[go: up one dir, main page]

WO2013191138A1 - トランス－３－ヒドロキシ－ｌ－プロリンの製造方法 - Google Patents

トランス－３－ヒドロキシ－ｌ－プロリンの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013191138A1
WO2013191138A1 PCT/JP2013/066609 JP2013066609W WO2013191138A1 WO 2013191138 A1 WO2013191138 A1 WO 2013191138A1 JP 2013066609 W JP2013066609 W JP 2013066609W WO 2013191138 A1 WO2013191138 A1 WO 2013191138A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
host organism
arginase
arginine
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2013/066609
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
木野　邦器
良太郎 原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
API Corp
Original Assignee
API Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by API Corp filed Critical API Corp
Publication of WO2013191138A1 publication Critical patent/WO2013191138A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03001—Arginase (3.5.3.1)

Definitions

  • the present invention provides a method for producing trans-3-hydroxy-L-proline, a method for producing (2S, 3S) -3-hydroxyornithine, and an arginase for obtaining (2S, 3S) -3-hydroxyornithine, It relates to ornithine cyclodeaminase to obtain (2S, 3S) -3-hydroxyproline.
  • Hydroxy-L-proline is a kind of modified amino acid having a structure in which a hydroxyl group is introduced into L-proline.
  • These isomers cis-4-hydroxy-L-proline, trans-4-hydroxy-L-proline, cis-3-hydroxy-L-proline, and trans-3-hydroxy-L-proline
  • chiral building It is a compound useful as a block.
  • cis-4-hydroxy-L-proline is a useful compound as a synthetic intermediate material for pharmaceuticals such as N-acetyl-4-hydroxy-L-proline, which is used as a carbapenem antibiotic and an anti-inflammatory agent.
  • trans-3-hydroxy-L-proline is used as a raw material for synthesis such as alisteromycin, and is a particularly useful compound among isomers of L-proline.
  • Hydroxy-L-proline is generally biosynthesized from L-glutamic acid in a three-step reaction with ProB, ProA and ProC in microorganisms such as E. coli. In nature it generally exists as trans-4-hydroxy-L-proline, and the presence of other isomers such as trans-3-hydroxy-L-proline is very limited.
  • Non-patent Document 1 As a method for producing trans-3-hydroxy-L-proline, a method of synthesizing from gluconolactone (Non-patent Document 1) and a method of synthesizing from beta-alanine (Non-patent Document 2) have been reported.
  • Non-patent Document 3 A method for biosynthesis of trans-3-hydroxy-L-proline using a fungus (Non-patent Document 3) has also been reported.
  • (2S, 3S) -3-hydroxy-L-ornithine is a kind of modified amino acid having a structure in which a hydroxyl group is introduced into L-ornithine, and is a compound useful as a chiral building block.
  • ⁇ -lactam It is a compound useful as a synthetic intermediate material for pharmaceuticals such as compounds.
  • Non-patent Document 4 As a method for producing (2S, 3S) -3-hydroxyornithine, a synthesis method by a sharpless asymmetric dihydroxylation method using 3-aminopropanol as a raw material (Non-patent Document 4) has been reported.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 have many problems such as a large number of reaction steps, poor efficiency, and non-selective asymmetric synthesis. There is.
  • the method for producing trans-3-hydroxy-L-proline described in Non-Patent Document 3 is practical because the biosynthetic process of trans-3-hydroxy-L-proline is unknown and requires time and labor. is not.
  • a method using proline trans-3-hydroxylase extracted from fungal cells (or cells) is not practical because the activity of the enzyme is extremely weak, and further, the amino acid sequence and base of the enzyme are not practical.
  • Non-Patent Document 4 the method for producing (2S, 3S) -3-hydroxy-L-ornithine described in Non-Patent Document 4 has many problems such as a harsh oxidation reaction and an expensive asymmetric catalyst. There is a point. Accordingly, the present invention provides a production method capable of economically and efficiently producing trans-3-hydroxy-L-proline or (2S, 3S) -3-hydroxy-L-ornithine. For that purpose.
  • An arginase action step in which a culture solution containing the obtained protein is allowed to act; Then A protein having ornithine cyclodeaminase activity, (2S, 3S) -3-hydroxyornithine obtained by the arginase action step, a host organism having the ability to produce the protein, a processed product of the host organism, and / or the host
  • a method for producing trans-3-hydroxy-L-proline which comprises an ornithine cyclodeaminase action step for allowing a culture solution containing the protein obtained by culturing an organism to act.
  • a protein having ornithine cyclodeaminase activity, a host organism having the ability to produce the protein, a processed product of the host organism, and / or the host organism are cultured in (2S, 3S) -3-hydroxyornithine.
  • [4] A protein having arginine hydroxylase activity on L-arginine, a host organism having the ability to produce the protein, a processed product of the host organism, and / or the protein obtained by culturing the host organism.
  • protein As used herein, “protein”, “peptide”, “oligopeptide” or “polypeptide” is a compound in which two or more amino acids are linked by peptide bonds. “Proteins”, “peptides”, “oligopeptides” or “polypeptides” may include alkyl groups including methyl groups, phosphate groups, sugar chains, and / or ester bonds and other covalent modifications. .
  • protein is a metal ion, coenzyme, allosteric ligand or other atom, ion, atomic group, or other “protein”, “peptide”, “ When ⁇ oligopeptides '' or ⁇ polypeptides '', biopolymers such as sugars, lipids, nucleic acids, etc., polystyrene, polyethylene, polyvinyl, polyester or other synthetic polymers are bound or associated by covalent or non-covalent bonds There is.
  • an amino acid may be represented by a compound name such as L-asparagine or L-glutamine, or may be represented by a conventional three-letter code such as Asn or Gln.
  • a compound name When expressed by a compound name, it is expressed using a prefix (L- or D-) indicating the configuration of the ⁇ -carbon of the amino acid.
  • L- or D- When expressed in conventional three-letter code, the three-letter code represents an L-amino acid unless otherwise specified.
  • an amino acid refers to any compound in which an amino group and a carboxyl group are bonded via at least one carbon atom and can be polymerized by a peptide bond.
  • Amino acids in the present specification include, but are not limited to, 20 L-amino acids used for translation of proteins synthesized in ribosomes from messenger RNA in vivo and D-amino acids that are stereoisomers thereof. It may contain any natural or non-natural amino acid.
  • Preparation of chromosomal DNA, amplification of the target gene, electrophoresis, staining, etc. can be performed according to conventional methods. For example, Sambrook, J. et al. And Russell, D .; W. See Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
  • nucleotide sequence homology is determined by aligning the nucleotide sequence of the query (query) and the nucleotide sequence of the subject (subject) so that the number of nucleotide sequence matches is the largest. Is expressed as a percentage of the quotient divided by the total number of nucleotides in the query nucleotide sequence.
  • homology of amino acid sequences is such that the number of amino acid residues whose sequences match between the amino acid sequence of the query (query) and the amino acid sequence of the comparison target (subject) is the largest.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence homology can be calculated by using the sequence alignment program CLUSTALW well known to those skilled in the art.
  • stringent conditions means that the Southern blotting method described in the above Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition is performed under the following experimental conditions.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence to be compared is band-formed by agarose electrophoresis, and then immobilized on a nitrocellulose filter or other solid phase by capillary action or electrophoresis. Pre-wash with a solution consisting of 6x SSC and 0.2% SDS.
  • a hybridization reaction between a probe obtained by labeling a polynucleotide having a desired nucleotide sequence with a radioisotope or other labeling substance and a polynucleotide to be compared immobilized on the solid phase is performed with 6 ⁇ SSC and 0.2. % Overnight in a solution of SDS. Thereafter, the solid phase was washed twice in a solution composed of 1 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes each, and then in a solution composed of 0.2 ⁇ SSC and 0.1% SDS at 65 ° C. Wash twice for 30 minutes each. Finally, the amount of the probe remaining on the solid phase is determined by quantifying the labeling substance.
  • hybridization under stringent conditions means that the amount of the probe remaining in the solid phase on which the polynucleotide comprising the nucleotide sequence to be compared is immobilized does not immobilize the polynucleotide comprising the desired nucleotide sequence. Means at least 25%, preferably at least 50%, more preferably at least 75% or more of the amount of probe remaining in the solid phase of the positive control experiment.
  • Table 1 shows a conceptual diagram of the reaction system of the production method of the present invention.
  • arginine hydroxylase, arginase, and / or ornithine cyclodeaminase (hereinafter, these enzymes may be referred to as “proteins having a desired function”).
  • proteins having a desired function proteins having a desired function
  • the “protein having a desired function (activity)” is a protein having arginine hydroxylase activity, arginase activity, and / or ornithine cyclodeaminase activity.
  • the protein having the desired function includes, but is not limited to, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4.
  • protein having arginine hydroxylase activity refers to a protein having an enzyme activity that catalyzes the hydroxylation reaction of L-arginine or a derivative thereof, ie, “arginine hydroxylase” (EC 1.14.11).
  • the arginine hydroxylase of the present invention may be an arginine hydroxylase derived from any species, provided that it has an activity to convert L-arginine to (2S, 3S) -3-hydroxyarginine.
  • the arginine hydroxylase of the present invention enzymes derived from the genus Streptomyces such as Streptomyces sp. And Streptomyces vinaceus can be used.
  • the arginine hydroxylase is (1) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (2) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having arginine hydroxylase activity; (3) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence usually showing 80% or more, preferably 90% or more homology, and having arginine hydroxylase activity; (4) consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleotide sequence usually showing 80% or more, preferably 90% or more homology, and containing arginine water A protein having oxidase activity; (5) Arginine hydroxylation, comprising an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under string
  • fusion protein refers to a fusion protein in which a specific binding tag peptide is linked to the amino terminus or carboxyl terminus of a protein having a desired function.
  • the specific binding tag peptide can be used to detect, separate, or purify the expressed protein more easily. It is a polypeptide that specifically binds to glycolipids, nucleic acids and their derivatives, resins and the like.
  • the ligand that binds to the specific binding tag may be immobilized in a solid support, either in a free state dissolved in an aqueous solution.
  • the fusion protein specifically binds to the ligand immobilized on the solid support, other components of the expression system can be washed away. Thereafter, the fusion protein can be separated and recovered from the solid support by adding a ligand in a free state or changing pH, ionic strength and other conditions.
  • Specific binding tags include, but are not limited to, His tag, myc tag, HA tag, intein tag, MBP, GST and similar polypeptides.
  • the specific binding tag may have any amino acid sequence provided that the fusion protein retains arginine hydroxylase activity, arginase activity, and / or ornithine cyclodeaminase activity.
  • protein having arginase activity refers to an enzyme that catalyzes a reaction of hydrolyzing L-arginine or a derivative thereof to L-ornithine or a derivative thereof and urea, that is, “arginase” (EC 3.5. Refers to 3.1).
  • the arginase of the present invention may be an enzyme derived from any species, provided that it has an activity of converting (2S, 3S) -3-hydroxyarginine to (2S, 3S) -3-hydroxyornithine. Absent.
  • Bacillus cereus Bacillus cereus
  • Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis
  • Bacillus anthracis Bacillus anthracis
  • Bacillus Brevibacillus Bacillus brevis
  • Bacillus cardo Veloqx Bacillus caldovelox
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilus
  • Bacillus Bacillus such as, Mesorhizobium loti (Mesorhizobium loti), Mesorhizobium Oost lari cam (Mesorhizobium australicum), Mesorhizobium Opo Tunis Tam (Mesorhizobium opportunistum), Mesori Enzyme can be used that derived from Biumu-methallyl radiodurans (Mesorhizobium metallidurans) Mesorhizobium genus such as.
  • the arginase is (1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, (2) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, and having arginase activity; (3) a protein consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 and an amino acid sequence usually showing 80% or more, preferably 90% or more homology, and having arginase activity; (4) consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, and a nucleotide sequence usually showing a homology of 80% or more, preferably 90% or more, and A protein having arginase activity; (5) an arginase comprising an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynu
  • a protein having ornithine cyclodeaminase activity refers to an enzyme that catalyzes the addition / elimination reaction of ammonia for converting L-ornithine or a derivative thereof to L-proline or a derivative thereof, ie, “ornithine cyclodeaminase”. This refers to (EC 4.3.1.12).
  • the ornithine cyclodeaminase of the present invention has the condition that it has an activity to convert (2S, 3S) -3-hydroxyornithine to (2S, 3S) -3-hydroxyproline (ie, trans-3-hydroxy-L-proline). As such, it may be an enzyme derived from any biological species.
  • Mesorhizobium genus such Mesorhizobium loti (Mesorhizobium loti, Agrobacterium, such as Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens), the genus Burkholderia, such as Burkholderia cepacia (Burkholderia cepacia) can be used an enzyme derived from Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) Pseudomonas such as Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) Corynebacterium such as.
  • Mesorhizobium loti (Mesorhizobium loti) MAFF 303099
  • Stock-derived distribution Is preferably ornithine cycloalkyl deaminase having the amino acid sequence set forth in ID NO: 4.
  • the ornithine cyclodeaminase is (1) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, (2) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and having arginase activity; (3) a protein having an ornithine cyclodeaminase activity consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and usually showing an amino acid sequence of 80% or more, preferably 90% or more, (4) consisting of an amino acid sequence encoded by a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a nucleotide sequence usually showing a homology of 80% or more, preferably 90% or more, and ornithine cyclo A protein having deaminase activity; (5) An ornithine cyclodeaminase comprising an amino acid sequence encoded by
  • the protein having the desired function described above can be produced, for example, by the method described later.
  • Method for producing protein having desired function The protein having the desired function described above can be produced by expressing a DNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence.
  • the method for expressing the DNA is not particularly limited, and the whole organism or a part of an organism such as a cell or tissue may be used, but a method using an expression system using a host organism described later. Is preferred. Moreover, if necessary, an expression system using a host cell or an inanimate expression system can also be used.
  • Host organisms that can be used in the present invention include prokaryotes such as E. coli and Bacillus subtilis and eukaryotes such as yeast, fungi, plants and animals.
  • prokaryotes such as E. coli and Bacillus subtilis
  • eukaryotes such as yeast, fungi, plants and animals.
  • Escherichia (Escherichia) bacteria e.g., E.
  • actinomycetes Actinomycetes
  • Bacillus Bacillus (Bacillus) bacteria
  • Serratia Serratia
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Rhodococcus Rhodococcus
  • Lactobacillus Lactobacillus
  • Streptomyces Streptomyces
  • Streptococcus Streptococcus
  • Escherichia coli Bacillus subtilis , Bacillus brevis , Bacillus stearothermophilus , Serratia marcescens , Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Brevibacterium flavum (Brevibacterium flavum), Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum), Rhodococcus Erythropolis ( Rhodococcus erythropolis ), Thermus thermophilus ( Thermus thermophilus ), Streptococcus lactis ( Lactobaci ), Lactobaci casei ( Lactobaci) llus casei ), Streptomyces lividans and the like.
  • Escherichia coli Thermus
  • a polynucleotide encoding a protein having a desired function is introduced into the host organism, so that the protein having the desired function is replicated and expressed in the host organism.
  • Genetic factors used in the present invention include, but are not limited to, plasmids, viruses, phages, cosmids and the like.
  • the vector may be a plasmid. More preferably, the vector may be a pET-21a (+) plasmid.
  • specific plasmid vectors include pBR322, pUC18, pHSG298, pUC118, pSTV28, pTWV228, pHY300PLK (the above plasmid vectors can be purchased from, for example, Takara Bio Inc.), pET expression vector series (manufactured by Novagen) Etc. Examples of E.
  • coli-coryneform bacterium shuttle vectors include plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmids pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE and pCRY3KX described in JP-A-2-276575; Plasmids pCRY2 and pCRY3 described in Kaihei 1-191686; pAM330 described in JP-A-58-67679; pHM1519 described in JP-A-58-77895; described in JP-A-58-192900 PAJ655, pAJ611 and pAJ1844; pCG1 described in JP-A-57-134500; pCG2 described in JP-A-58-35197; pCG4 and pCG1 described in JP-A-57-183799 ; PKV32 described in JP-A-2005-34025; pKW32 like described in
  • An “expression vector” that can be used in the present invention includes a polynucleotide that encodes a protein having a desired function using genetic engineering techniques well known to those skilled in the art using restriction enzymes, DNA ligation enzymes, and the like. It is a vector capable of expressing the protein, which is prepared by ligating any of these vectors. It is preferable to introduce a promoter sequence into the expression vector as necessary.
  • a promoter for expressing DNA encoding a protein having a desired function a promoter possessed by a host organism can be generally used, but is not limited thereto, and is used for initiating transcription of DNA of the protein. Any promoter may be used as long as it is a prokaryotic base sequence.
  • lactose operon promoter Specifically, lactose operon promoter, tryptophan operon promoter, ⁇ phage-derived PL promoter, tryptophan lactose hybrid (tac) promoter [HA Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. p.21 (1983)].
  • inducible promoters can be used for the purpose of improving the expression efficiency.
  • gene expression can be induced by adding lactose or isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG).
  • the “transformant” in the present invention is an organism into which the expression vector has been introduced and can express a desired trait related to a protein having a desired function.
  • arginine water It is an organism having the ability to produce a protein having oxidase activity, a protein having arginase activity, and / or a protein having ornithine cyclodeaminase activity.
  • An organism or cell into which the expression vector is introduced in the production of a transformant is called a host organism.
  • a plurality of proteins having a desired function may be co-expressed in the same transformant or may be expressed in separate transformants.
  • the transformant is produced by introducing the expression vector into any suitable host organism.
  • Expression vectors are introduced by electroporation, which creates voids in cell membranes by electrical stimulation, heat shock, combined with calcium ion treatment, and competent cell [Journal of Molecular Biology, Vol.53, p.159 (1970) ], Transformation method by pulse wave energization method [J. Indust. Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)], etc., transduction method using phage [E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p. 189 (1970)], junction transfer method [JGC Ottow, Ann. Rev. Microbiol., Vol. 29, p. 80 (1975)], cell fusion method [MH Gabor, J.
  • Bacteriol., Vol. 137, p. .1346 (1979)] and the like may be implemented by various techniques well known to those skilled in the art.
  • DNA encoding the protein linked to the promoter is introduced using a homologous recombination technique that directly introduces into the chromosome of the host organism, a transposon, an insertion sequence, or the like. It can also be expressed by techniques. Therefore, the transformant of the present invention is not particularly limited as long as the protein is expressed, and the gene introduction method is not particularly limited.
  • a protein having a desired function can be produced by culturing the transformant produced as described above and causing the transformant to produce a protein having a desired function.
  • the transformant can be cultured in a normal nutrient medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salt, various vitamins, etc.
  • a carbon source include sugars such as glucose, sucrose, fructose and maltose, ethanol Alcohols such as methanol, citric acid, malic acid, succinic acid, maleic acid, organic acids such as fumaric acid, molasses, etc. are used.
  • the nitrogen source for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea or the like is used alone or in combination.
  • inorganic salts that can be used include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate.
  • nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, and biotin can be added to the medium.
  • Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as aeration stirring and shaking.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the host microorganism can grow, but is usually 18 to 40 ° C.
  • the pH during the culture is not particularly limited as long as the host microorganism can grow, but it is usually 6 to 8.
  • the pH adjustment during the culture can be performed by adding an acid or an alkali.
  • the expression of the protein having the desired function is forced, the expression of the protein having the desired function is suppressed and the transformant is sufficiently grown while the transformant grows. Later, expression is preferably induced artificially.
  • Such induction and suppression of expression can use, for example, an expression control system of E. coli lactose operon and isopropylthio- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), but is not limited thereto. Any expression control system and inducer known to those skilled in the art can be used.
  • the collection of a protein having a desired function from the culture solution can be performed by a known collection method using the enzyme activity as an index.
  • the enzyme does not necessarily need to be purified to homogeneity, and may be purified to a degree of purification according to the application.
  • the protein having a desired function used in the present invention may be a crudely purified fraction or a purified enzyme.
  • a crudely purified fraction or purified enzyme not only the cells isolated from the culture solution in which the transformant was cultured, but also a crushed product obtained by crushing the culture solution or cells by means of ultrasonic waves, pressure squeezing, etc.
  • An extract containing the protein obtained by extracting the crushed material with water or the like, or a crude enzyme preparation of the protein obtained by subjecting the extract to further treatment with ammonium sulfate salting out, column chromatography, etc. Or the refined enzyme preparation etc. are mentioned.
  • the above-mentioned fusion protein can also be used.
  • a crushed material, an extract, a crudely purified fraction, a purified enzyme, etc. to a support
  • Immobilization of these cells, disrupted cells, extract or purified enzyme is carried out by immobilizing the cells on an appropriate carrier such as acrylamide monomer, alginic acid, or carrageenan according to a commonly used method known per se. It can be performed by the method of making it.
  • an appropriate carrier such as acrylamide monomer, alginic acid, or carrageenan according to a commonly used method known per se. It can be performed by the method of making it.
  • an appropriate buffer for example, a phosphate buffer (pH 6 to 10) of about 0.02 M to 0.2 M. Can be used.
  • the produced transformant itself can also be used in the production method of the present invention as a host organism having the ability to produce a protein having a desired function. That is, a protein having a desired function may be released outside the body or accumulated in the body while the transformant is alive using gene recombination technology.
  • the method for producing (2S, 3S) -3-hydroxyornithine of the present invention comprises (2S, 3S) -3-hydroxyarginine, a protein having arginase activity, a host organism having the ability to produce the protein, and the host organism And / or an arginase action step in which a culture solution containing the protein obtained by culturing the host organism is allowed to act. Further, in the production method of the present invention, after the arginase action step, (2S, 3S) -3-hydroxyornithine obtained by the arginase action step has a protein having ornithine cyclodeaminase activity and an ability to produce the protein.
  • the (2S, 3S) -3-hydroxyarginine is L
  • a culture solution containing arginine with a protein having arginine hydroxylase activity, a host organism having the ability to produce the protein, a processed product of the host organism, and / or the protein obtained by culturing the host organism It is preferably obtained by an arginine hydroxylase action step that acts on the arginine.
  • a protein having a desired function as a substrate specifically, L-arginine, (2S, 3S) -3-hydroxyarginine, (2S, 3S) -3-hydroxyornithine
  • a host organism having the ability to produce the protein a processed product of the host organism, and / or a culture solution containing the protein obtained by culturing the host organism.
  • the protein is produced by acting the compound as a substrate will be described below.
  • the activity of arginine hydroxylase used in the production method of the present invention is as follows: arginine hydroxylase, L-arginine, 2-oxoglutarate, L-ascorbic acid, and divalent iron ion
  • arginine hydroxylase hydroxylase
  • L-arginine 2-oxoglutarate
  • L-ascorbic acid 2-ascorbic acid
  • divalent iron ion In the reaction solution containing the above, it can be evaluated by quantifying (2S, 3S) -3-hydroxyarginine produced by allowing the enzyme to act on the L-arginine.
  • the hydroxylation reaction of L-arginine can be carried out using a reaction solution containing a buffer component for pH adjustment.
  • a buffer component HEPES, Tris, phosphoric acid or the like can be used, and among them, HEPES is preferable.
  • the pH is preferably adjusted to a range of 6.5 to 7.5.
  • the reaction solution may further contain 2-oxoglutaric acid involved as an electron donor in the hydroxylation reaction.
  • the reaction solution may further contain divalent iron ions, L-ascorbic acid and the like.
  • the reaction is usually carried out at 5 ° C. or higher and 45 ° C. or lower and usually 1 hour or longer and 72 hours or shorter.
  • the activity of arginase used in the production method of the present invention is that the enzyme is converted into the (2S, 3S) -3-in reaction solution containing the arginase and (2S, 3S) -3-hydroxyarginine. It can be evaluated by quantifying (2S, 3S) -3-hydroxyornithine produced by acting on hydroxyarginine.
  • the deamination reaction of (2S, 3S) -3-hydroxyarginine can be carried out using a reaction solution containing a buffer component for pH adjustment.
  • a buffer component HEPES, Tris, phosphoric acid or the like can be used, and among them, HEPES is preferable.
  • the pH is preferably adjusted to a range of 6.5 to 7.5.
  • the reaction is usually carried out at 5 ° C. or higher and 45 ° C. or lower and usually 1 hour or longer and 72 hours or shorter.
  • the activity of ornithine cyclodeaminase used in the production method of the present invention is as follows.
  • the reaction of the ornithine cyclodeaminase in the reaction solution containing the ornithine cyclodeaminase (2S, 3S) -3-hydroxyornithine (2S , 3S) -3-Hydroxyornithine can be evaluated by quantifying (2S, 3S) -3-hydroxyproline produced by acting on (2S, 3S) -3-hydroxyornithine ring
  • the reaction is preferably carried out using a reaction solution containing a buffer component for pH adjustment.
  • HEPES HEPES
  • Tris Tris
  • the pH is preferably adjusted to a range of 6.5 to 7.5.
  • the reaction is usually carried out at 5 ° C. or higher and 45 ° C. or lower and usually 1 hour or longer and 72 hours or shorter.
  • the arginine hydroxylase action step, arginase action step, ornithine cyclodeaminase action step may be performed continuously, or the obtained compound may be recovered and purified as necessary to be used as a substrate for the next step. Good.
  • the hydroxylation reaction, the deamination reaction, and / or the cyclization reaction can be scaled up on the condition that the reaction efficiency is equal to or higher than that of the examples.
  • a compound serving as a substrate when produced by acting on a host organism having the ability to produce a protein having a desired function, it can be produced by a fermentation method or a resting cell reaction system. Culture of a host organism having the ability to produce a protein having a desired function can be performed, for example, under the conditions described in the above-mentioned [Method for producing a protein having a desired function].
  • a compound serving as a substrate may be allowed to act on a processed product of a host organism having the ability to produce a protein having a desired function.
  • Processed products of host organisms include cells treated with acetone, toluene, etc., freeze-dried cells, disrupted cells, cell-free extracts obtained by disrupting cells, and purified enzymes (including partially purified enzymes). ) And the like.
  • an immobilized product obtained by immobilizing a treated product of these microorganisms on a carrier by a conventional method is also included in the treated product.
  • a compound serving as a substrate may be allowed to act on a culture solution containing the protein obtained by culturing a host organism having the ability to produce a protein having a desired function.
  • (2S, 3S) -3-hydroxyarginine, (2S, 3S) -3-hydroxyornithine, and / or (2S, 3S) -3-hydroxyproline produced by the production method of the present invention are centrifuged, It can be recovered by a combination of operations well known to those skilled in the art, such as specific adsorption on ion exchange resins and other carriers, high performance liquid chromatography (HPLC), lyophilization and the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the amount of (2S, 3S) -3-hydroxyarginine, (2S, 3S) -3-hydroxyornithine and / or (2S, 3S) -3-hydroxyproline produced by the production method of the present invention The purity and the like can be quantified by methods well known to those skilled in the art.
  • a commercially available analytical instrument such as LC / MS or LC / MS / MS is used for the quantification.
  • the analytical instrument is used according to the manufacturer's instructions.
  • derivatives with chromophores, fluorescent dyes and other sensitizers may be prepared and quantitative determination may be performed.
  • mass spectrometry a calculated value calculated by a method well known to those skilled in the art may be compared with an actually measured value determined by the analytical instrument.
  • the number of reaction steps can be reduced in both the production of (2S, 3S) -3-hydroxyornithine and the production of trans-3-hydroxy-L-proline. Can also be done selectively. Furthermore, in the production method of the present invention, the metal catalyst required in the conventional production method is not used, so that the safety in operation can be improved and obtained (2S, 3S) -3- Hydroxyornithine and trans-3-hydroxy-L-proline are particularly suitable for use in pharmaceutical intermediates where metal residues can be problematic.
  • (2S, 3S) -3-hydroxyornithine produced by the production method of the present invention can be suitably used for pharmaceutical intermediates and the like.
  • (2S, 3S) -3-hydroxyproline produced by the production method of the present invention can be suitably used for pharmaceutical intermediates and the like.
  • Example 1 Preparation of Arginine Hydroxylase, Arginase and Ornithine Cyclodeaminase 1
  • Materials and Methods 1.1 Microorganisms Streptomyces sp. NBRC 13098 and Bacillus cereus NBRC 15305 are independent administrative entities Product evaluation It was obtained from the Technology Infrastructure Organization (Kisarazu City, Chiba Prefecture).
  • Mesorhizobium loti (Mesorhizobium loti)
  • MAFF 303099 shares were obtained from National Institute of NIAS (Tsukuba, Ibaraki Prefecture). The chromosomal DNA of these cells was used as a template for gene amplification.
  • the Streptomyces sp. 2 (1% Bacto Malt Extract, 0.4% Bacto Yeast extract, 0.4% glucose) was inoculated into 5 mL, and cultured with shaking at 28 ° C. for 2 days under aerobic conditions. After culturing, the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 5000 ⁇ g, 10 minutes), and chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
  • Bacillus cereus is inoculated in 5 mL of Luria-Bertani (LB) medium (1% Bacto Tryptone, 0.5% Bacto Yeast extract, 1% NaCl), and 30 days at 30 ° C. under aerobic conditions. Cultured with shaking. After culturing, the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 5000 ⁇ g, 10 minutes), and chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
  • LB Luria-Bertani
  • the Mesozobium roti is inoculated into 5 mL of TY medium (0.5% Bacto Tryptone, 0.3% Bacto Yeast extract, 0.04% CaCl 2 ), and at a temperature of 25 ° C. for 3 days Cultured with shaking. After culturing, the cells were collected by centrifugation (4 ° C., 5000 ⁇ g, 10 minutes), and chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
  • RNA encoding arginine hydroxylase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using chromosomal DNA prepared from the Streptomyces sp.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a GC-RICH PCR system Roche Diagnostics Inc.
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 forward and reverse primer pairs consisting of the nucleotide sequences listed in SEQ ID NOs: 5 and 6 were used.
  • the PCR reaction conditions were 94 ° C for 3 minutes once, 94 ° C for 15 seconds, 50 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 60 seconds, 30 times, and 68 ° C for 7 minutes once. .
  • Arginase gene derived from Bacillus cereus DNA encoding arginase was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using chromosomal DNA prepared from the cells of Bacillus cereus as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • KOD-Plus- Toyobo Co., Ltd.
  • PCR reaction conditions were 94 ° C for 3 minutes once, 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 60 seconds, 30 times, and 68 ° C for 7 minutes once. .
  • Arginase gene derived from Mesozobium roti DNA encoding arginase was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the chromosomal DNA prepared from the cells of Mesozobium roti as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • KOD-Plus- Toyobo Co., Ltd.
  • pairs of forward and reverse primers consisting of the nucleotide sequences listed in SEQ ID NOs: 9 and 10 were used.
  • PCR reaction conditions were 94 ° C for 3 minutes once, 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 60 seconds, 30 times, and 68 ° C for 7 minutes once. .
  • Ornithine cyclodeaminase gene DNA encoding ornithine cyclodeaminase was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the chromosomal DNA prepared from the cell of Mesozobium roti as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • KOD-Plus- Toyobo Co., Ltd.
  • PCR reaction conditions were 94 ° C for 3 minutes once, 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 45 seconds and 68 ° C for 70 seconds, 30 times for 68 ° C for 7 minutes once. .
  • the ligation product was introduced into Escherichia coli JM109 strain (Nippon Gene Co., Ltd.) treated with calcium chloride by the heat shock method to construct an expression vector.
  • E. coli strain JM109 retaining the expression vector was LB-A agar medium (1% Bacto Trypton, 0.5% Bacto Yeast extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto Agar, 100 ⁇ g / mL ampicillin) at 37 ° C., 16 Incubated for hours.
  • the grown single colony was inoculated into 5 mL of LB-A liquid medium (1% Bacto Trypton, 0.5% Bacto Yeast extract, 1% NaCl, 100 ⁇ g / mL ampicillin), and cultured with shaking at 37 ° C.
  • the expression vector was extracted using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). In order to confirm that the desired DNA was inserted, the internal base sequence of the extracted expression vector was analyzed with a DNA sequencer (Applied Biosystems, Life Technologies Japan Ltd.).
  • the expression vectors were introduced into Escherichia coli Rosetta2 (DE3) treated with calcium chloride by the heat shock method.
  • the Escherichia coli was LB-AC agar medium (1% Bacto Trypton, 0.5% Bacto Yeast extract, 1% NaCl, 1.5% Bacto Agar, 100 ⁇ g / mL ampicillin, 34 ⁇ g / mL chloramphenicol) at 37 ° C. Incubated overnight.
  • the grown single colony was inoculated into 5 mL of LB-AC liquid medium (1% Bacto Trypton, 0.5% Bacto Yeast extract, 1% NaCl, 100 ⁇ g / mL ampicillin, 34 ⁇ g / mL chloramphenicol), 37 ° C., The culture was shaken at 200 rpm for 16 hours. Thereafter, 1 mL of the liquid medium was added to 100 mL of fresh LB-AC liquid medium, and cultured with shaking at 37 ° C. and 200 rpm. O. D.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the target enzymes (arginine hydroxylase, arginase and ornithine cyclodeaminase) having a histidine tag were purified from the cell-free extract according to a conventional method. Briefly, the first stage Ni 2+ affinity chromatography was performed using AKTA prime plus (GE Healthcare Japan, Inc.). After a His-trap HP 5 mL column (GE Healthcare Japan, Inc.) was equilibrated with solution A (20 mM KH 2 PO 4 , 20 mM imidazole, 500 mM NaCl, pH 7.4) for 20 minutes, the cell-free extract was Applied. Non-adsorbed protein was eluted by feeding solution A at 5 mL / min for 20 minutes.
  • the target enzyme was eluted by feeding solution B (20 mM KH 2 PO 4 , 500 mM imidazole, 500 mM NaCl, pH 7.4) at 5 mL / min for 10 minutes.
  • the second stage gel filtration chromatography was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare Japan, Inc.) according to the manufacturer's instructions.
  • the eluted target enzyme was applied to the column and then eluted with 20 mM phosphate buffer (pH 7).
  • the purified enzyme was stored at ⁇ 80 ° C. until used in the following experiments.
  • FIG. 1 shows a map of the expression vector.
  • a transformant having each of the expression vectors was prepared, and arginine hydroxylase, arginase and ornithine cyclodeaminase could be obtained (data not shown).
  • Example 2 Hydroxylation of L-arginine 1
  • Hydroxylation reaction solution 0.5 mg / mL arginine hydroxylase, 10 mM L-arginine, 20 mM 2-oxoglutarate, 2 mM L-ascorbic acid, 0.2 mM FeSO 4 , 20 mM Phosphate buffer (pH 7)
  • the hydroxylation reaction was carried out at 25 ° C. for 16 hours.
  • the arginine hydroxylase was not added.
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of the product after hydroxylation with arginine hydroxylase.
  • the vertical axis represents signal intensity (mV), and the horizontal axis represents retention time (minutes).
  • the peak of the signal intensity of (2S, 3S) -3-hydroxyarginine was a retention time of 3.20 minutes.
  • the signal intensity peak for L-arginine was 3.93 minutes retention time (control).
  • Arginine hydroxylase could use L-arginine as a substrate and convert the L-arginine to (2S, 3S) -3-hydroxyarginine.
  • the yield of the (2S, 3S) -3-hydroxyarginine was 100%.
  • FIG. 3 shows the results of LC / MS analysis of (2S, 3S) -3-hydroxyarginine.
  • the vertical axis represents relative intensity (relative abundance)
  • the horizontal axis represents mass-to-charge ratio (m / z).
  • the relative intensity peak was 443.17 (m / z
  • Example 3 Deamination Reaction of (2S, 3S) -3-Hydroxyarginine 1 Material and Method Deamination Reaction Solution (1.8 mg / mL Arginase (Bacillus cereus), 5 mM (2S, 3S) -3-Hydroxyarginine, 20 mM A phosphate buffer (pH 7)) was prepared, and the deamination reaction was performed at 30 ° C. for 16 hours. In the control reaction solution, the arginase was not added. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis and liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS) were performed as in Example 2.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • MS liquid chromatography mass spectrometry
  • FIG. 4 shows the results of HPLC analysis of the product after the deamination reaction with arginase.
  • the vertical axis represents signal intensity (mV), and the horizontal axis represents retention time (minutes).
  • the signal intensity peaks of (2S, 3S) -3-hydroxyornithine were retention times of 2.85 minutes, 3.49 minutes and 11.60 minutes.
  • FIG. 5 shows the results of LC / MS analysis of (2S, 3S) -3-hydroxyornithine.
  • the vertical axis represents relative intensity (relative abundance), and the horizontal axis represents mass-to-charge ratio (m / z).
  • the relative intensity peak was 401.07 (m / z), and the actually measured value was almost the same as the calculated value.
  • Arginase derived from Bacillus cereus Arginase derived from Mesozobium roti can also use (2S, 3S) -3-hydroxyarginine as a substrate, and (2S, 3S) -3-hydroxyarginine can be converted into (2S, 3S).
  • (2S, 3S) -3-hydroxyarginine can be converted into (2S, 3S).
  • Cyclization reaction of (2S, 3S) -3-hydroxyornithine 1 Materials and methods Cyclization reaction solution (0.5 mg / mL ornithine cyclodeaminase, 2.5 mM (2S, 3S) -3-hydroxyornithine, 20 mM phosphate buffer Solution (pH 7)) was prepared, and the deamination reaction was carried out at 30 ° C. for 16 hours. In the control reaction solution, the ornithine cyclodeaminase was not added. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis and liquid chromatography mass spectrometry (LC / MS) were performed as in Example 2.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • MS liquid chromatography mass spectrometry
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the product after the cyclization reaction with ornithine cyclodeaminase.
  • the vertical axis represents signal intensity (mV), and the horizontal axis represents retention time (minutes).
  • the peak of the signal intensity of (2S, 3S) -3-hydroxyproline was a retention time of 5.10 minutes.
  • the signal intensity peaks for (2S, 3S) -3-hydroxyornithine were retention times 2.85 minutes, 3.51 minutes and 11.58 minutes (control). These peaks with different retention times indicate derivatives in which FDAA is introduced only at the ⁇ -position, only the ⁇ -position, or both the ⁇ -position and the ⁇ -position, respectively.
  • Ornithine cyclodeaminase can use (2S, 3S) -3-hydroxyornithine as a substrate and convert (2S, 3S) -3-hydroxyornithine into (2S, 3S) -3-hydroxyproline, ie trans-3-hydroxy-L. -Converted to proline.
  • the yield of the trans-3-hydroxy-L-proline was 2.8%.
  • FIG. 7 shows the results of LC / MS analysis of trans-3-hydroxy-L-proline.
  • the vertical axis represents relative intensity (relative abundance), and the horizontal axis represents mass-to-charge ratio (m / z).
  • the peak of relative intensity was 384.09 (m / z), and the actually measured value was almost the same as the calculated value.
  • dpkA Gene cloning Amplifies the full length of the dpkA gene based on the gene sequence (hereinafter referred to as dpkA, SEQ ID NO: 20) encoding DpkA (GenBank Accession No. BAD89743, SEQ ID NO: 17) derived from Pseudomonas putida Primers (SEQ ID NO: 23) and dpkA_R (SEQ ID NO: 24) were designed and synthesized. Using a chromosomal DNA of Pseudomonas putida as a template, a PCR reaction was performed according to a conventional method to obtain a DNA fragment of about 1.0 kbp.
  • aip Mackerel (Scomber japonicus) derived from L- amino acid oxidase (GenBank Accession No. CAC00499) protein AIP (SEQ ID NO: 18) gene sequences encoding obtained by adding methionine to the sequence without the signal peptide (SEQ ID NO: 21. Hereinafter, " aip ”) was designed and synthesized. Furthermore, primers aip_F (SEQ ID NO: 25) and aip_R (SEQ ID NO: 26) for amplifying the full length of the aip gene were designed and synthesized. A PCR reaction was performed according to a conventional method to obtain a DNA fragment of about 1.5 kbp.
  • a gene sequence (hereinafter referred to as gdh, SEQ ID NO: 22) encoding a protein (SEQ ID NO: 19) in which glutamic acid at the 96th amino acid residue is substituted with alanine in GDH (GenBank Accession No. NP_388275) derived from Bacillus subtilis
  • primers gdh_F (SEQ ID NO: 27) and gdh_R (SEQ ID NO: 28) for amplifying the full length of the gdh gene were designed and synthesized.
  • a PCR reaction was performed according to a conventional method to obtain a DNA fragment of about 0.8 kbp.
  • pKW32aip was digested with Spe I and Nde I, and a DNA fragment of about 2.4 kbp containing aip was digested, and pKW32dpkA was digested with Xba I and Nde I to obtain an about 4.2 kbp dpkA open plasmid. It was introduced downstream to obtain pKW32 (dpkA, aip).
  • pKW32gdh was digested with Spe I and Nde I, and a DNA fragment of about 1.7 kbp containing gdh was digested, and pKW32 (dpkA, aip) was digested with Xba I and Nde I to obtain an open-ring plasmid of about 5. It was introduced downstream of a 7 kbp aip to obtain pKW32 (dpkA, aip, gdh).
  • E. coli Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by Novagen) was transformed according to a conventional method, Recombinant E. coli BL21 (DE3) / pET24 (dpkA, aip, gdh) was obtained.
  • the method for producing trans-3-hydroxy-L-proline and the method for producing (2S, 3S) -3-hydroxyornithine of the present invention has a small number of reaction steps, selective asymmetric synthesis, and a production process. Is clear.
  • the method for producing trans-3-hydroxy-L-proline of the present invention has an advantage that trans-3-hydroxy-L-proline can be produced from L-arginine which can be obtained at low cost. Therefore, the manufacturing method of the present invention has very high industrial applicability.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法
　本発明は、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法と、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法と、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを得るためのアルギナーゼと、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンを得るためのオルニチンシクロデアミナーゼとに関する。
　ヒドロキシ－Ｌ－プロリンは、ヒドロキシル基がＬ－プロリンに導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種である。ヒドロキシル基がＬ－プロリンに導入される部位（３位又は４位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより４種類の異性体が存在する。これらの異性体（シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、トランス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、シス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、及び、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン）はキラルビルディングブロックとして有用な化合物である。例えば、シス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンは、カルバペネム系抗生物質、消炎剤として利用されているＮ－アセチル－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン等の医薬品の合成中間原料として有用な化合物である。また、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンは、アリステロマイシン等の合成原料として利用されており、Ｌ－プロリンの異性体の中でも特に有用な化合物である。
　また、ヒドロキシ‐Ｌ－プロリンは、微生物、例えば大腸菌ではＬ－グルタミン酸からＰｒｏＢ、ＰｒｏＡ及びＰｒｏＣによる３段階反応で生合成されることが一般的である。自然界では一般的にトランス－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンとして存在しており、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン等の他の異性体の存在は極めて限定されている。
　トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法としては、グルコノラクトンから合成する方法（非特許文献１）、及び、ベータ－アラニンから合成する方法（非特許文献２）が報告されている。
　真菌を使用してトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンを生合成する方法（非特許文献３）も報告されている。
　また、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシ－Ｌ－オルニチンは、ヒドロキシル基がＬ－オルニチンに導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種で、キラルビルディングブロックとして有用な化合物であり、例えば、βラクタム化合物等の医薬品の合成中間原料として有用な化合物である。
　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法としては、３－アミノプロパノールを原料としたシャープレス不斉ジヒドロキシ化法による合成方法（非特許文献４）が報告されている。
Ｌｅｅ　Ｊ．　Ｈ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５７：１００７１（２００１） Ｓｉｎｈａ　Ｓ．ら、ＡＲＫＩＶＯＣ、１１：２０９（２００５） Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　Ｌ．ら、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６２：２６３（２００３） Ｐａｎｄｅｙ　Ｓ．Ｋ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、４７：４１６７（２００６）
　しかしながら、非特許文献１および非特許文献２に記載のトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法は、反応工程数が多く、効率が悪く、不斉合成が非選択的であるという問題点がある。
　また、非特許文献３に記載のトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法は、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの生合成過程が不明であり、時間及び労力も要するため、実用的ではない。また、真菌の細胞（若しくは菌体）から抽出したプロリン　トランス－３－水酸化酵素を利用する方法も、該酵素の活性が極めて弱いため、実用的ではなく、さらに、前記酵素のアミノ酸配列や塩基配列は不明であるため、遺伝子組換え技術（酵素法）を利用した大量生産を行うための効率的な製造システムを構築することができない。
　また、非特許文献４に記載の（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシ－Ｌ－オルニチンの製造方法は、反応工程数が多く、過酷な酸化反応や高価な不斉触媒を必要とするなどの問題点がある。
　そこで、本発明は、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、または（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシ－Ｌ－オルニチンを経済的かつ効率的に製造することが可能な製造方法を提供することをその目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、または（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシ－Ｌ－オルニチンの新規合成ルートを見出し、本発明を完成させた。
　なお、アルギナーゼ（ＥＣ　３．５．３．１）が（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに変換できること、及び、オルニチンシクロデアミナーゼ（ＥＣ　４．３．１．１２）が前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリン（すなわちトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン）に変換できることはこれまで知られていなかった。
　本発明の要旨は、以下の［１］～［４］に存する。
［１］　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギナーゼ作用工程、
　次いで、
　前記アルギナーゼ作用工程により得られる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるオルニチンシクロデアミナーゼ作用工程を有する
　ことを特徴とするトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法。
［２］　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギナーゼ作用工程を有する
　ことを特徴とする（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法。
［３］　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるオルニチンシクロデアミナーゼ作用工程を有する
　ことを特徴とするトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法。
［４］　Ｌ－アルギニンに、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギニン水酸化酵素作用工程により、前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを得る
　ことを特徴とする［１］または［２］に記載の製造方法。
　本発明によれば、反応工程数が少なく、不斉合成が選択的である（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法を提供することができる。
　また、本発明によれば、反応工程数が少なく、不斉合成が選択的であるトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法を提供することができる。
発現ベクターのマップ。 アルギニン水酸化酵素による水酸化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフ。 （２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフ。 アルギナーゼによる脱アミノ化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフ。 （２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフ。 オルニチンシクロデアミナーゼによる環化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフ。 トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフ。
　本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
　本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ－又はＤ－）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物をいう。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ－アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ－アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
　染色体ＤＮＡの調製、目的遺伝子の増幅、電気泳動、染色等は定法に従って行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照せよ。
　本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、問合せ（クエリー）のヌクレオチド配列と、比較対象（サブジェクト）のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を問合せ（クエリー）のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、問合せ（クエリー）のアミノ酸配列と、比較対象（サブジェクト）のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、アミノ酸配列が一致する部分のアミノ酸残基の数の合計を問合せ（クエリー）のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。前記ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
　本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎに説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことをいう。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×　ＳＳＣ及び０．２％　ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。所望のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと、前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×　ＳＳＣ及び０．２％　ＳＤＳからなる溶液中で６５℃、終夜行う。その後前記固相を１×　ＳＳＣ及び０．１％　ＳＤＳからなる溶液中で６５℃、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×　ＳＳＣ及び０．１％　ＳＤＳからなる溶液中で６５℃、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、所望のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることをいう。
　なお、本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　本発明の製造方法の反応系の概念図を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の概念図に記載の通り、本発明の製造方法では、アルギニン水酸化酵素、アルギナーゼ、及び／またはオルニチンシクロデアミナーゼ（以下、これらの酵素を「所望の機能を有するタンパク質」と称することがある。）を用いることを特徴としている。本発明の製造方法について、以下、順に説明する。
［所望の機能を有するタンパク質］
　本明細書において「所望の機能（活性）を有するタンパク質」とは、アルギニン水酸化酵素活性、アルギナーゼ活性、及び／又は、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質である。前記所望の機能を有するタンパク質は、配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列からなるタンパク質を含むが、これらに限定されない。以下、順に説明する。
　本明細書において「アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質」とは、Ｌ－アルギニン又はその誘導体の水酸化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質、即ち、「アルギニン水酸化酵素」（ＥＣ１．１４．１１．－）のことをいう。
　本発明のアルギニン水酸化酵素は、Ｌ－アルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに変換する活性を有することを条件として、いかなる生物種に由来するアルギニン水酸化酵素であってもかまわない。本発明のアルギニン水酸化酵素は、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）、ストレプトマイセス・ヴィナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ）等のストレプトマイセス属に由来する酵素を用いることができる。中でも、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＮＢＲＣ　１３０９８株由来の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するアルギニン水酸化酵素であることが好ましい。。
　前記アルギニン水酸化酵素は、
　（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
　（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
　（３）配列番号１のアミノ酸配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
　（４）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
　（５）配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質と、
　（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質
　とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質であることが好ましい。
　ここで、本明細書において「融合タンパク質」とは、特異的結合タグペプチドと、所望の機能を有するタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端とが連結した融合タンパク質をいう。前記特異的結合タグペプチドは、前記所望の機能を有するタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。特異的結合タグは、融合タンパク質が、アルギニン水酸化酵素活性、アルギナーゼ活性、及び／又は、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
　本明細書において「アルギナーゼ活性を有するタンパク質」とは、Ｌ－アルギニン又はその誘導体をＬ－オルニチン又はその誘導体と尿素とに加水分解する反応を触媒する酵素、即ち、「アルギナーゼ」（ＥＣ３．５．３．１）のことをいう。
　本発明のアルギナーゼは、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに変換する活性を有することを条件として、いかなる生物種の由来の酵素であってもかまわない。本発明のアルギナーゼは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・ブレビ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・カルドヴェロックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ）、メソリゾビウム・オーストラリカム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ａｕｓｔｒａｌｉｃｕｍ）、メソリゾビウム・オポーチュニスタム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ）、メソリゾビウム・メタリデュランス（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）等のメソリゾビウム属等に由来する酵素を用いることができる。中でも、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）ＮＢＲＣ　１５３０５株由来の配列番号２に記載のアルギナーゼ、及び、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ　３０３０９９株由来の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するアルギナーゼであることが好ましい。
　前記アルギナーゼは、
　（１）配列番号２又は３のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
　（２）配列番号２又は３に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルギナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（３）配列番号２又は３のアミノ酸配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、アルギナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（４）配列番号２又は３のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、アルギナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（５）配列番号２又は３のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、アルギナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質
　とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質であることが好ましい。
　本明細書において「オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質」とは、Ｌ－オルニチン又はその誘導体をＬ－プロリン又はその誘導体に変換するアンモニアの付加脱離反応を触媒する酵素、即ち、「オルニチンシクロデアミナーゼ」（ＥＣ４．３．１．１２）のことをいう。
　本発明のオルニチンシクロデアミナーゼは、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリン（すなわちトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン）に変換する活性を有することを条件として、いかなる生物種の由来の酵素であってもかまわない。本発明のオルニチンシクロデアミナーゼは、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ等のメソリゾビウム属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等のアグロバクテリウム属、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）等のバークホルデリア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム属等に由来する酵素を用いることができる。中でも、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ　３０３０９９株由来の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するオルニチンシクロデアミナーゼであることが好ましい。
　前記オルニチンシクロデアミナーゼは、
　（１）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
　（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルギナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（３）配列番号４のアミノ酸配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（４）配列番号４のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列と、通常８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（５）配列番号４のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列によってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質と、
　（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質
とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質であることが好ましい。
　上述の所望の機能を有するタンパク質は、例えば、後述する方法により、製造することができる。
［所望の機能を有するタンパク質の製造方法］
　上述の所望の機能を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを発現させることにより製造することができる。前記ＤＮＡを発現させる方法に特に制限はなく、生物の個体全体を用いても、細胞や組織のような生物の一部を用いてもよいが、後述する宿主生物を使用する発現系を用いる方法が好ましい。また、必要に応じて、宿主細胞を使用する発現系や無生物発現系も用いることができる。
　本発明で用いることができる宿主生物としては、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。具体的には、エシェリヒア（Escherichia）属細菌（例えば、大腸菌）が挙げられ、また、放線菌（Actinomycetes）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌等も、後述するベクターを導入する宿主として用いることができる。
　より具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等が挙げられる。中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。
　本発明で用いることのできる「ベクター」としては、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは、前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは、前記ベクターはｐＥＴ－２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。
　上記の他、具体的なプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えばタカラバイオ社から購入できる）、ｐＥＴ発現ベクターシリーズ（Novagen社製）等を挙げることができる。大腸菌－コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、特開平３－２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２－２７６５７５号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１－１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３；特開昭５８－６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８－７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８－１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７－１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８－３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７－１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ１１；特開２００５－３４０２５号公報に記載のｐＫＶ３２；国際公開番号ＷＯ２０１２／０２９８１９号公報に記載のｐＫＷ３２等、あるいはこれらの誘導体等を挙げることができる。また、ファージベクターとしては、（λＦｉｘIIベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入できる）等を挙げることができる。
　本発明で用いることのできる「発現ベクター」とは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、いずれかのベクターとを連結することによって作製される、前記タンパク質を発現可能なベクターである。
　発現ベクターには、必要に応じて、プロモーター配列を導入することが好ましい。所望の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターは、宿主生物が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、それに限られるものではなく、前記タンパク質のＤＮＡの転写を開始させるための原核生物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（ｔａｃ）プロモーター［H. A. Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げられる。これらのプロモーターのうち、発現効率を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンのプロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより遺伝子発現を誘導することができる。
　本発明における「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった生物であり、具体的には、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、及び／又は、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質を生産する能力を有する生物のことである。形質転換体の作製において、前記発現ベクターが導入される生物または細胞のことを、宿主生物という。
　なお、複数の所望の機能を有するタンパク質を、同一の形質転換体で共発現させてもよいし、別々の形質転換体で発現させてもよい。また、所望の機能を有するタンパク質として、形質転換体がもともと保持する内在性のタンパク質を利用してもよい。
　前記形質転換体は、前記発現ベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。発現ベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法、コンピテントセル法［Journal of Molecular Biology, Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法［J. Indust.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)］等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。
　上記のような発現ベクターを用いた発現方法の他に、プロモーターを連結した前記タンパク質をコードするＤＮＡを、宿主生物の染色体中に直接導入する相同組換え技術あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術によっても発現させることができる。従って、本発明の形質転換体は、前記タンパク質が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は特に限定されない。
　上記のようにして作製された形質転換体を培養し、該形質転換体に所望の機能を有するタンパク質を産生させることにより、所望の機能を有するタンパク質を製造することができる。
　形質転換体の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
　培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温度であれば特に制限はないが、通常１８～４０℃である。また、培養途中のｐＨについても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はないが、通常６～８である。培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加して行うことができる。
　形質転換体の培養において、所望の機能を有するタンパク質の発現が強制されるとき、形質転換体が増殖する間は、所望の機能を有するタンパク質の発現は抑制され、形質転換体が十分に増殖した後、発現が人工的に誘導されることが好ましい。かかる発現の誘導及び抑制は、例えば、大腸菌ラクトースオペロンの発現制御システムとイソプロピルチオ－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とを用いることができるが、これらに限定されない。当業者に周知ないずれかの発現制御システム及び誘導物質を用いることができる。
　培養液からの所望の機能を有するタンパク質の採取は、酵素の活性を指標として公知の採取方法により行うことができる。酵素は必ずしも均一にまで精製される必要はなく、用途に応じた精製度まで精製すればよい。
　本発明で用いられる所望の機能を有するタンパク質は、粗精製画分又は精製酵素であってもよい。粗精製画分又は精製酵素としては、形質転換体を培養した培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体を超音波、圧擦等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる、前記タンパク質を含有する抽出物や、該抽出物に更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる前記タンパク質の粗酵素標品又は精製した酵素標品等が挙げられる。また、所望の機能を有するタンパク質を精製する際は、上述の融合タンパク質を用いることもできる。
　また、上述の菌体、破砕物、抽出物、粗精製画分又は精製酵素等を担体に固定化してから、本発明の製造方法に用いることもできる。これら菌体、菌体破砕物、抽出物又は精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、又はカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。例えば、菌体を担体に固定化する場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２Ｍ～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６～１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。
　なお、作製された形質転換体そのものを、所望の機能を有するタンパク質を生産する能力を有する宿主生物として、本発明の製造方法に用いることもできる。即ち、遺伝子組換え技術を利用して形質転換体が生きている状態で、所望の機能を有するタンパク質を体外に放出させてもよいし、体内に蓄積させてもよい。
［本発明の製造方法］
　本発明の（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギナーゼ作用工程を有する。
　また、本発明の製造方法では、前記アルギナーゼ作用工程の後に、前記アルギナーゼ作用工程により得られる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるオルニチンシクロデアミナーゼ作用工程を設け、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンを製造することもできる。
　ここで、前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法においても、前記トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法においても、前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンは、Ｌ－アルギニンに、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギニン水酸化酵素作用工程により得られることが好ましい。
　本発明の製造方法では、基質となる化合物（具体的には、Ｌ－アルギニン、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニン、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン）に所望の機能を有するタンパク質を作用させてもよいし、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させてもよい。
　まず、基質となる化合物に前記タンパク質を作用させて製造する場合について、以下に説明する。
　本発明の製造方法（前記アルギニン水酸化酵素作用工程）に用いるアルギニン水酸化酵素の活性は、該アルギニン水酸化酵素、Ｌ－アルギニン、２－オキソグルタル酸、Ｌ－アスコルビン酸、及び、２価鉄イオンを含む反応液中で、前記酵素を前記Ｌ－アルギニンに対して作用させることにより生成される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを定量することにより評価することができる。Ｌ－アルギニンの水酸化反応はｐＨ調整のための緩衝成分を含む反応液を用いて実施することができる。前記緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸等を用いることができ、中でもＨＥＰＥＳが好ましい。ｐＨは６．５～７．５の範囲に調整することが好ましい。前記反応液は、前記水酸化反応で電子供与体として関与する２－オキソグルタル酸をさらに含んでいてもよい。前記反応液は、２価鉄イオン、Ｌ－アスコルビン酸等をさらに含んでいてもよい。また、通常５℃以上４５℃以下で、通常１時間以上７２時間以下で反応を行なう。
　本発明の製造方法（前記アルギナーゼ作用工程）に用いるアルギナーゼの活性は、該アルギナーゼ、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを含む反応液中で、前記酵素を前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに対して作用させることにより生成される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを定量することにより評価することができる。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの脱アミノ化反応はｐＨ調整のための緩衝成分を含む反応液を用いて実施することができる。前記緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸等を用いることができ、中でもＨＥＰＥＳが好ましい。ｐＨは６．５～７．５の範囲に調整することが好ましい。また、通常５℃以上４５℃以下で、通常１時間以上７２時間以下で反応を行なう。
　本発明の製造方法（前記オルニチンシクロデアミナーゼ作用工程）に用いるオルニチンシクロデアミナーゼの活性は、該オルニチンシクロデアミナーゼ、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを含む反応液中で、前記酵素を前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに対して作用させることにより生成される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンを定量することにより評価することができる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応はｐＨ調整のための緩衝成分を含む反応液を用いて実施することが好ましい。前記緩衝成分としては、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸等を用いることができ、中でも、ＨＥＰＥＳが好ましい。ｐＨは６．５～７．５の範囲に調整することが好ましい。また、通常５℃以上４５℃以下で、通常１時間以上７２時間以下で反応を行なう。
　前記アルギニン水酸化酵素作用工程、アルギナーゼ作用工程、オルニチンシクロデアミナーゼ作用工程は、連続して行なっても、得られる化合物を回収し、必要に応じて精製してから次の工程の基質として用いてもよい。
　本発明の製造方法のＬ－アルギニンの水酸化反応、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの脱アミノ化反応、及び、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応では、反応液濃度、反応液量、反応時間、反応温度、反応ｐＨ、及び／又は、その他の反応条件が、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニン、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン、及び／又は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンの目標とする製造量及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。前記水酸化反応、前記脱アミノ化反応、及び／又は、前記環化反応は、実施例と同等か、若しくはそれ以上の反応効率を奏することを条件として、スケールアップすることができる。
　また、基質となる化合物を、所望の機能を有するタンパク質を生産する能力を有する宿主生物に作用させて製造する場合は、発酵法や休止菌体反応系により製造することができる。
　所望の機能を有するタンパク質を生産する能力を有する宿主生物の培養は、例えば、上述の［所望の機能を有するタンパク質の製造方法］に記載の条件で行なうことができる。
　また、基質となる化合物を、所望の機能を有するタンパク質を生産する能力を有する宿主生物の処理物に作用させてもよい。宿主生物の処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）等が挙げられる。また、これらの微生物の処理物を、常法により担体に固定化した固定化物も処理物に含まれる。
　また、基質となる化合物を、所望の機能を有するタンパク質を生産する能力を有する宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液に作用させてもよい。
　本発明の製造方法で製造される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニン、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン、及び／又は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンは、遠心分離、イオン交換樹脂その他の担体への特異的吸着、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収することができる。また、本発明の製造方法で製造される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニン、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン、及び／又は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンの生成量、純度等は、当業者に周知の方法により定量することができる。前記定量には、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等のような市販の分析機器が用いられる。前記分析機器は、製造者の指示書に従って使用される。前記定量の感度を増強するために、発色団、蛍光色素その他の増感剤との誘導体が作製され、定量が実施される場合がある。質量分析では、当業者に周知な方法で算出された計算値と、前記分析機器で決定された実測値とが比較される場合がある。
　このような本発明の製造方法によれば、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造もトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造も反応工程数を少なくすることができ、不斉合成も選択的に行なうことができる。さらに、本発明の製造方法においては、従来の製造方法において必要であった金属触媒を使用しないため、作業上の安全性を向上させることができ、また、得られる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンやトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンを、金属の残留が問題となり得る医薬中間体等の用途に用いる場合に特に好適である。
［製造される化合物の用途］
　本発明の製造方法により製造される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンは、医薬中間体等の用途に好適に用いることができる。
　本発明の製造方法により製造される（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンは、医薬中間体等の用途に好適に用いることができる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
[実施例１]
　アルギニン水酸化酵素、アルギナーゼ及びオルニチンシクロデアミナーゼの調製
　１　材料及び方法
　1.1  微生物
　ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＮＢＲＣ　１３０９８株と、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）ＮＢＲＣ　１５３０５株とは独立行政法人　製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市）から入手された。メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ　３０３０９９株は独立行政法人　農業生物資源研究所（茨城県つくば市）から入手された。これらの菌体の染色体ＤＮＡが遺伝子増幅の鋳型として用いられた。
　1.2  培養
　ストレプトマイセス・エスピーの培養
　前記ストレプトマイセス・エスピーはＩＳＰ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｎｏ．２（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．４％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．４％　グルコース）５ｍＬに接種され、２８℃、好気条件下で２日間振盪培養された。培養後、菌体が遠心分離（４℃、５０００×ｇ、１０分間）によって回収され、染色体ＤＮＡが定法に従って調製された。
　バチルス・セレウスの培養
　前記バチルス・セレウスはＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ）５ｍＬに接種され、３０℃、好気条件下で１日間振盪培養された。培養後、菌体が遠心分離（４℃、５０００×ｇ、１０分間）によって回収され、染色体ＤＮＡが定法に従って調製された。
　メソリゾビウム・ロティの培養
　前記メソリゾビウム・ロティはＴＹ培地（０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．３％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．０４％　ＣａＣｌ2）５ｍＬに接種され、２５℃、好気条件下で３日間振盪培養された。培養後、菌体が遠心分離（４℃、５０００×ｇ、１０分間）によって回収され、染色体ＤＮＡが定法に従って調製された。
　1.3  目的遺伝子の増幅
　アルギニン水酸化酵素遺伝子
　アルギニン水酸化酵素をエンコードするＤＮＡが、前記ストレプトマイセス・エスピーの菌体から調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。前記ＰＣＲでは、ＧＣ－ＲＩＣＨ　ＰＣＲ　システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）が製造者の指示書に従って用いられた。アルギニン水酸化酵素遺伝子を増幅するために、配列番号５及び６に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃、３分間を１回と、９４℃、１５秒間、５０℃、３０秒間及び６８℃、６０秒間を３０回と、６８℃、７分間を１回とであった。
　バチルス・セレウス由来のアルギナーゼ遺伝子
　アルギナーゼをエンコードするＤＮＡが、前記バチルス・セレウスの菌体から調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。前記ＰＣＲでは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績株式会社）が製造者の指示書に従って用いられた。アルギナーゼ遺伝子を増幅するために、配列番号７及び８に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃、３分間を１回と、９４℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び６８℃、６０秒間を３０回と、６８℃、７分間を１回とであった。
　メソリゾビウム・ロティ由来のアルギナーゼ遺伝子
　アルギナーゼをエンコードするＤＮＡが、前記メソリゾビウム・ロティの菌体から調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。前記ＰＣＲでは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績株式会社）が製造者の指示書に従って用いられた。アルギナーゼ遺伝子を増幅するために、配列番号９及び１０に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃、３分間を１回と、９４℃、３０秒間、６０℃、３０秒間及び６８℃、６０秒間を３０回と、６８℃、７分間を１回とであった。
　オルニチンシクロデアミナーゼ遺伝子
　オルニチンシクロデアミナーゼをエンコードするＤＮＡが、前記メソリゾビウム・ロティの菌体から調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された。前記ＰＣＲでは、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績株式会社）が製造者の指示書に従って用いられた。アルギナーゼ遺伝子を増幅するために、配列番号１１及び１２に列挙されるヌクレオチド配列からなる順方向及び逆方向プライマーの対が用いられた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃、３分間を１回と、９４℃、３０秒間、６０℃、４５秒間及び６８℃、７０秒間を３０回と、６８℃、７分間を１回とであった。
　前記ＰＣＲ後、反応液の一部が採取され、アガロースゲル電気泳動に供された。アガロースゲルはエチジウムブロマイドによって染色され、前記目的遺伝子の増幅が紫外線照射条件下で可視化することによって確認された。
　1.4  発現ベクターの取得
　前記ＰＣＲにより増幅した目的遺伝子のＤＮＡがインサート用ＤＮＡとして用いられた。それぞれのインサート用ＤＮＡ０．５μｇと、ｐＥＴ－２１ａ（＋）プラスミド（ノバジェン）０．５μｇとが、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを含む酵素反応液と３７℃、１時間反応され、切断された。切断産物が、ＧＦＸ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）で精製された。精製産物は、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社）を用いて１６℃、１時間反応され、連結された。連結産物は、塩化カルシウム処理した大腸菌ＪＭ１０９株（株式会社　ニッポンジーン）にヒートショック法によって導入され、発現ベクターが構築された。発現ベクターを保持した大腸菌ＪＭ１０９株は、ＬＢ－Ａ寒天培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ、１．５％　Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ、１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン）で３７℃、１６時間培養された。生育したシングルコロニーが、ＬＢ－Ａ液体培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン）５ｍＬに接種され、３７℃、１６時間振盪培養された。発現ベクターは、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いて抽出された。所望のＤＮＡが挿入されていることを確認するために、抽出した発現ベクターの内部塩基配列がＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で解析された。
　1.5  目的遺伝子の発現
　アルギニン水酸化酵素をエンコードするＤＮＡの挿入が確認された発現ベクターと、アルギナーゼをエンコードするＤＮＡの挿入が確認された発現ベクターと、オルニチンシクロデアミナーゼをエンコードするＤＮＡの挿入が確認された発現ベクターとは、それぞれ、塩化カルシウム処理した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）にヒートショック法によって導入された。前記大腸菌は、ＬＢ－ＡＣ寒天培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ、１．５％　Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ、１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン、３４μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール）で３７℃で一晩培養された。生育したシングルコロニーが、ＬＢ－ＡＣ液体培地（１％　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％　Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ　アンピシリン、３４μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール）５ｍＬに接種され、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養された。その後、前記液体培地１ｍＬが１００ｍＬの新鮮なＬＢ－ＡＣ液体培地に添加され、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養された。Ｏ．Ｄ．660＝０．５に達した時点で、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が終濃度０．１ｍＭで添加され、遺伝子発現が、２５℃、１００ｒｐｍの培養条件下で６時間誘導された。培養菌体が、遠心分離（４℃、５０００×ｇ、１０分間）によって回収され、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁された。前記懸濁液は超音波破砕処理（３分間）され、上清（無細胞抽出液）が遠心分離（４℃、２００００×ｇ、３０分間）後に回収された。
　1.6  酵素の精製
　ヒスチジンタグを有する目的の酵素（アルギニン水酸化酵素、アルギナーゼ及びオルニチンシクロデアミナーゼ）が、前記無細胞抽出液から定法に従って精製された。簡潔には、１段階目のＮｉ2+アフィニティークロマトグラフィーはＡＫＴＡ　ｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて実施された。Ｈｉｓ－ｔｒａｐ　ＨＰ　５ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が、Ａ液（２０ｍＭ　ＫＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ　イミダゾール、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２０分間平衡化された後、無細胞抽出液が適用された。非吸着タンパク質が、Ａ液を５ｍＬ／分、２０分間送液することによって溶出された。前記目的の酵素は、Ｂ液（２０ｍＭ　ＫＨ2ＰＯ4、５００ｍＭ　イミダゾール、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５ｍＬ／分、１０分間送液することによって溶出された。２段階目のゲルろ過クロマトグラフィーはＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて、製造者に指示書に従って脱塩された。溶出された前記目的の酵素は前記カラムに適用された後、２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶出された。精製酵素は、以下の実験で使用されるまで、－８０℃で保存された。
　２　結果
　上述の手順により、アルギニン水酸化酵素遺伝子、アルギナーゼ遺伝子及びオルニチンシクロデアミナーゼ遺伝子それぞれを含む発現ベクター４種類を作製することができた。図１は、前記発現ベクターのマップを示す。また、前記発現ベクターそれぞれを有する形質転換体を作製し、アルギニン水酸化酵素、アルギナーゼ及びオルニチンシクロデアミナーゼを取得することができた（データは示されない。）。
[実施例２]
　Ｌ－アルギニンの水酸化反応
　１　材料及び方法
　水酸化反応液（０．５ｍｇ／ｍＬ　アルギニン水酸化酵素、１０ｍＭ　Ｌ－アルギニン、２０ｍＭ　２－オキソグルタル酸、２ｍＭ　Ｌ－アスコルビン酸、０．２ｍＭ　ＦｅＳＯ4、２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７））が調製され、水酸化反応が２５℃で１６時間行われた。対照反応液では、前記アルギニン水酸化酵素が添加されなかった。
　前記反応液１００μＬと、５００ｍＭ　ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）５０μＬと、１０ｍＭ　１－ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－５－Ｌ－ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）１００μＬとが混合され、４０℃で１時間加熱された。その後、１Ｍ　ＨＣｌ　５０μＬと、メタノール０．７ｍＬとが添加され、混合液は激しく撹拌された。前記混合液は、０．４５μｍフィルターを用いてろ過され、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）に供された。前記ＨＰＬＣ分析の各種条件は表２（ａ）及び（ｂ）に示す。ピーク物質は保持時間に基づいて同定された。前記ＬＣ／ＭＳ分析の各種条件は表３（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　２　結果
　図２は、アルギニン水酸化酵素による水酸化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。縦軸は信号強度（ｍＶ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの信号強度のピークは保持時間３．２０分であった。Ｌ－アルギニンの信号強度のピークは保持時間３．９３分であった（対照）。アルギニン水酸化酵素は、Ｌ－アルギニンを基質にでき、該Ｌ－アルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに変換できた。前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの収率は１００％であった。図３は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示す。縦軸は相対強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示し、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）を示す。相対強度のピークは４４３．１７（ｍ／ｚ）であり、実測値は計算値とほぼ同一であった。
[実施例３]
　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの脱アミノ化反応
　１　材料及び方法
　脱アミノ化反応液（１．８ｍｇ／ｍＬ　アルギナーゼ（バチルス・セレウス）、５ｍＭ　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニン、２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７））が調製され、脱アミノ化反応が３０℃で１６時間行われた。対照反応液では、前記アルギナーゼが添加されなかった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、実施例２と同様に実施された。
　２　結果
　図４は、アルギナーゼによる脱アミノ化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。縦軸は信号強度（ｍＶ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの信号強度のピークは保持時間２．８５分、３．４９分及び１１．６０分であった。ＦＤＡＡ分子が（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンのα位及び／又はδ位に導入される数の違いにより３種類の誘導体が存在する。これらの保持時間の異なるピークは、それぞれ、ＦＤＡＡが、α位のみか、δ位のみか、α位及びδ位両方かに導入された誘導体を示す。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの信号強度のピークは保持時間３．２０分であった（対照）。アルギナーゼは、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを基質にでき、該（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに変換できた。前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの収率は１００％であった。図５は、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示す。縦軸は相対強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示し、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）を示す。相対強度のピークは４０１．０７（ｍ／ｚ）であり、実測値は計算値とほぼ同一であった。なお、バチルス・セレウス由来のアルギナーゼと同様に、メソリゾビウム・ロティ由来のアルギナーゼも、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを基質にでき、該（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに変換できた（データは示されない。）。
[実施例４]

　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応
　１　材料及び方法
　環化反応液（０．５ｍｇ／ｍＬ　オルニチンシクロデアミナーゼ、２．５ｍＭ　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン、２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７））が調製され、脱アミノ化反応が３０℃で１６時間行われた。対照反応液では、前記オルニチンシクロデアミナーゼが添加されなかった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、実施例２と同様に実施された。
　２　結果
　図６は、オルニチンシクロデアミナーゼによる環化反応後の生成物のＨＰＬＣ分析の結果を示す。縦軸は信号強度（ｍＶ）を示し、横軸は保持時間（分）を示す。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンの信号強度のピークは保持時間５．１０分であった。（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの信号強度のピークは保持時間２．８５分、３．５１分及び１１．５８分であった（対照）。これらの保持時間の異なるピークは、それぞれ、ＦＤＡＡが、α位のみか、δ位のみか、α位及びδ位両方かに導入された誘導体を示す。オルニチンシクロデアミナーゼは（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを基質にでき、該（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリン、すなわちトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンに変換できた。また、前記トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの収率は２．８％であった。図７は、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンのＬＣ／ＭＳ分析の結果を示す。縦軸は相対強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を示し、横軸は質量電荷比（ｍ／ｚ）を示す。相対強度のピークは３８４．０９（ｍ／ｚ）であり、実測値は計算値とほぼ同一であった。
[参考例１]
［Ｎ－メチル－Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＤｐｋＡ）、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＡＩＰ）、グルコース－１－デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）を共発現した組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４ａ（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）の調製］
　特開２００５－９５１６７号公報に記載の方法を参考にして、ジアミノ酸を原料とした光学活性環状アミノ酸の合成に利用可能な組換え大腸菌の調製を以下の通り実施した。
（１）遺伝子のクローニング
　シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）由来ＤｐｋＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＡＤ８９７４３、配列番号１７）をコードする遺伝子配列（以下ｄｐｋＡ、配列番号２０）を元に、ｄｐｋＡ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマー（配列番号２３）とｄｐｋＡ＿Ｒ（配列番号２４）を設計、合成した。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
　マサバ（Ｓｃｏｍｂｅｒ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）由来のＬ－アミノ酸オキシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＡＣ００４９９）からシグナルペプチドを除いた配列にメチオニンを付加したタンパク質ＡＩＰ（配列番号１８）をコードする遺伝子配列（配列番号２１。以下、「ａｉｐ」と称する。）を設計、合成した。さらにａｉｐ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーａｉｐ＿Ｆ（配列番号２５）とａｉｐ＿Ｒ（配列番号２６）を設計、合成した。常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
　バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＧＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＰ＿３８８２７５）において９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したタンパク質（配列番号１９）をコードする遺伝子配列（以下ｇｄｈ、配列番号２２）を元に、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ（配列番号２７）とｇｄｈ＿Ｒ（配列番号２８）を設計、合成した。常法に従ってＰＣＲ反応を行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
（２）発現用プラスミドの調製
　上記（１）で得られたＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ、ＸｂａＩにより消化したＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６９６８０に記載のプラスミドｐＫＷ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、それぞれｐＫＷ３２ｄｐｋＡ，ｐＫＷ３２ａｉｐ，ｐＫＷ３２ｇｄｈを得た。
　続いて、ｐＫＷ３２ａｉｐをＳｐｅＩ、ＮｄｅＩにより消化してａｉｐを含む約２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２ｄｐｋＡをＸｂａＩ、ＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約４．２ｋｂｐのｄｐｋＡの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ，ａｉｐ）を得た。
　さらに、ｐＫＷ３２ｇｄｈをＳｐｅＩ、ＮｄｅＩにより消化してｇｄｈを含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ、ａｉｐ）をＸｂａＩ、ＮｄｅＩにより消化して得られた開環プラスミド約５．７ｋｂｐのａｉｐの下流に導入して、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ、ａｉｐ、ｇｄｈ）を得た。
　最後に、ｐＫＷ３２（ｄｐｋＡ、ａｉｐ、ｇｄｈ）を鋳型とし、ｄｐｋＡ、ａｉｐ、ｇｄｈを含む領域を増幅させるためのプライマーｄｐｋＡＮｄｅＩ＿Ｆ（配列番号２９）、およびｇｄｈＨｉｎｄ＿Ｒ（配列番号３０）を用いて常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＥＴ２４ａにＬｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてＴ７プロモーターの下流に導入することによってｐＥＴ２４（ｄｐｋＡ，ａｉｐ，ｇｄｈ）を得た。
（３）発現株の調製
　上記（２）で得られたプラスミドｐＥＴ２４（ｄｐｋＡ、ａｉｐ、ｇｄｈ）を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製））を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４（ｄｐｋＡ、ａｉｐ、ｇｄｈ）を得た。
[参考例２]
［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応例］
　１．４４ｍＭ（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン、０．２ｍＭ　ＮＡＤＰ＋、５０ｍＭグルコースを含む環化反応液が調製された。その反応液に［参考例１］で調製の組換え大腸菌湿菌体をＯＤ６００が約５０になるように菌体を投入し、３０℃１６時間で脱アミノ化、および環化反応を試みた。
　対照反応液では（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンは添加されず、代わりに１０ｍＭのＬ－オルニチンが添加された。
　高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析及び液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、実施例２と同様に実施された。その結果、対照反応液中では２ｍＭのＬ－プロリンが検出されたが、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチン添加反応液中からは、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンは検出されなかった。
　結論
　以上の結果から、アルギニン水酸化酵素によるＬ－アルギニンの水酸化反応（（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンの合成反応：第１段反応）と、アルギナーゼによる３－ヒドロキシアルギニンの脱アミノ化反応（（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの合成反応：第２段反応）と、オルニチンシクロデアミナーゼによる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応（（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシプロリンの合成反応：第３段反応）とによって、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンが製造できることが確認された。また、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの環化反応条件の改善、例えば、オルニチンシクロデアミナーゼの活性の増大、該活性の高い他の酵素への変更等によって、トランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンをより高収率に製造できることが示唆された。
　また、一般的に酵素の基質特異性は酵素によってその厳密性は異なることが知られている。上述の参考例では、Ｌ－オルニチンを基質とした場合は酵素活性が検出されたが、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンを基質とした場合は酵素活性が検出されなかった。基質におけるヒドロキシル基の有無で酵素活性が大きく変わり得ることがわかった。
　本発明のトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法、及び、（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法は、反応工程数が少なく、不斉合成が選択的であり、製造過程が明確である。また、本発明のトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法は、安価に入手可能なＬ－アルギニンからトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンを製造できる利点を有する。したがって、本発明の製造方法は産業上の利用性が非常に高い。

Claims (4)

  1. 　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギナーゼ作用工程、
    　次いで、
    　前記アルギナーゼ作用工程により得られる（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるオルニチンシクロデアミナーゼ作用工程を有する
    　ことを特徴とするトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法。
  2. 　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンに、アルギナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギナーゼ作用工程を有する
    　ことを特徴とする（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンの製造方法。
  3. 　（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシオルニチンに、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるオルニチンシクロデアミナーゼ作用工程を有する
    　ことを特徴とするトランス－３－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンの製造方法。
  4. 　Ｌ－アルギニンに、アルギニン水酸化酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質を生産する能力を有する宿主生物、該宿主生物の処理物、及び／または該宿主生物を培養して得られた該タンパク質を含む培養液を作用させるアルギニン水酸化酵素作用工程により、前記（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシアルギニンを得る
    　ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の製造方法。
PCT/JP2013/066609 2012-06-19 2013-06-17 トランス－３－ヒドロキシ－ｌ－プロリンの製造方法 Ceased WO2013191138A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-137396 2012-06-19
JP2012137396 2012-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013191138A1 true WO2013191138A1 (ja) 2013-12-27

Family

ID=49768734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/066609 Ceased WO2013191138A1 (ja) 2012-06-19 2013-06-17 トランス－３－ヒドロキシ－ｌ－プロリンの製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2013191138A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804596A (zh) * 2018-08-06 2020-02-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BACH, T. M. H. ET AL.: "Microbial production of N-acetyl cis-4-hydroxy-L-proline by coexpression of the Rhizobium L-proline cis-4- hydroxylase and the yeast N-acetyltransferase Mprl", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 97, 16 June 2012 (2012-06-16), pages 247 - 257 *
BAGNOST, T. ET AL.: "Immobilization of arginase and its application in an enzymatic chromatographic column: thermodynamic studies of nor-NOHA/arginase binding and role of the reactive histidine residue", J. CHROMATOGR. B, vol. 856, 2007, pages 113 - 120 *
INIESTA, V. ET AL.: "The inhibition of arginase by N(omega)-hydroxy-L-arginine controls the growth of Leishmania inside macrophages", J. EXP. MED., vol. 193, no. 6, 2001, pages 777 - 783 *
IRREVERRE, F. ET AL.: "Occurrence of cis- and trans-3-hydroxy-L-proline in acid hydrolyzate of telomycin", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 9, no. 1, 1962, pages 69 - 71 *
KUNIKI KINO: "Biseibutsu Koso no Shinki Yuyo Kino to Riyo", BIOTECHNOLOGY, vol. 89, no. 6, 2011, pages 329 - 331 *
LEE, J. H. ET AL.: "Efficient synthesis of 3-hydroxyprolines and 3-hydroxyprolinols from sugars", TETRAHEDRON, vol. 57, 2001, pages 10071 - 10076 *
PANDEY, S. K. ET AL.: "Enantioselective synthesis of (2R,3R)- and (2S,3S)-p- hydroxyornithine", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 47, 2006, pages 4167 - 4169 *
PETERSEN, L. ET AL.: "Novel proline hydroxylase activities in the pneumocandin-producing fungus Glarea lozoyensis responsible for the formation of trans 3- and trans 4-hydroxyproline", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 62, 2003, pages 263 - 267 *
SCHLEIFER, K. H. ET AL.: "Threo-beta- hydroxyornithine: a natural constituent of the peptidoglycan of Corynebacterium species Co 112", ARCH. MICROBIOL., vol. 134, no. 3, 1983, pages 243 - 246 *
SHIBASAKI, T. ET AL.: "Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio- and stereospecific hydroxylation of L-proline", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 64, no. 4, 2000, pages 746 - 750 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804596A (zh) * 2018-08-06 2020-02-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用
CN110804596B (zh) * 2018-08-06 2021-12-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种新型的脯氨酸3-羟化酶及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108220259B (zh) L-脯氨酸4-羟化酶
US8883459B2 (en) Process for production of cis-4-hydroxy-L-proline
CN106148259B (zh) 生产l-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用
CN1381586A (zh) 用于产生有旋光力的化合物的方法
JP6276178B2 (ja) シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法
CN107532185B (zh) 羟基-l-哌可酸的制造方法
KR20160097691A (ko) 신규 라이신 디카르복실라제 및 이를 이용하여 카다베린을 생산하는 방법
JP2008530978A (ja) ４−ハイドロキシ−ｌ−イソロイシン又はその塩の製造法
CN105238807A (zh) 一种辅酶高效再生体系的构建及其应用
JP5142268B2 (ja) 改良型没食子酸合成酵素および没食子酸の製造法
JP5140848B2 (ja) 没食子酸の製造法
Yang et al. Effective whole cell biotransformation of arginine to a four-carbon diamine putrescine using engineered Escherichia coli
CN101463358A (zh) 一种腈水合酶基因簇及其应用
JP6959379B2 (ja) ピペコリン酸４位水酸化酵素およびそれを利用した４−ヒドロキシアミノ酸の製造法
Watanabe et al. Identification and characterization of trans-3-hydroxy-L-proline dehydratase and Δ1-pyrroline-2-carboxylate reductase involved in trans-3-hydroxy-L-proline metabolism of bacteria
CN104673814B (zh) 一种来自于阴沟肠杆菌的l‑苏氨酸醛缩酶及其应用
WO2011108585A1 (ja) 遺伝子組換えStreptomyces属放線菌による有用物質生産法
WO2013191138A1 (ja) トランス－３－ヒドロキシ－ｌ－プロリンの製造方法
CN110607335B (zh) 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物生物合成方法
CN117903007B (zh) 一种亚精胺生物合成途径关键酶
Hara et al. Development of a multi-enzymatic cascade reaction for the synthesis of trans-3-hydroxy-l-proline from l-arginine
JP5697327B2 (ja) シス−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造方法
Schwardmann et al. Formamide-based production of amines by metabolically engineering Corynebacterium glutamicum
JP2011239686A (ja) ペプチド及びペプチド誘導体の製造方法
CN105039366A (zh) 一种密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶的基因及其表达

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13807322

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13807322

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP