WO2014058080A1 - 体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及び細胞作製キット - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for enhancing reprogramming of somatic cells and a kit for producing reprogrammed cells.
- iPS cells induced pluriopotent stem cells
- IPS cells are prepared by allowing a predetermined nuclear reprogramming factor to act on somatic cells. Therefore, iPS cells have fewer ethical problems than embryonic stem cells (ES cells) established from early embryos.
- ES cells embryonic stem cells
- Various methods have been reported so far as methods for producing iPS cells. For example, as a representative method, introduction of four transcription factor groups can be mentioned (Patent Document 1). However, in the approach of Patent Document 1, undesired phenomena such as inducing cell canceration have been reported depending on the type of gene to be artificially expressed.
- an iPS cell or a tissue prepared from the iPS cell is transplanted into a human body for treatment or the like, an artificially expressed gene and a vector in which the gene is incorporated may affect the human body. I cannot deny sex.
- Non-Patent Document 1 describes the use of a combination of one transcription factor that is artificially expressed and a predetermined compound for the purpose of reprogramming human-derived somatic cells.
- the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a method for enhancing cell reprogramming without requiring gene introduction, and use thereof.
- the present invention includes any of the following contents.
- a method for enhancing reprogramming of somatic cells comprising an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and a 3′-phosphoinositide dependent protein kinase-1
- somatic cells in contact with an abiotic substrate having an elastic modulus in the range of 0.1 kPa to 200 kPa
- a method comprising a culture step of culturing.
- An abiotic substrate having an elastic modulus of 0.1 kPa to 200 kPa, an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and A kit for preparing a reprogrammed cell comprising at least one factor selected from the group of factors consisting of an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1.
- a method for producing a cell with enhanced reprogramming comprising an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and a 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase—
- somatic cells in contact with an abiotic substrate having an elastic modulus in the range of 0.1 kPa to 200 kPa
- a method comprising culturing a cell.
- A a substrate for cell culture, (b) an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and 3′- A cell culture medium comprising at least one factor selected from a group of factors consisting of an activator of phosphoinositide-dependent protein kinase-1, and (c) an elastic modulus of 0.1 kPa or more immersed in the cell culture medium And a non-biological substrate that is within a range of 200 kPa or less.
- the present invention has an advantage that the reprogramming of somatic cells can be promoted with high efficiency and speed, while having the advantage that introduction of foreign genes can be completely removed as compared with the prior art.
- Example of this invention it is a figure which shows the state by which the iPS-like colony was induced
- the method according to the present invention is a method for enhancing reprogramming of somatic cells, At least selected from the group consisting of an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1.
- It comprises a culturing step of culturing somatic cells in contact with an abiotic substrate having an elastic modulus of 0.1 kPa or more and 200 kPa or less. Note that this method can also be regarded as a method of producing cells with enhanced reprogramming using somatic cells as starting cells.
- enhanced reprogramming of somatic cells refers to a state in which the expression level of a gene serving as an undifferentiated marker is enhanced compared to the starting cell (somatic cell). That is, it can be considered that the starting cell is brought into a different stage of differentiation (including an undifferentiated state).
- the cell morphology is determined using microscopic observation or a cell sorter, a change in cell morphology is observed.
- genes that are undifferentiation markers include, but are not limited to, Nanog gene, Oct3 / 4 gene, Tbx3 gene, Sox2 gene, SSEA3 gene, Klf4 gene, Rex1 gene, and Stella gene.
- the undifferentiated marker is arbitrarily selected by those skilled in the art, but is preferably both the Nanog gene and the Oct3 / 4 gene.
- the Oct3 / 4 gene is preferably in a positive state in which expression is particularly increased.
- change in cell morphology broadly refers to changes that occur in the morphology of somatic cells as starting cells as somatic cell reprogramming increases.
- somatic cell that is the starting cell is an adherent cell
- the target somatic cell is brought into a state showing multipotency or an earlier state, more preferably totipotency ( pluripotency) or an earlier state.
- multipotency refers to the ability to differentiate into some cell types such as the nervous system or hematopoietic system.
- totipotency refers to the ability to differentiate into all cells and tissues that constitute an individual, although the individual itself cannot be constituted.
- the “cell with enhanced reprogramming” obtained by the method of the present invention is a cell in which the expression of the undifferentiated marker is positive, or a cell in which the expression level of the undifferentiated marker is enhanced compared to the starting cell. is there.
- the “cell with enhanced reprogramming” is preferably a nuclear reprogramming cell. Comparison of presence or absence of teratoma formation ability, presence or absence of ES cell-like colony formation, or positive target (ES cell or iPS cell (induced pluripotent stem cell) prepared by conventional technology)
- the expression level of the undifferentiated marker can be used as an index, but is not limited thereto.
- the differentiation ability and undifferentiation proliferation ability of the separated nuclear reprogramming cells can be easily confirmed by using confirmation means widely used for ES cells.
- An “iPS cell” is a cell having properties close to those of an ES cell (Embryonic® Stem® Cell). More specifically, it is an undifferentiated cell, which has pluripotency and undifferentiated proliferation depending on culture conditions. Including cells having the ability.
- cells with enhanced reprogramming obtained by the method of the present invention is not particularly limited.
- the use of tests and research similar to ES cells the use of drug screening (somatic cells of the liver system), It can be used for cell therapy / tissue therapy (autologous cell / autologous tissue transplantation, allogeneic cell / transgenic tissue transplantation) and the like.
- the base material for culturing somatic cells is abiotic and has an elastic modulus in the range of 0.1 kPa to 200 kPa. More specifically, the substrate is abiotic means that the substrate is not a cell or a cell construct.
- the cell construct refers to a construct formed as an aggregate of cells such as a cell sheet and a tissue.
- Examples of the abiotic base material having an elastic modulus of 0.1 kPa or more and 200 kPa or less include hydrous gel (hydrogel), silicone, gelatin, and collagen gel. Is preferred.
- Water-containing gels are: acrylamide polymer; acrylic acid polymer; methacrylic acid polymer; alginic acid gel such as calcium alginate gel and magnesium alginate gel; kappa type or iota type carrageenan gel; native type or deacyl type gellan gum gel
- An organic polymer that constitutes the hydrogel such as containing a predetermined amount of an aqueous liquid.
- acrylamide polymer hydrogels are preferred.
- R 1 , R 2 , and R 3 are structures outside the basic skeleton and are not particularly limited.
- a hydrocarbyl group such as a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, an alkyl group, and an alkoxy group Group.
- the number of carbon atoms in the hydrocarbyl group and alkoxy group is preferably in the range of 1 to 10, and more preferably in the range of 1 to 5.
- Examples of monomers having a basic skeleton of acrylamide include acrylamide (AAm), N, N′-methylenebisacrylamide, N-isopropylacrylamide, hydroxyethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, and dimethyl. Examples thereof include aminopropylacrylamide and dimethylaminopropylacrylamide quaternized products or salts thereof.
- the abiotic substrate is a hydrogel as a monomer homopolymer or copolymer
- a crosslinking agent that crosslinks the polymers, and polymerization initiation An agent or the like may be included.
- the elastic modulus of the abiotic substrate may be in the range of 0.1 kPa or more and 200 kPa or less, but from the viewpoint of reprogramming efficiency, it is preferably in the range of 0.1 kPa or more and 100 kPa or less, More preferably, it is in the range of 0.1 kPa to 10 kPa, more preferably in the range of 0.1 kPa to 4 kPa, 0.1 kPa to 3 kPa to 3.5 kPa, or More preferably, it is in the range of 0.1 kPa or more and less than 3 kPa, particularly preferably in the range of 0.1 kPa or more and 1 kPa to 1.5 kPa, or more preferably 0.2 kPa or more and 1 kPa or less.
- the elastic modulus of the substrate is less than 0.1 kPa, or exceeds 200 kPa, the efficiency of somatic cell reprogramming is significantly reduced, or reprogramming does not proceed at all.
- a base material is a water-containing gel, it is easy to obtain the base material of a desired elasticity modulus by adjusting the water content or the crosslinking degree between polymers.
- the elastic modulus of the abiotic substrate may be measured by a method according to the type of the substrate.
- measurement may be performed by, for example, a method of calculating from the sinking amount of the weight or a method of stress measurement using an AFM (atomic force microscope).
- P is the weight load (unit N)
- a is the radius (unit m) of the bottom surface of the weight (contact surface with the hydrous gel)
- ⁇ h is the sinking amount of the weight (unit m)
- ⁇ is the sample. This is the Poisson's ratio of the water-containing gel. In the case of the water-containing gel used in Example 1 described later, ⁇ is 0.45.
- the hydrogel In the case of stress measurement by AFM, after placing the hydrogel in water or an aqueous solution and sufficiently swelling (substantial saturated swelling state), the hydrogel is pushed by an AFM cantilever whose elastic modulus is known, Measure the deflection of the AFM cantilever.
- the elastic modulus E (unit Pa) of the water-containing gel is determined from the value of the stress F (unit m) determined from the deflection of the AFM cantilever and the distance ⁇ (unit m) by which the water-containing gel is pushed in, using the following equation.
- ⁇ is the angle of the tip of the AFM cantilever (opening angle: unit degree)
- ⁇ is the Poisson's ratio of the sample (0.45 in the example).
- ⁇ is 1 ⁇ m or less when measuring the elastic modulus.
- the thickness of the abiotic substrate is not particularly limited, but is preferably in the range of 10 ⁇ m or more and 5 mm or less, and preferably in the range of 200 ⁇ m or less from the viewpoint of fluorescence observation.
- the abiotic substrate may be fixed in the form of a film on the surface of the cell culture substrate, for example.
- the substrate for cell culture include a dish for cell culture, a well plate for cell culture, and the like, and a configuration in which the base material is fixed to the bottom of the dish or the bottom of the well of the well plate is exemplified. .
- the surface of the abiotic substrate may be provided with a coating that serves as a scaffold for somatic cells, such as a gelatin coat, a collagen coat, and a laminin coat.
- a crosslinker that crosslinks the non-biological substrate and the coating material may be provided.
- the type of the crosslinker may be appropriately selected according to the material of the base material. However, when the base material is an acrylamide polymer, crosslinkers such as Sulfo-SANPAH (Pierce), Sulfo-SMCC, and GMBS are listed. It is done.
- histone deacetylase inhibitor is not particularly limited, and specific examples include trichostatin A, butyric acid, apicidin, valproic acid, and NaB. Of these, trichostatin A may be preferred.
- the said inhibitor may use only 1 type and may be used in combination of 2 or more type.
- the amount of the inhibitor used is not particularly limited as long as the effect of enhancing reprogramming of somatic cells is obtained, but the concentration in the cell culture medium in the culturing step is, for example, in the range of 0.1 nM to 10 mM, and 1 nM Above, it is preferably in the range of 1 mM or less, more preferably in the range of 2 nM or more and 0.5 mM or less.
- NaB is used as the inhibitor, it is, for example, within a range of 10 ⁇ M or more and 10 mM or less, preferably within a range of 0.1 mM or more and 1 mM or less, and within a range of 0.2 mM or more and 0.5 mM or less.
- trichostatin A is used as the inhibitor, it is, for example, in the range of 1 nM to 100 nM, preferably in the range of 2 nM to 50 nM, preferably in the range of 5 nM to 30 nM. More preferred.
- TGF- ⁇ receptor inhibitor is not particularly limited. Specifically, for example, A-83-01 (3- (6-Methylpyridin-2-yl) -1-phenylthiocarbamoyl-4-quinolin-4- ylpyrazole), SB431542 (manufactured by Stemgent), and LY2157299 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Of these, A-83-01 may be preferred.
- the inhibitor may preferably be a type I inhibitor. The said inhibitor may use only 1 type and may be used in combination of 2 or more type.
- the amount of the inhibitor used is not particularly limited as long as the effect of enhancing somatic cell reprogramming is obtained, but the concentration in the cell culture medium in the culturing step is, for example, in the range of 0.1 nM to 1 mM, and 1 nM Above, it is preferably within the range of 100 ⁇ M or less, and more preferably within the range of 10 nM or more and 10 ⁇ M or less.
- A-83-01 is used as the inhibitor, it is preferably in the range of 10 nM to 1 mM, preferably in the range of 50 nM to 200 ⁇ M, and preferably in the range of 100 nM to 100 ⁇ M. Is more preferable.
- SB431542 When SB431542 is used as the inhibitor, for example, it is in the range of 100 nM to 100 ⁇ M, preferably in the range of 200 nM to 50 ⁇ M, more preferably in the range of 500 nM to 20 ⁇ M. .
- LY2157299 When LY2157299 is used as the inhibitor, it is preferably in the range of 1 nM to 10 ⁇ M, preferably in the range of 10 nM to 1 ⁇ M, and more preferably in the range of 50 nM to 200 nM. .
- the type of the MAPK / ERK pathway inhibitor is not particularly limited. Specifically, for example, PD0325901 (N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro -4-iodophenyl) amino] -benzamide), U0126 (Promega), 5-Iodotubercidin (Merck) and the like. Among these, PD0325901 may be preferable.
- the said inhibitor may use only 1 type and may be used in combination of 2 or more type.
- the amount of the inhibitor used is not particularly limited as long as the effect of enhancing somatic cell reprogramming is obtained, but the concentration in the cell culture medium in the culturing step is, for example, in the range of 0.1 nM to 1 mM, and 1 nM Above, it is preferably within the range of 100 ⁇ M or less, and more preferably within the range of 10 nM or more and 10 ⁇ M or less.
- PD0325901 is used as the inhibitor, it is, for example, in the range of 0.01 ⁇ M or more and 1 mM or less, preferably in the range of 0.05 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less, and in the range of 0.1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
- U0126 is used as the inhibitor, it is, for example, in the range of 1 nM or more and 10 ⁇ M or less, preferably in the range of 10 nM or more and 1 ⁇ M or less, and more preferably in the range of 50 nM or more and 200 or less. .
- the type of activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 is not particularly limited. Specifically, for example, PS48 ((2Z) -5- (4-Chlorophenyl) -3-phenyl -2-pentenoic acid).
- the activator may preferably be one that specifically binds to the HM / PIF pocket of PDK-1 and activates PDK-1.
- the activator may be used alone or in combination of two or more.
- the amount of the activator used is not particularly limited as long as the effect of enhancing somatic cell reprogramming is obtained, but the concentration in the cell culture medium in the culturing step is, for example, in the range of 0.01 ⁇ M or more and 1 mM or less, The range is preferably 0.1 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less, more preferably 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
- Combination of inhibitors and activators One from at least two of an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1. It is preferable to select and use two or more types of factors in combination, more preferably to select and use one or more types of factors from at least three, and more preferably to select one or more types of factors from four. It may be more preferable to use in combination. When these are used in combination, an example of a preferable combination is a combination of NaB, A-83-01, PD0325901, and PS48. Another example of a preferred combination is a combination of trichostatin A, A-83-01, PD0325901, and PS48. Yet another example of a preferred combination is a combination of NaB, PD0325901, and PS48.
- it preferably contains at least an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, more preferably contains at least an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase— More preferably, it contains at least one activator, and particularly preferably contains at least an inhibitor of histone deacetylase. In another embodiment, it preferably comprises an inhibitor of histone deacetylase, more preferably further comprises an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1, and the MAPK / ERK pathway It is further preferable to further include an inhibitor of the above, and it is particularly preferable to further include an inhibitor of TGF- ⁇ receptor. In still another embodiment, it is preferable that at least trichostatin A is included.
- the following condition 1) When one or more factors are selected from one, two, or three of the above, it is most preferable to satisfy at least the following condition 1), and at least satisfy the following 2) condition: Preferably, it may be further preferable to satisfy at least the following condition 3). That is, an embodiment in which the following conditions 1) and 2) are simultaneously satisfied, or an aspect in which the following conditions 1) to 3) are simultaneously satisfied may be particularly preferable embodiments.
- One or more factors are selected from histone deacetylase inhibitors. 2) Select one or more factors from the activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1. 3) Select one or more factors from inhibitors of the MAPK / ERK pathway.
- the “somatic cell” to be reprogrammed that is, the type and origin of the starting cell is not particularly limited, and any somatic cell can be used.
- the type of somatic cell may be any cell other than germ cells, for example, keratinized epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface layer), exocrine secretion Glandular epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, adrenal medullary cells), metabolism / storage cells (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that constitute the interface (eg, type I alveoli) Cells), lumenal epithelial cells (eg, vascular endothelial cells), cilia cells with carrying ability (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts), contraction Sex
- somatic stem cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
- fibroblasts In a preferred embodiment, fibroblasts, synovial cells, keratinocytes, amniotic cells, endometrial cells, glial cells, astrocytes, meningeal cells, bone marrow derived myeloids that have been reported to establish induced pluripotent stem cells Cells, peripheral blood-derived CD34 positive blood cells, bone marrow mononuclear cells, T cells, natural killer T cells, natural killer cell lymphoma (NK cell lymphoma), B lymphocytes, umbilical vein endothelial cells, pancreatic ⁇ cells, testis-derived cells, Examples include natural killer tooth embryo-derived cells, mesentery-derived cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, stem cells, and adipose stem cells. Somatic cells may be primary culture cells or subculture cells. The origin of somatic cells may be derived from a mature individual in addition to those derived from a fetus (fetal) individual, for example.
- the animal species from which the somatic cell is derived is not particularly limited, but a somatic cell derived from a mammal (mammal) is preferable in consideration of industrial use such as cell therapy / tissue therapy.
- a somatic cell derived from a mammal is preferable in consideration of industrial use such as cell therapy / tissue therapy.
- the kind of mammal is not specifically limited, Experimental animals such as primates excluding mice, rats, rabbits, guinea pigs and humans; Pet animals such as dogs and cats; Domestic animals such as cows and horses; . Particularly in clinical application, human-derived tissue or cells are preferred.
- somatic cells differentiated from cells whose reprogramming has been enhanced by the present invention or somatic cells differentiated from iPS cells established by a conventional technique, “somatic cells” that are targets of enhanced reprogramming by this method.
- somatic cells that are targets of enhanced reprogramming by this method.
- Can be treated as A preferred embodiment of the somatic cell is the same as described above.
- somatic cells obtained by enhancing reprogramming of somatic cells preferably nuclear reprogramming cells
- somatic cells isolated from the patient it may be desirable to use somatic cells isolated from the patient in some aspects, For example, somatic cells involved in disease or somatic cells involved in disease treatment can be used.
- Methods for enhancing reprogramming of somatic cells include inhibitors of histone deacetylase, inhibitors of TGF- ⁇ receptor, inhibitors of MAPK / ERK pathway, and 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase -1 (PDK-1) activator in the presence of at least one factor selected from the factor group, somatic cells are cultured in contact with the abiotic substrate having a predetermined elastic modulus.
- the method includes a culturing step.
- the predetermined elasticity described above A method comprising a culturing step of culturing somatic cells in contact with a non-biological substrate.
- the non-biological substrate is placed in a liquid cell culture medium, and culturing is performed with somatic cells in contact with the surface of the substrate.
- a cell culture medium for iPS cells or a cell culture medium for ES cells can be appropriately used.
- ESGRO trade name of Millipore
- ReproFF trade name manufactured by Reprocell
- the culture conditions in the culture step are not particularly limited, and may be set according to, for example, a known method for producing iPS cells (Reference Document 1 etc.).
- the culture period is, for example, 2 to 30 days, The period is preferably 3 to 20 days, and more preferably 4 to 10 days.
- the culture temperature is, for example, 35 ° C to 39 ° C, preferably 35.5 ° C to 38.5 ° C, and more preferably 36 ° C to 38 ° C.
- Reference 1 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblastsby defined factors. Cell 131 (5): 861-72.
- At least one selected factor is added to be present in the cell culture medium. More specifically, the “additive” may be added to the cell culture medium and mixed, and then provided to the abiotic substrate, or the cell culture medium may be supplied to the abiotic substrate. After that, the “additive” may be added, or the “additive” is contained in the abiotic base material, and the “additive” is supplied to the cell culture medium through the base material. You may be made to do.
- the culture step can be performed without introducing any gene involved in reprogramming into the somatic cell as the starting cell.
- a culture system for performing the culture step is as described above: 1) a substrate for cell culture (for example, a culture container such as a dish), 2) a liquid cell culture medium disposed in the substrate, 3 A) a non-biological substrate immersed in the cell culture medium. Somatic cells to be cultured are arranged on the surface of a non-biological substrate during the culture. Moreover, you may add suitably the factor which improves the undifferentiation ability of a cell (undifferentiation ability improvement factor) to a culture system as needed. CCL2 (chemokine (CC motif) ligand 2) and the like can be mentioned as an undifferentiated ability improving factor.
- CCL2 chemokine (CC motif) ligand 2
- the factor for improving undifferentiation may be added directly to the cell culture medium, or it is incorporated into a carrier such as protein beads (registered trademark), cross-linked gelatin hydrogel (hydrogel obtained by cross-linking gelatin), atelocollagen, and nanofiber. You may make it release slowly by the method of making it.
- the carrier incorporating the undifferentiation ability improving factor may be provided to the culture system in a state of being placed on a carrier fixing member (a disk or the like that can be placed in a cell culture substrate). Alternatively, the factor may be gradually released by including the undifferentiated ability improving factor in the abiotic base material.
- cells with enhanced reprogramming obtained by the method according to the present invention may be separated from cells other than those desired by performing a separation and recovery step as necessary.
- the method for performing the separation and recovery step is not particularly limited, and for example, desired cells are separated using morphological characteristics as an index, for example, desired cells are separated using the presence or absence or expression level of a predetermined marker as an index, etc. These means can be adopted as appropriate.
- the kit according to the present invention comprises 1) an abiotic substrate having an elastic modulus of 0.1 kPa to 200 kPa, and 2) an inhibitor of histone deacetylase, inhibition of TGF- ⁇ receptor. And at least one factor selected from the group consisting of an agent, an inhibitor of the MAPK / ERK pathway, and an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1. Regarding the factor 2), an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and activation of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 It is preferable to comprise an agent.
- the configurations 1) to 2) are the same as those described in [1. This is the same as that described in the section “Method for enhancing reprogramming of somatic cells and cells with enhanced reprogramming”.
- the abiotic substrate is fixed to the surface of the cell culture substrate, for example, in a film form.
- the substrate for cell culture include a dish for cell culture, a well plate for cell culture, and the like, and a configuration in which the base material is fixed to the bottom of the dish or the bottom of the well of the well plate is exemplified.
- the substrate for cell culture may be a flat plate member (disk or plate or the like), and an abiotic substrate may be fixed to the surface of the substrate (see FIG. 5).
- the method for fixing the substrate to the cell culture substrate is not particularly limited, and the method may be appropriately selected according to the material of the substrate and the substrate.
- both may be fixed using the adhesive force of the water-containing gel, and if necessary Both may be fixed after treating the surface of the substrate such as glass with an appropriate silane coupling agent.
- the surface on the side in contact with the somatic cell among the surfaces of the non-biological substrate is protected with a removable protective layer.
- the protective layer is, for example, a glass thin film or a plastic thin film.
- these protective layers are removed in order to seed somatic cells (see also (b) in FIG. 5).
- the non-biological base material is a hydrogel
- a protective layer can be attached using the adhesive property of the gel, thereby preventing drying and alteration of the hydrogel. .
- the protective layer indirectly covers and protects the substrate.
- a configuration for example, a configuration in which a protective layer covers the well plate
- a configuration in which a base material is stored in a highly airtight bag may be used.
- the structure contained in the said non-biological base material may be sufficient as at least one selected. If these “additives” are contained in the base material in advance, it is preferable from the viewpoint of improving convenience and making the production kit compact.
- the substrate is a hydrogel, these “additives” can be incorporated into the substrate in a state dissolved or suspended in water.
- the “additives” are dissolved or suspended in water or the like and stored in a storage container with a lid or a storage bag. What is being done is mentioned.
- the additive when the “additive” is solid at normal temperature and pressure, the additive may be stored in a storage container with a lid or a storage bag in the solid state.
- the preparation kit may include an instruction manual for the kit.
- the instructions for use of the kit include the above [1.
- a method of enhancing reprogramming of somatic cells as described in the column of “Methods of enhancing reprogramming of somatic cells and cells with enhanced reprogramming” is recorded.
- the instructions for use may be printed on a recording medium such as paper, or electronically recorded on an electronic recording medium such as a floppy disk, a compact disk (CD), an MD, or a flash memory. It may be a thing.
- This preparation kit can be suitably used for the construction of a method for enhancing reprogramming of somatic cells according to the present invention and a culture system for carrying out the method.
- the present invention includes any of the following contents.
- a method for enhancing somatic cell reprogramming which is an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and a 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase
- a method comprising a culture step of culturing cells.
- the water-containing gel is a water-containing gel of a homopolymer or copolymer of a monomer having a basic skeleton of acrylamide.
- the above culturing step involves the presence of an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and an activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1.
- the concentration is 10 ⁇ M or more and 10 mM or less, and when an inhibitor of TGF- ⁇ receptor is included, the concentration is 0.01 ⁇ M or more.
- Activator of 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 having a concentration of 0.01 ⁇ M or more and 1 mM or less when an MAPK / ERK pathway inhibitor is included.
- kits Selected from the group of factors consisting of the above-mentioned histone deacetylase inhibitors, TGF- ⁇ receptor inhibitors, MAPK / ERK pathway inhibitors, and 3′-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 activators
- the kit according to 9) wherein at least one of the factors is contained in a form exhibiting sustained release.
- a method for producing a cell with enhanced reprogramming comprising an inhibitor of histone deacetylase, an inhibitor of TGF- ⁇ receptor, an inhibitor of MAPK / ERK pathway, and a 3′-phosphoinositide-dependent protein In the presence of at least one factor selected from the factor group consisting of kinase-1 activators, in contact with an abiotic substrate having an elastic modulus in the range of 0.1 kPa to 200 kPa.
- a method comprising a culture step of culturing somatic cells.
- a method for producing a cell with enhanced reprogramming comprising the step of enhancing reprogramming of somatic cells by the method according to any one of 1) to 8) above.
- a culture system comprising a non-biological substrate in a range of 1 kPa to 200 kPa. 15) The system according to 14), wherein CCL2 is added to the cell culture medium and / or the abiotic substrate as an undifferentiated ability improving factor.
- Example 1 (Preparation of foundation) A circular glass plate (manufactured by Fisherscientific) with a diameter of 25 mm was washed with 100% ethanol and dried. This circular glass plate was immersed in an aqueous solution containing 0.5% 3-methacryloxypropyltriethoxysilane and 1% acetone for 1 hour, washed again with 100% ethanol and dried. An aqueous solution containing 8.5 ⁇ l of 3-4% Acrylamide, 0.03-0.225% N, N′-Methylenebisacrylamide, 0.1% Tetramethylethylenediamine, and 0.1% ammonium persulfate on the circular glass plate. And a circular glass plate having a diameter of 22 mm was layered (see (a) in FIG. 5).
- the firmness of the gel was adjusted by changing the ratio of Acrylamide and N, N'-Methylenebisacrylamide. After 1 hour, after the gel solidified, the circular glass plate having a diameter of 22 mm was removed (see (b) in FIG. 5) and washed with a 50 mM HEPES-containing aqueous solution (PH8.5). In this way, a base (gel base) to which a polyacrylamide-based hydrogel was attached was prepared.
- D-PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
- Human fibroblasts (ScienCell) were cultured in Dulbecco's modified Egel medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, and 1% streptomycin. The cultured cells were collected and then seeded with 5 ⁇ 10 4 cells per gel substrate, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, 1% streptomycin, 0.25 mM NaB, 5 ⁇ M PS48, 0.5 ⁇ M The cells were cultured for 4 days in Dulbecco's modified Egel medium containing A-83-01 and 0.5 ⁇ M PD0325901. When the cells were cultured, the gel substrate was placed in a cell culture dish having a size that can be stored, and the gel substrate was completely immersed in the medium.
- human fibroblasts were cultured under the same conditions except that they were cultured on hard plastic (BD Falcon cell culture dish) or feeder cells instead of the gel base.
- Nanog positive, Oct3 / 4 positive appearance of colonies When human fibroblasts were cultured on a soft substrate (gel substrate), ES-like colonies appeared after 4 days of culture, and most cells were Nanog and Oct3 / 4 was expressed. The number of colonies expressing both Nanog and Oct3 / 4 was significantly larger than when cultured on hard plastic (shown as Rigid in the figure) (see FIGS. 1 and 2).
- Example 2 (Preparation of foundation) A circular glass plate (manufactured by Fisherscientific) with a diameter of 25 mm was washed with 100% ethanol and dried. This circular glass plate was immersed in an aqueous solution containing 0.5% 3-methacryloxypropyltriethoxysilane and 1% acetone for 1 hour, washed again with 100% ethanol and dried. On this circular glass plate, 8.5 ⁇ l of an aqueous solution containing 3% Acrylamide, 0.1% N, N′-Methylenebisacrylamide, 0.1% Tetramethylethylenediamine, and 0.1% ammonium persulfate was dropped, and the diameter was further reduced. A 22 mm circular glass plate was layered.
- the round glass plate having a diameter of 22 mm was removed and washed with a 50 mM HEPES-containing aqueous solution (PH 8.5).
- a base (gel base) having a hardness of 1 kPa to which a polyacrylamide-based hydrogel was adhered was prepared.
- Human fibroblasts (ScienCell) were cultured in Dulbecco's modified Egel medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, and 1% streptomycin. The cultured cells are collected, then 5 ⁇ 10 4 cells are seeded per gel substrate, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, 1% streptomycin, and any of the following (1) to (4) The cells were cultured for 4 days in Dulbecco's modified Egel medium containing these combinations of reagents.
- human fibroblasts were cultured in a medium (4i) containing 0.25 mM NaB, 5 ⁇ M PS48, 0.5 ⁇ M A-83-01 and 0.5 ⁇ M PD0325901 and a medium (0i) not containing a drug. .
- Nanog and Oct3 / 4 were compared by immunostaining.
- human fibroblasts were cultured on a base of 1 kPa hardness (gel base) with different combinations of drugs, ES-like colonies appeared after 4 days of culture.
- most cells expressed Nanog (red).
- Oct3 / 4 green was highly expressed under the conditions of 4i and ⁇ A8301 (FIG. 6).
- the fluorescence intensity of the immunostained images was compared. As a result, about 90% of Nanog expression and Oct3 / 4 expression of 4i were observed under the condition of -A8301. (FIG. 7).
- Example 3 (Preparation of foundation) The same operation as in Example 2 was performed.
- Human fibroblasts (ScienCell) were cultured in Dulbecco's modified Egel medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, and 1% streptomycin. The cultured cells are collected, then 5 ⁇ 10 4 cells are seeded per gel substrate, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin, 1% streptomycin, and any of the following (1) to (4) The cells were cultured for 4 days in Dulbecco's modified Egel medium containing these combinations of reagents.
- human fibroblasts were cultured in a medium (4i) containing 0.25 mM NaB, 5 ⁇ M PS48, 0.5 ⁇ M A-83-01 and 0.5 ⁇ M PD0325901 and a medium (0i) not containing a drug. .
- Nanog and Oct3 / 4 were compared by immunostaining.
- human fibroblasts were cultured on a base of 1 kPa hardness (gel base) with different combinations of drugs, ES-like colonies appeared after 4 days of culture.
- most cells expressed Nanog (red).
- Oct3 / 4 green was highly expressed under the conditions of 4i and TriA (FIG. 8).
- the fluorescence intensity of immunostained images was compared. As a result of TriA, the expression of Nanog was about 80% of the condition of 4i, and Oct3 / increased by 10%. 4 expression was seen.
- the present invention provides a method for enhancing cell reprogramming without requiring gene introduction.
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Description
本発明は、体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びリプログラミングされた細胞を作製するキットに関する。
再生医療等への応用を目的として、いわゆる誘導多能性幹細胞（induced pluriopotent stem cell：ｉＰＳ細胞）に代表される体細胞のリプログラミング技術の開発が重要視されている。
ｉＰＳ細胞は、所定の核初期化因子を体細胞に作用させて作製する。そのため、ｉＰＳ細胞は初期胚から樹立される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と比較して倫理的問題が少ない。これまでにｉＰＳ細胞の作製方法として様々な手法が報告されているが、例えば代表的な方法として、４つの転写因子群の導入が挙げられる（特許文献１）。しかし、特許文献１のアプローチでは、人為的に発現させる遺伝子の種類等によっては細胞のガン化を招来する等の不所望な現象が報告されている。また、ｉＰＳ細胞又は当該ｉＰＳ細胞から作製した組織等を治療等の目的でヒトの体内に移植した場合には、人為的に発現させる遺伝子及び当該遺伝子が組み込まれたベクターが人体に影響を及ぼす可能性を否定できない。
また、非特許文献１には、ヒト由来の体細胞をリプログラミングする目的で、人為的に発現させる１つの転写因子と所定の化合物との組み合せを用いることが記載されている。
Zhu et al., Cell Stem Cell, volume7, December 3, 2010, p651
しかしながら、これまでの体細胞のリプログラミング技術では、線維芽細胞などの一般的に入手し易い細胞をリプログラミング対象の細胞（出発細胞）とした際に、外来遺伝子の導入を完全に除き、高効率且つ迅速にリプログラミングがなされた技術の報告はない。
本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、遺伝子の導入を要することなく細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びその利用を提供することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本願発明は以下の何れかの内容を包含する。
体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子と、を備えた、リプログラミングされた細胞を作製するキット。
リプログラミングが亢進された細胞の作製方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。
（ａ）細胞培養用の基体、（ｂ）当該基体中に配置された、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子を含む細胞培養培地、および（ｃ）当該細胞培養培地中に浸漬された、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材、を含む培養システム。
本発明は、従来技術に比べて、外来遺伝子の導入を完全に除くことができるという利点を持ちつつ、高効率かつ迅速に体細胞のリプログラミングを亢進できるという効果を奏する。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
〔１．体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びリプログラミングが亢進された細胞〕
本発明に係る方法は、体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含んでなる。なお、この方法は、体細胞を出発細胞として、リプログラミングが亢進された細胞を作製する方法と捉えることもできる。
本発明に係る方法は、体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含んでなる。なお、この方法は、体細胞を出発細胞として、リプログラミングが亢進された細胞を作製する方法と捉えることもできる。
（体細胞のリプログラミングの亢進）
本明細書における「体細胞のリプログラミングの亢進」とは、未分化マーカーとなる遺伝子の発現量が、出発細胞（体細胞）と比較して亢進された状態を指す。すなわち、出発細胞を、より前段階の分化状態（未分化の状態を含む）にすることと捉えることもできる。好ましくは、顕微鏡観察又はセルソーター等を用いて細胞形態を判定する場合に、細胞形態の変化が認められる状態である。
本明細書における「体細胞のリプログラミングの亢進」とは、未分化マーカーとなる遺伝子の発現量が、出発細胞（体細胞）と比較して亢進された状態を指す。すなわち、出発細胞を、より前段階の分化状態（未分化の状態を含む）にすることと捉えることもできる。好ましくは、顕微鏡観察又はセルソーター等を用いて細胞形態を判定する場合に、細胞形態の変化が認められる状態である。
未分化マーカーとなる遺伝子は、例えば、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｔｂｘ３遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、ＳＳＥＡ３遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子、及びＳｔｅｌｌａ遺伝子等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。未分化マーカーは当業者において任意に選択されるが、好ましくはＮａｎｏｇ遺伝子及びＯｃｔ３／４遺伝子の両方である。Ｏｃｔ３／４遺伝子は、陽性の状態の中でも発現が特に上昇している状態が好ましい。
本明細書において「細胞形態の変化」とは、体細胞のリプログラミングが亢進することに伴って、出発細胞としての体細胞の形態に生じる変化を広く指す。例えば、出発細胞たる体細胞が接着性細胞の場合には、当該接着性細胞が持つ接着性に変化に生じることで認められる現象を指す。例えば、接着性細胞が有する突起物が衰退して、細胞が球状に近い状態に変化することが挙げられる。
「体細胞のリプログラミングの亢進」の好ましい一例では、対象となる体細胞（出発細胞）を多能性（multipotency）を示す状態かそれ以前の状態にすることであり、より好ましくは全能性（pluripotency）を示す状態かそれ以前の状態にすることである。なお、本明細書において、多能性（multipotency）とは、例えば神経系又は造血系など一部の細胞種に分化できる能力を指す。また、本明細書において、全能性（pluripotency）とは、個体自体を構成することは出来ないが、個体を構成するすべての細胞及び組織に分化できる能力を指す。
本発明の方法によって得られる「リプログラミングが亢進された細胞」とは、上記の未分化マーカーの発現が陽性である細胞、又は出発細胞よりも未分化マーカーの発現量が亢進されている細胞である。
ある一態様において、「リプログラミングが亢進された細胞」とは、好ましくは核初期化細胞である。核初期化細胞の判定として、テラトーマの形成能の有無、ＥＳ細胞様コロニーの形成能の有無、又は陽性対象（ＥＳ細胞又は従来技術で作製されたｉＰＳ細胞（誘導多能性幹細胞））と比較した未分化マーカーの発現量を指標に用いることできるが、これに限定されない。分離された核初期化細胞の分化能及び未分化増殖能はＥＳ細胞について汎用されている確認手段を利用することで容易に確認可能である。「ｉＰＳ細胞」とは、ＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未分化細胞であって、培養条件によって全能性（pluripotency）及び未分化増殖能を有する細胞を包含する。
本発明の方法によって得られる「リプログラミングが亢進された細胞」の用途は特に限定されず、例えば、ＥＳ細胞と同様の試験・研究の用途、薬剤のスクリーニング（肝臓系の体細胞）の用途、細胞療法／組織療法（自家細胞／自家組織移植、他家細胞／他家組織移植）の用途等に使用することができる。
（非生物性の基材）
体細胞を培養するための基材は非生物性であって、その弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である。基材が非生物性であるとは、より具体的には、基材が細胞又は細胞構築物ではないことを指す。ここで、細胞構築物とは、細胞シート及び組織等の細胞の集合体として形成された構築物を指す。
体細胞を培養するための基材は非生物性であって、その弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である。基材が非生物性であるとは、より具体的には、基材が細胞又は細胞構築物ではないことを指す。ここで、細胞構築物とは、細胞シート及び組織等の細胞の集合体として形成された構築物を指す。
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の上記基材としては、例えば、含水ゲル（ハイドロゲル）、シリコーン、ゼラチン、及びコラーゲンゲル等が挙げられるが、中でも含水ゲルが好ましい。
含水ゲルは、アクリルアミド系ポリマー；アクリル酸系ポリマー；メタクリル酸系ポリマー；アルギン酸カルシウムゲル、及びアルギン酸マグネシウムゲル等のアルギン酸ゲル；カッパ型又はイオタ型のカラギナンゲル；ネイティブ型又は脱アシル型等のジェランガムゲル；等の含水ゲルを構成する有機ポリマーが所定量の水性液体を含むことで構成される。これら含水ゲルの中でも、アクリルアミド系ポリマーの含水ゲルが好ましい。
アクリルアミド系ポリマーとは、アクリルアミドの基本骨格Ｃ（Ｒ1）2＝ＣＲ2－ＣＯＮ（Ｒ3）2を有するモノマーの単独重合体又は共重合体の含水ゲルを指す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、基本骨格外の構造であって特に限定されないが、例えば、互いに独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、アルキル基等のヒドロカルビル基、及びアルコキシ基等である。なお、ヒドロカルビル基及びアルコキシ基における炭素原子数は、１～１０個の範囲内であることが好ましく、１～５個の範囲内であることがより好ましい。アクリルアミドの基本骨格を有するモノマーとしては、例えば、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、及びジメチルアミノプロピルアクリルアミド４級化物又はそれらの塩が挙げられる。
なお、非生物性の基材が、モノマーの単独重合体又は共重合体としての含水ゲルの場合、当該モノマーに由来するゲルの骨格及び水分の他、ポリマー同士を架橋する架橋剤、及び重合開始剤等を含んでいてもよい。
非生物性の基材の弾性率は０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内であればよいが、リプログラミングの効率の観点では、０．１ｋＰａ以上で１００ｋＰａ以下の範囲内であることが好ましく、０．１ｋＰａ以上で１０ｋＰａ以下の範囲内であることがより好ましく、０．１ｋＰａ以上で４ｋＰａ以下の範囲内であることがより好ましく、０．１ｋＰａ以上で３ｋＰａ～３．５ｋＰａ以下の範囲内、或いは０．１ｋＰａ以上で３ｋＰａ未満の範囲内であることがさらに好ましく、０．１ｋＰａ以上で１ｋＰａ～１．５ｋＰａ以下の範囲内、或いは０．２ｋＰａ以上で１ｋＰａ以下の範囲内であることが特に好ましい。なお、基材の弾性率が０．１ｋＰａ未満である場合、または２００ｋＰａを超えている場合は、体細胞のリプログラミングの効率が格段に低下するか、全くリプログラミングが進まなくなる。なお、基材が含水ゲルの場合は、その含水率又はポリマー間の架橋度を調整することによって、所望の弾性率の基材を得ることは容易である。
なお、非生物性の基材の弾性率は、基材の種類に応じた方法で測定すればよい。例えば、基材が含水ゲルの場合には、例えば、おもりの沈み込み量から計算する方法、又は、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）による応力測定という方法、で測定すればよい。
より具体的には例えば、水又は水溶液中に含水ゲルを配置して十分に膨潤させた（実質的な飽和膨潤状態）後に、重量が分かっている円柱状のおもりを含水ゲル上に配置し、当該おもりの沈み込み量から、含水ゲルの弾性率を求めることができる。
ゲルの弾性率Ｅ（単位Ｐａ）は、
Ｅ＝Ｐ（１-ν2）/２ａΔｈ・・・・・・式（１）
求めることができる。ここで、Ｐはおもりの荷重（単位Ｎ）、ａはおもりの底面（含水ゲルとの接触面）の半径（単位ｍ）、Δｈはおもりの沈み込み量（単位ｍ）、νは試料である含水ゲルのポアソン比であり、後述する実施例１で用いた含水ゲルの場合、νは０．４５である。
ゲルの弾性率Ｅ（単位Ｐａ）は、
Ｅ＝Ｐ（１-ν2）/２ａΔｈ・・・・・・式（１）
求めることができる。ここで、Ｐはおもりの荷重（単位Ｎ）、ａはおもりの底面（含水ゲルとの接触面）の半径（単位ｍ）、Δｈはおもりの沈み込み量（単位ｍ）、νは試料である含水ゲルのポアソン比であり、後述する実施例１で用いた含水ゲルの場合、νは０．４５である。
また、ＡＦＭによる応力測定の場合は、水又は水溶液中に含水ゲルを配置して十分に膨潤させた（実質的な飽和膨潤状態）後に、弾性率がわかっているＡＦＭカンチレバーによって含水ゲルを押し、ＡＦＭカンチレバーのたわみを測定する。含水ゲルの弾性率Ｅ（単位Ｐａ）は、ＡＦＭカンチレバーのたわみから求められた応力Ｆ（単位ｍ）と含水ゲルを押し込んだ距離δ（単位ｍ）の値から以下の式を用いて求める。
Ｅ＝Ｆ×（１―ν2）×δ2／（２／π×ｔａｎ（α））・・・・・式（２）
ここでαはＡＦＭカンチレバー先端の角度（開き角：単位°）であり、νは試料のポアソン比である（実施例の場合は０．４５）。なお、含水ゲルの底面を支える支持体（ガラス等）からの影響を避けるため、弾性率の測定に際してδは１μｍ以下であることが望ましい。
Ｅ＝Ｆ×（１―ν2）×δ2／（２／π×ｔａｎ（α））・・・・・式（２）
ここでαはＡＦＭカンチレバー先端の角度（開き角：単位°）であり、νは試料のポアソン比である（実施例の場合は０．４５）。なお、含水ゲルの底面を支える支持体（ガラス等）からの影響を避けるため、弾性率の測定に際してδは１μｍ以下であることが望ましい。
非生物性の基材の厚さは特に限定されないが、例えば、１０μｍ以上で５ｍｍ以下の範囲内であり、蛍光観察という観点では２００μｍ以下の範囲内であることが好ましい。
非生物性の基材は、例えば、細胞培養用の基体の表面に膜状に固定されていてもよい。細胞培養用の基体とは、細胞培養用のディッシュ、及び細胞培養用のウェルプレート等が挙げられ、当該基材がディッシュの底部又はウェルプレートのウェルの底部に固定されている構成が例示される。
非生物性の基材の表面（培養工程で体細胞が接触する面）は、例えば、ゼラチンコート、コラーゲンコート、及びラミニンコート等の、体細胞の足場となるコーティングを設けてもよい。また、非生物性の基材と上記コーティングの材料とを架橋するクロスリンカーを設けてもよい。クロスリンカーの種類は、基材の材質に応じて適宜選択すればよいが、基材がアクリルアミド系ポリマーの場合はSulfo-SANPAH（Pierce社製）、Sulfo-SMCC、及びGMBS等のクロスリンカーが挙げられる。
（ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤）
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、トリコスタチンＡ、酪酸、アピシジン、バルプロ酸、及びＮａＢ等が挙げられる。なかでも、トリコスタチンＡが好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であることが好ましく、２ｎＭ以上で０．５ｍＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてＮａＢを用いる場合は、例えば１０μＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、０．１ｍＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であることが好ましく、０．２ｍＭ以上で０．５ｍＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてトリコスタチンＡを用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１００ｎＭ以下の範囲内であり、２ｎＭ以上で５０ｎＭ以下の範囲内であることが好ましく、５ｎＭ以上で３０ｎＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、トリコスタチンＡ、酪酸、アピシジン、バルプロ酸、及びＮａＢ等が挙げられる。なかでも、トリコスタチンＡが好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であることが好ましく、２ｎＭ以上で０．５ｍＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてＮａＢを用いる場合は、例えば１０μＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、０．１ｍＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であることが好ましく、０．２ｍＭ以上で０．５ｍＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてトリコスタチンＡを用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１００ｎＭ以下の範囲内であり、２ｎＭ以上で５０ｎＭ以下の範囲内であることが好ましく、５ｎＭ以上で３０ｎＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
（ＴＧＦ－β受容体の阻害剤）
ＴＧＦ－β受容体の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、A-83-01（3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1-phenylthiocarbamoyl-4-quinolin-4-ylpyrazole）、SB431542（Stemgent社製）、及びLY2157299（和光純薬社製）等が挙げられる。なかでも、A-83-01が好ましい場合がある。また、当該阻害剤はタイプＩ型の阻害剤であることが好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてA-83-01を用いる場合は、例えば１０ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり５０ｎＭ以上で２００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１００ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてSB431542を用いる場合は、例えば１００ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であり、２００ｎＭ以上で５０μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５００ｎＭ以上で２０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてLY2157299を用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であり、１０ｎＭ以上で１μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５０ｎＭ以上で２００ｎＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
ＴＧＦ－β受容体の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、A-83-01（3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1-phenylthiocarbamoyl-4-quinolin-4-ylpyrazole）、SB431542（Stemgent社製）、及びLY2157299（和光純薬社製）等が挙げられる。なかでも、A-83-01が好ましい場合がある。また、当該阻害剤はタイプＩ型の阻害剤であることが好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてA-83-01を用いる場合は、例えば１０ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり５０ｎＭ以上で２００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１００ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてSB431542を用いる場合は、例えば１００ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であり、２００ｎＭ以上で５０μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５００ｎＭ以上で２０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてLY2157299を用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であり、１０ｎＭ以上で１μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５０ｎＭ以上で２００ｎＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤）
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、PD0325901（N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-benzamide）、U0126（Promega社製）、及び5-Iodotubercidin（Merck社製）等が挙げられる。なかでも、PD0325901が好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてPD0325901を用いる場合は、例えば０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、０．０５μＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、０．１μＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてU0126を用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であり、１０ｎＭ以上で１μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５０ｎＭ以上で２００以下の範囲内であることがより好ましい。
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、PD0325901（N-[(2R)-2,3-dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-benzamide）、U0126（Promega社製）、及び5-Iodotubercidin（Merck社製）等が挙げられる。なかでも、PD0325901が好ましい場合がある。当該阻害剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該阻害剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、１ｎＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてPD0325901を用いる場合は、例えば０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、０．０５μＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、０．１μＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。当該阻害剤としてU0126を用いる場合は、例えば１ｎＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であり、１０ｎＭ以上で１μＭ以下の範囲内であることが好ましく、５０ｎＭ以上で２００以下の範囲内であることがより好ましい。
（３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤）
３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（ＰＤＫ－１）の活性化剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、PS48（(2Z)-5-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-2-pentenoic acid）が挙げられる。当該活性化剤は、ＰＤＫ－１のHM/PIFポケットに特異的に結合してＰＤＫ－１を活性化させるものであることが好ましい場合がある。当該活性化剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該活性化剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、０．１μＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１μＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（ＰＤＫ－１）の活性化剤の種類は特に限定されないが、具体的には例えば、PS48（(2Z)-5-(4-Chlorophenyl)-3-phenyl-2-pentenoic acid）が挙げられる。当該活性化剤は、ＰＤＫ－１のHM/PIFポケットに特異的に結合してＰＤＫ－１を活性化させるものであることが好ましい場合がある。当該活性化剤は１種類のみを用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。当該活性化剤の使用量は、体細胞のリプログラミング亢進の効果が得られる限り特に限定されないが、培養工程における細胞培養培地中の濃度として例えば０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、０．１μＭ以上で１００μＭ以下の範囲内であることが好ましく、１μＭ以上で１０μＭ以下の範囲内であることがより好ましい。
（阻害剤、及び活性化剤の組合せ）
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤のうちの少なくとも２つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることが好ましく、少なくとも３つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることがより好ましく、４つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることがより好ましい場合がある。これらを組合せて用いる場合において、好ましい組み合わせの一例は、NaB、A-83-01、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。好ましい組み合わせの別の一例は、トリコスタチンＡ、A-83-01、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。好ましい組み合わせのさらに別の一例は、NaB、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤のうちの少なくとも２つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることが好ましく、少なくとも３つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることがより好ましく、４つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組合せて用いることがより好ましい場合がある。これらを組合せて用いる場合において、好ましい組み合わせの一例は、NaB、A-83-01、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。好ましい組み合わせの別の一例は、トリコスタチンＡ、A-83-01、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。好ましい組み合わせのさらに別の一例は、NaB、PD0325901、及びPS48の組み合わせである。
また、一実施形態において、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤を少なくとも含んでいることが好ましく、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤を少なくとも含んでいることがより好ましく、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤を少なくとも含んでいることがさらに好ましく、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を少なくとも含んでいることが特に好ましい。別の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を含んでいることが好ましく、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤をさらに含んでいることがより好ましく、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤をさらに含んでいることがさらに好ましく、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤をさらに含んでいることが特に好ましい。また、さらに別の実施形態において、トリコスタチンＡを少なくとも含んでいることが好ましい。
さらに他の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤のうちの１つ、２つ、又は３つからそれぞれ一種類以上の因子を選択して組み合わせる場合は、少なくとも下記１）の条件を満たすことが最も好ましく、少なくとも下記２）の条件を満たすことが次に好ましく、少なくとも下記３）の条件を満たすことがさらに次に好ましい場合がある。すなわち、下記１）及び２）の条件を同時に満たす態様、又は、下記１）～３）の条件を同時に満たす態様は、特に好ましい態様でありうる。
１）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤から一種類以上の因子を選択する。
２）３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤から一種類以上の因子を選択する。
３）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤から一種類以上の因子を選択する。
１）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤から一種類以上の因子を選択する。
２）３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤から一種類以上の因子を選択する。
３）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤から一種類以上の因子を選択する。
（体細胞）
本発明において、リプログラミングの対象となる「体細胞」、すなわち出発細胞の種類、由来等は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。体細胞の種類は、例えば、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
本発明において、リプログラミングの対象となる「体細胞」、すなわち出発細胞の種類、由来等は特に限定されず、任意の体細胞を利用することができる。体細胞の種類は、例えば、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
好ましい一実施態様においては、誘導多能性幹細胞の樹立が報告されている繊維芽細胞、滑膜細胞、ケラチノサイト、羊膜細胞、子宮内膜細胞、グリア細胞、アストロサイト、髄膜細胞、骨髄由来ミエロイド細胞、末梢血由来CD34陽性血液細胞、骨髄単核細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞リンパ腫（NK cell lymphoma）、Ｂリンパ球、臍帯静脈内皮細胞、膵臓β細胞、精巣由来細胞、ナチュラルキラー歯胚由来細胞、腸間膜由来細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、幹細胞、及び脂肪幹細胞等が挙げられる。体細胞は、初代培養細胞であっても継代培養細胞であってもよい。体細胞の由来は、例えば、胎児期（胎仔期）の個体に由来するものの他、成熟した個体に由来するものを用いてもよい。
体細胞が由来する動物種も特に限定されないが、細胞療法／組織療法等の産業上の利用を考慮すると哺乳類（哺乳動物）由来の体細胞が好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。特に臨床応用においてはヒト由来の組織若しくは細胞が好ましい。
また、本発明によってリプログラミングが亢進された細胞から分化した体細胞、又は従前の技術で樹立されたｉＰＳ細胞から分化した体細胞についても、本法によるリプログラミング亢進の対象となる「体細胞」として扱うことができる。当該体細胞の好ましい態様は、上述と同様である。
体細胞のリプログラミングを亢進させることで得られる細胞（好ましくは核初期化細胞）を疾病の治療に用いる場合には、ある局面では患者自身から分離した体細胞を用いることが望ましい場合があり、例えば、疾病に関与する体細胞、又は疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。
（培養工程）
本発明に係る体細胞のリプログラミングを亢進させる方法は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（ＰＤＫ－１）の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、上記した所定の弾性率の非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法である。好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の存在下において、上記した所定の弾性率の非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法である。
本発明に係る体細胞のリプログラミングを亢進させる方法は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１（ＰＤＫ－１）の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、上記した所定の弾性率の非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法である。好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の存在下において、上記した所定の弾性率の非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法である。
培養工程では、非生物性の上記基材を液体の細胞培養培地中に配置して、当該基材の表面に体細胞が接した状態で培養を行う。細胞培養培地は、例えば、ｉＰＳ細胞用の細胞培養培地、又はＥＳ細胞用の細胞培養培地として公知のものを適宜用いることができ、具体的には、ESGRO（ミリポア社製の商品名）、及びReproFF（リプロセル社製の商品名）等が挙げられる。
培養工程における培養条件は特に限定されず、例えばｉＰＳ細胞を作製する公知の方法（参考文献１等）に準じて条件設定をすればよいが、培養期間は、例えば２日～３０日間であり、３日～２０日間であることが好ましく、４日～１０日間であることがより好ましい。培養の温度は、例えば、３５℃～３９℃であり、３５．５℃～３８．５℃であることが好ましく、３６℃～３８℃であることがより好ましい。
参考文献１：Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblastsby defined factors. Cell 131(5):861-72.
培養工程において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子（「添加剤」と総称する）は、上記細胞培養培地中に存在するように添加される。より具体的には、「添加剤」は細胞培養培地に添加して混合した後に、非生物性の上記基材に供されてもよいし、細胞培養培地を非生物性の上記基材に供した後に「添加剤」を添加してもよいし、「添加剤」を非生物性の上記基材中に含ませておいて、当該基材を介して「添加剤」が細胞培養培地に供給されるようにしてもよい。
参考文献１：Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblastsby defined factors. Cell 131(5):861-72.
培養工程において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子（「添加剤」と総称する）は、上記細胞培養培地中に存在するように添加される。より具体的には、「添加剤」は細胞培養培地に添加して混合した後に、非生物性の上記基材に供されてもよいし、細胞培養培地を非生物性の上記基材に供した後に「添加剤」を添加してもよいし、「添加剤」を非生物性の上記基材中に含ませておいて、当該基材を介して「添加剤」が細胞培養培地に供給されるようにしてもよい。
培養工程は、出発細胞たる体細胞に、リプログラミングに関与する一切の遺伝子を導入することなく行うことができる。
（培養システムの一例）
上記培養工程を行うための培養システムの一例は、上述の通り、１）細胞培養用の基体（例えば、ディッシュ等の培養容器）、２）当該基体中に配置された液体の細胞培養培地、３）当該細胞培養培地中に浸漬された非生物性の基材、を含んで構成される。培養対象となる体細胞は、培養に際して、非生物性の基材の表面に配される。また、培養システムには、必要に応じて、細胞の未分化能を向上させる因子（未分化能向上因子）を適宜加えてもよい。未分化能向上因子として、ＣＣＬ２（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２）等が挙げられる。未分化能向上因子は、直接、細胞培養培地中に加えてもよく、又はプロテインビーズ（登録商標）、架橋ゼラチンヒドロゲル（ゼラチンを架橋化して得られるヒドロゲル）、アテロコラーゲン、ナノファイバー等の担体に取り込ませる方法によって徐放化させてもよい。未分化能向上因子を取り込んでいる上記担体は、担体固定用の部材（細胞培養用の基体内に配置可能なディスク等）上に配された状態で、培養システムに供されてもよい。或いは、未分化能向上因子を非生物性の上記基材に含ませることで、当該因子を徐放化するようにしてもよい。
上記培養工程を行うための培養システムの一例は、上述の通り、１）細胞培養用の基体（例えば、ディッシュ等の培養容器）、２）当該基体中に配置された液体の細胞培養培地、３）当該細胞培養培地中に浸漬された非生物性の基材、を含んで構成される。培養対象となる体細胞は、培養に際して、非生物性の基材の表面に配される。また、培養システムには、必要に応じて、細胞の未分化能を向上させる因子（未分化能向上因子）を適宜加えてもよい。未分化能向上因子として、ＣＣＬ２（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２）等が挙げられる。未分化能向上因子は、直接、細胞培養培地中に加えてもよく、又はプロテインビーズ（登録商標）、架橋ゼラチンヒドロゲル（ゼラチンを架橋化して得られるヒドロゲル）、アテロコラーゲン、ナノファイバー等の担体に取り込ませる方法によって徐放化させてもよい。未分化能向上因子を取り込んでいる上記担体は、担体固定用の部材（細胞培養用の基体内に配置可能なディスク等）上に配された状態で、培養システムに供されてもよい。或いは、未分化能向上因子を非生物性の上記基材に含ませることで、当該因子を徐放化するようにしてもよい。
（培養工程以外の他の工程の例）
また、本発明に係る方法により得られた「リプログラミングが亢進された細胞」は、必要に応じて分離回収工程を行って、所望する以外の細胞と分離してもよい。分離回収工程を行う方法は特に限定されず、例えば形態的な特徴を指標にして所望の細胞を分離する、例えば所定のマーカーの発現の有無又は発現量を指標にして所望の細胞を分離する等の手段を適宜採用できる。
また、本発明に係る方法により得られた「リプログラミングが亢進された細胞」は、必要に応じて分離回収工程を行って、所望する以外の細胞と分離してもよい。分離回収工程を行う方法は特に限定されず、例えば形態的な特徴を指標にして所望の細胞を分離する、例えば所定のマーカーの発現の有無又は発現量を指標にして所望の細胞を分離する等の手段を適宜採用できる。
〔２．リプログラミングされた細胞を作製するキット〕
本発明に係るキットは、１）弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、２）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子とを少なくとも備えてなる。なお、２）の因子に関して、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤と、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤と、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤とを備えてなることが好ましい。なお、１）～２）の構成は、上記〔１．体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びリプログラミングが亢進された細胞〕欄で説明したものと同一である。
本発明に係るキットは、１）弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、２）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子とを少なくとも備えてなる。なお、２）の因子に関して、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤と、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤と、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤とを備えてなることが好ましい。なお、１）～２）の構成は、上記〔１．体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びリプログラミングが亢進された細胞〕欄で説明したものと同一である。
利便性に優れるとの観点では、作製キットにおいて、非生物性の上記基材が、細胞培養用の基体の表面に例えば膜状に固定されていることが好ましい。細胞培養用の基体とは、細胞培養用のディッシュ、及び細胞培養用のウェルプレート等が挙げられ、当該基材がディッシュの底部又はウェルプレートのウェルの底部に固定されている構成が例示される。或いは、細胞培養用の基体が平板状の部材（ディスク又はプレート等）であって、その表面に非生物性の基材が膜状に固定されていてもよい（図５参照）。なお、細胞培養用の基体に上記基材を固定する方法は特に限定されず、基体及び基材の材質等に応じて、適宜、方法を選択すればよい。例えば、基材が含水ゲルであって、細胞培養用の基体上で当該含水ゲルを生成する場合には、含水ゲルの接着力を利用して両者を固定してもよいし、必要に応じて適切なシランカップリング剤でガラス製等の基体の表面を処理しておいてから両者を固定してもよい。
また、作製キットにおいて、非生物性の上記基材の表面のうち体細胞が接する側の表面が、取り外し可能な保護層で保護されていることが好ましい。保護層は、例えばガラス薄膜、又はプラスチック薄膜であり、作製キットの使用時には、体細胞を播種するためにこれら保護層を取り外す（図５中の（ｂ）も参照）。例えば、非生物性の上記基材が含水ゲルの場合、当該ゲルが有する接着性を利用して保護層を付着させておくことができ、これによって含水ゲルの乾燥及び変質を防止することができる。なお、含水ゲルの乾燥及び変質を防止する目的では、必ずしも含水ゲルに保護層が直接的に接着した構成を採る必要はなく、例えば、保護層が間接的に基材上を被覆して保護する構成（例えばウェルプレート上を保護層が被覆する構成）、又は密閉性の高い袋の中に基材が格納された構成等であってもよい。
また、作製キットにおいて、上記のヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤から選択される少なくとも一つが、非生物性の上記基材中に含まれている構成であってもよい。これらの「添加剤」が予め基材中に含まれていれば、利便性の向上、及び作製キットのコンパクト化の観点では好ましい。なお、基材が含水ゲルの場合には、これらの「添加剤」を水に溶解又は懸濁した状態で基材中に取り込ませることができる。
なお、これらの「添加剤」を基材に取り込ませる以外の態様としては、例えば、「添加剤」が水等に溶解又は懸濁した状態で、蓋付の格納容器、又は格納袋内に収容されているものが挙げられる。或いは、「添加剤」が常温常圧で固体の場合には、当該固体の状態で、蓋付の格納容器、又は格納袋内に収容されているものが挙げられる。
また、作製キットは、キットの使用説明書を備えていてもよい。キットの使用説明書には、上記〔１．体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及びリプログラミングが亢進された細胞〕の欄で記載したような、体細胞のリプログラミングを亢進させる方法が記録されている。使用説明書は、例えば、紙等の記録媒体に印刷されていてもよいし、フロッピディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、ＭＤ、又はフラッシュメモリ等の電子的な記録媒体に電子的に記録されているものでもよい。
この作製キットは、本発明に係る体細胞のリプログラミングを亢進させる方法、及び当該方法を実施するための培養システムの構築に好適に用いることができる。
〔３．まとめ〕
以上のように、本発明は以下の何れかの内容を包含する。
１）体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。
２）上記基材の弾性率が０．２ｋＰａ以上で１ｋＰａ以下の範囲内である、１）に記載の方法。
３）上記基材が含水ゲルである、１）又は２）に記載の方法。
４）上記含水ゲルは、アクリルアミドの基本骨格を有するモノマーの単独重合体又は共重合体の含水ゲルである、３）に記載の方法。
５）上記培養工程は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤の存在下において行われる、１）～４）の何れかに記載の方法。
６）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が含まれる場合にその濃度は１０μＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内である、１）～５）の何れかに記載の方法。
７）上記体細胞は繊維芽細胞である、１）～６）の何れかに記載の方法。
８）上記培養工程を経て上記体細胞のリプログラミングを亢進させることで、Ｎanog及びOct3/4陽性であるとともに、テラトーマ形成能を有する細胞が生じる、１）～７）の何れかに記載の方法。
９）弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子と、を備えた、リプログラミングされた細胞を作製するキット。
１０）上記ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子が徐放性を示す形態で含まれている、９）に記載のキット。
１１）非生物性の上記基材が、細胞培養用の基体の表面に固定されている、９）又は１０）に記載のキット。
１２）リプログラミングが亢進された細胞の作製方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。１３）上記１）～８）の何れかに記載の方法によって体細胞のリプログラミングを亢進させる工程を含む、リプログラミングが亢進された細胞の作製方法。
１４）（ａ）細胞培養用の基体、（ｂ）当該基体中に配置された、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子を含む細胞培養培地、および（ｃ）当該細胞培養培地中に浸漬された、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材、を含む培養システム。
１５）未分化能向上因子として、ＣＣＬ２が上記細胞培養培地および／または上記非生物性の基材に添加された、１４）に記載のシステム。
以上のように、本発明は以下の何れかの内容を包含する。
１）体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。
２）上記基材の弾性率が０．２ｋＰａ以上で１ｋＰａ以下の範囲内である、１）に記載の方法。
３）上記基材が含水ゲルである、１）又は２）に記載の方法。
４）上記含水ゲルは、アクリルアミドの基本骨格を有するモノマーの単独重合体又は共重合体の含水ゲルである、３）に記載の方法。
５）上記培養工程は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤の存在下において行われる、１）～４）の何れかに記載の方法。
６）ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が含まれる場合にその濃度は１０μＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内である、１）～５）の何れかに記載の方法。
７）上記体細胞は繊維芽細胞である、１）～６）の何れかに記載の方法。
８）上記培養工程を経て上記体細胞のリプログラミングを亢進させることで、Ｎanog及びOct3/4陽性であるとともに、テラトーマ形成能を有する細胞が生じる、１）～７）の何れかに記載の方法。
９）弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子と、を備えた、リプログラミングされた細胞を作製するキット。
１０）上記ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子が徐放性を示す形態で含まれている、９）に記載のキット。
１１）非生物性の上記基材が、細胞培養用の基体の表面に固定されている、９）又は１０）に記載のキット。
１２）リプログラミングが亢進された細胞の作製方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。１３）上記１）～８）の何れかに記載の方法によって体細胞のリプログラミングを亢進させる工程を含む、リプログラミングが亢進された細胞の作製方法。
１４）（ａ）細胞培養用の基体、（ｂ）当該基体中に配置された、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子を含む細胞培養培地、および（ｃ）当該細胞培養培地中に浸漬された、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材、を含む培養システム。
１５）未分化能向上因子として、ＣＣＬ２が上記細胞培養培地および／または上記非生物性の基材に添加された、１４）に記載のシステム。
〔実施例１〕
（基盤の準備）
直径２５ｍｍの円形ガラス板（Fisherscientific社製）を１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板を、０．５％の3-methacryloxypropyltriethoxysilaneと１％のアセトンとを含む水溶液にて１時間浸したのち、再び１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板上に、８．５μリットルの３～４％ Acrylamide、０．０３～０．２２５％ N,N’-Methylenebisacrylamide、０．１％ Tetramethylethylenediamine、及び０．１％ ammonium persulfateを含有する水溶液を滴下し、さらに直径２２ｍｍの円形ガラス板を重層した（図５中の（ａ）参照）。ゲルの堅さはAcrylamideとN,N’-Methylenebisacrylamideとの比を変えることによって調整した。１時間後に、ゲルが固化した後に、直径２２ｍｍの円形ガラス板を取り除き（図５中の（ｂ）参照）、５０ｍＭのHEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にて洗浄した。このようにしてポリアクリルアミド系の含水ゲルが付着した基盤（ゲル基盤）を準備した。
（基盤の準備）
直径２５ｍｍの円形ガラス板（Fisherscientific社製）を１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板を、０．５％の3-methacryloxypropyltriethoxysilaneと１％のアセトンとを含む水溶液にて１時間浸したのち、再び１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板上に、８．５μリットルの３～４％ Acrylamide、０．０３～０．２２５％ N,N’-Methylenebisacrylamide、０．１％ Tetramethylethylenediamine、及び０．１％ ammonium persulfateを含有する水溶液を滴下し、さらに直径２２ｍｍの円形ガラス板を重層した（図５中の（ａ）参照）。ゲルの堅さはAcrylamideとN,N’-Methylenebisacrylamideとの比を変えることによって調整した。１時間後に、ゲルが固化した後に、直径２２ｍｍの円形ガラス板を取り除き（図５中の（ｂ）参照）、５０ｍＭのHEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にて洗浄した。このようにしてポリアクリルアミド系の含水ゲルが付着した基盤（ゲル基盤）を準備した。
（基盤のコート）
作成したゲル基盤の上に、５００μリットルの０．０５％ sulfo-SANPAH水溶液を滴下し、波長３１２ｎｍの紫外光を１０分間照射した。その後、５０ｍＭ HEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にてゲル基盤を洗浄し、次いで０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭ HEPES水溶液に翌日まで浸した（図５中の（ｃ）参照）。
作成したゲル基盤の上に、５００μリットルの０．０５％ sulfo-SANPAH水溶液を滴下し、波長３１２ｎｍの紫外光を１０分間照射した。その後、５０ｍＭ HEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にてゲル基盤を洗浄し、次いで０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭ HEPES水溶液に翌日まで浸した（図５中の（ｃ）参照）。
含水ゲルの弾性率の測定：
作成した含水ゲルの弾性率は、上記のゲル基盤上に形成したものを対象として測定した。具体的には、ゲル基盤をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS)水溶液に浸漬して、含水ゲルを充分に膨潤させた（実質的な飽和膨潤状態）。次いで、この含水ゲル上に、重量0.0159ｇの円柱状（底面の半径＝1.65ｍｍ）のおもりを配置し、当該おもりの沈み込み量から、上記式（１）に基づいて含水ゲルの弾性率を求めた。
作成した含水ゲルの弾性率は、上記のゲル基盤上に形成したものを対象として測定した。具体的には、ゲル基盤をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS)水溶液に浸漬して、含水ゲルを充分に膨潤させた（実質的な飽和膨潤状態）。次いで、この含水ゲル上に、重量0.0159ｇの円柱状（底面の半径＝1.65ｍｍ）のおもりを配置し、当該おもりの沈み込み量から、上記式（１）に基づいて含水ゲルの弾性率を求めた。
（細胞の播種及び培養）
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）を、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）を、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
また対照実験として、ゲル基盤に代えて硬いプラスチック（BDファルコン社製細胞培養ディッシュ）又はフィーダ細胞上で培養を行った以外は同様の条件にて、ヒト線維芽細胞を培養した。
（結果）
Nanog陽性、Oct3/4陽性、コロニーの出現
ヒト線維芽細胞を柔らかい基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れ、免疫染色したところほとんどの細胞がNanogとOct3/4を発現していた。NanogとOct3/4が両方発現しているコロニーの数は、堅いプラスチック（図中でRigidとして示す）上で培養したときと比べ、有意に大きかった（図１及び図２参照）。
Nanog陽性、Oct3/4陽性、コロニーの出現
ヒト線維芽細胞を柔らかい基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れ、免疫染色したところほとんどの細胞がNanogとOct3/4を発現していた。NanogとOct3/4が両方発現しているコロニーの数は、堅いプラスチック（図中でRigidとして示す）上で培養したときと比べ、有意に大きかった（図１及び図２参照）。
未分化マーカーの発現
堅さ（弾性率）１ｋＰａの基盤の上で培養した細胞に関して、未分化マーカーを発現しているかどうかを調べたところ、SSEA3、SSEA4、及びSox2の発現が上昇していることが免疫染色法で確認された。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲでｍＲＮＡの量を調べたところ、Oct3/4は弾性率０．２～３ｋＰａのゲル基盤上で培養した場合に、Nanogは弾性率１ｋＰａのゲル基盤上で培養した場合に、堅いプラスチック上で培養した場合と比べて多くなっていた（図３及び図４参照）。
堅さ（弾性率）１ｋＰａの基盤の上で培養した細胞に関して、未分化マーカーを発現しているかどうかを調べたところ、SSEA3、SSEA4、及びSox2の発現が上昇していることが免疫染色法で確認された。また、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲでｍＲＮＡの量を調べたところ、Oct3/4は弾性率０．２～３ｋＰａのゲル基盤上で培養した場合に、Nanogは弾性率１ｋＰａのゲル基盤上で培養した場合に、堅いプラスチック上で培養した場合と比べて多くなっていた（図３及び図４参照）。
〔実施例２〕
（基盤の準備）
直径２５ｍｍの円形ガラス板（Fisherscientific社製）を１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板を、０．５％の3-methacryloxypropyltriethoxysilaneと１％のアセトンとを含む水溶液にて１時間浸したのち、再び１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板上に、８．５μリットルの３％ Acrylamide、０．１％ N,N'-Methylenebisacrylamide、０．１％ Tetramethylethylenediamine、及び０．１％ ammonium persulfateを含有する水溶液を滴下し、さらに直径２２ｍｍの円形ガラス板を重層した。１時間後に、ゲルが固化した後に、直径２２ｍｍの円形ガラス板を取り除き、５０ｍＭのHEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にて洗浄した。このようにしてポリアクリルアミド系の含水ゲルが付着した硬さ１ｋＰａの基盤（ゲル基盤）を準備した。
（基盤の準備）
直径２５ｍｍの円形ガラス板（Fisherscientific社製）を１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板を、０．５％の3-methacryloxypropyltriethoxysilaneと１％のアセトンとを含む水溶液にて１時間浸したのち、再び１００％エタノールで洗浄し乾燥させた。この円形ガラス板上に、８．５μリットルの３％ Acrylamide、０．１％ N,N'-Methylenebisacrylamide、０．１％ Tetramethylethylenediamine、及び０．１％ ammonium persulfateを含有する水溶液を滴下し、さらに直径２２ｍｍの円形ガラス板を重層した。１時間後に、ゲルが固化した後に、直径２２ｍｍの円形ガラス板を取り除き、５０ｍＭのHEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にて洗浄した。このようにしてポリアクリルアミド系の含水ゲルが付着した硬さ１ｋＰａの基盤（ゲル基盤）を準備した。
（基盤のコート）
作成したゲル基盤の上に、５００μリットルの０．０５％ sulfo-SANPAH水溶液を滴下し、波長３１２ｎｍの紫外光を１０分間照射した。その後、５０ｍＭ HEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にてゲル基盤を洗浄し、次いで０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭ HEPES水溶液に翌日まで浸した。
作成したゲル基盤の上に、５００μリットルの０．０５％ sulfo-SANPAH水溶液を滴下し、波長３１２ｎｍの紫外光を１０分間照射した。その後、５０ｍＭ HEPES 含有水溶液（ＰＨ８．５）にてゲル基盤を洗浄し、次いで０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭ HEPES水溶液に翌日まで浸した。
（細胞の播種及び培養）
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）を、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、及び以下（１）～（４）の何れかの組み合わせの試薬を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。
（１）５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（－ＮａＢ）
（２）０．２５ｍＭ ＮａＢ、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（－ＰＳ４８）
（３）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、及び０．５μＭ PD0325901（－Ａ８３０１）
（４）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、及び０．５μＭ A-83-01（－ＰＤ０３２５９０１）
細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）を、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、及び以下（１）～（４）の何れかの組み合わせの試薬を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。
（１）５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（－ＮａＢ）
（２）０．２５ｍＭ ＮａＢ、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（－ＰＳ４８）
（３）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、及び０．５μＭ PD0325901（－Ａ８３０１）
（４）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、及び０．５μＭ A-83-01（－ＰＤ０３２５９０１）
細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
また、０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01及び０．５μＭ PD0325901を加えた培地（４ｉ）及び薬剤を加えなかった培地（０ｉ）でも同様にヒト線維芽細胞を培養した。
（結果）
Nanog及びOct3/4の発現を免疫染色によって比較した。ヒト線維芽細胞を薬剤の組み合わせを変えて１ｋＰａの硬さの基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れた。また、免疫染色したところほとんどの細胞がNanog（赤色）を発現していた。一方、Oct3/4（緑色）は、４ｉの条件及び－Ａ８３０１の条件で発現が多く観察された（図６）。また、Nanog及びOct3/4の発現を定量的に調べるため、免疫染色画像の蛍光強度を比較したところ、－Ａ８３０１の条件で４ｉの条件の９割程度のNanog発現及びOct3/4発現が見られた（図７）。
Nanog及びOct3/4の発現を免疫染色によって比較した。ヒト線維芽細胞を薬剤の組み合わせを変えて１ｋＰａの硬さの基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れた。また、免疫染色したところほとんどの細胞がNanog（赤色）を発現していた。一方、Oct3/4（緑色）は、４ｉの条件及び－Ａ８３０１の条件で発現が多く観察された（図６）。また、Nanog及びOct3/4の発現を定量的に調べるため、免疫染色画像の蛍光強度を比較したところ、－Ａ８３０１の条件で４ｉの条件の９割程度のNanog発現及びOct3/4発現が見られた（図７）。
〔実施例３〕
（基盤の準備）
実施例２と同様に行った。
（基盤の準備）
実施例２と同様に行った。
（基盤のコート）
実施例２と同様に行った。
実施例２と同様に行った。
（細胞の播種及び培養）
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）は、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、及び以下（１）～（４）の何れかの組み合わせの試薬を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。
（１）２０ｎＭ トリコスタチンＡ（シグマ・アルドリッヒ社製）、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（ＴｒｉＡ）
（２）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、２μＭ SB431542（シグマ・アルドリッヒ社製）、及び０．５μＭ PD0325901（ＳＢ４３１５４２）
（３）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、１００ｎＭ LY2157299（和光純薬社製）、及び０．５μＭ PD0325901（ＬＹ２１５７２９９）
（４）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び１００ｎＭ U0126（シグマ・アルドリッヒ社製）（Ｕ０１２６）
細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
ヒト線維芽細胞（ScienCell社）は、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、及び１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地にて培養した。培養した細胞を回収し、次いで、ゲル基盤１枚につき５×１０4個の細胞を播種し、１０％牛胎児血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、及び以下（１）～（４）の何れかの組み合わせの試薬を含むダルベッコ改変イーゲル培地にて４日間培養した。
（１）２０ｎＭ トリコスタチンＡ（シグマ・アルドリッヒ社製）、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び０．５μＭ PD0325901（ＴｒｉＡ）
（２）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、２μＭ SB431542（シグマ・アルドリッヒ社製）、及び０．５μＭ PD0325901（ＳＢ４３１５４２）
（３）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、１００ｎＭ LY2157299（和光純薬社製）、及び０．５μＭ PD0325901（ＬＹ２１５７２９９）
（４）０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01、及び１００ｎＭ U0126（シグマ・アルドリッヒ社製）（Ｕ０１２６）
細胞の培養に際して、ゲル基盤は、それを格納可能な大きさの細胞培養ディッシュ内に配置し、ゲル基盤が培地に完全に浸漬した状態とした。
また、０．２５ｍＭ ＮａＢ、５μＭ PS48、０．５μＭ A-83-01及び０．５μＭ PD0325901を加えた培地（４ｉ）及び薬剤を加えなかった培地（０ｉ）でも同様にヒト線維芽細胞を培養した。
（結果）
Nanog及びOct3/4の発現を免疫染色によって比較した。ヒト線維芽細胞を薬剤の組み合わせを変えて１ｋＰａの硬さの基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れた。また、免疫染色したところほとんどの細胞がNanog（赤色）を発現していた。一方、Oct3/4（緑色）は、４ｉの条件及びＴｒｉＡの条件で発現が多く観察された（図８）。また、Nanog及びOct3/4の発現を定量的に調べるため、免疫染色画像の蛍光強度を比較したところ、ＴｒｉＡの条件で４ｉの条件の８割程度のNanog発現、１割五分増しのOct3/4発現が見られた。
Nanog及びOct3/4の発現を免疫染色によって比較した。ヒト線維芽細胞を薬剤の組み合わせを変えて１ｋＰａの硬さの基盤（ゲル基盤）上で培養したところ、培養４日後でＥＳ様コロニーが現れた。また、免疫染色したところほとんどの細胞がNanog（赤色）を発現していた。一方、Oct3/4（緑色）は、４ｉの条件及びＴｒｉＡの条件で発現が多く観察された（図８）。また、Nanog及びOct3/4の発現を定量的に調べるため、免疫染色画像の蛍光強度を比較したところ、ＴｒｉＡの条件で４ｉの条件の８割程度のNanog発現、１割五分増しのOct3/4発現が見られた。
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載した参考文献に記載の内容は全て、リファレンスとして本明細書の内容に援用される。
本発明は、遺伝子の導入を要することなく細胞のリプログラミングを亢進させる方法を提供する。
Claims (13)
- 体細胞のリプログラミングを亢進させる方法であって、
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。 - 上記基材の弾性率が０．２ｋＰａ以上で１ｋＰａ以下の範囲内である、請求項１に記載の方法。
- 上記基材が含水ゲルである、請求項１又は２に記載の方法。
- 上記含水ゲルは、アクリルアミドの基本骨格を有するモノマーの単独重合体又は共重合体の含水ゲルである、請求項３に記載の方法。
- 上記培養工程は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤の存在下において行われる、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
- ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．１ｎＭ以上で１０ｍＭ以下の範囲内であり、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．１ｎＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内であり、３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤が含まれる場合にその濃度は０．０１μＭ以上で１ｍＭ以下の範囲内である、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
- 上記体細胞は繊維芽細胞である、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
- 上記培養工程を経て上記体細胞のリプログラミングを亢進させることで、Ｎanog及びOct3/4陽性であるとともに、テラトーマ形成能を有する細胞が生じる、請求項１～７の何れか一項に記載の方法。
- 弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材と、
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子と、を備えた、リプログラミングされた細胞を作製するキット。 - 上記ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子が徐放性を示す形態で含まれている、請求項９に記載のキット。
- 非生物性の上記基材が、細胞培養用の基体の表面に固定されている、請求項９又は１０に記載のキット。
- リプログラミングが亢進された細胞の作製方法であって、
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子の存在下において、
弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材に接した状態で体細胞を培養する培養工程を含む、方法。 - （ａ）細胞培養用の基体、
（ｂ）当該基体中に配置された、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤、ＴＧＦ－β受容体の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、及び３’－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１の活性化剤からなる因子群より選択される少なくとも一つの因子を含む細胞培養培地、および
（ｃ）当該細胞培養培地中に浸漬された、弾性率が０．１ｋＰａ以上で２００ｋＰａ以下の範囲内である非生物性の基材、
を含む培養システム。
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2013
- 2013-11-29 WO PCT/JP2013/082246 patent/WO2014058080A1/ja not_active Ceased
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