WO2013011178A1

WO2013011178A1 - Análisis rápido y preciso de la sialilación de proteínas

Info

Publication number: WO2013011178A1
Application number: PCT/ES2012/070501
Authority: WO
Inventors: Zihao Wang; Jessica SLOAN; Kevin WEE
Original assignee: Grifols SA
Current assignee: Grifols SA
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2013-01-24
Anticipated expiration: 2014-01-14
Also published as: HUE038020T2; CA2837981A1; PT2733218T; CA2837981C; UY34195A; US9260743B2; TR201809082T4; JP2014525742A; BR112013033883A2; BR112013033883B1; ES2675511T3; SG10201500002XA; EP2733218A4; AU2012285696A1; KR101864468B1; MX344407B; RU2013154278A; PL2733218T3; AR087175A1; EP2733218A1

Abstract

Métodos y kits para el análisis de la sialilación de glucopro teínas. Las muestras de glucoproteína se incuban por separado en tres condiciones: con beta-galactosidasa, con beta-galactosidasa + alfa-sialidasa, y sin enzima. Tras el tratamiento enzimático, se determinan cuantitativamente mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada (HPAEC PAD) la galactosa total en la muestra, la galactosa no sialilada y la galactosa exógena del medio. La determinación de estos valores permite deducir el porcentaje de sialilación de la glucoproteína.

Description

ANÁLISIS RÁPIDO Y PRECISO DE LA SIALILACION DE PROTEÍNAS SECTOR TÉCNICO

En el presente documento se describen métodos analíticos para analizar la sialilacion de proteínas.

ANTECEDENTES

Muchas proteínas requieren glucosilación para su función biológica. A menudo, los carbohidratos terminales, "de recubrimiento" ("capping") de cadenas glucosílicas son residuos de ácido siálico. Los ácidos siálicos comprenden una familia de ácidos neuramínicos enlazados a N y a 0. Los ácidos siálicos enlazados a N se forman enlazando restos de acetilo o glucosilo al residuo amino del ácido neuramínico, formando ácido iV-acet ilneuramínico (Neu5Ac) y ácido iV-glucolilneuramínico (Neu5Gc) , respectivamente. Si el grupo amino del neuramínico se sustituye por un resto hidroxilo, esto produce ácido 3-desoxi-D-glicero-D- galacto-2-nonulosónico (KDN) . Los ácidos siálicos enlazados a O se forman mediante las sustituciones de uno o más de los grupos hidroxilo de Neu5Ac, Neu5Gc o KDN por grupos metilo, acetilo, lactoílo, sulfato o fosfato. Por consiguiente, existe una población grande y diversa de ácidos siálicos.

Además, existe un interés considerable en analizar la sialilacion de proteínas, en general, debido a las numerosas funciones biológicas atribuidas a estas modificaciones. La sialilacion puede ser importante para la farmacocinét ica y la eficacia de la bioterapéut ica de proteínas. Consecuentemente, se han desarrollado varios métodos analíticos para evaluar el contenido de ácido siálico de glucoproteínas . Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos a base de anticuerpos para identificar restos de carbohidratos particulares. Los residuos de ácido siálico terminales pueden separarse enzimáticamente de la glucoproteina de interés y analizarse mediante HPLC. Sin embargo, cada uno de estos métodos presenta defectos y habitualmente requiere muestras puras o altas concentraciones. Los métodos convencionales utilizados por la industria farmacéutica adolecen de poca precisión, alta variabilidad de los datos y no pueden utilizarse con medios de cultivo complejos debido a la interferencia de la matriz. El método descrito en el presente documento supera dichos defectos y proporciona una cuantificación precisa y reproducible de la sialilacion de proteínas. Colectivamente, el método descrito en el presente documento comprende dos etapas: (1) se utiliza una reacción enzimática para hidrolizar los residuos de galactosa y ácido siálico de las glucoproteínas ; y (2) se utiliza un método de cromatografía de intercambio iónico para separar y cuantificar los residuos de galactosa. La parte enzimática del método implica la liberación de los restos de galactosa terminales expuestos (no recubiertos) mediante la exo-glucosidasa específica, β-(1-4)- galactosidasa ( β-galactosidasa) , mientras que los residuos de ácido siálico terminales son liberados por a- (2- 3 , 6 , 8 , 9 ) -sialidasa ( OC-sialidasa) . Antes de la digestión, se divide una muestra entre, como mínimo, tres tubos. El primer tubo, Reacción A, es una muestra de fondo y comprende solamente los tampones de reacción enzimática. El segundo tubo, Reacción B, se hace reaccionar con β- galactosidasa que escinde todos los residuos de galactosa que no están recubiertos por ácidos siálicos. El tercer tubo, Reacción C, se co-digiere tanto con neuraminidasa como con β-galactosidasa . La enzima neuraminidasa elimina los ácidos siálicos de recubrimiento y permite que la β- galactosidasa escinda todos los residuos galactosa expuestos. A continuación se utiliza cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada (HPAEC PAD) para determinar la cantidad de galactosa presente en las tres muestras. La proporción de galactosa no recubrimiento (es decir, Reacción B) con respecto a galactosa total (es decir, Reacción C) se utiliza para calcular el porcentaje de recubrimiento de residuos de galactosa, al tiempo que se explica también cualquier galactosa libre presente en los medios (Reacción A) .

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se describen métodos para analizar la sialilacion de una proteína. También se describe un método para determinar el contenido de sialilacion de una proteína que comprende: (a) preparar una proteína para el análisis; (b) tratar enzimáticamente la proteína preparada, que comprende: dividir la proteína preparada en una pluralidad de muestras de proteína que comprenden (i) como mínimo una muestra de proteína como muestra de los medios (Reacción A); (ii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa a, como mínimo, una muestra de proteína (Reacción B) ; (iii) añadir, como mínimo, β- galactosidasa y OC-sialidasa a, como mínimo, una muestra de proteína diferente (Reacción C) ; e incubar la pluralidad de muestras de proteína; y (c) analizar la pluralidad de muestras de proteína utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (d) determinar un contenido de carbohidratos para la pluralidad de muestras de proteína; y (e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína. También se describe un método que comprende además (f) analizar una pluralidad de controles positivos y negativos utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC-PAD; y (h) comparar la pluralidad de muestras de proteína con la pluralidad de patrones y controles.

También se describe la utilización de cromatografía HPAEC- PAD para determinar el contenido de sialilación de una proteína, que comprende: (a) preparar una proteína para el análisis; (b) tratar enzimáticamente la proteína preparada, que comprende: dividir la proteína preparada en una pluralidad de muestras de proteína que comprenden (i) como mínimo una muestra de proteína como muestra de los medios (Reacción A); (ii) añadir, como mínimo, β- galactosidasa a, como mínimo, una muestra de proteína (Reacción B) ; (iii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa y OC-sialidasa a, como mínimo, una muestra de proteína diferente (Reacción C) ; e incubar la pluralidad de muestras de proteína; y (c) analizar la pluralidad de muestras de proteína utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (d) determinar un contenido de carbohidratos para la pluralidad de muestras de proteína; y (e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína. También se describe la utilización que comprende además: (f) analizar una pluralidad de controles positivos y negativos utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC- PAD; y (h) comparar la pluralidad de muestras de proteína con la pluralidad de patrones y controles. También se describe un kit para determinar el contenido de sialilación de cualquier proteína que comprende: como mínimo un recipiente que comprende una pluralidad de recipientes que comprenden cantidades medidas previamente de una galactosidasa y una sialidasa; opcionalmente, recipientes que contienen, como mínimo, una composición tampón, una muestra de control positivo, una muestra de control negativo y patrones de carbohidratos, e instrucciones que describen un método para determinar el contenido de sialilación de una proteína, que comprende descripciones de: (a) preparar una proteína para el análisis; (b) tratar enzimáticamente la proteína preparada, que comprende: dividir la proteína preparada en una pluralidad de muestras de proteína que comprenden (i) como mínimo una muestra de proteína como muestra de los medios (Reacción A); (ii) añadir, como mínimo, β- galactosidasa a, como mínimo, una muestra de proteína (Reacción B) ; (iii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa y OC-sialidasa a, como mínimo, una muestra de proteína diferente (Reacción C) ; e incubar la pluralidad de muestras de proteína; y (c) analizar la pluralidad de muestras de proteína utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (d) determinar un contenido de carbohidratos para la pluralidad de muestras de proteína; y (e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína.

También se describe un kit que comprende además: (f) analizar un control positivo y negativo utilizando cromatografía HPAEC-PAD; (g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC-PAD; y (h) comparar los resultados de la pluralidad de muestras de proteína con los resultados de la pluralidad de patrones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un esquema de las Reacciones A, B y C, y los datos que se obtienen a partir de cada reacción respectiva. El porcentaje de recubrimiento mediante sialilación puede determinarse a partir del cociente de las diferencias en las Reacciones C y B y Reacciones C y A, respectivamente. Véase la ecuación 1.

La figura 2 muestra un cromatograma típico para una muestra de recAlpha-1 digerida en la Reacción C. Los tiempos de elución para galactosa varían entre aproximadamente 14 y 16 minutos.

La figura 3 muestra una comparación de una muestra de recAlpha-1 aguas arriba que se dializó contra agua desionizada o se centrifugó en un filtro de centrifugado de 10 kDa. En la muestra dializada quedaban impurezas, pero fueron eliminadas casi totalmente por el filtro de centrifugado de 10 kDa.

La figura 4 demuestra que los excipientes aguas arriba de medios de cultivo recAlpha-1 pueden detectarse y pueden co-eluirse cerca del pico de galactosa. En el panel A, se muestra un pico de excipiente que se eluye próximo al pico de galactosa en algunas muestras después de la limpieza del filtro de centrifugado. Para las muestras de la Reacción B, el pico de impureza se resuelve inicialmente del pico de galactosa y no se integra. En el panel B, el pico de impureza del proceso se co-eluye con una muestra de la Reacción C. En este caso, el pico de impureza debe dividirse como se ha mostrado anteriormente para evitar que sea integrado con el área del pico de galactosa. figura 5. La especificidad del método se confirmó analizado una mezcla de monosacáridos neutros y aminomonosacáridos derivados de glucoproteinas . figura 6. Ejemplo de una curva patrón de galactosa típica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Un ejemplo de una proteína que puede analizarse utilizando el método descrito en el presente documento es el inhibidor de alfa 1-proteinasa (también conocido como alfa 1-antitripsina) . El inhibidor de alfa 1-proteinasa es una glucoproteína serpina de origen natural que está implicada en la protección de las células de enzimas proteasa implicadas en la coagulación y la inflamación. La ausencia de inhibidor de alfa-1 proteinasa, deficiencia de alfa 1- antitripsina, conduce a trastornos respiratorios tales como enfisema y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) . Por consiguiente, existe un interés en la utilización de inhibidor de alfa-1 proteinasa como bioterapéutico para tratar enfermedades relacionadas con la deficiencia del inhibidor de alfa-1 proteinasa. El inhibidor de alfa-1 proteinasa recombinante (recAlpha-1) se diseñó para secreción por la línea celular PerC6 con estructuras de carbohidrato glicano enlazadas a N que están parcial o totalmente recubiertas por ácidos siálicos terminales (ácidos iV-acetilneuramínicos ) . Una disminución de la cantidad de ácidos siálicos terminales ha demostrado reducir la semi-vida de recAlpha-1 en suero. Por lo tanto, es importante conocer el porcentaje de residuos de galactosa recubiertos mediante ácidos siálicos en recAlpha-1 cuando se investiga su función o eficacia como fármaco terapéutico.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de la muestra para análisis y digestión enzimática

En el presente documento se describe un método para la determinación del contenido de sialilación de una glucoproteina . El método comienza con la preparación de una muestra de proteína para hidrólisis enzimática de los restos de carbohidrato. Por consiguiente, la proteína debe ponerse en condiciones compatibles con las reacciones enzimáticas, incluyendo ajusfar la concentración de proteína, eliminar componentes de la solución tales como sales disueltas, tampones, otras proteínas, carbohidratos, excipientes, etc., que podrían interferir con la enzima o enzimas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "preparado/a" o la frase "preparar una proteína para el análisis" describe el proceso de eliminar componentes de la solución que podrían interferir en la hidrólisis enzimática y diluir la solución de proteínas a una concentración óptima para el ensayo con agua desionizada.

Como mínimo, pueden utilizarse dos métodos ejemplares no limitantes para preparar componentes de la solución de proteínas a partir de proteínas para el análisis: (1) diálisis contra agua desionizada o (2) filtración centrífuga (también llamada filtración por centrifugado) . En ambos casos, se utilizó una membrana semipermeable con un límite de corte de peso molecular (MWCO) especificado para eliminar especies de peso molecular más bajo mientras se retenia la proteína analito de interés. Los intervalos de MWCO útiles incluyen 1 kDa, 2,5 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 50 kDa, 100 kDa, 250 kDa y 500 kDa. En el procedimiento de diálisis, la proteína se insertó en una membrana de diálisis y se dializó contra un exceso de agua desionizada o tampón adecuado y/o solución salina durante, como mínimo, 4 horas a 4°C. Como alternativa, en lugar de dializarla, una muestra de proteína puede prepararse para la digestión enzimática mediante filtración centrífuga. Durante la filtración centrífuga, la solución de proteína se centrifugó contra una membrana semipermeable con un MWCO especificado. Los componentes de la solución con pesos moleculares por debajo del MWCO pasan a través del filtro durante el centrifugado, mientras que la proteína y las especies de peso molecular más alto son retenidas. Habitualmente, la solución de proteína se concentra durante la filtración por centrifugado, debido a que el agua pasa a través de la membrana semipermeable. Generalmente, como ejemplo no limitante, se utilizó un filtro de centrifugado de 10 kDa, según las instrucciones del fabricante, para preparar la muestra de proteína.

Antes de la digestión enzimática, también se diluyeron muestras de proteína a una concentración de 1,0 a 1,5 mg/ml con agua desionizada, de modo que estuvieron dentro del intervalo lineal del ensayo. Una vez que se diluyeron las muestras, como mínimo, se realizó una reacción para cada condición (es decir, A, B y C) . La solución de proteína preparada se dividió, como mínimo, en tres muestras para desglucosilación enzimática. Véase la figura 1 . La Reacción A era el control de fondo (para controlar la galactosa exógena) . Esta reacción está compuesta solamente por los tampones para las reacciones enzimáticas y sirve como control para carbohidratos que pueden existir en el medio que comprende el analito de proteína. La Reacción B contenía β-galactosidasa, que hidrolizaba grupos carbohidratos no sialilados, pero no aquellos que estaban "recubiertos" con grupos sialilo. La Reacción C contenía tanto OC-sialidasa como β-galactosidasa . En esta reacción, la OC-sialidasa hidrolizaba los restos sialilo de recubrimiento, lo que permitía a continuación a la β- galactosidasa hidrolizar todos los grupos carbohidrato. En esta reacción combinada de OC-sialidasa y β-galactosidasa, toda la glucosilación (es decir, sialilada y no sialilada) se eliminó de la proteína, mientras que en la reacción de β-galactosidasa, solamente se eliminaron los grupos carbohidratos no recubiertos (no sialilados) . Los componentes para las tres condiciones de reacción se muestra en la tabla 1 .

Tabla 1 : Condiciones de Reacción de Glicosilasa

Tampón de

Agua Tampón de β-(1-4)- reacción de α-(2-3,6,8,9)-

Reacción desionizada reacción de galactosidasa

galactosidasa sialidasa (μΙ)

(μΙ) sialidasa (μΙ) (μΙ)

(μΙ)

A-Fondo 12 4 4 0 0

Β-β-

10 4 4 2 0 galactosidasa

C-β- galactosidasa 8 4 4 2 2 + oc-sialidasa Las diferentes reacciones se prepararon múltiples veces en base al número de muestras a digerir. Para cada digestión, se añadieron 45 μΐ de muestra a tres tubos diferentes. Posteriormente, se añadieron 20 μΐ de la enzima de reacción apropiada A, B o C al tubo indicado para ese tipo de reacción y se calentaron en un termomezclador a 37°C, agitando moderadamente, durante entre 2,5 horas y 4 horas. La reacción se inactivo mediante incubación a 90 °C durante 5 minutos .

Una vez completadas las digestiones, las muestras se prepararon para los análisis cromatográficos combinado 30 μΐ de muestra y 20 μΐ de patrón de desoxirribosa a 0,02 mg/ml en un frasco y mezclando minuciosamente. Las muestras se colocaron a continuación en un procesador de muestras automático de HPLC a 10°C y se procesaron utilizando el método cromatográfico descrito en el Ejemplo 2. Ejemplo 2: Metodología cromatográfica

Se realizó análisis por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD) en sistemas de cromatografía iónica Dionex ICS-3000 con bombas únicas, procesadores automáticos de muestras con termostato ajustados a 10°C, y unidades de detección electroquímica (Dionex, Sunnyvale, CA) . Se utilizaron electrodos de oro (Au) desechables para la detección amperométrica pulsada (PAD) (Dionex No. de Prod. 060139) . La forma de onda utilizada para el análisis de la muestra se basaba en la Ficha Técnica 21 de Dionex, que describe ajustes óptimos para PAD de carbohidratos tal como se muestra en la tabla 2. Véase la Ficha Técnica 21 de Dionex, Optimal Settings for Pulsed Amperometric Detection of Carbohydrates Using the Dionex ED40 Electrochemical Detector [Ajustes óptimos para detección amperométrica pulsada de carbohidratos utilizando el detector electroquímico Dionex ED40], Dionex (1998).

La cromatografía se realizó utilizando una columna de intercambio iónico CarboPac PA10 4 χ 250 mm de Dionex (Dionex No. de Prod. 046110) con una precolumna en línea CarboPac PA10 4 χ 50 mm (Dionex No. de Prod. 046115), y una columna AminoTrap de 4 χ 50 mm (Dionex No. de Prod. 046112) para unirse a la proteína desialilada e impedir su adsorción a la columna.

La primera fase móvil (A) contenía NaOH 20 mM y se utilizó para la separación isocrática a un caudal de 1 ml/min durante 30 minutos (el tiempo de ejecución inicial era de 28 minutos pero se amplió a 30 minutos durante el desarrollo para dejar más tiempo para el re-equilibrado al 100% de la fase móvil A) . La segunda fase móvil (B) contenía NaOH 500 mM y se utilizó para la elución de la columna, limpieza de la columna y limpieza del electrodo. El método de elución cromatográfica, incluyendo el lavado en rampa utilizando las fases móviles A y B se muestra en la tabla 3. El volumen de inyección de muestra era de 20 μΐ . Se realizaron análisis de datos utilizando el software Chromeleon® 6.8 Chromatography Data Analysis System ( Dionex ) .

Ejemplo 3: Patrones, controles, calibración e idoneidad del sistema

La concentración de galactosa se cuantificó en referencia a cantidades conocidas de un patrón de galactosa 10 mM (BioAssay Systems, EGAL-100) que se diluyó sucesivamente en un intervalo lineal de 8 pmol a 1,5 nmol. Durante el desarrollo del método, se realizó una única inyección de cada punto antes de las inyecciones de muestra para garantizar el rendimiento de la columna y el sistema. Véase la figura 6.

El monosacárido 2-desoxi-D-ribosa ( desoxirribosa ) se utilizó como patrón interno. Una cantidad equivalente de desoxirribosa se añadió a todas las muestras de proteína, patrones y controles para monitorizar el rendimiento del electrodo. Debido a la naturaleza de la PAD, se utilizó el patrón interno para corregir las diferencias en la respuesta del detector, que pueden producirse de inyección a inyección. El área del pico de galactosa para todas las muestras se corrigió dividiendo el área de galactosa por el área de desoxirribosa . Se utilizó un control positivo para garantizar la precisión del ensayo cada vez que se realizó. Esto requería monitorizar la función enzimática y asegurar el manejo apropiado de la muestra. La reacción de control era una mezcla 1 a 1 de fetuina sialilada bovina y patrón de asialofetuina disponibles en el mercado (Sigma F3004 y A4781, respectivamente) . Individualmente, la fetuina sialilada tiene un porcentaje de recubrimiento por encima del 99% y la asialofetuina tiene un porcentaje de recubrimiento del 0%. Cuando se mezclan a iguales proporciones, la proporción de recubrimiento ( sialilación) para fetuina debe ser del 50% ± 3%. El control de fetuina se preparó como un gran lote que se dividió en alícuotas, se congeló a -70°C y una muestra individual se descongeló y se utilizó como control cada vez que se digirió un juego de muestras y se procesó utilizando los métodos descritos en el presente documento.

Se monitorizó un experimento de idoneidad del sistema para asegurar el rendimiento del método analítico utilizando una mezcla de galactosa y desoxirribosa que se inyectó al comienzo de una serie, y se categorizaron cada 12 inyecciones de muestra (es decir, 2 muestras por duplicado), y al final de la serie para monitorizar el rendimiento del electrodo y la columna durante toda la serie. Los diferentes experimentos para una serie cromatográfica típica se muestra en la tabla 4.

Tabla 4 : Secuencia típica de una serie de cromatografía

Volumen de

Muestra Contenido Repetición

inyección (μΐ)

1 Blanco tampón³ 3 20

2 Patrón a alta conc- 3 20

idoneidad del sistema

3 Patrón a baja 1 20

concentraeión^b

4 Patrón a alta 1 20

concentraeión^b

5 Blanco enzimático⁰ 1 20

6 Fetuina-Reacción B^d 1 20

7 Fetuina-Reacción C^d 1 20

8 Fetuina-Reacción B^d 1 20

9 Fetuina-Reacción C^d 1 20

10 Patrón a alta conc- 1 20

idoneidad del sistema*

11 Blanco tampón³ 1 20

12 Muestra 1-Reacción A 1 20

13 Muestra 1-Reacción B 1 20

14 Muestra 1-Reacción C 1 20

15 Muestra 1-Reacción A 1 20

16 Muestra 1-Reacción B 1 20

17 Muestra 1-Reacción C 1 20

18 Blanco tampón³ 1 20 Tabla 4 : Secuencia típica de una serie de cromatografía

19 Muestra 2-Reacción A 1 20

20 Muestra 2-Reacción B 1 20

21 Muestra 2-Reacción C 1 20

22 Muestra 2-Reacción A 1 20

23 Muestra 2-Reacción B 1 20

24 Muestra 2-Reacción C 1 20

25 Patrón a alta conc- 1 20 idoneidad del sistema*

26 Blanco tampón³ 1 20

AL. N... 1 20

N + 1 Patrón a alta conc- 3 20 idoneidad del sistema ^b

N + 2 Lavado - - ^a El blanco tampón era una inyección sin material (es decir, contiene la fase móvil A solamente) . Pueden ser necesarias inyecciones de blanco adicionales para asegurar que la columna está limpia y equilibrada. Se recomienda que la segunda inyección de blanco se utilice para evaluar la limpieza de la columna. También debe realizarse una inyección de blanco como mínimo una vez cada 6 inyecciones de muestra o antes si fuera necesario (Blanco Tampón) .

b El patrón a baja concentración era galactosa 8 pmol y el patrón a alta concentración era galactosa 1500 pmol. Estos patrones de ensayo pretendían garantizar que los resultados de la muestra estaban dentro del intervalo lineal de las concentraciones más baja y más alta para el ensayo. El control de ensayo 1500 pmol también se utilizó como control de la idoneidad del sistema (por ejemplo, patrón a alta concentración- Tabla 4 : Secuencia típica de una serie de cromatografía

Idoneidad del sistema) durante la serie para monitorizar el rendimiento del electrodo y la columna y debe categorizarse cada 12 series de inyección de la muestra (es decir, cuatro conjuntos de muestras A, B y

C) .

° El blanco enzimático era una inyección que contenia las enzimas (es decir, β-galactosidasa y OC-sialidasa) y tampones sin ninguna muestra de proteina (es decir, Reacción C sin ningún analito de proteina) .

d Se utilizó fetuina bovina (una mezcla 1:1 de fetuina sialilada y asialofetuina) como control positivo para sialilación .

Ejemplo 4: Corrección y cálculo de los resultados

En la figura 2 se muestra un cromatograma representativo. Las áreas de todas las inyecciones de muestra se corrigieron mediante el área de desoxirribosa . Las correcciones se realizaron dividiendo el área del pico de galactosa por el área del pico de desoxirribosa. Este número corregido se utilizó a continuación para calcular el porcentaje de sialilación. Para calcular este porcentaje, se determinó la proporción de galactosa no recubierta con respecto a galactosa total utilizando la ecuación 1 :

Reacción C (Gal Total) - Reacción B (Gal sin

Porcentaje de recubrir)

recubrimiento (%) x 100

Reacción C (Gal Total) - Reacción A (Gal en

los medios)

Para calcular el porcentaje de recubrimiento, el área galactosa se dividió por el área de desoxirribosa para dar áreas de galactosa corregidas. El porcentaje de recubrimiento se calculó para cada una de las inyecciones por duplicado de una muestra utilizando las áreas corregidas. El área de galactosa corregida medida para la Reacción B se restó del área de galactosa corregida determinada a partir de la Reacción C; este valor corresponde a la cantidad de galactosa recubierta con sialilo. El área de galactosa corregida determinada para la Reacción A se restó a continuación del área de galactosa corregida medida para la Reacción C; este valor corresponde a la galactosa total (es decir, recubierta y sin recubrir) . La galactosa recubierta (C - B) se dividió por la galactosa total (C - A) y se multiplicó por 100 para dar el porcentaje de recubrimiento con sialilo. Los datos representativos se muestran en la tabla 5.

Tabla 5: Datos de recubrimiento de galactosa representativos

Muestra Area de Area de Area Porcentaje de Porcentaje de desoxirribosa galactosa corregida recubrimiento recubrimiento (nC x min) (nC x min) (nC x min) medio

Muestra 1-

4,597 0,162 0,035

Reacción A

Muestra 1-

4,523 0,537 0, 119 97,9 Reacción B

Muestra 1-

4,461 17,545 3,933

Reacción C

97,8

Muestra 1-

4,723 0,150 0,032

Reacción A

Muestra 1-

4,633 0,548 0, 118 97,7 Reacción B

Muestra 1-

4,557 17,48 3,763

Reacción C La idoneidad del sistema se monitorizó utilizando una mezcla de galactosa y desoxirribosa que se inyectó al comienzo de una serie y al final de la serie para monitorizar el rendimiento del electrodo y la columna durante toda la serie. El porcentaje de recubrimiento medio descrito se determinó a partir de las áreas corregidas de inyecciones por duplicado. Si el área del pico de galactosa en la Reacción B era menor que el área del pico de galactosa en el patrón de 8 pmol, entonces el porcentaje de recubrimiento se describió como ">% de [recubrimiento]" (es decir, "mayor que") calculado en base al área del pico de galactosa del patrón de 8 pmol en el numerador del cálculo. Se realizaron el cálculo del factor de cola (llamado "asimetría" en el software Chromeleon®) , placas teóricas y resolución y se determinaron mediante el software de adquisición de datos de Dionex. Los cálculos para los restantes criterios de idoneidad del sistema se determinaron de forma manual. Los parámetros de idoneidad del sistema representativos se muestran en la tabla 6.

Los criterios de aceptación del ensayo de idoneidad del sistema se muestran en la tabla 7.

Tabla 7 : Criterios de aceptación del ensayo de idoneidad del sistema

Parámetros para idoneidad del sistema Criterios

Porcentaje de diferencia del tiempo de

retención de desoxirribosa en la muestra

con respecto al tiempo de retención de ±5% desoxirribosa en la media del patrón a

alta y baja concentración

Porcentaje de diferencia del área de

galactosa del control de ensayo inicial

(patrón a alta concentración) e

inyecciones de control del ensayo de ±15% categorización (es decir, inyecciones de

idoneidad de sistema patrón a alta

concentración)

Porcentaje de diferencia del % de

recubrimiento de las muestras de ±2% recAlpha-1 por duplicado

Porcentaje de diferencia del resultado

del % de recubrimiento de control a

±3% del valor partir del resultado del % de

establecido recubrimiento establecido y esperado

previamente

Factor de cola (es decir asimetría)* 1±0, 2

Placas teóricas* >2000

Resolución* >8, 5

*E1 factor de cola se determinó utilizando el pico de desoxirribosa para cada inyección de muestra Ejemplo 5: Estequiometria de las reacciones de la muestra/enzimática y tiempo de digestión

Para optimizar la velocidad de la reacción enzimática, se analizó la proporción de enzima con respecto a proteína. La enzima β-galactosidasa es suministrada por el fabricante a una actividad de >3 Unidades/ml (actividad específica >6 Unidades/mg) , mientras que la enzima GC- sialidasa tiene una actividad de 5 Unidades/ml (actividad específica a 135 Unidades/mg) . La cantidad de cada enzima se mantuvo constante a 4 μΐ cada una, correspondiente a 0,012 Unidades de β-galactosidasa y 0,02 Unidades de GC- sialidasa en la reacción, mientras que la cantidad de proteína variaba de 540 a 2160 pmol. Las muestras analizadas eran una recAlpha-1 intercambiada con tampón y filtrada en sobrenadante de cultivo celular a una concentración de 1,4 mg/ml. Las muestras se prepararon tal como se muestra en la tabla 8.

Para cada estequiometria de reacción y punto temporal de digestión de recAlpha-1, se analizó el área del pico cromatográfico de galactosa y se determinó el porcentaje de recubrimiento. En la tabla 9 se muestra un resumen de los resultados, que demuestra que el valor de recubrimiento no cambia para ninguna de las condiciones estequiométricas . La estequiometría de reacción original (por ejemplo, 2,2 ^χ 1CT⁵ unidades /pmol de proteína) se estimó en base a las recomendaciones del fabricante. Sin embargo, estos resultados indican que las enzimas pueden ser excesivas en las condiciones recomendadas por el proveedor, incluso cuando la concentración de proteína se aumentó 4 veces. Dado este amplio intervalo dinámico de estequiometría, se seleccionó una condición estequiométrica "de punto medio" (es decir, aproximadamente 1,1 ^χ 1CT⁵ Unidades/pmol de proteína) para simplificar el procedimiento, minimizar el coste de la enzima y permitir la suficiente robustez en la preparación de la muestra.

La estequiometría de la reacción también se examinó comparando los resultados del recubrimiento para una muestra de recAlpha-1 aguas arriba (RAD-0637) preparada el Día 1 utilizando 4 μΐ de enzima en la reacción y el Día 2 (14 días más tarde), utilizando 2 μΐ de enzima. Los resultados del experimento muestran el mismo valor de recubrimiento para las cantidades enzimáticas de 2 μΐ y 4 μΐ, lo que indicaba que 2 μΐ de enzima eran suficientes para que la reacción continuara hasta completarse, lo que era coherente con la observación anterior (tabla 10) .

Ejemplo 6: Patrón interno

En este método de HPAEC-PAD, se utilizó un patrón interno para normalizar el área del pico de galactosa debido a la inherente variabilidad de la detección amperométrica en cada inyección. Inicialmente, se ensayaron dos patrones internos: galactosamina y desoxirribosa . Ambos patrones internos funcionaban adecuadamente y ambos se eluian en momentos suficientemente diferentes de la galactosa y no interferían en la cuantificación . Aunque la galactosamina se comportaba adecuadamente, se observaron algunas incoherencias en las áreas del pico que requerirían criterios de aceptación más amplios para monitorizar el rendimiento del sistema. Por consiguiente, la desoxirribosa se seleccionó como patrón interno. Además, la desoxirribosa se utiliza habitualmente como patrón en la industria para métodos de detección amperométrica . Las áreas para el pico de desoxirribosa mostraban menos variabilidad durante las largas secuencias de inyección y podían usarse con criterios de aceptación más estrechos.

Durante el desarrollo, se observaron varios casos de aumentos o disminuciones sin explicación del área de desoxirribosa. Sin embargo, en estas mismas muestras, a un aumento o disminución del área de desoxirribosa le seguía el cambio opuesto del pico de galactosa (tabla 11) .

Habitualmente , las fluctuaciones del área del pico podían explicarse como diferencias de la respuesta por parte del electrodo. Si éste fuera el caso, se esperaría que ambos picos aumentaran o disminuyeran. Se realizó un experimento en el que se añadió desoxirribosa a tres muestras pero no se mezcló. Las muestras se analizaron mediante HPAEC-PAD, a continuación se retiraron y se agitaron en vórtice para garantizar el mezclado de la muestra y el patrón interno. A continuación, se reinyectaron las muestras. Los resultados de estos experimentos muestran que la fluctuación de las áreas resulta del mezclado insuficiente de la muestra y el patrón interno. Esto sugiere que puede producirse la estratificación entre la solución de patrón interno y la muestra y los usuarios deben mezclar la reacción suficientemente antes de colocarla en la bandeja del procesador automático de muestras. Los resultados de estos experimentos se resumen en la tabla 12.

Ejemplo 7: Comparación de proveedores de enzima

Dado el carácter critico de la calidad de las enzimas β- galactosidasa y sialidasa para la velocidad de la reacción y la cuantificación de la galactosa, se compararon enzimas β-galactosidasa y OC-sialidasa de cuatro proveedores diferentes. El objetivo era calibrar la aptitud de la velocidad de la reacción que proporcionará una respuesta adecuada y establecer un proveedor suplente en caso de que las enzimas del proveedor principal ya no estuvieran disponibles en el mercado. Los proveedores seleccionados fueron Sigma, Glyko-Prozyme, New England BioLabs y QA Bio. Las enzimas de QA Bio se utilizaron para la mayoría de los experimentos descritos en el presente documento. Sigma fue eliminada cuando una reacción enzimática no produjo ninguna respuesta. Glyko-Prozyme también fue eliminado como opción cuando las áreas del pico de galactosa fueron iguales para muestras tratadas con β-galactosidasa a aquellas muestras tratadas tanto con β-galactosidasa como con a-sialidasa en dos experimentos diferentes (es decir, la actividad de -sialidasa era indetect able ) . Se prepararon experimentos comparativos directos que comparaban las enzimas de New England BioLabs y QA Bio y se realizaron el mismo día. Los resultados se compararon también con datos de días anteriores con las mismas muestras digeridas con enzimas de QA Bio. Las diferencias porcentuales entre las dos enzimas eran despreciables y la desviación estándar relativa (% de DER) para las varias series de ensayos indicaban que las enzimas β- galactosidasa y α-sialidasa de New England BioLabs eran comparables a las de QA Bio y podían usarse como proveedor suplente en el caso en el que las enzimas de QA Bio ya no estuvieran disponibles en el mercado. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 13. Tabla 13 : Resultados de muestras digeridas utilizando enzimas de QA Bio o New England BioLabs

Muestra Fecha del Fabricante de Porcentaje de análisis la enzima recubrimiento

Fetuina Día 1 QA Bio 49,5

Fetuina Día 5 QA Bio 52, 1

Fetuina Día 5 New England 52, 8

BioLabs

Media 51,5

Desv. Est. 1,74

% de DER 3,38

RAD0637 Día 1 QA Bio 97, 4

RAD0637 Día 15 QA Bio 97,2

RAD0637 Día 15 New England 97,6

BioLabs

Media 97,4

Desv. Est. 0,20

% de DER 0,21

Ejemplo 8: Tipo y preparación de la muestra

Dado que las muestras de proteína aguas arriba pueden contener 5 mg/ml de galactosa de medios de cultivo celular, se desarrolló un método de preparación de la muestra para eliminar la mayoría del exceso de galactosa de los medios, así como otros excipientes potencialmente interferentes . Esta limpieza sola no era suficiente para eliminar todas las impurezas del proceso, así que debe realizarse una limpieza adicional como parte de la preparación para el método de recubrimiento. Se evaluaron dos métodos de limpieza rápida: diálisis contra agua desionizada y filtrado en filtro de centrifugado a 10 kDa. El experimento utilizaba una muestra de recAlpha-1 intercambiada con tampón. En este experimento, se dializó una muestra contra agua desionizada durante 4 horas mientras que otra muestra se limpió simultáneamente utilizando un filtro de centrifugado de 10 kDa. Ambas muestras se analizaron a continuación mediante el método de recubrimiento. La conclusión del experimento era que los filtros de centrifugado de 10 kDa eran más efectivos en la eliminación de impurezas que la diálisis y permiten la preparación de hasta 30 muestras de una vez, con un tiempo de ejecución significativamente aumentado. Los cromatogramas de ambos procedimientos de limpieza que implicaban digestión con la Reacción C ( β-galactosidasa y OC-sialidasa) se muestran en la figura 3. La muestra filtrada por centrifugado se reconstituyó con agua desionizada y, por consiguiente, tenia una menor concentración que la muestra dializada. Aunque cantidades vestigiales de galactosa pueden seguir estando presentes después de la limpieza, todos los picos de fondo (es decir, Reacción A) se contaron posteriormente en el cálculo del porcentaje de recubrimiento restando el área del pico contaminado.

También se observó que algún excipiente o excipientes de los sobrenadantes del cultivo celular se eluyen poco después del pico de galactosa y, en algunos casos, aparecen como un reborde del pico en el pico de galactosa (véase la figura 4) . En dichos casos donde algunos excipientes residuales no pueden ser eliminados mediante el filtro de centrifugado de 10 kDa, la presencia de esta impureza se excluyó del área del pico de galactosa realizando integración "descendente" y no integrando el pico de impureza. Ejemplo 9: Especificidad

La especificidad es la capacidad del método para evaluar el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes, tales como impurezas, productos de degradación, matrices, etc. La especificidad del método se determinó preparando una mezcla de monosacáridos neutros y aminomonosacáridos disponibles en el mercado y analizando la mezcla mediante HPAEC-PAD. Los azúcares evaluados fueron fucosa, galactosamina, glucosamina y galactosa. Los azúcares se analizaron individualmente para confirmar los tiempos de retención y, a continuación, se analizaron como una mezcla para determinar la especificidad (figura 5) . La separación de monosacáridos era comparable a la observada en la Ficha Técnica 20 de Dionex, donde la galactosa se eluye después de los otros tres monosacáridos . Véase la Ficha Técnica 20 de Dionex, "Analysis of Carbohydrates by High Performance Anión Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection" [Análisis de carbohidratos mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada] (HPAE-PAD) , Dionex Corp. (2000) . Además, para muestras altamente impuras, es decir, sobrenadantes de cultivo celular, los niveles de fondo se analizaron para evaluar si cualesquiera excipientes interferentes estaban presentes y si se eliminaban mediante preparación de la muestra. Ejemplo 10: Linealidad

La linealidad del ensayo de sialilación HPAEC PAD es su capacidad para obtener resultados del ensayo que sean directamente proporcionales a la concentración o contenido de analito en un intervalo dado. Además, un intervalo derivado del estudio de linealidad se utilizó para confirmar el grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión alcanzable mediante el procedimiento. La linealidad para el método se evaluó preparando una curva de calibración patrón de galactosa con un intervalo óptimo de 8 pmol a 1,5 nmol (figura 6) . El coeficiente de determinación (coeficiente de regresión) era de 0,99 o mayor para el intervalo de 8 pmol a 1,5 nmol. Los residuales de regresión también se analizaron y mostraron no estar sesgados en ese intervalo. La curva de calibración puede ampliarse hasta 2 nmol y mantener una linealidad aceptable, pero con una pérdida de exactitud en el extremo inferior de la curva de calibración. El intervalo de la curva de calibración óptima se monitorizó en diferentes fechas, utilizando diferentes sistemas, columnas y electrodos de oro desechables de Dionex ICS- 3000. La tabla 14 resume estos resultados.

Tabla 14: Resumen de R-cuadrado, pendiente y ordenada en el origen para seis curvas de calibración

Ordenada

Fecha del

Instrumento R² Pendiente en el análisis

origen

Día 1 RTQ-0087 0,9999 0, 0276 0, 0435

Día 4 RTQ-0094 1,0000 0, 0279 -0, 0139

Día 11 RTQ-0094 0,9999 0,0263 0, 0342

Día 39 RTQ-0094 1,0000 0,028 0,0029

Día 42 RTQ-0094 1,0000 0, 0308 -0, 0553

Día 46 RTQ-0087 0,9998 0,0297 0, 1138 Ejemplo 11: Limite de cuantificación

El límite de cuantificación (LDC) del ensayo de sialilación HPAEC PAD indica la cantidad más baja de analito en una muestra que puede determinarse cuantitativamente con precisión y exactitud adecuadas. Hay varias maneras de calcular el LDC de un método cuantitativo. Un método se basa en la desviación estándar de la ordenada en el origen dividida por la pendiente media. Otro método se basa en el análisis visual del cromatograma . En primer lugar, se calculó el LDC del ensayo en base a la proporción señal con respecto a ruido de un cromatograma típico. Específicamente, el nivel de ruido en una región horizontal de 1 minuto del cromatograma se midió y se multiplicó por 10 para dar el LDC en términos de altura del pico. La altura del pico se convirtió a continuación en las cantidades en pmol en base a la altura del pico de los patrones de calibración. Los resultados del nivel de ruido se compararon con un patrón de calibración que producía una respuesta similar (véase la tabla 15) . El nivel de ruido se obtuvo en seis días diferentes en dos sistemas ICS-3000 diferentes. Estos resultados indican que los niveles de ruido en días diferentes dieron resultados similares (±0,02) y estaban aproximadamente al nivel del patrón de 8 pmol (diferencia de 0,12 nC χ min, que era insignificante en comparación con la altura del patrón de 1500 pmol a aproximadamente 70 nC x min) . Tabla 15 : Comparación del nivel de ruido en seis análisis para galactosa 8 pmol

Altura del

Diferencia

pico del

Fecha del del nivel de

Instrumento patrón análisis ruido x 10

galactosa 8 (nC x min)

pmol

Día 1 RTQ-0094 0,22 0,27

Día 7 RTQ-0087 0,25 0,40

Día 14 RTQ-0087 0,27 0,37

Día 28 RTQ-0087 0,22 0,36

Día 36 RTQ-0087 0,25 0,30

Día 37 RTQ-0087 0, 23 0, 45

Media 0,24 0,36

Dado que el nivel de ruido del cromatograma puede cambiar de instrumento a instrumento, el LDC se calculó también de una manera diferente. En base a los valores en la tabla 14 y específicamente en la desviación estándar de la ordenada en el origen (0,0577) dividida por la pendiente media (0,0283) y multiplicada por 10, se calculó que el LDC era de 20 pmol. Los dos métodos de cálculo del límite de cuantificación sugieren que LDC era de aproximadamente 8 a 20 pmol.

Ejemplo 12: Exactitud del método

La exactitud del método se determinó mediante la concordancia entre un patrón conocido y los resultados medidos experimentalmente . Dado que no hay ningún "estándar de oro" que sirva como referencia, la exactitud del método se determinó utilizando una mezcla a partes iguales de patrones de fetuina sialilada y asialofetuina disponibles en el mercado. El patrón de fetuina bovina sialilada y el patrón de asialofetuina se prepararon a concentraciones iguales según lo determinado mediante absorbancia UV a 280 nm (es decir, A280) . Los patrones se analizaron individualmente, a continuación se prepararon en una proporción 1:1 y se analizaron. El patrón de fetuina sialilada tenia un porcentaje de recubrimiento del 99,4% mientras que el patrón de asialofetuina tenia un porcentaje de recubrimiento del 1,2%, debido a que la cantidad de galactosa en la Reacción B es ligeramente superior a la Reacción C. En base a estos descubrimientos, el porcentaje de recubrimiento esperado para la mezcla de fetuina de control seria de aproximadamente el 50%. Se estableció que el resultado real para la mezcla de fetuina era del 49,3% en base a la media de múltiples series. Los resultados para el experimento se resumen en la tabla 16. Aunque no puede realizarse la derivación de variabilidad o exactitud exacta a partir de la medición a A280, estos resultados indican que este método era exacto dentro de unos pocos puntos de porcentaje. Además, este control de fetuina se analizó como parte de los estudios de precisión intermedios en días diferentes (véase la tabla 18 y la tabla 19, más adelante), y mostró tener una desviación estándar relativa (% de DER) del 3%. La utilización de dicho control se recomienda cada vez que se realiza el ensayo . Tabla 16: Resultados para patrones de fetuina para determinar la exactitud del método HPAEC-PAD

Area de Porcentaje

Porcentaje de

Fetuina Reacción galactosa de

recubrimiento

(nC x min) recuperación

Asíalo A 0

Asialo B 27,636 -1,2 100

Asialo C 27,301

Sialilada A 0

Sialilada B 0,182 99, 4 100

Sialilada C 28,808

Reacción A 0

Reacción B 14, 019 49, 3 99

Reacción C 27,657

Ejemplo 13: Reproducibilidad

La repetibilidad del ensayo se evaluó para la coherencia de los resultados obtenidos del método durante un corto intervalo del tiempo en las condiciones prescritas. La repetibilidad del método se determinó utilizando una muestra de sobrenadante de cultivo celular de recAlpha-1 en seis inyecciones duplicadas. La muestra de fondo (es decir, la Reacción A) no se analizó, dado que esta muestra se había analizado previamente y había mostrado no contener ninguna galactosa interférente . La desviación estándar relativa se determinó para el área de galactosamina, el área de galactosa y el porcentaje de recubrimiento en las seis inyecciones duplicadas. Los resultados se resumen en la tabla 17 y se muestran tanto corregidos mediante el área de galactosamina como sin corrección. Los datos muestran que la repetibilidad es de aproximadamente el 0,20%. Tabla 17: Reproducibilidad del método

Inyección Porcentaje de

Área de Área de Área

de Porcentaje de recubrimiento

Reacción galactosamina galactosa corregida

muestra recubrimiento sin

(nC x min) (nC x min) (nC x min)

No. corrección

1 B 14,681 1 ,364 0,093

96,8 96,5

1 C 13,408 39,026 2,911

2 B 14,917 1 ,359 0,091

96,8 96,6

2 C 13,851 39,396 2,844

3 B 14,865 1 ,389 0093

96,6 96,5

3 C 14,506 39,863 2,748

4 B 15,241 1 ,412 0,093

96,5 96,2

4 C 14,140 37,593 2,659

5 B 14,936 1 ,375 0,092

96,4 96,5

5 C 15,070 38,760 2,572

6 B 14,710 1 ,360 0,092

96,3 96,5

6 C 15,532 39,260 2,528

Gal sola 14,897 1,376 0,092

Media 96,6 96,5

Gal + Sal 14,418 38,983 2,70

Gal sola 0,201 0,021 0,001

Desv. Est. 0,19 0,11

Gal + Sal 0,786 0,775 0,151

Gal sola 1,35 1,50 0,82

% de DER 0,2 0,12

Gal + Sal 5,45 1,90 5,59

Ejemplo 14 : Precisión intermedia

Además del estudio de repetibilidad, el análisis de precisión intermedia incorporaba varios factores adicionales: días diferentes, ajuste de instrumentos diferente y diferente preparación de la muestra. La precisión intermedia del método se investigó preparando una muestra de recAlpha-1 de desarrollo del proceso aguas abajo (RAD-5904) para análisis de recubrimiento en tres días diferentes y a tres concentraciones diferentes. Para los análisis, se utilizaron diferentes sistemas de cromatografía Dionex ICS-3000, electrodos desechables, columnas AminoTrap, precolumnas y columnas analíticas. Los resultados muestran que la desviación estándar relativa (DER) de la muestra es del 0,25%. Además, los porcentajes de recubrimiento del control de fetuina preparado en los tres días de análisis también se compararon. La DER del control de fetuina era del 2,99%. Los resultados para la precisión intermedia de muestras de recAlpha-1 y el control de fetuina se resumen en la tabla 18 y la tabla 19, respectivamente. Las áreas se promediaron a partir de series por duplicado y no se corrigieron.

Tabla 18: Resultados de precisión intermedia para recAlpha-1

Volumen de Área Porcentaje de

Reacción

muestra (μΐ) (nC x min) recubrimiento

Dia 1

20 B 0,525

95, 7

20 C 12, 073

40 B 0, 7035

95,5

40 C 15, 756

80 B 0, 4335

95, 4

80 C 9,48

Dia 2

20 B 0, 491

95,9

20 C 12, 0425

40 B 0,6645

95, 7

40 C 15,396

80 B 0,3745

96, 2

80 C 9, 7415 Tabla 18: Resultados de precisión intermedia para recAlpha-1

Volumen de Área Porcentaje de

Reacción

muestra (μΐ) (nC x min) recubrimiento

Dia 3

20 B 0,554

95, 8

20 C 13,161

40 B 0,708

95,9

40 C 17, 434

80 B 0, 417

95,9

80 C 9,298

Media 95,7

Desv. Est. 0,24

% de DER 0,25

Tabla 19: Resultados de precisión intermedia para el control de fetuina

Reacción de Porcentaje de

Área (nC x min)

fetuina recubrimiento

Dia 1

B 14, 119

51, 8

C 29,281

Dia 2

B 13,679

49, 3

C 27, 002

Dia 3

B 18, 683

49, 1

C 36,676

Media 50,1

Desv. Est. 1,50

% de DER 2, 99 Ejemplo 15: Robustez

La robustez del ensayo es una medida de su capacidad para no ser afectado por pequeñas, pero deliberadas, variaciones en los parámetros del método o el manejo de la muestra. Se modificaron deliberadamente varios factores diferentes en unos pocos conjuntos de experimentos, tales como estabilidad del procesador automático de muestras, tiempo de reacción de la enzima, volumen de enzima e interferencia de la matriz.

Estabilidad de la muestra en el procesador automático de muestras

La robustez se determinó examinando la estabilidad de la muestra durante 48 horas en las condiciones del procesador automático de muestras de HPLC (es decir, 10°C) para determinar si la muestra que espera la inyección en el procesador automático de muestras a 10°C comprometería la calidad de los resultados. Una muestra preparada individualmente contenida en el procesador automático de muestras se inyectó a diversos intervalos y se determinó la respuesta de pico de las cantidades de galactosa para cada punto temporal. Los resultados se resumen en la tabla 20 y muestran un valor de desviación estándar relativa del 0,23%, coherente con la desviación estándar relativa determinada a partir de la precisión intermedia. Los resultados se muestran tanto corregidos mediante el área del pico de galactosamina como sin corrección. Estos datos indican que las muestras pueden mantenerse en el procesador automático de muestras durante hasta 48 horas antes de la inyección sin afectar a los resultados de recubrimiento . Tabla 20: Resultados para la estabilidad de la muestra en el procesador automático de muestras

Tiempo de reacción de la enzima

La robustez también se examinó modificando el tiempo de la reacción enzimática de 1 a 4 horas para explicar la variabilidad en diferentes velocidades de reacción para diferentes lotes de enzima. Se incubó una muestra a puntos temporales de 1, 2,5 y 4 horas y se analizó cada uno. Los resultados se resumen en la tabla 21 y muestran que aunque el porcentaje de recubrimiento era similar para los tres tiempos de reacción, la muestra de digestión de una hora era ligeramente inferior a las reacciones más largas. En base a estos datos, se determinó que una digestión de 2,5 horas es suficiente para que se realice la reacción hasta completarse. Dado que el método depende de la velocidad de reacción de dos enzimas, los resultados de porcentaje de recubrimiento inferior en el tiempo de reacción de 1 hora indican que la enzima sialidasa era la etapa limitante de la velocidad. Tabla 21: Resultados para los tiempos de reacción de la enzima

Volumen

Tiempo de Área de

de Porcentaje de

Reacción reacción galactosa

muestra recubrimiento

(h) (nC x min)

(μΐ)

40 B 1 0, 740

96, 4

40 C 1 20,617

40 B 2,5 0,638

96,6

40 C 2,5 18, 817

40 B 4 0,647

96,8

40 C 4 20, 323

Interferencia de la matriz

Aunque la interferencia del excipiente y de la matriz se abordó en la sección de especificidad, se realizó un estudio de enriquecimiento de la matriz para garantizar que la matriz aguas arriba no produce un sesgo de los resultados. Una muestra de Alpha-1 obtenida de plasma (PD Alpha-1) que contiene diferentes matrices se añadió a los medios de cultivo celular y el porcentaje de recubrimiento se midió utilizando el método descrito en el presente documento. Los medios seleccionados para el experimento contenían el nivel más alto de aditivos utilizado en experimentos de desarrollo aguas arriba, tales como medios CDM4PERMAB™ (Hyclone), Pluronic^® F-68 (BASF), Antifoam-C (Dow Corning^®), y diversos medios de cultivo celular. Se añadió Alpha-1 obtenida de plasma a los medios a una concentración de 0,5 mg/ml. La muestra se preparó a continuación utilizando el procedimiento de lavado habitual de intercambio con tampón en fosfato 20 mM, pH 7 seguido de filtrado por centrifugado a 10 kDa. El porcentaje de recubrimiento de la PD Alpha-1 añadida a los medios de cultivo se comparó con los resultados de recubrimiento para PD Alpha-1 que no se había añadido a los medios de cultivo celular (véase la tabla 22) . Los resultados muestran un porcentaje de recubrimiento del 99,4% para PD Alpha-1 añadida a los medios y del 99,2% (media) para PD Alpha-1 no añadida a los medios, lo que estaba dentro de la precisión intermedia asociada a este método. Estos resultados indican que los medios de cultivo celular no interfieren en el ensayo después de que las muestras se hayan sometido a las etapas de limpieza apropiadas .

Resumen

Los resultados obtenidos a partir de los experimentos de desarrollo y pre-cualificación se resumen en la tabla 23. En base a los estudios anteriores, este método se optimizó para la determinación de la tasa de recubrimiento en muestras de proteína. Los parámetros de linealidad, LDC, precisión, exactitud y robustez determinados para este ensayo muestran que este método era coherente, preciso y fiable .

Tabla 23: Resumen de los parámetros del método

Parámetros Experimento Resultados

Linealidad Seis curvas patrón del

área del pico frente a

R² ≥ 0,99 galactosa (de 8 a 1500

pmol )

Intervalo Intervalo de trabajo

de la concentración de < 1,5 mg/ml proteína

LDC 8 pmol de

galactosa/inyección

Repetibilidad Seis duplicados de

muestra el mismo

0,20% de DER día/en el mismo

instrumento

Precisión Recubrimiento

0, 25% de DER para intermedia calculado en base a

muestras de tres días, dos

recAlpha-1; 2,99% columnas, tres

para control de electrodos y dos

fetuina sistemas ICS 3000

Exactitud Proximidad del valor

97-103% de medio de fetuina al

recuperación valor preestablecido Tabla 23: Resumen de los parámetros del método

Parámetros Experimento Resultados

Robustez Estabilidad de la

muestra a 10 °C durante Sin efecto 48 h

Tiempo de reacción de

la enzima de 2 a 4 Sin efecto horas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para determinar el contenido de sialilación de una proteina que comprende:

(a) preparar una proteina para el análisis;

(b) tratar enzimáticamente la proteina preparada que comprende :

dividir la proteina preparada en una pluralidad de muestras de proteina, que comprenden

(i) como mínimo una muestra de proteína como muestra de los medios (Reacción A) ;

(ii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa a, como mínimo, una muestra de proteína (Reacción B) ;

(iii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa y 0C- sialidasa a, como mínimo, una muestra de proteína diferente (Reacción C) ; e

incubar la pluralidad de muestras de proteína; y

(c) analizar la pluralidad de muestras de proteína utilizando cromatografía HPAEC-PAD;

(d) determinar un contenido de carbohidratos para la pluralidad de muestras de proteína; y (e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína.

2. Método, según la reivindicación 1, que comprende además :

(f) analizar una pluralidad de controles positivos y negativos utilizando cromatografía HPAEC-PAD;

(g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC-PAD; y

(h) comparar la pluralidad de muestras de proteína con la pluralidad de patrones y controles.

3. Utilización de cromatografía HPAEC-PAD para determinar el contenido de sialilación de una proteína, que comprende :

(a) preparar una proteína para el análisis;

(b) tratar enzimáticamente la proteína preparada, que comprende :

dividir la proteína preparada en una pluralidad de muestras de proteína, que comprenden

(i) como mínimo una muestra de proteína como muestra de los medios (Reacción A);

(iii) añadir, como mínimo, β-galactosidasa y GC- sialidasa a, como mínimo, otra muestra de proteína (Reacción C) ; e

incubar la pluralidad de muestras de proteína; y

(d) determinar un contenido de carbohidratos para la pluralidad de muestras de proteína; y

(e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína .

4. Utilización, según la reivindicación 3, que comprende además :

(g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC-PAD; y

5. Kit para determinar el contenido de sialilación de cualquier proteina que comprende:

como mínimo, un recipiente que comprende una pluralidad de recipientes que comprenden cantidades medidas previamente de una galactosidasa y una sialidasa;

opcionalmente , recipientes que contienen, como mínimo, una composición tampón, una muestra de control positivo, una muestra de control negativo y patrones de carbohidratos, e

instrucciones que describen un método para determinar el contenido de sialilación de una proteína, que comprenden descripciones de:

(a) preparar una proteína para el análisis;

(b) tratar enzimáticamente la proteína preparada que comprende:

(ü) añadir, como mínimo, β-galactosidasa a, como mínimo, una muestra de proteína (Reacción B) ;

incubar la pluralidad de muestras de proteína; y

(e) calcular un porcentaje de sialilación para la proteína .

6. Kit, según la reivindicación 5, que comprende además:

(f) analizar un control positivo y negativo utilizando cromatografía HPAEC-PAD;

(g) analizar una pluralidad de patrones utilizando cromatografía HPAEC-PAD; y

(h) comparar los resultados de la pluralidad de muestras de proteína con los resultados de la pluralidad de patrones .