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WO2014076213A1 - Neue zellspezifisch wirksame nukleotid-moleküle und applikationskit zu deren anwendung - Google Patents

Neue zellspezifisch wirksame nukleotid-moleküle und applikationskit zu deren anwendung Download PDF

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WO2014076213A1
WO2014076213A1 PCT/EP2013/073887 EP2013073887W WO2014076213A1 WO 2014076213 A1 WO2014076213 A1 WO 2014076213A1 EP 2013073887 W EP2013073887 W EP 2013073887W WO 2014076213 A1 WO2014076213 A1 WO 2014076213A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleotide
nucleotide molecules
molecules
bound
peptide
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2013/073887
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tobias PÖHLMANN
Rolf Günther
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Original Assignee
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU filed Critical Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
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Priority to US14/442,655 priority patent/US20160193362A1/en
Priority to CN201380066844.XA priority patent/CN105051191A/zh
Priority to HK15111778.8A priority patent/HK1211055A1/xx
Priority to EP13814439.9A priority patent/EP2920305A1/de
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Definitions

  • the invention relates to novel biologically active molecules based on nucleotides, with which the expression of genes can be specifically indexed or reduced in certain cells, and an application kit for use.
  • An inhibition of the expression of genes can be achieved inter alia by the introduction of siRNA (short interfering RNA) or miRNA (microRNA).
  • siRNA molecules can classically interact with the mRNA of the target gene and, together with specific endoribonucleases, form an RNA-protein complex called "RISC" (RNA induced silencing complex) .
  • RISC RNA induced silencing complex
  • the RISC complex binds to the target mRNA, with endonucleases cleave the target mRNA to prevent gene expression, thereby inhibiting targeting.
  • RNA molecules double-stranded RNA molecules
  • siRNA double-stranded RNA molecules
  • siRNA is designed so that these effects are suppressed.
  • nucleic acids are often limited to short nucleic acid sequences; the problem with longer sequences is that the molecules are unstable and thus can not be efficiently introduced into cells via directional delivery; the known binding of short peptides to the ends of longer nucleic acids and their cell-specific cleavage often does not lead to the desired cell-specific effect, since the binding of peptides to the end of a long RNA or DNA sequence does not lead to sufficient inactivation.
  • the invention is based on the object to modify long nucleic acid molecules so that by chemical modifications their biological function is reliably inactivated and cell-specific completely restored.
  • nucleotide molecules are bound to nucleotide molecules in such a way that their spatial structure is so strongly changed that their biological function is no longer guaranteed or molecules normally attached to the nucleic acids no longer have access to the nucleic acids.
  • the object of the present invention is achieved by single- or double-stranded nucleotide molecules with a length of more than 21 bases for introduction into cells, which are characterized in that the nucleotide molecules are at least bound to a peptide or polymer for their inactivation, which inhibits the biological activity of these molecules and which can be cleaved off by enzymes and thereby the biological effect is restored.
  • at least one peptide or polymer can be attached between the ends of the nucleotides.
  • at least one peptide or polymer may be attached to the backbone of the nucleotides such that both ends are bound together.
  • such constructs are also provided in which at least one peptide or polymer between the ends of the nucleotides and additionally at least one peptide or polymer is bound to the backbone of the nucleotides so that both ends are bound to one another to inhibit the nucleotide molecules ,
  • the present invention is based in particular in the sense of the preceding in that long nucleic acid molecules are designed so that their biological function is reliably inactivated by chemical modifications and can also be completely restored cell-specific.
  • long nucleotide molecules or “long nucleic acid molecules” in the context of the present invention includes not only those having a length of more than 21 bases. In particular, those nucleotide molecules or nucleic acid molecules are also included, which have a length of more than 23 bases. Prefers are those nucleotide molecules or nucleic acid molecules that are more than 25 bases in length.
  • long nucleic acid molecules are modified in the sense of the invention by chemical modifications so that their biological function is reliably inactivated and also completely cell-specifically restored, said nucleic acid molecules or nucleotide molecules having a length of more than 30, 40, 50 or more Have bases.
  • nucleotide molecules are also provided for introduction into cells, which are characterized in that the nucleotide molecules for their inactivation are bound at least to a peptide or polymer which inhibits the biological activity of these molecules and which by enzymes can be cleaved and thereby the biological effect is again caused, in particular molecules are provided with a length which are in the range of 23 to 10,000 bases.
  • lengths of the nucleotide molecules or nucleic acid molecules according to the invention which are in the range of 23, 25, 30, 40 or 50 to 100 bases, in particular in the range of 23 to 100 bases. These lengths are typically found in, but are not limited to, shRNA nucleotide or nucleic acid molecules, miRNAs, and antisense nucleotides.
  • single or double-stranded nucleotide molecules are also provided for introduction into cells, which are characterized in that the nucleotide molecules for their inactivation is bound at least to a peptide or polymer which inhibits the biological activity of these molecules and which can be cleaved by enzymes and thereby the biological effect is again caused, in particular molecules are provided with a length which are preferably in the range of 100 to 2000 bases. These lengths are typically found in, but are not limited to, nucleotide molecules or nucleic acid molecules from the group of synthetic mRNAs, aptamers.
  • nucleotide molecules are also provided for introduction into cells, which are characterized in that the nucleotide molecules for their inactivation is bound at least to a peptide or polymer which inhibits the biological activity of these molecules and which can be cleaved by enzymes and thereby the biological effect is again caused, in particular molecules are provided with a length which are preferably in the range of 2,000 to 10,000 bases. These lengths are typically found in, but not limited to, nucleotide molecules or nucleic acid molecules, such as mRNAs.
  • the peptides or polymers are designed so that the Structure of the nucleotides changes and thereby their biological activity is inhibited.
  • the peptides or polymers are cleaved from the nucleotides by specific enzymes, they revert to their original structure and unfold their normal biological activity.
  • the cleavage by specific enzymes can be induced in particular by the fact that they show activity in specific disease or developmental states of cells (in particular cell cycle or differentiation in stem cells), specific for certain cell types or disease-relevant alteration of them (in particular degeneration or infection) or genotype-specific activity. Furthermore, a specific cleavage for the detection of certain enzymes or in the mentioned applications can take place.
  • Specific enzymes may be, for example, proteases or peptidases (caspases, aminopeptidases or serine proteases, in particular caspase-1, caspase-2, caspase-3, caspase-4, caspase-5, caspase-6, caspase-7, caspase-8, KL 4, PLAP, IRAP, uPA, FAP- ⁇ or viral PRoteases, for example HIV protease, coxsackievirus protease, Epstein Barr viras protease, hepatitis A, B, C virus protease), nucleases, glycosidases, saccharases or chitinases.
  • proteases or peptidases caspases, aminopeptidases or serine proteases, in particular caspase-1, caspase-2, caspase-3, caspase-4, caspase-5, caspase-6, caspase-7, caspase-8, KL 4, PLAP, IRAP, uPA
  • binding peptides or polymers for example to micro (mi) RNA, it can be achieved that normally occurring 3d structures are modified by sequence homologies.
  • binding peptides or polymers to mRNA it can be achieved, for example, that the initiation sites for the attachment of ribosomes to the mRNA are masked for translation and thus the protein encoded on the mRNA is not expressed.
  • the selection of the bonds of peptides or polymers is not limited to the ends of the nucleotide molecules, but can also be done on the sugar molecules of the nucleotides, the phosphates or the organic bases.
  • the nature of the single or double-stranded nucleotide molecules of the present invention is not limited to particular nucleic acid molecule or nucleotide molecule species.
  • the single- or double-stranded nucleotide molecule according to the invention may be an mRNA, a DNA, a shRNA or a PNA.
  • the single or double-stranded nucleotide molecule according to the invention can also be an aptamer or a spiegelmer.
  • the single- or double-stranded nucleotide molecules of the invention may be immunostimulating RNAs.
  • the single- or double-stranded nucleotide molecule of the present invention is provided not only in the form of one of the aforementioned single nucleotide-molecule species. Rather, in a preferred embodiment, mixtures or mixed forms of the individual species (mRNA, DNA, shRNA, PNA, immunostimulatory RNA, aptamer and / or spiegelmer) of the single- or double-stranded nucleotide molecules according to the invention are also provided.
  • aptamer encompasses short single-stranded DNA or RNA oligonucleotides capable of binding a specific molecule via their three-dimensional structure
  • spiegelmer encompasses L-ribonucleic acid aptamers (L-RNA aptamers for short).
  • L-ribonucleic acid aptamers are ribonucleic acid (RNA) -like molecules composed of unnatural L-ribonucleotides. They are artificial Oligonucleotides and stereochemical mirror images of natural oligonucleotides.
  • L-ribonucleic acid aptamers thus constitute a special form of aptamers and, like these, can bind specific molecules via their three-dimensional structure.
  • L-ribonucleic acid aptamers are known under the trade name "Spiegelmer”.
  • immunostimulatory RNAs are understood as meaning RNA molecules which are capable of reacting with cell-specific molecular complexes, for example RIG-I (RIG-I ("retinoic acid-inducible gene 1") is an RIG-I-like receptor dsRNA Helicase enzyme, which is a member of the family of RIG-I-like receptors (RLRs), interacts to activate a signal transduction chain and / or induce an immune response and / or apoptosis (for review, see Kawai and Akira, Ann NY Acad Sci 1 143: 1-20 (2008) and Schlee et al., Immunol Rev. 227 (1): 66-74 (2009)). These immunostimulatory RNAs may also be characterized by a 5 "triphosphate.
  • An application kit for the application and administration of the biologically active nucleotide molecules, comprising at least one of them, is advantageous
  • ampoule A which contains and may further contain the biologically active molecule:
  • At least one further ampoule (ampule B) with a transfection system for example nanoparticles, polyethyleneimines or lipids,
  • At least one further ampoule which contains further constituents for binding to the biologically active molecules or the transfection system,
  • FIG. 1 Exemplary and schematic representation of an mRNA (Ia) to which biological molecules or molecular complexes, for example ribosomes (2), accumulate in the known manner and thereby trigger a biological process. Furthermore, the modification of the mRNA (lb) by, for example, a peptide (3a) is shown, whereby the attachment of the biological molecules or molecular complexes, such as ribosomes (2) and thus the triggering of a biological process is prevented. If the peptide (s) (3a) are again cleaved off from the mRNA, the biological molecules or molecular complexes (2) can re-accumulate in the known form to the mRNA (Ia) and trigger the known biological processes.
  • a mRNA
  • FIG. 2 Exemplary and schematic representation of an mRNA (Ia) to which biological molecules or molecular complexes, for example ribosomes (2), are deposited in the known manner, thereby triggering a biological process. Furthermore, the modification of the mRNA (lb) by, for example, a peptide (3b) is shown, whereby the spatial structure of the mRNA changes such that the attachment of the biological molecules or molecular complexes, such as ribosomes (2) and thus the triggering of a biological process is prevented. This process can be supported by the formation of double strands of RNA by random or planned homologies.
  • FIG. 1 shows the exemplary mechanism by means of an mRNA (Ia).
  • ribosomes (2) attach themselves to the mRNA and thereby trigger a biological process; in the case of ribosomes, translation.
  • Peptide (3a) By modifying the exemplary mRNA (Ib) by a bound example Peptide (3a) prevents the attachment of, for example, the ribosomes (2).
  • no translation of this mRNA (1b) can occur.
  • the attachment of the exemplary ribosome (2) to the mRNA (la) is no longer prevented and there is the normal biological process, in the case of ribosomes, the translation instead.
  • the binding of the peptide (3 a) can take place at the initiation site of the exemplary ribosomes or at another site of the mRNA; according to the binding site either the attachment of the ribosomes (2) or the complete reading of the exemplary mRNA is prevented.
  • the normal biological function of the mRNA upon binding of the exemplary peptide can no longer occur.
  • FIG. 2 shows a further possibility of the exemplary mechanism by means of an mRNA (Ia).
  • mRNA mRNA
  • ribosomes (2) attach themselves to the mRNA and thereby trigger a biological process; in the case of ribosomes, translation.
  • exemplary mRNA (lc) a bound exemplary peptide (3b)
  • the spatial structure of the exemplary mRNA is changed such that the attachment of, for example, the ribosomes (2) is prevented.
  • no translation of this mRNA (1c) can occur.
  • RNA induction of the production of toxic proteins in target cells:
  • the RNA can be chosen so that its sequence codes for one or more sections of a toxic protein or peptide or for an entire toxic protein or peptide.
  • bacterial toxins such as diphtheria, anthrax A, anthrax B, botulinum toxin or toxins of higher organisms (cones snails, snakes, lizards, insects, spiders, scorpions).
  • allergens in target cells, especially in combination with transport sequences necessary for a display of allergens at the Provide cell surface, so that they are accessible to the immune system. It is particularly preferred to combine the allergen with an HLA sequence, in particular sequentially in succession, or the allergen at one point in the interior of the HLA sequence, so that allergen and HLA are presented together on the cell surface.
  • HLA sequence in particular sequentially in succession, or the allergen at one point in the interior of the HLA sequence, so that allergen and HLA are presented together on the cell surface.
  • Non-human allergens such as ambrosia, are particularly suitable as allergens.

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Abstract

Zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren Anwendung. Aufgabe war es, lange Nukleinsäuremoleküle so zu modifizieren, dass durch chemische Modifikationen deren biologische Funktion zuverlässig inaktiviert wird und auch zellspezifisch vollständig wiederhergestellt werden kann. Erfindungsgemäß werden mehrere Peptide oder Polymere so an Nukleotidmoleküle gebunden, dass deren räumliche Struktur sich so stark verändert wird, dass deren biologische Funktion nicht mehr gewährleistet wird bzw. sich an die Nukleinsäuren normalerweise anlagernde Moleküle keinen Zugang mehr zu den Nukleinsäuren finden. Anwendung finden diese Moleküle insbesondere bei der zellspezifischen Beeinflussung von Zellen durch die Einbringung von Nukleinsäuren.

Description

Beschreibung der Erfindung
Neue zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren
Anwendung
Die Erfindung betrifft neue biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von Nukleotiden, mit denen gezielt in bestimmten Zellen die Expression von Genen indiziert oder vermindert werden kann, sowie einen Applikationskit zur Anwendung.
Durch die Einbringung von Nukleinsäuren Zellen kann erreicht werden, dass in diesen Zellen entweder die, auf den eingebrachten DNA-Sequenzen kodierten Gene oder Genabschnitte, Proteine oder Proteinbruchstücke, sowie kürzere oder längere Peptide produziert werden; oder im Fall der Einbringung von interferrierenden RNA-Molekülen die Expression eines spezifisch- der RNA komplimentären Genabschnittes unterdrückt wird. Eine Hemmung der Expression von Genen kann unter Anderem durch die Einbringung von siRNA (engl, short interfering RNA) oder miRNA (microRNA) erreicht werden. SiRNA-Moleküle können klassischer Weise nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens interagieren und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC" (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt.
Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19-23bp), doppelsträngi- gen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 41 1(6836), 494-8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective Inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921-7; US 5,898,031 A; US 7,056,704 B2).
Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing).
Für derzeitige Anwendungen von siRNA wird häufig angestrebt, ausschließlich die Expression eines einzigen Gens in einer Zelle zu unterdrücken. Effekte, bei denen mehrere Gene gleichzeitig oder unspezifisch ausgeschalten werden sind somit nicht erwünscht, weshalb die Sequenzen der siRNA so gestaltet werden, dass diese Effekte unterbunden werden.
Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.:„Ligand-Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006) oder durch Bindung kurzer Peptide, welche zellspezifisch abgespalten werden eine Zellspezifität zu erreichen (WO 2008/098569 A2). Durch den Einsatz dieser modifizierten siRNA Moleküle kann erreicht werden, dass selektiv in bestimmten Zellen die Expression von Genen reduziert bzw. unterbunden wird.
Diese Methoden für die gezielte Wirkung von Nukleinsäuren ist allerdings oft auf kurze Nukleinsäuresequenzen beschränkt; bei längeren Sequenzen besteht das Problem, dass die Moleküle instabil sind und dadurch nicht über ein gerichtetes Delivery effizient in Zellen eingebracht werden können; die bekannte Bindung von kurzen Peptiden an die Enden längerer Nukleinsäuren und deren zellspezifische Abspaltung führt häufig nicht zu dem gewünschten zeilspezifischen Effekt, da die Bindung von Peptiden an das Ende einer langen RNA- oder DNA-Sequenz nicht zu einer ausreichenden Inaktivierung führt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, lange Nukleinsäuremoleküle so zu modifizieren, dass durch chemische Modifikationen deren biologische Funktion zuverlässig inaktiviert wird und auch zellspezifisch vollständig wiederhergestellt werden kann.
Erfindungsgemäß werden mehrere Peptide oder Polymere so an Nukleotidmoleküle gebunden, dass deren räumliche Struktur sich so stark verändert wird, dass deren biologische Funktion nicht mehr gewährleistet wird bzw. sich an die Nukleinsäuren normalerweise anlagernde Moleküle keinen Zugang mehr zu den Nukleinsäuren finden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle mit einer Länge von mehr als 21 Basen zur Einbringung in Zellen gelöst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid-Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden sind, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird. In einer Ausführungsform kann zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid oder Polymer zwischen die Enden der Nukleotide gebunden werden. In einer alternativen Ausfuhrungsförm kann zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid oder Polymer so an das Rückgrad der Nukleotide gebunden werden, dass beide Enden aneinander gebunden sind. In einer weiteren Ausführungsform sind auch solche Konstrukte vorgesehen, bei denen zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid oder Polymer zwischen die Enden der Nukleotide und zudem mindestens ein Peptid oder Polymer so an das Rückgrad der Nukleotide gebunden wird, dass beide Enden aneinander gebunden sind.
Im Kern basiert die vorliegende Erfindung also insbesondere im Sinne des vorgehenden darin, dass lange Nukleinsäuremoleküle so gestaltet sind, dass durch chemische Modifikationen deren biologische Funktion zuverlässig inaktiviert wird und auch zellspezifisch vollständig wiederhergestellt werden kann. Unter dem Begriff „lange Nukleotid-Moleküle" oder „lange Nukleinsäuremoleküle" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind nicht nur solche umfasst, die eine Länge von mehr als 21 Basen haben. Insbesondere sind auch solche Nukleotid-Moleküle oder Nukleinsäuremoleküle umfasst, die eine Länge von mehr als 23 Basen haben. Bevorzugt sind solche Nukleotid-Moleküle oder Nukleinsäuremoleküle, die eine Länge von mehr als 25 Basen haben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind lange Nukleinsäuremoleküle im Sinne der Erfindung durch chemische Modifikationen so modifiziert, dass deren biologische Funktion zuverlässig inaktiviert wird und auch zellspezifisch vollständig wiederhergestellt werden kann, wobei diese Nukleinsäuremoleküle oder Nukleotidmoleküle eine Länge von mehr als 30, 40, 50 oder mehr Basen haben.
Erfindungsgemäß werden aber auch einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle zur Einbringung in Zellen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid- Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird, wobei insbesondere Moleküle mit einer Länge bereitgestellt werden, die im Bereich von 23 bis 10.000 Basen liegen.
Besonders bevorzugt sind Längen der erfindungsgemäßen Nukleotid-Moleküle oder Nukleinsäuremoleküle, die im Bereich von 23, 25 30, 40 oder 50 bis 100 Basen liegen, insbesondere im Bereich von 23 bis 100 Basen. Diese Längen findet man typischerweise bei Nukleotid-Molekülen oder Nukleinsäuremolekülen aus der Gruppe der sh NAs, miRNAs und antisense-Nukleotiden, sind aber nicht auf diese beschränkt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden auch einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle zur Einbringung in Zellen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid-Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird, wobei insbesondere Moleküle mit einer Länge bereitgestellt werden, die bevorzugt im Bereich von 100 bis 2.000 Basen liegen. Diese Längen findet man typischerweise bei Nukleotid-Molekülen oder Nukleinsäuremolekülen aus der Gruppe der synthetischen mRNAs, Spiegelmere und Aptamere, sind aber nicht auf diese beschränkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden auch einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle zur Einbringung in Zellen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Nukleotid-Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird, wobei insbesondere Moleküle mit einer Länge bereitgestellt werden, die bevorzugt im Bereich von 2.000 bis 10.000 Basen liegen. Diese Längen findet man typischerweise bei Nukleotid-Molekülen oder Nukleinsäuremolekülen wie mRNAs, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Im Gegensatz zu beschriebenen Methoden, bei denen kurze Nukleotid-Moleküle durch Bindung von Peptiden oder Polymeren biologisch inaktiviert werden, was auf die Struktur der Peptide zurückzuführen ist, wird in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, dass die Peptide oder Polymere so gestaltet werden, dass sich die Struktur der Nukleotide ändert und dadurch deren biologische Aktivität inhibiert wird. Werden die Peptide oder Polymere durch spezifische Enzyme von den Nukleotiden abgespalten, kehren diese in ihre ursprüngliche Struktur zurück und entfalten ihre normale biologische Aktivität.
Die Abspaltung durch spezifische Enzyme kann insbesondere dadurch induziert werden, dass diese bei spezifischen Krankheits- oder Entwicklungszuständen von Zellen (insbesondere Zellzyklus oder Ausdifferenzierung bei Stammzellen), spezifisch für bestimmte Zellarten oder krankheitsrelevante Veränderung derer (insbesondere Entartung oder Infektion) oder genotypspezifisch Aktivität zeigen. Des Weiteren kann eine spezifische Abspaltung zur Detektion bestimmter Enzyme oder bei den erwähnten Anwendungen erfolgen.
Spezifische Enzyme können hierbei beispielsweise Proteasen oder Peptidasen (Caspasen, Aminopeptidasen oder Serinproteasen; im Speziellen Caspase-1, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, KL 4, PLAP, IRAP, uPA, FAP- α oder virale PRoteasen, beispielsweise HIV-Protease, Coxsackievirus-Protease, Epstein- Barr-Viras-Protease, Hepatisis-A, -B, -C Virus-Protease), Nukleasen, Glycosidasen, Saccharasen oder Chitinasen sein.
Durch die beschriebene Bindung von Peptiden oder Polymeren beispielsweise an micro- (mi-) RNA kann erreicht werden, dass normalerweise auftretende 3d-Strukturen durch Sequenzhomologien verändert werden. Bei der Bindung von Peptiden oder Polymeren an mRNA kann beispielsweise erreicht werden, dass die Initiationsstellen für die Anlagerung von Ribosomen an die mRNA zur Translation verdeckt und so das auf der mRNA codierte Protein nicht exprimiert wird.
Die Auswahl der Bindungen von Peptiden oder Polymeren ist dabei nicht auf die Enden der Nukleotid-Moleküle beschränkt, sondern können auch an den Zuckermolekülen der Nukleotide, den Phosphaten oder den organischen Basen erfolgen.
Wie bereits oben erwähnt ist die Natur der einzel- oder doppelsträngigen Nukleotid- Moleküle der vorliegenden Erfindung nicht auf bestimmte Nukleinsäuremolekül- oder Nukleotid-Molekül-Spezies limitiert. So kann das erfindungsgemäße einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Molekül eine mRNA, eine DNA, eine shRNA oder eine PNA sein. Das erfindungsgemäße einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Molekül kann aber auch ein Aptamer oder ein Spiegelmer sein. In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen einzel- oder doppelsträngigen Nukleotid-Moleküle immunstimulierende RNAs sein. Außerdem wird das erfindungsgemäße einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Molekül nicht nur in Form einer der vorgenannten einzelnen Nukleotid-Molekül-Spezies bereitgestellt. Vielmehr werden in einer bevorzugten Ausführungsform auch Mischungen oder Mischformen aus den einzelnen Spezies (mRNA, DNA, shRNA, PNA, immunstimulierende RNA, Aptamer und/oder Spiegelmer) der erfindungsgemäßen einzel- oder doppelsträngigen Nukleotid-Moleküle bereitgestellt.
Der Begriff„Aptamer" umfasst kurze einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide, die in der Lage sind, ein spezifisches Molekül über ihre dreidimensionale Struktur binden können. Der Begriff „Spiegelmer" umfasst L-Ribonukleinsäureaptamere (kurz L-RNA- Aptamere). L-Ribonukleinsäureaptamere sind der Ribonukleinsäure (RNA) ähnliche Moleküle, die aus unnatürlichen L-Ribonukleotiden aufgebaut sind. Sie sind künstliche Oligonukleotide und stereochemische Spiegelbilder natürlicher Oligonukleotide. L- Ribonukleinsäureaptamere stellen somit eine spezielle Form der Aptamere dar und können wie diese spezifische Moleküle über ihre dreidimensionale Struktur binden. L- Ribonukleinsäureaptamere sind unter dem Markennamen„Spiegelmer" bekannt.
Unter immunstimulierenden RNAs im Sinne der Erfindung werden RNA-Moleküle verstanden, die in der Lage sind, mit zelleigenen Molekülkomplexen, beispielsweise RIG-I (RIG-I („retinoic acid-inducible gene 1") ist ein RIG-I-like receptor dsRNA Helicase- Enzym, das Mitglied der Familie der RIG-I-like Rezeptoren (RLR) ist) zu interagieren. Durch die Interaktion wird eine Signaltransduktionskette aktiviert und/oder eine Immunreaktion und/oder Apoptose ausgelöst (siehe zur Übersicht Kawai und Akira, Ann N Y Acad Sei 1 143: 1-20 (2008) und Schlee et al., Immunol Rev. 227(l):66-74 (2009)). Diese immunstimulatorischen RNAs können außerdem durch eine 5"Triphosphat gekennzeichnet sein.
Vorteilhaft ist ein Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der biologisch wirksamen Nukleotid-Moleküle, bestehend zumindest aus
- wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das biologisch wirksame Molekül enthält und weiter enthalten kann:
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle oder das Transfektionssystem enthält,
- Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B und C
- eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
- eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig.l : Beispielhafte und schematische Darstellung einer mRNA (la), an die sich in der bekannten Art und Weise biologische Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) anlagern und dadurch einen biologischen Prozess auslösen. Des Weiteren ist die Modifikation der mRNA (lb) durch beispielsweise ein Peptid (3a) dargestellt, wodurch die Anlagerung der biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) und damit die Auslösung eines biologischen Prozesses verhindert wird. Werden das oder die Peptide (3a) wieder von der mRNA abgespalten, können sich die biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe (2) wieder in der bekannten Form an die mRNA (la) anlagern und die bekannten biologischen Prozesse auslösen.
Fig.2: Beispielhafte und schematische Darstellung einer mRNA (la), an die sich in der bekannten Art und Weise biologische Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) anlagern und dadurch einen biologischen Prozess auslösen. Des Weiteren ist die Modifikation der mRNA (lb) durch beispielsweise ein Peptid (3b) dargestellt, wodurch sich die räumliche Struktur der mRNA derart ändert, dass die Anlagerung der biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe, beispielsweise Ribosomen (2) und damit die Auslösung eines biologischen Prozesses verhindert wird. Dabei kann dieser Prozess durch die Bildung von Doppelsträngen der RNA durch zufällige oder entsprechend geplante Homologien unterstützt werden. Werden das oder die Peptide (3b) wieder teilweise oder vollständig von der mRNA abgespalten, ändert sich die Raumstruktur der mRNA wieder und es können sich die biologischen Moleküle oder Molekülkomplexe (2) wieder in der bekannten Form an die mRNA (la) anlagern und die bekannten biologischen Prozesse auslösen.
In Fig. 1 ist der beispielhafte Mechanismus anhand einer mRNA (la) dargestellt. Dabei lagern sich normalerweise beispielsweise Ribosomen (2) an die mRNA an und lösen dadurch einen biologischen Prozess; im Falle von Ribosomen die Translation aus. Durch die Modifikation der beispielhaften mRNA (lb) durch ein gebundenes beispielhaftes Peptid (3a) wird die Anlagerung beispielsweise der Ribosomen (2) verhindert. Dadurch kann im Falle von Ribosomen (2) keine Translation dieser mRNA (lb) passieren. Bei Abspaltung des Peptides (3 a) beispielsweise durch ein Enzym wird die Anlagerung des beispielhaften Ribosomes (2) an die mRNA (la) nicht mehr verhindert und es findet der normale biologische Prozess, im Falle von Ribosomen die Translation statt. Dabei kann die Bindung des Peptides (3 a) an der Initiationsstelle von den beispielhaften Ribosomen oder an einer anderen Stelle der mRNA erfolgen; entsprechend der Bindungsstelle wird entweder die Anlagerung der Ribosomen (2) oder das vollständige Ablesen der beispielhaften mRNA verhindert. In jedem Falle aber kann die normale biologische Funktion der mRNA bei Bindung des beispielhaften Peptides nicht mehr erfolgen.
In Fig. 2 ist eine weitere Möglichkeit des beispielhaften Mechanismus anhand einer mRNA (la) dargestellt. Dabei lagern sich normalerweise beispielsweise Ribosomen (2) an die mRNA an und lösen dadurch einen biologischen Prozess; im Falle von Ribosomen die Translation aus. Durch die Modifikation der beispielhaften mRNA (lc) durch ein gebundenes beispielhaftes Peptid (3b) wird die Raumstruktur der beispielhaften mRNA derart verändert, dass die Anlagerung beispielsweise der Ribosomen (2) verhindert wird. Dadurch kann im Falle von Ribosomen (2) keine Translation dieser mRNA (lc) passieren. Bei Abspaltung des Peptides (3b) beispielsweise durch ein Enzym wird die Anlagerung des beispielhaften Ribosomes (2) an die mRNA (la) nicht mehr verhindert und es findet der normale biologische Prozess, im Falle von Ribosomen die Translation statt.
Anwendungsbeispiele:
1) Induktion der Produktion toxischer Proteine in Zielzellen: Die RNA kann so gewählt werden, dass ihre Sequenz für einen oder mehrere Abschnitte eines toxischen Proteins oder Peptids oder für ein gesamtes toxisches Protein oder Peptid kodiert. Beispiele sind bakterielle Toxine wie beispielsweise Diphterie, Anthrax A, Anthrax B, Botulinum toxin oder Toxine höherer Lebewesen (Kegel Schnecken, Schlangen, Echsen, Insekten, Spinnen, Skorpione).
2) Induktion der Produktion von Allergenen in Zielzellen, insbesondere in Kombination mit Transportsequenzen, die für ein Display der Allergene an der Zelloberfläche sorgen, so dass sie für das Immunsystem zugänglich werden. Besonders bevorzugt ist es, das Allergen mit einer HLA Sequenz zu kombinieren, insbesondere sequenziell hintereinander oder das Allergen an einer Stelle im Inneren der HLA Sequenz, so dass Allergen und HLA gemeinsam an der Zelloberfläche präsentiert werden. Als Allergen eignen sich insbesondere nichthumane Allergene wie beispielsweise Ambrosia.
3) Spezifische Induktion der Produktion von HLA Proteinen, die an der Zelloberfläche präsentiert werden beispielsweise zur Induktion von Immuntoleranz nach Transplantationen von Geweben oder Organen (Transplantationsmedizin).
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen mRNA
la, lb inhibierte mRNA
2 Ribosom
3 a, 3b Peptid

Claims

Patentansprüche
1. Einzel- oder doppelsträngige Nukleotid-Moleküle mit einer Länge von mehr als 21 Basen zur Einbringung in Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid- Moleküle zu deren Inaktivierung zumindest an ein Peptid oder Polymer gebunden ist, welches die biologische Wirkung dieser Moleküle inhibiert und welches durch Enzyme abgespalten werden kann und dadurch die biologische Wirkung wieder hervorgerufen wird.
2. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid gebunden wird, welches die Spaltsequenz von Proteasen enthalten.
3. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid so an das Rückgrad der Nukleotide gebunden wird, dass beide Enden aneinander gebunden werden.
4. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Peptid zwischen die Enden der Nukleotide gebunden wird.
5. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle mindestens ein Polymer gebunden wird, welches durch Enzyme abgespalten werden kann.
6. Nukleotid-Moleküle gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Inhibierung der Nukleotid-Moleküle eine Kombination aus mindestens einem Polymer und mindestens einem Peptid gebunden wird, welche durch Enzyme abgespalten werden können.
7. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine mRNA ist.
8. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine miRNA ist.
9. Nukleotid-Moleküle einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine DNA ist.
10. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine shRNA ist.
11. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleotid-Molekül eine PNA ist.
12. Nukleotid-Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotid-Moleküle weitere Modifikationen, insbesondere LNAs, enthalten.
13. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung Nukleotid-Moleküle gemäß Ansprüchen 1 bis 10, bestehend zumindest aus
- wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche das Nukleotid-Molekül enthält und weiter enthalten kann:
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Zell-penetrierende Peptide, Nanopartikel, Polyethylenimine oder Lipide,
- mindestens eine weitere Ampulle (Ampulle C) welche weitere Bestandteile zur Bindung an die biologisch wirksamen Moleküle oder das Transfektionssystem enthält,
- Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A, B, - eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
- eine Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung.
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