の他の態様としては、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。
　ここで高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体のさらなる他の態様としては、配列番号：８に記載のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
　ここで配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの変異体としては、上記ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド及びアミノ酸の変異を伴なわない縮重変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明の「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」の形態には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等が含まれる。「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」は、当業者であれば、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を保持するびまん型胃がん等から調製したｃＤＮＡのライブラリー又はゲノムＤＮＡのライブラリーから、公知のハイブリダイゼーション技術を利用して単離することができる。また、前記びまん型胃がん等から調製したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（ＰＣＲ)を利用することにより増幅し、調製することもできる。
　さらに、このようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを調製することができる。
　なお、上記の通り、本発明の「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド」及び「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」は、広義には、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）及び人工的に配列が改変されたものの双方を含む。しかしながら、、特に、後述する検出の対象としての「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド」及び「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」を指す場合には、主として、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）を意味することに留意されたい。
　＜ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出方法＞
　本発明は、また、試料中におけるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、を含む。
　本発明において「試料」とは、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物も含む。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
　さらに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
　本発明において「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出」は、前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、前記ゲノムＤＮＡからの転写産物、前記転写産物からの翻訳産物を対象として行うことができる。
　また、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、ヒト第１０番染色体間の相互転座又は１０番染色体内の切断及び再結合によって形成されるものであるから、「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」においては、この相互転座という現象を検出してもよい（図１及び３参照のこと）。かかる相互転座の検出においては、例えば、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン４のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、また、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１１のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよい。
　本発明における「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」には、公知の手法を用いることができる。「前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」を対象とする場合においては、例えば、蛍光等を用いたｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析を用いることができる。また、「前記ゲノムＤＮＡからの転写産物」を対象とする場合においては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いることができる。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを接触させることにより、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができる。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの検出において、本発明にかかるＣＥＰ５５－ＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＣ＿００００１０．１０で特定されるゲノムの配列のうち９５２５６３６９～９５２８８８４９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＣＥＰ５５遺伝子）である。
　また、本発明にかかるＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＣ＿００００１０．１０で特定されるゲノムの配列のうち４３５７２５１７～４３６２５７９９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＲＥＴ遺伝子）である。
　しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
　本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ１）　ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＣＥＰ５５プローブ」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ２）　５’ＣＥＰ５５プローブと、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン４のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＣＥＰ５５プローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ３）　ＲＥＴ遺伝子のエクソン１１のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＲＥＴプローブ」とも称する）と、３’ＲＥＴプローブとの組み合わせ。
本発明において、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましく、また、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ２）又は（ａ３）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域としては、同観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける切断点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
　また、本発明において、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするゲノムＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド、例えば、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
　また、本発明において、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度をより向上させるという観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００～１０００塩基であることが好ましい。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）や酵素的金属沈着に基づく銀等によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブとは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。異なる色素にて標識した上記（ａ１）のプローブの組み合わせを用いてｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの重なりが観察された場合、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる（図３及び４　参照）。一方、異なる色素にて標識した上記（ａ２）及び（ａ３）のいずれかのプローブの組み合わせを用いてｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの分離が観察された場合、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
　なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とを接触させる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーな条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーな条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ－４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントな条件を実現することができる。
　前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
　前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いてＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。
　ＰＣＲやシークエンシングにおいては、前記生体試料から調製したＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）やＲＮＡを鋳型としてＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの一部又は全部を特異的に増幅するために、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを用いることができる。
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる前記融合ポリヌクレオチド等において、片方のプライマーがＣＥＰ５５遺伝子領域にハイブリダイズし、他方のプライマーがＲＥＴ遺伝子領域にハイブリダイズするプライマーセットである。これらポリヌクレオチドの長さは、通常１５～１００塩基であり、好ましくは１７～３０塩基である。
　また、本発明の（ｃ）に記載のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法による検出の精度や感度の観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から５０００塩基内の前記融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列であることが好ましい。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド等の塩基配列に基づき、公知の手法により適宜設計することができる。公知の手法としては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ソフトウェア（登録商標、ＡＢＩ社製）を利用する方法が挙げられる。
　「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、好ましくは、下記（ｃ１）に記載のポリヌクレオチドである。
（ｃ１）　ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＣＥＰ５５プライマー」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプライマー」とも称する）との組み合わせ。
　例えば、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの検出においては、ＣＥＰ５５遺伝子の開始コドンを含むエクソン２、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼ領域内にあるエクソン１４に対してプライマーを設計することで、ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼ領域を含む全てのバリアントと、ＣＥＰ５５遺伝子との融合遺伝子が検出できる（図２参照）。
　本発明において、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出する方法としては、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析が挙げられる。これら方法においては、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体が用いられる。かかる抗体としては、例えば、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）、ＣＥＰ５５タンパク質の前記融合点よりＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＣＥＰ５５－Ｎ末抗体」とも称する）、ＲＥＴタンパク質の前記融合点よりＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＲＥＴタンパク質－Ｃ末抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）のＣＥＰ５５タンパク質及び野生型（正常型）のＲＥＴタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
　ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドは、前記融合点特異的抗体により、また、前記ＣＥＰ５５－Ｎ末抗体と前記ＲＥＴタンパク質－Ｃ末抗体との組み合わせにより検出することができる。
　「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分からなるポリペプチド、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド、前記ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分からなるポリペプチド等を免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン及び放射性物質が挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインＧ又はプロテインＡ等を用いて標的蛋白質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
　＜ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法＞
　後述の実施例において示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合は、ＲＥＴタンパク質の活性化をもたらし、がんの悪性化等に寄与してと考えられる。そのため、このような融合が検出されるがん患者においては、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による治療が有効である蓋然性が高い。
　従って、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料におけるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法を提供する。
　本発明において「患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法を適用する対象となる「がん」としては、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子の発現が認められるがんであれば特に制限はない。好ましくはびまん型胃がんである。患者からの生体試料の採取は、生体試料の種類に応じて公知の手法により行うことができる。
　本発明においてがん治療の有効性を評価する対象となる「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、ＲＥＴタンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（一般名：バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）；ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする化合物）、４－［４－［３－［４－クロロ‐３－（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］－Ｎ－メチルピリジン－２－カルボアミド（一般名：ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）；ＢＲＡＦ及びＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ－［２－（ジエチルアミノ）エチル］－５－［（Ｚ）－（５－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－インドール－３－イリデン）メチル］－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボキシアミド　モノ［（２Ｓ）－２－ヒドロキシサクシネート］（一般名：スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ－（３，３－ジメチルインドリン－６－イル）－２－（ピリジン－４－イルメチルアミノ）ニコチンアミド（一般名：モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ－（４－（６，７－ジメトキシキノリン－４－イルオキシ）フェニル）－Ｎ－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキシアミド（一般名；ＸＬ１８４／カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）；ＭＥＴ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）が挙げられる。
　「試料」の定義、試料からのＤＮＡやＲＮＡ等の抽出方法、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド及びＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出の手法等は、上記の通りである。
　本発明の方法により、患者から単離した試料において、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在が検出された場合、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定され、一方、当該ポリヌクレオチド又は当該ポリペプチドの存在が検出されなかった場合は、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が低いと判定される。
　＜ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤、並びにＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤＞
　上記の通り、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）～（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドは、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出に好適に用いることができる。従って、また、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性の判定にも好適に用いることができる。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
　これらポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、該特定の塩基配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
　なお、（ａ）～（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ、Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ、トレオ―ス核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
　また、上記の通り、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド）の検出に好適に用いることができる。
　本発明の薬剤においては、有効成分としての前記物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加え、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩等が挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
　また、ポリヌクレオチドや抗体を含む標品に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド、又はこれらを保持する細胞等）や陰性対照、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（ＤＡＰＩ等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、本発明の方法に用いるためのキットとすることもできる。当該キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットをも提供するものである。
　＜がんを治療する方法、がんの治療剤＞
　上記の通り、本発明の方法によりＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在を検出された患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと考えられる。このため、がん患者のうち、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子を保持する患者に選択的に、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんを治療する方法であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法を提供するものである。
　また、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤を提供するものである。
　「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、上記の通り、ＲＥＴタンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の例としては、前述の通りである。
　患者へのＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類等に応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない
　＜実験材料＞
　びまん型胃がん手術切除凍結標本１３症例を研究対象とした。また、陰性対照として、正常胃粘膜組織を用いた。
　＜ＲＮＡ抽出＞
　液体窒素内にて凍結保存されていた腫瘍組織を、クライオプレップ（製品名：ＣＰ０２、コバリス社製）にて粉砕した。次いで、粉砕された腫瘍組織から、トータルＲＮＡ精製用キット（製品名：ＲＮＡｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。
　＜ＲＮＡシークエンス＞
　前記にて調製したトータルＲＮＡ２μｇを用いて、ｍＲＮＡｓｅｑサンプル調製キット（イルミナ社製）により、ライブラリーの合成を行なった。すなわち、先ず２μｇのトータルＲＮＡを９４℃にて５分間処理し、断片化した後、ｃＤＮＡ合成を行なった。次いで、得られたｃＤＮＡの両端にシークエンス用のアダプターを結合し、その後アガロースゲルに泳動、精製した。そして、精製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、３００塩基長のライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡライブラリーを高速シークエンサー（ＧＡ２Ｘ、イルミナ社製）を用いて、その両端５０ｂｐをシークエンス解読した。
　＜シークエンス情報の解析＞
　得られた配列情報からＰＣＲによる重複クローンを除外した後、Ｂｏｗｔｉｅソフトを用いて既知のデータベース（Ｒｅｆｓｅｑ及びＥｎｓｅｍｂｌｅ）にマッピングし、両端の配列が、異なる遺伝子由来の配列であるものを抽出した（非特許文献４　参照）。
　＜ＲＴ－ＰＣＲ及びサンガー法による確認＞
　ＲＮＡシークエンスに用いた同じトータルＲＮＡから、新たに逆転写酵素（スーパースクリプトIIIファースト（１ｓｔ）－ストランド合成システム、インビトロゲン社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。得られた配列を元にＰＣＲプライマーを合成し、ＥｘＴａｑ　ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行い、その後、電気泳動にてＰＣＲ産物を確認した。さらに、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、同プライマー、ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステム社製）及びＡＢＩ　３７３０シークエンサーを用いて、サンガー法によりシークエンシング解析を行った。そして、得られた結果から、融合遺伝子の融合点と読み枠とを確認した。
　転写反応及びＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。
　＜逆転写反応＞
　先ず、前記トータルＲＮＡ５μｇ（８μＬ）に、ランダムヘキサマーズプライマー（５０ｎｇ／μＬ）１μＬと、１０ｍＭ　ｄＮＴＰミックス１μＬとを混ぜ、６５℃にて５分間反応し、氷上にて急冷した。次いで、１０×ＲＴバッファー２μＬと、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２４μＬと、０．１Ｍ　ＤＴＴ２μＬと，ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μＬ）１μＬと、スーパースクリプトIIIＲＴ（２００Ｕ／μＬ）１μＬとを順番に添加した。そして、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間、４℃にて５分間という条件にて、逆転写反応を行った。次いで、得られた逆転写産物に、ＲＮａｓｅＨ　１μＬを添加し、３７℃にて２０分間かけ、トータルＲＮＡを消化した後、使用するまで、－２０℃にて保存した。
　＜ＰＣＲ反応＞
　前記にて調製した１ｓｔストランドｃＤＮＡ２μＬと、１０×ＥｘＴａｑバッファー１μＬと、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ１．２μＬと、Ｈ２Ｏ４．７μＬと、ＥｘＴａｑ　ＨＳ　０．１μＬと、２μＭ　ＣＦ／ＣＲミックスプライマー　１μＬとを混合し、先ず、９５℃にて３分間、次いで、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間及び７２℃にて３０秒間という反応サイクルを３５サイクル繰り返した後、７２℃にて５分間反応した。
　（実施例１）
　［ＲＮＡシークエンスによる新規キナーゼ融合遺伝子の同定］
　１３症例のびまん型胃がん臨床検体から、ＰＣＲによる重複クローンを除外した上で、各々８．０ｘ１０７以上のペア塩基配列が得られた。それらを既存の遺伝子データベースに参照した結果、図２に示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子候補（ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ９タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ５１タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、以下「ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子」とも称する）を１例において検出した。
　［ＲＴ－ＰＣＲ及びサンガーシークエンスによる確認］
　次に、同一検体を用いてＲＴ－ＰＣＲとサンガーシークエンスによる融合遺伝子の検証を行なった。その結果、ＲＴ－ＰＣＲにて、前記融合遺伝子について、症例特異的な増幅、すなわち、びまん型胃がんのみにおいて前記融合遺伝子が発現しており、正常胃粘膜組織においては、前記融合遺伝子が発現していないことが明らかになった。
　さらに、得られたＰＣＲ産物をシークエンス解析することによって、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子においては、図２及び配列番号：７及び９に示す通り、ＣＥＰ５５のエクソン３（配列番号：１、７又は９の４８８～７６３位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２（配列番号：３又は５の２３２７～２４７４位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）とが直接結合することにより、これら遺伝子の読み枠にずれが生じることなく融合していることが明らかになった。
　従って、以上の結果から、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子とは、同じ１０番染色体に同じ方向で存在することから、びまん型胃がん等のがん細胞特異的に、１０番染色体間の相互転座（図１左側　参照）又は１０番染色体内の切断及び再結合（図１右側　参照）により、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合が生じていることが示唆された。実際、未分化胃がん患者由来のがん組織より得たゲノムＤＮＡの融合部位の塩基配列解析より、該患者がん組織においては１０番染色体内の切断及び再結合により、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合が生じていることが見出された。
　（実施例２）
　［ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの機能、並びに該ポリペプチドを発現しているがん細胞に対するＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の有効性についての解析］
　前述の遺伝子融合は、ＲＥＴタンパク質の活性化をもたらすものと考えられ、さらには該活性化によりその下流のシグナルも活性化され、細胞ががん化することが考えられる。したがって、このような活性化が生じている患者に対し、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。そこで、これらの点について確認すべく、以下に示す通り、適宜定法に従い、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子について解析を行った。
　先ず、未分化胃がん患者由来のがん組織より得たＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子（ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ５１タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）のｃＤＮＡの５’側に、ＦＬＡＧエピトープタグをコードするｃＤＮＡを翻訳の読み枠を合わせて連結し、ｐＭＸｓレトロウイルスベクターにクローニングした。
　また、このベクターに部位特異的な変異を導入し、ＲＥＴキナーゼ部位内の１アミノ酸を置換したキナーゼ活性変異体（ＫＤ変異型ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド：Ｋ７５８Ｍ）をコードするベクターも作製した。
　次に、このように調製して得られたレトロウイルスベクターを、マウス正常繊維芽細胞株ＮＩＨ－３Ｔ３細胞に各々感染させ、野性型又は変異型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を得た。
　また、肺腺がんにおいて検出されるＲＥＴ融合遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子、以下「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子」とも称する）についても、前記同様に該遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを作製した。さらに、前記同様にＲＥＴキナーゼ部位内のリジンをメチオニンに置換したキナーゼ活性変異体をコードするレトロウイルスベクターも作製した。さらに、これらレトロウイルスベクターをＮＩＨ－３Ｔ３細胞に各々感染させ、野性型又は変異型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を調製した。そして、この細胞株を対照群として以下に示す実験に供した。
　なお、ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子については、Ｋｏｈｎｏ　Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２年２月１２日オンライン公開、１８巻、３号、３７５～３７７ページ　参照。また、本実施例において対照として用いたＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子は、該文献に記載の「ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ　ｆｕｓｉｏｎ　ｖａｒｉａｎｔ　１」である。
　また、本明細書において、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子及びＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子（又はＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチド及びＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチド）を「ＲＥＴ融合遺伝子（又はＲＥＴ融合ポリペプチド）」とも総称する。
　野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株をソフトアガー培地（培地中のアガーの濃度：４ｍｇ／ｍＬ、以下同じ）に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＲＥＴ融合ポリペプチドの形質転換能を調べた。得られた結果を図５に示す。
　また、低分子ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を各々播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＲＥＴ融合ポリペプチドによる形質転換に対するＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の効果を調べた。得られた結果を図６に示す。
　さらに、野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を液体培地にて各々培養し、血清飢餓処理を施した後に、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加した液体培地に交換して培養した。そして、このようにして得られた各細胞株から、タンパク質を抽出し、各種リン酸化タンパク質又は非リン酸化タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うことにより、ＲＥＴ融合にポリペプチドの下流のシグナルについて解析を行った。得られた結果を図７に示す。
　また、野性型若しくは変異型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株又は野生型のＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を免疫不全マウス（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ）の皮下に、１箇所につき細胞１ｘ１０６個を移植し、これらＲＥＴ融合ポリペプチドを発現する細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を調べた。得られた結果を図８に示す。
　図５に示した結果から明らかなように、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞は足場非依存性のコロニー形成を示した。一方、ＲＥＴタンパク質のキナーゼ活性を不活性化することによって、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は顕著に抑制されることが明らかになった。
　さらに、図６に示す通り、かかるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によって著しく阻害されることも明らかになった。
　また、図７に示した結果から明らかなように、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞ではＲＥＴキナーゼドメインの強いリン酸化が認められた（図７の「ｐ－ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」において「Ｗ」が付記されているレーン　参照）。さらに、このリン酸化はＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤処理又はＲＥＴタンパク質におけるキナーゼ活性の不活性化によって顕著に抑制されることも明らかになった（図７の「ｐ－ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」において「Ｖ」及び「Ｘ」、又は「ＫＤ」が付記されているレーン　参照）。
　また、図７に示す通り、ＡＫＴのリン酸化は、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドによって強く引き起こされた（図７の「ｐ－ＡＫＴ（Ｓ４７３）」において「Ｗ」が付記されているレーン　参照）。さらに、ＳＴＡＴ３及びＭＡＰＫのリン酸化も該融合ペプチドによって亢進されることも明らかになった（図７の「ｐ－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」及び「ｐ－ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４７０５）」において「Ｗ」が付記されているレーン　参照）。しかし、これらのリン酸化もＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤処理又はＲＥＴタンパク質におけるキナーゼ活性の不活性化によって顕著に抑制されることも明らかになった（図７の「ｐ－ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」、「ｐ－ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」及び「ｐ－ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４７０５）」において「Ｖ」及び「Ｘ」、又は「ＫＤ」が付記されているレーン　参照）。
　また、図８に示す通り、野生型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ－３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植した結果、その移植後１４日以内に腫瘍形成が観察された。一方、変異型のＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ－３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植しても、その移植後３０日迄の観察において、腫瘍形成を全く確認することができなかった。
　したがって、ＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合遺伝子は形質転換能を有してがん遺伝子として働いること、さらには該形質転換にはＲＥＴキナーゼ活性の活性化が必要であることが明らかになった。
　また、かかるＣＥＰ５５－ＲＥＴ融合ポリペプチドによる形質転換能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によって、該融合ポリペプチドにおけるＲＥＴチロシンキナーゼの活性化やその下流のシグナルであるＡＫＴ等の活性化が阻害されることにより、抑制されることも明らかになった。
　以上説明したように、本発明によれば、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドやその発現産物を検出することが可能となり、さらに、この検出により、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。この融合はＲＥＴタンパク質の活性化をもたらし、ひいては細胞をがん化してしまう。さらに、上記にて実証している通り、かかるＲＥＴの活性化及びがん化は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤により顕著に抑制することができる。従って、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の標的となりうるため、本発明は、がん治療の効率を高める上で、極めて有用である。

Claims (8)

  1. 　ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  2. 　請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
  3. 　試料中における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
    （ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
    （ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
    を含む方法。
  4. 　請求項３に記載の方法により、試料中における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）～（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤。
    （ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
    （ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
    （ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
    （ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
  5. 　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
  6. 　請求項５に記載の方法によりＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）～（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
    （ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
    （ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
    （ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
    （ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
  7. 　がんを治療する方法であって、請求項５に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
  8. 　ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、請求項５に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
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