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WO2013099871A1 - Ｓｐｆｓ測定用センサーチップ、およびｓｐｆｓ測定用センサーチップを用いたｓｐｆｓ測定方法、ならびにｓｐｆｓ測定用センサーチップを備えたｓｐｆｓ測定装置 - Google Patents

Ｓｐｆｓ測定用センサーチップ、およびｓｐｆｓ測定用センサーチップを用いたｓｐｆｓ測定方法、ならびにｓｐｆｓ測定用センサーチップを備えたｓｐｆｓ測定装置 Download PDF

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WO2013099871A1
WO2013099871A1 PCT/JP2012/083483 JP2012083483W WO2013099871A1 WO 2013099871 A1 WO2013099871 A1 WO 2013099871A1 JP 2012083483 W JP2012083483 W JP 2012083483W WO 2013099871 A1 WO2013099871 A1 WO 2013099871A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sensor chip
spfs
dielectric member
spfs measurement
thin film
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/083483
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正貴 松尾
賢治 石田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Konica Minolta Inc filed Critical Konica Minolta Inc
Priority to US14/367,323 priority Critical patent/US9970875B2/en
Priority to JP2013551705A priority patent/JP6098523B2/ja
Priority to EP12862962.3A priority patent/EP2799843B1/en
Publication of WO2013099871A1 publication Critical patent/WO2013099871A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices

Definitions

  • the present invention relates to surface plasmon enhanced fluorescence using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) (hereinafter simply referred to as “SPFS”) in the fields of medicine, biotechnology, and the like.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • the present invention relates to an SPFS measurement sensor chip used in a spectroscopic measurement apparatus, an SPFS measurement method using the SPFS measurement sensor chip, and an SPFS measurement apparatus including the SPFS measurement sensor chip.
  • an SPFS apparatus capable of performing analyte detection with high accuracy based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) applying the surface plasmon resonance phenomenon.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPFS surface plasmon excitation-enhanced fluorescence spectroscopy
  • ATR attenuated total reflection
  • This makes it possible to form a localized electric field enhanced several tens to several hundreds of times on the surface of a metal thin film, and a fluorescent substance bonded (labeled) with the analyte trapped in the enhanced localized electric field is arranged to fluoresce.
  • This is a method for detecting an extremely small amount of analyte at a very low concentration by efficiently exciting the fluorescence of a substance and observing this fluorescence.
  • a sensor chip for SPFS measurement used in such an SPFS apparatus includes a dielectric member that constitutes a prism, and a metal thin film is formed on the upper surface of the dielectric member.
  • the SPFS measurement sensor chip having such a configuration requires complicated matching of optical conditions, and the optical characteristics and quality storage stability of the SPFS measurement sensor chip are important requirements.
  • the SPFS measurement sensor chip provided with a resin dielectric member has a problem that the characteristics such as signal, noise, and detection sensitivity vary greatly depending on the environmental conditions, and the quantitativeness cannot be ensured.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 4689907
  • a measuring chip used for a surface plasmon resonance device (SPR device) using a surface plasmon resonance (SPR) phenomenon is substantially provided with a liquid reservoir. It has been proposed that when a cup-shaped dielectric is injection molded, a resin introduction gate (resin injection port) is disposed at the bottom of the dielectric and injection molded.
  • the SPFS measurement sensor chip has a large variation in characteristics such as signal, noise, and detection sensitivity depending on the environmental conditions, and cannot ensure quantitativeness.
  • the resin injection port is arranged at the bottom of the dielectric as in Patent Document 1, injection molding is performed as shown by the solid line in the graph of FIG. 9 of Comparative Example 1 described later.
  • the S / N ratio which is the ratio between the signal to be detected and the background noise in the fluorescence measurement, is compared with the initial S / N ratio (iniS / N), and the S / N ratio after leaving the environment ( There is a problem in that final S / N) is lowered and becomes an obstacle to high-precision and accurate SPFS measurement.
  • the SPV measurement sensor chip does not stabilize the CV value that is the coefficient of variation, which is an obstacle to high-precision and accurate SPFS measurement. There's a problem.
  • the present invention is an SPFS measurement sensor that can perform quantitative and accurate SPFS measurement with little fluctuation in characteristics such as signal, noise, and detection sensitivity even under environmental conditions. It is an object of the present invention to provide an SPFS measurement method using a chip, an SPFS measurement sensor chip, and an SPFS measurement apparatus including the SPFS measurement sensor chip.
  • the sensor chip for SPFS measurement of the present invention comprises: A sensor chip for SPFS measurement provided with a dielectric member constituting a prism produced by injection molding a resin, The reflection light incident surface of the dielectric member, the metal thin film forming surface of the dielectric member, and the reflected light that is incident from the excitation light incident surface and reflected by the metal thin film forming surface of the dielectric member is emitted.
  • a resin injection port is arranged on one side end surface of the dielectric member intersecting with the light emitting surface, As viewed from the metal thin film forming surface side of the dielectric member, the distance from the side end surface position of the resin injection port to the position farthest from the side end surface position of the resin injection port of the metal thin film formation surface is b.
  • the center of the ligand fixing part as a reaction part is located between a distance of 3b / 8 to 6b / 8 from the side end face position of the resin injection port.
  • the SPFS measuring method of the present invention includes: A sensor chip for SPFS measurement provided with a dielectric member constituting a prism produced by injection molding a resin, The reflection light incident surface of the dielectric member, the metal thin film forming surface of the dielectric member, and the reflected light that is incident from the excitation light incident surface and reflected by the metal thin film forming surface of the dielectric member is emitted.
  • a sensor chip for SPFS measurement in which a resin injection port is arranged on one side end surface of a dielectric member that intersects the light emitting surface, As viewed from the metal thin film forming surface side of the dielectric member, the distance from the side end surface position of the resin injection port to the position farthest from the side end surface position of the resin injection port of the metal thin film formation surface is b.
  • the amount of the analyte is calculated by measuring the fluorescence emitted from the fluorescent substance labeled with the analyte immobilized by the ligand on the metal thin film.
  • the S / N ratio which is the ratio between the signal to be detected and the background noise in the fluorescence measurement, is the initial S as shown by the solid line in the graph of FIG. Even when compared to the / N ratio (iniS / N), it can be seen that the S / N ratio (final S / N) after being left in the environment does not decrease, and high-precision and accurate SPFS measurement can be performed.
  • the present invention is characterized in that a flow path capable of introducing a specimen is formed on the metal thin film forming surface of the dielectric member.
  • a flow path into which the specimen can be introduced is formed.
  • the flow path is made near the metal thin film. It is possible to detect a trace amount and an extremely low concentration analyte by efficiently exciting a fluorescent substance bound (labeled) with the captured analyte and observing the fluorescence.
  • the ligand fixing part is formed in the flow path,
  • the flow direction in the flow path is configured to be parallel to the excitation light incident surface and the reflected light emission surface of the dielectric member.
  • the sample solution flows in a direction parallel to the excitation light incident surface and the reflected light emission surface of the dielectric member, and the analyte can be reliably captured by the ligand fixing portion formed in the flow path. .
  • the SPFS measurement sensor chip is provided with a positioning and fixing portion for positioning and fixing the SPFS measurement sensor chip in the SPFS measurement device for detection.
  • the SPFS measurement sensor chip can be accurately positioned in the SPFS measurement device that performs detection using the positioning and fixing unit provided on the SPFS measurement sensor chip. Accurate position adjustment between the center position of the fixed part and the irradiation region can be performed, and high-precision and accurate SPFS measurement can be performed.
  • the present invention is characterized in that the positioning and fixing portion is formed on a flow path lid member provided on the dielectric member.
  • the positioning fixing part is formed on the dielectric member.
  • the SPFS measuring device of the present invention is characterized by including the SPFS measuring sensor chip described above.
  • the present invention there are few fluctuations in characteristics such as signal, noise, detection sensitivity, etc., depending on the environmental conditions, it is possible to ensure quantitativeness, and it is possible to carry out highly accurate and accurate SPFS measurement.
  • FIG. 1 is a perspective view of a sensor chip for SPFS measurement according to the present invention.
  • FIG. 2 is a top view of the SPFS measurement sensor chip of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an outline of an evaluation method performed using the SPFS measurement sensor chip of FIG.
  • FIG. 4 is a partial enlarged cross-sectional view for explaining the outline of the sensor chip for SPFS measurement in FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the evaluation method.
  • 6 is a perspective view of a sensor chip for SPFS measurement of Comparative Example 1.
  • FIG. 7 is a top view of the SPFS measurement sensor chip of FIG.
  • FIG. 8 is a bottom view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of the evaluation method.
  • FIG. 1 is a perspective view of a sensor chip for SPFS measurement according to the present invention.
  • FIG. 2 is a top view of the SPFS measurement sensor chip of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic
  • FIG. 10 is a top view of a sensor chip 10 for SPFS measurement according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view taken along line AA of the SPFS measurement sensor chip 10 of FIG.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view taken along line BB of the SPFS measurement sensor chip 10 of FIG.
  • FIG. 13 is a top view of a sensor chip 10 for SPFS measurement according to still another embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a front view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG. 15 is a right side view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG.
  • FIG. 16 is a schematic top view for explaining a method of fixing the SPFS measurement sensor chip of FIG. 13 to the sensor chip holder.
  • Example 1 1 is a perspective view of a sensor chip for SPFS measurement of the present invention
  • FIG. 2 is a top view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG. 1
  • FIG. 3 is an evaluation performed using the sensor chip for SPFS measurement of FIG.
  • FIG. 4 is a partial enlarged cross-sectional view for explaining the outline of the sensor chip for SPFS measurement in FIG. 3, and
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the evaluation method.
  • the sensor chip 10 for SPFS measurement of this example is a surface plasmon enhanced fluorescence spectroscopic measurement using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS; Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy). It is a sensor chip for SPFS measurement used for an apparatus.
  • SPFS surface plasmon enhanced fluorescence spectroscopic measurement using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • the SPFS measurement sensor chip 10 includes a dielectric member 12 made of a hexahedron having a substantially trapezoidal cross section (a truncated quadrangular pyramid shape) that constitutes a prism as well as a dielectric member body.
  • the horizontal upper surface of the member 12 constitutes a metal thin film forming surface 14 on which the metal thin film 16 is formed.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 is constituted by the dielectric member 12 and the metal thin film 16 formed on the metal thin film forming surface 14 of the dielectric member 12.
  • one side surface below the dielectric member 12 forms an excitation light incident surface 18 on which excitation light from a light source (not shown) enters as shown by an arrow in FIG. 1. is doing.
  • the other side surface below the dielectric member 12 forms a reflected light emitting surface 20 from which the reflected light reflected by the metal thin film 16 is emitted, as shown by the arrow in FIG.
  • the light emitted from the reflected light emitting surface 20 is received by the light receiving means (not shown) disposed on the other side surface below the dielectric member 12 so that the reflected light reflected by the metal thin film 16 is received. It has become.
  • the material of the dielectric member 12 is formed of a material that is optically transparent at least with respect to the excitation light.
  • a resin material by injection molding is used. Formed from.
  • Examples of the resin material forming the dielectric member 12 include polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate, polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP), cyclic olefin copolymer (COC), and cyclic.
  • polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate
  • polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP)
  • PP polypropylene
  • COC cyclic olefin copolymer
  • Polycyclic olefins such as olefin polymer (COP), vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride, polystyrene, polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether sulfone (PES), polycarbonate ( PC), polyamide, polyimide, acrylic resin, triacetyl cellulose (TAC), and the like can be used.
  • COP olefin polymer
  • vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride
  • PEEK polyether ether ketone
  • PSF polysulfone
  • PES polyether sulfone
  • PC polycarbonate
  • PC polyamide
  • polyimide acrylic resin
  • TAC triacetyl cellulose
  • the dielectric member 12 intersects the excitation light incident surface 18 of the dielectric member 12, the metal thin film forming surface 14 of the dielectric member 12, and the reflected light emitting surface 20.
  • the dielectric member 12 is manufactured by disposing a resin injection port (gate) 24 on one of the side end faces 22 and injection molding a resin material.
  • intersection means not only when intersecting substantially vertically but also when intersecting at a certain angle, and is not limited.
  • Immobilization of antigen capture carrier That is, using a cyclic olefin polymer (COP), a dielectric member 12 (refractive index of 1.52) having dimensions of 25 mm long ⁇ 8 mm wide ⁇ 3 mm high was produced by injection molding.
  • COP cyclic olefin polymer
  • dielectric member 12 reffractive index of 1.52
  • a metal thin film 16 made of gold having a thickness of 41 nm was formed on the metal thin film forming surface 14 of the dielectric member 12 by using a sputtering method.
  • the flow path lid member 44 is composed of an acrylic pressure-sensitive adhesive sheet (thickness 0.1 mm) in which a flow path groove having a width of 3 mm and a length of 23 mm, which forms the flow path wall 42, is punched.
  • the flow path 46 was formed by bonding a 2 mm thick plate material (lid) 13 made of PMMA (polymethyl methacrylate resin) to the surface of the sensor chip 10 for SPFS measurement.
  • a laser light (wavelength: 635 nm) is emitted from a light source 26 through a wavelength separation filter (manufactured by Nippon Vacuum Optics Co., Ltd.) 28 and a deflector plate 30, and a sensor chip for SPFS measurement.
  • a wavelength separation filter manufactured by Nippon Vacuum Optics Co., Ltd.
  • the excitation light from the light source 26 was applied to the sensor chip 10 for SPFS measurement.
  • FIG. 4 schematically shows a sensor chip for SPFS measurement, and the system in which the S / N ratio was evaluated was not a dye fixed on the gold film surface as shown in FIG. The system was filled with a dye-containing buffer throughout the flow path.
  • a light receiving sensor detects fluorescence by surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy through a 10 ⁇ objective lens (manufactured by Nikon Corporation) and a wavelength separation filter (manufactured by Nippon Vacuum Optics Co., Ltd.) 34 as the light collecting means 32 36 was detected with a photomultiplier tube PMT (manufactured by Hamamatsu Photonics).
  • TBS Tris-Buffered Saline
  • the S / N ratio which is the ratio between the signal to be detected and the background noise in the fluorescence measurement, is compared with the initial S / N ratio (iniS / N).
  • the S / N ratio (final S / N) after leaving the environment does not decrease, and the SPFS measurement can be performed with high accuracy and accuracy.
  • the CV value which is the coefficient of variation
  • the CV value is stable, and high-precision and accurate SPFS measurement can be performed.
  • the material of the metal thin film 16 is not particularly limited, but preferably comprises at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, More preferably, it is made of gold and may be made of an alloy of these metals.
  • such a metal is suitable as the metal thin film 16 because it is stable against oxidation and, as will be described later, the electric field enhancement by surface plasmon light (complex wave) becomes large.
  • the method for forming the metal thin film 16 is not particularly limited, and examples thereof include a sputtering method, a vapor deposition method (resistance heating vapor deposition method, electron beam vapor deposition method, etc.), electrolytic plating, electroless plating method, and the like. . It is preferable to use a sputtering method or a vapor deposition method because it is easy to adjust the thin film formation conditions.
  • the thickness of the metal thin film 16 is not particularly limited, but preferably, gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 Desirably within the range of ⁇ 500 nm and their alloys: 5 to 500 nm.
  • gold 20 to 70 nm
  • silver 20 to 70 nm
  • aluminum 10 to 50 nm
  • copper 20 to 70 nm
  • platinum 20 to 70 nm
  • alloys thereof It is desirable to be within the range of 10 to 70 nm.
  • the thickness of the metal thin film 16 is within the above range, surface plasmon light (dense wave) is likely to be generated, which is preferable. Moreover, if it is the metal thin film 16 which has such thickness, a shape will not be specifically limited.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 configured as described above is used as the sensor chip 10 of the SPFS measurement apparatus.
  • a solution containing a ligand that specifically binds to the analyte to be detected is flowed on the metal thin film 16, the ligand is immobilized on the metal thin film 16, and then washed.
  • the sensor chip 10 for SPFS measurement is not limited to the state after the ligand is immobilized on the metal thin film 16 as described above, but the state before the ligand is immobilized on the metal thin film 16. The thing is also included.
  • sample solution containing the analyte bound (labeled) with the fluorescent substance is caused to flow on the metal thin film 16 and specifically washed with the ligand on the metal thin film 16 and then washed.
  • the sample solution used here is a solution prepared using a specimen.
  • the specimen and the reagent are mixed and treated to bind the fluorescent substance to the analyte contained in the specimen. Things.
  • specimens include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, etc.).
  • the analyte contained in the sample is, for example, a nucleic acid (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), etc., or nucleoside Nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules thereof, Specific examples thereof include a complex, and may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signal transduction substance, a hormone, and the like, and is not particularly limited.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • excitation light is emitted from the light source 26 arranged on one side of the dielectric member 12 below the measurement point (irradiation region), that is, the center A of the ligand fixing portion 38.
  • P1 is refracted by being incident from the excitation light incident surface 18 of the dielectric member 12 at an incident angle ⁇ 1 with respect to the excitation light incident surface 18, and is incident on the metal thin film 16 on the upper surface of the dielectric member 12 to be a total reflection condition.
  • Irradiation is performed as excitation light P2 at ⁇ (a constant incident angle (resonance angle)).
  • the reflected light P3 reflected by the metal thin film 16 is refracted at a constant angle ⁇ 2 by the reflected light emitting surface 20 formed on the other side surface below the dielectric member 12, and is reflected as a reflected light P4.
  • the light is received by a light receiving means (not shown) disposed on the other side surface below the member 12, and it can be confirmed whether the incident angle ⁇ is a predetermined total reflection condition.
  • the excitation light P2 irradiated from the light source 26 is generated by generating surface plasmon light (dense wave) on the surface of the metal thin film 16 by the excitation light P2 irradiated to the metal thin film 16 on the upper surface of the dielectric member 12.
  • the amount of photons possessed is increased to several tens to several hundreds of times to obtain the electric field enhancement effect of surface plasmon light.
  • the analyte is captured by the ligand fixed to the SPFS measurement sensor chip 10, and in order to receive the fluorescence emitted by the fluorescent substance labeled with this analyte, the photoelectron is located above the SPFS measurement sensor chip 10.
  • a light receiving sensor 36 such as a multiplier tube (PMT) or CCD is provided.
  • a condensing means 32 for efficiently condensing the fluorescence, and light other than the fluorescence is removed to remove the fluorescence.
  • a wavelength separation filter 34 for selecting only the wavelength is provided.
  • the distance from the side end face position 12a of the inlet 24 to the position 18a farthest away is b, Highly accurate and accurate SPFS measurement is performed when the center A of the ligand fixing part 38 as a reaction part is located between the side end face position 12a of the resin injection port 24 and a distance of 3b / 8 to 6b / 8. it can.
  • Comparative Example 1 6 is a perspective view of the sensor chip for SPFS measurement of Comparative Example 1
  • FIG. 7 is a top view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG. 6
  • FIG. 8 is a bottom view of the sensor chip for SPFS measurement of FIG. 9 is a graph showing the results of the evaluation method.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 was produced in the same manner as the evaluation test described above. However, as shown in FIGS. 6 and 8, a resin injection port (gate) 24 is arranged at the bottom 40 of the dielectric member 12.
  • the detection target in the fluorescence measurement is lower than the initial S / N ratio (iniS / N), and the S / N ratio (final S / N) after leaving the environment is reduced. There is a problem that it becomes an obstacle to high-precision and accurate SPFS measurement.
  • the SPV measurement sensor chip does not stabilize the CV value that is the coefficient of variation, which is an obstacle to high-precision and accurate SPFS measurement. I know there is a problem.
  • Example 2 10 is a top view of a sensor chip 10 for SPFS measurement according to another embodiment of the present invention
  • FIG. 11 is a cross-sectional view taken along the line AA of the sensor chip 10 for SPFS measurement of FIG. 10
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of the SPFS measurement sensor chip 10 taken along line BB.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 of this embodiment has basically the same configuration as the SPFS measurement sensor chip 10 shown in FIGS. 1 to 5, the same reference numerals are given to the same components. A detailed description thereof will be omitted.
  • the flow path wall 42 made of a spacer is provided on the metal thin film forming surface 14 of the dielectric member 12
  • a channel lid member 44 is provided on the upper surface of the channel wall 42.
  • the channel lid member 44 has two spaced reagent inlets 48 formed therein.
  • a fixing portion 54 is formed.
  • the ligand fixing part as a reaction part is provided between the side end face position 12a of the resin inlet 24 and a distance of 3b / 8 to 6b / 8. Since the center A of 38 is located, the flow path wall 42 and the flow path lid member 44 are formed so as to be shifted to a position away from the side end face position 12a of the resin inlet 24 of the dielectric member 12 as a whole.
  • a concave positioning positioning portion is formed as the positioning fixing portion 54.
  • the shape, number, and arrangement position of the positioning fixing portion 54 such as a convex shape and a slit shape are measured by SPFS. The position can be appropriately changed according to the shape of the position fixing portion on the apparatus side.
  • the flow path 46 into which the specimen can be introduced is formed.
  • the metal thin film By flowing a sample solution containing the specimen (analyte) to be detected into the flow path 46, the metal thin film It is possible to detect a trace amount and an extremely low concentration analyte by efficiently exciting a fluorescent substance bound (labeled) with the analyte captured in the vicinity and observing this fluorescence.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 can be accurately positioned in the SPFS measurement device that performs detection using the positioning and fixing unit 54 provided on the SPFS measurement sensor chip 10, the ligand fixing unit 38 that is a reaction unit is provided. It is possible to accurately adjust the position of the center of the light source and the irradiation region, and to perform SPFS measurement with high accuracy and accuracy.
  • the flow direction in the flow path 46 is configured to be parallel to the excitation light incident surface 18 and the reflected light emission surface 20 of the dielectric member 12 as indicated by arrows in FIG. ing.
  • any of the direction away from the side end surface position 12a of the resin injection port 24 of the dielectric member 12 and the opposite direction may be sufficient.
  • the sample solution flows in a direction parallel to the excitation light incident surface 18 and the reflected light emission surface 20 of the dielectric member 12, and the analyte is supplied to the ligand fixing portion 38 formed in the flow path 46. Can be reliably captured.
  • Example 3 13 is a top view of a sensor chip 10 for SPFS measurement according to still another embodiment of the present invention
  • FIG. 14 is a front view of the sensor chip for SPFS measurement in FIG. 13
  • FIG. 15 is a sensor for SPFS measurement in FIG. 3 is a right side view of the chip 10.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 of this embodiment has basically the same configuration as the SPFS measurement sensor chip 10 shown in FIGS. 1 to 12, the same reference numerals are given to the same components. A detailed description thereof will be omitted.
  • the recessed positioning positioning fixing portions 54 are formed at both side end portions 52 of the one projecting portion 50 in the width direction of the flow path lid member 44.
  • the positioning and fixing portion 54 can be integrally formed with the dielectric member 12 by injection molding of a resin material.
  • one positioning fixing part 54 can be used as the resin injection port 24.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 constituted by the dielectric member 12 having the positioning and fixing portion 54 as described above is used by being positioned and fixed to a sensor chip holder fixed in the SPFS measurement apparatus.
  • the sensor chip 10 is placed on the sensor chip holder 56 fixed in the SPFS measuring apparatus and biased in the A direction.
  • the reference surface 54 a of the positioning and fixing portion 54 comes into contact with the inner surface of the sensor chip holder 56, thereby positioning in the A direction.
  • the reference surface 54 b of the positioning and fixing portion 54 comes into contact with the inner surface of the sensor chip holder 56, thereby positioning in the B direction.
  • a convex-shaped positioning and fixing portion is formed as the positioning and fixing portion 54.
  • the shape, number, and arrangement position of this positioning and fixing portion 54 such as a concave shape and a slit shape are measured by SPFS. It can be appropriately changed according to the shape of the sensor chip holder 56 on the apparatus side.
  • the SPFS measurement sensor chip 10 can be accurately positioned in the SPFS measurement device that performs detection using the positioning and fixing portion 54 that is formed integrally with the dielectric member 12.
  • the position of the center of the ligand fixing part 38 and the irradiation region can be accurately adjusted, and high-precision and accurate SPFS measurement can be performed.
  • the dielectric member 12 constituting the prism is a hexahedron having a substantially trapezoidal cross section.
  • the shape of the truncated quadrangular pyramid but the shape of the dielectric member 12 is not particularly limited. For example, it can be a triangular prism shape having a triangular cross-section, and the scope of the present invention is not deviated. Various changes are possible.
  • the present invention relates to surface plasmon enhanced fluorescence using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) (hereinafter simply referred to as “SPFS”) in the fields of medicine, biotechnology, and the like.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • the present invention can be applied to the SPFS measurement sensor chip used in the spectroscopic measurement apparatus, the SPFS measurement method using the SPFS measurement sensor chip, and the SPFS measurement apparatus including the SPFS measurement sensor chip.

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Description

ＳＰＦＳ測定用センサーチップ、およびＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いたＳＰＦＳ測定方法、ならびにＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたＳＰＦＳ測定装置
　本発明は、例えば、医療、バイオテクノロジーなどの分野において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）（以下、単に「ＳＰＦＳ」と言う）を用いた表面プラズモン増強蛍光分光測定装置に用いられるＳＰＦＳ測定用センサーチップ、およびＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いたＳＰＦＳ測定方法、ならびにＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたＳＰＦＳ測定装置に関する。
　従来より、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。
　このような検体検出装置の一つとしては、表面プラズモン共鳴現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、高精度にアナライト検出を行えるようにしたＳＰＦＳ装置がある。
　表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）条件において励起光を入射することで発生するエバネッセント波と、金属薄膜表面に存在する表面プラズモンとが共鳴することにより、金属薄膜表面に数十倍～数百倍に増強した局在電場を形成することが可能となり、この増強した局在電場に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を配置し蛍光物質の蛍光を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出する方法である。
特許第４６８９９０７号公報
　ところで、このようなＳＰＦＳ装置に用いられるＳＰＦＳ測定用センサーチップは、プリズムを構成する誘電体部材を備えており、この誘電体部材の上面に金属薄膜が形成されている。
　このような構成を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、複雑な光学条件のマッチングが必要であり、ＳＰＦＳ測定用センサーチップの光学特性と品質の保存安定性は重要な要件である。
　特に、樹脂製の誘電体部材を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、環境条件によっては、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が大きく、定量性が確保できないという課題があった。
　すなわち、たとえば、出荷輸送時の環境（－１０℃～５０℃）や、冷蔵保存（４℃）や冷凍保存（－２０℃）から、実使用の温度（２０℃～３７℃）まで復帰などの環境変化において、定量性が確保できないという課題があった。
　ところで、特許文献１（特許第４６８９９０７号公報）においては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象を用いた表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）に用いる測定チップにおいて、液溜め部を備えた略カップ形状の誘電体を射出成形する際に、誘電体の底部に樹脂導入用ゲート（樹脂注入口）を配置して射出成形することが提案されている。
　しかしながら、上記のように、ＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、環境条件によっては、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が大きく、定量性が確保できない。
　従って、この特許文献１のように、誘電体の底部に樹脂注入口を配置して射出成形した場合には、後述する比較例１の図９のグラフの実線で示したように、ＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、蛍光測定において検出対象のシグナルとバックグランドノイズとの比であるＳ／Ｎ比が、初期Ｓ／Ｎ比（iniＳ／Ｎ）に比較して、環境放置後のＳ／Ｎ比（finalＳ／Ｎ）が低下して、高精度で正確なＳＰＦＳ測定の障害となってしまうという問題がある。
　また、比較例１の図９のグラフの点線で示したように、ＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、変動係数であるＣＶ値が安定せず、高精度で正確なＳＰＦＳ測定の障害となってしまうという問題がある。
　本発明は、このような現状に鑑み、環境条件によっても、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が少なく、定量性が確保でき、高精度で正確なＳＰＦＳ測定を実施できるＳＰＦＳ測定用センサーチップ、およびＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いたＳＰＦＳ測定方法、ならびにＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたＳＰＦＳ測定装置を提供することを目的とする。
　本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、本発明のＳＰＦＳ測定用センサーチップは、
　樹脂を射出成形することによって作製したプリズムを構成する誘電体部材を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップであって、
　前記誘電体部材の励起光入射面と、前記誘電体部材の金属薄膜形成面と、前記励起光入射面から入射し、前記誘電体部材の金属薄膜形成面で反射された反射光が出射する反射光出射面とに交差する誘電体部材の一方の側端面に樹脂注入口を配置し、
　前記誘電体部材の金属薄膜形成面側から見て、前記樹脂注入口の側端面位置から、前記金属薄膜形成面の前記樹脂注入口の側端面位置から最も離間した位置までの距離をｂとした時に、
　前記樹脂注入口の側端面位置から、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間に、反応部であるリガンド固定部の中心が位置するように構成したことを特徴とする。
　また、本発明のＳＰＦＳ測定方法は、
　樹脂を射出成形することによって作製したプリズムを構成する誘電体部材を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップであって、
　前記誘電体部材の励起光入射面と、前記誘電体部材の金属薄膜形成面と、前記励起光入射面から入射し、前記誘電体部材の金属薄膜形成面で反射された反射光が出射する反射光出射面とに交差する誘電体部材の一方の側端面に樹脂注入口を配置したＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いて、
　前記誘電体部材の金属薄膜形成面側から見て、前記樹脂注入口の側端面位置から、前記金属薄膜形成面の前記樹脂注入口の側端面位置から最も離間した位置までの距離をｂとした時に、
　前記樹脂注入口の側端面位置から、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間にある前記誘電体部材上に形成した金属薄膜の少なくとも一部分に、前記誘電体部材側から励起光を照射し、
　前記金属薄膜上のリガンドによって固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光を測定して、アナライト量を算出することを特徴とする。
　このように構成することによって、後述する実施例１の図５のグラフの実線で示したように、蛍光測定において検出対象のシグナルとバックグランドノイズとの比であるＳ／Ｎ比が、初期Ｓ／Ｎ比（iniＳ／Ｎ）に比較しても、環境放置後のＳ／Ｎ比（finalＳ／Ｎ）が低下せず、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できることが分かる。
　また、後述する実施例１の図５のグラフの点線で示したように、変動係数であるＣＶ値が安定して、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できることが分かる。
　すなわち、環境条件によっても、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が少なく、定量性が確保でき、高精度で正確なＳＰＦＳ測定を実施できる。
　また、本発明では、前記誘電体部材の金属薄膜形成面上に、検体を導入可能な流路が形成されていることを特徴とする。
　このように構成することによって、検体を導入可能な流路が形成されているので、検出対象となる検体（アナライト）を含有する試料溶液をこの流路内に流すことによって、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出することが可能である。
　また、本発明では、前記流路内に前記リガンド固定部が形成されており、
　前記流路における流れ方向が、前記誘電体部材の前記励起光入射面と前記反射光出射面とに平行な方向となるように構成されていることを特徴とする。
　このように構成することによって、誘電体部材の励起光入射面と反射光出射面とに平行な方向に試料溶液が流れて、流路内に形成したリガンド固定部にアナライトが確実に捕捉できる。
　従って、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出することが可能である。
　また、本発明では、前記ＳＰＦＳ測定用センサーチップ上に、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップを位置決め固定を行うための位置決め固定部を備えることを特徴とする。
　このように構成することによって、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ上に備えられた位置決め固定部を用いて、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップを正確に位置決めできるので、反応部であるリガンド固定部の中心の位置と照射領域との正確な位置調整ができ、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できる。
　また、本発明では、前記位置決め固定部が、前記誘電体部材上に備えられた流路蓋部材に形成されていることを特徴とする。
　また、本発明では、前記位置決め固定部が、前記誘電体部材に形成されていることを特徴とする。
　また、本発明のＳＰＦＳ測定装置は、前述のいずれかに記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたことを特徴とする。
　本発明によれば、環境条件によっても、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が少なく、定量性が確保でき、高精度で正確なＳＰＦＳ測定を実施できる。
図１は、本発明のＳＰＦＳ測定用センサーチップの斜視図である。 図２は、図１のＳＰＦＳ測定用センサーチップの上面図である。 図３は、図１のＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いて行った評価方法の概略を説明する概略図である。 図４は、図３のＳＰＦＳ測定用センサーチップの概略を説明する部分拡大断面図である。 図５は、評価方法の結果を示すグラフである。 図６は、比較例１のＳＰＦＳ測定用センサーチップの斜視図である。 図７は、図６のＳＰＦＳ測定用センサーチップの上面図である。 図８は、図６のＳＰＦＳ測定用センサーチップの下面図である。 図９は、評価方法の結果を示すグラフである。 図１０は、本発明の別の実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の上面図である。 図１１は、図１０のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０のＡ－Ａ線での断面図である。 図１２は、図１０のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０のＢ－Ｂ線での断面図である。 図１３は、本発明のさらに別の実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の上面図である。 図１４は、図１３のＳＰＦＳ測定用センサーチップの正面図である。 図１５は、図１３のＳＰＦＳ測定用センサーチップの右側面図である。 図１６は、図１３のＳＰＦＳ測定用センサーチップをセンサーチップホルダーに固定する方法を説明するための概略上面図である。
　以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。
　［実施例１］
　図１は、本発明のＳＰＦＳ測定用センサーチップの斜視図、図２は、図１のＳＰＦＳ測定用センサーチップの上面図、図３は、図１のＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いて行った評価方法の概略を説明する概略図、図４は、図３のＳＰＦＳ測定用センサーチップの概略を説明する部分拡大断面図、図５は、評価方法の結果を示すグラフである。
　図１～図２に示したように、この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）を用いた表面プラズモン増強蛍光分光測定装置に用いられるＳＰＦＳ測定用センサーチップである。
　そして、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、誘電体部材本体を構成するとともに、プリズムを構成する断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）からなる誘電体部材１２を備えており、この誘電体部材１２の水平な上面が、金属薄膜１６が形成された金属薄膜形成面１４を構成している。
　この誘電体部材１２と、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４に形成された金属薄膜１６とでＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を構成している。
　また、図１に示したように、誘電体部材１２の下方の一方の側面が、図示しない光源からの励起光が、図１の矢印で示したように、入射する励起光入射面１８を形成している。
　一方、誘電体部材１２の下方の他方の側面が、図１の矢印で示したように、金属薄膜１６によって反射された反射光が出射する反射光出射面２０を形成している。
　なお、この反射光出射面２０から出射した光は、誘電体部材１２の下方の他方の側面の側に配置された図示しない受光手段によって、金属薄膜１６によって反射された反射光を受光するようになっている。
　この場合、誘電体部材１２の材質は、少なくとも励起光に対して光学的に透明な材料から形成され、安価で取り扱い性に優れるＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を提供する上で、射出成形による樹脂材料から形成されている。
　誘電体部材１２を形成する樹脂材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
　そして、図１～図２に示したように、誘電体部材１２の励起光入射面１８と、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４と、反射光出射面２０とに交差する誘電体部材１２の一方の側端面２２に樹脂注入口（ゲート）２４を配置し、樹脂材料を射出成形することにより、誘電体部材１２を作製する。
　なお、この場合、「交差する」とは、略垂直に交差する場合だけでなく、一定の角度を有して交差する場合も含める意味であり、限定されるものではない。
（評価試験）
　そして、図１のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を用いて、図３、図４の評価方法を行った。
　（１－１）抗原捕捉担体の固定化：
　すなわち、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）を用いて、縦２５ｍｍ×横８ｍｍ×高さ３ｍｍの寸法の誘電体部材１２（屈折率１．５２）を射出成型により作製した。
　そして、この誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４にスパッタリング法を用いて、厚さ４１ｎｍの金からなる金属薄膜１６を形成した。
　（１－２）流路の作製：
　図３に示したように、流路壁４２を構成する、幅３ｍｍｘ長さ２３ｍｍの流路溝が打ち抜かれたアクリル系粘着シート（厚さ０．１ｍｍ、）で、流路蓋部材４４を構成する、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル樹脂）製の２ｍｍ厚の板材（蓋）１３をＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の表面に貼合することによって、流路４６を形成した。
　ここで、図３に示したように、光源２６から、レーザー光（波長：６３５ｎｍ）を、波長分離フィルター（日本真空光学（株）製）２８、偏向板３０を介して、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の金属薄膜１６へのレーザー光の入射角度角が最適角になるように光源２６を固定した後、光源２６による励起光をＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０に照射した。
　なお、図４は、模式的にＳＰＦＳ測定用センサーチップを示したものであり、Ｓ／Ｎ比を評価した系は、図４に示したように、金膜面に色素を固定したものではなく、流路内全体に色素入りバッファーを満たした系で行った。
　そして、集光手段３２として１０倍の対物レンズ（（株）ニコン製）、波長分離フィルター（日本真空光学（株）製）３４を介して、表面プラズモン励起増強蛍光分光法による蛍光を、受光センサー３６として光電子増倍管ＰＭＴ（浜松ホトニクス（株）製）で検出した。
　なお、測定条件としては、
＜測定対象＞
　ノイズ対象として、流路内に測定バッファー（「Tris-Buffered Saline (TBS)」バッファー)を流した。
　シグナル対象として、流路内に色素含有バッファー（「Alexa Fluor 647」反応性色素を含むTBSバッファー）を流した。
＜評価内容＞
　初期（ini）：チップの環境放置なしで、シグナルとバックグランドノイズの測定を実施した。
　環境放置後（final）：流路形成チップの環境放置後、すなわち、６０℃、８０質量％の環境下で、２４０時間放置後、２４時間室温環境下で放置後のシグナルとバックグランドノイズの測定を実施した。
　その結果、図２に示したように、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４の側から見て、樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから、金属薄膜形成面１４の樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから最も離間した位置１８ａまでの距離をｂとした時に、
　樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間では環境放置有無に関わらずシグナル・ノイズが安定して計測できることが確認され、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間にリガンド固定部３８の中心Ａを配置すると、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できることが判明した（図２の斜線部分参照）。
　すなわち、図５のグラフの実線で示したように、蛍光測定において検出対象のシグナルとバックグランドノイズとの比であるＳ／Ｎ比が、初期Ｓ／Ｎ比（iniＳ／Ｎ）に比較しても、環境放置後のＳ／Ｎ比（finalＳ／Ｎ）が低下せず、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できることが分かる。
　また、図５のグラフの点線で示したように、変動係数であるＣＶ値が安定して、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できることが分かる。
　すなわち、環境条件によっても、シグナルやノイズ、検出感度などの特性の変動が少なく、定量性が確保でき、高精度で正確なＳＰＦＳ測定を実施できることが分かる。
　なお、本発明において、金属薄膜１６の材質としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成しても良い。
　すなわち、このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するように、表面プラズモン光（粗密波）による電場増強が大きくなるので、金属薄膜１６として好適である。
　また、金属薄膜１６の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易であるので望ましい。
　さらに、金属薄膜１６の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、および、それらの合金：５～５００ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
　なお、電場増強効果の観点からは、より好ましくは、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、および、それらの合金：１０～７０ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
　金属薄膜１６の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモン光（粗密波）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１６であれば、形状は、特に限定されない。
　このように構成されるＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、ＳＰＦＳ測定装置のセンサーチップ１０として用いられる。
　以下に、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を、ＳＰＦＳ装置に用いる場合について説明する。
　先ず、検出対象となるアナライトと特異的に結合するリガンドを含む溶液を金属薄膜１６上に流して、金属薄膜１６上にリガンドを固定化した後洗浄する。
　なお、本発明において、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０としては、このように金属薄膜１６上にリガンドを固定化した後の状態のものだけでなく、金属薄膜１６上にリガンドを固定化する前の状態のものをも含むものである。
　その後、蛍光物質で結合（標識）したアナライトを含む試料溶液を、金属薄膜１６上に流し、金属薄膜１６上のリガンドと特異的に結合させた後洗浄する。
　なお、ここで用いられる試料溶液は、検体を用いて調製された溶液であり、例えば、検体と試薬とを混合して検体中に含有されるアナライトに蛍光物質を結合させるための処理をしたものが挙げられる。
　このような検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。
　また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
　そして、図３に示したように、測定ポイント（照射領域）、すなわち、リガンド固定部３８の中心Ａに対して、誘電体部材１２の下方の一方の側面側に配置した光源２６から、励起光Ｐ１を誘電体部材１２の励起光入射面１８から励起光入射面１８に対する入射角度θ１で入射させて屈折させ、誘電体部材１２の上面の金属薄膜１６に向かって、全反射条件となる入射角θ（一定角度の入射角（共鳴角度））で、励起光Ｐ２として照射する。
　そして、金属薄膜１６で反射された反射光Ｐ３は、誘電体部材１２の下方の他方の側面に形成された反射光出射面２０により、一定角度θ２で屈折されて、反射光Ｐ４として、誘電体部材１２の下方の他方の側面側に配置された図示しない受光手段によって受光され、全反射条件となる所定の入射角θであるかどうかを確認することができるようになっている。
　すなわち、一定角度の入射角θ（共鳴角度）で、金属薄膜１６上に表面プラズモン光（粗密波）が生ずるのを、出射面側に配置した受光手段で受光される金属薄膜１６からの反射光Ｐ４のシグナルが変化（光量が減少）する地点で見つけることができる。
　そして、この誘電体部材１２の上面の金属薄膜１６に照射された励起光Ｐ２によって、金属薄膜１６の表面に表面プラズモン光（粗密波）を発生させることによって、光源２６より照射した励起光Ｐ２が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。
　そして、この電場増強効果により、金属薄膜１６に固定化されたリガンドによって、金属薄膜１６の表面近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出するようになっている。
　すなわち、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０に固定されているリガンドによってアナライトが捕捉され、このアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光を受光するために、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の上方には、光電子増倍管（ＰＭＴ）やＣＣＤなどの受光センサー３６が設けられている。
　なお、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０と受光センサー３６との間には、図３に示したように、蛍光を効率良く集光するための集光手段３２と、蛍光以外の光を除去して蛍光のみを選択する波長分離フィルター３４が設けられている。
　そして、前述したように、図２に示したように、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４の側から見て、樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから、金属薄膜形成面１４の樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから最も離間した位置１８ａまでの距離をｂとした時に、
　樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間に、反応部であるリガンド固定部３８の中心Ａが位置する場合に、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できる。
　［比較例１］
　図６は、比較例１のＳＰＦＳ測定用センサーチップの斜視図、図７は、図６のＳＰＦＳ測定用センサーチップの上面図、図８は、図６のＳＰＦＳ測定用センサーチップの下面図、図９は、評価方法の結果を示すグラフである。
　前述の評価試験と同様にして、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を作製した。但し、図６、図８に示したように、誘電体部材１２の底部４０に樹脂注入口（ゲート）２４を配置している。
　そして、実施例１の評価試験と同様に評価試験を行った。
　その結果、図９のグラフの実線で示したように、ＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、誘電体部材１２の底部４０に樹脂注入口２４を配置して射出成形した場合には、蛍光測定において検出対象のアッセイシグナルとアッセイブランクシグナルとの比であるＳ／Ｎ比が、初期Ｓ／Ｎ比（iniＳ／Ｎ）に比較して、環境放置後のＳ／Ｎ比（finalＳ／Ｎ）が低下して、高精度で正確なＳＰＦＳ測定の障害となってしまうという問題がある。
　また、比較例１の図９のグラフの点線で示したように、ＳＰＦＳ測定用センサーチップでは、変動係数であるＣＶ値が安定せず、高精度で正確なＳＰＦＳ測定の障害となってしまうという問題があることが分かる。
　［実施例２］
　図１０は、本発明の別の実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の上面図、図１１は、図１０のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０のＡ－Ａ線での断面図、図１２は、図１０のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０のＢ－Ｂ線での断面図である。
　この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、図１～図５に示したＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０と基本的には同様な構成であるので、同一の構成部材には、同一の参照番号を付して、その詳細な説明を省略する。
　この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０では、図１０～図１２に示したように、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４上に、スペーサーから構成される流路壁４２を備えており、この流路壁４２の上面に流路蓋部材４４を備えている。
　これにより、誘電体部材１２の金属薄膜形成面１４上に、検体を導入可能な流路４６が形成されている。また、流路蓋部材４４には、２つの離間した試薬注入口４８が形成されている。
　さらに、流路蓋部材４４の幅方向の一方の突設部５０の両側端部５２には、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の位置決め固定を行うための凹部形状の位置決め固定部５４が形成されている。
　また、この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０では、前述したように、樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間に、反応部であるリガンド固定部３８の中心Ａが位置するので、流路壁４２と流路蓋部材４４は、全体的に誘電体部材１２の樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから離間する位置にずれて形成されている。
　なお、この実施例では、位置決め固定部５４として凹部形状の位置決め固定部が形成されているが、凸部形状、スリット形状など、この位置決め固定部５４の形状、数、配置位置などは、ＳＰＦＳ測定装置側の位置固定部の形状などに応じて適宜変更可能である。
　このように構成することによって、検体を導入可能な流路４６が形成されているので、検出対象となる検体（アナライト）を含有する試料溶液をこの流路４６内に流すことによって、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出することが可能である。
　また、ＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０上に備えられた位置決め固定部５４を用いて、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を正確に位置決めできるので、反応部であるリガンド固定部３８の中心の位置と照射領域との正確な位置調整ができ、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できる。
　また、この場合、流路４６における流れ方向は、図１０の矢印で示したように、誘電体部材１２の励起光入射面１８と反射光出射面２０とに平行な方向となるように構成されている。なお、平行であれば、誘電体部材１２の樹脂注入口２４の側端面位置１２ａから離間する方向、その逆の方向のいずれであっても良い。
　このように構成することによって、誘電体部材１２の励起光入射面１８と反射光出射面２０とに平行な方向に試料溶液が流れて、流路４６内に形成したリガンド固定部３８にアナライトが確実に捕捉できる。
　従って、金属薄膜１６の近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトを検出することが可能である。
　［実施例３］
　図１３は、本発明のさらに別の実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の上面図、図１４は、図１３のＳＰＦＳ測定用センサーチップの正面図、図１５は、図１３のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０の右側面図である。
　この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、図１～図１２に示したＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０と基本的には同様な構成であるので、同一の構成部材には、同一の参照番号を付して、その詳細な説明を省略する。
　上述する実施例２では、流路蓋部材４４の幅方向の一方の突設部５０の両側端部５２に凹部形状の位置決め固定部５４を形成しているが、この実施例のＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０では、図１３～図１５に示したように、誘電体部材１２の両側端面２２，２３に凸部形状の位置決め固定部５４が形成されている。
　なお、本実施例においては、位置決め固定部５４は、樹脂材料を射出成形することによって、誘電体部材１２と一体的に成形することができる。
　なお、一方の位置決め固定部５４を、樹脂注入口２４とすることもできる。
　このように位置決め固定部５４を有する誘電体部材１２で構成されたＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０は、ＳＰＦＳ測定装置内に固定されたセンサーチップホルダーに位置決め固定されて使用される。
　具体的には、図１６に示すように、ＳＰＦＳ測定装置内に固定されたセンサーチップホルダー５６に、センサーチップ１０を載置した状態で、Ａ方向に付勢する。これにより、位置決め固定部５４の基準面５４ａが、センサーチップホルダー５６の内面と接触することにより、Ａ方向についての位置決めがなされる。
　さらに、Ｂ方向に付勢することにより、位置決め固定部５４の基準面５４ｂが、センサーチップホルダー５６の内面と接触することにより、Ｂ方向についての位置決めがなされる。
　なお、この実施例では、位置決め固定部５４として凸部形状の位置決め固定部が形成されているが、凹部形状、スリット形状など、この位置決め固定部５４の形状、数、配置位置などは、ＳＰＦＳ測定装置側のセンサーチップホルダー５６の形状などに応じて適宜変更可能である。
　このように構成することによって、誘電体部材１２と一体的に成形された位置決め固定部５４を用いて、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップ１０を正確に位置決めできるので、反応部であるリガンド固定部３８の中心の位置と照射領域との正確な位置調整ができ、高精度で正確なＳＰＦＳ測定が実施できる。
　以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、プリズムを構成する誘電体部材１２を、断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）としたが、この誘電体部材１２の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、断面三角形の三角柱形状とすることもできるなど本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
　　本発明は、例えば、医療、バイオテクノロジーなどの分野において、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）（以下、単に「ＳＰＦＳ」と言う）を用いた表面プラズモン増強蛍光分光測定装置に用いられるＳＰＦＳ測定用センサーチップ、およびＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いたＳＰＦＳ測定方法、ならびにＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたＳＰＦＳ測定装置に適用できる。
１０   ＳＰＦＳ測定用センサーチップ
１２   誘電体部材
１２ａ  側端面位置
１４   金属薄膜形成面
１６   金属薄膜
１８   励起光入射面
２０   反射光出射面
２２    側端面
２３    側端面
２４    樹脂注入口
２６    光源
２８　　波長分離フィルター
３０    偏向板
３２    集光手段
３４    波長分離フィルター
３６    受光センサー
３８    リガンド固定部
４０    底部
４２   流路壁
４４   流路蓋部材
４６   流路
４８   試薬注入口
５０   突設部
５２   両側端部
５４   位置決め固定部
５４ａ　基準面
５６   センサーチップホルダー

Claims (13)

  1. 　樹脂を射出成形することによって作製したプリズムを構成する誘電体部材を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップであって、
    　前記誘電体部材の励起光入射面と、前記誘電体部材の金属薄膜形成面と、前記励起光入射面から入射し、前記誘電体部材の金属薄膜形成面で反射された反射光が出射する反射光出射面とに交差する誘電体部材の一方の側端面に樹脂注入口を配置し、
    　前記誘電体部材の金属薄膜形成面側から見て、前記樹脂注入口の側端面位置から、前記金属薄膜形成面の前記樹脂注入口の側端面位置から最も離間した位置までの距離をｂとした時に、
    　前記樹脂注入口の側端面位置から、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間に、反応部であるリガンド固定部の中心が位置するように構成したことを特徴とするＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  2. 　前記誘電体部材の金属薄膜形成面上に、検体を導入可能な流路が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  3. 　前記流路内に前記リガンド固定部が形成されており、
    　前記流路における流れ方向が、前記誘電体部材の前記励起光入射面と前記反射光出射面とに平行な方向となるように構成されていることを特徴とする請求項２に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  4. 　前記ＳＰＦＳ測定用センサーチップに、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップを位置決め固定を行うための位置決め固定部を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  5. 　前記位置決め固定部が、前記誘電体部材上に備えられた流路蓋部材に形成されていることを特徴とする請求項４に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  6. 　前記位置決め固定部が、前記誘電体部材に形成されていることを特徴とする請求項４に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  7. 　樹脂を射出成形することによって作製したプリズムを構成する誘電体部材を備えたＳＰＦＳ測定用センサーチップであって、
    　前記誘電体部材の励起光入射面と、前記誘電体部材の金属薄膜形成面と、前記励起光入射面から入射し、前記誘電体部材の金属薄膜形成面で反射された反射光が出射する反射光出射面とに交差する誘電体部材の一方の側端面に樹脂注入口を配置したＳＰＦＳ測定用センサーチップを用いて、
    　前記誘電体部材の金属薄膜形成面側から見て、前記樹脂注入口の側端面位置から、前記金属薄膜形成面の前記樹脂注入口の側端面位置から最も離間した位置までの距離をｂとした時に、
    　前記樹脂注入口の側端面位置から、３ｂ／８～６ｂ／８の距離の間にある前記誘電体部材上に形成した金属薄膜の少なくとも一部分に、前記誘電体部材側から励起光を照射し、
    　前記金属薄膜上のリガンドによって固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光を測定して、アナライト量を算出することを特徴とするＳＰＦＳ測定方法。
  8. 　前記誘電体部材の金属薄膜形成面上に、検体を導入可能な流路が形成されていることを特徴とする請求項７に記載のＳＰＦＳ測定方法。
  9. 　前記流路内に前記リガンド固定部が形成されており、
    　前記流路における流れ方向が、前記誘電体部材の前記励起光入射面と前記反射光出射面とに平行な方向となるように構成されていることを特徴とする請求項８に記載のＳＰＦＳ測定方法。
  10. 　前記ＳＰＦＳ測定用センサーチップに、検出を行うＳＰＦＳ測定装置内にＳＰＦＳ測定用センサーチップを位置決め固定を行うための位置決め固定部を備えることを特徴とする請求項７から９のいずれかに記載のＳＰＦＳ測定方法。
  11. 　前記位置決め固定部が、前記誘電体部材上に備えられた流路蓋部材に形成されていることを特徴とする請求項１０に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  12. 　前記位置決め固定部が、前記誘電体部材に形成されていることを特徴とする請求項１０に記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップ。
  13. 　請求項１から６のいずれかに記載のＳＰＦＳ測定用センサーチップを備えたことを特徴とするＳＰＦＳ測定装置。
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