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WO2014054917A1 - 허혈혈청을 포함하는 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 활성화 촉진 방법 - Google Patents

허혈혈청을 포함하는 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 활성화 촉진 방법 Download PDF

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WO2014054917A1
WO2014054917A1 PCT/KR2013/008904 KR2013008904W WO2014054917A1 WO 2014054917 A1 WO2014054917 A1 WO 2014054917A1 KR 2013008904 W KR2013008904 W KR 2013008904W WO 2014054917 A1 WO2014054917 A1 WO 2014054917A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
stem cells
ischemic
serum
promoting
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2013/008904
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English (en)
French (fr)
Inventor
방오영
문경준
조연희
김석재
김동희
류수경
이지현
남지윤
성지희
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Life Public Welfare Foundation
Original Assignee
Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2015535568A priority Critical patent/JP6203273B2/ja
Priority to US14/433,495 priority patent/US10072247B2/en
Priority to EP13843643.1A priority patent/EP2905331A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting stem cell activation comprising ischemia and a method for promoting activation of stem cells.
  • the present invention also relates to stem cells whose activation is promoted by ischemia serum stimulation.
  • stem cells As an alternative to solve these problems, interest in stem cells has increased, and pluripotent stem cells with the ability to form all organs through proliferation and differentiation have been treated for most diseases, as well as Parkinson's disease and various cancers. It is suggested that it can be applied to a variety of treatments, such as diabetes and spinal cord injury.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more new cells. Embryonic stem cells, induced pluripotent cells, and adult stem cells (adult stem cell) and the like are the most actively studied. In the case of embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, there are still limitations in applying them to the clinic due to stability issues such as ethical issues and tumor formation. In the case of adult stem cells, clinical studies have been conducted in patients due to its stability, but in the case of neural stem cells and cord blood cells, adult cells are transplanted to themselves. Autograft is not yet possible and there is a limit to transplant the nerve stem of others. Bone marrow or adipose-derived mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells) are the stem cells that are most actively studied in the clinic because they can be easily obtained in the human body.
  • stem cells obtained from normal individuals have been reported to be superior in functional recovery after cerebral infarction compared to stem cells from bone marrow of normal animals (Zacharek A, Shehadah A, Chen J, Cui X, Roberts C, Lu). M, Chopp M. Comparison of bone marrow stromal cells derived from stroke and normal rats for stroke treatment.Stroke. 2010; 41: 524-530).
  • stem cells obtained from patients may change the characteristics of stem cells during long-term incubation in bovine serum.
  • stem cell therapy After transplanting stem cells, there is a problem that the number of stem cells is significantly reduced after a certain time. This is because cell death occurs when stem cells are placed in toxic environments such as cerebral infarction and myocardial infarction. Therefore, it is important for stem cell therapy to improve the viability of stem cells to be transplanted so that stem cells survive in the long term and maintain a therapeutic effect.
  • FBS fetal bovine serum
  • the present inventors are studying how to apply appropriate stimulation to stem cells to maintain an activated state in the early stages of cerebral infarction suitable for transplantation.
  • stimulating stem cells with ischemic serum growth factors in stem cells It was confirmed that the secretion of is promoted, the proliferative power is improved, the survival is increased, and the like, the activation of stem cells is promoted, and completed the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide an activated stem cell cultured in a medium containing ischemic serum.
  • the present inventors are studying how to apply appropriate stimulation to stem cells to maintain an activated state in the early stages of cerebral infarction suitable for transplantation.
  • stimulating stem cells with ischemic serum growth factors in stem cells It was confirmed that the secretion of is promoted, the proliferative power is improved, the survival is increased, and the like, the activation of stem cells is promoted, and completed the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide an activated stem cell cultured in a medium containing ischemic serum.
  • the present invention provides a composition for promoting stem cell activation and a method for promoting activation of stem cells comprising ischemia as an active ingredient.
  • the present invention also provides an activated stem cell cultured in a medium containing ischemic serum.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating ischemic disease comprising stem cells cultured in a medium containing ischemic serum as an active ingredient.
  • Ischemic serum by stimulating stem cells, such as promoting the secretion of growth factors, improved survival rate, improved mobility to the site of injury, improved growth rate or maintain the characteristics of stem cells suitable for transplantation of stem cells into brain patients Activation can be promoted to be in a state.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the contents of the present invention for activating stem cells using acute stimulation ischemia.
  • Figure 2 is a microscopic observation of the stem cells cultured using FBS, normal serum, ischemic serum (A), the results of confirming the cell phenotype of the stem cells using flow cytometric analysis (B and C) , And cell growth rate (D) (FBS: bovine serum treated group, IS: ischemic serum treated group, NS: normal serum treated group).
  • FBS bovine serum treated group
  • IS ischemic serum treated group
  • NS normal serum treated group
  • Figure 3 is a real-time genetic analysis (Real-) expression of the growth factor (VEGF, GDNF, HGF, bFGFF) gene and stem cell differentiation factor (BDNF, NGF) expression in stem cells after incubating mesenchymal stem cells with ischemic serum or FBS The results measured using time PCR) is shown (10% FBS: bovine serum treated group, 10% IS: 10% ischemic serum treated group, 10% NS: 10% normal serum treated group).
  • VEGF growth factor
  • GDNF GDNF
  • HGF bFGFF
  • BDNF stem cell differentiation factor
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of confirming whether the stem cells treated with ischemic serum is promoted to ischemic tissues and the change of stem cell migration ability when treated with blocking agents AMD3100 and PHA66752 (FBS: small serum treated group, IS) : Ischemic serum treated group, NS: normal serum treated group, IBE: ischemic brain extracts).
  • FBS small serum treated group
  • IS Ischemic serum treated group
  • NS normal serum treated group
  • IBE ischemic brain extracts
  • FIG. 5 is a view showing the results of confirming the change in the growth rate and the cell cycle of the cell according to the treatment of ischemia.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of confirming the cell survival rate of stem cells according to ischemic serum treatment in ischemic brain-like environment (FBS: small serum treatment group, IS: ischemic serum treatment group, NS: general serum treatment group).
  • FBS small serum treatment group
  • IS ischemic serum treatment group
  • NS general serum treatment group
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of confirming the change in the number of cells according to the period of mesenchymal stem cell culture with this after obtaining ischemic serum according to the elapsed time after ischemia induction in cerebral ischemia animals (P3: 3 passage culture, P4: 4) Passage culture, FBS: bovine serum treated group, 1D IS: ischemic serum treated group 1 day after cerebral infarction, 7D IS: ischemic serum treated group 7 days after cerebral infarction, 14D IS: ischemic serum treated group 14 days after cerebral infarction, 28D IS: cerebral infarction Ischemia serum treated group on day 28).
  • FBS bovine serum treated group
  • 1D IS ischemic serum treated group 1 day after cerebral infarction
  • 7D IS ischemic serum treated group 7 days after cerebral infarction
  • 14D IS ischemic serum treated group 14 days after cerebral infarction
  • 28D IS cerebral infarction Ischemia serum treated group on day 28).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of confirming the change in cell cycle according to the period during the mesenchymal stem cell culture after obtaining the ischemia serum according to the elapsed time after ischemia induction in cerebral ischemia animals (P3: three passage culture, P4: four passage) Culture, FBS: bovine serum treated group, 1D IS: ischemic serum treated group 1 day after cerebral infarction, 7D IS: ischemic serum treated group 7 days after cerebral infarction, 14D IS: ischemic serum treated group 14 days after cerebral infarction, 28D IS: post cerebral infarction Ischemia treated group on day 28).
  • FIG. 9 is a diagram showing the survival rate of stem cells in ischemia-brain-like environment according to the period of time in culture of mesenchymal stem cells after the ischemia was obtained according to the elapsed time after ischemia induction in cerebral ischemia animals (P3: 3 passage culture) , P4: 4 passage culture, FBS: bovine serum treated group, 1D IS: ischemia treated group 1 day after cerebral infarction, 7D IS: ischemic serum treated group 7 days after cerebral infarction, 14D IS: ischemic serum treated group 14 days after cerebral infarction, 28D IS: ischemia treated group 28 days after cerebral infarction).
  • Figure 10 is obtained after ischemia induction in ischemia in the cerebral ischemia animal is obtained by culturing the mesenchymal stem cells from the two passages cultured from two passages aging through beta-galactosidase staining in six passages culture (P3: 3 passage culture, P4: 4 passage culture, FBS: bovine serum treatment group, 1D IS: ischemia serum treatment group 1 day after cerebral infarction, 7D IS: ischemia serum treatment 7 day after cerebral infarction) Group, 14D IS: ischemia treated group 14 days after cerebral infarction, 28D IS: ischemic serum treated group 28 days after cerebral infarction)
  • ischemic serum obtained on day 1 after ischemia induction in cerebral ischemia compared with normal serum (A).
  • Fractalkine, CD54, LIX, L-selectin, RANTES, and TIMP-1 were found to have low levels (NS: normal serum, IS: ischemic serum). Serum was obtained and the levels of TIMP-1 and VEGF (C) contained in the serum were observed by ELISA.
  • TIMP-1 tended to decrease compared to normal serum on day 1, and serum on day 7 and 14 and 28 was statistically significant.
  • VEGF showed a tendency to increase over time compared to normal serum (1D IS: ischemia at day 1 after cerebral infarction, 7D IS: ischemia at day 7 after cerebral infarction, 14D ischemia at day 14 after cerebral infarction, 28D IS). : Ischemic serum 28 days after cerebral infarction).
  • FIG 12 after obtaining the serum of cerebral infarction patients and the normal control group was confirmed the cytokine and growth factor levels contained in the serum using the cytokine multiplex method. Quantitative analysis revealed that VEGF and HGF were high in serum of cerebral infarction (A), while BDNF and NGF were low (B). Chemokines MCP-1, SDF-1 and SCF were found to be low in serum of cerebral infarction patients (C).
  • the present invention provides a composition for promoting stem cell activation, comprising ischemia as an active ingredient.
  • Ischemic serum according to the present invention stimulates stem cells, thereby promoting activation such that growth of secretion of growth factors, improvement of survival rate, improvement of mobility to the site of injury, improvement of proliferation rate, etc., so that the stem cells are in a state suitable for transplantation into patients with brain injury You can.
  • the ischemic serum is serum obtained from a patient suffering from at least one disease selected from the group consisting of cerebral infarction, myocardial infarction, cerebral hemorrhage, neurotrauma and spinal cord injury, and includes all kinds of ischemic serum or autologous ischemic serum.
  • the ischemic serum may have different properties from the serum in a normal state and may promote activation of stem cells when treated in stem cells.
  • the ischemic serum When the ischemic serum is obtained from acute cerebral infarction, the ischemic serum may be obtained from a patient within 1 to 90 days of the onset of cerebral infarction, and preferably the ischemic serum obtained within 1 to 30 days immediately after the cerebral infarction.
  • the concentration of ischemia added is preferably treated at a concentration of 5% to 20%, more preferably at a concentration of 10%.
  • the ischemic serum may be further included in inflammatory cytokines or cell growth factors compared to normal serum.
  • the inflammatory cytokine may be cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1 (CINC-1), interleukin-1 (IL-1) or macrophage inflammatory protein 3 (MIP-3), and the cell growth factor is VEGF (Vascular endothelial growth factor).
  • CINC-1 cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1
  • IL-1 interleukin-1
  • MIP-3 macrophage inflammatory protein 3
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • But may be, but not limited to, GLDF (Glial cell-derived neurotrophic factor), HGF (hepatocyte growth factor) or bFGF (basic fibroblast growth factor).
  • the ischemic serum may be less cell differentiation factor or chemokine compared to the general serum.
  • the chemokine may be SDF-1 (Stromal cell-derived factor-1), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) or SCF (Stem cell factor), the cell differentiation factor is a brain derived neurotrophic factor (BDNF) or NGF (Nerve growth factor) may be, but is not limited thereto.
  • Stem cells may be activated by exposure to an active substance, and stem cell activation includes growth factor secretion, improvement of survival rate, improvement of mobility to damaged sites, improvement of proliferation rate, or maintenance of stem cell characteristics of stem cells, It means that the stem cells change to be suitable for transplantation. Activated stem cells can be transplanted directly to the damaged area without the need for long culture periods. Such stem cell activation may be accompanied by changes in cell cycle and growth factor genes by stimulation of active substances. Therefore, the activation of stem cells means that the normal culture stem cells are induced and promoted to be transplanted to the site of injury.
  • the stem cells may include adult stem cells, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, adipose stem cells, hematopoietic stem cells, umbilical cord blood stem cells and dedifferentiated stem cells, and may be allogeneic or autologous stem cells.
  • the present invention provides a medium for promoting stem cell activation, comprising the step of culturing stem cells in the medium, including ischemia serum as an active ingredient, the method for promoting activation of stem cells.
  • the stem cell activation promoting medium is generally a medium containing ischemic serum in a medium that can be used in the art.
  • DMEM Denbecco's modified essential medium
  • NPBM Neuronal progenitor cell basal medium: Clonetics
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • EGF Extramal growth factor
  • the concentration may be 1 ng / ml to 100 ng / ml, preferably 10 ng / ml. Can be.
  • Stem cell activation-promoting medium containing ischemic serum may be made to be activated by stimulating stem cells by including ischemic serum in the basic medium, and more specifically.
  • Stem cells cultured in the medium may promote the secretion of growth factors, and may be a form of stem cells suitable for transplantation, such as improving survival rate, improving mobility to an injury site, and increasing proliferation rate.
  • Ischemic serum contained in the stem cell activation promoting medium may be preferably included in a concentration of 5 to 20%, more preferably in a concentration of 10%.
  • Cultivation for the activation of stem cells in the stem cell activation promoting medium, including ischemia as an active ingredient may be made by incubating for 24 hours at a temperature of 33 °C to 38 °C, preferably 37 °C.
  • the stem cells can be cultured in a rich state or attached to the culture vessel.
  • the culture vessel for example, a chamber glass, a non-coating dish such as a container widely used in the art may be used.
  • the present invention also provides an activated stem cell cultured in a medium containing ischemic serum.
  • the activated stem cells are stem cells having characteristics of improving growth factor secretory capacity, survival rate, mobility to damaged sites, improvement of proliferation rate, or maintenance of characteristics as stem cells.
  • the growth factor means a protein having an important function of regulating the proliferation, growth, and maintenance of stem cells, but is not particularly limited thereto, but includes, but is not limited to, VEGF (Vascular endothelial growth factor), GDN F (Glial cell-derived neurotrophic factor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4 (Neurotrophin-4), EGF (Epidermal growth factor), bFGF (Basic fibroblast growth factor) or CNTF (Ciliaryneurotrophic factor) and the like.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • GDN F Glial cell-derived neurotrophic factor
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • NT-4 Neurotrophin-4
  • EGF Epidermatitis growth factor
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • CNTF Central fibroblast growth factor
  • the damage refers to damage caused by ischemia.
  • the improvement in growth rate refers to an increase in cell proliferation rate
  • the rate of cell proliferation refers to a rate at which stem cells self-differentiate to increase the number of cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic disease comprising the activated stem cells as an active ingredient.
  • Ischemic serum according to the present invention is suitable for transplantation of stem cells into brain injury patients by stimulating stem cells, promoting the growth factor secretion, improved survival rate, improved mobility to the site of injury, improved growth rate or maintain the characteristics of stem cells Activation can be promoted to be in a state. Therefore, the ischemic serum of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of ischemic diseases.
  • the ischemic disease may be ischemic brain disease or ischemic heart disease or ischemic peripheral vascular disease.
  • the mechanisms of ischemic brain disease, ischemic heart disease, and peripheral vascular disease are very similar, and the same or similar effect may be seen in ischemic heart disease or peripheral vascular disease if it is effective in ischemic brain disease.
  • the ischemic brain disease may include thrombosis, embolism, transient ischemic attack, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, white matter dysfunction, and small infarction
  • the ischemic heart disease may include myocardial infarction or angina.
  • the stem cells may be used for transplantation as it is, and may be transplanted as a composition to which various agents are added or gene-introduced to improve the treatment efficiency according to the transplantation.
  • composition of the present invention for example, 1) the addition of a substance that improves the cell proliferation rate of the present invention or promotes further differentiation into neuronal cells, or the introduction of a gene having such an effect, 2) the present invention
  • the addition of a substance that improves the survival rate in the damaged nerve tissue of the cell, or the introduction of a gene having such an effect 3) the addition of a substance that prevents the adverse effects of the cells of the present invention from the damaged nerve tissue, or the like
  • Introduction of genes that have an effect 4) addition of substances that extend the lifespan of donor cells, or introduction of genes that have such effects, 5) addition of substances that modulate the cell cycle, or such effects
  • the method of administering the stem cells of the present invention is not particularly limited and may be, for example, topical administration, intravenous administration, intraarterial administration, cerebrospinal fluid administration (eg, lumbar puncture and intraventricular administration (intraventricular adminstration). ) Can be used.
  • cell transplantation into a patient can be administered by any route as long as it can induce migration to the disease site.
  • the cells to be transplanted may be collected by injecting them into a syringe while suspended using artificial cerebrospinal fluid and physiological saline, exposing the damaged nerve tissue by surgery, and injecting the damaged portion directly with a needle. It may be considered to load the vehicle with a means for directing stem cells to the lesion.
  • the activated stem cells of the invention may be topical (including buccal, sublingual, skin and intraocular administration), parenteral (including subcutaneous, intradermal, intramuscular, instillation, intravenous, intraarterial, intraarticular and cerebrospinal fluid) or Administration can be via several routes including percutaneous administration, preferably parenteral, most preferably direct to the affected area. Since the stem cells of the present invention have high mobility to damaged areas, particularly ischemic injury sites, the stem cells can be effectively moved to areas requiring treatment.
  • injection into the cerebrospinal fluid can also be expected.
  • the cells can be injected by a normal lumbar puncture, surgery is unnecessary, and since only anesthesia is completed, the patient can be treated in a hospital room.
  • infusion into the artery and intravenous can also be expected.
  • the transplantation can be performed by the usual transfusion method, and the transplantation operation in the ward is possible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a cell therapeutic agent, and the cell therapeutic agent is a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention by cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans (US FDA regulation).
  • the cell therapeutic agent is a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention by cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans (US FDA regulation).
  • US FDA regulation for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferating and screening live autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or otherwise altering the biological properties of the cells to restore the function of the cells or tissues.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and diluent in addition to the active ingredient described above for administration.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, textose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil.
  • compositions of the present invention can be prepared in various parenteral forms according to known methods.
  • isotonic aqueous solutions or suspensions are preferred for injectable formulations.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Effective dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on the age and gender of the patient but may be administered to a subject by suspending in a suitable diluent at a concentration of 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the diluent is used for the purpose of protecting and maintaining the cells and facilitating their use when injected into the desired tissue.
  • the diluent may include a saline solution, a phosphate buffer solution, a buffer solution such as HBSS, plasma, cerebrospinal fluid, or a blood component.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, chemical therapy, radiotherapy, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the treatment of ischemic brain disease.
  • Bone marrow was collected from white rats, diluted 1: 1 in phosphate buffer (PBS), and bone marrow-derived mesenchymal stem cells were collected by centrifugation and culture. The obtained mesenchymal stem cells were cultured under 5% CO 2 and 37 ° C. Subsequently, passage 2-5 generation (passage 2-5, P2-5) cells were used in Examples. The experiment was conducted with the approval of the Experimental Animal Research Committee.
  • PBS phosphate buffer
  • the 3 ⁇ 10 5 bone marrow-derived mesenchymal stem cells obtained in Example 1 were cultured by dividing them into a pretreatment group or a control group in a 35 mm culture dish.
  • Ischemia was continuously treated up to 4-5 generations of passage culture, and 3 days of culture were performed per passage. The experiment was repeated three times for each group.
  • Ischemic serum used in the ischemic serum treated group was obtained from 1 day old rats after inducing cerebral artery infarction in white rats. Ischemic serum was used to induce acute stimulation of stabilized stem cells, and this acute stimulation confirmed whether the stem cells are activated as stem cells suitable for transplantation into patients with ischemic brain disease.
  • the process of activating stem cells using the ischemic serum of the present invention is shown in FIG.
  • ischemic serum When ischemic serum was treated to stem cells, treatment group (10% NS, 10% IS) and FBS treated with mesenchymal stem cells or normal serum or ischemic serum to increase gene expression of growth factor Comparison was made using one control. Expression of BDNF and NGF genes involved in the differentiation of VEGF, GDNF, HGF, bFGF, and stem cells, which are growth factors involved in cell growth and survival in stem cells, were determined by real-time PCR. The change in amount was measured.
  • VEGF was increased in the treatment group treated with ischemia compared to the group treated with FBS or normal serum (a), but the GDNF treatment group was not different from the serum treatment group. Increased compared to the control treated with FBS (b). In addition, in the case of HGF and bFGF, gene expression was increased in the ischemic serum treated group compared to the FBS or normal serum treated group (c and d).
  • BDNF and NGF genes which induce differentiation of stem cells into neurons, showed lower gene expression compared to the control group treated with FBS only.
  • stem cell transplantation is an important factor in the stem cell transplantation treatment, it was confirmed whether the stem cell treated with ischemic serum is promoted to ischemic tissue.
  • Stem cells pretreated with ischemic serum and non-ischemic stem cells were cultured in chamber glass, and the number of stem cells that migrated for 48 hours was measured using agagel including ischemia-brain extract.
  • factors that induce stem cell migration after treatment with chemokine SDF-1 antagonist AMD3100 or HGF receptor c-Met inhibitor PHA66752, an increase in stem cell migration was blocked. was measured.
  • stem cells activated through ischemia serum pretreatment was promoted, partially blocked by AMD3100, PHA66752 treatment.
  • ischemic serum pretreatment various factors in addition to SDF-1 and HGF are involved in the movement of these stem cells.
  • the ability of the stem cells to move to the damaged area is improved and can selectively move to the damaged area such as cerebral infarction.
  • Trypsin-treated cells were pelleted by centrifugation at 1,300 rpm for 3 minutes and then resuspended with 1 ml of 90% ethanol and incubated overnight at 4 ° C. Ethanol was removed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes and 500 ⁇ l of 0.1% triton X-100, 20 g / ml RNaseA PBS was resuspended. After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, 50 ⁇ g / ml of PI was added and the change in cell cycle according to ischemia serum treatment was measured.
  • S and G2 / M phases increased when cultured using ischemia compared to the cultured with FBS.
  • S and G2 / M phases increased after 10% and 20% ischemic serum treatment (3 days) compared to 10% FBS culture.
  • the ratio of G2 / M phase is similar to 10% FBS, the proportion of S and G2 / M phase increases compared to 10% FBS as 2, 3, and 4 generation subcultures are used.
  • ischemic serum treated group In order to determine whether the stem cells stimulated with ischemic serum are resistant in ischemic environment and can increase survival rate, ischemic serum treated group, FBS treated group and normal serum The cell viability of the treatment group was compared. After subcultured with ischemic serum, 20% ischemic brain extracts were treated with cells to form an ischemic brain like environment culture. After 24 hours, the cells were trypsinized, pelleted by centrifugation at 1300 rpm for 3 minutes with 5% FBS-PBS, and 150 ⁇ l of 1 ⁇ binding buffer was added thereto. Then, 10 ⁇ l of AnnexinV FITC and 10 ⁇ l of 50 ⁇ g / ml PI were added and reacted at room temperature for 15 minutes, followed by 350 ⁇ l of 1 ⁇ binding buffer.
  • Ischemia was obtained after 1, 7, 14, and 28 days of ischemia-induced animal from the cerebral ischemia-induced animals, and then serially cultured from 2 passages to 6 passages, and the number of cells in each passage was measured under a microscope. .
  • Ischemic induction from ischemia-induced ischemia was obtained after 1, 7, 14, and 28 days, and then trypsin-treated cells serially passaged from 2 passages to 6 passages were used to trypsin 1,300 rpm, After centrifugation for 3 minutes, pellets were resuspended with 1 ml of 90% ethanol and incubated overnight at 4 ° C. Ethanol was removed by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes and resuspended in 0.1% triton X-100, 20 ⁇ g / ml RNaseA PBS 500. After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, 50 ⁇ g / ml of PI was added, and the change in cell cycle according to passage was measured according to ischemia serum treatment.
  • the cells in the S and G2 / M phases of gene replication and cell division were increased in the group cultured with ischemia on day 1 compared with the control group cultured with FBS until 2-6 generation passage. It was. At 7, 14, and 28 days, the group cultured with ischemic serum was confirmed to increase compared to the control group cultured with FBS until 2-4 generation passage.
  • the survival rate can be increased.
  • Cell viability was compared and analyzed. Specifically, after subcultured with ischemic serum, 20% ischemic brain extracts were treated with cells to form an ischemic brain-like environment culture. After 24 hours, the cells were trypsinized, pelleted by centrifugation at 1300 rpm for 3 minutes with 5% FBS-PBS, and 150 ⁇ l of 1 ⁇ binding buffer was added thereto. Thereafter, 10 ⁇ l of AnnexinV FITC and 10 ⁇ l of 50 ⁇ g / ml PI were added and reacted at room temperature for 15 minutes, followed by 350 ⁇ l of 1 ⁇ binding buffer.
  • stem cells cultured only with FBS show a greater number of beta-galactosidase staining-positive cells than stem cells cultured with ischemic serum obtained at 1, 7 and 14 days after ischemia.
  • Visual confirmation was possible under a microscope (a).
  • the percentages of the cells that were positive for beta-galactosidase staining in the total cells were measured and the ratios were plotted (b). This confirms that ischemic serum culture can slow the aging of stem cells.
  • the levels of cytokines and growth factors contained in ischemia and normal serum used in Examples 1 and 2 were analyzed using a rat cytokine antibody array and ELISA of R & D System.
  • serum levels of cerebral infarction and normal group were obtained and analyzed using human cytokine multiplex of BIO-RAD to check the levels of cytokines and growth factors. The experiment was repeated three times for each group.
  • membranes coated with 29 different antibodies are reacted in blocking buffer for 1 hour, and serum is mixed with detection antibodies for 1 hour.
  • the sample thus reacted is mixed with the membrane and reacted at 4 ° C. for 12 hours.
  • the solution was washed three times with washing solution and reacted with streptavidin-HRP for 30 minutes. After the reaction, the result was confirmed by developing the film after washing three times with a washing solution.
  • CINC-1, IL-1, and MIP-3 were found to be high in ischemia and Fractalkine, CD54, LIX, L-selectin, RANTES, and TIMP-1 were found to be low.
  • TIMP-1 showed a tendency to decrease in ischemic serum on day 1, it was confirmed that statistically significant decrease in ischemic serum on day 7, day 14, 28 (c).
  • VEGF tended to increase with time after ischemia (d).
  • Ischemic serum was obtained from patients within 7 weeks after the onset of cerebral infarction, and the levels of cytokines and growth factors included were compared with those of normal subjects using human cytokine multiplex from BIO-RAD.
  • the standard sample was vortexed with 250 ⁇ l of standard buffer, incubated for 5 minutes on ice, and then transferred to a standard vial for 5 minutes.
  • 150 ⁇ l of standard buffer was added to each of tubes 2 to 8 of eight tubes, and 200 ⁇ l of standard solution was added to the first tube. Then 50 ⁇ l each was transferred from tube 1 to 2 and from 2 to 3 step dilution.
  • 150 ⁇ l of reading buffer was added to the prepared filter plate, and the culture was sufficiently wetted by incubating for 5 minutes, and then the buffer solution was removed by vacuum filtration.
  • the serum and normal serum of cerebral infarction patients were different in the levels of growth factors HGF, VEGF, BDNF, NGF and chemokines SDF-1, MCP-1, SCF.
  • the levels of HGF and VEGF which can promote stem cell growth and autologous division, were high in serum of cerebral infarction patients (a), while BDNF and NGF, which induce differentiation of stem cells into neurons, were low.
  • a serum of cerebral infarction patients
  • BDNF and NGF which induce differentiation of stem cells into neurons
  • chemokines SDF-1, MCP-1, and SCF which show positive chemotaxis in the body, were present in the serum of cerebral infarction patients at a lower level than the serum of normal subjects (c).
  • the levels of substances regulating stem cell activity are different in serum of cerebral infarction patients compared to serum of normal persons.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).

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Description

허혈혈청을 포함하는 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 활성화 촉진 방법
본 발명은 허혈혈청을 포함하는 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 활성화를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 허혈혈청 자극에 의해서 활성화가 촉진된 줄기세포에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근 줄기세포를 이용한 치료법은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되어 왔으나, 면역거부반응과 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
이러한 문제점을 해결할 수 있는 대안으로 줄기세포에 대한 관심이 고조되었으며, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 수 있는 능력을 가진 만능줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론, 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 적용 될 수 있다는 가능성이 제시되고 있다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 배아줄기세포(embryonic stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent cell), 성체줄기세포(adult stem cell) 등이 가장 활발하게 연구되고 있다. 이중 배아줄기세포나 유도만능줄기세포의 경우 윤리적인 문제나 종양형성과 같은 안정성 문제로 인해 임상에 적용하기에는 아직까지 한계가 있다. 성체줄기세포의 경우 안정성 측면에서 유리하여 환자를 대상으로 임상연구가 시도된 바 있으나, 성체줄기세포 중 신경줄기세포(neural stem cell), 제대혈세포(cord blood cell)의 경우 자신의 세포를 자신에게 이식하는 자가이식(autograft)이 아직 불가능하여 타인의 신경줄기를 이식하여야 하는 한계점이 있다. 골수나 지방-유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)의 경우 인체에서 쉽게 얻을 수 있어 임상에서 가장 활발히 연구되고 있는 줄기세포이다.
중간엽줄기세포를 이용한 세포 치료법에 대하여, 자신의 골수에서 중간엽줄기세포를 분리하여 이를 증식한 후, 다시 정맥으로 주입하는 세포치료법에 대한 장기간 임상연구를 시행하여 이를 보고한 바 있다(Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol. 2005;57:874-882)(Lee JS, Hong JM, Moon GJ, Lee PH, Ahn YH, Bang OY. A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke. Stem Cells. 2010;28:1099-1106). 그러나 이러한 장점을 가진 중간엽줄기세포의 경우에도 골수에서 분리한 뒤 세포치료를 위해 사용할 수 있는 충분한 농도(약 1 x 108개 세포)로 배양하는데 4-5주 이상의 배양기간이 소요되는 한계점이 있다.
이와 같이, 줄기세포 종류에 따라 자가이식이 불가능하거나 또는 자가이식이 가능하더라도 치료 효과를 얻기까지 배양하는데 긴 시간이 소요되므로, 동종이식(allograft)에 대한 연구가 진행되고 있다. 즉, 정상인에서 미리 얻어 놓은 세포를 사용하는 것이 환자에서 얻는 것보다 훨씬 용이하기 때문에 최근 동종 줄기세포를 이용한 세포치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
그러나, 상기와 같은 장점을 가진 줄기세포의 동종이식 치료제 개발에서도 다음과 같은 문제점이 보고되고 있다.
(a) 정상인에서 얻은 줄기세포와 환자(예를 들어, 뇌경색 환자)에서 얻은 줄기세포의 특성은 차이가 나는 것으로 보고되고 있다. 즉, 뇌경색 동물의 골수에서 얻은 줄기세포가 정상동물의 골수에서 얻은 줄기세포에 비해 뇌경색 후 기능회복에 있어서 우월하다고 보고된 바 있다(Zacharek A, Shehadah A, Chen J, Cui X, Roberts C, Lu M, Chopp M. Comparison of bone marrow stromal cells derived from stroke and normal rats for stroke treatment. Stroke. 2010;41:524-530). 따라서 동종이식을 하더라도, 타인의 줄기세포를 단순히 주입하는 것보다 줄기세포에 적절한 자극을 주어 줄기세포를 이식에 적합한 상태로 활성화시키는 과정이 필요하다. 또한 환자에게서 얻은 줄기세포도 장기간 소혈청에서 배양하는 과정에서 줄기세포의 특성이 변화될 가능성이 있다.
(b) 줄기세포를 이식한 후, 일정시간이 경과하면 줄기세포의 수가 현저히 감소되는 문제점이 있다. 이는 줄기세포가 뇌경색, 심근경색과 같은 독성 환경에서 놓였을 경우, 세포사멸(cell death)이 일어나기 때문이다. 따라서 이러한 환경에서 줄기세포가 장기적으로 살아남아 치료효과가 유지될 수 있도록, 이식될 줄기세포의 생존능을 향상시키는 것이 줄기세포치료에 있어서 중요하다.
(c) 뇌경색/심근경색과 같은 급성손상이 일어난 후 세포 치료의 효과는 얼마나 빨리 줄기세포를 주입하냐에 따라 결정된다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 자가 또는 동종의 줄기세포를 이식하더라도, 치료에 적합한 농도의 줄기세포로 배양하는데 있어서 많은 기간이 소요되어 치료가 필요한 환자에 적절한 시기에 이식할 수 없는 한계점이 있다. 따라서 줄기세포에 적절한 자극을 주어 활성화를 유도함으로써 증식률을 향상시켜 배양기간을 단축하고, 배양과정에서 급성손상 당시 줄기세포에 가해졌던 자극(conditioning)이 소실되는 것을 최소화 하는 것이 필요하다.
(d) 일반적으로 줄기세포의 배양과정에는 소혈청(fetal bovine serum; FBS)을 사용하고 있으나, 소혈청의 경우 일부 줄기세포 내부로 들어가 광우병과 같은 인수공통감염병 (zoonosis)을 유발할 수 있다는 위험성이 보고되고 있다.
이처럼 뇌 손상 환자를 치료하기 위한 줄기세포 치료에서, 동종 또는 자가 이식 줄기세포를 사용하는 경우 다양한 한계점이 보고되어 있으나, 이러한 한계점을 극복하기 위한 적절한 줄기세포의 활성화를 유도하는 방법에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 따라서, 줄기세포 치료의 기존 한계점을 극복하기 위하여 줄기세포를 적절한 상태로 활성화시키기 위한 방법에 대한 연구가 필요하다.
본 발명자들은 줄기세포에 적절한 자극을 가하여, 이식에 적합한 뇌경색 초기의 활성화된 상태를 유지하도록 하는 방법에 관하여 연구하던 중, 허혈혈청(ischemic serum)으로 줄기세포를 자극하는 경우, 줄기세포에서 성장인자의 분비가 촉진되고, 증식력이 향상되며, 생존능이 증가되는 등 줄기세포의 활성화가 촉진됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 활성화 촉진방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된, 활성화된 줄기세포를 제공하는데 있다.
본 발명자들은 줄기세포에 적절한 자극을 가하여, 이식에 적합한 뇌경색 초기의 활성화된 상태를 유지하도록 하는 방법에 관하여 연구하던 중, 허혈혈청(ischemic serum)으로 줄기세포를 자극하는 경우, 줄기세포에서 성장인자의 분비가 촉진되고, 증식력이 향상되며, 생존능이 증가되는 등 줄기세포의 활성화가 촉진됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 활성화 촉진방법을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된, 활성화된 줄기세포를 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물 및 줄기세포의 활성화 촉진 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된, 활성화된 줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은, 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 허혈혈청은 줄기세포를 자극함으로써, 성장인자의 분비촉진, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 또는 줄기세포의 특성유지 등 줄기세포가 뇌손상 환자에게 이식되기에 적절한 상태가 되도록 활성화를 촉진시킬 수 있다.
도 1은 급성자극인 허혈혈청을 이용하여 줄기세포를 활성화시키는 본 발명의 내용을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 FBS, 일반혈청, 허혈혈청을 이용해 배양된 줄기세포를 현미경으로 관찰한 사진(A), 상기 줄기세포의 세포표현형을 유세포분석(flow cytometric analysis)을 이용하여 확인한 결과(B 및 C), 및 세포증식율(D)을 나타내는 도이다(FBS: 소혈청 처리군, IS: 허혈혈청 처리군, NS: 일반혈청 처리군).
도 3은 중간엽줄기세포를 허혈혈청 또는 FBS 로 배양 후 줄기세포에서 성장인자(VEGF, GDNF, HGF, bFGFF) 유전자 및 줄기세포 분화 인자(BDNF, NGF)의 발현정도를 실시간 유전자분석법(Real-time PCR)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.(10% FBS: 소혈청 처리군, 10% IS: 10% 허혈혈청 처리군, 10% NS: 10% 일반혈청 처리군).
도 4는 허혈혈청을 처리한 줄기세포가 허혈조직으로 이동이 촉진되는지 여부 및 차단제인 AMD3100, PHA66752 처리시, 줄기세포 이동능의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(FBS: 소혈청 처리군, IS: 허혈혈청 처리군, NS: 일반혈청 처리군, IBE: 허혈뇌추출물(ischemic brain extracts)).
도 5는 허혈혈청 처리에 따른, 세포의 성장속도 및 세포주기의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 허혈혈청 처리에 따른 줄기세포의 세포 생존율을 허혈뇌 유사환경에서 확인한 결과를 나타낸 도이다(FBS: 소혈청 처리군, IS: 허혈혈청 처리군, NS: 일반혈청 처리군).
도 7은 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 경과시간에 따라 허혈혈청을 수득 후 이를 가지고 중간엽줄기세포 배양시 기간에 따른 세포수의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(P3: 3계대 배양, P4: 4계대 배양, FBS: 소혈청 처리군, 1D IS: 뇌경색 후 1일째 허혈혈청 처리군, 7D IS: 뇌경색 후 7일째 허혈혈청 처리군, 14D IS: 뇌경색 후 14일째 허혈혈청 처리군, 28D IS: 뇌경색 후 28일째 허혈혈청 처리군).
도 8은 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 경과시간에 따라 허혈혈청을 수득 후 이를 가지고 중간엽줄기세포 배양시 기간에 따른 세포주기 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(P3: 3계대 배양, P4: 4계대 배양, FBS: 소혈청 처리군, 1D IS: 뇌경색 후 1일째 허혈혈청 처리군, 7D IS: 뇌경색 후 7일째 허혈혈청 처리군, 14D IS: 뇌경색 후 14일째 허혈혈청 처리군, 28D IS: 뇌경색 후 28일째 허혈혈청 처리군).
도 9은 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 경과시간에 따라 허혈혈청을 수득 후 이를 가지고 중간엽줄기세포 배양시 기간에 따라 허혈뇌 유사환경에서 줄기세포의 생존률을 확인한 것을 나타낸 도이다(P3: 3계대 배양, P4: 4계대 배양, FBS: 소혈청 처리군, 1D IS: 뇌경색 후 1일째 허혈혈청 처리군, 7D IS: 뇌경색 후 7일째 허혈혈청 처리군, 14D IS: 뇌경색 후 14일째 허혈혈청 처리군, 28D IS: 뇌경색 후 28일째 허혈혈청 처리군).
도 10는 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 경과시간에 따라 허혈혈청을 수득 후 이를 가지고 중간엽 줄기세포를 2계대 배양부터 배양하여 6계대 배양에 베타-갈락토시다아제 (beta-galactosidase) 염색을 통해 노화정도를 확인한 것을 나타낸 도이다.(P3: 3계대 배양, P4: 4계대 배양, FBS: 소혈청 처리군, 1D IS: 뇌경색 후 1일째 허혈혈청 처리군, 7D IS: 뇌경색 후 7일째 허혈혈청 처리군, 14D IS: 뇌경색 후 14일째 허혈혈청 처리군, 28D IS: 뇌경색 후 28일째 허혈혈청 처리군)
도 11은 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 1일째 얻은 허혈혈청에 포함된 싸이토카인 함유량을 일반혈청과 비교하여 관찰한 것이다(A). 정상 쥐와 뇌경색을 유도한 쥐로부터 혈청을 얻어 싸이토카인 항체 어레이(cytokine antibody array)를 수행후 정량화한 결과(B), CINC-1, IL-1alpha, MIP-3alpha는 일반혈청에 비해 허혈혈청 높은 수준을 보이는 반면, Fractalkine, CD54, LIX, L-selectin, RANTES, TIMP-1은 낮은 수준임을 확인하였다.(NS: 일반혈청, IS: 허혈혈청) 더불어, 뇌허혈 동물에서 허혈 유도 후 경과시간에 따라 허혈혈청을 수득하여 혈청에 포함된 TIMP-1 과 VEGF (C)의 수준을 ELISA 로 관찰한 것이다. TIMP-1은 일반혈청에 비해 1일째 감소하는 경향이 있고, 7일, 14일 28일째 혈청은 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다. VEGF는 일반혈청에 비해 시간이 지날수록 증가하는 경향을 확인하였다.(1D IS: 뇌경색 후 1일째 허혈혈청, 7D IS: 뇌경색 후 7일째 허혈혈청, 14D IS: 뇌경색 후 14일째 허혈혈청, 28D IS: 뇌경색 후 28일째 허혈혈청).
도 12은 뇌경색 환자와 정상인 대조군의 혈청을 수득 후 혈청에 포함된 사이토카인 및 성장인자 수준을 cytokine multiplex 방법을 이용해 확인하였다. 정량적으로 분석한 결과, 성장인자 중 VEGF 와 HGF는 뇌경색 환자 혈청에서 높은 수준으로 확인된 반면(A), BDNF와 NGF 는 낮은 수준으로 확인되었다(B). 케모카인인 MCP-1, SDF-1, SCF는 뇌경색 환자의 혈청에서 낮은 수준으로 확인되었다(C).
본 발명은 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 허혈혈청은 줄기세포를 자극함으로써, 성장인자의 분비 촉진, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 등 줄기세포가 뇌손상 환자에게 이식되기에 적절한 상태가 되도록 활성화를 촉진시킬 수 있다.
상기 허혈혈청이란, 뇌경색, 심근경색, 뇌출혈, 신경외상 및 척추손상으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환에 걸린 환자로부터 얻어지는 혈청으로써, 동종의 허혈혈청 또는 자가 허혈혈청을 모두 포함한다. 상기 허혈혈청은 정상상태의 혈청과는 그 성질이 상이하여 줄기세포에 처리하는 경우 줄기세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다.
상기 허혈혈청은 급성 뇌경색 환자로부터 얻는 경우, 뇌경색 발병 1일 내지 90일 내의 환자로부터 얻은 허혈혈청일 수 있으며, 바람직하게는 뇌경색 직후 1일 내지 30일 이내에 얻은 허혈혈청일 수 있다. 배양 시, 첨가되는 허혈혈청의 농도는 5% 내지 20% 농도로 처리되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 10% 의 농도로 처리될 수 있다.
상기 허혈혈청은 염증성 싸이토카인 또는 세포성장인자가 일반혈청과 비교하여 더 포함될 수 있다. 상기 염증성 싸이토카인은 CINC-1(Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1), IL-1(Interleukin-1) 또는 MIP-3(Macrophage inflammatory protein 3)일 수 있으며, 상기 세포성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), GDNF(Glial cell-derived neurotrophic factor), HGF(hepatocyte growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 허혈혈청은 세포분화인자 또는 케모카인이 일반혈청이 비교하여 덜 포함된 것일 수 있다. 상기 케모카인은 SDF-1(Stromal cell-derived factor-1), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) 또는 SCF(Stem cell factor)일 수 있으며, 상기 세포분화인자는 BDNF (Brain derived neurotrophic factor) 또는 NGF(Nerve growth factor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
줄기세포는 활성물질에 노출되어 활성화 될 수 있으며, 상기 줄기세포 활성화란 줄기세포의 성장인자 분비능 향상, 생존율 향상, 손상부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 또는 줄기세포의 특성 유지를 포함하는 것으로, 줄기세포가 이식에 적합한 상태가 되도록 변화하는 것을 의미한다. 활성화된 줄기세포는 오랜 배양기간을 거칠 필요 없이 바로 손상부위로 이식할 수 있다. 이러한 줄기세포의 활성화는 활성물질의 자극에 의하여, 세포주기 및 성장인자 유전자 변화가 수반되어 나타날 수 있다. 따라서, 줄기세포의 활성화가 촉진되는 것은 일반 배양 줄기세포가 손상 부위에 이식 가능한 상태가 되도록 유도 및 촉진되는 것을 의미한다.
상기 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함할 수 있으며 동종 또는 자가 줄기세포일 수 있다.
또한 본 발명은 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 배지 및 상기 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 활성화 촉진 방법을 제공한다.
상기 줄기세포 활성화 촉진용 배지는 일반적으로 당업계에서 사용할 수 있는 배지에 허혈혈청을 포함하는 배지이다. 바람직한 배지로서는, 세포배양에 사용되는 통상의 배지인 DMEM (Dulbecco's modified essential medium) 또는 NPBM(Neural progenitor cell basal medium: Clonetics)를 사용할 수 있다.
또한 상기 기본배지에 bFGF (Basic fibroblast growth factor) 또는 EGF (Epidermal growth factor)를 단독 또는 함께 첨가할 수 있으며, 농도는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 10 ng/ml을 첨가할 수 있다.
허혈혈청을 포함하는 줄기세포 활성화 촉진용 배지는 기본배지에 허혈혈청을 포함함으로써, 줄기세포를 자극하여 활성화된 상태로 만들 수 있으며 보다 구체적으로. 상기 배지에 배양된 줄기세포가 성장인자의 분비를 촉진하고, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 등 이식에 적합한 형태의 줄기세포가 될 수 있도록 할 수 있다.
상기 줄기세포 활성화 촉진용 배지에 포함되는 허혈혈청은 바람직하게는 5 내지 20%의 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10%의 농도로 포함될 수 있다.
허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 배지에서 줄기세포의 활성화를 위한 배양은 33 ℃내지 38 ℃, 바람직하게는 37 ℃의 온도에서 24시간 동안 배양하여 이루어질 수 있다.
기타 배양조건에는 특별한 제한이 없으며, 줄기세포는 부유한 상태 또는 배양용기에 부착한 상태로 배양될 수 있다. 배양용기로는 예를 들어, 챔버글래스, 비코팅 접시(non-coating dish)등 당업계에 널리 사용되는 용기를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된, 활성화된 줄기세포를 제공한다.
상기 활성화된 줄기세포는 성장인자 분비능 향상, 생존율 향상, 손상부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 또는 줄기세포로써의 특성 유지의 특성을 갖는 줄기세포이다.
상기 성장인자는 줄기세포의 증식, 성장, 유지 생존을 조절하는 중요한 기능을 갖는 단백질을 의미하며, 특별히 이에 제한되지 않으나, VEGF (Vascular endothelial growth factor), GDN F(Glial cell-derived neurotrophic factor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4 (Neurotrophin-4), EGF(Epidermal growth factor), bFGF(Basic fibroblast growth factor) 또는 CNTF(Ciliaryneurotrophic factor) 등을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 배양과정에서 자극된 줄기세포로부터 생산되는 성장인자 중 증식, 성장, 유지, 생존 등을 조절하는 성장인자인 VEGF, GDNF, HGF, 또는 bFGF일 수 있다.
상기 손상은 허혈에 의한 손상을 의미한다.
상기 증식 속도 향상은 세포 증식률이 증가되는 것을 말하며, 세포 증식률이란, 줄기세포가 자가 분열하여 세포의 수가 증가하는 속도를 말한다.
또한 본 발명은 상기 활성화된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 허혈 혈청은 줄기세포를 자극함으로써, 성장인자의 분비 촉진, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식속도 향상 또는 줄기세포의 특성 유지 등 줄기세포가 뇌손상 환자에게 이식되기에 적절한 상태가 되도록 활성화를 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 허혈 혈청은 허혈성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심장질환 또는 허혈성 말초혈관질환일 수 있다. 허혈성 뇌질환과 허혈성 심장질환 및 말초혈관질환의 기전은 매우 유사하여 허혈성 뇌질환에 효과를 보이는 경우 허혈성 심장질환이나 말초혈관질환에서도 동일 또는 유사한 효과가 나타날 수 있다. 상기 허혈성 뇌질환은 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 백질 이상증 및 소경색을 포함할 수 있으며, 상기 허혈성 심장질환은 심근경색 또는 협심증을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포는 그대로 이식에 사용할 수 있으며, 이식에 따른 치료효율을 향상시키기 위하여 각종 약제를 첨가한, 혹은, 유전자 도입한 조성물로서 이식할 수도 있다.
본 발명의 조성물의 조제에 있어서는 예를 들어, 1) 본 발명의 세포증식률을 향상시키는 또는 신경계 세포로의 더한층 분화를 촉진하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 2) 본 발명의 세포의 손상신경조직 내에서의 생존률을 향상시키는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 3) 본 발명의 세포가 손상신경조직으로부터 받는 악영향을 저지하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 4) 도너세포(donner cell)의 수명을 연장시키는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 5) 세포주기를 조절하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 6) 면역반응의 억제를 목적으로 하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 7) 에너지 대사를 활발히 하는 물질의 첨가, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 8) 도너세포의 숙주 조직 내에서의 유주능을 향상시키는 물질, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입, 9) 혈류를 향상시키는 물질, 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입(혈관신생 유도도 포함한다), 10) 숙주(host) 뇌신경으로 어떠한 치료효과를 가지는 물질의 첨가(대상질환으로서는 예를 들어, 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 백질이상증 및 소경색) 혹은 이와 같은 효과를 가지는 유전자의 도입을 행하는 것을 들 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 줄기세포의 투여방법은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 국소 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 뇌척수액내 투여(예를 들어, 요추천자(lumbar puncture)와 뇌실 내 투여 (intraventricular adminstration)) 등을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 환자로의 세포이식은 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 예를 들어, 이식하는 세포를 인공뇌척수액과 생리식염수 등을 사용하여 부유시킨 상태에서 주사기에 모으고, 수술에 의하여 손상한 신경조직을 노출하여 이 손상부위에 주사바늘로 직접 주입하는 것에 의하여 행할 수 있으며, 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 활성화된 줄기세포는 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 본 발명의 줄기세포는 손상된 부위, 특히 허혈 손상 부위로의 이동성이 높기 때문에, 효과적으로 치료가 필요한 부위로 이동이 가능하다.
또한, 뇌척수액 중으로의 주입도 효과를 기대할 수 있다. 이 경우, 통상의 요추천자(lumbar puncture)로 세포를 주입하는 것이 가능하기 때문에 수술이 불필요하고, 국소마취만으로 끝내기 때문에 병실에서 환자를 처치할 수 있는 점에서 좋다. 나아가, 동맥 내와 정맥 내로의 주입도 효과를 기대할 수 있다.
따라서, 통상의 수혈 요령으로 이식이 가능하게 되고, 병동에서의 이식조작이 가능하다는 점에서 좋다.
본 발명의 약학적 조성물은 세포 치료제로 사용가능하며, 상기 세포치료제란 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 적합한 희석제에 1×103 내지 5×106 세포/ml 농도로 현탁시켜 개체에 투여될 수 있다. 상기 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.
본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 화학적 치료, 방사성 치료, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 골수유래 줄기세포의 채취 및 배양
흰 쥐에서 골수를 채취하여 인산염완충액 (PBS)에 1:1로 희석하고, 원심분리 및 배양을 통해 골수유래 중간엽줄기세포를 채취하였다. 얻어진 중간엽 줄기세포는 5% CO2 및 37 ℃하에서 배양하였으며, 이후 실시예에서는 계대배양 2-5세대 (passage 2-5, P2-5) 세포를 사용하였다. 실험은 실험동물연구위원회의 승인하에 진행되었다.
실시예 2. 허혈혈청을 이용한 줄기세포 자극
상기 실시예 1에서 얻어진, 3×105개의 골수유래 중간엽줄기세포를 35mm 배양접시에 전처리군 또는 대조군으로 나누어 배양하였다. 대조군배지는 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서, 일반혈청 처리군과 허혈혈청 처리군은 일반혈청 (NS) 혹은 허혈혈청 (IS)을 각각 10% 포함하는 배지에서 24시간 동안 (단회처리, 계대배양 4-5 세대) 혹은 배양 초기부터 FBS를 사용하지 아니하고 배양하였다. 허혈혈청은 계대 배양 4-5 세대까지 지속적으로 처리하였으며, 한 계대 배양 당 3일 배양을 수행하였다. 실험은 각 군당 3회씩 반복하여 실행하였다. 허혈혈청 처리군에 사용된 허혈혈청은 흰 쥐에 중뇌동맥경색을 유발시킨 후, 1일된 쥐로부터 얻었다. 허혈혈청은 안정화되어 있는 줄기세포에 급성 자극을 유발하기 위하여 사용되었으며, 이러한 급성자극을 통해 줄기세포가 허혈성뇌질환 환자에 이식하기 적합한 줄기세포로 활성화 되는지 여부를 확인하였다. 본 발명의 허혈혈청을 이용하여 줄기세포를 활성화시키는 과정을 도 1에 나타내었다.
2.1 허혈혈청을 처리한 줄기세포의 표현형 및 세포수의 변화
FBS, 일반혈청, 및 허혈혈청을 이용하여 배양된 줄기세포의 세포 표현형을 유세포분석 (flow cytometric analysis)을 이용하여 비교하였으며, 광학 현미경을 통해 전처리 전 후의 세포수를 비교하여 수치화하였다.
결과를 도 2 에 나타내었다.
도 2의 a에 나타난 바와 같이, 일반혈청 처리군, 허혈혈청 처리군과 대조군 모두 세포형상에는 차이가 없음을 관찰하였다. 또한 도 2의 b 및 c에서 나타난 바와 같이, 일반적으로 백혈구에서 발현되는 CD11b에 대해서는 음성인 반면, 줄기세포 마커인 CD90에 대해서는 양성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 허혈혈청의 처리가 줄기세포의 표현형에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 단회 배양 후 일반혈청 혹은 허혈혈청 처리군이 FBS 처리 군에 비해 세포수가 증가함을 확인하였고, 이를 도표로 나타내었다 (d). 2계대 배양에서 6계대 배양에 걸쳐 연속적인 배양을 수행한 결과, 허혈혈청을 포함한 배지로 배양한 줄기세포의 증식비율이 일반혈청 혹은 FBS로 배양한 줄기세포에 비해 높은 것을 확인하였고, 이를 도식화하였다 (e).
2.2 허혈혈청을 처리한 줄기세포의 성장인자 발현 측정
허혈혈청을 줄기세포에 처리한 경우, 성장인자의 유전자 발현을 증가시킬 수 있는지 여부를 중간엽 줄기세포에 일반혈청 혹은 허혈혈청을 처리한 처리군(10% NS, 10% IS)과 FBS를 처리한 대조군을 이용하여 비교하였다. 각각의 처리군과 대조군을 실시간 유전자 분석법(Real-time PCR)으로 줄기세포에서 세포성장 및 생존에 관여하는 성장인자인 VEGF, GDNF, HGF, bFGF, 줄기세포를 분화시키는데 관여하는 BDNF, NGF 유전자 발현양의 변화를 측정하였다.
결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, VEGF 는 허혈혈청을 처리한 처리군이 FBS 또는 일반혈청을 처리한 군에 비하여 증가하였고 (a), GDNF 는 허혈혈청 처리군이 일반 혈청 처리군과는 차이가 없으나, FBS를 처리한 대조군에 비해 증가하였다 (b). 또한, HGF와 bFGF 의 경우, FBS 또는 일반혈청 처리군에 비해 허혈혈청 처리군에서 유전자 발현이 증가하였다 (c 및 d).
반면, 줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도하는 BDNF 및 NGF의 유전자의 발현은 일반혈청과 허혈혈청 처리군이 FBS만 처리한 대조군에 비해 낮은 유전자 발현을 나타내었다.
이를 종합하면, 세포 증식 및 성장에 관여하는 성장인자의 발현은 증가하고, 분화를 유도하는 성장인자는 감소하는 바, 허혈혈청 처리가 줄기세포에서 성장인자의 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다.
2.3 허혈혈청을 처리한 줄기세포의 이동 능력 측정
줄기세포를 이식하는 치료법은 줄기세포가 목적하는 부위로 이동하는 것이 중요한 요소이므로, 허혈혈청을 처리한 줄기세포가 허혈조직으로 이동이 촉진되는지 여부를 확인하였다. 허혈혈청으로 전처리를 한 줄기세포와 허혈혈청을 처리하지 않은 줄기세포를 챔버 글래스에 배양한 후, 허혈-뇌 추출물을 포함한 아가젤을 두고 48시간 동안 이동하는 줄기세포의 수를 측정하였다. 또한, 줄기세포의 이동을 유도하는 인자인 SDF-1, HGF를 차단하기 위하여, 케모카인 SDF-1 길항제인 AMD3100 혹은 HGF 수용체 c-Met의 저해제인 PHA66752를 처리한 후, 줄기세포 이동의 증가가 차단되는지 여부를 측정하였다.
결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 허혈혈청 전처리를 하지 않은 줄기세포에 비해, 허혈혈청 전처리를 통해 활성화 된 줄기세포는 이동이 촉진되었으며, AMD3100, PHA66752 처리에 의하여 부분적으로 차단되었다. 이와 같은 결과를 통해, 허혈혈청 전처리에 의하여 줄기세포의 이동성이 증가하며 이러한 줄기세포의 이동에는 SDF-1, HGF 외에도 다양한 인자들이 관여함을 확인하였다. 결과적으로 허혈혈청을 줄기세포에 전처리하여 배양하는 경우, 손상부위로 이동하는 줄기세포의 능력이 향상되어 선택적으로 뇌경색과 같은 손상 부위로 이동할 수 있음을 알 수 있다.
2.4 허혈혈청 처리에 따른 세포 주기의 변화 측정
트립신(Trypsin) 처리한 세포를 1,300rpm, 3분간 원심분리하여 펠렛을 만든 후 90% 에탄올 1ml로 재부유(resuspension)시키고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 에탄올을 제거하고 0.1% triton X-100, 20g/ml RNaseA PBS 500㎕ 재부유시켰다. 37 ℃ 에서 30분동안 배양한 후 50㎍/ml의 PI를 넣고 허혈혈청 처리에 따른 세포주기의 변화를 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 허혈혈청을 이용해 배양한 경우 FBS로 배양한 것에 비해 S기와 G2/M기가 증가함을 확인하였다. 10% FBS 배양에 비해 10%, 20% 허혈혈청을 단회(3일간) 처리한 후 S, G2/M 기가 증가하였고, 10% 허혈헐청을 이용하여 계대배양을 한 경우 1세대 계대 배양에서는 S기와 G2/M기의 비율이 10% FBS 와 비슷하지만 2, 3, 4 세대 계대배양이 됨에 따라 S기와 G2/M기의 비율이 10% FBS 에 비해 증가함을 확인하였다.
2.5 허혈혈청 처리에 따른 줄기세포의 세포 생존율 분석
허혈혈청으로 자극된 줄기세포가 허혈 환경에서 저항성을 나타내어 생존율이 높아질 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 허혈뇌 유사환경에서 허혈혈청을 처리한 처리군과 FBS를 처리한 처리군, 일반 혈청으로 처리한 처리군의 세포생존율을 비교분석하였다. 허혈 혈청으로 계대배양을 한 후, 20% 허혈 뇌 추출물을 세포에 처리하여 허혈뇌유사 환경 배양을 조성하였다. 24시간 후에 세포를 트립신 처리하여 5 % FBS-PBS 로 1300 rpm, 3분간 원심분리하여 펠렛을 만든 후, 1x 결합 완충액(binding buffer)을 150 ㎕ 넣었다. 이 후, AnnexinV FITC 10 ㎕, 50 ㎍/ml PI를 10 ㎕넣고 상온에서 15분간 반응시킨 후 1x 결합 완충액 350 ㎕를 넣어 분석하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 허혈혈청으로 줄기세포를 자극하여 배양한 경우 허혈뇌 유사 환경배양에서 죽은 세포는 FBS 로 배양한 경우에 비해 현저히 감소하였고, 생존한 세포는 증가하였다. 이를 통해, 허혈혈청 처리시, 허혈 저항성이 증가되어 허혈부위에 이식하는 경우, 줄기세포의 생존율을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
2.6 허혈 후 시기별 허혈혈청 처리에 따른 세포수의 변화 측정
뇌허혈 유발동물로부터 허혈유발 1일, 7일, 14일, 28일 후 허혈혈청을 얻은 후, 이를 이용해 2계대 배양에서부터 6계대 배양까지 순차적으로 계대배양하였고, 각 계대에 세포수를 현미경상에서 측정하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, FBS를 포함한 배지에서 보다 허혈유발 1일, 7일, 14일, 28일에 얻은 허혈혈청을 포함하는 배지로 배양한 경우 계대가 증가할수록 얻을 수 있는 세포수가 증가함을 확인하였다.
2.7 허혈 후 시기별 허혈혈청 처리에 따른 세포 주기의 변화 측정
뇌허혈 유발동물로부터 허혈유발 1일, 7일, 14일, 28일 후 허혈혈청을 얻은 후, 이를 이용해 2계대 배양에서부터 6계대 배양까지 순차적으로 계대배양한 세포들을 트립신(Trypsin) 처리하여 1,300rpm, 3분간 원심분리하고 펠렛을 만든 후 90% 에탄올 1 ml로 재부유 (resuspension)시키고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 에탄올을 제거하고 0.1% triton X-100, 20 ㎍/ml RNaseA PBS 500 재부유시켰다. 37 ℃에서 30분 동안 배양한 후 50 ㎍/ml의 PI를 넣고 허혈혈청 처리에 따른 계대배양별 세포주기의 변화를 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 유전자 복제와 세포분열단계인 S기와 G2/M 기에 있는 세포들이 1일째 허혈혈청으로 배양한 군에서 2-6 세대 계대배양까지 FBS로 배양한 대조군에 비해 증가함을 확인하였다. 7일, 14일, 28일째 허혈혈청으로 배양한 군은 2-4세대 계대배양까지 FBS로 배양한 대조군에 비해 증가함을 확인하였다.
2.8 허혈 후 시기별 허혈혈청 처리에 따른 줄기세포의 세포 생존율 분석
허혈 후 시기별 허혈혈청으로 배양된 줄기세포가 허혈 환경에서 저항성을 나타내어 생존율이 높아질 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 허혈뇌 유사환경에서 시기별 허혈혈청을 처리한 처리군과 FBS를 처리한 처리군의 세포생존율을 비교분석하였다. 구체적으로는, 허혈 혈청으로 계대배양을 한 후, 20% 허혈 뇌 추출물을 세포에 처리하여 허혈뇌유사 환경 배양을 조성하였다. 24시간 후에 세포를 트립신 처리하여 5% FBS-PBS 로 1300rpm, 3분간 원심분리하여 펠렛을 만든 후 1x 결합 완충액 (binding buffer)을 150㎕넣었다. 이 후, AnnexinV FITC 10 ㎕, 50㎍/ml PI를 10 ㎕넣고 상온에서 15분간 반응시킨 후 1x 결합 완충액 350 ㎕를 넣어 분석하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 1일, 7일, 14일, 28일째 허혈혈청으로 줄기세포를 배양한 경우 허혈뇌 유사 환경배양에서 죽은 세포는 FBS 로 배양한 경우에 비해 현저히 감소하였고, 생존한 세포는 증가하였다. 또한, 계대배양을 거듭하더라도 허혈혈청으로 배양한 줄기세포가 FBS 로 배양한 줄기세포에 비해 허혈뇌 유사환경에서 생존율이 높음을 확인하였다. 이를 통해, 허혈혈청 처리시, 허혈 저항성이 증가되어 허혈부위에 이식하는 경우, 줄기세포의 생존율을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
2.9 허혈 후 시기별 허혈혈청 처리에 따른 줄기세포의 노화 (senescence)분석
허혈혈청 배양이 줄기세포의 노화 (senescence)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 2세대 배양부터 허혈혈청과 FBS로 배양한 줄기세포를 6세대 배양에 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 염색 후 비교분석하였다. 구체적으로는, 허혈혈청과 FBS 로 배양한 6세대 배양세포를 4% 파라포름알데히드로 고정화한 후 930 ㎕ 1X Staining Solution, 10 ㎕ Staining Supplement A, 10 ㎕ Staining Supplement B, 50 ㎕ 20 mg/ml X-gal 용액(cell signaling 제품) 혼합물을 처리 후 37 ℃에서 24시간 반응 후 관찰하였다.
그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, FBS로만 배양한 줄기세포는 허혈후 1일, 7일, 14일 28일에 얻은 허혈혈청으로 배양한 줄기세포에 비해 베타-갈락토시다아제 염색 양성인 세포의 수가 많은 것을 현미경상에서 육안으로 확인할 수 있었다(a). 전체 세포 중 베타-갈락토시다아제 염색 양성인 세포수를 측정하여 비율을 도표로 나타내었다(b). 이를 통해 허혈혈청배양이 줄기세포의 노화를 늦출 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 허혈혈청의 싸이토카인 및 성장인자 분석
상기 실시예 1 내지 2에서 사용한 허혈혈청 및 일반혈청에 함유된, 사이토카인과 성장인자의 수준을 R&D System사의 Rat cytokine antibody array와 ELISA를 이용해 분석하였다. 또한 뇌경색환자와 정상군의 혈청을 얻어 싸이토카인과 성장인자의 수준을 확인하고자 BIO-RAD 사의 Human cytokine multiplex를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 군당 3회 반복하여 실행하였다.
3.1 허혈 뇌경색 동물의 허혈혈청 싸이토카인 및 성장인자 분석
뇌경색 유도 1일째 허혈혈청과 일반혈청에 포함된 싸이토카인 및 성장인자의 수준을 R&D systems 사의 Rat cytokine antibody array 및 ELISA를 이용하여 분석하였다.
구체적으로는 싸이토카인과 성장인자를 포함하는 29종의 서로 다른 항체가 도포된 멤브레인은 차단 완충액(blocking buffer)에서 1시간동안 반응시키고, 혈청은 검출항체와 섞어 1시간 반응시킨다. 이렇게 반응시킨 시료를 멤브레인에 섞어 4 ℃에서 12시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 세척액으로 3회 세척 후 스트렙타비딘-HRP를 30분 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 세척액으로 3회 세척 후 필름에 현상하여 결과를 확인하였다.
그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11a 에 나타낸 바와 같이 총 29종의 단백질 중 9종의 단백질이 필름에 현상됨을 확인하였고, 이는 각각 CINC-1, Fractalkine, CD54, IL-1alpha, LIX, L-selectin, MIP-3alpha, RANTES, TIMP-1이었다.
상기 필름에 현상된 각 점을 기준점(control spot)를 이용해 표준화하여 정량분석하였으며, 그 결과를 도 11b에 나타내었다.
도 11b에 나타난 바와 같이, CINC-1, IL-1, MIP-3는 허혈혈청에서 높은 수준으로 확인되었으며, Fractalkine, CD54, LIX, L-selectin, RANTES, TIMP-1은 낮은 수준으로 확인되었다.
또한, ELISA를 이용하여 VEGF와 TIMP-1의 허혈 후 시기에 따른 변화를 확인하였으며, 그 결과를 도 11c 및 d에 나타내었다.
도 11 c 및 d에 나타난 와 같이, TIMP-1은 1일째 허혈혈청에서 감소하는 경향이 나타나며, 7일, 14일 28일째 허혈혈청에 통계적으로 유의미하게 감소함을 확인하였다 (c). VEGF는 허혈 후 시간이 경과할수록 증가하는 경향을 나타내었다(d).
결과적으로, 허혈혈청에는 줄기세포를 활성화 시킬 수 있는 염증성 싸이토카인과 성장인자의 수준이 높고, 세포분열과 성장을 억제할 수 있는 세포부착분자 등은 낮음을 확인하였다.
3.2 뇌경색 환자의 허혈혈청 싸이토카인 및 성장인자 분석
뇌경색 발병 후 7주일 이내의 환자로부터 허혈혈청을 얻어 정상인의 혈청과 비교하여 포함된 싸이토카인 및 성장인자의 수준을 BIO-RAD 사의 Human cytokine multiplex 를 이용해 분석하였다.
구체적으로는 표준 시료는 250 ㎕의 표준 완충액을 넣어 와류(vortex)시킨 후 얼음에서 5분간 배양한 다음, 표준 바이알로 옮겨 와류해 준 후 5분 간 배양하였다. 준비한 표준시료를 4배 희석하기 위하여 8개의 튜브 중 2~8번 튜브에 각 150 ㎕의 표준 버퍼를 넣고, 1번 튜브에는 표준 용액만 200 ㎕ 넣었다. 그 다음 50 ㎕ 씩 튜브 1에서 2로, 2에서 3으로 옮겨주며 단계희석하였다. 준비된 여과 플레이트에 150 ㎕의 리딩 완충액 (reading buffer)을 넣고 5분간 배양하여 필터를 충분히 적신 후, 진공 여과를 이용하여 완충액을 제거하였다. 선혼합된 항체 비드 (premixed antibody beads)를 30초간 와류시킨 후, 50 ㎕ 씩 각 웰(wel)l에 넣어준 후 진동여과로 완충액을 제거하였다. 150 ㎕의 세척 완충액으로 세척한 후 진공으로 제거한 후 웰 당 25 ㎕의 샘플과 표준시료를 넣고, 밀봉 한 후 700rpm에서 60분 간 플레이트 교반기 (plate shaker) 상에서 실온 조건에서 배양하였다. 60분 후 진공을 이용해 용액을 제거하고, 150 ㎕의 세척 완충액를 넣어 3회 세척하였다. 25 ㎕의 검출 항체를 넣고, 밀봉 후 700rpm에서 30분 간 교반 배양후 3회 세척하였다. SAPE(streptavidin-PE) 용액을 각 웰당 50 ㎕씩 넣고, 700rpm에서 30분 간 교반 배양 해주고, 3회 세척하였다. 그 다음 120 ㎕의 리딩 완충액을 각 웰에 넣은 후 700rpm 에서 5분 간 교반 배양한 후 Luminex instrument에 넣고 리딩하였다.
그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 뇌경색 환자의 혈청과 정상인 혈청은 성장인자인 HGF, VEGF, BDNF, NGF 와 케모카인인 SDF-1, MCP-1, SCF의 수준에서 상이함을 나타내었다. 줄기세포의 성장 및 자가분열 촉진할 수 있는 HGF, VEGF 의 수준은 뇌경색 환자의 혈청에서 높게 나타난 반면(a), 줄기세포의 신경세포로의 분화를 유도할 수 있는 BDNF와 NGF는 낮음을 확인하였다(b). 체내에서 줄기세포가 양성 주화성을 보이는 케모카인인 SDF-1, MCP-1, SCF는 뇌경색 환자의 혈청에서 정상인의 혈청에 비해 낮은 수준으로 존재함을 확인하였다(c). 이를 통해 뇌경색 환자의 혈청에 정상인의 혈청에 비해 줄기세포를 활성을 조절하는 물질의 수준이 다름을 확인하였다.
제제예 1. 약학적 제제의 제조
1.1 주사제의 제조
허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된 줄기세포 5×106세포/ml
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

Claims (25)

  1. 허혈혈청 (ischemic serum)을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포 활성화는 줄기세포의 성장인자 분비능 향상, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식 속도 향상 및 줄기세포의 특성 유지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 허혈혈청은 뇌경색, 심근경색, 뇌출혈, 신경외상 및 척추손상으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 질환에 걸린 환자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 허혈혈청은 동종 또는 자가 허혈혈청인 것을 특징으로하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 허혈혈청은 뇌경색 발병 1일 내지 90일 이내의 환자로부터 얻은 허혈혈청임을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 허혈혈청은 염증성 싸이토카인 또는 세포성장인자가 일반혈청과 비교하여 더 포함된 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 염증성 싸이토카인은 CINC-1(Cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1), IL-1α(Interleukin-1α) 및 MIP-3α(Macrophage inflammatory protein 3α)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), GDNF(Glial cell-derived neurotrophic factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 허혈혈청은 세포분화인자 또는 케모카인이 일반혈청이 비교하여 덜 포함된 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 케모카인은 SDF-1(Stromal cell-derived factor-1), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) 및 SCF(Stem cell factor)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 세포분화인자는 BDNF (Brain derived neurotrophic factor) 또는 NGF(Nerve growth factor)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈줄기세포 및 역분화줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 동종 또는 자가 줄기세포인 것을 특징으로하는, 줄기세포 활성화 촉진용 조성물.
  14. 허혈혈청을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성화 촉진용 배지.
  15. 제14항에 있어서, 상기 허혈혈청은 5 내지 20%의 농도로 포함된 것을 특징으로 하는, 줄기세포 활성화 촉진용 배지.
  16. 허혈혈청을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 활성화 촉진 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 활성화는 줄기세포의 성장인자 분비능 향상, 생존율향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식 속도 향상 및 줄기세포의 특성 유지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 활성화 촉진 방법.
  18. 허혈혈청을 포함한 배지에서 배양된, 활성화된 줄기세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 줄기세포는 성장인자 분비능 향상, 생존율 향상, 손상 부위로의 이동성 향상, 증식 속도 향상 및 줄기세포의 특성 유지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 활성화된 줄기세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 성장인자는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), GDNF(Glial cell-derived neurotrophic factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 활성화된 줄기 세포.
  21. 제19항에 있어서, 상기 손상은 허혈에 의한 손상임을 특징으로 하는, 활성화 된 줄기세포.
  22. 제18항의 활성화된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심장질환인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 백질이상증 및 소경색으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 허혈성 심장질환은 심근경색 또는 협심증인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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