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WO2013136174A1 - Utilisation cosmétique d'un extrait d'avoine en tant qu'agent activateur de la caspase-14 - Google Patents

Utilisation cosmétique d'un extrait d'avoine en tant qu'agent activateur de la caspase-14 Download PDF

Info

Publication number
WO2013136174A1
WO2013136174A1 PCT/IB2013/000657 IB2013000657W WO2013136174A1 WO 2013136174 A1 WO2013136174 A1 WO 2013136174A1 IB 2013000657 W IB2013000657 W IB 2013000657W WO 2013136174 A1 WO2013136174 A1 WO 2013136174A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oat
extract
peptide
cosmetic
skin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/IB2013/000657
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Marie Botto
Nouha Domloge
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ISP Investments LLC
Original Assignee
ISP Investments LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ISP Investments LLC filed Critical ISP Investments LLC
Publication of WO2013136174A1 publication Critical patent/WO2013136174A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/004—Aftersun preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9794—Liliopsida [monocotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists

Definitions

  • the present invention is in the field of cosmetics. It relates to a cosmetic care method comprising the topical application on at least a portion of the skin of the face or body, an oat extract (Avena sativa L), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, which activates the expression of caspase-14 at the cutaneous level, and more particularly to prevent and / or repair damage to the skin cells DNA, in particular related to photoaging.
  • a cosmetic care method comprising the topical application on at least a portion of the skin of the face or body, an oat extract (Avena sativa L), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, which activates the expression of caspase-14 at the cutaneous level, and more particularly to prevent and / or repair damage to the skin cells DNA, in particular related to photoaging.
  • the visible signs of aging are partly attributed to genetic predisposition and partly to the individual's environmental factors and other lifestyle-related stressors.
  • the main function of the skin which is the largest organ of the human body, is to protect the body against many of these factors, including external factors.
  • factors such as pollution, overexposure to the sun, or the use of irritating products such as surfactants, preservatives or perfumes, or mechanical factors, such as abrasions, shaving or hair removal.
  • Pollution is understood to mean both “external” pollution due for example to diesel particles, ozone or heavy metals, and "internal” pollution, which may be due in particular to solvent emissions from paints, glues, or wallpaper (such as toluene, styrene, xylene or benzaldehyde), or even smoking or exposure to cigarette smoke. Dryness of the atmosphere is also an important cause of skin aggression.
  • extrinsic aging contributes to the acceleration of so-called "extrinsic" aging of the skin.
  • extrinsic aging is due to environmental factors to which the organism is subjected throughout its life, factors grouped under the term of external aggressions. People with fair skin are particularly sensitive to the harmful effects of external aggressions, especially ultraviolet radiation from the sun.
  • This barrier represents the skin, consists of several layers of cells of various natures that ensure the skin its continual renewal. This renewal process is primarily due to a phenomenon of desquamation of the cells on the surface of the skin, a phenomenon which must be compensated by the renewal of the epidermis provided by the keratinocytes of the basal layer which actively divide and differentiate into the skin.
  • caspase-14 is a unique member of the caspase family. Indeed, unlike other members of the caspase family that are ubiquitously expressed, caspase-14 is only expressed and active in the epidermis and is absent from most other adult tissues (Eckart et al., J. Invest Dermatol., 2000, 44: 425-432).
  • caspase-14 plays a large role, particularly in the processes of maintenance of hydration, formation of corneocytes, and protection against apoptosis, especially during external aggressions such as those due to UV radiation (Denecker et al., J. Cell Biology, 2008, 451-458).
  • an oat extract (Avena sativa L.) is a good activator of caspase-14, and has a significant effect on the protection of the skin against external aggression such as UV radiation, thanks in particular to a function of protecting and repairing the DNA of cutaneous cells.
  • the oat extract (Avena sativa L.) used according to the invention offers, in particular, the following advantages:
  • the subject of the present invention is a cosmetic care method for preventing and / or repairing damage to cutaneous cell DNA, comprising topical application to at least a portion of the skin of the face or body, oat extract (Avena sativa L.), in a composition comprising a physiologically acceptable medium, which activates the expression of caspase-14 at the cutaneous level.
  • oat extract Avena sativa L.
  • Oats is an annual plant belonging to the genus Avena grown as a grain or fodder. Oats proteins, rich in tryptophan, participate in the production of serotonin and melatonin in humans. Oats also contain many antioxidants such as avenanthramides, tocopherols and tocotrienols (Bryngelsson et al, 2002). To carry out the extraction, one can use the whole plant or a specific part of the oats (leaves, seeds, etc.). More particularly according to the invention, the seeds of oats are used.
  • the oat extract (Avena sativa L.) used according to the invention is preferably a peptide extract derived from the hydrolysis of proteins extracted from oat seeds.
  • a peptide compound refers to the protein fragments, the peptides and the free amino acids present in the extract resulting from the hydrolysis.
  • the oat extract is obtained by extraction of the proteins, followed by controlled hydrolysis which releases peptide compounds.
  • the oat seeds are crushed using a plant grinder.
  • the powder thus obtained is subsequently "delipidated" with the aid of a conventional organic solvent, such as, for example, an alcohol, hexane or acetone.
  • the oat proteins are then extracted by the conventional method (Osborne, 1924) modified; the oat seed crushed is suspended in an alkaline solution containing an insoluble polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) adsorbent product (0.01-20%); in fact, it has been observed that the hydrolysis and subsequent purification operations are facilitated by this means. In particular, the concentration of phenolic-type substances, interacting with proteins, is significantly reduced.
  • the proteins can then be precipitated by varying the ionic strength by acidifying the medium, thereby eliminating soluble components and nucleic acids. The precipitate is then washed with an organic solvent such as, for example, ethanol or methanol and the solvent is evaporated by drying in vacuo.
  • the protein-rich precipitate is dissolved in water or other solvent and is then a more purified form of the hydrolyzate.
  • the extraction can also be carried out in neutral or acidic medium always in the presence of polyvinylpolypyrrolidone.
  • the precipitation step is then carried out using a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • the precipitate obtained can be separated from the precipitating agents by dialysis after redissolving in water or another solvent.
  • the soluble fraction containing proteins, carbohydrates and possibly lipids, is collected after centrifugation and filtration steps. This crude solution is then hydrolyzed under mild conditions to generate soluble peptide compounds. Hydrolysis is defined as a chemical reaction involving the cleavage of a molecule by water, this reaction being possible in a neutral, acidic or basic medium.
  • the hydrolysis is carried out chemically and / or advantageously by proteolytic enzymes.
  • endoproteases of plant origin papain, bromelain, ficin
  • microorganisms Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.
  • an amount of polyvinylpolypyrrolidone is added to the reaction medium during this mild hydrolysis step.
  • the solution obtained constitutes a first advantageous form of oat peptide extract according to the invention.
  • the oat peptide extract may be further purified to select the molecular weights and the nature of the peptides generated.
  • the fractionation can advantageously be carried out by ultrafiltration and / or by a chromatographic type method.
  • peptide extracts and in particular peptide extracts of low molecular weight, has many advantages in cosmetics.
  • hydrolysis and purification make it possible to obtain a mixture of peptide compounds that are more stable, more easily standardized and do not cause allergic reactions in cosmetics. .
  • the preferred oat peptide extract according to the invention essentially comprises peptide compounds of low molecular weight, that is to say advantageously comprises only peptides of low molecular weight.
  • it essentially comprises peptide compounds with a molecular weight of less than 5 kDa, that is to say advantageously the oat peptide extract according to the invention comprises only peptides whose molecular weight is less than 5 kDa.
  • the oat extract obtained according to the invention is analyzed qualitatively and quantitatively for its physico-chemical characteristics and its content of peptide compounds; the peptides, amino acids and protein fragments are determined according to standard techniques, which are well known to those skilled in the art.
  • the oat extract has a pH of between 4 and 7, and preferably between 5 and 6, and comprises between 0.5 and 8 g / l of peptide compounds in weight of dry extract and between 0.5 and 5 g / l of sugars by weight of dry extract, preferably the oat extract according to the invention is diluted to contain between 1.5 and 3.5 g / 1 of peptide compounds by weight of dry extract and between 2 and 5 g / 1 of sugars by weight of dry extract.
  • the oat extract according to the invention activates caspase-14 after application to the skin.
  • the oat extract increases the amount of caspase-14, either by increasing the protein synthesis thereof (by direct or indirect modulation of gene expression), or by other biological processes. such as stabilization of messenger RNA transcripts.
  • the subject of the invention relates to a cosmetic care method for preventing and / or repairing the damage to dna of cutaneous cells, comprising topical application to at least a portion of the skin of the face or body, an oat extract according to the invention, in a composition comprising a physiologically acceptable medium, which activates the expression of caspase-14 at cutaneous level. Damage to cellular DNA in humans is repaired every day, but not all. Unrepaired damage will accumulate over time. It is therefore essential to prevent this damage and to repair it.
  • DNA is the protective role of the oat extract according to the invention in the cells of the skin to limit the occurrence of damage to the DNA.
  • the repairing role of the oat extract according to the invention in terms of the damage previously suffered by the skin cells is designated.
  • the cutaneous cells according to the invention designate the cells of the epidermis and of the dermis, and in particular the keratinocytes.
  • Damage to the DNA of the skin cells refers to the damage due to photochemical reactions between the bases of the DNA, such as for example the formation of cyclobutane pyrimidine dimers or any other damage to the DNA. during external aggression that can produce the environment.
  • aggressions such as pollution, UV radiation, in particular UVB, linked for example to overexposure to the sun, or irritating products such as surfactants, preservatives or perfumes. .
  • the cosmetic care method according to the invention is preferably aimed at preventing and / or repairing the damage to the cutaneous cell DNA which is linked to photoaging and induced by UV radiation, in particular UVB, and thus preventing and / or delay the appearance of cutaneous signs of photo-aging.
  • Unprocessed damage to skin tissue DNA caused by photoaging causes premature aging of the skin, which often only becomes visible when the person has already passed the age of 20 but is increasing with time. .
  • the composition comprising oat extract and a physiologically acceptable medium is applied topically to at least a portion of the skin of the face or body.
  • a physiologically acceptable medium according to the invention refers in particular to media which are suitable for use in contact with human skin or integuments, without risk, for example, of toxicity, incompatibility, instability, or allergic response.
  • any of the more or less purified forms of the oat extract according to the invention is then solubilized in water or in any mixture containing water, and then sterilized by ultrafiltration.
  • the oat extract is first solubilized in one or more physiologically acceptable solvents, conventionally used by the person skilled in the art, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • physiologically acceptable solvents such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • the oat extract according to the invention is solubilized in a cosmetic vector such as liposomes, or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any physiologically adapted vector.
  • a cosmetic vector such as liposomes, or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any physiologically adapted vector.
  • the composition according to the invention intended to be applied topically to at least a part of the skin of the face or the body is in the form of cream, oil-in-water emulsion, or water-in-oil or multiple emulsion, solution, suspension, microemulsion, aqueous or anhydrous gel, serum, or dispersion of vesicles, patch, spray, ointment, ointment, lotion, colloid, milk, lotion, stick or powder.
  • the oat extract according to the invention is present in the composition at a concentration of between approximately 0.0001% and 20%, and preferably at a concentration of between 0.05 and 0.05%. approximately 5% and even more preferably at a concentration of between 1% and 3% approximately relative to the total weight of the final composition.
  • the composition according to the invention further contains at least one other active agent, preferably an agent promoting the action of the oat extract according to the invention.
  • active agent preferably an agent promoting the action of the oat extract according to the invention.
  • the classes of the following ingredients include other peptide active agents, plant extracts, cicatrizing, anti-aging, anti-wrinkle, soothing, anti-radical, anti-UV agents, agents stimulating the synthesis of dermal macromolecules or energy metabolism, moisturizing, antibacterial, antifungal, anti-inflammatory, anesthetic agents, modulating agents differentiation, pigmentation or skin depigmentation, stimulating agents the growth of nails or hair etc.
  • an agent having an activity in the field of anti-wrinkles such as an anti-radical agent or antioxidant, or an agent stimulating the synthesis of dermal macromolecules, or an agent stimulating the energy metabolism
  • the active agent is chosen from vitamins, phytosterols, flavonoids, DHEA and / or one of its precursors or one of its chemical or biological derivatives, a metalloproteinase inhibitor, or a retinoid.
  • additives such as solvents, diluents, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, odor absorbers, thickeners, emulsifiers, humectants, emollients perfumes, antioxidants, film-forming agents, chelating agents, sequestering agents and conditioning agents may be added to the composition according to the invention.
  • these adjuvants and their proportions are chosen in such a way as not to impair the desirable properties of the composition comprising the oat extract according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, be between 0.01% and 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5% to 80% by weight and preferably from 5% to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they may be used in a proportion ranging from 0.3% to 30% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the composition is applied in the morning as anti-aging day care and / or bedtime evening as a night repairing care.
  • the composition allows in particular a protection of the skin vis-à-vis environmental aggressions, including UV radiation, in particular UVB, limiting the occurrence of damage at the level of the DNA of the cutaneous cells.
  • UV radiation in particular UVB
  • the composition plays a role in repairing possible damage that the skin has suffered during the day.
  • the composition is applied before an exposure of the skin to the sun, and is therefore an excellent sun care, in particular to prevent damage to the skin. Cutaneous cells DNA, and / or after exposure to the sun, as an after-sun care to specifically repair any damage to the skin at the DNA level.
  • the oat seeds (Avena sativa L.) are dissolved in 10 volumes of water in the presence of 2% of POLYCLAR® 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). The mixture is adjusted to a pH of between 6 and 8 with a 1M aqueous sodium hydroxide solution. Precipitation in an acid medium is then carried out. The pellet is put back into solution and after adjusting the pH, 2% bromelain is added to the reaction medium. The hydrolysis is obtained after 2 hours of stirring at 50 ° C. The enzyme is then inactivated by heating the solution at 80 ° C for 2 hours. After centrifugation, the supernatant aqueous solution corresponding to a crude oat hydrolyzate is recovered.
  • POLYCLAR® 10 polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble
  • the purification process of the crude hydrolyzate begins with successive filtrations using Seitz-Orion plate filters of decreasing porosity (up to 0.2 ⁇ ) in order to obtain a bright and clear beige solution, qualified as a hydrolyzate .
  • the oat hydrolyzate thus obtained is characterized by a solids content of 10 to 15 g / kg, a protein content of 8 to 12 g / l and a sugar content of 2 to 4 g / l. .
  • This hydrolyzate is then purified to remove proteins of molecular weight greater than 10 kDa, using tangential flow filtrations. For this, the hydrolyzate is pumped under pressure through a Pellicon® support equipped with Pellicon® 2 Biomax 10 kDa cassette. The filtrate recovered is further eluted through a Pellicon® 2 Biomax 5 kDa cassette. At the end of purification, a bright and clear peptide hydrolyzate comprising only peptide compounds with a molecular weight of less than 5 kDa is obtained. A dilution phase is then carried out in order to obtain a peptide hydrolyzate characterized by a content of peptide compounds of 1.5 to 3.5 g / l. This peptide hydrolyzate corresponds to the preferred active oat extract according to the invention.
  • the purpose of this study is to determine the expression of caspase-14 in normal human keratinocytes treated or not with the aid of a peptide extract of oats according to the invention.
  • Normal human keratinocytes, KHN, in culture are treated with the peptide extract according to Example 1 at 1% or 3% for 24 h.
  • the cells are then washed, fixed with 3.7% paraformaldehyde with 0.1% triton in the presence of BSA (diluted 1/100).
  • BSA diluted 1/100.
  • the cells are incubated in the presence of a mouse monoclonal antibody specific for caspase-14 (BD Biosciences), and then a secondary antibody, coupled to a fluorescent marker.
  • the cells are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Nikon Eclipse E600 microscope).
  • KHN cells are cultured in 6-well plate to a confluence of 60% and then treated with 20 ⁇ . of peptide extract according to Example 1 at 1%. Then, 100 ⁇ l of a previously prepared mixture containing the caspase-14 siRNA and the transfecting agent are added gently dropwise well per well. The cell culture plate is incubated at 37 ° C and 5% CO2 for 72 hours. The culture medium is renewed every 2 days. Four conditions are put in place:
  • condition 1 control without siRNA and without peptide extract
  • condition 2 cells transfected with siRNA, without peptide extract
  • condition 4 cells transfected with siRNA and treated with the peptide extract.
  • the comet test is a test that quantifies the damage to DNA at the cellular level.
  • KHN cells are:
  • condition a cultured for 24 hours with the peptide extract according to Example 1 at a concentration of 1% and 3%, then irradiated with UVB radiation at a rate of 20 mJ / cm 2 , in order to observe a protective effect of the peptide active agent according to the invention on the cells;
  • condition b irradiated firstly with UVB radiation at a rate of 20 mJ / cm 2 and then treated for 24 h with the peptide extract according to example 1 at a concentration of 1% and 3%, in order to find a repair effect of the asset on the cells.
  • a control condition is carried out in each case without peptide active.
  • the cells are then trypsinized from their support and then centrifuged at 900 rpm for 5 minutes in order to concentrate and count them.
  • a defined number of cells (25,000 cells) is then included in a 0.75% Low Melting agarose gel and then deposited on a glass slide previously coated with 1% agarose.
  • the slides are then immersed in a lysis solution for 1 h 30 at 4 ° C. and then in an alkaline solution for 20 minutes at 4 ° C.
  • the cells are thus lysed and the DNA denatured.
  • the slides are immersed in an electrophoresis solution before applying an electric field (20 V - 250 mA).
  • the denatured DNA is subjected to migration within the agarose gel at 4 ° C.
  • the application of a fluorescent dye of the DNA on the slides makes it possible to observe under the microscope the DNA appearing in the form of comets in the case where it has been damaged.
  • Quantification software is used to determine the average Tail Moment applied to each condition tested. This parameter gives information on the level of DNA damage: the higher it is, the greater the damage to the DNA.
  • the Tail Moment decreases substantially when the peptide extract according to Example 1 is applied in pretreatment (at a concentration of 1% or 3%), that is to say that the cells underwent less only in the control condition when subjected to subsequent UVB radiation.
  • EXAMPLE 5 Demonstration of the Restorative Action of the Peptide Extract According to Example 1 on Human Skin Biopsies Subjected to UVB Radiations
  • the aim of this experiment is to measure the repair capacities of the peptide extract.
  • oats according to the invention after irradiation with UVB radiation of human skin biopsies.
  • UV radiation, and particularly UVB causes dimerization reactions which take place at sites comprising two adjacent pyrimidines (thymidine, cytosine).
  • Several types of photoproducts are then formed, including cyclobutane-pyrimidine dimers or DCPs.
  • Biopsies of human skin are cultured at the air / liquid interface. These biopsies are irradiated with UVB radiation at a rate of 200 mJ / cm 2 . After irradiation, in a first condition, a 1% solution of the peptide extract according to Example 1 is applied topically to the biopsies for 24 hours. In a second condition, a 3% solution of the peptide extract according to Example 1 is applied topically for 24 hours. A control condition is achieved by topical application of a PBS solution after irradiation.
  • cyclobutane-pyrimidine dimers For the labeling of cyclobutane-pyrimidine dimers, skin biopsies are embedded in paraffin and histological sections of 3 ⁇ m thickness are made. The slides are deparaffinized, hydrated and then immunostained with an antibody directed against cyclobutane-pyrimidine dimers (MBL D 194-1, mouse monoclonal) followed by a suitable secondary antibody (Invitrogen A21202), coupled to a fluorescent marker. The skin sections are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Nikon Eclipse E 80i microscope).
  • the observed fluorescence is more intense when the biopsies have been subjected to LTVB radiation.
  • a much less intense fluorescence is observed than in the control condition with UVB.
  • the oat peptide extract according to the invention has allowed a better and a more important repair of the damage suffered by the DNA of the cutaneous cutaneous cells, this thanks in particular to the activation of caspase-14. It is also observed that this repair action is dose-dependent since it is greater when a greater amount of peptide extract according to Example 1 is applied.
  • Example 6 Composition of a sunscreen

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Description

UTILISATION COSMETIQUE D'UN EXTRAIT D'AVOINE EN TANT QU'AGENT ACTIVATEUR DE LA CASPASE-14 La présente invention se situe dans le domaine de la cosmétique. Elle se rapporte à une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine (Avena sativa L), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané, et plus particulièrement pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, en particulier liés au photovieillissement.
Les signes visibles du vieillissement sont en partie attribués à la prédisposition génétique et en partie aux facteurs environnementaux de l'individu et autres facteurs de stress associés au mode de vie.
La principale fonction de la peau, qui est l'organe le plus grand du corps humain, est de protéger l'organisme contre un grand nombre de ces facteurs, notamment extérieurs. A titre d'exemple, on peut citer des facteurs tels que la pollution, la surexposition au soleil, ou encore l'utilisation de produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums, ou des facteurs mécaniques, telles que les abrasions, le rasage ou l'épilation. Par pollution, on entend aussi bien la pollution « extérieure » due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution « intérieure » qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldéhyde), ou bien encore le tabagisme ou l'exposition à la fumée de cigarette. La sécheresse de l'atmosphère est également une cause importante d'agression cutanée.
Ces facteurs aboutissent à une altération de la fonction barrière de la peau, qui se traduit par un inconfort cutané, des phénomènes sensoriels désagréables, tels que des tiraillements ou des démangeaisons, voire des fragilités excessives et des rougeurs.
Par ailleurs, ces facteurs participent à l'accélération du vieillissement dit « extrinsèque » de la peau. En effet, le vieillissement extrinsèque est dû à des facteurs environnementaux auxquels est soumis l'organisme tout au long de sa vie, facteurs l'on regroupe sous le terme d'agressions extérieures. Les personnes ayant la peau claire sont plus particulièrement sensibles aux effets nocifs des agressions extérieures, en particulier aux rayonnements ultraviolets du soleil. Cette barrière que représente la peau, est constituée par plusieurs couches composées de cellules de natures diverses qui permettent d'assurer à la peau son renouvellement continuel. Ce processus de renouvellement passe avant tout par un phénomène de desquamation des cellules qui se trouvent à la surface de la peau, phénomène qui doit être compensé par le renouvellement de Pépiderme assuré par les kératinocytes de la couche basale qui se divisent activement et se différencient en cellules de la couche cornée ou cornéocytes. Ces activités de renouvellement, mais aussi de réparation de la peau dans le cas de dommages tels que les rayonnements UV, sont extrêmement contrôlées par un ensemble de voies de signalisation. Parmi ces voies de signalisation, l'une d'entre elles fait intervenir une protéase, la caspase-14. La caspase-14 est un membre unique au sein de la famille des caspases. En effet, contrairement aux autres membres de la famille des caspases qui sont exprimés de façon ubiquitaire, la caspase-14 est uniquement exprimée et active dans l'épiderme et est absente de la plupart des autres tissus adultes (Eckart et al., J. Invest. Dermatol., 2000, 44 :425-432). Il a notamment été prouvé le rôle crucial de la caspase-14 dans la formation de la barrière que forme l'épiderme (Denecker et al, Nat. Cell. Biol. 2007, 9 : 666-674). En effet, celle-ci est exprimée et exerce son activité protéolytique seulement dans les couches de l'épiderme où ont Heu la différenciation et la « cornification », ainsi que dans le follicule pileux (Lippens et al., Cell Death Differ., 2000, 10 :257-259). De plus, il a été prouvé que la caspase-14 joue un grand rôle en particulier dans les processus de maintien de l'hydratation, de formation des cornéocytes, et de protection contre l'apoptose, notamment lors d'agressions extérieures comme celles dues aux rayonnements UV (Denecker et al., J. Cell Biology, 2008, 451-458).
L'ensemble de ces conclusions ont, entre autre, conduit à l'élaboration de compositions pharmaceutiques comprenant la caspase-14 en tant qu'agent actif, utilisables plus particulièrement en tant qu'écran solaire (WO2008025830).
Cependant, il n'existe aucun composé facile à mettre en œuvre, permettant d'activer la caspase-14, et présentant une activité cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages au niveau de la peau, principalement liés au photo-vieillissement et, plus particulièrement, protéger la peau contre les rayonnements UV, alors que le besoin de soin innovant de ce type existe.
C'est ainsi que la Demanderesse a découvert et mis en évidence qu'un extrait d'avoine (Avena sativa L.), est un bon agent activateur de la caspase-14, et a une action significative sur la protection de la peau contre les agressions extérieures telles que les rayonnements UV, grâce notamment, à une fonction de protection et de réparation de l'ADN des cellules cutanées.
L'extrait d'avoine (Avena sativa L.) utilisé selon l'invention offre notamment les avantages suivants :
- il active la caspase-14 ;
- il permet de conserver l'hydratation de l'épiderme et optimise le rôle de barrière de l'épiderme ; et
- il prévient et répare les dommages de l'ADN des cellules de la peau soumises à des rayonnements UV, en particulier UVB.
La présente invention a pour objet une méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine {Avena sativa L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané.
L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description.
L'avoine est une plante annuelle appartenant au genre Avena cultivée comme céréale ou comme fourrage. Les protéines de l'avoine, riches en tryptophane, participent à la production de sérotonine et mélatonine chez l'Homme. Aussi, l'avoine contient de nombreux antioxydants comme les avénanthramides, les tocophérols et les tocotriénols (Bryngelsson et al, 2002). Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière ou une partie spécifique de l'avoine (feuilles, graines, etc.). Plus particulièrement selon l'invention, on utilise les graines de l'avoine.
L'extrait d'avoine (Avena sativa L.) utilisé selon l'invention est préférentiellement un extrait peptidique provenant de l'hydrolyse des protéines extraites des graines d'avoine.
Il est possible, pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier ensuite les composés peptidiques ainsi obtenus. Selon la présente invention, un composé peptidique désigne les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans l'extrait issu de l'hydrolyse.
Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée afin de préparer l'extrait d'avoine selon l'invention. Préférentiellement, l'extrait d'avoine est obtenu par extraction des protéines, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des composés peptidiques. A titre d'exemple, dans une première étape, les graines d'avoine sont broyées à l'aide d'un broyeur à plantes. Avantageusement, la poudre ainsi obtenue est ultérieurement "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique, comme par exemple un alcool, l'hexane ou l'acétone.
On réalise ensuite l'extraction des protéines de l'avoine suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyât de graines d'avoine est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 - 20%) ; en effet, il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. En particulier, la concentration en substances de type phénolique, interagissant avec les protéines, se trouve nettement réduite. Les protéines peuvent ensuite être précipitées en faisant varier la force ionique en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant organique tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme plus purifiée de l'hydrolysat.
L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide toujours en présence de polyvinylpolypyrrolidone. Après une étape de filtration, l'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium) ou un solvant organique (alcool, acétone). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant.
La fraction soluble, contenant les protéines, des glucides et éventuellement des lipides, est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration. Cette solution brute est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des composés peptidiques solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique.
Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). Pour les mêmes raisons que précédemment, c'est-à-dire l'élimination des substances polyphénoliques, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu réactionnel lors de cette étape d'hydrolyse ménagée. Après fïltration, la solution obtenue constitue une première forme avantageuse d'extrait peptidique d'avoine selon l'invention.
L'extrait peptidique d'avoine peut être encore purifié afin de sélectionner les poids moléculaires et la nature des peptides générés. Le fractionnement peut s'effectuer avantageusement par ultrafiltration et/ ou par une méthode de type chromatographique.
L'utilisation d'extraits peptidiques, et en particulier d'extraits peptidiques de bas poids moléculaires, présente de nombreux avantages en cosmétique. Outre le fait de générer des composés peptidiques qui ne préexistaient pas dans le mélange protéique de départ extrait, l'hydrolyse et la purification permettent d'obtenir un mélange de composés peptidiques plus stables, plus facilement standardisables et ne provoquant pas de réactions allergiques en cosmétique.
L'extrait peptidique d'avoine préféré selon l'invention comprend essentiellement des composés peptidiques de bas poids moléculaires, c'est-à-dire ne comprend avantageusement que des peptides de bas poids moléculaire. Préférentiellement, il comprend essentiellement des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa, c'est-à-dire avantageusement l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention ne comprend que des peptides dont le poids moléculaire est inférieur à 5 kDa.
L'extrait d'avoine obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés peptidiques ; les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine a un pH compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, et comprend entre 0,5 et 8 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 0,5 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec, préférentiellement l'extrait d'avoine selon l'invention est dilué pour contenir entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 2 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec.
L'extrait d'avoine selon l'invention, et plus particulièrement l'extrait peptidique d'avoine, active la caspase-14 après application au niveau cutané. Selon l'invention, l'extrait d'avoine augmente la quantité de caspase-14, soit par augmentation de la synthèse protéique de celle-ci (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique), soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation des transcrits d'ARN messager.
Ainsi, l'objet de l'invention se rapporte à une méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine selon l'invention, dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané. Les dommages subis par l'ADN cellulaire chez l'Homme se réparent tous les jours, mais pas tous. Les dégâts non réparés vont alors s'accumuler au fil des ans. Il est ainsi essentiel de prévenir ces dommages et de les réparer.
Par prévenir les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, on désigne le rôle protecteur de l'extrait d'avoine selon l'invention au niveau des cellules de la peau pour limiter l'apparition de dommages au niveau de l'ADN.
Par réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, on désigne le rôle réparateur de l'extrait d'avoine selon l'invention au niveau de l'endommagement préalablement subi par les cellules de la peau.
Les cellules cutanées selon l'invention désignent les cellules de l'épiderme et du derme, et en particulier les kératinocytes.
Les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées selon l'invention désignent les dommages dus à des réactions photochimiques entre les bases de l'ADN, comme par exemple la formation de dimères pyrimidiques de cyclobutane ou encore tout autre dommage subi par l'ADN lors d'agressions extérieures que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les rayonnements UV, en particulier UVB, liés par exemple à une surexposition au soleil, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums.
La méthode de soin cosmétique selon l'invention vise préférentiellement à prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées qui sont liés au photovieillissement et induits par des rayonnements UV, en particulier les UVB, et ainsi prévenir et/ou retarder l'apparition des signes cutanés du photo-vieillissement.
Les dommages non réparés ainsi subis par l'ADN des cellules cutanées liés au photovieillissement, entraînent un vieillissement prématuré de la peau, qui ne deviennent souvent visibles que lorsque la personne a déjà passé le cap des 20 ans mais qui s'accentuent avec le temps.
Ils prennent principalement la forme de rides, notamment de ridules autour de la bouche et des yeux, et d'hyperpigmentation, notamment sous forme de taches brunes bénignes qui peuvent être disséminées sur le corps et en particulier sur le front, le nez et les joues. Dans le cadre des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition comprenant l'extrait d'avoine et un milieu physiologiquement acceptable est appliquée topiquement sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps.
Un milieu physiologiquement acceptable selon l'invention désigne en particulier des milieux qui conviennent à une utilisation en contact avec la peau ou les phanères humains, sans risque par exemple de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, ou encore de réponse allergique.
A cet effet, l'une quelconque des formes plus ou moins purifiées de l'extrait d'avoine selon l'invention est alors solubilisée dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants physiologiquement acceptables, classiquement utilisés par l'homme du métier, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine selon l'invention est solubilisé dans un vecteur cosmétique comme les liposomes, ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur physiologiquement adapté.
De manière préférée, la composition selon l'invention destinée à être appliquée de façon topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps se présente sous forme de crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, microémulsion, gel aqueux ou anhydre, sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de spray, d'onguent, de pommade, de lotion, de colloïde, de lait, de lotion, de stick ou de poudre.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait d'avoine selon l'invention est présent dans la composition à une concentration comprise entre 0,0001% à 20% environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05% et 5% environ, encore plus préférentiellement à une concentration comprise entre 1% et 3% environ par rapport au poids total de la composition finale.
Encore plus préférentiellement, la composition selon l'invention contient en outre, au moins un autre agent actif, préférentiellement un agent favorisant l'action de l'extrait d'avoine selon l'invention. On peut citer, de manière non limitative, les classes d'ingrédients suivantes : d'autres agents actifs peptidiques, des extraits de végétaux, des agents cicatrisants, anti-âge, antirides, apaisants, anti-radicalaires, anti-UV, des agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou le métabolisme énergétique, des agents hydratants, antibactériens, antifongiques, anti-inflammatoires, anesthésiques, des agents modulants la différenciation, la pigmentation ou la dépigmentation cutanée, des agents stimulants la pousse des ongles ou des cheveux etc. Préférentiellement, on utilisera un agent présentant une activité dans le domaine des antirides, tel qu'un agent anti- radicalaire ou antioxydant, ou un agent stimulant la synthèse de macromolécules dermiques, ou encore un agent stimulant le métabolisme énergétique. Plus particulièrement, l'agent actif est choisi parmi les vitamines, les phytostérols, les flavonoïdes, la DHEA et/ou un de ses précurseurs ou un de ses dérivés chimiques ou biologiques, un inhibiteur de métalloprotéinase, ou un rétinoïde.
En outre, des additifs tels que des solvants, des diluants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des absorbeurs d'odeurs, des agents épaississants, émulsifiants, humectants, émollients, des parfums, des antioxydants, des agents filmogènes, chélatants, séquestrants, conditionnants, peuvent être ajoutés à la composition selon l'invention.
Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition comprenant l'extrait d'avoine selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, être compris entre 0,01% et 20% du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5% à 80% en poids et de préférence de 5% à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans une proportion allant de 0,3% à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.
Enfin, dans un mode préférentiel de réalisation des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est appliquée le matin en tant que soin anti-âge de jour et/ou le soir au coucher en tant que soin réparateur de nuit. En cas d'application en soin de jour, la composition permet en particulier une protection de la peau vis-à-vis des agressions de l'environnement, notamment les rayonnements UV, en particulier UVB, en limitant l'apparition de dommages au niveau de l'ADN des cellules cutanées. En tant que soin de nuit, la composition joue plus particulièrement un rôle de réparation des éventuels dommages que la peau aura subie lors de la journée.
Dans un autre mode de réalisation avantageux des méthodes de soin cosmétique selon l'invention, la composition est appliquée avant une exposition de la peau au soleil, et constitue donc un excellent soin avant-soleil permettant en particulier de prévenir les dommages au niveau de l'ADN des cellules cutanées, et/ou après une exposition au soleil, en tant que soin après-soleil afin de réparer plus particulièrement les éventuels dommages subis par la peau au niveau de l'ADN.
Les exemples suivants décrivent et démontrent l'efficacité d'un extrait d'avoine tel que décrit selon l'invention mais ne doivent pas être interprétés comme une limitation de la présente invention.
Exemple 1 : préparation d'un extrait peptidique d'avoine (Avena sativa LA
Les graines d'avoine (Avena sativa L.) sont mises en solution dans 10 volumes d'eau en présence de 2% de POLYCLAR® 10 (polyvinylpyrrolidone - PVPP - insoluble). Le mélange est ajusté à un pH compris entre 6 et 8 avec une solution aqueuse de soude 1 M. Une précipitation en milieu acide est ensuite réalisée. Le culot est remis en solution et après ajustement du pH, de la bromélaïne à 2% est ajoutée dans le milieu réactionnel. L'hydrolyse est obtenue après 2 heures d'agitation à 50°C. On procède ensuite à l'inactivation de l'enzyme par chauffage de la solution à 80°C pendant 2 heures. Après centrifugation, la solution aqueuse surnageante correspondant à un hydrolysat brut d'avoine est récupérée.
Le procédé de purification de Phydrolysat brut commence par des filtrations successives à l'aide de filtres-plaques Seitz-Orion de porosité décroissante (jusqu'à 0,2 μπι) afin d'obtenir une solution beige brillante et limpide, qualifié d'hydrolysat.
A cette étape, l'hydrolysat d'avoine ainsi obtenu est caractérisé par un extrait sec titrant de 10 à 15 g/kg, un taux de protéines de 8 à 12 g/1 et un taux de sucres de 2 à 4 g/1.
La nature protéique de cet hydrolysat est mise en évidence après analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen). L'hydrolysat protéique d'avoine est chauffé à 70°C pendant 10 minutes dans des conditions réductrices dénaturantes dans un tampon de préparation d'échantillon NuPAGE® LDS. Une solution de NuPAGE® Antioxydant est ajoutée dans la cuve intérieure (cathode) pour éviter que les protéines réduites ne se réoxydent durant l'électrophorèse. La migration des protéines est réalisée dans du tampon de migration NuPAGE® MES avec le standard SeeBlue Plus2 comme marqueur de poids moléculaire. La coloration des protéines est effectuée à l'aide de Bleu de Coomassie® R-250. Dans ces conditions, on observe que les protéines obtenues ont un poids moléculaire inférieur à 40 kDa.
Cet hydrolysat est ensuite purifié afin d'éliminer les protéines de poids moléculaire supérieur à 10 kDa, à l'aide de filtrations à flux tangentiel. Pour cela, l'hydrolysat est pompé sous pression à travers un support Pellicon® équipée de cassette Pellicon® 2 Biomax 10 kDa. Le filtrat récupéré est encore élué à travers une cassette Pellicon® 2 Biomax 5 kDa. En fin de purification, on obtient un hydrolysat peptidique brillant et limpide comprenant uniquement des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa. On procède ensuite à une phase de dilution afin d'obtenir un hydrolysat peptidique caractérisé par une teneur en composés peptidiques de 1,5 à 3,5 g/1. Cet hydrolysat peptidique correspond à l'extrait d'avoine actif préféré selon l'invention. Exemple 2 : étude de l'expression de la caspase-14 dans des kératinocvtes humains normaux, en présence de l'extrait peptidique d'avoine selon l'exemple 1
Le but de cette étude est de déterminer l'expression de la caspase-14 dans des kératinocytes humains normaux traités ou non à l'aide d'un extrait peptidique d'avoine selon l'invention.
Protocole :
Des kératinocytes humains normaux, KHN, en culture sont traités avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à 1 % ou à 3 % pendant 24 h. Les cellules sont ensuite lavées, fixées au paraformaldéhyde 3,7% avec triton 0,1% en présence de BSA (dilué au l/100ième). Les cellules sont incubées en présence d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la caspase-14 (BD Biosciences), puis d'un anticorps secondaire, couplé à un marqueur fluorescent. Les cellules sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Nikon Eclipse E600 microscope).
Résultats :
On observe une augmentation de l'intensité lumineuse dans les cellules KHN traitées avec l'extrait peptidique par rapport à la condition contrôle. Cette augmentation de fluorescence est dose-dépendante puisqu'elle est plus importante lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est dosé à 3 % qu'à 1 %. Par conséquent, l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention active l'expression de la caspase-14 dans les KHN. Exemple 3 : étude de l'expression de la caspase-14 par siRNA dans des KHN traités avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1
Afin de quantifier l'efficacité d'un extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur la surexpression de la caspase-14 dans une population de KHN, le gène codant pour la caspase-14 a été « éteint » par utilisation de la technique du siRNA.
Protocole :
Des cellules KHN sont mises en culture en plaque 6 puits jusqu'à une confluence de 60 % puis traitées avec 20 ΐ. d'extrait peptidique selon l'exemple 1 à 1 %. Ensuite, 100 μΐ, d'un mélange préalablement réalisé contenant le siRNA de la caspase-14 et l'agent transfectant sont rajoutés délicatement au goutte à goutte, puits par puits. La plaque de culture cellulaire est incubée à 37°C et à 5 % en C02 pendant 72 h. Le milieu de culture est renouvelé tous les 2 jours. Quatre conditions sont mises en place :
- condition 1 : contrôle sans siRNA et sans extrait peptidique ;
- condition 2 : cellules transfectées avec le siRNA, sans extrait peptidique ;
- condition 3 : cellules non transfectées mais traitées avec l'extrait peptidique ;
- condition 4 : cellules transfectées avec le siRNA et traitées avec l'extrait peptidique.
La quantification de l'expression de la caspase-14 est observée par la technique classique d'immunotransfert (Western Blot) réalisée à l'aide d'un anticorps anti-caspase- 14 et selon un protocole classique. Afin d'analyser la compensation apportée par le peptide dans les KHN ayant été transfectés avec le siRNA, la comparaison sera faite par rapport à des KHN non traités et dont le gène n'a pas été éteint par siRNA.
Résultats :
Entre les conditions 1 et 3, on constate que l'ajout de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 a entraîné une augmentation d'environ 1/5 de l'expression de la protéine caspase-14 par rapport au contrôle. Entre les conditions 1 et 2, on constate bien l'effet du siRNA sur l'expression de la protéine caspase-14 : en effet, celle-ci est en baisse d'environ 1/3. Par contre, l'ajout de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 aux cellules transfectées avec le siRNA permet de restaurer l'expression de la caspase-14, et la baisse due à la présence de siRNA n'est plus que d'environ 1/6 par rapport à la condition contrôle.
En conclusion, l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention a permis d'augmenter l'expression de la caspase-14 dans les KHN. Exemple 4 : test comètes sur des cellules KHN
Le test comètes est un test qui permet de quantifier les dommages causés à l'ADN au niveau cellulaire.
Protocole :
Dans ce but, des cellules KHN sont :
- condition a : mises en culture pendant 24 h avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à une concentration de 1 % et de 3 %, puis irradiées avec des rayonnements UVB à raison de 20 mJ/ cm2, afin de constater un effet protecteur de l'actif peptidique selon l'invention sur les cellules ;
- condition b : irradiées dans un premier temps avec des rayonnements UVB à raison de 20 mJ/ cm2, puis traitées pendant 24 h avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1 à une concentration de 1 % et de 3 %, afin de constater un effet réparateur de l'actif sur les cellules.
Une condition contrôle est réalisée dans chaque cas sans actif peptidique.
Les cellules sont ensuite trypsinées de leur support, puis centrifugées à 900 tour/min pendant 5 minutes afin de les concentrer et les dénombrer.
Un nombre défini de cellules (25 000 cellules) est ensuite inclus dans un gel d'agarose Low Melting à 0,75 %, puis déposé sur une lame de verre préalablement recouverte d'agarose à 1 %. Les lames sont ensuite immergées dans une solution de lyse pendant lh30 à 4 °C, puis dans une solution alcaline pendant 20 minutes à 4 °C. Les cellules sont ainsi lysées et l'ADN dénaturé. Les lames sont plongées dans une solution d'électrophorèse avant d'appliquer un champ électrique (20 V - 250 mA). L'ADN ainsi dénaturé est soumis à une migration au sein du gel d'agarose à 4 °C. L'application d'un colorant fluorescent de l'ADN sur les lames (l'iodure de propidium à 2 μg/ ml) permet d'observer au microscope l'ADN apparaissant sous forme de comètes dans le cas où il a été endommagé.
Un logiciel de quantification permet de déterminer le Tail Moment moyen appliqué à chaque condition testée. Ce paramètre renseigne sur le niveau d'endommagement de l'ADN : plus il est élevé, plus les dommages sur l'ADN sont importants.
Résultats :
Dans la condition a, le Tail Moment diminue sensiblement lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliqué en prétraitement (à une concentration de 1 % ou de 3 %), c'est-à-dire que les cellules ont subies moins de dommages que dans la condition contrôle, lorsqu'elles sont soumises à des rayonnements UVB ultérieurs. Ces résultats confirment bien l'effet protecteur de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur les cellules KHN, plus particulièrement au niveau de leur ADN. Par ailleurs, lorsque l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliqué après irradiation, sans prétraitement (condition b), le Tail Moment diminue de façon dose dépendante. Ce test en condition b a permis de mettre en évidence le rôle réparateur de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention sur l'ADN des cellules cutanées testées soumises à des irradiations UVB préalables.
Exemple 5 : mise en évidence de l'action réparatrice de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 sur des biopsies de peau humaine soumises à des rayonnements UVB Le but de cette expérience est de mesurer les capacités de réparation de l'extrait peptidique d'avoine selon l'invention après irradiation par rayonnements UVB de biopsies de peau humaine. Le rayonnement UV, et particulièrement UVB, entraine des réactions de dimérisation qui ont lieu au niveau des sites comprenant deux pyrimidines adjacentes (thymidine, cytosine). Plusieurs types de photoproduits sont alors formés, dont les dimères de cyclobutane-pyrimidine ou DCPs. Or, il est connu que lorsqu'une cellule est exposée à un stress génotoxique, son cycle de division est temporairement arrêté pour permettre la réparation de l'ADN et éviter ainsi l'apparition de mutations dans les générations suivantes de cellules. La prolifération cellulaire ne reprend qu'ensuite. Si la fréquence ou la quantité des dommages est trop élevée, ou encore la réparation inefficace, les cellules enclenchent un processus de mort programmée, l'apoptose. Par conséquent, en mesurant par immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-DCPs, la quantité de photoproduits formés, il est possible d'évaluer l'efficacité d'un composé ayant une action réparatrice sur l'ADN.
Protocole d' immunomarquage des DCPs sur des biopsies de peau soumises à des UVB
Des biopsies de peau humaine sont mises en culture à l'interface air/liquide. Ces biopsies sont soumises à des irradiations par rayonnements UVB à raison de 200 mJ/ cm2. Après irradiation, dans une première condition, une solution à 1 % de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée topiquement sur les biopsies durant 24 h. Dans une seconde condition, une solution à 3 % de l'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée topiquement durant 24 h. Une condition contrôle est réalisée par application topique d'une solution de PBS après irradiation.
Pour le marquage des dimères cyclobutane-pyrimidine, les biopsies de peau sont incluses dans de la paraffine et des coupes histologiques de 3 um d'épaisseur sont effectuées. Les lames sont déparaffinées, hydratées puis soumises à un immunomarquage par un anticorps dirigé contre les dimères cyclobutane-pyrimidine (MBL D 194-1, mouse monoclonal) puis par un anticorps secondaire adapté (Invitrogen A21202), couplé à un marqueur fluorescent. Les coupes de peau sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Nikon Eclipse E 80i microscope).
Résultats :
En condition contrôle, la fluorescence observée est plus intense lorsque les biopsies ont été soumises aux rayonnements LTVB. Dans les deux conditions testées avec posttraitement avec l'extrait peptidique selon l'exemple 1, on observe une fluorescence beaucoup moins intense que dans la condition contrôle avec UVB.
Conclusions :
L'extrait peptidique d'avoine selon l'invention a permis une meilleure et une plus importante réparation des dommages subis par l'ADN des cellules cutanées tetsées, ceci grâce notamment à l'activation de la caspase-14. On observe aussi que cette action de réparation est dose-dépendante puisque celle-ci est plus importante lorsqu'une plus grande quantité d'extrait peptidique selon l'exemple 1 est appliquée.
Exemple 6 : composition d'une crème solaire
Noms %
Ingrédient (Noms INCI)
commerciaux massique
PHASE A
Aqua (Eau déminéralisée) qsp
Glycerin 3,00
Versene NA2 Disodium EDTA 0,10
Triethanolamine 0,50
UltraThix® P100 Acrylic acid/VP Crosspolymer 0,70
PHASE B j
Dimethicone (lOOcs) 0,50
Glucamate SSE20 PEG-20 Methyl Glucose Sesquistearate 2,50
Glucamate S S Methyl Glucose Sesquistearate 0,50 Noms %
Ingrédient (Noms INCI)
commerciaux massique
Lanette® 16 Cetyl Alcohol 1,50
Ceraphyl® SLK Isodecyl Neopentanoate 3,00
Ceraphyl® 230 Diisopropyl Adipate 2,00
Escalol® 517 Avobenzone 3,00
Escalol® 587 Octisalate 5,00
Escalol® 597 Octocrylene 2,00
Bis-Ethylhexyloxyphenol
Escalol® S 3,00
Methoxyphenyl Triazine
PHASE C
Cyclopentasiloxane 5,00
Cyclopentasiloxane,
Si-Tec™ RE- 100 Dimethicone/Vinyltrimethylsiloxysilicate 1,00
Crosspolymer
PHASE D
Ethanol 5,00
Phenoxyethanol, Benzoic acid,
Optiphen™ ND 1,20
Dehydroacetic acid
PHASE E
Extrait d'avoine selon l'exemple 1 3,00
Parfum (Fragrance) qsp
Colorant qsp

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de soin cosmétique pour prévenir et/ou réparer les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées, comprenant l'application topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'un extrait d'avoine (Avena sativa L.), dans une composition comprenant un milieu physiologiquement acceptable, qui active l'expression de la caspase-14 au niveau cutané.
2. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 1, dans laquelle les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées sont induits par des rayonnements UV.
3. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 2, dans laquelle les dommages subis par l'ADN des cellules cutanées sont induits par des rayonnements UVB.
4. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait d'avoine (Avena sativa L.) est un extrait peptidique provenant de l'hydrolyse des protéines extraites des graines d'avoine.
5. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 4, dans laquelle l'extrait peptidique d'avoine comprend essentiellement des composés peptidiques de poids moléculaire inférieur à 5 kDa.
6. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle l'extrait peptidique d'avoine comprend entre 0,5 et 8 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 0,5 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec.
7. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'extrait peptidique d'avoine comprend entre 1,5 et 3,5 g/1 de composés peptidiques en poids d'extrait sec et entre 2 et 5 g/1 de sucres en poids d'extrait sec.
8. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'extrait d'avoine est présent à une concentration comprise entre 0,0001% et 20% par rapport au poids total de la composition finale.
9. Méthode de soin cosmétique selon la revendication 8, dans laquelle l'extrait d'avoine est présent à une concentration comprise entre 1% et 3% par rapport au poids total de la composition finale.
10. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle la composition destinée à être appliquée de façon topique sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps se présente sous forme de crème, émulsion huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsion multiple, solution, suspension, microémulsion, gel aqueux ou anhydre, sérum, ou encore de dispersion de vésicules, de patch, de spray, d'onguent, de pommade, de lotion, de colloïde, de lait, de lotion, de stick ou de poudre.
11. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle la composition est appliquée le matin en tant que soin anti-âge de jour et/ou le soir au coucher en tant que soin réparateur de nuit.
12. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle la composition est appliquée avant une exposition au soleil, en tant que soin avant-soleil.
13. Méthode de soin cosmétique selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle la composition est appliquée après une exposition au soleil, en tant que soin après-soleil.
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