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WO2013005649A1 - 抗ヒトｃｃｒ６抗体 - Google Patents

抗ヒトｃｃｒ６抗体 Download PDF

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WO2013005649A1
WO2013005649A1 PCT/JP2012/066594 JP2012066594W WO2013005649A1 WO 2013005649 A1 WO2013005649 A1 WO 2013005649A1 JP 2012066594 W JP2012066594 W JP 2012066594W WO 2013005649 A1 WO2013005649 A1 WO 2013005649A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
ccr6
human
amino acid
seq
Prior art date
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Application number
PCT/JP2012/066594
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English (en)
French (fr)
Inventor
裕也 磯田
真美 小山
神田　豊
山野　和也
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Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons

Definitions

  • the present invention includes an antibody that binds to the extracellular region of sulfated human CCR6 and the antibody fragment, a hybridoma that produces the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, and a vector obtained by introducing the vector.
  • the present invention relates to a transformant obtained, a method for producing an antibody or antibody fragment using the hybridoma or the transformant, and a therapeutic agent and a diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment.
  • the human CC chemokine receptor 6 (CC chemokine receptor 6 or chemokine, CC motif, receptor 6) (hereinafter referred to as CCR6) is also known as chemokine receptor-like 3 (CKR-L3), YTL6PR, YTL4PR BN-1, DCCR2, DCR2, surface antigen classification (hereinafter referred to as CD) 196 (CD196), G protein-coupled receptor 29 (G protein-coupled receptor 29; GPR29), CMKBR6, CC-CKR- Also known as 6.
  • Human CCR6 was isolated and identified as orphan receptor CKR-L3 in 1996 by Pharmacia Upjohn (Non-patent Document 1). On the other hand, a gene encoding human CCR6 protein was cloned in 1997 as STRL22 (Non-patent Document 2). Further, the DNA sequence and amino acid sequence of human CCR6 are published on public databases and can be referred to from accession numbers such as NM_004367, NM_031409, and NP_004358, for example. However, the three-dimensional structure of human CCR6 protein has not yet been clarified.
  • Human CCR6 is a G protein-coupled receptor (GPCR) having a seven-transmembrane structure, and is a membrane protein consisting of a molecular weight of about 65 kDa and a total length of 374 amino acids.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the structural feature of human CCR6 is that an extracellular loop (hereinafter referred to as ECL) 1 and an extracellular loop 2 (ECL2) are intermolecular disulfide bonds, as is commonly recognized in many GPCRs.
  • ECL extracellular loop
  • ECL2 extracellular loop 2
  • Nt The N-terminal extracellular domain containing the 1st to 46th amino acid sequences of human CCR6 has 11 serine residues (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue (Ser) and 1 threonine residue). It is suggested from the results of in silico prediction experiments that there is a possibility that O-type sugar chains may be added to these Ser and Thr residues. In addition, there are two potential sites for N-linked sugar chain addition in Nt, and one site each in ECL1 and ECL3. However, in reality, N-linked sugar chains are added in vivo. Whether or not it is still unknown.
  • Non-Patent Document 4 the possibility of the 18th tyrosine residue present in Nt being sulfated is suggested from the results of in silico prediction experiments.
  • Non-Patent Document 5 the possibility of the 18th tyrosine residue present in Nt being sulfated is suggested from the results of in silico prediction experiments.
  • Non-Patent Document 5 the possibility of the 18th tyrosine residue present in Nt being sulfated is suggested from the results of in silico prediction experiments.
  • Non-Patent Document 5 the possibility of the 18th tyrosine residue present in Nt being sulfated is suggested from the results of in silico prediction experiments.
  • Non-Patent Document 5 the possibility of the 18th tyrosine residue present in Nt being sulfated is suggested from the results of in silico prediction experiments.
  • sulfation of Tyr residues existing in the N-terminal extracellular region has been confirmed in vitro, and these sulfated Tyr
  • IL interleukin
  • Non-patent Documents 7 and 8 As ligands that bind to human CCR6, chemokine types Mip-3 ⁇ (LARC / CCL20) and defensin ⁇ (defensin- ⁇ ) have been reported (Non-patent Documents 7 and 8). It has been revealed that macrophage inflammatory protein (Macrophage inflammatory protein 3 ⁇ ; Mip-3 ⁇ ) is secreted from macrophages and hepatocytes, and defensin ⁇ is secreted from epithelium, skin, oral cavity and trachea, respectively. It is known to be involved in the defense of infection by attracting to the local site of inflammation and also involved in the induction of inflammation.
  • Macrophage inflammatory protein 3 ⁇ is secreted from macrophages and hepatocytes
  • defensin ⁇ is secreted from epithelium, skin, oral cavity and trachea, respectively. It is known to be involved in the defense of infection by attracting to the local site of inflammation and also
  • Th17 cells Human CCR6 is expressed in Th17 cells.
  • Th1 cells involved in cellular immunity
  • Th2 cells involved in humoral immunity.
  • the Th17 cell is a helper T cell newly discovered in recent years as one of the subsets of helper T cells having different properties from Th1 cells and Th2 cells.
  • Th17 cells occupy about several percent of CD4 positive helper T cells in human blood. Th17 cells have the ability to produce inflammatory cytokines IL-17, IL-21 and IL-22 (Non-Patent Document 9), rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), It has been revealed that it is closely involved in the pathogenesis of autoimmune diseases such as inflammatory bowel disease (IBD), asthma, psoriasis and systemic lupus erythematosus (SLE) (Non-patent Documents 10-14).
  • IBD inflammatory bowel disease
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Th17 cells are currently attracting worldwide attention as new target cells for therapeutic drugs for autoimmune diseases. It has been revealed that most Th17 cells in human peripheral blood express CCR6 (Non-patent Documents 15-19). So far, human CCR6 has been used in various studies as a specific marker for Th17 cells.
  • Th17 cells have been implicated in HIV infection, graft-versus-host disease (GVHD), periodontal disease, and the like (Non-patent Documents 20-22).
  • Human CCR6 is also expressed in Th1 / 17 cells, ⁇ T cells, Th22 cells, memory B cells, naive B cells, some CD8 cells and some Th1 cells in addition to Th17 cells. Have also been reported to be associated with autoimmune diseases (Non-Patent Documents 23-29). Furthermore, it is known that human CCR6 is also expressed in a cell group (population) having IL-17 production ability among regulatory T cells (regulatory T cell; Treg) (Non-patent Document 30). In recent years, cells of the innate immune system called Innate Lymphoid cells (innate immunity lymphoid cells; ILC) have been revealed (Non-patent Document 31), and some of them (ILC17 or ILC2 etc.) are human CCR6. Has been reported to be associated with the expression of cerebral dysfunction and disease state (IBD or sinusitis) (Non-patent Documents 32-34).
  • CCR6 expression has also been confirmed in cancers such as liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, and colon cancer, and is considered to be related to cancer growth, invasion, and metastasis (Non-patent Document 35-). 38).
  • anti-CCR6 antibody examples include 53103 (R & D systems), 11A9 (BD Pharmingen), 4C6 (ATGen), R6H1 (eBioscience), TG7 (BioLegend) or MM (abcam). It has been known.
  • the present invention relates to an antibody that binds to sulfated human CCR6 and the antibody fragment, a hybridoma that produces the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, and a trait obtained by introducing the vector. It is an object of the present invention to provide a transformant, a method for producing an antibody or the antibody fragment using the hybridoma or the transformant, and a therapeutic agent and a diagnostic agent using the antibody or the antibody fragment.
  • CCR6 CC chemokine receptor 6
  • the antibody and the antibody fragment according to (1) or (2), wherein the epitope to which the antibody and the antibody fragment bind includes at least the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • CDRs Antibody variable regions comprising CDR1 to chain variable regions 1 to 3
  • the antibody variable region comprising CDR1 to CDR3 of the antibody light chain variable region, and the CDR1 to CDR3 of the antibody heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 80 to 82 and represented by SEQ ID NOs: 83 to 85, respectively.
  • An antibody comprising any one antibody variable region selected from antibody variable regions comprising CDR1 to CDR3 of an antibody light chain variable region comprising an amino acid sequence.
  • B An antibody that competitively reacts with any one antibody selected from the antibodies represented by (a) and the antibody fragment.
  • C An antibody that reacts with an epitope including an epitope with which any one antibody selected from the antibodies represented by (a) reacts, and the antibody fragment.
  • (F) An antibody that competitively reacts with any one antibody selected from the antibodies represented by (d) above and the antibody fragment.
  • G An antibody that reacts with an epitope including an epitope with which any one antibody selected from the antibodies represented by (d) reacts, and the antibody fragment.
  • H An antibody that reacts with the same epitope as the epitope with which any one antibody selected from the antibodies represented by (d) reacts, and the antibody fragment.
  • antibody fragment from a peptide comprising Fab, Fab ′, (Fab ′) 2 , single chain antibody (scFv), dimerized V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv) and CDR The antibody fragment according to any one of (1) to (9), which is selected.
  • (11) A DNA encoding the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10).
  • a transformant obtained by introducing the vector containing the DNA described in (11) is cultured in a medium, and the antibody or the antibody fragment described in any one of 1 to 10 is produced in the culture.
  • a diagnostic agent for a disease involving human CCR6-positive cells comprising the antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (10) as an active ingredient.
  • the diagnostic agent according to (14), wherein the disease involving human CCR6-positive cells is a disease selected from cancer and autoimmune diseases.
  • the diagnostic agent according to (14) or (15), wherein the human CCR6-positive cell is at least one cell selected from naive / memory B cells, Th1 / 17 cells, Th17 cells, and Th22 cells.
  • a therapeutic agent for a disease involving human CCR6-positive cells comprising the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10) as an active ingredient.
  • the therapeutic agent according to (17), wherein the disease involving human CCR6-positive cells is a disease selected from cancer and autoimmune diseases.
  • the therapeutic agent according to (17) or (18), wherein the human CCR6-positive cells are at least one cell selected from naive / memory B cells, Th1 / 17 cells, Th17 cells and Th22 cells.
  • a method for diagnosing a disease involving human CCR6-positive cells comprising detecting or measuring human CCR6-positive cells using the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10).
  • (21) Use of the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (10) for producing a diagnostic agent for a disease involving human CCR6-positive cells.
  • (22) Use of the antibody or antibody fragment thereof according to any one of (1) to (10) for producing a therapeutic agent for a disease involving human CCR6-positive cells.
  • an antibody that binds to sulfated human CCR6 and the antibody fragment a hybridoma that produces the antibody, a DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, and a transformant obtained by introducing the vector , A method for producing an antibody or antibody fragment using the hybridoma or the transformant, and a therapeutic agent and a diagnostic agent using the antibody or antibody fragment.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the cloning of the human CCR6 gene.
  • FIG. 2 (a) shows a schematic diagram of the construction of the human CCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6.
  • FIG. 2 (b) shows a schematic diagram of the construction of Tc26-hCCR6.
  • FIGS. 3 (a) and (b) show the results of FCM analysis of the CCR6 expression level on the cell surface of human CCR6-expressing cells CHO-hCCR6 [FIG. 3 (a)] and CHOK1-hCCR6 [FIG. 3 (b)]. Show.
  • FIG. 3 (c) shows the result of FCM analysis for the hCCR6-His tag expressed in CHO-hCCR6.
  • FIG. 4 (a) and 4 (b) show the results of FCM analysis of the CCR6 expression level on the cell surface of human CCR6-expressing cells U937-CCR6 [FIG. 4 (a)] and CCR6G16 [FIG. 4 (b)].
  • the vertical axis represents the number of cells and the horizontal axis represents the fluorescence intensity [FIG. 4 (a) is FL1, FIG. 4 (b) is FL3].
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the construction of various human mouse chimeric CCR6 expression vectors.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the construction of various human mouse chimeric CCR6 expression vectors.
  • FIGS. 7 (a) to (g) show the results of analyzing the expression level of human mouse chimeric CCR6 on the cell surface of various cells by FCM using an anti-human CCR6 monoclonal antibody.
  • Parent strains CHO / DG44 [FIG. 7 (a)] Various human mouse chimeric CCR6-expressing cells [CHO-mECL2hCCR6 [FIG. 7 (b)], CHO-mNthCCR6 [FIG. 7 (c)], CHO-mECL3hCCR6 [FIG. 7 (d) )], CHO-mECL1hCCR6 [FIG.
  • FIG. 7 (e) CHO-hCCR [FIG. 7 (f)] and CHO-mNt-hCCR6 [FIG. 7 (g)]
  • the expression level of human mouse chimeric CCR6 on the cell surface The result analyzed by FCM using an anti-human CCR6 monoclonal antibody is shown.
  • the vertical axis represents the number of cells and the horizontal axis represents the fluorescence intensity [FIG. 7 (a) to FIG. 7 (f) is FL1, FIG. 7 (g) is FL2].
  • 8A to 8D show various human mouse chimeric CCR6-expressing cells [CHO-mNthCCR6 [FIG. 8 (a)], CHO-mECL1hCCR6 [FIG.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of the construction of a human CCR6 N-terminal extracellular domain expression vector pKANTEX / NthCCR6-IgG4Fc fused with the Fc region of human IgG4.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE analysis of human CCR6 N-terminal extracellular domain Fc fusion protein NthCCR6-IgG4Fc digested with glycosidase.
  • FIG. 10 shows a schematic diagram of the construction of a human CCR6 N-terminal extracellular domain expression vector pKANTEX / NthCCR6-IgG4Fc fused with the Fc region of human IgG4.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-PAGE analysis of human CCR6 N-terminal extracellular domain Fc fusion protein NthCCR6-IgG4Fc digested with glycosidase.
  • FIG. 12 shows the result of binding ELISA of anti-human CCR6 monoclonal antibody against human CCR6 N-terminal extracellular domain Fc fusion protein NthCCR6-IgG4Fc.
  • the vertical axis shows the binding activity (OD415 / 490), and the horizontal axis shows the type of protein reacted.
  • FIG. 13 shows the results of SDS-PAGE analysis of purified anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704 and KM4705.
  • FIG. 14 shows information on instructions for commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies.
  • FIGS. 15 (a)-(d) show anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592 [FIG.
  • the vertical axis represents binding activity (mean fluorescence intensity; MFI), and the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL).
  • FIGS. 16 (a) to (c) show anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704 and KM4705 and commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies, human CCR6-expressing cells CHO-hCCR6, various human mouse chimeric CCR6-expressing cells CHO-mNthCCR6.
  • the result of having analyzed the binding activity with respect to CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-mECL3hCCR6 by FCM is shown.
  • the vertical axis represents the binding activity (mean fluorescence intensity; MFI), and the horizontal axis represents each CCR6-expressing cell.
  • FIG. 17 (a) and (b) show the N-terminal extracellular domain amino acid sequence of human CCR6 and the synthetic peptide used in the binding ELISA.
  • 18 (a) and (b) show the results of binding ELISA analysis of the binding activity of anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies to various human CCR6 N-terminal partial peptides. Show.
  • FIG. 18 (a) shows the results of anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592 and KM4705 and commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies, and FIG.
  • 18 (b) shows the results of anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4703 and KM4704 antibodies.
  • the vertical axis represents the binding activity (OD415 / 490), and the horizontal axis represents the type of peptide reacted.
  • 19 (a)-(h) show the commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibody 53103 [FIG. 19 (a)], R6H1 [FIG. 19 (b)], 11A9 [FIG. 19 (d)] and MM [FIG. d)], and the NthCCR6-IgG4Fc protein of the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592 [FIG. 19 (e)], KM4703 [FIG.
  • FIGS. 19 (a) to 19 (h) show typical sensorgrams of the respective antibodies obtained from the Biacore analysis results.
  • the vertical axis represents antibody reactivity (RU), and the horizontal axis represents time (sec) after antibody injection.
  • FIG. 20 (a) shows a schematic diagram of a calcium assay system for measuring an increase in intracellular calcium by a human CCR6-specific ligand Mip-3 ⁇ -dependent human CCR6 signal using human CCR6-expressing nalwa cells.
  • FIG. 21 shows a schematic diagram of cloning of a gene encoding the KM4705 antibody variable region of the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, and KM4704 and preparation of an anti-human CCR6 chimeric antibody expression vector.
  • 22 (a)-(d) show the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4592 chimera [FIG.
  • FIG. 22 (d) shows the results of FCM analysis of the binding activity to human CCR6-expressing cell CHO-hCCR6 and cynomolgus CCR6-expressing cell CHO-cynomolgus CCR6.
  • the vertical axis represents binding activity (mean fluorescence intensity; MFI), and the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL).
  • FIG. 23 shows anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera and KM4705 chimera human CCR6-expressing cell CHO-hCCR6, various human mouse chimeric CCR6-expressing cells CHO-mNthCCR6, CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-
  • the vertical axis represents the binding activity (mean fluorescence intensity; MFI), and the horizontal axis represents each CCR6-expressing cell.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 24 shows the result of binding ELISA analysis of the binding activity of anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera, and KM4705 chimera to various human CCR6 N-terminal partial peptides.
  • the vertical axis represents the binding activity (OD415 / 490), and the horizontal axis represents the peptide used.
  • FIG. 25 shows the neutralizing activity of the anti-human CCR6 chimeric antibody in the Mip-3 ⁇ -dependent intracellular calcium increase assay system using human CCR6-expressing namalwa cells.
  • the vertical axis shows the increase in intracellular calcium (%), and the horizontal axis shows the anti-human CCR6 chimeric antibody added.
  • 26 (a) and 26 (b) show effector cells obtained by isolating PBMCs isolated from healthy human peripheral blood [donor number # 11-067 [FIG. 26 (a)] and # 11-068 [FIG. 26 (b)]].
  • 2 shows the antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) of the anti-CCR6 antibody against human CCR6-expressing CHO cells (CHO-hCCR6) used as.
  • the horizontal axis represents the concentration (ng / mL) of each antibody, and the vertical axis represents the cytotoxic activity rate (%).
  • FIGS. 27 (a) and (b) show anti-T and B cells in PBMC isolated from peripheral blood of healthy individuals [donor number # 45 [FIG. 27 (a)] and 95 [FIG. 27 (b)]].
  • the removal activity of CCR6 antibody is shown.
  • the ratio of the number of various living cells is shown on the vertical axis when the number of memory T cells, naive T cells or B cells in the sample treated with the anti-DNP antibody is 100%.
  • the horizontal axis indicates the name of the treated antibody.
  • the present invention relates to an antibody that binds to sulfated human CCR6 and the antibody fragment.
  • the antibody and the antibody fragment of the present invention include an antibody that binds to the extracellular region of sulfated human CCR6 and the antibody fragment.
  • the extracellular region of human CCR6 preferably contains the 1st to 46th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the epitope to which the antibody of the present invention and the antibody fragment bind preferably contains at least the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the ninth to 23rd amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 More preferably, the amino acid is included.
  • the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably sulfated.
  • an antibody of the present invention specifically, an antibody containing the 18th Tyr in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of sulfated human CCR6 as an epitope and a protein represented by sulfated SEQ ID NO: 2 of human CCR6 And an antibody containing the 18th Tyr of the amino acid sequence as an epitope.
  • the antibody of the present invention has a high affinity for human CCR6 and binds to an epitope containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • An antibody having a sum activity is mentioned.
  • the antibody of the present invention has a high affinity for human CCR6 and binds to an epitope containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And antibodies having antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity).
  • the antibodies of the present invention include antibodies that bind to sulfated human CCR6 and not to unsulfated human CCR6, specifically bind to human CCR6 containing sulfated amino acid residues, and An antibody that does not bind to human CCR6 containing an unsulfated amino acid residue, and specifically binds to an epitope containing the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of human CCR6 and Examples thereof include an antibody that does not bind to an epitope containing the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 that is not sulfated.
  • antibody of the present invention include antibodies selected from the following (a) to (d).
  • CDR Complementarity determining regions
  • VH sequences of antibody heavy chain variable regions
  • V regions Antibody variable regions
  • VL comprising CDR1 to CDR3 of an antibody light chain variable region (hereinafter referred to as VL) comprising the amino acid sequences represented by numbers 59 to 61, represented by SEQ ID NOs: 68 to 70, respectively.
  • VH CDRs 1 to 3 containing the amino acid sequences shown below and V regions containing CDRs 1 to 3 of the VL containing amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 71 to 73, respectively, and amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 80 to 82, respectively.
  • VH CDR1-3 and VL C comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 83-85, respectively Antibodies comprising any one of V regions selected from V region containing the R1 ⁇ 3.
  • B An antibody that competitively reacts with any one antibody selected from the antibodies represented by (a) above.
  • C An antibody that reacts with an epitope including an epitope to which any one antibody selected from the antibodies represented by (a) reacts.
  • D An antibody that reacts with the same epitope as that to which any one antibody selected from the antibodies represented by (a) reacts.
  • an antibody selected from the following (e) to (h) can be mentioned.
  • KM4592 is an example of an anti-human CCR6 monoclonal antibody comprising a V region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 and a V region comprising VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55. It is done.
  • One embodiment of an anti-human CCR6 monoclonal antibody comprising a V region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 64 and a V region comprising VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67 is KM4703.
  • an anti-human CCR6 monoclonal antibody comprising a V region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 76 and a V region comprising VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79 is KM4704.
  • One embodiment of the anti-human CCR6 monoclonal antibody comprising a V region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 88 and a V region comprising VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 91 is KM4705.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that binds to both sulfated human CCR6 and non-sulfated CCR6, and a human in which the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is sulfated.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that binds to the 1st to 23rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the 9th to 17th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Antibodies that bind to epitopes comprising are also included. Specifically, anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4705, an antibody that reacts with an epitope containing an epitope to which KM4705 reacts, an antibody that reacts with the same epitope as that to which KM4705 reacts, and the like.
  • An antibody that reacts with an epitope including the epitope to which the antibody of the present invention reacts has the same or a part of the same epitope (also referred to as an antigenic determinant) as the antibody of the present invention in human CCR6, and binds to the epitope refers to an antibody.
  • An antibody that reacts with the same epitope as that to which the antibody of the present invention reacts refers to an antibody that can recognize and bind to the same amino acid residue on human CCR6 recognized by the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that specifically binds to the N-terminal region of human CCR6 and has neutralizing activity of human CCR6, an antibody that specifically binds to the N-terminal region of human CCR6 and has ADCC activity, sequence An antibody that binds to amino acids 9 to 23 of the amino acid sequence represented by No. 2 and has human CCR6 neutralizing activity and an epitope comprising amino acids 9 to 23 of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 2 Antibodies that bind and have ADCC activity are also included.
  • human CCR6 comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And a polypeptide having the function of human CCR6, and a polypeptide having 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, most preferably 95 And a polypeptide having an amino acid sequence having a homology of at least% and having the function of human CCR6.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold. Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] etc., for example, can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human CCR6 include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, NCBI accession number NM_004367 or NM_031409. Consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, a base sequence of NCBI accession number NM_004367 or NM_031409, wherein one or more bases are deleted, substituted or added, And a gene comprising a DNA encoding a polypeptide having the function of human CCR6, a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, NCBI accession number NM_004367 or NM_031409 and at least 60 base sequences
  • a polypeptide comprising a human CCR6 function comprising a base sequence having a homology of at least%, preferably a base sequence having a homology of at least 80%, more preferably a base
  • a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, NCBI accession number NM_004367 or NM_031409 is used as a probe.
  • a hybridizable DNA obtained by a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, a DNA microarray method, etc. specifically, derived from a hybridized colony or plaque Hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L sodium chloride using a filter or slide glass on which DNA or a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized Shon method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, After Oxford University, (1995)], the SSC solution with a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution with a concentration of 1 consists of 150 mmol / L sodium chloride and 15 mmol / L sodium citrate) The used, mention may be made of DNA that can be identified by washing the filter or slide
  • the DNA capable of hybridizing is the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, DNA having at least 60% homology with the base sequence of NCBI accession number NM_004367 or NM_031409, preferably Can include DNA having a homology of 80% or more, more preferably DNA having a homology of 95% or more.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such polymorphism, and is also included in the gene encoding human CCR6 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art unless otherwise specified, but the base sequence may be BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997), Genome Res. , 7, 649 (1997), http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo / information3. numerical value calculated using default parameters in htmL].
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 if blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value f If the r aligned alignment in bits) is 15 and -Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, it is 25 for programs other than blastn (http: // www. gov / blast / htmL / blastcgihelp.
  • a polypeptide containing a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is prepared. It can be produced by culturing a transformant that has been deleted and into which an expression vector containing the deletion has been introduced. Further, based on the polypeptide or DNA prepared by the above method, an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 by the same method as described above. Polypeptides containing can be obtained.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in FIG. 1 is fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc). Or a chemical synthesis method such as t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is converted into a known transmembrane region prediction program SOSUI (http://bp.nuap.nagaya-u.ac.jp/SOSUI). /SOSUI_submit.html), TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html), TMHMM ver. 2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) or ExPAsy Proteomics Server (http://Ca.expasy.org/) It is done.
  • the N-terminal extracellular domain from the N-terminal which is the extracellular domain predicted in TMpred, is from the N-terminal extracellular domain
  • the 100-th to 117-th are extracellular loop (hereinafter abbreviated as ECL) 1, 178-th.
  • ECL2 extracellular loop
  • ECL3 extracellular loop
  • ECL3 extracellular loop
  • the extracellular region of human CCR6 in the present invention may be any structure as long as the extracellular region of human CCR6 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a structure equivalent to a structure that can be taken in the natural state. Good.
  • the structure that the extracellular region of human CCR6 can take in the natural state refers to the natural three-dimensional structure of human CCR6 expressed on the cell membrane.
  • That the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof specifically recognizes the natural three-dimensional structure of the extracellular region of human CCR6 and binds to the extracellular region is a radioimmunoassay using a solid phase sandwich method or the like, Alternatively, a known immunological detection method for cells expressing human CCR6 using an enzyme immunoassay (ELISA) or the like, preferably a binding property of a cell expressing a specific antigen such as a fluorescent cell staining method and an antibody to the specific antigen Can be examined.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FCM flow cytometry
  • Biacore Biacore
  • the cell expressing human CCR6 may be any cell as long as it expresses human CCR6.
  • a cell naturally existing in the human body a cell line established from a cell naturally existing in the human body, Or the cell obtained by the gene recombination technique etc. are mentioned.
  • Examples of the cells naturally present in the human body include cells in which the polypeptide is expressed in the human body.
  • cells in which the polypeptide is expressed in the human body include cells in which the polypeptide is expressed in the human body.
  • Th17 cells Th1 / 17 cells, ⁇ T cells, Th22 cells, memory / naive B cells, Some CD8 cells, some Th1 cells and some ILCs.
  • human CCR6 As a cell line established from cells naturally existing in the human body, among cell lines obtained by establishing cells expressing the human CCR6 obtained from the human body, the human CCR6 is expressed.
  • Cell lines For example, human liver cancer cell line HepG2, human colon cancer cell line Cano-2, human colon cancer cell line HT-29, human T cell leukemia cell lines HUT102 and MT-2, which are cell lines established from humans, etc. Can be mentioned.
  • cells obtained by gene recombination techniques specifically express human CCR6 obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding human CCR6 into insect cells or animal cells, for example. Cell and the like.
  • sulfated human CCR6 refers to CCR6 in which a sulfate molecule is bound to the OH substituent of a tyrosine residue (Tyr residue) present in the amino acid sequence of human CCR6.
  • Figure 3 shows human CCR6 containing at least one sulfated Tyr residue.
  • the Tyr residue to be sulfated may be any Tyr residue in the amino acid sequence of human CCR6, and preferably includes a Tyr residue present in the extracellular region of human CCR6.
  • human CCR6 examples include the 1st to 50th N-terminal domains of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, ECL1, ECL2 and ECL3, preferably the N-terminal domain.
  • sulfated human CCR6 examples include human CCR6 in which the 18th Tyr residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is sulfated.
  • TPSTs tyrosyl protein sulfotransferases
  • Examples of the monoclonal antibody in the present invention include an antibody produced by a hybridoma or a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by a single clone of antibody-producing cells, recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary sequence) constituting the monoclonal antibody.
  • epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences, an amino acid sequence modified by post-translational modification, and a three-dimensional structure composed of the amino acid sequences.
  • amino acid sequences modified by post-translational modification include, for example, an O-linked sugar chain bonded to Tyr and Ser having an OH substituent, and an N-linked sugar bonded to Gln and Asn having an NH 2 substituent.
  • An amino acid sequence in which a sulfate group or the like in which a chain and a sulfate molecule are bonded to Tyr having an OH substituent is bound.
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds includes an epitope containing a sulfated Tyr residue contained in the extracellular region of human CCR6.
  • a sulfated Tyr residue contained in the 1st to 46th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferable, and is contained in the 9th to 46th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a sulfated Tyr residue is more preferred, and a sulfated Tyr residue contained in the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is more preferred, and the 18th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Most preferred are sulfated Tyr residues.
  • examples of the epitope to which the antibody of the present invention binds include an epitope containing a sulfated Tyr residue and an epitope containing a non-sulfated Tyr residue contained in the extracellular region of human CCR6.
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds is a deletion in which a partial domain of human CCR6 is deleted, or a mutant in which a domain derived from another protein is substituted, and a partial peptide fragment of human CCR6, etc. This can be determined by conducting a binding experiment.
  • the epitope recognized by the antibody of the present invention specifically recognizes sulfated Tyr in the N-terminal extracellular region of human CCR6, and has a different amino acid sequence (including post-translational modifications) or three-dimensional structure from that of commercially available anti-human CCR6. Structure. Specific recognition of sulfated Tyr in the N-terminal extracellular region of human CCR6 means that human CCR6 that binds to human CCR6 whose N-terminal extracellular region is sulfated and whose N-terminal extracellular region is not sulfated. Means not to be combined.
  • epitope recognized by the antibody of the present invention include an epitope containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • An epitope containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by SEQ ID NO: 2 when binding of the antibody to a partial peptide containing the human CCR6N-terminal extracellular region is confirmed. It has high binding activity to the partial peptide containing amino acids 9 to 23 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which the 18th tyrosine of the amino acid sequence is sulfated, and is represented by SEQ ID NO: 2 that is not sulfated. This means that the binding activity to the partial peptide containing the 9th to 23rd amino acids in the amino acid sequence is reduced or absent.
  • the epitope recognized by the antibody of the present invention also includes an epitope comprising the first to 23rd amino acids, particularly the ninth to 17th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • human CCR6 functions include CCR6 activation dependent on human CCR6-specific ligand, activation of G protein (G protein), increase of intracellular calcium, influx of extracellular calcium, cell Examples include proliferation, cell migration, and cell differentiation.
  • G protein G protein
  • neutralizing activity refers to activity that inhibits any of the functions of human CCR6 described above.
  • human CCR6-specific ligands macrophage inductive protein-3 ⁇ (Mip-3 ⁇ ), CC chemokine receptor ligand 20 (CCL20), and defensin- ⁇ are known.
  • the neutralizing activity of the antibody of the present invention was obtained by simultaneously adding a human CCR6-specific ligand such as Mip-3 ⁇ and an antibody to a CCR6-expressing cell into which a human CCR6 gene was introduced or a cell line naturally expressing CCR6.
  • a human CCR6-specific ligand such as Mip-3 ⁇
  • an antibody to a CCR6-expressing cell into which a human CCR6 gene was introduced or a cell line naturally expressing CCR6.
  • FDSS manufactured by Hamamatsu Photonics
  • FLIPR manufactured by Molecular Devices
  • NOVOstar manufactured by BMG LABTECH
  • FlexSTATION manufactured by Molecular Devices
  • x ViewL PerkinElmer, IN Cell analyzer (GE Healthcare) or ArrayScan (Thermo Scientific) can be used for measurement.
  • high neutralizing activity means stronger neutralizing activity than known anti-human CCR6 antibodies or commercially available anti-human CCR6 antibodies, and is 2 times, 3 times, 4 times stronger than existing antibodies.
  • affinity means the affinity with which the antibody of the present invention binds to human CCR6, and is measured by kinetic analysis.
  • Biacore T100 manufactured by GE Healthcare
  • affinity more preferably 1.5 ⁇ 10 9 (mol / L) or less is mentioned.
  • the antibody that binds to human CCR6 extracellular domain with high affinity a antibody having sufficient affinity as therapeutic antibodies, existing dissociation constant K D of 1.5 ⁇ 10 9 (mol / L ) (M) refers to binding to human CCR6 with the following affinity.
  • an antibody having high ADCC activity refers to a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)], an ADCC activity higher than that of a commercially available anti-human CCR6 antibody when simultaneously measuring the ADCC activity of a plurality of antibodies.
  • Antibody molecules are also referred to as immunoglobulins (hereinafter referred to as Ig), and human antibodies are classified into IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM isotypes according to the difference in molecular structure. Is done. IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 having relatively high amino acid sequence homology are collectively referred to as IgG.
  • Antibody molecules are composed of polypeptides called heavy chains (hereinafter referred to as H chains) and light chains (hereinafter referred to as L chains).
  • H chains is an H chain variable region (also expressed as VH)
  • H chain constant region also expressed as CH
  • L chain is also expressed as an L chain variable region (VL) from the N terminal side.
  • CL Each region of the L chain constant region (also expressed as CL).
  • CH has known ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains for each subclass.
  • CH is further composed of each domain of the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain from the N-terminal side.
  • a domain refers to a functional structural unit constituting each polypeptide of an antibody molecule.
  • the CH2 domain and the CH3 domain are collectively referred to as an Fc region or simply Fc.
  • CL C ⁇ chain and C ⁇ chain are known.
  • the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, CH3 domain, and Fc region are EU indexes [Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] can be specified by the number of amino acid residues from the N-terminus.
  • CH1 is an amino acid sequence of EU indexes 118 to 215
  • hinge is an amino acid sequence of EU indexes 216 to 230
  • CH2 is an amino acid sequence of EU indexes 231 to 340
  • CH3 is an EU index 341 to 447. Each amino acid sequence is identified.
  • antibodies of the present invention include gene sets such as human chimeric antibodies (hereinafter also simply referred to as “chimeric antibodies”), humanized antibodies (also referred to as complementarity determining regions (CDR) transplanted antibodies), and human antibodies. Replacement antibodies are also included.
  • chimeric antibodies hereinafter also simply referred to as “chimeric antibodies”
  • CDR complementarity determining regions
  • the chimeric antibody means an antibody composed of VH and VL of an antibody other than an animal (non-human animal) and CH and CL of a human antibody.
  • non-human animal any mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used as long as it can produce a hybridoma.
  • a hybridoma is a cell that produces a monoclonal antibody having a desired antigen specificity obtained by fusing a B cell obtained by immunizing a non-human animal with a myeloma cell derived from a mouse or the like.
  • the variable region constituting the antibody produced by the hybridoma consists of the amino acid sequence of a non-human animal antibody.
  • Human chimeric antibodies are obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from non-human animal cell-derived hybridomas producing monoclonal antibodies, and expressing them as expression vectors for animal cells having DNAs encoding human antibodies CH and CL, respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector is constructed by insertion and can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • a humanized antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of a non-human animal antibody into CDRs corresponding to VH and VL of a human antibody.
  • An area other than the CDRs of VH and VL is referred to as a framework area (hereinafter referred to as FR).
  • the humanized antibody is composed of a cDNA encoding a VH amino acid sequence consisting of a VH CDR amino acid sequence of a non-human animal antibody and a VH FR amino acid sequence of any human antibody, and a VL CDR amino acid of a non-human animal antibody.
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VL consisting of the sequence and the amino acid sequence of FR of VL of any human antibody is constructed, and inserted into an expression vector for animal cells having DNA encoding CH and CL of human antibody, respectively.
  • An antibody expression vector can be constructed and introduced into animal cells for expression and production.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • a human antibody can be obtained by immunizing a mouse carrying a human immunoglobulin gene (Tomizuka K. et. Al., Proc Natl Acad Sci USA. 97, 722-7, 2000.) with a desired antigen. I can do it. Further, by using a phage display library obtained by amplifying antibody genes from human-derived B cells, a human antibody can be obtained without immunization by selecting a human antibody having a desired binding activity ( Winter G. et.al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55.1994). Furthermore, by immortalizing human B cells using EB virus, cells that produce human antibodies having a desired binding activity can be produced and human antibodies can be obtained (Rosen A. et. Al.,). Nature 267, 52-54.1977).
  • the antibody present in the human body can be cultured, for example, by immortalizing lymphocytes isolated from human peripheral blood by infecting EB virus or the like and then cloning the lymphocytes, The antibody can be purified from the culture.
  • the human antibody phage library is a phage library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal is an animal in which a human antibody gene is integrated into the chromosome of a host animal.
  • a human antibody-producing transgenic animal can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, and then transplanting the ES cells into early embryos of other mice and then generating them.
  • a human antibody production method from a human antibody-producing transgenic animal is obtained by obtaining and culturing a human antibody-producing hybridoma by a hybridoma production method performed in a normal non-human mammal. Production can be accumulated.
  • the VH and VL amino acid sequences of the antibodies of the present invention include human antibody VH and VL amino acid sequences, non-human animal antibody VH and VL amino acid sequences, or non-human animal antibody CDRs as the human antibody framework. Any of the amino acid sequences of the transplanted humanized antibody may be used. Specific examples include VH and VL amino acid sequences of non-human animal antibodies produced by hybridomas, humanized antibody VH and VL amino acid sequences, human antibody VH and VL amino acid sequences, and the like.
  • the amino acid sequence of CL in the antibody of the present invention may be either an amino acid sequence of a human antibody or an amino acid sequence of a non-human animal antibody, but C ⁇ or C ⁇ of an amino acid sequence of a human antibody is preferable.
  • the CH of the antibody of the present invention may be any as long as it belongs to immunoglobulin, but preferably any of subclass belonging to IgG class, ⁇ 1 (IgG1), ⁇ 2 (IgG2), ⁇ 3 (IgG3) and ⁇ 4 (IgG4) Can also be used.
  • the effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody.
  • Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity), complement-dependent cytotoxicity (Complement-Dependent) Cytotoxicity (CDC activity) or antibody-dependent phagocytosis (ADP activity) by phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells is known.
  • ADCC activity and CDC activity are measured using a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • ADCC activity means that an antibody bound to an antigen on a target cell binds to an Fc receptor of an immune cell through the Fc region of the antibody, thereby activating an immune cell (natural killer cell, etc.) and damaging the target cell. Activity.
  • the Fc receptor (hereinafter also referred to as FcR) is a receptor that binds to the Fc region of an antibody, and induces various effector activities by the binding of the antibody.
  • FcR corresponds to an antibody subclass, and IgG, IgE, IgA, and IgM specifically bind to Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, Fc ⁇ R, and Fc ⁇ R, respectively.
  • Fc ⁇ R has Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RII (CD32), and Fc ⁇ RIII (CD16) subtypes, and Fc ⁇ RIA, Fc ⁇ RIB, Fc ⁇ RIIC, Fc ⁇ RIIA, Fc ⁇ RIIB, Fc ⁇ RIIC, Fc ⁇ RIIIA, and Fc ⁇ RIIIB are present. To do. These different Fc ⁇ Rs are present on different cells [Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)].
  • Fc ⁇ RIIIB is specifically expressed in neutrophils, and Fc ⁇ RIIIA is expressed in monocytes, Natural Killer cells (NK cells) and some T cells. Antibody binding via Fc ⁇ RIIIA induces NK cell-dependent ADCC activity.
  • CDC activity refers to an activity in which an antibody bound to an antigen on a target cell activates a series of cascades (complement activation pathways) composed of complement-related proteins in the blood and damages the target cell.
  • cascades complement activation pathways
  • migration and activation of immune cells can be induced by protein fragments generated by complement activation.
  • the cascade of CDC activity begins when C1q, which has a binding domain with the Fc region of an antibody, binds to the Fc region and binds to two serine proteases, C1r and C1s, to form a C1 complex.
  • the antibodies of the present invention include VH complementary chain determining regions CDR1 to CDR3 comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 56 to 58 and VL comprising the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 59 to 61 respectively.
  • V region comprising CDR1-3, VH CDR1-3 comprising amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 68-70, respectively, and V comprising CDR1-3, VL comprising amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 71-73, respectively Region, V region comprising VH CDR1 to 3 each comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 80 to 82 and V region comprising CDR 1 to 3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 83 to 85, respectively, and SEQ ID NO: 92, respectively. CDRs 1 to 3 of VH containing the amino acid sequences represented by ⁇ 94 and amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 95 to 97, respectively.
  • Antibodies comprising any one of V regions selected from V region comprising CDRl ⁇ 3 of VL comprising the like.
  • the antibody of the present invention is represented by the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4592 containing VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 64.
  • One antibody is mentioned.
  • the antibodies of the present invention include antibodies that compete with the above-described antibodies and bind to human CCR6, antibodies that react with the epitope to which the above-mentioned antibody reacts, and antibodies that react with the same epitope as the above-mentioned antibody reacts with. It is done.
  • the antibody of the present invention is fused with an Fc fusion protein in which Fc and an antibody fragment are bound, an Fc fusion protein in which Fc and a naturally occurring ligand or receptor are bound (also referred to as immunoadhesin), and a plurality of Fc regions. Also included are Fc fusion proteins and the like. An Fc region containing an amino acid residue modification that has been modified to enhance or lack the effector activity of the antibody, stabilize the antibody, and control the blood half-life is also included in the antibody of the present invention. Can be used.
  • Examples of the antibody fragment in the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing a plurality of CDRs.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain), and about half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonded. It is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight bound by (SS bond).
  • F (ab ′) 2 is a fragment obtained by treating IgG with proteolytic enzyme pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), and Fab is linked via an SS bond in the hinge region.
  • Antibody fragment having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than those bound together.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the SS bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • scFv uses an appropriate peptide linker (P) such as a linker peptide in which one VH and one VL are connected to an arbitrary number of linkers (G4S) consisting of four Gly and one Ser residue.
  • P peptide linker
  • G4S linkers
  • VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide which is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen binding specificity forms a dimer, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity for the same antigen or a bispecific antigen-binding activity for different antigens.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue, which are bound via an SS bond between the cysteine residues.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • a peptide containing a plurality of CDRs can be linked to each other directly or via an appropriate peptide linker.
  • a DNA encoding the CDRs of the modified antibody VH and VL of the present invention is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism It can be expressed and manufactured by doing.
  • the peptide containing CDR can also be manufactured by chemical synthesis methods, such as Fmoc method or tBoc method.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically recognizes the extracellular region of human CCR6 of the present invention and binds to the extracellular region with a radioisotope, a low molecular weight drug, a macromolecule. Or a derivative of an antibody obtained by chemically or genetically linking a drug, protein, or antibody drug.
  • the derivative of the antibody in the present invention specifically recognizes the extracellular region of human CCR6 of the present invention and binds to the extracellular region on the N-terminal side of the H chain or L chain of the monoclonal antibody or antibody fragment thereof, Chemistry of radioisotopes, low molecular weight drugs, high molecular weight drugs, immunostimulants, proteins, antibody drugs, or nucleic acid drugs on the C-terminal side, appropriate substituents or side chains in antibody molecules, and sugar chains Can be produced by a conventional method [Introduction to Antibody Engineering, Jinjinshokan (1994)].
  • DNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment that specifically recognizes the extracellular region of human CCR6 of the present invention and binds to the extracellular region is linked to DNA encoding the protein or antibody drug to be bound. And then inserted into an expression vector, introduced into an appropriate host cell, and expressed by a genetic engineering technique.
  • radioisotope examples include 111 In, 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, and 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • low molecular weight drugs examples include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P glycoprotein inhibitors, platinum Anti-cancer agents such as complex derivatives, M-phase inhibitors and kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], steroidal agents such as hydrocortisone and prednisone, non-steroidal agents such as aspirin and indomethacin, gold thiomalate, Anti-inflammatory agents such as immunomodulators such as penicillamine, cyclophosphamide and azathioprine, and antihistamines such as chlorpheniramine maleate and clemacytin [Inflammation and anti-inflammatory therapy, Ishiyaku Publishing Co., Ltd. ( 1982)].
  • anticancer agents include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU), doxorubicin (Adriamycin), epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, daunomycin, pepromycin, estramustine, paclitaxel, paclitaxel, paclitaxel Taxotea), aldesleukin, asparaginase, buoy Rufan, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine
  • Examples of a method for binding a low molecular weight drug to an antibody include, for example, a method of binding a drug and an amino group of an antibody via glutaraldehyde, and a drug amino group and an antibody carboxyl group via a water-soluble carbodiimide. And the like.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • PEG polyethylene glycol
  • albumin dextran
  • polyoxyethylene polyoxyethylene
  • styrene maleic acid copolymer polyoxyethylene
  • polyvinyl pyrrolidone polyvinyl pyrrolidone
  • pyran copolymer examples include hydroxypropyl methacrylamide.
  • Examples of a method of binding PEG and an antibody include a method of reacting with a PEGylation modifying reagent [Bioconjugate pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • Examples of the PEGylation modifying reagent include a modifier for the ⁇ -amino group of lysine (Japanese Patent Laid-Open No. 61-178926), a modifier for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-23587). And a modifier for guanidino group of arginine (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan) and ⁇ -galactosylceramide (KRN7000). Is mentioned.
  • proteins include cytokines or growth factors that activate immunocompetent cells such as NK cells, macrophages, or neutrophils, and toxin proteins.
  • cytokines or growth factors examples include interferon (hereinafter referred to as INF) - ⁇ , INF- ⁇ , INF- ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-12, IL-15, IL- 18, IL-21, IL-23, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and macrophage colony stimulating factor (M-CSF).
  • INF interferon
  • IL interleukin
  • IL-12 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-15 interleukin
  • IL-15 interleukin- 18, IL-21
  • IL-23 granulocyte colony stimulating factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • toxin protein examples include ricin, diph
  • Examples of the antibody drug include an antigen against which apoptosis is induced by antibody binding, an antigen involved in tumor pathogenesis or an antigen that regulates immune function and an antigen involved in angiogenesis of a lesion site.
  • antigens whose apoptosis is induced by antibody binding include, for example, cluster of differentiation (hereinafter referred to as CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, and Epidemial GrowthFact. EGFR) and the like.
  • CD cluster of differentiation
  • antigens involved in tumor pathogenesis or antibodies that regulate immune function include CD4, CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (eg, CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7- H3 or B7-H4), ligands of B7 family molecules (eg, CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 or BTLA), OX-40, OX-40 ligand, CD137, tumor necrosis factor (TNF) receptor family Molecule (eg DR4, DR5, TNFR1 or TNFR2), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule, receptor family of TRAIL family molecules ( RAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, or TRAIL-R4), receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANK), RANK ligand, CD25, folate receptor and cytokine [eg IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇
  • antigens for antibodies that inhibit angiogenesis of lesion sites include, for example, vascular electrical growth factor (VEGF), anangiopoietin, fibroblast growth factor (FGF), EGF, hepatocyte growthGF (hepatocytes). Insulin-like growth factor (IGF), erythropoietin (EPO), TGF ⁇ , IL-8, ephrin, angiopoietin, SDF-1, or a receptor thereof.
  • VEGF vascular electrical growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF hepatocyte growthGF
  • IGF Insulin-like growth factor
  • EPO erythropoietin
  • TGF ⁇ IL-8
  • ephrin angiopoietin
  • SDF-1 a receptor thereof.
  • a fusion antibody with a protein or antibody drug comprises linking a cDNA encoding a protein to a cDNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment, constructing a DNA encoding the fusion antibody, and expressing the DNA for prokaryote or eukaryote It is inserted into a vector and expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce a fusion antibody.
  • the nucleic acid drug include a drug containing a nucleic acid such as small interference ribonucleic acid (siRNA) or microRNA that acts on a living body by controlling the function of a gene.
  • siRNA small interference ribonucleic acid
  • microRNA microRNA
  • the extracellular region of human CCR6 of the present invention is specifically recognized and bound to the extracellular region.
  • the agent that binds to the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof include a label used in a usual immunological detection or measurement method.
  • the label include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase and luciferase, luminescent materials such as acridinium ester and lophine, and fluorescent materials such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC). Can be mentioned.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for a disease involving human CCR6 positive cells which specifically recognize the extracellular region of human CCR6 and which contains a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof which binds to the extracellular region as an active ingredient. About.
  • the disease involving human CCR6-positive cells may be any disease involving human CCR6-positive cells, and examples thereof include autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases include autoimmune diseases involving human CCR6 positive T cells and / or B cells and / or ILC, human CCR6 positive T cells and / or B cells and / or cytokines derived from ILC. Or autoimmune diseases involving cells controlled by human CCR6-positive T cells and / or B cells and / or ILC-derived cytokines.
  • autoimmune disease examples include rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease, asthma, psoriasis, sinusitis, and systemic lupus erythematosus.
  • human CCR6-positive T cells include Th17 cells, Th1 / 17 cells, and Th22 cells.
  • human CCR6-positive B cells include naive / memory B cells.
  • the antibody of the present invention can inhibit CCR6-positive T cells and / or B cells, it simultaneously suppresses a plurality of cells such as Th1 / 17, Th17, Th22 and naive / memory B cells, and is used in autoimmune diseases. Inhibition of T-cell cytokine production, which is considered a problem, and autoantibody production by B cells can also be inhibited. Further, the antibody of the present invention can inhibit CCR6-positive ILC.
  • the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment or derivative thereof of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the route of administration is preferably the most effective for treatment, and includes oral administration, parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, and intravenous administration. Is preferred.
  • parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, and intravenous administration. Is preferred.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments and tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult.
  • the present invention relates to an immunological detection or measurement method for human CCR6, an immunological detection for human CCR6, or an antibody that binds to an extracellular region of sulfated human CCR6 or an antibody fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a reagent for measurement, an immunological detection or measurement method for cells expressing human CCR6, and a diagnostic agent for diseases involving human CCR6-positive cells.
  • any known method can be used as a method for detecting or measuring the amount of human CCR6.
  • Examples include immunological detection or measurement methods.
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (Western immunoassay), Western Examples include blotting or physicochemical techniques.
  • a disease associated with human CCR6 can be diagnosed.
  • Known immunological detection methods can be used to detect cells expressing the polypeptide, but immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, or immunohistochemical staining, Preferably used.
  • fluorescent antibody staining methods such as FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can also be used.
  • biological samples to be used for detecting or measuring human CCR6 in the present invention include tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid, or culture fluid, and human CCR6 is expressed. There is no particular limitation as long as it may contain cells.
  • the diagnostic agent containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • a reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • detection reagent examples include reagents used in usual immunological detection or measurement methods such as a labeled secondary antibody that recognizes the monoclonal antibody or antibody fragment or derivative thereof, and a substrate corresponding to the label. Is mentioned.
  • the antibody production method, disease treatment method, and disease diagnosis method of the present invention will be specifically described below.
  • Antibody Production Method Preparation of Antigen Human CCR6 or human CCR6 to be used as an antigen is expressed in Escherichia coli, yeast, insect cells, or an expression vector containing cDNA encoding human CCR6 full length or a partial length thereof. It can be obtained by introducing it into animal cells. Moreover, human CCR6 can be purified and obtained from various human tumor cultured cells, human cells, human tissues, etc. that express human CCR6 in large quantities. Further, the cultured tumor cells or the tissue can be used as an antigen as it is. Furthermore, a synthetic peptide having a partial sequence of human CCR6 can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • the human CCR6 used in the present invention is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Current Protocols InMolecular 7 in Current Protocols in 1989.
  • the DNA encoding human CCR6 can be expressed in a host cell and produced by the following method.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding human CCR6 downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing the polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector can be used as long as it can autonomously replicate in the host cell to be used or can be integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can do.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells and animal cells, and any can be used as long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector When a prokaryote such as E. coli is used as a host cell, the recombinant vector is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a portion encoding human CCR6, and a transcription termination sequence. It is preferable that the vector contains The recombinant vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene. Furthermore, the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of the DNA encoding the human CCR6 can be substituted so that the codon is optimal for expression in the host, thereby improving the production rate of the target human CCR6. Can do.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 from Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Qiagen
  • PKYP10 Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phages such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter and T7 promoter can be mentioned.
  • artificially designed and modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrps are connected in series are also included.
  • Examples of host cells include E. coli XL1-Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, E. coli DH5 ⁇ and the like.
  • Any method can be used for introducing a recombinant vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell to be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter. , Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter and enhancer.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • IE SV40 early promoter
  • a retroviral promoter e.g., a promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter.
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter and enhancer.
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. , 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector incorporating a DNA encoding human CCR6 obtained as described above is cultured in a medium, and the human CCR6 is produced and accumulated in the culture. Then, human CCR6 can be produced by collecting from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • human CCR6 When expressed in cells derived from eukaryotes, human CCR6 with an added sugar or sugar chain can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122 , 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science, 122 , 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and the presence of 5% CO 2 .
  • Examples of the method for producing human CCR6 include a method for producing it in a host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the outer cell membrane.
  • the host cell to be used or the human CCR6 to be produced is produced. By changing the structure, an appropriate method can be selected.
  • human CCR6 can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075).
  • the obtained human CCR6 can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells When human CCR6 is expressed in a dissolved state in cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, or dynomill. Use to crush the cells to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Methods such as electrophoresis, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing or isoelectric focusing. Use alone or in combination, Rukoto can.
  • a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical)
  • human CCR6 When human CCR6 is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, the cell is recovered and crushed in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble substance of human CCR6 as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble body of human CCR6 is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the human CCR6 is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified polypeptide preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as human CCR6 or a sugar modification product thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • human CCR6 used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive or Shimadzu You can also be produced.
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously or intravenously or intraperitoneally in the animal together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • the myeloma cells are subcultured in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine], and subcultured to normal medium 3 to 4 days before cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • a mixture of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), MEM medium and dimethyl sulfoxide is added at 37 ° C. with stirring.
  • the cells are gently suspended in the HAT medium [normal medium containing hypoxanthine, thymidine, and aminopterin] to the antibody-producing cells for fusion. This suspension is cultured for 7-14 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing human CCR6 and does not react with an antigen not containing human CCR6 is selected by a hybridoma selection method such as a binding assay described later.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and a stable and strong antibody titer was observed.
  • One is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma SFM medium and cultured for 3 to 7 days. .
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the resulting supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Digo GF21 can also be added to the Hybridoma SFM medium.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is quantified by the Raleigh method or absorbance at 280 nM.
  • the monoclonal antibody is selected by a binding assay by the enzyme immunoassay shown below and a kinetic analysis by Biacore. In addition to these methods, selection can also be made by identifying a target antigen of an antibody by a known method [The Prostate, 67, 1163 (2007)].
  • (6-a) Binding assay As an antigen, a gene-transferred cell or a recombinant obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding human CCR6 obtained in (1) into E. coli, yeast, insect cells, animal cells, or the like. A protein or a purified polypeptide or partial peptide obtained from human tissue is used. When the antigen is a partial peptide, a conjugate with a carrier protein such as BSA or KLH is prepared and used.
  • a carrier protein such as BSA or KLH
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as the first antibody and allowed to react.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the immunogen is selected.
  • a monoclonal antibody that competes with the anti-human CCR6 monoclonal antibody of the present invention and binds to human CCR6 can be obtained by adding a test antibody to the above-described binding assay system and allowing it to react. That is, by screening for an antibody that inhibits the binding of the monoclonal antibody when the test antibody is added, a monoclonal antibody that competes with the acquired monoclonal antibody for binding to the human CCR6 extracellular region can be obtained.
  • an epitope that is recognized by a monoclonal antibody that binds to the extracellular region of human CCR6 of the present invention and an antibody that binds to the same epitope are identified by identifying the epitope of the antibody obtained by the above-described binding assay system. These can be obtained by preparing and immunizing a partial synthetic peptide, a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of an epitope, or the like.
  • human CCR6, the partial peptide, and a conjugate of the partial peptide and a carrier protein are immobilized on a sensor chip by, for example, an amine coupling method, and then a purified monoclonal antibody having a plurality of known concentrations is allowed to flow, bind and Measure dissociation.
  • the obtained data is subjected to kinetics analysis using a positive binding model using software attached to the device, and various parameters are acquired.
  • the binding activity to cells expressing human CCR6 is determined by fluorescence using an antibody conjugated with an appropriate fluorescent substance FITC, PE, Cy5, GFP, Alexa488, Alexa647, etc.
  • Cell binding ELISA, FCM (Guava EasyCyte Mini flow cytometry system, manufactured by Millipore), cell sorter FACSAria (registered trademark) (manufactured by BD Pharmigen), FMAT8100HTS system (manufactured by Applied Biosystems), ABI 8200 cell (Applied Bio) and the like can be used.
  • a recombinant antibody expression vector is an animal cell expression vector in which DNAs encoding human antibodies CH and CL are incorporated, and the animal cell expression vector is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for DNA encoding CH and CL of human antibodies
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any animal cell expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • promoters and enhancers include SV40 early promoter [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 960 (1987)], or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expressing a recombinant antibody of a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 Hybridoma, 17, 559 (1998)
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated from the library using DNA encoding the C region portion or V region portion of the mouse antibody as a probe.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence.
  • non-human animals that produce non-human antibody-producing hybridoma cells include mice, rats, hamsters, and rabbits, and any animal can be used as long as hybridoma cells can be produced. it can.
  • RNA easy kit manufactured by Qiagen
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)], or Oligo-dT> Sur (Sup.
  • a kit such as a registered trademark Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) is used.
  • mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation (registered trademark) Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification (registered trademark) Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP Express [Stratesies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ ZAPI II (manufactured by Stratagene), ⁇ gt10, Clgt11A: Clgt11 DNA: Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), ⁇ ExCell, pT7T3-18U (Pharmacia), pCD2 [Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • cDNA clones encoding non-human antibody VH or VL from a cDNA library for example, colony hybridization using an isotope or fluorescently labeled probe, or plaque hybridization [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like are used.
  • a primer is prepared, and cDNA or cDNA library synthesized from mRNA is used as a template, Polymerase Chain Reaction method (hereinafter referred to as PCR method, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Spring Spring Harbor). (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)] can also be used to prepare cDNA encoding VH or VL.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction method
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method. .
  • nucleotide sequence analysis methods include the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], etc., followed by ABI PRISM 3700 (manufactured by PE Biosystems) and A.P. L. F. Examples thereof include a base sequence automatic analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia).
  • VH and VL complete amino acid sequences for example, BLAST method [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)], and the like, it can be confirmed whether the complete amino acid sequences of VH and VL are novel.
  • a human chimeric antibody expression vector VH or VL of a non-human antibody is respectively upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody of the recombinant antibody expression vector obtained in (1).
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each of the encoded cDNAs.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to be appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1). Each is cloned to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • a cDNA encoding the non-human antibody VH or VL is amplified by a PCR method using a synthetic DNA having a recognition sequence of an appropriate restriction enzyme at both ends, and the recombinant antibody expression vector obtained in (1) Can also be cloned.
  • a cDNA encoding VH or VL of human CDR-grafted antibody can be constructed as follows.
  • the amino acid sequence of the VH or VL of the human antibody for grafting the amino acid sequence of the CDR of the VH or VL of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, or common amino acid sequences of each subgroup of FRs of human antibodies [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] are used.
  • an FR amino acid sequence having the highest homology (at least 60% or more) with the FR amino acid sequence of the VH or VL of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • Frequency of codon usage of the designed amino acid sequence in the base sequence of the antibody gene [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Considering Health and Human Services (1991)]
  • the DNA sequence is converted into a DNA sequence, and the DNA sequence encoding the VH or VL amino acid sequence of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired human CDR graft A plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the antibody VH or VL is obtained.
  • a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene)
  • the nucleotide sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired human CDR graft
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the antibody VH or VL is obtained.
  • a product obtained by synthesizing the full length VH and the full length VL as one long chain DNA based on the designed DNA sequence can be used in place of the PCR amplification product.
  • cDNA encoding the human CDR-grafted antibody VH or VL can be obtained for expression of the human-type CDR-grafted antibody obtained in (1). Can be easily cloned into a vector.
  • a human CDR-grafted antibody can be obtained by transplanting only non-human antibody VH and VL CDRs into human antibody VH and VL FRs. The binding activity is reduced compared to the original non-human antibody [BIO / TECHNOLOGY, 9,266 (1991)].
  • amino acid residues that are directly involved in binding to the antigen amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and Decreased by maintaining the three-dimensional structure of the antibody, identifying amino acid residues indirectly involved in antigen binding, and substituting those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody Antigen binding activity can be increased.
  • the amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be modified by performing the PCR described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2), and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends are introduced into the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1), and cloned so as to be expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody.
  • Transient expression of recombinant antibodies Transient expression of recombinant antibodies using the recombinant antibody expression vectors obtained in (3) and (6) or modified expression vectors
  • any cell can be used as long as it can express the recombinant antibody.
  • COS-7 cells American Type Culture Collection (ATCC) number: CRL1651] [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991)].
  • an expression vector For introduction of an expression vector into COS-7 cells, the DEAE-dextran method [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press (1991)], or lipofection [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are measured by enzyme immuno-antibody method [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratories, 1996]. Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC CCL-61
  • DUKXB11 ATCC CCL-9096
  • Pro-5 ATCC CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice 20 also referred to as ATCC number: CRL1662 or YB2 / 0
  • mouse myeloma cell NS0 mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC number: CRL1580
  • dihydro CHO cells deficient in folate reductase gene Dihydroformate Reductase, hereinafter referred to as dhfr
  • a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of the reducing terminal of a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the N-glycoside-linked complex sugar chain
  • a host cell having a decreased or deleted activity such as a protein involved in the transport of an intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus, such as an ⁇ 1,6-fucose transferase gene
  • Examples include CHO cells (International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 02/31140), Lec13 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)] that has acquired lectin resistance.
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (hereinafter referred to as G418) (Japan).
  • G418 sulfate hereinafter referred to as G418, (Japan).
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma-SFM medium ( Invitrogen) or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums.
  • RPMI1640 medium manufactured by Invitrogen
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL301 medium manufactured by JRH
  • IMDM medium manufactured by Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium Invitrogen
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A-column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A LaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratory. (1988)]. It is also possible to combine methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practicies, Third]. edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • Activity evaluation of purified monoclonal antibody or antibody fragment thereof The activity evaluation of the purified monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention can be carried out as follows.
  • the binding activity to the human CCR6-expressing cell line is measured by the surface plasmon resonance method using the binding assay described in 1- (6a) and the Biacore system described in (6b). In addition, the fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • CDC activity or ADCC activity against an antigen-positive cultured cell line is measured by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373 (1993)].
  • Method for controlling effector activity of antibody As a method for controlling the effector activity of the human CCR6 monoclonal antibody of the present invention, for example, the 297th asparagine (Fragment, crystallizable, hereinafter referred to as Fc region) of an antibody A method for controlling the amount of fucose (also referred to as core fucose) ⁇ -1,6-linked to N-acetylglucosamine (GlcNAc) present at the reducing end of an N-linked complex sugar chain that binds to Asn) (International Publication No. 2005 / No. 035586, International Publication No. 2002/31140, International Publication No. 00/61739) and a method of controlling by modifying amino acid residues in the Fc region of an antibody.
  • the effector activity can be controlled by any method using the human CCR6 monoclonal antibody of the present invention.
  • Effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody.
  • antibody-dependent cytotoxic activity ADCC activity
  • complement-dependent cytotoxic activity CDC activity
  • antibody-dependent phagocytosis antibody-dependent phagocytosis, ADP activity
  • the effector activity of the antibody can be increased or decreased by controlling the content of fucose added to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-linked complex sugar chain on the Fc region.
  • the antibody is expressed using CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene. An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • Antibodies without fucose binding have high ADCC activity.
  • the antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced.
  • an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower ADCC activity than an antibody to which fucose is not bound.
  • ADCC activity and CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody.
  • the CDC activity of an antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased.
  • an antibody with controlled effector activity of an antibody can be obtained by using the above method in combination with one antibody.
  • the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention can be used for the treatment of diseases involving human CCR6-positive cells.
  • the therapeutic agent containing the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof may contain only the antibody or the antibody fragment, or a derivative thereof as an active ingredient. It is provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the technical field of pharmaceutics, mixed with one or more physically acceptable carriers.
  • Examples of the administration route include oral administration and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments and tapes.
  • Preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid It is produced using an antiseptic such as esters, or a flavor such as strawberry flavor or peppermint as an additive.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • Injection is manufactured using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, disperses the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof as fine particles, and facilitates absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • Method for diagnosing disease using anti-human CCR6 monoclonal antibody or antibody fragment thereof of the present invention By detecting or measuring human CCR6 or cells expressing human CCR6 using the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention, Diseases associated with CCR6 can be diagnosed.
  • the diagnosis of an autoimmune disease which is one of the diseases associated with human CCR6, can be performed, for example, by detecting or measuring human CCR6 as follows. Diagnosis can be made by detecting human CCR6 expressed in cells in a patient using an immunological technique such as flow cytometry.
  • the immunological technique is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance labeled immunoassay method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method, a physicochemical method and the like can be mentioned.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method is, for example, a method in which an antigen of the present invention or an antibody fragment thereof is reacted with an antigen or an antigen-expressing cell and further reacted with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment. Measure with a scintillation counter.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and further, a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted, and then a coloring dye. Is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • an enzyme label known in the art [enzyme immunoassay, Medical School (1987)] can be used.
  • alkaline phosphatase label for example, alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, or biotin label is used.
  • the sandwich ELISA method is a method of binding an antibody to a solid phase, trapping an antigen to be detected or measured, and reacting a second antibody with the trapped antigen.
  • the ELISA method two types of antibodies or antibody fragments recognizing an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is pre-plated on a plate (for example, 96 Next, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin. After the cells adsorbed with the antibody are reacted with cells or a lysate thereof, tissue or a lysate thereof, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites or ocular fluid, the label is obtained. The detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction according to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used in the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments recognizing different epitopes, or a combination of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies or antibody fragments.
  • the fluorescence immunoassay is measured by the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay a fluorescent label known in the art [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] can be used.
  • FITC or RITC is used.
  • the luminescent immunoassay is measured by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, and acridinium ester, lophine, and the like are used.
  • Western blotting involves fractionating an antigen or cells expressing the antigen with SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE (polyacrylamide gel) [Antibodies-A Laboratory Manual Spring Harbor Laboratory (1988)], and then separating the gel. Blotting was performed on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane, and an antibody or antibody fragment that recognizes the antigen was reacted with the membrane, and further, a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase, or a biotin label was applied. After reacting with the anti-mouse IgG antibody or binding fragment, the label is measured by visualization.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PAGE polyacrylamide gel
  • the monoclonal antibody of the present invention was reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was washed at room temperature. React for 2 hours.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham).
  • ECL Western Blotting Detection Reagents manufactured by Amersham.
  • an antibody used for detection by Western blotting an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding human CCR6, which is an antigen, to the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and detecting the aggregate.
  • a physicochemical method a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, or a latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical test method, Kanbara Publishing (1998)] can be used.
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration or the like in the test sample is measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • a known immunological detection method can be used, but preferably, immunoprecipitation method, immune cell staining method, immunohistochemical staining method or fluorescent antibody staining method Etc. are used.
  • cells expressing human CCR6 are reacted with the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and then a carrier having specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen antibody. Allow the complex to settle.
  • a carrier having specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to the antigen antibody. Allow the complex to settle.
  • the following method can be used.
  • the above-described monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS.
  • the antibody When the antibody is in an unpurified state, such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein-G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant is dispensed and bound.
  • an unpurified state such as a hybridoma culture supernatant, anti-mouse immunoglobulin, anti-rat immunoglobulin, protein-A or protein-G is immobilized on a 96-well plate for ELISA in advance. After blocking with BSA-PBS, the hybridoma culture supernatant is dispensed and bound.
  • Immunoprecipitates are extracted from the well-washed plate with SDS-PAGE sample buffer and detected by Western blotting as described above.
  • the immune cell staining method or the immunohistochemical staining method is a method in which cells or tissues expressing an antigen are treated with a surfactant or methanol to improve the passage of the antibody in some cases, and then reacted with the monoclonal antibody of the present invention. And then reacting with a fluorescent label such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or a biotin label, or an anti-immunoglobulin antibody or a binding fragment thereof, then the label is visualized and microscopically observed .
  • a fluorescent label such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase or a biotin label
  • a fluorescent antibody staining method in which a fluorescently labeled antibody is reacted with a cell and analyzed with a flow cytometer [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific Fick (1987)].
  • the monoclonal antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, which binds to the extracellular region of human CCR6, can detect cells expressing a natural three-dimensional structure by fluorescent antibody staining.
  • the formed antibody-antigen complex and the free that is not involved in the formation of the antibody-antigen complex can be measured without separating the antibody or antigen.
  • Example 1 Construction of CHO cell expressing human CCR6 on cell membrane (1) Cloning of human CCR6 gene A gene encoding human CCR6 was isolated from cDNA derived from human leukocytes by the following procedure (SEQ ID NOs: 1 and 3).
  • a 24 mer region within the open reading frame (hereinafter abbreviated as ORF) from the CCR6 start codon A forward primer (Human-CCR6-f) (SEQ ID NO: 5) that binds to and a reverse primer (Human-CCR6-r) (SEQ ID NO: 6) that binds to the 21 mer within the ORF up to the CCR6 stop codon was designed.
  • DNA polymerase KOD-Plus (TOYOBO) was used, and 50 ⁇ L of a reaction solution containing human leukocyte-derived cDNA as a template [10 ⁇ Buffer for KOD-Plus, 0.2 mmol / L dNTPs, 0. 2 ⁇ mol / L
  • PCR In PCR, after heating at 94 ° C. for 5 minutes, 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes were performed.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified DNA fragment of about 1.1 kbp was recovered using QIAEXII (QIAGEN) according to the attached manual.
  • the recovered DNA fragment was subjected to ligation reaction using pCR4 Blunt-TOPO vector (Invitrogen) according to the attached manual.
  • the reaction solution was used to transform E. coli DH5 ⁇ strain (Competent Quick DH5 ⁇ , TOYOBO), and vector DNA was isolated from the resulting ampicillin resistant clone using a vector extractor PI-50 (Kurabo).
  • the base sequence of DNA inserted into each vector was determined according to the attached manual using PRISM3730x1 (Applied Biosystems) and Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Amplified fragments derived from two independent PCRs were subcloned, and the base sequences of 6 clones in which no PCR error was observed were determined.
  • the human CCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6 (isoform 1) was constructed by the following procedure (FIGS. 1 and 2).
  • a synthetic oligo DNA (CCR6MunI-f) (SEQ ID NO: 7) in which a restriction enzyme MunI recognition sequence and a Kozak sequence are added to the 5 ′ end of the forward primer that binds to the 28mer region in the ORF from the human CCR6 start codon, and CCR6 termination Synthetic oligo DNA (CCR6BamHI-) with a histidine tag (His-tag) sequence, a stop codon, and a restriction enzyme BamHI recognition sequence added to the 5 'end of the reverse primer that binds to the 3' 25 base region in the ORF without codons r) (SEQ ID NO: 8) was designed.
  • DNA polymerase KOD-Plus (TOYOBO) was used, and 50 ⁇ L of a reaction solution [10 ⁇ Buffer for KOD-plus, 0.2 mmol containing the TOPO-hCCR6 (isoform1) vector obtained above as a template. / L dNTPs, 0.2 ⁇ mol / L
  • the above two primers, KOD-plus 1U, 1 mmol / LmgSO 4 ] were prepared.
  • PCR was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1.5 minutes.
  • a vector DNA fragment TOPO-hCCR6MunI-BamHI was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • the target vector was treated with the restriction enzyme BamHI (Takara Bio) for 2 hours, and then treated with the restriction enzyme MunI (Takara Bio) for 2 hours.
  • the pKANTEX93 vector described in International Publication No. 97/10354 was subjected to enzyme treatment with restriction enzymes EcoRI (Bio labs) and BamHI (Takara Bio) for 3 hours.
  • Each reaction solution is subjected to agarose electrophoresis, and about 1.1 kbp hCCR6 DNA fragment and about 9.1 kbp pKANTEX93-EcoRI-BamHI DNA fragment are collected using QIAEXII (QIAGEN) according to the attached manual. did.
  • the CCR6 DNA fragment and pKANTEX93-EcoRI-BamHI DNA fragment obtained above were mixed at a molar ratio of 16: 1, and Ligation High ver. 2 (manufactured by TOYOBO) was added in an equal volume, and a binding reaction was performed overnight at 16 ° C.
  • the hCCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6 (containing a restriction enzyme MunI site and a Kozak sequence at the N-terminus of isoform 1 and a His-tag sequence and a restriction enzyme BamHI site at the C-terminus) isoform1) was produced [FIG. 2 (a)].
  • the human CCR6-expressing Tol2 transposon vector Tc26_hCCR6 was constructed according to the following procedure.
  • pKTABEX_TC26 an expression vector (hereinafter referred to as pKTABEX_TC26) excluding the antibody constant region of the Tol2 transposon expression vector (International Publication No. 2010/143698) is described. ) was digested with the restriction enzyme BglII, and the blunt ends were blunted using a Blunting high kit (TOYOBO).
  • CHO / DG44 cells are Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM medium) supplemented with 10% fetal bovine dialysis serum (Invitrogen), 50 ⁇ g / mL Gentamycin (Nacalai Tesque) and 1 ⁇ HT supplement (Invitrogen). (Invitrogen) (hereinafter referred to as a basic medium).
  • the cultured CHO / DG44 cells were 137 mmol / L KCl, 2.7 mmol / L NaCl, 8.1 mmol / L Na2HPO4, 1.5 mmol / L KH 2 PO 4 , 4.0 mmol / LmgCl 2 (hereinafter referred to as K-PBS buffer).
  • a cell suspension of 8 ⁇ 10 6 cells / mL was prepared.
  • 200 ⁇ L cell suspension (1.6 ⁇ 10 6 cells) and 10 ⁇ g pKANTEX-hCCR6 (isoform 1) linearized vector were mixed and added to Gene PuLser Cuvette (distance between electrodes 2 mm) (BIO-RAD) for gene transfer.
  • Gene transfer was performed using the apparatus Gene Pulser (BIO-RAD) under the conditions of a pulse voltage of 0.35 KV and an electric capacity of 250 ⁇ F.
  • the cell suspension is mixed with 10 mL of a basic medium not added with HT (hereinafter referred to as HT-medium), seeded in a 75 cm 2 adherent cell flask (manufactured by Greiner), and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Culturing was performed in the inside. After culturing for 3 days, the culture medium is replaced with an HT-basic medium (hereinafter referred to as 50 nM / IMDM medium) containing 50 nM methotrexate (hereinafter referred to as MTX) and cultured to proliferate cells resistant to MTX.
  • HT-medium a basic medium not added with HT
  • 50 nM / IMDM medium an HT-basic medium
  • MTX 50 nM methotrexate
  • the HT-basal medium hereinafter, 200 nM MTX / IMDM medium
  • 200 nM MTX / IMDM medium containing 200 nM MTX was replaced and cultured to obtain a 200 nM MTX resistant strain.
  • the obtained MTX resistant strain was named CHO-hCCR6 (isoform 1).
  • the human CCR6-expressing Tol2 transposon vector Tc26_hCCR6 prepared above was introduced into CHO-K1 cells as follows. 4.0 ⁇ 10 6 floating-conditioned CHO-K1 cells (RIKEN cell bank: RCB0285) were collected in a centrifuge tube, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, and then washed with cold PBS ( ⁇ ). did.
  • the washed treated cells were suspended in the included 100 [mu] L Solution_V the Nucleofector TM kit V (amaxa), 2 ⁇ g human CCR6 expression Tol2 transposon vector per cuvette, and 5 [mu] g Tol2 transposase expression vector (WO 2010/143698) (hereinafter, after adding abbreviated as TPEX_pMug), transferred a total volume of Nucleofector dedicated cuvette, under conditions of program U024 of Nucleofector TM, were transgenic. 20 mL of subculture medium was placed in the reservoir, and the pulsed cells were immediately added and suspended. After seeding in a 96-well plate for culture at 200 ⁇ L / well, the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions.
  • CHX / IMDM basic medium
  • CHX basic medium
  • CHX / IMDM a basic medium
  • CHX cycloheximide
  • BSA-PBS bovine serum albumin
  • the cells were centrifuged, the supernatant was removed, and the cells were washed 3 times with BSA-PBS. After washing, the cells were suspended in 400 ⁇ L of FCM buffer, passed through a cell strainer mesh, and the fluorescence intensity was analyzed using a flow cytometer (FACSCalibur (registered trademark), Becton Dickinson).
  • FACSCalibur registered trademark
  • Becton Dickinson Becton Dickinson
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibody did not react with the parental strains CHO / DG44 and CHO-K1, but introduced the hCCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6 (isoform 1) or Tc26-hCCR6, respectively. It reacted to both DG44 cells and CHO-K1 cells [FIGS. 3 (a) and 3 (b)].
  • hCCR6-His-tag protein For CHO-hCCR6, the expression of hCCR6-His-tag protein was confirmed using an anti-His tag body.
  • Cells were prepared in the same manner as described above, treated with ethanol, and subjected to cell membrane permeabilization. 100 ⁇ L of 1 ⁇ g / mL anti-His tag antibody (QIAGEN) was added to these cells, reacted at 4 ° C. for 1 hour, and Goat F (ab ′) 2 polyclonal anti-mouse-FITC (Dako) diluted 50 times as a secondary antibody. Analysis was performed in the same manner as described above except that 100 ⁇ L was added and reacted at 4 ° C. for 1 hour.
  • the anti-His tag antibody did not react with the parent strain CHO / DG44, but reacted with CHO / DG44 cells into which the hCCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6 (isoform 1) was introduced [FIG. c)]. Therefore, it was confirmed that CHO / DG44 cells introduced with the hCCR6 expression vector pKANTEX-hCCR6 (isoform 1) highly express hCCR6 fused with a His tag.
  • Example 2 Construction of human monocytic cells expressing human CCR6
  • the hCCR6 expression vector prepared in Example 1 (2) Using pKANTEX-hCCR6 (isoform 1), gene transfer was performed to U937 cells in the same manner as in Example 1 (3). Drug resistance selection was performed under culture conditions containing 0.5 mg / mL G418. As a result, U937 cells U937-CCR6 expressing hCCR6 were obtained.
  • Example 3 Construction of cells expressing human CCR6 for calcium assay A cell for detecting a signal from human CCR6 (hCCR6) by a calcium assay was constructed. According to a known method [Analytical Biochemistry 400 (2010) 163-172], an inducible expression cell of hCCR6 was constructed using KJMGER8 cells (a cell line derived from Namalwa cells) as a host. Specifically, an assay cell (hereinafter referred to as CCR6G16) capable of detecting a signal from hCCR6 by a calcium assay by co-introducing an hCCR6 (isoform 1) induction plasmid and a G ⁇ 16 expression plasmid into KJMGER8 cells is constructed. did.
  • CCR6G16 an assay cell capable of detecting a signal from hCCR6 by a calcium assay by co-introducing an hCCR6 (isoform 1) induction plasmid and a G ⁇ 16 expression plasmid into KJMGER8
  • the CCR6-induced expression plasmid was prepared according to a known method [Analytical Biochemistry 400 (2010) 163-172].
  • the G ⁇ 16 expression plasmid was prepared by incorporating human G ⁇ 16 DNA into the expression vector pAMoh (International Publication No. 030887366).
  • pAMoh International Publication No. 030887366
  • SIGMA 10 nM ⁇ -estradiol
  • DNA fragments encoding various types of chimeric CCR6 are sense megaprimes and antisense megaprimers of about 150 bases (Human-1-162-f, Human-138-288-r, Human-264-413-f, Human-394). -540-r, Human-519-677-f, Human-649-781-r, Human-759-914-f, Human-890-1020-r, Human-999-1125-f, MouseNt-1-162 -F, MouseL1-264-413-f, MouseL2-519-677-f and MouseL3-759-914-f) (SEQ ID NOs: 9-21) and restriction enzyme added primers (MouseCCR6Mun1-f, CCR6Mun1 and CCR6Bam) 1) (SEQ ID NO: 22-24), was prepared subjected to PCR.
  • the expression vector TOPO-mNtCCR6 containing a DNA fragment encoding chimeric CCR6 whose N-terminal extracellular region is the amino acid sequence of a mouse is used, and the extracellular loop (ECL) 1 is a mouse.
  • Expression vector TOPO-mECL2hCCR6 which contains a DNA fragment encoding chimeric CCR6, wherein ECL2 is the amino acid sequence of a mouse, is an amino acid sequence of mouse
  • An expression vector TOPO-mECL3hCCR6 containing a DNA fragment encoding a certain chimeric CCR6 was prepared.
  • the produced expression vector was subjected to enzyme treatment for 2 hours using the restriction enzyme BamHI (Takara Bio). Next, the enzyme treatment was performed for 2 hours using the restriction enzyme MunI (Takara Bio).
  • the DNA encoding the target chimeric CCR6 was obtained using the EcoRI-BamHI-pKANTEX93 vector fragment treated with the restriction enzymes EcoRI and BamHI and the DNA fragment encoding each chimeric CCR6.
  • Expression vectors pKANTEX-mNthCCR6, pKANTEX-mECL1hCCR6, pKANTEX-mECL2hCCR6 and pKANTEX-mECL3hCCR6 were prepared.
  • CHO / DG44 cells CHO-mNthCCR6, CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-mECL3hCCR6 expressing each chimeric CCR6 were prepared.
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibody reacted with CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-mECL3hCCR6, but did not react with CHO-mNthCCR6 and the parental CHO / DG44 [FIG. 7 (a) to (f) ].
  • the anti-mouse CCR6 monoclonal antibody reacted with CHO-mNthCCR6 [FIG. 7 (g)].
  • Each isotype control antibody did not react with any cells [FIGS. 7 (a) to (g)].
  • Example 5 Construction of CHO cells expressing cynomolgus monkey CCR6 (1) Cloning of cynomolgus monkey CCR6 gene In order to examine the reactivity of anti-human CCR6 antibody to cynomolgus monkey CCR6, a cynomolgus monkey CCR6 expression vector was prepared. Since cynomolgus CCR6 cDNA sequence has not been reported so far, cynomolgus CCR6 cDNA was cloned by the following procedure.
  • rhesus monkey CCR6 ORF accesion No. AF508730
  • rhesus monkey chromosome 4 accesion No. NC — 007861
  • the nucleotide sequences located upstream and downstream of the rhesus monkey CCR6 ORF were determined.
  • cynomolgus monkey CCR6 cloning primers Macacaf-CCR6-f and Macacaf-CCR6- r
  • an expression vector TOPO-mfCCR6-MunI-BamHI containing a gene encoding cynomolgus monkey CCR6 was prepared from cynomolgus monkey leukocyte-derived cDNA in the same manner as in Example 1 (1), and the gene sequence was identified. did.
  • cynomolgus monkey CCR6 has two isoforms (SEQ ID NOs: 114 and 116), which differ in base sequence by 4 bases, and in terms of amino acid sequence, the 177th amino acid residue of the cynomolgus monkey CCR6 intracellular domain.
  • Val or Ile SEQ ID NOs: 115, 117.
  • 177Val type cynomolgus CCR6 was 11 clones out of 15 clones
  • 177Ile type cynomolgus CCR6 was 4 clones out of 15 clones.
  • the vector in which isoform 1 was cloned was TOPO-cynomolgus CCR6 (isoform 1), and the vector in which isoform 2 was cloned was TOPO-mfCCR6 (isoform 2).
  • a cynomolgus monkey CCR6 expression vector pKANTEX-mfCCR6 (isoform1) was constructed in the same manner as in Example 1 (2) except that TOPO-mfCCR6 (isoform1) was used as a template.
  • the DNA fragment encoding the human CCR6 N-terminal extracellular domain is a primer [CCR6 (1) containing a restriction enzyme NotI recognition sequence or a restriction enzyme BamHI recognition sequence using pKANTEX-hCCR6 (isoform1) prepared in Example 1 (2) as a template. -28) -f and CCR6 (118-138) -BamHI-r] (SEQ ID NO: 29, 30) were used for PCR amplification.
  • DNA polymerase KOD-Plus (TOYOBO) was used, and 50 ⁇ L of the reaction solution [10 ⁇ Buffer for KOD-Plus, 0.2 mmol containing TOPO-hCCR6 (isoform1) prepared in Example 1 as a template. / L dNTPs, 0.2 ⁇ mol / L The above two primers, KOD-plus 1U, 1 mmol / LmgSO 4 ] were prepared.
  • PCR was performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 62 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute.
  • the resulting vector was named TOPO-NthCCR6-IgG4Fc.
  • TOPO-NthCCR6-IgG4Fc and pKANTEX CD27-IgG4Fc described in International Publication No. 2010/001908 were subjected to enzyme treatment using restriction enzymes NotI and BamHI, and fragments of about 250 bp and about 9.5 kbp were obtained and ligated. .
  • NthCCR6-IgG4Fc for expressing NthCCR6-Fc was obtained.
  • the gene sequence of NthCCR6-Fc encoded by this vector is shown in SEQ ID NO: 31, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 32.
  • NthCCR6-IgG4Fc Production of human CCR6 N-terminal extracellular domain Fc fusion protein (NthCCR6-IgG4Fc) Expression of NthCCR6-IgG4Fc in the same manner as in Example 1 (3) using the expression vector prepared in Example 6 (1) above Cells were made. Cell culture was performed using serum-free medium EXCELL302 (manufactured by JRH Bioscience) for one week, and then the culture supernatant was collected and purified by the method described below.
  • EXCELL302 manufactured by JRH Bioscience
  • the culture supernatant was centrifuged at 3000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes, and after collecting the supernatant, the supernatant was filtered using 0.22 ⁇ m pore size PES membrane (manufactured by Asahi Techno Glass).
  • a 0.8 cm pore diameter column is filled with 0.5 mL of Mab Select (Amersham Pharmacia Biotech), 3.0 mL of purified water is added, and 2.0 mL of 0.1 M citrate buffer and 2 M borate-0.15 M NaCl are added. Equilibration was performed with 1.5 mL of a buffer solution (pH 7.5) (hereinafter referred to as borate buffer).
  • the culture supernatant was passed through a column and then washed with 10 mL of borate buffer. After washing, the protein adsorbed on the carrier was eluted using 2.25 mL of 0.1 M citrate buffer (pH 3.5). The elution fraction was obtained by dividing it into 3 fractions each of 250 ⁇ L, 1 mL ⁇ 2. Next, the absorbance (OD 280 ) of 280 nM of each of the obtained fractions was measured with an absorptiometer (SHIMADZU UV-1700) to identify the eluted fraction containing the target protein.
  • SHIMADZU UV-1700 an absorptiometer
  • the buffer for the target protein elution fraction was changed to 0.01 M sodium citrate-0.15 M NaCl buffer (pH 6.0) using Econo-Pac 10DG (BIO-RAD).
  • the NthCCR6-IgG4Fc solution was sterile filtered using a 0.22 ⁇ m pore size Millex GV (MILLIPORE) and stored at 4 ° C.
  • NthCCR6-IgG4Fc protein It was confirmed to exist as a dimer. Moreover, since the molecular weight of NthCCR6-IgG4Fc inferred from the amino acid sequence is about 30 kDa, the possibility that a sugar chain was added to the NthCCR6-IgG4Fc protein was considered.
  • the obtained NthCCR6-IgG4Fc purified protein was subjected to enzyme treatment using O-Glycosidase and N-Glycosidase, and SDS-PAGE analysis of the digest was performed.
  • the O-glycosidase-treated sample band was at the same 100 kDa and 50 kDa positions as the enzyme-untreated sample band, but the N-glycosidase-treated sample and O The bands of the samples treated with -glycosidase + N-glycosidase shifted to low molecular weights of 70 kDa and 35 kDa (FIG. 11).
  • NthCCR6-IgG4Fc Since two sugar chains of about 1.5 kDa are bound to the Fc site of the antibody, it is considered that the produced NthCCR6-IgG4Fc has more sugar chains in the NthCCR6 site. In addition, it was revealed that the produced NthCCR6-IgG4Fc protein has an N-linked sugar chain bound thereto instead of an O-linked sugar chain.
  • NthCCR6-IgG4Fc human CCR6 N-terminal extracellular domain Fc fusion protein
  • tween-PBS PBS containing 0.05% tween 20
  • BSA-PBS PBS containing 0.05% tween 20
  • mouse IgG2b, kappa isotype control (BD Bioscience) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • DAKO peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin rabbit antibody
  • the substrate was washed three times with tween-PBS, and a substrate solution containing a chromogenic substrate ABTS [2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] [1 mmol / L ABTS-0.1 mol / L citrate buffer (pH 4.2), 0.1% H 2 O 2 ] was added at 50 ⁇ L / well to perform a color reaction. After the reaction, the absorbance at 415 nM (OD 415 ) was measured using a plate reader (Emax; Moleclar Devices).
  • the anti-human CCR6 antibody bound to the NtCCR6-IgG4Fc protein.
  • almost no binding was observed in wells to which isotype control mouse IgG2b antibody or BSA-PBS was added (FIG. 12). Therefore, it was revealed that the produced NthCCR6 protein fused with human IgG4Fc has the N-terminal region of human CCR6 to which the anti-human CCR6 monoclonal antibody specifically reacts.
  • Example 7 Production of monoclonal antibody against human CCR6 (1) Preparation of immunogen (a) Cellular immunization CHOK1-hCCR6 produced in Example 1 and U937CCR6 produced in Example 2 were added at 1 ⁇ 10 7 cells / 500 ⁇ L. The number of cells was adjusted to 4 weeks, 4 weeks old to SD rats, NZB mice, (NZB ⁇ NZW) F1 mice, BXSB mice (Japan SLC Co., Ltd.) or Balb / c mice (Claire Japan), a total of 4 Administered once.
  • KLH, THY or BSA is dissolved in PBS to a concentration of 10 mg / mL, and 1/10 volume of 25 mg / mL MBS [N- (m-Leimidobenzoyl-oxy) -succinimide] or SMCC [4- (N- Maleimidomethyl) cyclohexane- 1-carboxylicacid N-hydroxysuccinimidester] was added dropwise and allowed to react with stirring for 30 minutes.
  • KLH-MBS, THY-SMCC, or BSA-SMCC were prepared by removing unreacted MBS or SMCC using a Sephadex G-25 column pre-equilibrated with PBS, respectively.
  • each carrier protein was mixed with 1 mg of peptide dissolved in 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.0), stirred at room temperature for 3 hours, dialyzed with PBS after reaction, Used as a source.
  • mice immunized with cells or peptides were partially blood collected from the tail vein after the final immunization, and the binding activity of the obtained antiserum was measured by a fluorescent cell staining method using a flow cytometer (Becton Dickinson).
  • MEM medium Minimum Essential Medium medium
  • loosened with tweezers and centrifuged (1200 rpm).
  • Red blood cells were removed by adding Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.6) to the resulting precipitate fraction and treating for 1 to 2 minutes.
  • the obtained precipitate fraction (cell fraction) was washed 3 times with MEM medium and used for cell fusion.
  • U937-CCR6 cells and U937 cells prepared in Example 2 were used as assay cells. After washing the cells passaged in RPMI medium supplemented with 500 ng / mL G418 and GlutaMAX-1 (manufactured by GIBCO) or RPMI medium supplemented with only GlutaMAX-1 (hereinafter abbreviated as subculture medium), 0. A cell suspension was prepared by suspending in BSA-PBS (hereinafter abbreviated as assay buffer) containing 2 mg / mL human IgG and 0.05% sodium azide.
  • BSA-PBS hereinafter abbreviated assay buffer
  • Example 7 (2) Flow cytometer analysis As in Example 7 (2), 1 to 5 ⁇ 10 5 assay cells were suspended in 100 ⁇ L assay buffer, and the hybridoma supernatant was dispensed at 50 ⁇ L / well as the primary antibody. And allowed to react for 30 minutes at ice temperature. After the reaction, the cells were washed twice with BSA-PBS, and Alexa488-labeled anti-rat immunoglobulin G (H + L) (manufactured by Invitrogen) diluted with FCM buffer 500 times as a secondary antibody was added at 50 ⁇ L / well. In addition, the reaction was allowed to proceed for 30 minutes in the dark at light temperatures.
  • H + L Alexa488-labeled anti-rat immunoglobulin G
  • P2 CCR6-2S (B) peptide (SEQ ID NO: 33) -THY conjugate body
  • B peptide (SEQ ID NO: 33) -THY conjugate body
  • P2-BSA was used as a positive antigen
  • control peptide-BSA conjugate was used as a negative antigen.
  • P2-THY was used as a positive antigen, and a control peptide-THY conjugate was used as a negative antigen.
  • P3 CCR6-2 (B) peptide (SEQ ID NO: 40) -THY conjugate body
  • P3-BSA was used as a positive antigen
  • control peptide-BSA was used as a negative antigen.
  • P3-THY was used as a positive antigen and control peptide-THY negative antigen was used.
  • the plate on which the antigen was solidified was washed with PBS, and 1% BSA-PBS was added at 100 ⁇ L / well to block active groups remaining for 1 hour at room temperature. After standing, 1% BSA-PBS was discarded, and the immunized animal antiserum or hybridoma culture supernatant was dispensed at 50 ⁇ L / well as a test sample and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • Tween-PBS After washing with 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (ICI trademark Tween 20 equivalent) -PBS (hereinafter referred to as Tween-PBS), HRP-labeled rabbit anti-mouse IgG (H + L) as a secondary antibody A polyclonal antibody or an HRP-labeled rabbit anti-rat IgG (H + L) polyclonal antibody was added at 50 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour.
  • polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate ICI trademark Tween 20 equivalent
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid) ammonium] substrate solution [1 mmol / L ABTS, 0.1 mol / L citrate buffer (PH 4.2), 0.1% H 2 O 2 ] was added to cause color development.
  • 50 ⁇ L / well of 5% SDS was added to stop the reaction, and the absorbance (OD415 nM-OD490 nM) at a sample wavelength of 415 nM and a reference wavelength of 490 nM was measured using a plate reader (SPECTRA max; Molecular Devices).
  • mice 8-Azagnine resistant mouse myeloma cell line P3X63Ag8U. 1 (P3-U1: purchased from ATCC) was cultured in RPMI 1640 medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% FCS (hereinafter referred to as normal medium), and 2 ⁇ 10 7 cells or more were secured at the time of cell fusion. Used for production fusion partner.
  • HAT medium RPMI1640 medium (manufactured by Invtrogen) [suspended in 100 mL.
  • the suspension was dispensed into a 96-well culture plate at 200 ⁇ L / well and cultured for 8 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The culture supernatant was aspirated and fresh HAT medium was dispensed at 200 ⁇ L / well.
  • Example 7 For peptide-immunized individuals, the binding ELISA assay described in Example 7 (4) was performed, and wells that reacted with positive subjects but did not react with negative subjects were selected. Cloning from cells contained in selected wells by limiting dilution using s-cloning medium (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) containing 2-mercaptoethanol, FCS and gentamicin (hereinafter referred to as medium for hybridoma culture)] This was performed twice to obtain a single cell clone.
  • s-cloning medium manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.
  • FCS 2-mercaptoethanol
  • FCS gentamicin
  • anti-human CCR6 rat monoclonal antibodies KM4703 and KM4704 were obtained from individuals immunized with SD rats with CHOK1-hCCR6, anti-human CCR6 mouse monoclonal antibody KM4705 was obtained from individuals immunized with NZB mice with CHOK1-hCCR6, and sulfated Tyr residues.
  • Anti-human CCR6 mouse monoclonal antibody KM4592 was established from balb / c mice immunized with partial peptide P2 of human CCR6 containing CCR6-2S (B). These monoclonal antibodies that specifically bind to human CCR6 were obtained by conducting a screening assay on a scale of about 24,000.
  • Example 7 (7) Purification of monoclonal antibody
  • the hybridoma obtained in Example 7 (6) above is expanded and cultured in a hybridoma culture medium until the number of cells becomes 1 ⁇ 10 7 cells, and centrifuged (1200 rpm, 4 ° C., 5 minutes). After that, the suspension was suspended in 100 mL of a medium in which 5% Ultra-Low IgG FCS (Invitrogen) was added to Hybridoma SFM (Invitrogen) and cultured for 7 days.
  • Ultra-Low IgG FCS Invitrogen
  • the culture supernatant was centrifuged (1200 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and after collecting the supernatant, the supernatant was filtered using 0.22 ⁇ m pore size PES membrane (manufactured by Asahi Techno Glass). Purification of the monoclonal antibody and SDS-PAGE were performed in the same manner as in Example 6 (2).
  • the mouse antibody was purified using ProSepG (Millipore) resin, and the rat antibody was purified using Mabselect (Millipore) resin.
  • the subclass of the monoclonal antibody was determined by a binding ELISA using a sub cluster ipting kit (manufactured by DS Pharma Biomedical).
  • the anti-human CCR6 mouse monoclonal antibodies KM4592 and KM4705 are mouse IgG2b subclass
  • the anti-human CCR6 rat monoclonal antibodies KM4703 and KM4704 are rat IgG2b subclass.
  • Example 8 Examination of properties of anti-CCR6 monoclonal antibody
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and commercially available anti-human CCR6 obtained in Example 7 (7) were used.
  • the activity of the monoclonal antibody was evaluated. Information on instructions for commercially available anti-human monoclonal antibodies is shown in FIG.
  • Each 5 ⁇ 10 5 cells suspended in FCM buffer were reacted with 0.0001 to 10 ⁇ g / mL anti-human CCR6 monoclonal antibody (KM4592, KM4703, KM4704, KM4705) as the primary antibody.
  • anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4592, KM4703, KM4704, KM4705
  • Alexa Fluoro 488-labeled anti-mouse immunoglobulin G (H + L) antibody or Alexa Fluoro 488-labeled anti-rat immunoglobulin G (H + L) antibody both manufactured by Biolegend was used.
  • Measurement was carried out by measuring 510 to 530 nM fluorescence excited by a laser beam of 488 nM argon with a flow cytometer (Cytomics FC500 MPL, manufactured by Beckman Colter).
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704 and KM4705 of the present invention all have a cross reaction with cynomolgus monkey CCR6.
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and commercially available anti-human CCR6 mouse monoclonal antibodies of the present invention all bind to CHO-hCCR6, CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-mECL3hCCR6, It did not bind only to CHO-mNt hCCR6 [FIGS. 16 (a) to (c)].
  • the epitopes of the anti-CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and the commercially available anti-human CCR6 mouse monoclonal antibody of the present invention are all N-terminal regions containing the 1st to 46th amino acids of human CCR6. It was revealed.
  • any synthetic peptide introduced a Cys residue on the N-terminal side or C-terminal side.
  • 11 polyethylene glycol (PEG) polymers were introduced on the C-terminal side of CCR6-1 and the N-terminal side of CCR6-4.
  • the 7th Cys residue of CCR6-4 was changed to a Ser residue to suppress binding between peptides.
  • the BSA-PBS was discarded, and 10 ⁇ g / mL anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and a commercially available anti-human CCR6 mouse monoclonal antibody were dispensed at 50 ⁇ L / well as primary antibodies on the plate.
  • the reaction was performed for 2 hours. Further, as a positive control for an antibody that specifically reacts with a sulfated Tyr residue, an anti-sulfated Tyr antibody (Millipore) diluted to 10 ⁇ g / mL was used.
  • any anti-human CCR6 monoclonal antibody binds to an epitope present in the extracellular domain of the human CCR6 N-terminal region (amino acids 1 to 46 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). became. Further, since the anti-sulfated Tyr-specific antibody partially bound to the NthCCR6-IgG4Fc protein produced in CHO cells, it was revealed that the NthCCR6-IgG4Fc protein contains a sulfated Tyr residue [FIG. a) and Table 1].
  • Both of the commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies 11A9 and R6H1 bind strongly to the CCR6-1 peptide containing the first to 17th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 CCR6 containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 containing a sulfated Tyr residue, although partially binding to the CCR6-2 peptide containing the 9th to 23rd amino acids of It did not bind to the -2S peptide [FIG. 18 (a) and Table 1].
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703 and KM4704 of the present invention are all strong against the CCR6-2S peptide containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 containing the sulfated Tyr residue.
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703 and KM4704 all bind to the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the 18th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It has been shown to bind to epitopes containing sulfated Tyr.
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4705 of the present invention binds strongly to the CCR6-1 peptide containing the first to 17th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the CCR6-2 peptide containing the 9th to 23rd amino acids and the CCR6-2S peptide containing the 9th to 23rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 containing the sulfated Tyr residue [ FIG. 18 (a) and Table 1].
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4705 bound to human CCR6 regardless of the presence or absence of sulfation of the 18th Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It binds to the 1st to 23rd amino acid sequences, and the epitope does not include the 18th Tyr side chain of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It was revealed to bind to an epitope containing the 17th amino acid sequence.
  • An anti-human IgG antibody was immobilized on a CM5 sensor chip (manufactured by GE Healthcare Bioscience) using a Human Antibody Capture Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) according to the attached protocol.
  • the NthCCR6-IgG4Fc protein obtained in Example 6 was injected into a flow cell in which anti-human IgG antibody was immobilized, and was captured so as to have about 10 resonance units (hereinafter abbreviated as RU).
  • the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704, KM4705 and commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies which were diluted 2-fold stepwise from 27000 ng / mL to a concentration of 10 points, were supplied to the flow cell at a flow rate of 30 ⁇ L / min.
  • the sensorgram for each antibody concentration was obtained by injection.
  • the acquired sensorgram was analyzed using Biacore T100 Evaluation software (manufactured by GE Healthcare Bioscience), and the affinity of each antibody for human CCR6 was calculated.
  • each dissociation constant K D of 2.45 nm was the affinity of 4.97NM, 53103 or 11A9, respectively dissociation constant, K D, Of 70.9 nM and 20 nM, and a low affinity of 1/4 or less compared to MM or R6H1.
  • anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704 and KM4705 of the invention each dissociation constant K D of 0.38 nM, 1.15 nm, a 0.67nM or 6.52NM, any antibodies 6.5nM It had the following affinity. Particularly KM4592, KM4703 and KM4704 the dissociation constant, K D, is less high affinity 1.2 nM, had a superior high affinity as compared to existing anti-human CCR6 monoclonal antibodies.
  • CCR6G16 cells in which human CCR6 (hCCR6) was induced and expressed were prepared.
  • Mip-3 ⁇ a human CCR6-specific ligand
  • GPCR G-protein coupled receptor
  • CCR6G16 cells constructed in Example 3 were cultured in the presence of 10 nM ⁇ -estradiol (manufactured by SIGMA) for 24 to 48 hours to induce and express hCCR6.
  • CCR6G16 cells in which hCCR6 was inducibly expressed were suspended at 4 ⁇ 10 5 cells / mL with 10 mm HEPES (Invitrogen) -HBSS (GIBCO).
  • the value obtained by subtracting the AUC of the well not added with the ligand from the AUC of each well added with the ligand was defined as a calcium reaction.
  • the calcium reaction was shown with the calcium reaction at the time of addition of ligand 1 nM (no antibody) as 100% [FIG. 20 (b)].
  • anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4703 and KM4704 strongly inhibited Mip-3 ⁇ -dependent intracellular Ca 2+ increase compared to commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibodies.
  • anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592 and KM4705 hardly inhibited the increase in Mip-3 ⁇ -dependent intracellular Ca 2+ .
  • Example 9 Isolation and analysis of cDNA encoding variable region of anti-human CCR6 monoclonal antibody (1) Preparation of mRNA from anti-human CCR6 antibody-producing hybridoma Each hybridoma KM4592, KM4703, KM4704 obtained in Example 7 and MRNA was prepared from 5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cells of KM4705 using ISOGEN (Nippon Gene). Using the prepared mRNA as a template, cDNA of each anti-human CCR6 monoclonal antibody was prepared using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) according to the attached instruction manual.
  • VL light chain variable region
  • primers specific to mouse IgG1 (mouse-IgG1-a1 and mouse-IgG1-a2) using the cDNA obtained in Example 9 (1) as a template (SEQ ID NOs: 46 and 47) PCR was carried out using and the VH cDNA fragment of each antibody was amplified.
  • PCR was carried out using mouse Ig ( ⁇ ) specific primers (mouse-kappa-a1 and mouse-kappa-a2) (SEQ ID NOs: 48 and 49) instead of the antibody-specific subclass-specific primers.
  • the VL cDNA fragment was amplified. Thereafter, cloning was performed in the same manner as in Example 1 (1).
  • a vector containing a full-length VH cDNA and an expression vector containing a VL cDNA pCR / KM4592VL PCR, pCR / KM4592VH PCR, pCR / KM4703VL PCR, pCR / KM4703VH PCR, pCR / KM4704VL PCR, pCR / KM4704VH PCR, pCR / KM4705VL PCR and pCR / KM4705VH PCR were obtained.
  • a schematic diagram of the cloning is shown in FIG.
  • the base sequence and amino acid sequence of the variable region contained in the obtained anti-human CCR6 monoclonal antibody expression vector are shown below.
  • VH and VL base sequences of the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4592 are SEQ ID NOs: 50 and 53
  • amino acid sequences deduced from the sequences are SEQ ID NOs: 51 and 54
  • VH and VL amino acid sequences of the secreted antibody are SEQ ID NO: 52 and 55.
  • CDR1 to CDR3 of VH are shown in SEQ ID NOs: 56 to 58
  • CDR1 to CDR of VL are shown in SEQ ID NOs: 59 to 61.
  • VH and VL nucleotide sequences of the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4703 are SEQ ID NOs: 62 and 65
  • the amino acid sequences deduced from the sequences are SEQ ID NOs: 63 and 66
  • the VH and VL amino acid sequences of the secreted antibody are SEQ ID NO: 64 and 67.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VH are shown in SEQ ID NOs: 68 to 70, respectively
  • amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VL are shown in SEQ ID NOs: 71 to 73, respectively.
  • VH and VL nucleotide sequences of the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4704 are SEQ ID NOs: 74 and 77
  • the amino acid sequences deduced from the sequences are SEQ ID NOs: 75 and 78
  • the VH and VL amino acid sequences of the secreted antibody are SEQ ID NO: 76 and 79.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VH are shown in SEQ ID NOs: 80 to 82, respectively
  • amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VL are shown in SEQ ID NOs: 83 to 85, respectively.
  • VH and VL base sequences of the anti-human CCR6 monoclonal antibody KM4705 are shown in SEQ ID NOs: 86 and 89, the amino acid sequences deduced from the sequences are shown in SEQ ID NOs: 87 and 90, and the VH and VL amino acid sequences of the secreted antibody are shown in SEQ ID NO: 88 and 91.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VH are shown in SEQ ID NOs: 92 to 94, respectively, and the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of VL are shown in SEQ ID NOs: 95 to 97, respectively.
  • Example 10 Preparation of anti-CCR6 chimeric antibody (1) Construction of anti-human CCR6 chimeric antibody expression vector The chimeric antibody prepared in the present invention was prepared by using VH of the anti-human CCR6 monoclonal antibody obtained in Example 9 (2) and It is a chimeric antibody in which the H chain constant region and human kappa chain constant region of human IgG1 disclosed in WO 97/10354 are linked to VL.
  • KM4592VL primer KM4592K pKTABEX F and KM4592K pKTABEX R (SEQ ID NO: 98, 99), KM4592VH primer KM4592H pKTABEX92 and KM4592F, respectively, using pCR vectors containing DNA fragments encoding VL or VH of each antibody as templates.
  • H pKTABEX R (SEQ ID NO: 100, 101), KM4703VL primer KM4703 K pKTABEX F and KM4703 K pKTABEX R (SEQ ID NO: 102, 103), KM4703VH primer KM4703H pKTABEX F and KM4703Hp 105 , KM4704VL primer KM4704 pKTABEX F and KM4704 K pKTABEX R (SEQ ID NO: 106, 107), KM4704VH primer KM4704 H pKTABEX F and KM4704 H pKTABEX R (SEQ ID NO: 108, 109), KM4705VL primer KM4705KXFK 110, 111) and KM4705VH primers KM4705H pKTABEX F and KM4705H pKTABEX R (SEQ ID NOS: 112, 113) were used to amplify DNA fragments
  • PCR is 0.5 ⁇ g / mL pCR / VH or VL vector, 2 ⁇ KOD-FX buffer 25 ⁇ L, 0.4 mm dNTP, KOD-FX polymerase (manufactured by TOYOBO) 1 ⁇ L, each containing 50 ⁇ L of total 0.3 ⁇ M primer.
  • a solution was prepared, heated at 94 ° C. for 2 minutes, and then subjected to 30 cycles of 94 ° C. for 20 seconds and 68 ° C. for 40 seconds.
  • a pCR vector containing DNA fragments encoding VH and VL was prepared.
  • the DNA fragment encoding VL was digested with restriction enzymes BglII (manufactured by New England Biolabs) and BsiWI (manufactured by New England Biolabs) to obtain a BglII-BsiWI fragment of VL. Further, the DNA fragment encoding VH was digested with restriction enzymes SalI (manufactured by New England Biolabs) and NheI (manufactured by New England Biolabs) to obtain a SalI-NheI fragment of VH.
  • the obtained DNA fragment encoding the VH or VL is inserted into an appropriate position of the human pKTABEX-Tc26.2 expression vector, and the anti-human CCR6 monoclonal antibodies KM4592, KM4703, KM4704 or KM4705 are used.
  • Anti-human CCR6 chimeric antibody expression vectors pKTABEX-Tc26.2 / KM4592, pKTABEX-Tc26.2 / KM4703, pKTABEX-Tc26.2 / KM4704 and pKTABEX-Tc26.2 / KM4705 containing DNA encoding the variable region of .
  • Example 10 (2) Expression and purification of anti-human CCR6 chimeric antibody using animal cells
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody expression vector prepared in Example 10 (1) was expressed in the same manner as in Example 1 (3).
  • the fucosyltransferase (FUT8) gene was introduced into CHO-K1 cells knocked out (hereinafter referred to as CHO-K1 FUT8KO), and anti-human CCR6 chimeric antibody expressing cells CHO / KM4592 (Fu-), CHO / KM4703 (Fu-), CHO, / KM4704 (Fu-) and CHO / KM4705 (Fu-) were prepared.
  • an anti-dinitrophenylazine (DNP) human antibody (Motoki K et. Al., Clin. Cancer Res. 11, 3126-3135, 2005) was prepared.
  • the cells were cultured in CHX / IMDM medium for 1 week in the same manner as in Example 6 (2).
  • a purified antibody was obtained from the obtained culture supernatant using Mabselect (manufactured by Millipore) in the same manner as in Example 6 (2) above.
  • the purified antibody was subjected to SDS-PAGE analysis to confirm the antibody protein.
  • Example 11 Evaluation of activity of anti-human CCR6 chimeric antibody
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera, and KM4705 obtained in Example 10 (2) The activity of the chimera was evaluated.
  • Example 1 Analysis of binding activity of anti-human CCR6 chimeric antibody to human and cynomolgus CCR6 by fluorescent cell staining method (FCM analysis)
  • FCM analysis Anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera and KM4705 chimera were prepared in Example 1.
  • the binding activity to human CCR6-expressing CHO cells (CHO-hCCR6) and cynomolgus monkey CCR6-expressing CHO cells (CHO-cynomolgus CCR6) prepared in Example 5 was measured by the same method as in Example 8 (1).
  • Alexa Fluor 488 goat anti-human IgG (H + L) manufactured by Invitrogen, cat. A11013 was used as the secondary antibody.
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4592 chimera [FIG. 22 (a)], KM4703 chimera [FIG. 22 (b)], and KM4704 chimera [FIG. c)] and KM4705 chimera [FIG. 22 (d)] reacted to both CHO-hCCR6 and CHO-cynomolgus CCR6 in an antibody concentration-dependent manner (FIG. 22).
  • the reactivity of any antibody to human CCR6 and cynomolgus monkey CCR6 was equivalent, and had the same binding activity as the parent antibody.
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera and KM4705 chimera of the present invention all bind to CHO-hCCR6, CHO-mECL1hCCR6, CHO-mECL2hCCR6 and CHO-mECL3hCCR6, and to CHO-mNtCCR6. It did not bind only to (FIG. 23). Moreover, the anti-DNP antibody did not bind to any cells.
  • the epitope of the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera and KM4705 chimera of the present invention is the same as that of each parent antibody, and all antibodies have amino acids 1 to 46 of human CCR6. It became clear that it reacts with the epitope of the containing N terminal region.
  • all of the anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera and KM4704 chimera contain CCR6 containing the 9th to 23rd amino acid sequences of human CCR6 containing a sulfated Tyr residue as compared with the negative control anti-DNP antibody. It bound strongly to the -2S peptide. Further, it did not bind at all to the CCR6-1 peptide containing the 1st to 17th amino acid sequences of human CCR6 and the CCR6-2 peptide containing the 9th to 23rd amino acid sequences of human CCR6 (FIG. 24).
  • the anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera and KM4704 chimera all bind to the amino acid sequence from 9th to 23rd, and in particular to the epitope containing the 18th sulfated Tyr residue of human CCR6. Became clear.
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4705 chimera of the present invention binds strongly to the CCR6-1 peptide containing the first to 17th amino acid sequences of human CCR6 and contains CCR6 containing the 9th to 23rd amino acid sequences of human CCR6. It also bound to the CCR6-2S peptide containing the 9th to 23rd amino acid sequences of human CCR6 containing the -2 peptide and sulfated Tyr residues (FIG. 24).
  • the anti-human CCR6 chimeric antibody KM4705 chimera binds to human CCR6 regardless of the presence or absence of sulfation of the 18th Tyr of human CCR6, so the 1st to 23rd amino acids not containing the 18th Tyr side chain It has been shown that it binds to a sequence and in particular to an epitope comprising the amino acid sequence from 9th to 17th of human CCR6.
  • FIG. 25 shows the amount of intracellular Ca 2+ increase (%) in each antibody-added well when the value obtained by subtracting the AUC of the well not added with ligand from the AUC of the well added with 1 nM of ligand is 100%. Shown in
  • anti-CCR6 chimeric antibodies KM4703 chimera and KM4704 chimera strongly inhibited Mip-3 ⁇ -dependent intracellular Ca 2+ increase compared to commercially available anti-human CCR6 monoclonal antibody. Further, the anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera and KM4705 chimera hardly inhibited the increase in Mip-3 ⁇ -dependent intracellular Ca 2+ .
  • the anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4703 chimera and KM4704 chimera exhibit strong neutralizing activity. Further, like the binding activity of each chimeric antibody confirmed in Examples 11 (1) to (3), the neutralizing activity of any anti-human CCR6 chimeric antibody was equivalent to that of each parent antibody.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • Lymphoprep (Axis-Shield) dispensed 12.5 mL into a 50 mL tube (Greiner), 25 mL of diluted peripheral blood was gently layered and centrifuged for 20 minutes at 840 g, brake off, and room temperature. Separated, the mononuclear cell layer was separated. The mononuclear cell fraction thus obtained was washed twice with an ADCC medium, adjusted to an optimal cell density with the same medium, and used as an effector cell suspension.
  • each antibody solution was given a final concentration of 10000 ng / mL, 100 ng / mL, 1 ng / mL, 0.1 ng / mL,.
  • the target cell suspension prepared in (5) -1 was then dispensed at 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L / well, and finally prepared in (5) -2.
  • the effector cell suspension was dispensed at 2.5 ⁇ 10 5 cells / 50 ⁇ L / well to a total volume of 150 ⁇ L and reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours.
  • anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera, and KM4705 chimera showed ADCC activity against human CCR6-expressing CHO cells CHO-hCCR6 [FIGS. 26 (a) and (b)].
  • Flow Count manufactured by BECKMAN COULTER
  • Flow Count as an internal standard was added at 100 ⁇ L / well, centrifuged, and the supernatant was removed. Further, after washing the cells with 1 to 2 mL of FACS buffer, 1 mL of FACS buffer and 1 ⁇ L LIVE / DEAD yellow (manufactured by Invitrogen) were added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 30 minutes in the dark.
  • the cells were washed with a FACS buffer, 100 ⁇ L of PBS containing 0.2 mg / mL human IgG (manufactured by Sigma) was added, and reacted at 4 ° C. for 1 hour in the dark.
  • the cells were washed with FACS buffer, and various staining antibodies (FITC-labeled anti-CD3 antibody, AF700-labeled anti-CD45RO antibody, PerCPCy5.5 standard anti-CD45RA antibody for T cell staining, and PerCPCy5.5 label for B-cell staining) 100 ⁇ L FACS buffer containing an appropriate amount of anti-CD19 antibody was added and reacted in the dark for 20 minutes at 4 ° C., then the cells were washed with FACS buffer, and 100 ⁇ L PFA (para form aldehyde) was added. And allowed to react at room temperature for 10 minutes.
  • various staining antibodies FITC-labeled anti-CD3 antibody, AF700-labeled anti-CD45RO antibody, PerCPCy5.5 standard anti-CD45RA antibody for T cell staining, and PerCPCy5.5 label for B-cell staining
  • the cells were washed with FACS buffer, suspended in 300 ⁇ L of FACS buffer, and the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer (LSRIIFlow cytometer (registered trademark), Becton Dickinson). The data measurement was completed when the number of Flow Count Beads used as an internal standard reached 50000 counts.
  • LSRIIFlow cytometer registered trademark
  • Becton Dickinson The data measurement was completed when the number of Flow Count Beads used as an internal standard reached 50000 counts.
  • the anti-human CCR6 chimeric antibodies KM4592 chimera, KM4703 chimera, KM4704 chimera, and KM4705 chimera exhibited cytotoxic activity against CD19 + B cells and CD3 + CD45RO + CD45RA-Memory T cells, while cytotoxic against CD3 + CD45RO-CD45RA + Native T cells. It was confirmed that no activity was shown [FIGS. 27 (a) and (b)].
  • SEQ ID NO: 5 base sequence of Human-CCR6-f primer
  • SEQ ID NO: 6 base sequence of Human-CCR6-r primer
  • SEQ ID NO: 7 base sequence of CCR6MunI-f primer
  • SEQ ID NO: 8 base sequence sequence number of CCR6BamHI-r primer 9: nucleotide sequence of Human-1-162-f primer
  • SEQ ID NO: 10 nucleotide sequence of Human-138-288-r primer
  • SEQ ID NO: 11 nucleotide sequence of Human-264-413-f primer
  • SEQ ID NO: 12 Human-394 -540-r primer nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 13 Human-519-677-f primer nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 14 Human-649-781-r primer nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 15 Human-759-914-f primer
  • Nucleotide sequence number 16 nucleotide sequence of Human 890-1020-r primer

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Abstract

　本発明は、高いアフィニティーでヒトＣＣＲ６に結合しかつ中和活性を有する抗体および該抗体断片、硫酸化されたヒトＣＣＲ６に結合する抗体および該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、並びに抗体または該抗体断片を用いた治療薬および診断薬に関する。

Description

抗ヒトＣＣＲ６抗体
　本発明は、硫酸化されたヒトＣＣＲ６の細胞外領域に結合する抗体および該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、並びに抗体または該抗体断片を含む治療薬および診断薬に関する。
　ヒトＣＣケモカイン受容体６（ＣＣ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　６または、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＣＣ　ｍｏｔｉｆ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ　６）（以下、ＣＣＲ６と記す）は、別名ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ　３（ＣＫＲ－Ｌ３）、ＳＴＲＬ２２、ＤＲＹ６、ＧＰＲ－ＣＹ４、ＢＮ－１、ＤＣＣＲ２、ＤＣＲ２、表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；以下、ＣＤと記す）１９６（ＣＤ１９６）、Ｇタンパク質結合受容体２９（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２９；ＧＰＲ２９）、ＣＭＫＢＲ６、ＣＣ－ＣＫＲ－６などとしても知られる。
　ヒトＣＣＲ６は、１９９６年にＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｕｐｊｏｈｎ社においてオーファン受容体ＣＫＲ－Ｌ３として単離同定された（非特許文献１）。一方、ヒトＣＣＲ６タンパク質をコードする遺伝子は、ＳＴＲＬ２２として、１９９７年にクローニングされた（非特許文献２）。また、ヒトＣＣＲ６のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、公的データベース上に公開されており、例えば、ＮＭ＿００４３６７、ＮＭ＿０３１４０９およびＮＰ＿００４３５８等のアクセッション番号から参照可能である。しかし、ヒトＣＣＲ６タンパク質の立体構造は、いまだ明らかにされていない。
　ヒトＣＣＲ６は、７回膜貫通型の構造を有するＧタンパク質共役型受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）であり、分子量約６５　ｋＤａ、全長３７４アミノ酸からなる膜タンパク質である。ヒトＣＣＲ６の構造上の特徴は、多くのＧＰＣＲに共通して認められているように細胞外ループ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｏｐ、以下ＥＣＬと記す）１と細胞外ループ２（ＥＣＬ２）とが、分子内ジスルフィド結合していることが示唆されている（非特許文献３）。
　ヒトＣＣＲ６の１番目～４６番目のアミノ酸配列を含むＮ末端側細胞外ドメイン（以下、Ｎｔと略記することもある）には、１１個のセリン残基（Ｓｅｒ）と１個のスレオニン残基（Ｔｈｒ）が存在しており、これらＳｅｒ残基およびＴｈｒ残基にＯ型糖鎖が付加される可能性があることが、インシリコ予測実験の結果から示唆されている。また、Ｎ結合型糖鎖付加の可能性がある部位も、Ｎｔに２箇所、ＥＣＬ１とＥＣＬ３にぞれぞれ１箇所ずつ存在するが、実際にＮ結合型糖鎖が生体内で付加されているのか否かは未だ不明である。
　また、Ｎｔに存在する１８番目のチロシン残基が硫酸化修飾される可能性がインシリコでの予測実験の結果から示唆されている（非特許文献４）。一方で、ＣＣＲ６以外の他のいくつかのＧＰＣＲにおいては、Ｎ末端細胞外領域に存在するＴｙｒ残基の硫酸化がｉｎ　ｖｉｔｒｏで確認されており、これらの硫酸化Ｔｙｒはリガンドとの結合やそれに伴う遊走活性に重要であることが示されている（非特許文献５）。
　ヒトＣＣＲ６はリガンドであるケモカインと結合し、細胞内にＧαｉタンパク質を介したシグナルを伝達し（非特許文献６）、その結果、Ｔｈ１７細胞の遊走、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ；以下、ＩＬと略記する）－１７などの炎症性サイトカインの分泌に関与することが知られている。
　ヒトＣＣＲ６に結合するリガンドとしては、ケモカインの一種Ｍｉｐ－３α（ＬＡＲＣ／ＣＣＬ２０）およびデフェンシンβ（ｄｅｆｅｎｓｉｎ－β）が報告されている（非特許文献７、８）。マクロファージ炎症性タンパク質（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３α；Ｍｉｐ－３α）はマクロファージおよび肝細胞から分泌され、またデフェンシンβは上皮、皮膚、口腔および気管からそれぞれ分泌されることが明らかになっており、Ｔｈ１７細胞を炎症局所へ誘引することにより感染防御に関与するとともに、炎症惹起にも関与することが知られている。
　ヒトＣＣＲ６はＴｈ１７細胞に発現が認められている。従来ヘルパーＴ細胞には細胞性免疫に関与するＴｈ１細胞と液性免疫に関与するＴｈ２細胞という２つのサブセットが存在することが知られていた。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞とは性質の異なるヘルパーＴ細胞のサブセットの１つとして、近年新たに発見されたヘルパーＴ細胞である。
　Ｔｈ１７細胞は、ヒト血中においてＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の約数％を占める。Ｔｈ１７細胞は炎症性サイトカインであるＩＬ－１７、ＩＬ－２１およびＩＬ－２２を産生する能力を有しており（非特許文献９）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、乾癬および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫疾患の病態形成に密接に関与していることが明らかとなってきている（非特許文献１０－１４）。
　Ｔｈ１７細胞は、現在、自己免疫疾患治療薬の新規ターゲット細胞として世界中で注目されている。ヒト末梢血中の大部分のＴｈ１７細胞は、ＣＣＲ６を発現していることが明らかになっている（非特許文献１５－１９）。これまでに、ヒトＣＣＲ６はＴｈ１７細胞の特異的マーカーとして様々な研究に利用されている。
　また、Ｔｈ１７細胞は、ＨＩＶ感染、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）および歯周病等にも関与が示唆されている（非特許文献２０－２２）。
　ヒトＣＣＲ６は、Ｔｈ１７細胞以外にもＴｈ１／１７細胞、γδＴ細胞、Ｔｈ２２細胞、メモリーＢ細胞、ナイーブＢ細胞、一部のＣＤ８細胞および一部のＴｈ１細胞等にも発現が認められており、これらの細胞も自己免疫疾患との関連が報告されている（非特許文献２３－２９）。更に、ヒトＣＣＲ６は調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ；Ｔｒｅｇ）のうち、ＩＬ－１７産生能を有する細胞群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）にも発現していることが知られている（非特許文献３０）。近年になって、Ｉｎｎａｔｅ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ（自然免疫のリンパ系細胞；ＩＬＣ）という自然免疫系の細胞が明らかとなってきており（非特許文献３１）、その一部（ＩＬＣ１７またはＩＬＣ２等）ではヒトＣＣＲ６の発現および病態（ＩＢＤまたは副鼻腔炎）との関連が報告されている（非特許文献３２－３４）。
　また肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌または大腸癌などの癌においても、ＣＣＲ６の発現が確認されており、癌の増殖、浸潤および転移に関係していると考えられている（非特許文献３５－３８）。
　抗ＣＣＲ６抗体としては、５３１０３（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１１Ａ９（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、４Ｃ６（ＡＴＧｅｎ社製）、Ｒ６Ｈ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＴＧ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）またはＭＭ（ａｂｃａｍ社製）等が知られている。
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１９９６　２２７：８４６－５３． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１９９７　４０：１７５－８０． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ　２００２，４１：８３３２－８３４１． Ａｍ　Ｊ　Ｒｅｓｐｉｒ　Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３８：７３８－７４３． Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　２００６；２６：５８３８－５８４９． Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　２００５；２８８：Ｃ３２１ Ｊ　Ｌｅｕｋｏｃ　Ｂｉｏｌ　１９９７；６２：６３４－６４４． Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９９；２８６：５２５－５２８． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　２００８；２８：４５４－４６７． Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ　２００８；２２３：８７－１１３ Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｔｈｅｒ　Ｔａｒｇｅｔｓ；２０１０；１４：９１１－２２． Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐｅｒｉ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００９；１５７：２０９－２１５ Ｊ　Ｉｎｔｅｒ　Ｍｅｄ　２００９；２６５：６４４－６５２． Ｃｌｉｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ　２０１０；２９：１２５１－１２５８． Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７　８：６３９－４６． Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．２００７　２０４：１８４９－６１． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００８　１８０（１２）７９４８－５７． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：２１４－２１． Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ　Ａｌｌｅｇｙ　Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔ　２００９；８：２２１－２８． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２０１０；１８４：１６０４－１６． Ｂｌｏｏｄ　２０１０；１１６：１１６５－７１． Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００２；１２８：５４８－５４． Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９９９；１６２：１８６－１９４． Ｂｌｏｏｄ　２０００；９６：２３３８－４５． Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ　２００９；６６：３９０－４０２． Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０１１），Ａｕｊｉａ　ｅｔ　ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２０１１．０２．００２．，ｉｎ　ｐｒｅｓｓ． Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０；１３０：１３７３－１３８３． ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　２０１０，５，１４１０８． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２００９；１８２：１７９４－１７９８． Ｂｌｏｏｄ　２００９；１１３：４２４０． Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１　１２：２１－２７ Ｎａｔｕｒｅ　２０１０　４６４：１３７１－５ ＪＥＭ　２０８　１１２７－１１３３ Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１　１２：１０５５－６３ Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　Ｈｅｐａｔｏｌ　２００６；２１：１６１－８． Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　２００４；１０：３７４－３８０． Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　２００８；１３４：１１８１－８９． Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２００７；１７８：８０１３－２１．
　上記したように、ヒトＣＣＲ６のＮｔに存在する１８番目のチロシン残基が硫酸化修飾される可能性がインシリコでの予測実験の結果から示唆されている。一方で、ＣＣＲ６以外の他のいくつかのＧＰＣＲにおいては、Ｎ末端細胞外領域に存在するＴｙｒ残基の硫酸化がｉｎ　ｖｉｔｒｏで確認されており、これらの硫酸化Ｔｙｒはリガンドとの結合やそれに伴う遊走活性に重要であることが示されている。しかしながら、上記した従来の抗ＣＣＲ６抗体が認識するエピトープなどの詳細は明らかでない。
　したがって、本発明は、硫酸化されたヒトＣＣＲ６に結合する抗体および該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いた抗体または該抗体断片の製造方法、抗体または該抗体断片を用いた治療薬および診断薬を提供することを目的とする。
（１）硫酸化されたヒトＣＣケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）の細胞外領域に結合する抗体および該抗体断片。
（２）前記ヒトＣＣＲ６の細胞外領域が、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～４６番目のアミノ酸を含む、（１）に記載の抗体および該抗体断片。
（３）抗体および該抗体断片が結合するエピトープが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを少なくとも含む、（１）または（２）に記載の抗体および該抗体断片。
（４）前記エピトープが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含む、（１）～（３）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（５）前記エピトープにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒが硫酸化されている、（１）～（４）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（６）抗体が下記（ａ）～（ｄ）から選ばれる抗体である、（１）～（５）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。　
（ａ）それぞれ配列番号５６～５８で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３およびそれぞれ配列番号５９～６１で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域、それぞれ配列番号６８～７０で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号７１～７３で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域並びにそれぞれ配列番号８０～８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域から選ばれるいずれか１つの抗体可変領域を含む抗体。
（ｂ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｃ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｄ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（７）抗体が下記（ｅ）～（ｈ）から選ばれる抗体である、（１）～（６）のいずれか１に記載の抗体および該抗体断片。
（ｅ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域並びに配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号７９に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域から選ばれるいずれか１つの抗体可変領域を含む抗体。
（ｆ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体および該抗体断片。
（ｇ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（ｈ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
（８）抗体が、遺伝子組換え抗体である（１）～（７）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（９）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（８）に記載の抗体または該抗体断片。
（１０）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる、（１）～（９）のいずれか１に記載の抗体断片。
（１１）（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）に記載のＤＮＡを含むベクターを導入して得られる形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１～１０のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
（１３）（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を用いるヒトＣＣＲ６の検出または測定用試薬。
（１４）（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
（１５）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患が癌および自己免疫疾患から選ばれる疾患である、（１４）に記載の診断薬。
（１６）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が、ｎａｉｖｅ／ｍｅｍｏｒｙ　Ｂ細胞、Ｔｈ１／１７細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｈ２２細胞から選ばれる少なくとも１つの細胞である、（１４）または（１５）に記載の診断薬。
（１７）（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
（１８）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患が癌および自己免疫疾患から選ばれる疾患である、（１７）に記載の治療薬。
（１９）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が、ｎａｉｖｅ／ｍｅｍｏｒｙ　Ｂ細胞、Ｔｈ１／１７細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｈ２２細胞から選ばれる少なくとも１つの細胞である、（１７）または（１８）に記載の治療薬。
（２０）（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を用いてヒトＣＣＲ６陽性細胞を検出または測定することを含む、ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（２１）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の使用。
（２２）ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、（１）～（１０）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の使用。
　本発明により、硫酸化されたヒトＣＣＲ６に結合する抗体および該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いた抗体または該抗体断片の製造方法、抗体または該抗体断片を用いた治療薬および診断薬を提供することができる。
図１は、ヒトＣＣＲ６遺伝子のクローニングの概略図を示す。 図２（ａ）は、ヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６の構築の概略図を示す。図２（ｂ）は、Ｔｃ２６－ｈＣＣＲ６の構築の概略図を示す。 図３（ａ）および（ｂ）は、ヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６［図３（ａ）］およびＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６［図３（ｂ）］の細胞表面のＣＣＲ６発現量をＦＣＭで解析した結果を示す。図３（ｃ）は、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６に発現しているｈＣＣＲ６－Ｈｉｓタグに対するＦＣＭ解析の結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度（ＦＬ１）を示す。 図４（ａ）および（ｂ）は、ヒトＣＣＲ６発現細胞Ｕ９３７－ＣＣＲ６［図４（ａ）］およびＣＣＲ６Ｇ１６［図４（ｂ）］の細胞表面のＣＣＲ６発現量をＦＣＭで解析した結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度［図４（ａ）はＦＬ１、図４（ｂ）はＦＬ３］を示す。 図５は各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ベクターの構築の模式図を示す。 図６は各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ベクター構築に用いるプライマーの対応を示す。 図７（ａ）～（ｇ）は、各種細胞の細胞表面のヒトマウスキメラＣＣＲ６発現量を、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体を用いたＦＣＭで解析した結果を示す。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４〔図７（ａ）〕各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞［ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６〔図７（ｂ）〕、ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６〔図７（ｃ）〕、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６〔図７（ｄ）〕、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６〔図７（ｅ）〕、ＣＨＯ-hＣＣＲ〔図７（ｆ）〕およびＣＨＯ－ｍＮｔ－ｈＣＣＲ６〔図７（ｇ）〕］の細胞表面のヒトマウスキメラＣＣＲ６発現量を、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体を用いたＦＣＭで解析した結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度［図７（ａ）から図７（ｆ）はＦＬ１、図７（ｇ）はＦＬ２］を示す。 図８（ａ）～（ｄ）は、各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞［ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６〔図８（ａ）〕、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６〔図８（ｂ）〕、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６〔図８（ｃ）〕およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６〔図８（ｄ）〕］のＣＣＲ６発現量を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＦＣＭで解析した結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度（ＦＬ１）を示す。 図９（ａ）および（ｂ）は、カニクイザルＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６の細胞表面のＣＣＲ６発現量を、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体を用いたＦＣＭ［図９（ａ）］および抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＦＣＭ［図９（ｂ）］で解析した結果を示す。いずれのヒストグラムも、縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度（ＦＬ１）を示す。 図１０は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を融合させたヒトＣＣＲ６　Ｎ末端細胞外ドメイン発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ／ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃの構築の模式図を示す。 図１１は、グリコシダーゼで消化したヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４ＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。 図１２は、ヒトＣＣＲ６　Ｎ末端細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃに対する抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡの結果を示す。縦軸に結合活性（ＯＤ４１５／４９０）を、横軸に反応させたタンパク質の種類を示す。 図１３は、精製した抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４およびＫＭ４７０５のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。 図１４は、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の説明書の情報を示す。 図１５（ａ）～（ｄ）は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２［図１５（ａ）］、ＫＭ４７０３［図１５（ｂ）］、ＫＭ４７０４［図１５（ｃ）］およびＫＭ４７０５［図１５（ｄ）］のヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６およびカニクイザルＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６に対する結合活性を、ＦＣＭで解析した結果を示す。縦軸に結合活性（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を、横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。 図１６（ａ）～（ｃ）は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４およびＫＭ４７０５並びに市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６、各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６に対する結合活性を、ＦＣＭで解析した結果を示す。縦軸に結合活性（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を、横軸に各ＣＣＲ６発現細胞を示す。 図１７（ａ）および（ｂ）は、ヒトＣＣＲ６のＮ末細胞外ドメインアミノ酸配列およびｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡに用いた合成ペプチドを示した。 図１８（ａ）および（ｂ）は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の各種ヒトＣＣＲ６Ｎ末端部分ペプチドに対する結合活性を、ｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。図１８（ａ）は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体、図１８（ｂ）は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４抗体の結果を示す。いずれも縦軸に結合活性（ＯＤ４１５／４９０）を、横軸に反応させたペプチドの種類を示す。 図１９（ａ）～（ｈ）は、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体５３１０３［図１９（ａ）］、Ｒ６Ｈ１［図１９（ｂ）］、１１Ａ９［図１９（ｄ）］およびＭＭ［図１９（ｄ）］、並びに抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２［図１９（ｅ）］、ＫＭ４７０３［図１９（ｆ）］、ＫＭ４７０４［図１９（ｇ）］およびＫＭ４７０５［図１９（ｈ）］のＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質への結合活性を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて解析した結果を示す。図１９（ａ）～（ｈ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ解析結果から得られた各抗体の典型的なセンサーグラムを示す。縦軸は抗体反応性（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔ；ＲＵ）、横軸は抗体をインジェクションしてからの時間（ｓｅｃ）を示す。 図２０（ａ）は、ヒトＣＣＲ６発現ｎａｍａｌｗａ細胞を用いた、ヒトＣＣＲ６特異的リガンドＭｉｐ－３α依存的ヒトＣＣＲ６シグナルによる細胞内カルシウム増加量を測定するカルシウムアッセイ系の概略図を示す。図２０（ｂ）は、各抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体存在下のＭｉｐ－３α依存的ヒトＣＣＲ６シグナルによる細胞内カルシウム増加量（％）を示す。縦軸に、Ｍｉｐ－３α依存的な細胞内カルシウム増加量（％）を、横軸に添加した抗体およびリガンドを示す。 図２１は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４のＫＭ４７０５抗体可変領域をコードする遺伝子のクローニングおよび抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現ベクター作製の概略図を示す。 図２２（ａ）～（ｄ）は、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ［図２２（ａ）］、ＫＭ４７０３キメラ［図２２（ｂ）］、ＫＭ４７０４キメラ［図２２（ｃ）］およびＫＭ４７０５キメラ［図２２（ｄ）］のヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６およびカニクイザルＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６に対する結合活性を、ＦＣＭで解析した結果を示す。縦軸に結合活性（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を、横軸に抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。 図２３は、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラのヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６、各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６に対する結合活性を、ＦＣＭで解析した結果を示す。縦軸に結合活性（ｍｅａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＭＦＩ）を、横軸に各ＣＣＲ６発現細胞を示す。 図２４は、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラ、ＫＭ４７０５キメラの各種ヒトＣＣＲ６Ｎ末端部分ペプチドに対する結合活性を、ｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。縦軸に結合活性（ＯＤ４１５／４９０）を、横軸に用いたペプチドを示す。 図２５は、ヒトＣＣＲ６発現ｎａｍａｌｗａ細胞を用いた、Ｍｉｐ－３α依存的細胞内カルシウム増加アッセイ系における、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体の中和活性を示した。縦軸に細胞内カルシウム増加量（％）、横軸に添加した抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体を示す。 図２６（ａ）および（ｂ）は、健常人末梢血［ドナー番号＃１１－０６７〔図２６（ａ）〕および＃１１－０６８〔図２６（ｂ）〕］から単離したＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた、ヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）に対する抗ＣＣＲ６抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。横軸に各抗体の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。また、●はキメラ抗体ＫＭ４７０３キメラ、▲はキメラ抗体ＫＭ４７０４キメラ、■はキメラ抗体ＫＭ４７０５キメラ、◆はキメラ抗体ＫＭ４５９２キメラを示す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。 図２７（ａ）および（ｂ）は、健常人末梢血［ドナー番号＃４５〔図２７（ａ）〕および９５〔図２７（ｂ）〕］から単離したＰＢＭＣ中のＴおよびＢ細胞に対する抗ＣＣＲ６抗体の除去活性を示す。抗ＤＮＰ抗体で処理したサンプルにおけるメモリー（Ｍｅｍｏｒｙ）Ｔ細胞、ナイーブ（Ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞ないしＢ細胞の生細胞数を１００％とした際の、各種生細胞数の割合を縦軸に示した。横軸には、処理した抗体の名称を示した。
　本発明は、硫酸化されたヒトＣＣＲ６に結合する抗体および該抗体断片に関する。本発明の抗体および該抗体断片としては、硫酸化されたヒトＣＣＲ６の細胞外領域に結合する抗体および該抗体断片が挙げられる。該ヒトＣＣＲ６の細胞外領域は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～４６番目のアミノ酸を含むことが好ましい。
　本発明の抗体および該抗体断片が結合するエピトープは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを少なくとも含むことが好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むことがより好ましい。また、本発明の抗体および該抗体断片が結合するエピトープにおいて、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒは硫酸化されていることが好ましい。
　本発明の抗体として、具体的には、硫酸化されたヒトＣＣＲ６の配列番号２で表されるアミノ酸配列における１８番目のＴｙｒをエピトープに含む抗体およびヒトＣＣＲ６の硫酸化された配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒをエピトープに含む抗体が挙げられる。
　また、本発明の抗体としては、ヒトＣＣＲ６に対して高いアフィニティーを有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むエピトープに結合した結果、ヒトＣＣＲ６の中和活性を有する抗体が挙げられる。
　また、本発明の抗体としては、ヒトＣＣＲ６に対して高いアフィニティーを有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むエピトープに結合した結果、ヒトＣＣＲ６発現細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を有する抗体が挙げられる。
　更に、本発明の抗体としては、硫酸化されたヒトＣＣＲ６に結合し且つ硫酸化されていないヒトＣＣＲ６には結合しない抗体、硫酸化されたアミノ酸残基を含むヒトＣＣＲ６に特異的に結合し且つ硫酸化されていないアミノ酸残基を含むヒトＣＣＲ６には結合しない抗体、並びにヒトＣＣＲ６の硫酸化された配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを含むエピトープに特異的に結合し且つ硫酸化されていない配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを含むエピトープには結合しない抗体が挙げられる。
　本発明の抗体としては、具体的には、下記（ａ）～（ｄ）から選ばれる抗体が挙げられる。　
（ａ）それぞれ配列番号５６～５８で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１～３およびそれぞれ配列番号５９～６１で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域（以下、Ｖ領域と記す）、それぞれ配列番号６８～７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号７１～７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域並びにそれぞれ配列番号８０～８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域から選ばれるいずれか１つのＶ領域を含む抗体。
（ｂ）上記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体。
（ｃ）上記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体。
（ｄ）上記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体。
　より具体的には、以下の（ｅ）～（ｈ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ｅ）配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域並びに配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域から選ばれるいずれか１つの抗体Ｖ領域を含む抗体。
（ｆ）上記（ｅ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体。
（ｇ）上記（ｅ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体。
（ｈ）上記（ｅ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体。
　さらに具体的には、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域を含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の一態様としてはＫＭ４５９２が挙げられる。配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域を含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の一態様としてはＫＭ４７０３が挙げられる。配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域を含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の一態様としてはＫＭ４７０４が挙げられる。配列番号８８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含むＶ領域を含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の一態様としてはＫＭ４７０５が挙げられる。
　また、本発明の抗体としては、硫酸化されたヒトＣＣＲ６と硫酸化されていないＣＣＲ６の両方に結合する抗体、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒが硫酸化されているヒトＣＣＲ６と配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒが硫酸化されていないＣＣＲ６との両方に結合する抗体、ならびに硫酸化された配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを含むエピトープと硫酸化されていない配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを含むエピトープの両方に結合する抗体が挙げられる。
　また、本発明の抗体としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～２３番目のアミノ酸配列に結合する抗体、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～１７番目のアミノ酸配列を含むエピトープに結合する抗体も含まれる。具体的には、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０５、ＫＭ４７０５が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体およびＫＭ４７０５が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体などが挙げられる。
　本発明の抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体とは、ヒトＣＣＲ６に本発明の抗体と同一または部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。また、本発明の抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体とは、本発明の抗体が認識するヒトＣＣＲ６上の同一のアミノ酸残基を認識し結合しうる抗体をいう。
　本発明の抗体としては、ヒトＣＣＲ６のＮ末端領域に特異的に結合し且つヒトＣＣＲ６の中和活性を有する抗体、ヒトＣＣＲ６のＮ末端領域に特異的に結合し且つＡＤＣＣ活性を有する抗体、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸に結合しかつヒトＣＣＲ６中和活性を有する抗体ならびに配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むエピトープに結合しかつＡＤＣＣ活性を有する抗体なども含まれる。
　本発明において、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４３５８のアミノ酸配列を配列番号２と記載する。本発明においてヒトＣＣＲ６としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＣＲ６の機能を有するポリペプチド、ならびに配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなりかつヒトＣＣＲ６の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数１０個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトＣＣＲ６をコードする遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列が挙げられる。配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつヒトＣＣＲ６の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＣＣＲ６の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＣＣＲ６の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども本発明のヒトＣＣＲ６をコードする遺伝子に含有される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列を含むＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味し、具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０　ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドガラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては配列番号１で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４３６７またはＮＭ＿０３１４０９の塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる
　真核生物のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も本発明のヒトＣＣＲ６をコードする遺伝子に含有される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍＬ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ　の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ　の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍＬ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍＬ）。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを得ることができる。さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るポリペプチド、または図１において１以上のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法またはｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明におけるヒトＣＣＲ６の細胞外領域としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＳＯＳＵＩ／ＳＯＳＵＩ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍＬ）、ＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍＬ）、ＴＭＨＭＭ　ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などがあげられる。具体的には、ＴＭｐｒｅｄにおいて予測される細胞外ドメインであるＮ末より５０番目までをＮ末細胞外ドメイン、１００番目から１１７番目までをｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｏｐ（以下、ＥＣＬと略記する）１、１７８番目から２０７番目までをＥＣＬ２、２６６番目から２８８番目までをＥＣＬ３として挙げることができる。Ｎ末細胞外ドメインとしては配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、１番目から４６番目のアミノ酸などを挙げることができる。
　本発明におけるヒトＣＣＲ６の細胞外領域としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むヒトＣＣＲ６の細胞外領域が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＣＣＲ６の細胞外領域が天然状態でとりうる構造とは、細胞膜上に発現しているヒトＣＣＲ６の天然型の立体構造のことをいう。
　本発明の抗体またはその抗体断片が、ヒトＣＣＲ６の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたヒトＣＣＲ６を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる。
　例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステムズ社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］、フローサイトメトリー（以下、ＦＣＭと略記する）を用いる蛍光細胞染色法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法が挙げられる。
　また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　ヒトＣＣＲ６を発現した細胞としては、該ヒトＣＣＲ６を発現していればいずれの細胞でもよく、例えば、ヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、または遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞としては、ヒト体内において該ポリペプチドが発現している細胞が挙げられ、例えば、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１／１７細胞、γδＴ細胞、Ｔｈ２２細胞、メモリー／ナイーブＢ細胞、一部のＣＤ８細胞、一部のＴｈ１細胞および一部のＩＬＣ等が挙げられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、ヒト体内から得られた該ヒトＣＣＲ６が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ヒトＣＣＲ６を発現している細胞株が挙げられる。例えば、ヒトから樹立された細胞株であるヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｎｏ－２、ヒト大腸がん細胞株ＨＴ－２９、ヒトＴ細胞白血病細胞株ＨＵＴ１０２およびＭＴ－２などが挙げられる。
　遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、例えば、該ヒトＣＣＲ６をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該ヒトＣＣＲ６を発現した細胞などが挙げられる。
　本発明において、硫酸化されたヒトＣＣＲ６とは、ヒトＣＣＲ６のアミノ酸配列中に存在するチロシン残基（Ｔｙｒ残基）のＯＨ置換基に硫酸分子が結合したＣＣＲ６を示し、ヒトＣＣＲ６の分子内に少なくとも１つの硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６を示す。硫酸化されるＴｙｒ残基は、ヒトＣＣＲ６のアミノ酸配列中のいずれのＴｙｒ残基でもよいが、好ましくはヒトＣＣＲ６の細胞外領域内に存在するＴｙｒ残基が挙げられる。
　ヒトＣＣＲ６の細胞外領域としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～５０番目までのＮ末端ドメイン、ＥＣＬ１、ＥＣＬ２およびＥＣＬ３が挙げられ、好ましくはＮ末端ドメインが挙げられる。硫酸化されたヒトＣＣＲ６として具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒ残基が硫酸化されたヒトＣＣＲ６が挙げられる。
　Ｔｙｒ残基の硫酸化は、特異的な硫酸転移酵素によって硫酸分子がＣＣＲ６のＴｙｒ残基へ転移され、硫酸化Ｔｙｒ残基が生成することが知られている。硫酸転移酵素としては、ｔｙｒｏｓｙｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ＴＰＳＴｓ）が知られている。
　本発明におけるモノクロ－ナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（一次配列）が均一である。
　エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列および該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、例えば、糖鎖がＯＨ置換基を有するＴｙｒおよびＳｅｒに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するＧｌｎおよびＡｓｎに結合したＮ結合型糖鎖並びに硫酸分子がＯＨ置換基を有するＴｙｒに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の抗体が結合するエピトープとしては、ヒトＣＣＲ６の細胞外領域に含まれる硫酸化Ｔｙｒ残基を含むエピトープが挙げられる。中でも、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～４６番目のアミノ酸に含まれる硫酸化Ｔｙｒ残基が好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～４６番目のアミノ酸に含まれる硫酸化Ｔｙｒ残基がより好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸に含まれる硫酸化Ｔｙｒ残基がさらに好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目の硫酸化Ｔｙｒ残基が最も好ましい。
　また本発明の抗体が結合するエピトープとしては、ヒトＣＣＲ６の細胞外領域に含まれる硫酸化Ｔｙｒ残基を含むエピトープと硫酸化されていないＴｙｒ残基を含むエピトープも挙げられる。
　本発明の抗体が結合するエピトープは、ヒトＣＣＲ６の一部のドメインを欠失させた欠損体、または他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体およびヒトＣＣＲ６の部分ペプチド断片等を用いた抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。
　本発明の抗体が認識するエピトープとしては、ヒトＣＣＲ６のＮ末細胞外領域の硫酸化Ｔｙｒを特異的に認識し、市販抗ヒトＣＣＲ６のエピトープとは異なるアミノ酸配列（翻訳後修飾を含む）または立体構造である。ヒトＣＣＲ６のＮ末細胞外領域の硫酸化Ｔｙｒを特異的に認識するとは、Ｎ末細胞外領域が硫酸化されたヒトＣＣＲ６には結合しかつＮ末細胞外領域が硫酸化されていないヒトＣＣＲ６には結合しないことをいう。
　本発明の抗体が認識するエピトープとしては、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むエピトープが挙げられる。エピトープが配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むとは、ヒトＣＣＲ６Ｎ末細胞外領域を含む部分ペプチドに対する抗体の結合を確認した場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のチロシンが硫酸化されている配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含む部分ペプチドに対する結合活性が高く、硫酸化されていない配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含む部分ペプチドへの結合活性が低下または無いことをいう。
　また本発明の抗体が認識するエピトープとしては配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～２３番目のアミノ酸、特に９番目～１７番目のアミノ酸を含むエピトープも含まれる。
　本発明において、ヒトＣＣＲ６の機能としては、ヒトＣＣＲ６特異的リガンド依存的に引き起こされるＣＣＲ６の活性化、Ｇタンパク質（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の活性化、細胞内カルシウム量の増加、細胞外カルシウムの流入、細胞増殖、細胞遊走および細胞分化などが挙げられる。
　本発明において中和活性とは、上述したヒトＣＣＲ６のいずれかの機能を阻害する活性をいう。ヒトＣＣＲ６特異的リガンドとしては、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ－３α（Ｍｉｐ－３α）、ＣＣ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｌｉｇａｎｄ　２０（ＣＣＬ２０）およびｄｅｆｅｎｓｉｎ－βなどが知られている。
　本発明の抗体の中和活性は、ヒトＣＣＲ６遺伝子を導入したＣＣＲ６発現細胞または天然にＣＣＲ６を発現している細胞株に、ヒトＣＣＲ６特異的リガンド、例えば、Ｍｉｐ－３αと抗体とを同時に加えた時に、Ｍｉｐ－３α依存的カルシウムシグナルを阻害できるか否かを、ＦＤＳＳ（浜松ホトニクス社製）、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、ＮＯＶＯｓｔａｒ（ＢＭＧ　ＬＡＢＴＥＣＨ社製）、ＦｌｅｘＳＴＡＴＩＯＮ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、ＶｉｅｗＬｕｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＡｒｒａｙＳｃａｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いて測定することで、確認できる。
　本発明において、高い中和活性とは、公知の抗ヒトＣＣＲ６抗体または市販されている抗ヒトＣＣＲ６抗体と比べて強い中和活性をいい、既存抗体よりも２倍、３倍、４倍強い中和活性、好ましくは５倍以上高い中和活性をいう。具体的には、実施例８の（５）の条件で、リガンドＭｉｐ－３αを１ｎＭ加えた際に２５％以上の抑制効果のある抗体をいう。
　本発明においてアフィニティーとは、本発明の抗体がヒトＣＣＲ６へ結合する親和性のことをいい、反応速度論的な解析により測定されるものであり、例えばＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ジーイーヘルスケア社製）を用いて測定することができる。
　本発明の抗体のアフィニティーとしては、解離定数ＫＤが７×１０９（ｍｏｌ／Ｌ）（以下、Ｍと略記する場合もある）以下のアフィニティー、好ましくは２．０×１０９（ｍｏｌ／Ｌ）以下のアフィニティー、より好ましくは１．５×１０９（ｍｏｌ／Ｌ）以下のアフィニティーが挙げられる。
　本発明において、高いアフィニティーでヒトＣＣＲ６細胞外領域に結合する抗体とは、治療用抗体として十分なアフィニティーを有する抗体であり、既存の解離定数ＫＤが１．５×１０９（ｍｏｌ／Ｌ）（Ｍ）以下のアフィニティーでヒトＣＣＲ６に結合することをいう。
　本発明において、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体とは、ヒトＣＣＲ６を発現細胞に対して、公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］を用いて、同時に複数の抗体のＡＤＣＣ活性を測定した場合に、市販抗ヒトＣＣＲ６抗体より高いＡＤＣＣ活性を示す抗体をいう。
　抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
　抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
　ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
　本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＦｃ領域は、ＥＵインデックス［Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
　具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８～２１５番のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６～２３０番のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１～３４０番のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１～４４７番のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
　本発明の抗体としては、特にヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも略記する）、ヒト化抗体［相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）移植抗体ともいう］およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体も含まれる。
　キメラ抗体とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬと、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬからなる抗体を意味する。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
　ハイブリドーマとは、非ヒト動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウスなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞をいう。したがって、ハイブリドーマが産生する抗体を構成する可変領域は、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列からなる。
　ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト化抗体とは、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの対応するＣＤＲに移植した抗体をいう。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ以外の領域はフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）と称される。
　ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
　ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Ｔｏｍｉｚｕｋａ　Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．９７，７２２－７，２０００．）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したｐｈａｇｅ　ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Ｗｉｎｔｅｒ　Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－５５．１９９４）。さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Ｒｏｓｅｎ　Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　２６７，５２-５４．１９７７）。
　ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
　本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、または非ヒト動物抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のアミノ酸配列のいずれでもよい。具体的には、例えば、ハイブリドーマが産生する非ヒト動物抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列などが挙げられる。
　本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
　本発明の抗体のＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）およびγ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＣＤＣ活性）、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＰ活性）などが知られている。本発明においてＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］を用いて測定することができる。
　ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃ領域を介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することで免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
　Ｆｃ受容体（以下、ＦｃＲと記すこともある）とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘導する。ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応しており、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。更にＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、ぞれぞれＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在している［Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）］。
　ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは、単球、Ｎａｔｕｒａｌ　Ｋｉｌｌｅｒ細胞（ＮＫ細胞）および一部のＴ細胞に発現している。ＦｃγＲＩＩＩＡを介した抗体の結合は、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性を誘導する。
　ＣＤＣ活性とは標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により免疫細胞の遊走、活性化を誘導することができる。ＣＤＣ活性のカスケードは、抗体のＦｃ領域との結合ドメインを有するＣ１ｑが、Ｆｃ領域に結合し、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒおよびＣ１ｓと結合することでＣ１複合体を形成することで開始する。
　本発明の抗体として具体的には、それぞれ配列番号５６～５８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨの相補鎖決定領域ＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号５９～６１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域、それぞれ配列番号６８～７０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号７１～７３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域、それぞれ配列番号８０～８２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域並びにそれぞれ配列番号９２～９４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号９５～９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲ１～３を含むＶ領域から選ばれるいずれか１つのＶ領域を含む抗体が挙げられる。
　本発明の抗体として具体的には、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、配列番号６４で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０３、配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０４ならびに配列番号８８で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号９１で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０５から選ばれるいずれか１つの抗体が挙げられる。
　また本発明の抗体としては、上述の抗体と競合してヒトＣＣＲ６に結合する抗体、上述の抗体が反応するエピトープに反応する抗体および上述の抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体が挙げられる。
　本発明の抗体には、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も包含される。また、抗体のエフェクター活性を増強または欠損させるため、抗体を安定化させるためおよび血中半減期を制御するためにアミノ酸残基改変を行ったアミノ酸残基改変を含むＦｃ領域も本発明の抗体に用いることができる。
　本発明において抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよび複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤＲ同士を直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明の改変抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体には、本発明のヒトＣＣＲ６の細胞外領域を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体若しくはその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、タンパク質、または抗体医薬などを化学的若しくは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における、抗体の誘導体は、本発明のヒトＣＣＲ６の細胞外領域を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端側、Ｃ末端側、抗体分子中の適当な置換基若しくは側鎖、並びに糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、タンパク質、抗体医薬または核酸医薬などを化学的手法［抗体工学入門，地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明のヒトＣＣＲ６の細胞外領域を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたいタンパク質または抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕまたは２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤およびキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，癌と化学療法社（１９９６）］、ハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリンおよびインドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤、並びにマレイン酸クロルフェニラミンおよびクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｏｔｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセートおよびメイタンシノイド並びにその誘導体などが挙げられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、および水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマーおよびヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
　これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的若しくは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、または（３）免疫原性の消失若しくは抗体産生の抑制などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。
　ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）およびアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）およびαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
　タンパク質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカインまたは増殖因子、および毒素タンパク質などが挙げられる。
　サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）－α、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。毒素タンパク質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシンおよびＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
　抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原および病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩ、およびＥｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１またはＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ　ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体およびサイトカイン［例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βまたはＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣまたはＣＴＡＣＫなど）並びにこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、ｅｐｈｒｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＳＤＦ－１またはこれらの受容体などが挙げられる。
　タンパク質または抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡにタンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
　核酸医薬としては、例えば、遺伝子の機能を制御することによって生体に作用するｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡなどの核酸を含む医薬品が挙げられる。例えば、Ｔｈ１７細胞のマスター転写因子ＲＯＲγｔを抑制する核酸医薬とのコンジュゲートが考えられる。
　上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のヒトＣＣＲ６の細胞外領域を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステルおよびロフィンなどの発光物質、並びにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　また、本発明は、ヒトＣＣＲ６の細胞外領域を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含有するヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患としては、ヒトＣＣＲ６陽性の細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、自己免疫疾患が挙げられる。
　自己免疫疾患としては、例えば、ヒトＣＣＲ６陽性のＴ細胞および／またはＢ細胞および／またはＩＬＣが関与する自己免疫疾患、ヒトＣＣＲ６陽性のＴ細胞および／またはＢ細胞および／またはＩＬＣ由来のサイトカインによって病態が制御されている自己免疫疾患、またはヒトＣＣＲ６陽性のＴ細胞および／またはＢ細胞および／またはＩＬＣ由来サイトカインによってコントロールされる細胞が関与する自己免疫疾患などが挙げられる。
　自己免疫疾患として、好ましくは、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、喘息、乾癬、副鼻腔炎および全身性エリテマトーデスなどが挙げられる。
　ヒトＣＣＲ６陽性のＴ細胞として、具体的には、例えば、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１／１７細胞およびＴｈ２２細胞が挙げられる。ヒトＣＣＲ６陽性のＢ細胞として、具体的には、例えば、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）／メモリー（ｍｅｍｏｒｙ）Ｂ細胞が挙げられる。
　本発明の抗体は、ＣＣＲ６陽性のＴ細胞および／またはＢ細胞を阻害することができることから、Ｔｈ１／１７、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２およびナイーブ／メモリーＢ細胞など複数の細胞を同時に抑制し、自己免疫疾患で問題と考えられているＴ細胞性のサイトカインの産生抑制、Ｂ細胞による自己抗体産生も阻害することができる。また、本発明の抗体は、ＣＣＲ６陽性のＩＬＣを阻害することができる。
　本発明の抗体若しくは該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体若しくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、静脈内投与が好ましい。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
　投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　更に、本発明は硫酸化されたヒトＣＣＲ６の細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＣＲ６の免疫学的検出または測定方法、ヒトＣＣＲ６の免疫学的検出用または測定用試薬、ヒトＣＣＲ６が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法、およびヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。
　本発明においてヒトＣＣＲ６の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてヒトＣＣＲ６が発現した細胞を検出または測定することにより、ヒトＣＣＲ６が関連する疾患を診断することができる。当該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、または免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。
　本発明においてヒトＣＣＲ６を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、または培養液などが挙げられ、ヒトＣＣＲ６が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤および塩などが挙げられる。
　検出用試薬としては、例えば、該モノクローナル抗体若しくはその抗体断片またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、および標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるヒトＣＣＲ６またはヒトＣＣＲ６を発現させた細胞は、ヒトＣＣＲ６全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ヒトＣＣＲ６を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト細胞、ヒト組織などからヒトＣＣＲ６を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりヒトＣＣＲ６の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるヒトＣＣＲ６は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、該ヒトＣＣＲ６をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ヒトＣＣＲ６をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞および動物細胞などが挙げられ、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＣＣＲ６をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　前記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ヒトＣＣＲ６をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトＣＣＲ６の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、およびｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども挙げられる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９および大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号公報）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０　，１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６０，１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ｉ，ＩＩ（ｐｐ．８８３－９００）］；、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ　＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）、などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
　以上のようにして得られるヒトＣＣＲ６をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ヒトＣＣＲ６を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ヒトＣＣＲ６を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたヒトＣＣＲ６を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％　ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ヒトＣＣＲ６をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合タンパク質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
　ヒトＣＣＲ６の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法および宿主細胞外膜上に生産させる方法が挙げられ、使用する宿主細胞、または生産させるヒトＣＣＲ６の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ヒトＣＣＲ６が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ヒトＣＣＲ６を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してヒトＣＣＲ６の生産量を上昇させることもできる。得られたヒトＣＣＲ６は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ヒトＣＣＲ６が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ヒトＣＣＲ６が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトＣＣＲ６の不溶体を回収する。回収した該ヒトＣＣＲ６の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ヒトＣＣＲ６を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ヒトＣＣＲ６またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトＣＣＲ６またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるヒトＣＣＲ６は、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ヒトＣＣＲ６ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下若しくは静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、またはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが用いられる。
　前記骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％　ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ヒトＣＣＲ６を含む抗原に反応し、ヒトＣＣＲ６を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％　硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラムまたはプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。タンパク質量の定量は、ローリー法または２８０ｎＭでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、およびＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。これらの方法以外に、公知の方法［Ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７，１１６３（２００７）］により、抗体の標的抗原を同定することで選択することもできる。
（６－ａ）バインディングアッセイ
　抗原としては、（１）で得られるヒトＣＣＲ６をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞若しくは動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナントタンパク質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチド若しくは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡまたはＫＬＨなどのキャリアタンパク質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
　抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　また、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体と競合してヒトＣＣＲ６に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインティングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ヒトＣＣＲ６細胞外領域への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
　更に、本発明のヒトＣＣＲ６の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
（６－ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるカイネティクス解析
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（登録商標）を用い、抗原と被験物の間の結合におけるカイネティクスを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、更に濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。
　または、ヒトＣＣＲ６、該部分ペプチド、該部分ペプチドをキャリアタンパク質とコンジュゲートしたものをセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合および解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによるカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。
（６－ｃ）細胞蛍光染色法
　ヒトＣＣＲ６を発現している細胞に対する結合活性は、適当な蛍光物質ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｃｙ５、ＧＦＰ、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７などをコンジュゲートさせた抗体などを用いて、蛍光検出器としてＣｅｌｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡ、ＦＣＭ（Ｇｕａｖａ　ＥａｓｙＣｙｔｅ　Ｍｉｎｉ　フローサイトメトリーシステム、ミリポア社製）、セルソーターＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製）、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、ＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム（アプライドバイオ社製）等を用いて測定することができる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］およびｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）］などが挙げられる。
　動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などが挙げられる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ若しくはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが挙げられ、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、またはＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、またはＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（登録商標）Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐＣＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］などが挙げられる。
　ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］などが挙げられる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、例えば、アイソトープまたは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
　また、例えば、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
　塩基配列解析方法としては、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）およびＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などが挙げられる。
　決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。
　また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴまたはＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。
　作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲを行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＶＨ、ＶＬ各々について各６本の合成ＤＮＡを設計する。さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの各５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
　ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
　または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲを行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）および（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えば、ＣＯＳ－７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，ＣＲＣ　ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ　＃　１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］などが挙げられる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などのタンパク質若しくはＮ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などのタンパク質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与するタンパク質などの活性が低下若しくは欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］などが挙げられる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を向上させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などのタンパク質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］、またはウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
３．精製モノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ヒトＣＣＲ６発現細胞株に対する結合活性は、前述の１－（６ａ）記載のバインディングアッセイおよび（６ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
　抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］により測定する。
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明のヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、例えば、抗体の定常領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、以下、Ｆｃ領域と表記する）の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα－１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）および抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが挙げられる。本発明のヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいう。例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）、およびマクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが挙げられる。
　Ｆｃ領域上のＮ結合型複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンに付加するフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
　一方、抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書および米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加させることも低下させることもできる。
　更に、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、並びに口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤などが挙げられる。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
６．本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、ヒトＣＣＲ６またはヒトＣＣＲ６が発現した細胞を検出または測定することにより、ヒトＣＣＲ６が関連する疾患を診断することができる。
　ヒトＣＣＲ６が関連する疾患の一つである自己免疫疾患の診断は、例えば、以下のようにヒトＣＣＲ６の検出または測定して行うことができる。患者体内の細胞に発現しているヒトＣＣＲ６をフローサイトメトリーなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法および物理化学的手法などが挙げられる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法，医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。
　例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。
　前記ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。
前記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。
　濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法，ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣなどを用いる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２，廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどを用いる。
　ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。
　一例を以下に示す。配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるヒトＣＣＲ６と本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要，金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
　ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　一方、ヒトＣＣＲ６が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
　免疫沈降法は、ヒトＣＣＲ６を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ－セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ－ＰＢＳによりブロッキングする。
　抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン－Ａまたはプロテイン－ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。
　次に、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ヒトＣＣＲ６を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
　免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
　また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ－サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、ヒトＣＣＲ６の細胞外領域に結合する、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
　また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体－抗原複合体と、抗体－抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］　細胞膜上にヒトＣＣＲ６を発現するＣＨＯ細胞の造成
（１）ヒトＣＣＲ６遺伝子のクローニング　
　ヒト白血球由来ｃＤＮＡより、以下の手順でヒトＣＣＲ６をコードする遺伝子を単離した（配列番号１および３）。ＮＣＢＩデータベースに登録されているヒトＣＣＲ６（以下、ｈＣＣＲ６と略記する場合もある）の配列（ＡＹ２４２１２６）をもとに、ＣＣＲ６開始コドンからｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（以下、ＯＲＦと略記する）内２４　ｍｅｒの領域に結合するフォワードプライマー（Ｈｕｍａｎ－ＣＣＲ６－ｆ）（配列番号５）およびＣＣＲ６終止コドンまでのＯＲＦ内２１　ｍｅｒに結合するリバースプライマー（Ｈｕｍａｎ－ＣＣＲ６－ｒ）（配列番号６）を設計した。
　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、鋳型としてヒト白血球由来ｃＤＮＡを含む５０μＬの反応溶液［１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー２種、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　１Ｕ、１ｍｍｏｌ／ＬｍｇＳＯ４］を調製して、行った。
　ＰＣＲは、９４℃　５分間の加熱の後、９４℃　３０秒間、５８℃　３０秒間、６８℃　２分間のサイクルを３０サイクル行った。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約１．１　ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を添付マニュアルに従い回収した。回収したＤＮＡ断片を、ｐＣＲ４　Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付マニュアルに従いライゲーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｑｕｉｃｋ　ＤＨ５α、ＴＯＹＯＢＯ）に形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりベクター抽出機ＰＩ－５０（クラボウ）を用いてベクターＤＮＡを単離した。
　各ベクターに挿入されたＤＮＡの塩基配列を、ＰＲＩＳＭ３７３０ｘ１（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。独立した２回のＰＣＲに由来する増幅断片をそれぞれサブクローニングし、ＰＣＲエラーが認められなかった６クローンの塩基配列を決定した。
　その結果、ＮＣＢＩに登録されているヒトＣＣＲ６をコードするＤＮＡ配列および登録されているヒトＣＣＲ６をコードするＤＮＡ配列と１塩基異なる配列の、２種類のＤＮＡ配列が同定された。それらの配列を、それぞれヒトＣＣＲ６アイソフォーム１（配列番号１）およびアイソフォーム２（配列番号３）と命名した。アイソフォーム１および２の配列は、１塩基異なっていたが、ＤＮＡ配列にコードされるヒトＣＣＲ６のアミノ酸配列は一致していた（配列番号２および４）。アイソフォーム１がクローニングされたベクターをＴＯＰＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）、アイソフォーム２がクローニングされたベクターをＴＯＰＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ２）とした。
（２）ヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）およびＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６の構築
　免疫原、スクリーニングのアッセイ細胞および取得抗体の性質検討に用いるため、２種類のヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）およびＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６の構築を行った。
　以下の手順で、ヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を構築した（図１、２）。
　ヒトＣＣＲ６開始コドンからＯＲＦ内２８　ｍｅｒの領域に結合するフォワードプライマーの５’末端に、制限酵素ＭｕｎＩ認識配列およびコザック配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（ＣＣＲ６ＭｕｎＩ－ｆ）（配列番号７）、およびＣＣＲ６終止コドンを含まないＯＲＦ内３’側２５塩基の領域に結合するリバースプライマーの　５’末端に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）配列、終止コドンおよび制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（ＣＣＲ６ＢａｍＨＩ－ｒ）（配列番号８）を設計した。
　ＰＣＲを行うために、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、上記で得られたＴＯＰＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）ベクターを鋳型として含む５０μＬの反応溶液［１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－ｐｌｕｓ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー２種、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　１Ｕ、１ｍｍｏｌ／ＬｍｇＳＯ４］を調製した。ＰＣＲは、９４℃　２分間の加熱の後、９４℃　１５秒間、５８℃　３０秒間、６８℃　１．５分間のサイクルを、３０サイクル行った。以下は、実施例１（１）と同様にしてベクターＤＮＡ断片ＴＯＰＯ－ｈＣＣＲ６ＭｕｎＩ－ＢａｍＨＩを作製した。
　目的の配列のベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）で２時間酵素処理を行い、次に制限酵素ＭｕｎＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）で２時間酵素処理を行った。次に、国際公開第９７／１０３５４号に記載のｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏ　ｌａｂｓ）およびＢａｍＨＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）で３時間酵素処理を行った。それぞれの反応液をアガロース電気泳動に供し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてぞれぞれ約１．１　ｋｂｐのｈＣＣＲ６　ＤＮＡ断片および約９．１　ｋｂｐのｐＫＡＮＴＥＸ９３－ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片を添付マニュアルに従い回収した。
　上記で得たＣＣＲ６　ＤＮＡ断片およびｐＫＡＮＴＥＸ９３－ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片をモル比１６：１で混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を等量ボリューム加え、１６℃で一晩結合反応を行った。以下は、実施例１（１）と同様にして、アイソフォーム１のＮ末に制限酵素ＭｕｎＩサイトおよびコザック配列、Ｃ末にＨｉｓ－ｔａｇ配列および制限酵素ＢａｍＨＩサイトを含むｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を作製した［図２（ａ）］。
　以下の手順で、ヒトＣＣＲ６発現Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６を構築した。
　Ｔｏｌ２トランスポゼース依存的に遺伝子導入を行うことができるＴｏｌ２トランスポゾン発現ベクターを作製するために、Ｔｏｌ２トランスポゾン発現ベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）の抗体定常領域を除いた発現ベクター（以下、ｐＫＴＡＢＥＸ＿ＴＣ２６と記す）を制限酵素ＢｇｌＩＩで消化処理を行った後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　ｈｉｇｈ　キット（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＤＮＡ末端の平滑化を行った。
　次に、制限酵素ＢａｍＨＩ処理を行ない、更にａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ７５）（宝酒造社）を用いて脱リン酸化処理を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約６．３　ｋｂｐのＤＮＡを回収してＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した。他方、ヒトＣＣＲ６をサブクローニングしたベクターＤＮＡについては、制限酵素ＳｗａＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化を行い、その反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約１．１　ｋｂｐのＤＮＡを回収し精製した。以下は同様にして、ｈＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片を含むＴｏｌ２トランスポゾンベクターＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６を取得した［図２（ｂ）］。
（３）ヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）およびＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６の導入
　上記で作製したヒトＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を、制限酵素ＢｓｐＥＩ（Ｂｏｌａｓ）で切断し、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）線状化ベクターを取得した。本ベクターを無血清培養馴化したｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌ／ＤＧ４４（ＣＨＯ／ＤＧ４４）細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］（以下、ＣＨＯ／ＤＧ４４と略記する）に遺伝子導入し、ｈＣＣＲ６発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を樹立した。
　遺伝子導入は、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー，３，１３３（１９９）］に準じて行った。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞は、１０％ウシ胎児透析血清（インビトロジェン社）、５０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社）および１×ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ培地）（インビトロジェン社）（以下、基本培地と記す）で継代した。
　培養したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を１３７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ＬｍｇＣｌ２（以下、Ｋ－ＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁して８×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。２００μＬ細胞懸濁液（１．６×１０６個）および１０μｇ　ｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）線状化ベクターを混和し、Ｇｅｎｅ　ＰｕＬｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）へ加え、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を用いて、パルス電圧０．３５ＫＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。
　該細胞懸濁液、ＨＴを添加しない基本培地（以下、ＨＴ－培地と記す）１０ｍＬに混和し、７５　ｃｍ２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に播種し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。３日間培養した後、培養液を５０ｎＭ　ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（以下、ＭＴＸと記す）を含むＨＴ－基本培地（以下、５０ｎＭ／ＩＭＤＭ培地と記す）に置換して培養を行い、ＭＴＸに耐性を示す細胞の増殖が確認された時点で、２００ｎＭ　ＭＴＸを含むＨＴ－基本培地（以下、２００ｎＭ　ＭＴＸ／ＩＭＤＭ培地）に置換して培養を行い、２００ｎＭ　ＭＴＸ耐性株を取得した。得られたＭＴＸ耐性株をＣＨＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）と命名した。
　上記で作製したヒトＣＣＲ６発現Ｔｏｌ２トランスポゾンベクターＴｃ２６＿ｈＣＣＲ６は、以下のようにしてＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した。４．０Ｘ１０６個の浮遊馴化したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ：ＲＣＢ０２８５）を遠心チューブに採取し、１０００　ｒｐｍ、５分間、遠心分離し上清を除いた後、ｃｏｌｄ　ＰＢＳ（－）で洗浄した。
　洗浄処理した細胞をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTM　ｋｉｔ　Ｖ（ａｍａｘａ）に付属の１００μＬ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ＿Ｖに懸濁し、１キュベットあたり２μｇ　ヒトＣＣＲ６発現Ｔｏｌ２トランスポゾンベクター、および５μｇ　Ｔｏｌ２トランスポゼース発現ベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）（以下、ＴＰＥＸ＿ｐＭｕｇと略記する）を加えた後、全量をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ専用キュベットに移して、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTMのｐｒｏｇｒａｍ　Ｕ０２４　の条件で、遺伝子導入を行った。リザ－バーに継代培地を２０ｍＬ入れ、直ちにパルスをかけた細胞を加え懸濁し、培養用の９６穴プレートに２００μＬ／ｗｅｌｌで播種後、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。
　遺伝子導入後、３～７日間細胞を培養し、コンフルエントに近くなった時点で、３μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を含む基本培地（以下、ＣＨＸ／ＩＭＤＭ）に培地交換した。その後、細胞の増殖状態を見ながらＣＨＸ／ＩＭＤＭの培地交換を繰り返し、シクロヘキシミド耐性コロニーが確認されてから拡大培養を行なった。取得したヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６とした。
（４）ヒトＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）およびＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６の確認
　上記実施例１（３）で得られた２００ｎＭ　ＭＴＸ耐性株およびＣＨＸ耐性株のｈＣＣＲ６発現を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて確認した。ＭＴＸ耐性細胞株の場合は、ほぼコンフルエントの細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅｓ（以下、Ｄ－ＰＢＳと記す）で洗浄後、０．０２％　ＥＤＴＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて剥がした。
　ＭＴＸ耐性細胞株およびＣＨＸ耐性細胞株の細胞懸濁液を遠心分離し、１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｌｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと略記する）（ＫＯＨＪＩＮ　ＢＩＯ）を用いて細胞を洗浄した。さらに遠心分離し上清を除いた後、細胞ペレットを０．０５％　ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）を含むＢＳＡ－ＰＢＳ（以下、ＦＣＭバッファーと記す）で懸濁し、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製した。
　細胞懸濁液２５μＬに、０．８ｍｇ／ｍＬ　ＩｇＧ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）を２５μＬ添加し、ｈｕｍａｎ　ＣＣＲ６　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｍｏｎｏｃｌｏａｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭＡｂ）（ｃｌｏｎｅ　５３１０３）（ＦＡＢ１９５Ｆ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０μＬ、またはネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ｂ、ｋａｐｐａ　ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）２０μＬを添加し、更にＦＣＭバッファーを添加して総量１００μＬとして、４℃で３０分間、遮光下で反応させた。
　反応終了後、細胞を遠心分離し、上澄みを取り除きＢＳＡ－ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、細胞を４００μＬのＦＣＭ　ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、セルストレイナーのメッシュを通し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光強度を解析した。
　その結果、ネガティブコントロールと比べて抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体は、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４およびＣＨＯ－Ｋ１には反応せず、ｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）またはＴｃ２６－ｈＣＣＲ６をそれぞれ導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の両方に反応した［図３（ａ）、図３（ｂ）］。
　従って、ｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（アイソフォーム１）ベクターまたはＴｃ２６－ｈＣＣＲ６ベクターを導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ－Ｋ１細胞は、何れもｈＣＣＲ６を高発現していることが確認された。
　また、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６については、抗Ｈｉｓタグ体を用いてｈＣＣＲ６－Ｈｉｓ‐ｔａｇタンパク質の発現を確認した。上述と同様にして細胞を調製し、エタノール処理を行い細胞の細胞膜透過処理を行った。この細胞に１μｇ／ｍＬ抗Ｈｉｓタグ抗体（ＱＩＡＧＥＮ）を１００μＬ加え、４℃で１時間反応させ、２次抗体として５０倍希釈したＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）を１００μＬ加え、４℃で１時間反応させた以外は、上記と同様にして解析を行った。
　その結果、ネガティブコントロール抗体と比べて抗Ｈｉｓタグ抗体は、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４には反応せず、ｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）を導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に反応した［図３（ｃ）］。従って、ｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）を導入したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞は、Ｈｉｓタグが融合したｈＣＣＲ６を高発現していることが確認された。
［実施例２］　ヒトＣＣＲ６を発現するヒト単球細胞の造成
　ヒトＣＣＲ６を発現した単球細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５９３．２）を作製するために、実施例１（２）で作製したｈＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）を用いて、実施例１（３）と同様にしてＵ９３７細胞へ遺伝子導入を行った。薬剤耐性セレクションは、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を含む培養条件で行なった。その結果、ｈＣＣＲ６を発現しているＵ９３７細胞Ｕ９３７－ＣＣＲ６を取得した。
　Ｕ９３７－ＣＣＲ６のＣＣＲ６発現は、フローサイトメーター（ＦＣＭ）を用いて確認した。以下は、実施例１（４）に記載の方法で実施した。その結果、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体は、Ｕ９３７－ＣＣＲ６に反応したが、ネガティブコントロール抗体は反応しなかった［図４（ａ）］。従って、Ｕ９３７－ＣＣＲ６はヒトＣＣＲ６を発現していることが確認された。
［実施例３］　カルシウムアッセイ用ヒトＣＣＲ６発現細胞の造成
　ヒトＣＣＲ６（ｈＣＣＲ６）からのシグナルをカルシウムアッセイで検出するための細胞を構築した。公知の方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４００（２０１０）１６３-１７２〕に準じて、ＫＪＭＧＥＲ８細胞（Ｎａｍａｌｗａ細胞由来の細胞株）を宿主として、ｈＣＣＲ６の誘導発現細胞を構築した。具体的には、ＫＪＭＧＥＲ８細胞に、ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）の誘導発現プラスミドとＧα１６発現プラスミドを共導入することにより、ｈＣＣＲ６からのシグナルをカルシウムアッセイで検出できるアッセイ細胞（以下、ＣＣＲ６Ｇ１６と記す）を構築した。
　ＣＣＲ６誘導発現プラスミドは、公知の方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４００（２０１０）１６３-１７２〕に準じて作製した。Ｇα１６発現プラスミドは、発現ベクターｐＡＭｏｈ（国際公開第０３０８７３６６号）にヒトＧα１６　ＤＮＡを組み込むことにより作製した。ＣＣＲ６Ｇ１６細胞を１０ｎＭ　β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（ＳＩＧＭＡ）存在下で２４時間から４８時間培養することにより、ｈＣＣＲ６を誘導発現することができる。
　ｈＣＣＲ６を誘導発現させたＣＣＲ６Ｇ１６細胞におけるｈＣＣＲ６の発現は、実施例１（４）と同様にして確認した。その結果、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体はＣＣＲ６Ｇ１６に反応し、ネガティブコントロール抗体はＣＣＲ６Ｇ１６に反応しなかった［図４（ｂ）］。従って、１０ｎＭ　β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ処理したＣＣＲ６Ｇ１６は、ヒトＣＣＲ６を発現していることが明らかになった。
［実施例４］　ヒトマウスキメラＣＣＲ６を発現するＣＨＯ細胞の造成
（１）ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６の構築
　抗ｈＣＣＲ６抗体のエピトープ解析を行うために、Ｃ末端側にＨｉｓ－ｔａｇ配列を含み、ヒトＣＣＲ６の一部の細胞外領域をマウスＣＣＲ６の細胞外領域に置換したヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ベクターを作製した。ヒトマウスキメラＣＣＲ６（以下、キメラＣＣＲ６と略記する）の模式図および構築方法を図５に示す。
　各種キメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片は、１５０塩基前後のセンスメガプライマーおよびアンチセンスメガプライマー（Ｈｕｍａｎ－１－１６２－ｆ、Ｈｕｍａｎ－１３８－２８８－ｒ、Ｈｕｍａｎ－２６４－４１３－ｆ、Ｈｕｍａｎ－３９４－５４０－ｒ、Ｈｕｍａｎ－５１９－６７７－ｆ、Ｈｕｍａｎ－６４９－７８１－ｒ、Ｈｕｍａｎ－７５９－９１４－ｆ、Ｈｕｍａｎ－８９０－１０２０－ｒ、Ｈｕｍａｎ－９９９－１１２５－ｆ、ＭｏｕｓｅＮｔ－１－１６２－ｆ、ＭｏｕｓｅＬ１－２６４－４１３－ｆ、ＭｏｕｓｅＬ２－５１９－６７７－ｆおよびＭｏｕｓｅＬ３－７５９－９１４－ｆ）（配列番号９～２１）および制限酵素付加プライマー（ＭｏｕｓｅＣＣＲ６Ｍｕｎ１－ｆ、ＣＣＲ６Ｍｕｎ１およびＣＣＲ６ＢａｍＨ１）（配列番号２２～２４）を用いて、ＰＣＲを行ない作製した。
　ＰＣＲを行うために、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、５０μＬの反応溶液［１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ、０．４μｍｏｌ／Ｌ制限酵素付加プライマー２種、１　ｐｍｏｌキメラＣＣＲ６構築用センス－アンチセンスプライマー９種、０．２ｍｍ　ｄＮＴＰｓ、１Ｕ　ＫＯＤ－ｐｌｕｓ、１ｍｍｏｌ／ＬｍｇＳＯ４］を調製した。各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６の構築に用いたプライマーは図６に示す。ＰＣＲは、９４℃で５分間加熱の後、９４℃　１５秒間、６０℃　３０秒間、６８℃　２分間のサイクルを２５サイクル行った。　
　以下は、実施例１（１）と同様にして、Ｎ末細胞外領域がマウスのアミノ酸配列であるキメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターＴＯＰＯ－ｍＮｔＣＣＲ６、細胞外ループ（ＥＣＬ）１がマウスのアミノ酸配列であるキメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターＴＯＰＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＥＣＬ２がマウスのアミノ酸配列であるキメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターＴＯＰＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＥＣＬ３がマウスのアミノ酸配列であるキメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターＴＯＰＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６を作製した。
　作製した発現ベクターを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いて、ぞれぞれ２時間、酵素処理を行った。次に、制限酵素ＭｕｎＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）を用いて、２時間、酵素処理を行った。以下は実施例１（２）と同様にして、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで処理したＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ－ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクター断片と各キメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ用いて、目的のキメラＣＣＲ６をコードするＤＮＡが含まれている発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６を作製した。
（２）ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびｐＫＡＮＴＥＸ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６の導入
　上記実施例４（１）で作製した各キメラＣＣＲ６発現ベクターを用いて、実施例１（３）と同様にしてキメラＣＣＲ６発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を作製した。薬剤耐性セレクションは、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８を添加した培養下で行なった。その結果、各キメラＣＣＲ６を発現したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６を作製した。
（３）ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６の確認
　各ヒトキメラＣＣＲ６発現細胞のヒトキメラＣＣＲ６の発現解析は、実施例１（４）の方法と同様にして行なった。但し、ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６は、ＰＥ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ，２９－２Ｌ１７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰＥ　ａｒｍｅｎｉａｎ　ｈａｍｓｔｅｒ　ＩｇＧ　ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｅ　ＨＴＫ８８８）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて解析した。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体は、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６に反応したが、ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６および親株のＣＨＯ／ＤＧ４４に反応しなかった［図７（ａ）～（ｆ）］。また、抗マウスＣＣＲ６モノクローナル抗体は、ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６に反応した［図７（ｇ）］。各ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ抗体はいずれの細胞へも反応しなかった［図７（ａ）～（ｇ）］。
　更に、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を用いて各キメラＣＣＲ６タンパク質のＣ末端側に融合させたＨｉｓタグの発現を、実施例１（４）と同様にして確認した結果、抗Ｈｉｓタグ抗体は、いずれのヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞にも反応した［図８（ａ）～（ｄ）］。
　従って、各種ヒトマウスキメラＣＣＲ６発現細胞は、Ｃ末端側にＨｉｓタグを含むヒトマウスキメラＣＣＲ６を発現していることが確認された。
［実施例５］　カニクイザルＣＣＲ６を発現するＣＨＯ細胞の造成
（１）カニクイザルＣＣＲ６遺伝子のクローニング　
　抗ヒトＣＣＲ６抗体のカニクイザルＣＣＲ６への反応性を検討するために、カニクイザルＣＣＲ６発現ベクターの作製を行った。カニクイザルＣＣＲ６　ｃＤＮＡ配列はこれまでに報告がないため、以下の手順で、カニクイザルＣＣＲ６　ｃＤＮＡをクローニングした。
　すでに報告されているアカゲザルＣＣＲ６　ＯＲＦ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ５０８７３０）およびアカゲザル４番染色体（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＣ＿００７８６１）の配列より、アカゲザルＣＣＲ６　ＯＲＦの上流および下流に位置する塩基配列を決定した。ヒトＣＣＲ６遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＣ０３７９６０）より得たヒトＣＣＲ６の上流および下流に位置する塩基配列と相同性の高いアカゲサルの配列を用いて、カニクイザルＣＣＲ６クローニングプライマー（Ｍａｃａｃａｆ－ＣＣＲ６－ｆ　および　Ｍａｃａｃａｆ－ＣＣＲ６－ｒ）（配列番号２５、２６）を設計した。
　これらのプライマーを用いて、カニクイザル白血球由来ｃＤＮＡより、実施例１（１）と同様の方法でカニクイザルＣＣＲ６をコードする遺伝子を含む発現ベクターＴＯＰＯ－ｍｆＣＣＲ６－ＭｕｎＩ－ＢａｍＨＩを作製し、該遺伝子配列を同定した。
　その結果、カニクイザルＣＣＲ６には２つのアイソフォーム（配列番号１１４、１１６）が存在し、それらは塩基配列については４塩基が異なり、アミノ酸配列については、カニクイザルＣＣＲ６細胞内ドメインの１７７番目のアミノ酸残基がＶａｌまたはＩｌｅと異なることが明らかになった（配列番号１１５、１１７）。各遺伝子多型は、１７７ＶａｌタイプのカニクイザルＣＣＲ６（アイソフォーム１）は１５クローン中１１クローン、１７７ＩｌｅタイプのカニクイザルＣＣＲ６（アイソフォーム２）は１５クローン中４クローンであった。
　アイソフォーム１がクローニングされたベクターをＴＯＰＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）、アイソフォーム２がクローニングされたベクターをＴＯＰＯ－ｍｆＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ２）とした。
（２）カニクイザルＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）の構築
　以下の手順で、カニクイザルＣＣＲ６発現ベクターを構築した。カニクイザルＣＣＲ６開始コドンからＯＲＦ内２８　ｍｅｒの領域に結合するフォワードプライマーの５’末端に、制限酵素ＭｕｎＩ認識配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（ＣＣＲ６ＭｕｎＩ－ｆ）（配列番号２７）およびＣＣＲ６終止コドンを含まないＯＲＦ内３’側２５塩基の領域に結合するリバースプライマーの５’末端に、Ｈｉｓ－ｔａｇ配列、終止コドンおよび制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（ＣＣＲ６ＢａｍＨＩ－ｒ）（配列番号２８）を設計した。
　鋳型としてＴＯＰＯ－ｍｆＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を用いる以外は、実施例１（２）と同様の方法でカニクイザルＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｍｆＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を構築した。
（３）カニクイザルＣＣＲ６発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ　１）の導入
　上記（２）で作製したカニクイザルＣＣＲ６発現ベクターを、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に遺伝子導入することにより、カニクイザルＣＣＲ６を発現するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を作製した。導入するベクターとしてｐＫＡＮＴＥＸ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を用いる以外は、実施例１（３）と同様にして実施した。得られたＭＴＸ耐性株をＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６と命名した。
（４）カニクイザルＣＣＲ６発現細胞ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６の確認
　（３）で取得した細胞のカニクイザルＣＣＲ６の発現確認は、実施例１（４）同様に実施した。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体は、ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６に結合し、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４には結合しなかった［図９（ａ）］。また、実施例１（４）と同様にして抗Ｈｉｇ－ｔａｇ抗体の反応性を確認した結果、抗ｈＣＣＲ６抗体と同様にＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６に反応し、親株のＣＨＯ／ＤＧ４４には反応しなかった［図９（ｂ）］。
　従って、ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６は、Ｃ末端側にＨｉｓ－ｔａｇが融合したカニクイザルＣＣＲ６を発現していることが確認された。
［実施例６］　ヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質（ＮｔｈＣＣＲ６－Ｆｃ）の作製
（１）ヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃの構築
　ヒトＣＣＲ６の１番目～４６番目のアミノ酸配列を含むＮ末端側細胞外ドメインと安定化させるためのアミノ酸改変を含むヒトＩｇＧ４抗体のＦｃを融合させたヒトＣＣＲ６Ｎ末端細胞外ドメイン（以下、ＮｔｈＣＣＲ６と表記することもある）発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ－ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃは、国際公開第２０１０／０００１９０８号に記載のｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７－ＩｇＧ４Ｆｃ発現ベクターのＣＤ２７－ＩｇＧ４ＦｃをコードするＤＮＡ断片を、ＮｔｈＣＣＲ６をコードするＤＮＡ断片に置換して作製した（図１０）。
　ヒトＣＣＲ６Ｎ末端細胞外ドメインをコードするＤＮＡ断片は、実施例１（２）で作製したｐＫＡＮＴＥＸ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を鋳型として、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列または制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を含むプライマー［ＣＣＲ６（１－２８）－ｆおよびＣＣＲ６（１１８－１３８）－ＢａｍＨＩ－ｒ］（配列番号２９、３０）を用いてＰＣＲで増幅した。
　ＰＣＲを行うために、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、鋳型として実施例１で作製したＴＯＰＯ－ｈＣＣＲ６（ｉｓｏｆｏｒｍ１）を含む５０μＬの反応溶液［１０×Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、０．２μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー２種、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ　１Ｕ、１ｍｍｏｌ／ＬｍｇＳＯ４］を調製した。
　ＰＣＲは、９４℃　２分間加熱の後、９４℃　１５秒間、６２℃　３０秒間、６８℃　１分間のサイクルを２５サイクル行った。得られたベクターを、ＴＯＰＯ－ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃと命名した。ＴＯＰＯ－ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃおよび国際公開第２０１０／００１９０８号に記載のｐＫＡＮＴＥＸ　ＣＤ２７－ＩｇＧ４Ｆｃを、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて酵素処理を行ない、約２５０ｂｐと約９．５ｋｂｐの断片を取得して連結した。
　その結果、ＮｔｈＣＣＲ６－Ｆｃを発現するためのベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃを得た。本ベクターにコードされるＮｔｈＣＣＲ６－Ｆｃの遺伝子配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に記載した。
（２）ヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質（ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ）の作製
　上述実施例６（１）で作製した発現ベクターを用いて、実施例１（３）と同様にしてＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ発現細胞を作製した。細胞培養は、無血清培地ＥＸＣＥＬＬ３０２（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて１週間行い、その後培養上清を回収し下記記載の方法で精製を行った。
　培養上清は、３０００　ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて上清を濾過した。０．８　ｃｍ孔径カラムにＭａｂ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍＬを充填し、精製水３．０ｍＬを添加し、０．１Ｍ　クエン酸バッファー２．０ｍＬおよび２Ｍホウ酸－０．１５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ホウ酸バッファーと記す）１．５ｍＬで平衡化を行った。
　次に、上記培養上清をカラムに通塔した後、ホウ酸バッファー１０ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ　３．５）２．２５ｍＬを用いて担体に吸着したタンパク質の溶出を行った。溶出画分は２５０μＬ、１ｍＬ×２ずつ、計３画分に分けて取得した。次に、得られた各画分の２８０ｎＭの吸光度（ＯＤ２８０）を吸光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ　ＵＶ－１７００）で測定し、目的タンパク質が含まれている溶出画分を特定した。
　目的タンパク質溶出画分のバッファーを、Ｅｃｏｎｏ－Ｐａｃ　１０ＤＧ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いて０．０１　Ｍクエン酸ナトリウム－０．１５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ　６．０）に交換した。ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ溶液は、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過し４℃で保存した。
　得られた精製サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥの解析結果、還元状態では分子量約５０ｋＤａの位置にバンドが確認され、非還元状態では分子量約１００ｋＤａの位置にバンドが確認されたことから、ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質は２量体として存在することが確認された。
　また、アミノ酸配列から推察されるＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃの分子量は約３０ｋＤａであることから、ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に糖鎖が付加している可能性が考えられた。得られたＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ精製タンパク質をＯ－ＧｌｙｃｏｓｉｄａｓｅおよびＮ－Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅを用いて酵素処理を行い、消化物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行った。
　その結果、非還元および還元状態いずれにおいても、Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ処理したサンプルのバンドは酵素未処理のサンプルのバンドと同じ１００　ｋＤａおよび５０　ｋＤａの位置であったが、Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ処理したサンプルおよびＯ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ＋Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ処理したサンプルのバンドは低分子量の７０　ｋＤａおよび３５　ｋＤａにシフトした（図１１）。
　抗体のＦｃ部位には１．５ｋＤａ程度の糖鎖が２本結合しているため、作製したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃはさらに多くの糖鎖がＮｔｈＣＣＲ６部位に存在していると考えられる。また、作製したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質は、Ｏ結合型糖鎖ではなくＮ結合型糖鎖が結合していることが明らかになった。
（３）ヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質（ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ）の結合活性
　上述（２）で作製したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質の結合特異性を確認するために、以下のｂｉｎｄｉｎｇ　ＥＬＩＳＡを行った。
　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製）をＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ（グライナー社製）へ固層化し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃを、５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、室温で１時間反応させた。
　反応後、０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと略記する）を用いて３回ウェルを洗浄し、ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ＣＣＲ６　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｉｔｂｏｄｙ（５３１０３　ｃｌｏｎｅ）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ），またはｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ｂ，κ　ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応させた。
　反応後、ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンラビット抗体（ＤＡＫＯ）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。反応後、ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで３回洗浄し、発色基質ＡＢＴＳ［２．２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾール－６－スルホン酸）アンモニウム］を含む基質液［１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＴＳ－０．１　ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２），０．１％　Ｈ２Ｏ２］を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、発色反応を行なった。反応後、４１５ｎＭの吸光度（ＯＤ４１５）をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；ＭｏｌｅｃｕＬａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６抗体はＮｔＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に結合した。また、ｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ｂ　ａｎｔｉｂｏｄｙまたはＢＳＡ－ＰＢＳを添加したウェルではほとんど結合しなかった（図１２）。従って、作製したヒトＩｇＧ４Ｆｃが融合したＮｔｈＣＣＲ６タンパク質は、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体が特異的に反応するヒトＣＣＲ６のＮ末端領域を有することが明らかになった。
［実施例７］　ヒトＣＣＲ６に対するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
（ａ）細胞免疫
　実施例１で作製したＣＨＯＫ１-ｈＣＣＲ６、実施例２で作製したＵ９３７ＣＣＲ６を１×１０７　ｃｅｌｌｓ／５００μＬの細胞数に調製し、４週令ＳＤラット、ＮＺＢマウス、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス、ＢＸＳＢマウス（日本エスエルシー株式会社）またはＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレア）に、１週間毎に、計４回投与した。
　ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６は、ＳＤラット６匹、ＢＸＳＢマウス３匹、ＮＺＢマウス３匹、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス３匹、Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹に免疫した。
（ｂ）ペプチド免疫
　硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６Ｎ末端部分ペプチドＰ２：ＣＣＲ６－２Ｓ（Ｂ）（配列番号３３）またはヒトＣＣＲ６Ｎ末端部分ペプチドＰ３：ＣＣＲ６－２（Ｂ）（配列番号４０）を、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＴＨＹ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）またはＢＳＡとコンジュゲートさせ、ペプチド抗原を調製した。
　ＫＬＨ、ＴＨＹまたはＢＳＡをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍＬに調製し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍＬのＭＢＳ　［Ｎ－（ｍ－Ｍａ　ｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－ｏｘｙ）－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］またはＳＭＣＣ［４－（Ｎ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－　１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ　Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ］を滴下して３０分撹拌反応させた。
　予めＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ－２５カラムで未反応のＭＢＳまたはＳＭＣＣを除き、ぞれぞれＫＬＨ－ＭＢＳ、ＴＨＹ－ＳＭＣＣまたはＢＳＡ－ＳＭＣＣを調製した。次に、各キャリアータンパク質を０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、撹拌反応させ、反応後にＰＢＳを用いて透析したものを、ペプチド免疫原として用いた。
　これらペプチドコンジュゲート体　１００μｇを、水酸化アルミニウムアジュバンド（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｐ９９、１９８８）２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに、６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスおよび４週齢雌ＳＤラットに１週間に１回、計３回投与した。
　ＣＣＲ６特異的抗体価の低い個体に関しては、さらに、２回追加免疫を実施した。ＣＣＲ６－２Ｓ（Ｂ）ペプチド－ＴＨＹは、ＳＤラット３匹およびＢａｌｂ／ｃマウス３匹に免疫した。ＣＣＲ６－２Ｓ（Ｂ）－ＢＳＡは、ＳＤラット３匹に免疫した。ＣＣＲ６－２（Ｂ）ペプチド－ＴＨＹは、ＳＤラット３匹およびＢａｌｂ／ｃマウス３匹に免疫し、ＣＣＲ６－２（Ｂ）－ＫＬＨは、ＳＤラット３匹に免疫した。
　細胞免疫またはペプチド免疫したマウスは、最終免疫後、尾静脈より部分採血し、得られた抗血清の結合活性をフローサイトメーター（べクトンディッキンソン社製）を用いた蛍光細胞染色法により測定した。十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ培地（日水製薬社製）（以下、ＭＥＭ培地）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ）した。得られた沈殿画分にトリス－塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ　７．６）を添加し、１～２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）ＡＢＩ８２００ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ解析
　実施例２で作製したＵ９３７－ＣＣＲ６細胞およびＵ９３７細胞をアッセイ細胞として用いた。５００ｎｇ／ｍＬ　Ｇ４１８およびＧｌｕｔａＭＡＸ－１（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ培地またはＧｌｕｔａＭＡＸ－１のみを添加したＲＰＭＩ培地（以下、継代用培地と略記する）で継代した細胞を、洗浄後、０．２ｍｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧおよび０．０５％　ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅを含むＢＳＡ－ＰＢＳ（以下、アッセイバッファーと略記する）で懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
　次に、ＡＢＩ８２００用黒色９６ウェルプレート（アプライドバイオ社製）に２×１０４個／１００μＬ／ウェルで分注した。該プレートに、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を１０μＬ／ウェルで分注し、２次抗体としてアッセイバッファーで１６６６倍に希釈したＡｌｅｘａ６４７標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５０μＬ／ウェル分注した。遮光下で、３時間静置した後、レーザー光６３３　Ｈｅ／Ｎｅで励起された６５０－６８５ｎＭの蛍光をＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム（アプライドバイオ社製）で測定した。
（３）フローサイトメーター解析
　実施例７（２）と同様に、アッセイ細胞１～５×１０５個の細胞を１００μＬアッセイバッファーに懸濁し、１次抗体としてハイブリドーマ上清を５０μＬ／ウェルで分注し、氷温中で３０分間反応させた。反応後、ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄した後、２次抗体として　ＦＣＭバッファーで　５００倍に希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、５０μＬ／ウェルで加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。
　反応後ＢＳＡ－ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄した後、５００μＬのＢＳＡ－ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎＭアルゴンで励起される５１０－５３０ｎＭの蛍光をフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ　ＥａｓｙＣｙｔｅ　Ｍｉｎｉ　フローサイトメトリーシステム、ミリポア社製）で測定した。
（４）バインディングＥＬＩＳＡ
　９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに陽性抗原ペプチド、陰性抗原ペプチドを１０μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。それぞれの陽性抗原ペプチドと陰性抗原ペプチドの組み合わせは、下記の通りである。
　Ｐ２：ＣＣＲ６－２Ｓ（Ｂ）ペプチド（配列番号３３）－ＴＨＹコンジュゲート体免疫個体のアッセイは、Ｐ２－ＢＳＡを陽性抗原とし、コントロールペプチド－ＢＳＡコンジュゲート体を陰性抗原とした。
　Ｐ２－ＢＳＡ免疫個体のアッセイは、Ｐ２－ＴＨＹを陽性抗原とし、コントロールペプチド－ＴＨＹコンジュゲート体を陰性抗原とした。
　Ｐ３：ＣＣＲ６－２（Ｂ）ペプチド（配列番号４０）－ＴＨＹコンジュゲート体免疫個体のアッセイは、Ｐ３－ＢＳＡを陽性抗原とし、コントロールペプチド－ＢＳＡを陰性抗原とした。
　Ｐ３－ＫＬＨ免疫個体のアッセイは、Ｐ３－ＴＨＹを陽性抗原とし、コントロールペプチド－ＴＨＹ陰性抗原とした。
　抗原を固層化したプレートはＰＢＳで洗浄後、１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェル加え、室温で１時間放置残っている活性基をブロックした。放置後１％　ＢＳＡ－ＰＢＳを捨て、被検サンプルとして被免疫動物抗血清またはハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、室温にて２時間放置した。
　０．０５％　ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ　２０相当品）－ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと表記）で洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体、もしくはＨＲＰ標識ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体を５０μＬ／ウェル加えて室温にて１時間放置した。
　放置後、プレートをＴｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＡＢＴＳ〔２．２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾール－６－スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＴＳ，０．１　ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４．２），０．１％　Ｈ２Ｏ２〕を添加して発色させた。
　発色反応後、５％　ＳＤＳを５０μＬ／ウェル加えて反応停止し、サンプル波長４１５ｎＭ、リファレンス波長４９０ｎＭにおける吸光度（ＯＤ４１５ｎＭ－ＯＤ４９０ｎＭ）をプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ　ｍａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。
（５）マウス骨髄腫細胞の調製
　８－アザグニン耐性マウス　骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３－Ｕ１：ＡＴＣＣより購入）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、正常培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、ハイブリドーマ作製のフュージョンパートナーに供した。
（６）ハイブリドーマの作製
　上記（１）で得られたマウス脾臓細胞と上記（５）で得られた骨髄腫細胞とを、１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ，５分間）した。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）１ｇ、ＭＥＭ培地１ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．３５ｍＬの混液を、１０８個のマウス脾臓細胞あたり０．５ｍＬ加えた。
　次に該混濁液に１～２分毎にＭＥＭ培地１ｍＬ加えた後、さらにＭＥＭ培地を加えて全量を５０ｍＬにした。該混濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ，５分間）し、得られた沈殿画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞をメスピペットによる吸込み吸出して、ゆるやかに１０％　ＦＣＳおよびＨＡＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＨＡＴ培地と記す）［１００ｍＬ中に懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％　ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で８日間培養した。培養上清を吸引し、新しいＨＡＴ培地を２００μＬ／ウェルずつ分注した。
　１日培養後、細胞免疫個体については、実施例７（２）および（３）に記載した蛍光細胞染色法を用いて、培養上清をＵ９３７－ＣＣＲ６および親株のＵ９３７に反応させ、Ｕ９３７－ＣＣＲ６に反応しＵ９３７に反応しないウェルを選択した。
　ペプチド免疫個体については、実施例７（４）に記載したバインディングＥＬＩＳＡアッセイを行い、陽性対象に反応し、陰性対象に反応しないウェルを選択した。選択したウェルに含まれる細胞から、２－メルカプトエタノール、ＦＣＳおよびゲンタマイシンを含むｓ－クローニングメディウム（三光純薬社製）（以下、ハイブリドーマ培養用培地と記す）］を用いた限界希釈法によるクローニングを２回行い、シングルセルクローンを取得した。
　その結果、ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６をＳＤラットに免疫した個体から抗ヒトＣＣＲ６ラットモノクローナル抗体ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４を、ＣＨＯＫ１－ｈＣＣＲ６をＮＺＢマウスに免疫した個体から抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体ＫＭ４７０５を、硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６の部分ペプチドＰ２：ＣＣＲ６－２Ｓ（Ｂ）を免疫したｂａｌｂ／ｃマウスから、抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体ＫＭ４５９２をそれぞれ確立した。これらヒトＣＣＲ６特異的に結合するモノクロ－ナル抗体は、約２４０００規模のスクリーニングアッセイを行うことで取得した。
（７）モノクローナル抗体の精製
　上記実施例７（６）で取得したハイブリドーマを、ハイブリドーマ培養用培地で１×１０７個の細胞数になるまで拡大培養し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ（インビトロジェン社製）に５％Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ　ＩｇＧ　ＦＣＳ（インビトロジェン社製）を添加した培地１００ｍＬに懸濁し、７日間培養した。
　培養上清を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、４℃、５分間）した後、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径ＰＥＳ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて上清を濾過した。モノクローナル抗体の精製およびＳＤＳ－ＰＡＧＥは、実施例６（２）と同様の方法で行なった。また、マウス抗体は、ＰｒｏＳｅｐＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）レジンを使用し、ラット抗体は、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）レジンを用いて精製した。
　その結果、非還元条件では約１５０ｋＤａ付近に、還元条件では約５０　ｋＤａおよび２５　ｋＤａ付近にバンドが確認された（図１３）。よって精製タンパク質は抗体分子を含むことが確認された。
　また、モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキット（ｒａｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　ｋｉｔ）（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いたバインディングＥＬＩＳＡにより行った。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体ＫＭ４５９２とＫＭ４７０５はマウスＩｇＧ２ｂサブクラス、抗ヒトＣＣＲ６ラットモノクローナル抗体ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４はラットＩｇＧ２ｂサブクラスであることが明らかになった。
［実施例８］　抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体の性質検討
　以下の（１）から（５）では、実施例７（７）で得られた抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の活性評価を行った。市販抗ヒトモノクローナル抗体の説明書の情報を図１４に示す。
（１）蛍光細胞染色法（ＦＣＭ解析）による抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のカニクイザルＣＣＲ６への交差反応性評価
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４およびＫＭ４７０５の、実施例１で作製されたヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）および実施例５で作製されたカニクイザルＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６）への結合活性は、実施例１（６）に同様の方法で測定した。
　ＦＣＭバッファーで懸濁した各５×１０５個に、１次抗体として０．０００１～１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体（ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５）を反応させた、また、２次抗体として、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体またはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　測定は、レーザー光４８８ｎＭアルゴンで励起される５１０～５３０ｎＭの蛍光をフローサイトメーター（ベックマンコルター社製、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ　ＦＣ５００　ＭＰＬ）で測定して行った。
　その結果、図１５（ａ）～（ｄ）に示すように、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２［図１５（ａ）］、ＫＭ４７０３［図１５（ｂ）］、ＫＭ４７０４［図１５（ｃ）］およびＫＭ４７０５［図１５（ｄ）］はいずれも、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６の両方に抗体濃度依存的に反応した。また、いずれの抗体のヒトＣＣＲ６およびカニクイザルＣＣＲ６への反応性は同等であった。
　従って、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４およびＫＭ４７０５はいずれも、カニクイザルＣＣＲ６に交差反応を有することが明らかになった。
（２）ＦＣＭを用いた抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のエピトープ解析
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体のエピトープ解析を、ＦＣＭ解析で行った。実施例１で作製されたヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）および実施例４で作製したヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６）に対する各抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の結合活性は、上記実施例１（６）および実施例８（１）の方法と同様にして測定した。
　その結果、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体はいずれも、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６に結合し、ＣＨＯ－ｍＮｔ　ｈＣＣＲ６に対してのみ結合しなかった［図１６（ａ）～（ｃ）］。
　従って、本発明の抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体のエピトープは、いずれもヒトＣＣＲ６の１番目～４６番目のアミノ酸を含むＮ末端領域であることが明らかになった。
（３）バインディングＥＬＩＳＡによる抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のエピトープ解析
　ヒト抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体のエピトープ解析をバインディングＥＬＩＳＡで行なった。
　バインディングＥＬＩＳＡには、実施例６（２）で作製したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質およびヒトＣＣＲ６のＮ末端領域の部分ペプチドＣＣＲ６－１（１番目～１７番目）（配列番号３４）、ＣＣＲ６－２Ｓ（９番目～２３番目、Ｔｙｒ１８－ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）（配列番号３５）、ＣＣＲ６－２（９番目～２３番目）（配列番号３６）、ＣＣＲ６－３（２０番目～３４番目）（配列番号３７）、ＣＣＲ６－４（３０番目～４６番目）（配列番号３８）を含む合成ペプチド［図１７（ａ）および（ｂ）］を用いた。
　合成ペプチドは、ｋｅｙｈｏｌｅ－ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）へコンジュゲートさせるために、何れの合成ペプチドもＮ末端側またはＣ末端側にＣｙｓ残基を導入した。また、部分ペプチドの溶解性を制御するため、ＣＣＲ６－１のＣ末端側およびＣＣＲ６－４のＮ末端側に、１１個のｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）ポリマーを導入した。更に、ＣＣＲ６－４（配列番号３８）の７番目のＣｙｓ残基はＳｅｒ残基へ改変することで、ペプチド間の結合を抑制した。合成ペプチドＣＣＲ６－１（配列番号３９）、ＣＣＲ６－２Ｓ（配列番号３３）、ＣＣＲ６－２（配列番号４０）、ＣＣＲ６－３（配列番号４１）およびＣＣＲ６－４（配列番号４２）とした。
　９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、１０μｇ／ｍＬのＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質、１０μｇ／ｍＬの各ヒトＣＣＲ６のＮ末端領域部分合成ペプチドを、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。該プレートをＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させ、残っている活性基をブロックした。
　反応後、ＢＳＡ－ＰＢＳを捨て、該プレートに一次抗体として、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、２時間反応させた。また、硫酸化Ｔｙｒ残基に特異的に反応する抗体の陽性コントロールとして、１０μｇ／ｍＬに希釈した抗硫酸化Ｔｙｒ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。
　反応後、該プレートをｔｗｅｅｎ－ＰＢＳを用いて３回洗浄し、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリンウサギ抗体（ＤＡＫＯ社製）またはペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンウサギ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温１時間反応させた。以下は、実施例６（３）と同様にして、抗体の結合活性を測定した。その結果を図１８（ａ）および（ｂ）並びに表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体４Ｃ６を除いた全ての抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体は、ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃに強く結合したが、ヒトＣＣＲ６の２０番目～３４番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－３ペプチドおよびヒトＣＣＲ６の３０番目～４６番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－４ペプチドにはまったく結合しなかった。また、抗硫酸化Ｔｙｒ抗体は、ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃおよび硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６の９番目～２３番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドには結合したが、他の部分ペプチドにはまったく結合しなかった［図１８（ａ）および（ｂ）並びに表１］。
　従って、何れの抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体とも、ヒトＣＣＲ６のＮ末端領域細胞外ドメイン（配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～４６番目のアミノ酸）に存在するエピトープに結合することが明らかになった。また、抗硫酸化Ｔｙｒ特異的抗体がＣＨＯ細胞で製造したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に部分的に結合したことから、ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質は硫酸化Ｔｙｒ残基を含むことが明らかになった［図１８（ａ）および表１］。
　市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体１１Ａ９およびＲ６Ｈ１は何れも配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～１７番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－１ペプチドに強く結合し、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２ペプチドにも部分的に結合したが、硫酸化Ｔｙｒ残基を含む配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドには結合しなかった［図１８（ａ）および表１］。
　また市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体５３１０３、ＴＧ７－４８８およびＭＭは何れも配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～１７番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－１ペプチドに強く反応したが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２ペプチドおよび硫酸化Ｔｙｒ残基を含む配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドには殆ど結合しなかった［図１８（ａ）および表１］。
　従って、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体５３１０３、ＴＧ７－４８８、ＭＭ、１１Ａ９およびＲ６Ｈ１は何れも、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～１７番目のアミノ酸を含む領域を中心としたエピトープに結合することが明らかになった。また、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体１１Ａ９およびＲ６Ｈ１は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～２３番目のアミノ酸を含むエピトープに結合することが明らかになった。
　一方、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４は何れも硫酸化Ｔｙｒ残基を含む配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドに強く結合したが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～１７番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－１ペプチドおよび配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２ペプチドにはまったく結合しなかった［図１８（ａ）および（ｂ）並びに表１］。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４は何れも、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸に結合し、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目の硫酸化Ｔｙｒを含むエピトープに結合することが明らかになった。また、これら３つの抗体は、硫酸化Ｔｙｒ残基を含むＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に結合したことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目の硫酸化Ｔｙｒを含むペプチドだけでなく、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目の硫酸化Ｔｙｒを含むヒトＣＣＲ６の立体構造も認識し、特異的に結合することが明らかになった。
　更に、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０５は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～１７番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－１ペプチドに強く結合し、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２ペプチドおよび硫酸化Ｔｙｒ残基を含む配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドにも結合した［図１８（ａ）および表１］。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０５は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒの硫酸化の有無によらずヒトＣＣＲ６に結合したことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～２３番目のアミノ酸配列に結合し、且つエピトープには配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒ側鎖は含まれず、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～１７番目のアミノ酸配列を含むエピトープに結合することが明らかになった。
（４）抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のヒトＣＣＲ６　Ｎ末細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質（ＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃ）へのアフィニティー解析
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の結合活性を、、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）によるＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。
　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、添付プロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に固定化した。ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、実施例６で取得したＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質をインジェクションし、約１０　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔ（以下、ＲＵと略記する）になるようにキャプチャーさせた。
　その後、２７０００ｎｇ／ｍＬから段階的に２倍希釈し、１０点の濃度に調製した抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体を３０μＬ／ｍｉｎの流速でフローセルへインジェクションし、各抗体濃度のセンサーグラムを取得した。取得されたセンサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、各抗体のヒトＣＣＲ６に対するアフィニティーを算出した。
　その結果、何れの抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体とも、センサーチップのフローセルに固定化されたＮｔｈＣＣＲ６－ＩｇＧ４Ｆｃタンパク質に特異的に結合した［図１９（ａ）～（ｈ）］。また、各センサーグラムから算出された結合速度定数（ｋａ１）（１／ｓＭ）、解離速度定数（ｋｄ１）（１／ｓ）および解離定数ＫＤ（ｎＭ）［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ×１０－９（Ｍ）］を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、市販の抗ヒトＣＣＲ６マウスモノクローナル抗体ＭＭまたはＲ６Ｈ１は、それぞれ解離定数ＫＤが２．４５ｎＭ、４．９７ｎＭのアフィニティーであったが、５３１０３または１１Ａ９は、それぞれ解離定数ＫＤが７０．９ｎＭ、２０ｎＭのアフィニティーであり、ＭＭまたはＲ６Ｈ１と比べて１／４以下の低いアフィニティーであった。
　一方、本発明の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４およびＫＭ４７０５は、それぞれ解離定数ＫＤが０．３８ｎＭ、１．１５ｎＭ、０．６７ｎＭまたは６．５２ｎＭであり、何れの抗体も６．５ｎＭ以下のアフィニティーを有していた。特にＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４は、解離定数ＫＤが１．２ｎＭ以下の高いアフィニティーであり、既存の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体と比べて優位に高いアフィニティーを有していた。
（５）抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の中和活性評価
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のヒトＣＣＲ６中和活性をカルシウムアッセイを用いて測定した。
　実施例３と同様にして、ヒトＣＣＲ６（ｈＣＣＲ６）を誘導発現させたＣＣＲ６Ｇ１６細胞を調製した。本細胞にヒトＣＣＲ６特異的リガンドであるＭｉｐ－３αを添加し、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）であるヒトＣＣＲ６からのシグナルを、細胞内カルシウムイオンの増加により確認する、カルシウムアッセイで検出した。本アッセイを用いて、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の中和活性を測定した。アッセイ概略を図２０（ａ）に示す。
　実施例３で構築したＣＣＲ６Ｇ１６細胞を１０ｎＭ　β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）存在下で２４時間から４８時間培養し、ｈＣＣＲ６を誘導発現させた。ｈＣＣＲ６を誘導発現させたＣＣＲ６Ｇ１６細胞を１０ｍｍＨＥＰＥＳ（インビトロジェン社製）－ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社製）で４×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁した。
　細胞懸濁液を３８４穴プレートに３０μＬずつ播種し、ＦＬＩＰＲ　Ｃａｌｃｉｕｍ　４　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＭｏｌｅｃＬａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）に含まれるＣａ２＋　ｉｎｄｉｃａｔｏｒを５μＬ、１０ｍｍ　ＨＥＰＥＳ－ＨＢＳＳを５μＬ、３０ｍｇ／ｍＬ　Ａｍａｒａｎｔｈ（ナカライテスク社製）を０．２μＬ、各濃度に希釈した抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４、ＫＭ４７０５および市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体を５μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で６０分間静置した。
　次いで、各ウェルに１ｎＭのヒトＣＣＲ６リガンドＭｉｐ－３αを添加した。リガンド添加後、ＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社製）を用いて、１秒毎のＣａ２＋　ｉｎｄｉｃａｔｏｒの蛍光変化（励起波長４８０ｎＭ、蛍光波長５３０ｎＭ）を、３分間測定した。各ウェルのＣａ２＋　ｉｎｄｉｃａｔｏｒの蛍光強度の初期値を１に標準化した相対蛍光値をｒａｔｉｏ値とした。リガンド添加前の初期ｒａｔｉｏ値をベースラインとして、リガンド添加後６０秒間のｒａｔｉｏ値の時間曲線下面積（以下、ＡＵＣと記す）を解析に用いた。
　リガンドを添加した各ウェルのＡＵＣから、リガンド非添加のウェルのＡＵＣを引いた値をカルシウム反応とした。カルシウム反応は、リガンド１ｎＭ（抗体なし）添加時のカルシウム反応を１００％として示した［図２０（ｂ）］。ネガティブコントロールとしてヒトＣＣＲ６を誘導発現させていないＣＣＲ６Ｇ１６細胞を用いた場合は、リガンド刺激によるカルシウム反応はみられなかった。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４は、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体に比べて、Ｍｉｐ－３α依存的な細胞内Ｃａ２＋の増加を強力に阻害した。また、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２およびＫＭ４７０５は、Ｍｉｐ－３α依存的な細胞内Ｃａ２＋の増加を殆ど阻害しなかった。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４は強い中和活性を示すことが明らかとなった。
［実施例９］　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）抗ヒトＣＣＲ６抗体産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
　実施例７で取得した各ハイブリドーマＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４　およびＫＭ４７０５のそれぞれ、５×１０７～１×１０８個の細胞より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。調製したｍＲＮＡを鋳型としてＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い各抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のｃＤＮＡを調製した。
（２）抗ＣＣＲ６モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
　上記実施例９（１）で取得したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＭ４７０３およびＫＭ４７０４に関しては、ラットＣＨ１特異的なプライマー（ｒａｔ－ｈｃ－ＣＨ１）（配列番号４３）を用いてＰＣＲを行い、各抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）のｃＤＮＡ断片を増幅した。
　また、抗体の各サブクラス特異的プライマーの代わりにラットＩｇ（κ）特異的なプライマー（ｒａｔ－ｋａｐｐａ－ａ１およびｒａｔ－ｋａｐｐａ－ａ２）（配列番号４４、４５）を用いてＰＣＲを行い、各抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）のｃＤＮＡ断片を増幅した。
　また、ＫＭ４５９２およびＫＭ４７０５に関しては、上記実施例９（１）で取得したｃＤＮＡを鋳型として、マウスＩｇＧ１に特異的なプライマー（ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ１－ａ１およびｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ１－ａ２）（配列番号４６、４７）を用いてＰＣＲを行い、各抗体のＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。
　また、抗体の各サブクラス特異的プライマーの代わりにマウスＩｇ（κ）特異的なプライマー（ｍｏｕｓｅ－ｋａｐｐａ－ａ１およびｍｏｕｓｅ－ｋａｐｐａ－ａ２）（配列番号４８、４９）を用いてＰＣＲを行い、各抗体のＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。以降は、実施例１（１）と同様にしてクローニングを行なった。
　その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＶＨのｃＤＮＡを含むベクターおよびＶＬのｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＣＲ／ＫＭ４５９２ＶＬ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４５９２ＶＨ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４７０３ＶＬ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４７０３ＶＨ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４７０４ＶＬ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４７０４ＶＨ　ＰＣＲ、ｐＣＲ／ＫＭ４７０５ＶＬ　ＰＣＲおよびｐＣＲ／ＫＭ４７０５ＶＨ　ＰＣＲが取得された。クローニングの概略図を図２１に示す。
　取得された抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体発現ベクターに含まれる可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２のＶＨおよびＶＬの塩基配列を配列番号５０および５３、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号５１および５４に、分泌された抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号５２および５５に示した。また、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３を配列番号５６～５８、ＶＬのＣＤＲ１～３を配列番号５９～６１に示す。
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０３のＶＨおよびＶＬの塩基配列を配列番号６２および６５、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号６３および６６に、分泌された抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号６４および６７に示した。また、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６８～７０、ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７１～７３に示した。
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０４のＶＨおよびＶＬの塩基配列を配列番号７４および７７、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号７５および７８に、分泌された抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号７６および７９に示した。また、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８０～８２、ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８３～８５に示した。
　抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４７０５のＶＨおよびＶＬの塩基配列を配列番号８６および８９、該配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号８７および９０に、分泌された抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を配列番号８８および９１に示した。また、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９２～９４、ＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９５～９７に示した。
［実施例１０］　抗ＣＣＲ６キメラ抗体の作製
（１）抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現ベクターの構築
　本発明で作製するキメラ抗体は、実施例９（２）で取得された抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬに、国際公開第９７／１０３５４号に開示されているヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域およびヒトκ鎖定常領域をそれぞれ連結したキメラ抗体である。
　方法としては、実施例８（３）で得られた各モノクローナル抗体のＶＬまたはＶＨが含まれているｐＣＲベクターと、国際公開第９７／１０３５４号に記載されているヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域およびヒトκ鎖定常領域をｐＫＴＡＢＥＸ－ＴＣ２６に導入したＴｏｌ２トランスポゾン抗体発現ベクター（以下、ｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２と記す）（国際公開第２０１０／１４３６９８号）を用いて、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した（図２１）。
　各抗体のＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片が含まれるｐＣＲベクターを鋳型として、それぞれＫＭ４５９２ＶＬのプライマーＫＭ４５９２　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４５９２　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号９８、９９）、ＫＭ４５９２ＶＨのプライマーＫＭ４５９２　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４５９２　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１００、１０１）、ＫＭ４７０３ＶＬのプライマーＫＭ４７０３　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０３　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１０２、１０３）、ＫＭ４７０３ＶＨのプライマーＫＭ４７０３　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０３　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１０４、１０５）、ＫＭ４７０４ＶＬのプライマーＫＭ４７０４　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０４　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１０６、１０７）、ＫＭ４７０４ＶＨのプライマーＫＭ４７０４　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０４　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１０８、１０９）、ＫＭ４７０５ＶＬのプライマーＫＭ４７０５　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０５　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１１０、１１１）ならびにＫＭ４７０５ＶＨのプライマーＫＭ４７０５　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　ＦおよびＫＭ４７０５　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒ（配列番号１１２、１１３）を用いて、ＰＣＲを行いＶＨおよびＶＬのをコードするＤＮＡ断片の増幅を行った。
　ＰＣＲは、０．５μｇ／ｍＬ　ｐＣＲ／ＶＨ　ｏｒ　ＶＬベクター、２×ＫＯＤ－ＦＸバッファー２５μＬ、０．４ｍｍ　ｄＮＴＰ、ＫＯＤ－ＦＸ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）１μＬ、各０．３μＭプライマーを含む全量５０μＬの反応溶液を調製し、９４℃　２分間加熱後、９４℃　２０秒間、６８℃　４０秒間の反応サイクルを３０サイクル行った。以下は、実施例１と同様にしてＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を含むｐＣＲベクターを作製した。
　ＶＬをコードするＤＮＡ断片は、制限酵素ＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、ＶＬのＢｇｌＩＩ－ＢｓｉＷＩ断片を取得した。また、ＶＨをコードするＤＮＡ断片は、制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＮｈｅＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、ＶＨのＳａｌＩ－ＮｈｅＩ断片を取得した。
　以下は上記と同様にして、取得した該ＶＨまたはＶＬをコードするＤＮＡ断片を、ヒトｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２発現ベクターの適切な位置に挿入して、抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体ＫＭ４５９２、ＫＭ４７０３、ＫＭ４７０４またはＫＭ４７０５の可変領域をコードするＤＮＡを含む抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現ベクターｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２／ＫＭ４５９２、ｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２／ＫＭ４７０３、ｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２／ＫＭ４７０４およびｐＫＴＡＢＥＸ－Ｔｃ２６．２／ＫＭ４７０５を作製した。
　（２）動物細胞を用いた抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体の発現・精製
　上記実施例１０（１）で作製した抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現ベクターは、実施例１（３）と同様にして　α１，６－ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＦＵＴ８）遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞（以下、ＣＨＯ－Ｋ１　ＦＵＴ８ＫＯと記す）に導入し、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体発現細胞ＣＨＯ／ＫＭ４５９２（Ｆｕ－）、ＣＨＯ／ＫＭ４７０３（Ｆｕ－）、ＣＨＯ／ＫＭ４７０４（Ｆｕ－）およびＣＨＯ／ＫＭ４７０５（Ｆｕ－）を作製した。
　同様にして、抗ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＤＮＰ）ヒト抗体（Ｍｏｔｏｋｉ　Ｋ　ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１１，３１２６－３１３５，２００５）を作製した。該細胞は、実施例６（２）と同様にしてＣＨＸ／ＩＭＤＭ培地で１週間培養した。
　次に、上述実施例６（２）と同様にＭａｂｓｅｌｅｃｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、取得した培養上清から精製抗体を取得した。精製抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を行い抗体タンパク質を確認した。
　その結果、還元状態では、５０ｋＤａおよび２５ｋＤａ付近に、非還元状態では１５０　ｋＤａ付近にバンドを確認した。この結果から、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラの精製抗体が取得されたことがわかった。
［実施例１１］　抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体の活性評価
　以下の（１）から（６）では、実施例１０（２）で得られた抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラ、およびＫＭ４７０５キメラの活性評価を行った。
（１）蛍光細胞染色法（ＦＣＭ解析）による抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体のヒトおよびカニクイザルＣＣＲ６に対する結合活性の解析
　抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラの、実施例１で作製されたヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）および実施例５で作製されたカニクイザルＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６）への結合活性は、実施例８（１）と同様の方法で測定した。ただし、二次抗体として、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、ｃａｔ．Ａ１１０１３）を用いた。
　その結果、図２２（ａ）～（ｄ）に示すように本発明の抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ［図２２（ａ）］、ＫＭ４７０３キメラ［図２２（ｂ）］、ＫＭ４７０４キメラ［図２２（ｃ）］およびＫＭ４７０５キメラ［図２２（ｄ）］はいずれも、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ＣＣＲ６の両方に抗体濃度依存的に反応した（図２２）。また、いずれの抗体のヒトＣＣＲ６およびカニクイザルＣＣＲ６への反応性は同等であり、親抗体と同様の結合活性を有していた。
（２）ＦＣＭによる抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体のエピトープ解析
　抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラのヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）および実施例４で作製したヒトマウスキメラＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｍＮｔｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６）に対する結合活性を、実施例８（２）の方法と同様にして測定した。また、ネガティブコントロール抗体として、抗ＤＮＰヒト抗体を用いた。
　その結果、本発明の抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラはいずれも、ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ１ｈＣＣＲ６、ＣＨＯ－ｍＥＣＬ２ｈＣＣＲ６およびＣＨＯ－ｍＥＣＬ３ｈＣＣＲ６に結合し、ＣＨＯ－ｍＮｔ　ｈＣＣＲ６に対してのみ結合しなかった（図２３）。また、抗ＤＮＰ抗体は何れの細胞にも結合しなかった。
　従って、本発明の抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラのエピトープは、各親抗体のエピトープと同じであり、全ての抗体がヒトＣＣＲ６の１番目～４６番目のアミノ酸を含むＮ末端領域のエピトープに反応することが明らかになった。
（３）バインディングＥＬＩＳＡによる抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体のエピトープ解析
　ヒト抗ＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラの、ヒトＣＣＲ６Ｎ末端部分ペプチドに対する結合活性を、実施例８（３）と同様にして測定した。ただし、二次抗体として、Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製、ｃａｔ．Ａ１１０ＰＤ）を用いた。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラおよびＫＭ４７０４キメラはいずれも、ネガティブコントロール抗ＤＮＰ抗体と比べて、硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６の９番目～２３番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドに強く結合した。また、ヒトＣＣＲ６の１番目～１７番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－１ペプチドおよびヒトＣＣＲ６の９番目～２３番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－２ペプチドにはまったく結合しなかった（図２４）。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラおよびＫＭ４７０４キメラは何れも、９番目～２３番目のアミノ酸配列に結合し、特にヒトＣＣＲ６の１８番目の硫酸化Ｔｙｒ残基を含むエピトープに結合することが明らかになった。
　更に、本発明の抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４７０５キメラは、ヒトＣＣＲ６の１番目～１７番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－１ペプチドに強く結合し、ヒトＣＣＲ６の９番目～２３番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－２ペプチドおよび硫酸化Ｔｙｒ残基を含むヒトＣＣＲ６の９番目～２３番目のアミノ酸配列を含むＣＣＲ６－２Ｓペプチドにも結合した（図２４）。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４７０５キメラは、ヒトＣＣＲ６の１８番目のＴｙｒの硫酸化の有無によらずヒトＣＣＲ６に結合したことから、１８番目のＴｙｒ側鎖を含まない１番目～２３番目のアミノ酸配列に結合し、特にヒトＣＣＲ６の９番目～１７番目のアミノ酸配列を含むエピトープに結合することが明らかになった。
　以上の結果から、本発明の抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラは、各親抗体と同様のエピトープに反応することが明らかとなった。
（４）抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体の中和活性評価
　抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラおよびＫＭ４７０５キメラの、Ｍｉｐ－３α依存的ヒトＣＣＲ６の中和活性を、実施例８（５）と同様のカルシウムアッセイ方法で測定した。
　リガンドを添加した各ウェルのＡＵＣから、リガンド非添加のウェルのＡＵＣを引いた値をカルシウム反応とした。また、リガンド１ｎＭ添加（抗体なし）のウェルのＡＵＣから、リガンド非添加ウェルのＡＵＣを引いたものを１００％とした時の、各抗体添加ウェルの細胞内Ｃａ２＋増加量（％）を図２５に示す。
　図２５に示すように、抗ＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４７０３キメラおよびＫＭ４７０４キメラは、市販の抗ヒトＣＣＲ６モノクローナル抗体に比べて、Ｍｉｐ－３α依存的細胞内Ｃａ２＋の増加を強く阻害した。また、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラおよびＫＭ４７０５キメラはＭｉｐ－３α依存的細胞内Ｃａ２＋の増加を殆ど阻害しなかった。
　従って、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４７０３キメラおよびＫＭ４７０４キメラは、強い中和活性を示すことが明らかになった。また、実施例１１（１）～（３）で確認された各キメラ抗体の結合活性と同様、いずれの抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体の中和活性も各親抗体と同等であった。
（５）抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体のヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性の評価
　実施例１で作製されたヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６）に対するＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（５）－１　標的細胞懸濁液の調製
　ほぼコンフルエントのヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６をＤ－ＰＢＳで洗浄後、０．０２％ＥＤＴＡ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて剥がした。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を取り除いた後、細胞ペレットを５％牛胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社）を含むフェノールレッド不含有ＲＰＭＩ　１６４０倍地（インビトロジェン社製）で洗浄し、同培地で至適の細胞密度に調整して標的細胞懸濁液とした。
（５）－２　エフェクター細胞懸濁液の調整
　末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　：ＰＢＭＣ）は、健常人末梢血から以下に示した方法により分離した。ヘパリンナトリウム注（味の素社製）を０．５ｍＬ加えたシリンジを用いて、健常人から健常人末梢血を５０ｍＬを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水（大塚製薬社製）を加えて希釈し、良く攪拌した。
　５０ｍＬチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１２．５ｍＬずつ分注したＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ社製）の上に、２５ｍＬの希釈末梢血を静かに重層し、８４０ｇ、ブレーキオフ、室温の条件で２０分間遠心分離して、単核球層を分離した。こうして得られた単核球画分を、ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄し、同培地により至適の細胞密度に調製して、エフェクター細胞懸濁液とした。
（５）－３　ＡＤＣＣ活性の測定
　９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、各抗体溶液を終濃度１００００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬで５０μＬずつ分注した後、次に（５）－１で調製した標的細胞懸濁液を１×１０４個／５０μＬ／ウェルずつ分注し、最後に（５）－２で調製したエフェクター細胞懸濁液を２．５×１０５個／５０μＬ／ウェルずつ分注し、全量を１５０μＬとして、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。
　また、反応開始から３時間１５分後に、標的細胞全遊離と一部の培地のみのウェルに、９％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１５μＬ／ウェルで添加した。なお、エフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は２５：１とした。反応後、ＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔｅｓｔ（和光純薬社製）を用いて各培養上清の発色を測定した。
　ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（Ａ－Ｂ－Ｃ）／（Ｄ－Ｅ）｝×１００
Ａ：［検体の吸光度］
Ｂ：［標的細胞自然遊離の吸光度］
Ｃ：［エフェクター細胞自然遊離の吸光度］
Ｄ：［標的細胞全遊離の吸光度］－［９％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００を加えた培地の吸光度］
Ｅ：［標的細胞自然遊離の吸光度］－［培地のみの吸光度］
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラ、およびＫＭ４７０５キメラはヒトＣＣＲ６発現ＣＨＯ細胞ＣＨＯ－ｈＣＣＲ６に対してＡＤＣＣ活性を示した［図２６（ａ）および（ｂ）］。
（６）抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体のＴおよびＢ細胞に対する除去活性の評価
　健常人末梢血から単離したＰＢＭＣ中のＴおよびＢ細胞に対する除去活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（６）－１　標的細胞兼エフェクター細胞懸濁液の調整
　（５）－２に示した方法で、健常人末梢血由来ＰＢＭＣを分離し、５ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ×１００（インビトロジェン社製）、５ｍＬ　ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１０ｍＭ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ、５ｍＬ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１００ｍＭ（１００×），ｌｉｑｕｉｄ（インビトロジェン社製）、５ｍＬ　２００ｍＭ－Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（インビトロジェン社製）を添加したＰＢＭＣ用培地（５００ｍＬ　ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社製）で２回洗浄した後、同培地により１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に調製して、標的細胞兼エフェクター細胞懸濁液とした。
（６）－２　除去活性の評価
　２４ウェル平底プレートの各ウェルに、各抗体溶液を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように２００μＬずつ分注した後、（６）－１で調製した標的兼エフェクター細胞懸濁液を８００μＬずつ分注し、全量を１ｍＬとして、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、２４時間反応させた。反応後、１５ｍＬチューブに各ウェルの細胞液を全量回収した後、各ウェルを１ｍＬの０．０５％　ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅおよび１０ｍｍ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒと略記する。）で２回洗浄し、洗浄液を同じ１５ｍＬチューブに回収した。
　回収した細胞液に、内部標準としてＦｌｏｗ　Ｃｏｕｎｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、遠心分離した後、上清を取り除いた。さらに、１～２ｍＬのＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄した後、１ｍＬ　ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒおよび１μＬ　ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ｙｅｌｌｏｗ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して、室温で３０分間暗所にて反応させた。
　次に、ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、０．２ｍｇ／ｍＬ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＰＢＳを１００μＬ添加して、４℃で１時間暗所にて反応させた。反応後、ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、各種染色用抗体（Ｔ細胞染色にはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＡＦ７００標識抗ＣＤ４５ＲＯ　抗体、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５標抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、Ｂ細胞染色にはＰｅｒＣＰＣｙ５．５標識抗ＣＤ１９抗体を用いた。）を適量含む１００μＬ　ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを添加して、４℃で２０分間暗所にて反応させた後、細胞をＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、１００μＬ　ＰＦＡ（ｐａｒａ　ｆｏｒｍ　ａｌｄｅｈｙｄｅ）を添加して室温で１０分間反応させた。
　反応後、細胞をＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに懸濁してフローサイトメーター（ＬＳＲＩＩＦｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光強度を測定した。データの測定は、内部標準として用いたＦｌｏｗ　Ｃｏｕｎｔ　Ｂｅａｄｓの個数が５００００カウントに達した時点で終了した。
　その結果、抗ヒトＣＣＲ６キメラ抗体ＫＭ４５９２キメラ、ＫＭ４７０３キメラ、ＫＭ４７０４キメラ、およびＫＭ４７０５キメラは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ－Ｍｅｍｏｒｙ　Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示す一方で、ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ４５ＲＡ＋ＮａｉｖｅＴ細胞に対して細胞傷害活性を示さないことが確認できた［図２７（ａ）および（ｂ）］。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１１年７月１日付で出願された米国仮出願（６１／５０３７４５）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号５：Ｈｕｍａｎ－ＣＣＲ６－ｆプライマーの塩基配列
配列番号６：Ｈｕｍａｎ－ＣＣＲ６－ｒプライマーの塩基配列
配列番号７：ＣＣＲ６ＭｕｎＩ－ｆプライマーの塩基配列
配列番号８：ＣＣＲ６ＢａｍＨＩ－ｒプライマーの塩基配列
配列番号９：Ｈｕｍａｎ－１－１６２－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１０：Ｈｕｍａｎ－１３８－２８８－ｒプライマーの塩基配列
配列番号１１：Ｈｕｍａｎ－２６４－４１３－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１２：Ｈｕｍａｎ－３９４－５４０－ｒプライマーの塩基配列
配列番号１３：Ｈｕｍａｎ－５１９－６７７－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１４：Ｈｕｍａｎ－６４９－７８１－ｒプライマーの塩基配列
配列番号１５：Ｈｕｍａｎ－７５９－９１４－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１６：Ｈｕｍａｎ　８９０－１０２０－ｒプライマーの塩基配列
配列番号１７：Ｈｕｍａｎ　９９９－１１２５－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１８：Ｍｏｕｓｅ　Ｎｔ－１－１６２－ｆプライマーの塩基配列
配列番号１９：Ｍｏｕｓｅ　Ｌ１－２６４－４１３－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２０：Ｍｏｕｓｅ　Ｌ２－５１９－６７７－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２１：Ｍｏｕｓｅ　Ｌ３－７５９－９１４－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２２：Ｍｏｕｓｅ　ＣＣＲ６Ｍｕｎ１－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２３：ＣＣＲ６Ｍｕｎ１－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２４：ＣＣＲ６ＢａｍＨ１－ｒプライマーの塩基配列
配列番号２５：Ｍａｃａｃａｆ－ＣＣＲ６－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２６：Ｍａｃａｃａｆ－ＣＣＲ６－ｒプライマーの塩基配列
配列番号２７：ＣＣＲ６ＭｕｎＩ－ｆプライマーの塩基配列
配列番号２８：ＣＣＲ６ＢａｍＨＩ－ｒプライマーの塩基配列
配列番号２９：ＣＣＲ６（１－２８）－ｆプライマーの塩基配列
配列番号３０：ＣＣＲ６（１１８－１３８）－ＢａｍＨＩ－ｒプライマーの塩基配列
配列番号３１：ｈＮｔＣＣＲ６－Ｆｃの塩基配列
配列番号３２：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３３：合成ＣＣＲ６－２Ｓのアミノ酸配列
配列番号３４：ＣＣＲ６－１のアミノ酸配列
配列番号３５：ＣＣＲ６－２Ｓのアミノ酸配列
配列番号３６：ＣＣＲ６－２のアミノ酸配列
配列番号３７：ＣＣＲ６－３のアミノ酸配列
配列番号３８：ＣＣＲ６－４のアミノ酸配列
配列番号３９：合成ＣＣＲ６－１のアミノ酸配列
配列番号４０：合成ＣＣＲ６－２のアミノ酸配列
配列番号４１：合成ＣＣＲ６－３のアミノ酸配列
配列番号４２：合成ＣＣＲ６－４のアミノ酸配列
配列番号４３：ラット－ｈｃ－ＣＨ１の塩基配列
配列番号４４：ラット－ｋａｐｐａ－ａ１の塩基配列
配列番号４５：ラット－ｋａｐｐａ－ａ２の塩基配列
配列番号４６：マウス－ＩｇＧ１－ａ１の塩基配列
配列番号４７：マウス－ＩｇＧ１－ａ２の塩基配列
配列番号４８：マウス－ｋａｐｐａ－ａ１の塩基配列
配列番号４９：マウス－ｋａｐｐａ－ａ２の塩基配列
配列番号５６：ＫＭ４５９２　ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５７：ＫＭ４５９２　ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５８：ＫＭ４５９２　ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５９：ＫＭ４５９２　ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６０：ＫＭ４５９２　ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６１：ＫＭ４５９２　ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６８：ＫＭ４７０３　ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６９：ＫＭ４７０３　ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７０：ＫＭ４７０３　ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７１：ＫＭ４７０３　ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号７２：ＫＭ４７０３　ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号７３：ＫＭ４７０３　ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８０：ＫＭ４７０４　ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８１：ＫＭ４７０４　ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８２：ＫＭ４７０４　ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号８３：ＫＭ４７０４　ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号８４：ＫＭ４７０４　ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号８５：ＫＭ４７０４　ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９２：ＫＭ４７０５　ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９３：ＫＭ４７０５　ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９４：ＫＭ４７０５　ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９５：ＫＭ４７０５　ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９６：ＫＭ４７０５　ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号９７：ＫＭ４７０５　ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号９８：ＫＭ４５９２　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号９９：ＫＭ４５９２　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１００：ＫＭ４５９２　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１０１：ＫＭ４５９２　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１０２：ＫＮ４７０３　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１０３：ＫＭ４７０３　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１０４：ＫＭ４７０３　Ｈ　ｐＫＴＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１０５：ＫＭ４７０３　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１０６：ＫＭ４７０４　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１０７：ＫＭ４７０４　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１０８：ＫＭ４７０４　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１０９：ＫＭ４７０４　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１１０：ＫＭ４７０５　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１１１：ＫＭ４７０５　Ｋ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１１２：ＫＭ４７０５　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｆの塩基配列
配列番号１１３：ＫＭ４７０５　Ｈ　ｐＫＴＡＢＥＸ　Ｒの塩基配列
配列番号１１４：カニクイザルＣＣＲ６アイソフォーム１の塩基配列
配列番号１１５：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１１６：カニクイザルＣＣＲ６アイソフォーム２の塩基配列
配列番号１１７：合成コンストラクトのアミノ酸配列

Claims (22)

  1. 　硫酸化されたヒトＣＣケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）の細胞外領域に結合する抗体および該抗体断片。
  2. 　前記ヒトＣＣＲ６の細胞外領域が、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１番目～４６番目のアミノ酸を含む、請求項１に記載の抗体および該抗体断片。
  3. 　抗体および該抗体断片が結合するエピトープが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒを少なくとも含む、請求項１または２に記載の抗体および該抗体断片。
  4. 　前記エピトープが、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目～２３番目のアミノ酸を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  5. 　前記エピトープにおける配列番号２で表されるアミノ酸配列の１８番目のＴｙｒが硫酸化されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
  6. 　抗体が下記（ａ）～（ｄ）から選ばれる抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。　
    （ａ）それぞれ配列番号５６～５８で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３およびそれぞれ配列番号５９～６１で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域、それぞれ配列番号６８～７０で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号７１～７３で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域並びにそれぞれ配列番号８０～８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１～３およびそれぞれ配列番号８３～８５で表されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３を含む抗体可変領域から選ばれるいずれか１つの抗体可変領域を含む抗体。
    （ｂ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体および該抗体断片。
    （ｃ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
    （ｄ）前記（ａ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
  7. 　抗体が下記（ｅ）～（ｈ）から選ばれる抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体および該抗体断片。
    （ｅ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域並びに配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域および配列番号７９に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗体可変領域から選ばれるいずれか１つの抗体可変領域を含む抗体。
    （ｆ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体と競合反応する抗体および該抗体断片。
    （ｇ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープを含むエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
    （ｈ）前記（ｄ）で表される抗体から選ばれるいずれか１つの抗体が反応するエピトープと同じエピトープに反応する抗体および該抗体断片。
  8. 　抗体が、遺伝子組換え抗体である請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  9. 　遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項８に記載の抗体または該抗体断片。
  10. 　抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体断片。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  12. 　請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクターを導入して得られる形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
  13. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を用いるヒトＣＣＲ６の検出または測定用試薬。
  14. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
  15. 　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患が癌および自己免疫疾患から選ばれる疾患である、請求項１４に記載の診断薬。
  16. 　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が、ｎａｉｖｅ／ｍｅｍｏｒｙ　Ｂ細胞、Ｔｈ１／１７細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｈ２２細胞から選ばれる少なくとも１つの細胞である、請求項１４または１５に記載の診断薬。
  17. 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
  18. ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患が癌および自己免疫疾患から選ばれる疾患である、請求項１７に記載の治療薬。
  19. 　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が、ｎａｉｖｅ／ｍｅｍｏｒｙ　Ｂ細胞、Ｔｈ１／１７細胞、Ｔｈ１７細胞およびＴｈ２２細胞から選ばれる少なくとも１つの細胞である、請求項１７または１８に記載の治療薬。
  20. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を用いてヒトＣＣＲ６陽性細胞を検出または測定することを含む、ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
  21. 　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
  22. 　ヒトＣＣＲ６陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
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