WO2013014091A1 - Snrna rnu2 - 1 als tumormarker - Google Patents
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- WO2013014091A1 WO2013014091A1 PCT/EP2012/064321 EP2012064321W WO2013014091A1 WO 2013014091 A1 WO2013014091 A1 WO 2013014091A1 EP 2012064321 W EP2012064321 W EP 2012064321W WO 2013014091 A1 WO2013014091 A1 WO 2013014091A1
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Definitions
- the invention relates to a method for the diagnosis of malignant diseases, which is based on the determination of the content of a particular snRNA, RNU2-1 f or partial sequences thereof in different body fluids and a kit for the diagnosis of such diseases and the use of this snRNA and its partial sequences and more specific Primer for the diagnosis of such
- SnRNAs Small nuclear RNAs
- SnRNAs are small RNA molecules that are involved in a number of important processes. SnRNAs are catalytically active as part of the spliceosome. They are responsible for the recognition and splicing of the intron of pre-mRNA contained in the nucleus. They also form complexes with several specific proteins, called snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) or snurps.
- snRNPs small nuclear ribonucleoprotein particles
- snRNAs In different body fluids such as blood or serum / plasma, ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid and urine are snRNAs and their
- Subsequences detectable by RNA or DNA amplification techniques. In various types of tumors there are specific expression patterns of snRNAs.
- Tumor markers used to assess the course of the disease are endogenous substances that can be found more frequently in some tumor diseases in the blood. The tumor cells form these substances themselves or stimulate their formation.
- a tumor marker that is highly sensitive and specific for the presence of a malignant disease.
- a tumor marker that provides meaningful values regardless of the type of tumor and in which
- Differential diagnosis can be used.
- the invention relates to a method for the diagnosis of malignant diseases, comprising the following steps:
- the snRNA serving as marker according to the invention has the following nucleotide sequence:
- RNU2-1f Meaningful fragments (RNU2-1f) of RNU2-1 are the following:
- the snRNA RNU2-1 has in its nucleus a nucleotide sequence that provides (among other sequences?) For the tumor events a relevant statement.
- This nucleotide sequence is shown in bold in SEQ1 and reproduced in the above table as SEQ4.
- the nucleotide sequence of SEQ4 corresponds in all nucleotides of a microRNA miR-1246, which is part of the nucleotide sequence pre-miR-1246. However, this pre-miR-1246 has nothing to do with the tumor activity of interest here; the correspondence of the central nucleotide sequences is purely coincidental.
- the diagnostics developed for miR-1246 can be used for purposes according to the invention for detecting a tumor activity of the patient.
- the fragments SEQ2 to SEQ10 reproduced above are sequences derived from Qiagen PCR products which can be used for tumor diagnosis.
- the sequences SEQ2 and SEQ3 are compared to the sequence SEQ4 shortened by one or two nucleotides at the 3 'end, the sequences SEQ5 to SEQ10 have SEQ4
- sequences SEQ 2 to SEQ 10 listed above appear in the frequencies given in the cloning of PCR products with the Qiagen miR-1246 qRT-PCR assay. In 76% of the sequences is one
- SnRNAs were quantitatively real-time
- qRT-PCR Polymerase chain reaction
- Cholangiocarcinoma hepatocellular carcinoma, renal cell and bladder carcinoma and GIST. This not only distinguished healthy patients from the sick, but also patients with malignancies of patients with inflammatory changes relevant for differential diagnosis.
- biomarkers SEQ1 and SEQ2 to SEQ 10 are not limited to the first or early diagnosis of malignant diseases.
- the data from the experiments show that they can also be used as progression markers and predicative markers. It has been found that the expression of the fragments SEQ2 to SEQ10 in colorectal carcinoma, bronchial and pancreatic carcinoma correlates with the course of the disease (course marker), the concentration of these fragments decreases with good clinical response to chemotherapy. Accordingly, the method according to the invention is also of value for the treatment of malignant diseases. It was also
- the method according to the invention provides that the concentration of at least one fragment expressing the presence or absence of a malignant disease of the snRNA RNU2-1 is determined.
- a qualitative determination can be made using a miR-1246 (SEQ4) specific probe. Since RNU2-1 and its fragments are detectable even in healthy patients in small amounts, the determined content is compared with a reference value.
- a reference value can be a standard value, the value found being compared with the value of a healthy patient (standard value), but as a rule it is a relative value, since this is easier to determine.
- a reference value can be a standard value, the value found being compared with the value of a healthy patient (standard value), but as a rule it is a relative value, since this is easier to determine.
- Reference value can be the expression of a
- unaffected micro-RNA ie a micro-RNA that is expressed unchanged in healthy and diseased patients, be, or even an added synthetic micro-RNA whose relative concentration in the sample is known.
- a synthetic microRNA is syn-cel-54, which has been developed as a miRNA mimic for such reference purposes.
- Relative quantifications can be carried out, for example, in the form of quantitative real-time PCR (qRT-PCR).
- RNAs in a sample is determined, if appropriate after amplification by fluorescence measurement. Quantitative determinations are made using primers specific for the corresponding RNA fragments, ie by primers for miR-1246 (SEQ4) or one on at least one of
- Quantitative determinations may also be made by specific primers to fragments other than SEQ2 to SEQ10 of RNU2-1. Also in this case, it is advantageous if such a primer detects a plurality of fragments which have a similarity in the sequence of a few nucleotides, as is also present in SEQ 1 to 10.
- the invention further relates to a kit for the diagnosis of malignant diseases, comprising at least one probe and / or a primer for detecting the sn RNA RNU2-1, the SEQ1 and / or at least one of the fragments SEQ2 to
- SEQ10 contains the snRNA RNU2-1.
- the kit expediently also contains a reference RNA together with the associated probe and / or associated primer.
- the invention relates to the use of RNU2-1 and / or at least one of its fragments for the diagnosis of malignant diseases and to the use of probes and / or primers specific for these fragments.
- the probes are in particular also miR-1246 (SEQ4) specific primers, thus hybridizing oligonucleotides.
- the invention enables a differential diagnosis between non-malignant diseases and neoplasias.
- overexpression of RNU2-1 resulted from its fragments SEQ1 and SEQ2 to SEQ10 in the sample of a non-cancer patient or a healthy subject.
- RNA content was extracted using a miRVana RNA isolation kit (Ambion, Austin, USA) according to the manufacturer's instructions. Frozen samples were thawed on ice and 0.17 ml of it was diluted with the same volume miRVana PARIS 2X denaturing Solution and then incubated on ice for 5 min. Thereafter, 5 ⁇ each of the synthesized miRNA mimic syn-cel-54 were added to the samples for the purpose of normalization
- microRNA used 2 ⁇ of the total RNA solution were in the Reverse transcription reaction (37 ° C for 60 min and 95 ° C for 5 min, followed by 4 ° C) was used.
- the real-time qPCR was tested on an Opticon 2 system (MJ Research, Waltham, MA) according to the protocol of the
- the miR-1246 has the following nucleotide sequence: miR-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG This sequence is completely identical to the fragment SEQ4 of RNU2-1 and is present in the fragments SEQ1 and SEQ2, 3 and 5 to 10 almost completely or completely included.
- Non-Hodgkin's lymphoma o Primary CNS lymphoma
- Figure 1 shows the result of a serum test of a healthy
- FIG. 2 shows a corresponding test with the miR-1246 assay from Qiagen.
- the assay related to Figure 1 is specific for the fragments of RNU2-1 but less sensitive overall. Since the Qiagen assay on miR-1246 detects more fragments, the specificity is increased.
- Figure 3 shows the result of serum tests on various malignant
- the threshold (cut off) is -2.995 and is indicated by the dashed line.
- PDAC pancreatic ductal adenocarcinoma
- CRC colorectal carcinoma
- R rectal carcinoma
- CRC I to IV for the UICC stages I to IV of the CRC
- HC healthy controls
- DC diseased controls (differential diagnoses)
- CRP for c -reactive protein.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen mit den Schritten: Bereitstellen einer aus einer Körperflüssigkeit oder einer Körperausscheidung gewonnenen Probe, sowie Bestimmen der Konzentration der snRNA RNU2-1 oder ihrer Fragmente in der Probe, sowie ein Kit zur Durchführung dieser Diagnose und die Verwendung von auf RNU2-1 und Fragmenten davon spezifischen Sonden.
Description
SNRNA RNU2 - 1 ALS TUMORMARKER
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das auf der Bestimmung des Gehalts einer bestimmten snRNA, RNU2-1 f oder Teilsequenzen davon in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten beruht sowie ein Kit zur Diagnose solcher Erkrankungen und die Verwendung dieser snRNA und ihrer Teilsequenzen und dafür spezifischer Primer zur Diagnose solcher
Erkrankungen.
Small nuclear RNAs (snRNAs) sind kleine RNA-Moleküle, die in einer Reihe wichtiger Prozesse eingebunden sind. Als Bestandteil des Spleißosoms sind snRNAs katalytisch aktiv. Sie sind für die Erkennung und für das Spleißen des Introns der im Zellkern enthaltenen prä-mRNA verantwortlich. Sie bilden ferner Komplexe mit mehreren spezifischen Proteinen, sogenannte snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) oder snurps.
In unterschiedlichen Körperflüssigkeiten wie Blut bzw. Serum/Plasma, Ascites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis und Urin sind snRNAs und ihre
Teilsequenzen mittels RNA- bzw. DNA-Amplifikationstechniken nachweisbar. In diversen Tumorarten finden sich spezifische Expressionsmuster von snRNAs.
Bisher sind keine Untersuchungen zu der snRNA RNU2-1 und ihren
Teilsequenzen in Serum/Plasma, Ascites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis, Pankreasgangsekret, Pankreaszystenflüssigkeit, Glaskörperflüssigkeit,
Gallenflüssigkeit, Stuhl oder Urin von Patienten mit neoplastischen
Erkrankungen berichtet worden.
Trotz bedeutender Fortschritte im Bereich der Onkologie in den letzten
Jahrzehnten sind die bösartigen Neubildungen auch weiterhin nach den Krankheiten des Kreislaufsystems die zweithäufigste Todesursache für beide Geschlechter in Deutschland. Zurzeit stirbt ungefähr jeder Vierte an einer Krebskrankheit. Die bisher v.a. zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs eingesetzten Tumormarker sind körpereigene Substanzen, die bei manchen Tumorerkrankungen im Blut vermehrt vorkommen können. Die Tumorzellen bilden diese Substanzen selbst oder regen ihre Bildung an.
Entsprechend wäre es wünschenswert, über einen Tumormarker zu verfügen, der mit hoher Sensitivität und Spezifität auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung hinweist. Insbesondere besteht ein Bedarf an einem Tumormarker, der unabhängig vom Tumortyp aussagekräftige Werte liefert und in der
Differentialdiagnostik einsetzbar ist.
Es wurde jetzt überraschend gefunden, dass die snRNA RNU2-1 und insbesondere ihre Fragmente [hier RNU2-1 f genannt], auch vesikulär geschützte Fragmente der RNU2-1 aus Körperflüssigkeiten isoliert, einen solchen Tumormarker darstellen, der mit relativ hoher Sensitivität und/oder Spezifität nachgewiesen werden kann und eine aussagekräftige Diagnose zum Tumorgeschehen eines Patienten liefert.
Entsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das die folgenden Schritte aufweist:
- Bereitstellen einer aus einer Körperflüssigkeit oder einer Körperausscheidung gewonnenen Probe sowie
- Bestimmen der Konzentration der snRNA RNU2-1 oder von Teilsequenzen davon.
Die erfindungsgemäß als Marker dienende snRNA hat die folgende Nukleotid- Sequenz:
RNU2-1
ATCGCTTCTC GGCCTTTTGG CTAAGATCAA GTGTAGTATC TGTTCTTATC AGTTTAATAT CTGATACGTC CTCTATCCGA GGACAATATA TTAAATGGAT TTTTGGAGCA GGGAGATGGA ATAGGAGCTT GCTCCGTCCA CTCCACGCAT CGACCTGGTA TTGCAGTACC TCCAGGAACG GTGCACCC
(NCBI Reference Sequence RNU2-1 : Nr.002716.3)
Aussagekräftige Fragmente (RNU2-1f) von RNU2-1 sind die folgenden:
SEQ1: 5 -...CAATATATTA AATGGATTTT TGGAGCAGGG
Sm site
AGATGGAATA GGAGCTTGCT CCGTCCACTC CACGCATCGACCT.
SEQ2 AATGGAI I I I GGAGCA 1x
SEQ3 AATGGAI I I I GGAGCAG 1x -
SEQ4 AATGGAI I I I GGAGCAGG 29x—
SEQ5 AATGGAI I I I GGAGCAGGG 54x
SEQ6 AATGGAI I I I GGAGCAGGGA 8x
SEQ7 AATGGAI I I I GGAGCAGGGAG 31x
SEQ8 AATGGAI I ITTGGAGCAGGGAGA 2x
SEQ9 AATGGAI I ITTGGAGCAGGGAGAT 1x
SEQ10 AATGGAI I ITTGGAGCAGGGAGATGG 2x
129
Die snRNA RNU2-1 hat in ihrem Kern eine Nukleotidsequenz, die (neben weiteren Sequenzen?) für das Tumorgeschehen eine relevante Aussage liefert. Diese Nukleotidsequenz ist in SEQ1 fettgedruckt dargestellt und in der vorstehenden Tabelle als SEQ4 wiedergegeben. Die Nukleotidabfolge von SEQ4 entspricht in allen Nukleotiden einer MicroRNA miR-1246, die Bestandteil der Nukleotidsequenz prä-miR-1246 ist. Diese prä- miR-1246 hat allerdings mit dem hier interessierenden Tumorgeschehen nichts zu tun; die Übereinstimmung der zentralen Nukleotidsequenzen ist rein zufällig.
Nichts desto weniger kann die für miR-1246 entwickelte Diagnostik für erfindungsgemäße Zwecke zum Nachweis einer Tumoraktivität des Patienten eingesetzt werden.
Die vorstehend wiedergegebenen Fragmente SEQ2 bis SEQ10 sind aus Qiagen-PCR-Produkten abgeleitete Sequenzen, die zur Tumordiagnostik herangezogen werden können. Die Sequenzen SEQ2 und SEQ3 sind gegenüber der Sequenz SEQ4 um ein bzw. zwei Nukleotide am 3'-Ende verkürzt, die Sequenzen SEQ5 bis SEQ10 weisen über die SEQ4
hinausgehende Nukleotide auf und sind deshalb für eine Differenzierung gegenüber miR-1246 geeignet.
Die vorstehend aufgeführten Sequenzen SEQ2 bis SEQ10 erscheinen bei der Klonierung von PCR-Produkten mit dem Qiagen miR-1246 qRT-PCR Assay in den angegebenen Häufigkeiten. Bei 76 % der Sequenzen ist eine
Unterscheidung gegenüber miR-1246 möglich, bei 24 % der Fragmente handelt es sich um Sequenzen, die sowohl mit der miR-1246 als auch RNU2-1 Sequenz bzw. mit Teilsequenzen beider Transkripte übereinstimmt, so dass eine eindeutige Unterscheidung beider Transkripte nicht möglich ist. (Eigene experimentelle Daten belegen jedoch, dass miR-1246 in humanen Zellen nicht gebildet wird, woraus sich die Interpretation ableiten lässt, dass alle genannten Sequenzen (SEQ2-10) als Fragmente der RNU2-1 anzusehen sind.)
Im Rahmen eines Forschungsprojektes wurde das Material (Serum, Blut, Aszites, Pleuraerguss, Liquor cerebrospinalis Gallen- und Pankreasgangsekret, Sputum, Glaskörperflüssigkeit, Perikarderguss und Urin), das als flüssige Phase durch Abzentrifugation der zellulären Komponenten gewonnen wird,
molekulargenetisch hinsichtlich der Expression verschiedener snRNAs untersucht. snRNAs waren mittels quantitativer real-time
Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) in allen Materialien detektierbar und es ist gelungen den Zusammenhang zwischen der Expression bestimmter snRNAs in den aufgelisteten Körperflüssigkeiten und der Diagnose des Malignoms zu demonstrieren. Es wurde gezeigt, dass eine signifikante Korrelation zwischen der Abundanz/Konzentration (Überexpression) von Fragmenten der RNU2-1 in verschiedenen Körperflüssigkeiten und den häufigsten Malignomentitäten, wie Brustkarzinom, Bronchialkarzinom, Kolorektalem Karzinom, Prostatakarzinom, Pankreaskarzinom, Magenkarzinom, Ovarialkarzinom Lymphome,
Cholangiokarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Nierenzell- und Blasenkarzinom sowie GIST besteht. Damit konnten nicht nur gesunde Patienten von kranken unterschieden werden, sondern auch Patienten mit Malignomen von Patienten mit differentialdiagnostisch relevanten entzündlichen Veränderungen.
Beispielsweise wurde bei der Untersuchung des Serums der Patienten mit Pankreaskarzinom und kolorektalem Karzinom eine hohe Spezifität von 97,7 bzw. 90,6% erzielt.
Der Einsatz der Biomarker SEQ1 sowie SEQ2 bis SEQ 10 beschränkt sich nicht nur auf die Erst- bzw. Frühdiagnose der malignen Erkrankungen. Die Daten der Experimente zeigen, dass sie ebenfalls als Verlaufsmarker und als prädikative Marker eingesetzt werden können. Es wurde festgestellt, dass die Expression der Fragmente SEQ2 bis SEQ10 bei kolorektalem Karzinom, Bronchial- und Pankreaskarzinom mit dem Krankheitsverlauf korreliert (Verlaufsmarker), die Konzentration dieser Fragmente sinkt bei gutem klinischen Ansprechen auf eine Chemotherapie. Entsprechend ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Behandlung von malignen Erkrankungen von Wert. Außerdem wurde
festgestellt, dass z. B. beim kolorektalen Karzinom und beim Ovarialkarzinom die Konzentration von RNU2-1 f bzw. die Veränderung der Konzentration des
Markermoleküls unter Therapie mit der Zeit bis zum Progress bzw. mit
Überleben korreliert.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die snRNA RNU2-1 bzw. ihre Fragmente in den untersuchten Körperflüssigkeiten einen vielversprechenden
Pantumormarker zur Diagnose und zur Beurteilung des Verlaufes eines
Malignoms darstellen. Bisher sind keine Pantumormarker, die ähnliche
Sensitivität oder Spezifität für die breite Anzahl an Tumorentitäten besitzt, beschrieben worden.
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, dass die Konzentration von wenigstens eines für das Vorliegen oder die Abwesenheit einer malignen Erkrankung des Patienten aussagekräftigen Fragments der snRNA RNU2-1 bestimmt wird. Eine qualitative Bestimmung kann mit Hilfe einer für miR-1246 (SEQ4) spezifischen Sonde erfolgen. Da RNU2-1 und seine Fragmente auch in gesunden Patienten in geringen Mengen nachweisbar sind, wird der ermittelte Gehalt mit einem Referenzwert verglichen. Ein solcher Referenzwert kann einerseits ein Normwert sein, wobei der gefundene Wert mit dem Wert eines gesunden Patienten (Normwert) verglichen wird, ist aber in der Regel ein Relativwert, da dieser einfacher zu bestimmen ist. Solche relativen
Quantifizierungen sind an und für sich bekannt und benötigen einen
Referenzwert. Ein solcher Referenzwert kann die Expression einer
unbeeinflussten micro-RNA, also einer micro-RNA, die in gesunden und erkrankten Patienten unverändert exprimiert wird, sein, oder aber auch eine zugesetzte synthetische micro-RNA, deren relative Konzentration in der Probe bekannt ist. Eine solche synthetische micro-RNA ist beispielsweise syn-cel-54, die für solche Referenzzwecke als miRNA-Mimic entwickelt wurde. Relative Quantifizierungen können beispielsweise in Form der quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) vorgenommen werden.
Zweckmäßigerweise wird der Gesamtgehalt an RNAs in einer Probe ggf. nach Amplifikation durch Fluoreszenzmessung bestimmt. Quantitative Bestimmungen erfolgen über auf die entsprechenden RNA-Fragmente spezifische Primer, also
durch Primer für miR-1246 (SEQ4) oder einen auf wenigstens eine der
Sequenzen SEQ1 bis SEQ10 spezifischen Primer.
Quantitative Bestimmungen können ferner durch spezifische Primer auf andere Fragmente als SEQ2 bis SEQ10 von RNU2-1 erfolgen. Auch in diesem Fall ist es vorteilhaft, wenn ein solcher Primer mehrere Fragmente erfasst, die eine Übereinstimmung in der Abfolge einiger Nukleotide, wie sie auch in SEQ1 bis 10 vorliegt, aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Diagnose von malignen Erkrankungen, das wenigstens eine Sonde und/oder einen Primer zum Nachweis der sn RNA RNU2-1 , der SEQ1 und/ oder wenigstens eines der Fragmente SEQ2 bis
SEQ10 der snRNA RNU2-1 enthält. Das Kit enthält zweckmäßigerweise ferner eine Referenz-RNA samt zugehöriger Sonde und/oder zugehörigem Primer.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung von RNU2-1 und/oder wenigstens eines seiner Fragmente zur Diagnose von malignen Erkrankungen sowie die Verwendung von auf diese Fragmente spezifischen Sonden und/oder Primer. Die Sonden sind insbesondere auch auf miR-1246 (SEQ4) spezifische Primer, also damit hybridisierende Oligonukleotide.
Die Erfindung ermöglicht insbesondere eine Differentialdiagnose zwischen nichtmalignen Erkrankungen und Neoplasien. In den Proben der Patienten mit einer Krebserkrankung ergab sich eine Überexpression von RNU2-1 anhand seiner Fragmente SEQ1 und SEQ2 bis SEQ10 in der Probe eines nicht unter einer Krebserkrankung leidenden Patienten oder eines gesunden Probanden.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Techniken zur
Anreicherung/Amplifikation der RNU2-1 -Fragmente über Primer, zum
qualitativen und quantitativen Nachweis der Fragmente wie auch zur
Aufreinigung und Gehaltsbestimmung sind an und für sich bekannt.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
• Probenaufbereitunq
• Proben (Serum, Vollblut, Ascites, Pleuraerguss, Urin und Liquor
cerebrospinalis) wurden innerhalb von 60 min nach der Entnahme zentrifugiert
(500 x g, 10 min, RT) und der Überstand bei -80 °C gelagert.
• RNA- Extraktion
Aus dem Material wurde der gesamte RNA-Gehalt unter Verwendung eines miRVana RNA Isolation Kits (Ambion, Austin, USA) nach der Anleitung des Herstellers extrahiert. Tiefgefrorene Proben wurden dazu auf Eis aufgetaut und 0,17 ml davon mit dem gleichen Volumen miRVana PARIS 2X denaturing Solution verdünnt und anschließend 5 min auf Eis inkubiert. Daraufhin wurden in die Proben zum Zweck der Normalisierung jeweils 5 μΙ der synthetisierten miRNA-Mimic syn-cel-54 in einer
Konzentration von 5 fmol/ml hinzugefügt. Gleiche Volumina
Säure/Phenol/Chloroform (Ambion) wurden jedem Aliquot zugesetzt und die Proben anschließend 5 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Zu der wässerigen Phase wurde Glycogen gegeben, wonach 1 ,25 Volumina 100 %iges Ethanol zugemischt wurden. Nach der Passage durch eine miRVana PARIS Säule wurden entsprechend den Vorschriften des Herstellers mehrere Waschschritte durchgeführt. Schließlich wurde die RNA in 100 μΙ nuclease-freiem Wasser eluiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messung eines 2 μΙ Aliquots auf einem NanoDropR ND-3300 Fluorospektrometer bestimmt.
• MiRNA-Expressionsbestimmunq durch quantitative real-time Polymerase- kettenreaktion
Qiagen-miRNA-Assays (Qiagen, Hilden, Deutschland) wurden nach den Vorschriften des Herstellers zur Quantifizierung des Gehalts an
microRNA herangezogen: 2 μΙ der gesamten RNA-Lösung wurden in die
Reverse-Transkription-Reaktion (37°C über 60 min und 95 °C über 5 min, gefolgt von 4°C) eingesetzt. Die real-time-qPCR wurde auf einem Opticon 2 System (MJ Research, Waltham, MA) nach dem Protokoll des
Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die allgemeinen Zyklus-Bedingungen waren wie folgt: 95 °C über 15 min, 40 Zyklen von 15 s bei 94 °C, 30 s bei 55 °C und 30 s bei 70 °C. Jede Probe wurde mindestens doppelt analysiert. Mittlere Schwellenwert-Zykluswerte (Ct- Werte) und Standardabweichungen wurden für alle micro-RNAs berechnet. Die Konzentration von syn-cel-54 in den jeweiligen Proben wurde ebenfalls gemessen. Die Menge an Ziel-micro-RNA wurde relativ zur Menge an syn-cel-54 normalisiert.
Entsprechend der Angaben von www.mirbase.org besitzt die miR-1246 die folgende Nukleotid-Sequenz: miR-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG Diese Sequenz stimmt mit dem Fragment SEQ4 von RNU2-1 vollständig überein und ist in den Fragmenten SEQ1 sowie SEQ2, 3 und 5 bis 10 fast vollständig oder vollständig enthalten.
Expressionsprofile von Patienten mit folgenden Erkrankungen zeigten eine Überexpression RNU2-1 , bestimmt anhand der Fragmente SEQ2 bis SEQ 10: · Neoplasien:
o Pankreaskarzinom
o Kolorektales Karzinom
o HCC
o CCC
o Lungenkarzinom
o Nierenzellkarzinom
o Blasenkarzinom
o Non-Hodgkin-Lymphom
o Primäres-ZNS-Lymphom
o Ovarialkarzinom
o Mammakarzinom
o Prostatakarzinom
o Magenkarzinom
o Pleuramesotheliom
o Gallengangkarzinom
o GIST
o Sarkome
o Peritonelmesotheliom
• Erkrankungen die als Differentialdiagnose in Frage kommen:
o bakterielle Peritonitis
o Pneumonie
o Silikose
o COPD
o Leberzirrhose
o Hepatitis
o Kardiale Dekompensation
o Pankreatitis
o CED
o Kollagenosen
o Sarkoidose
Figur 1 zeigt das Ergebnis eines Serumtests eines gesunden und an
kolorektalem Karzinom erkrankten Patienten, bei dem ein auf die Fragmente SEQ4 bis SEQ10 spezifischer Assay eingesetzt wurde.
Figur 2 zeigt einen entsprechenden Test mit dem miR-1246-Assay von Qiagen. Der für Fig. 1 verwandte Assay ist hinsichtlich der Fragmente von RNU2-1 spezifisch, jedoch insgesamt weniger sensitiv. Da der Qiagen-Assay auf miR- 1246 mehr Fragmente erfasst, ist die Spezifität gesteigert.
Figur 3 zeigt das Ergebnis von Serumtests bei verschiedenen malignen
Erkrankungen und Kontrollen. Der Schwellenwert (cut off) liegt bei -2,995 und ist durch die gestrichelte Linie angezeigt. PDAC steht für pancreatic ductal adeno- carcinoma, CRC für colorectal Carcinoma, R für rectal Carcinoma, CRC I bis IV für die UICC-Stadien I bis IV des CRC, HC für gesunde Kontrollen, DC für erkrankte Kontrollen (Differentialdiagnosen), CRP für c-reaktives Protein.
- Patentansprüche -
SEQUENCE LISTING
<110> Ruhr-Universität Bochum
Schmiegel, Wolff Prof. Dr.
<120> Tumormarker
<130> SCMG0010 <150> DE 102001108254
<151 > 2011-07-22
<150> DE 102012005153
<151 > 2012-03-16
<160> 11
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211 > 187
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atcgcttctc ggccttttgg ctaagatcaa gtgtagtatc tgttcttatc agtttaatat 60 ctgatacgtc ctctatccga ggacaatata ttaaatggat ttttggagca ggagatggaa taggagcttg ctccgtccac tccacgcatc gacctggtat tgcagtacct ccaggaacgg tgcaccc 187
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<212> DNA
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<213> Homosapiens <400> 10
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Claims
1 . Verfahren zur Diagnose von malignen Erkrankungen mit den Schritten
- Bereitstellen einer aus einer Körperflüssigkeit oder einer Körperausscheidung gewonnenen Probe sowie
- Bestimmen der Konzentration der snRNA RNU2-1 und/oder ihrer Fragmente in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch den Vergleich des Gehalts wenigstens eines der Fragmente SEQ1 und/oder SEQ2 bis SEQ10 RNU2-1 mit einem Schwellenwert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine relative Quantifizierung des Gehalts wenigstens eines der Fragmente SEQ2 bis SEQ10 mit einer Vergleichs-RNA.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Vergleichs-RNA eine synthetische micro-RNA ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt der Anreicherung der Fragmente SEQ2 bis SEQ10 in der Probe durch real-time qPCR.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Bestimmung des Gesamt-RNA-Gehalts durch Fluoreszenzmessung.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt der quantitativen Bestimmung der Fragmente SEQ2 bis SEQ10 über spezifische Primer.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe aus Vollblut, Serum, Plasma, Sputum, Aszites, Pleuraerguss, Stuhl, Pankreassekret, Gallengangssekret, Urin, Zystenflüssigkeit oder Liquor cerebrospinalis gewonnen wird.
9. Kit zur Diagnose von malignen Erkrankungen, enthaltend wenigstens eine Sonde und/oder einen Primer zum Nachweis wenigstens eines, insbesondere der Gesamtheit der Fragmente SEQ2 bis SEQ10.
10. Kit nach Anspruch 9, enthaltend eine Referenz-RNA samt zugehöriger Sonde und/oder zugehörigen Primer.
1 1 . Kit nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch wenigstens ein mit SEQ4 (miR-1246), insbesondere allen Fragmenten SEQ2 bis SEQ10 und der Referenz- micro-RNA hybridisierendes Oligonukleotid.
12. Verwendung von für SEQ4 (miR-1246) spezifischen Sonden zur Diagnose von Krebserkrankungen.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein mit SEQ4 (miR-1246) hybridisierendes Oligonukleotid ist.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnose eine quantitative Bestimmung des Gehalts an Fragmenten SEQ2 bis SEQ10 mit der Sonde einschließt.
15. Verwendung der snRNA RNU2-1 , Fragmenten davon vorzugsweise wenigstens eines, insbesondere der Gesamtheit der Fragmente SEQ2 bis SEQ10 zur Diagnose von Krebserkrankungen.
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| LUCY PIGATI ET AL: "Selective Release of MicroRNA Species from Normal and Malignant Mammary Epithelial Cells", PLOS ONE, vol. 5, no. 10, 1 January 2010 (2010-01-01), pages e13515, XP055039946, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/journal.pone.0013515 * |
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