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WO2013072110A1 - Mikrofluidisches filterelement zum abscheiden von probenbestandteilen aus einem biologischen probenfluid - Google Patents

Mikrofluidisches filterelement zum abscheiden von probenbestandteilen aus einem biologischen probenfluid Download PDF

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Publication number
WO2013072110A1
WO2013072110A1 PCT/EP2012/068901 EP2012068901W WO2013072110A1 WO 2013072110 A1 WO2013072110 A1 WO 2013072110A1 EP 2012068901 W EP2012068901 W EP 2012068901W WO 2013072110 A1 WO2013072110 A1 WO 2013072110A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
filter element
microfluidic
filter
sample fluid
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2012/068901
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martina Daub
Thomas BRETTSCHNEIDER
Christian Dorrer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of WO2013072110A1 publication Critical patent/WO2013072110A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • Microfluidic filter element for separating sample components from a biological sample fluid
  • the present invention relates to a microfluidic filter element for
  • compositions of the sample fluid can be separated from this. However, the often low concentration of these ingredients is one
  • the prior art uses a multiplicity of different filters which, on the one hand, are selected depending on the size of the constituents to be separated on the one hand and the remaining constituents contained in the sample fluid on the other hand.
  • the size of the components of the sample to be detected must therefore be sufficiently different from the remaining components of the sample liquid. In the case of bacteria in whole blood, this requirement is not met because the size of the bacteria is comparable to the size of the cellular components of the blood.
  • microchannel-based separation techniques which are the different hydrodynamic ones
  • GB-2401942 A discloses a filter element for use in a
  • Detection assay in which specific binding molecules are immobilized on the surface of a porous membrane.
  • the desired target components are trapped using the binding molecules and thus fixed on the underside of the membrane.
  • Another possibility is the separation of specific sample components from a sample fluid with the help of functionalized beads of a few
  • Micrometer diameter For this purpose, for example, antibodies are immobilized on the bead surface. After addition of the beads to the sample fluid, they bind to the associated antigens and in this way collect the desired sample constituents, such as, for example, pathogenic cells. The separation of the beads including the pathogenic cells from the sample fluid is then carried out by filtration or, in the case of magnetic beads, by external magnetic fields.
  • the subject of the present invention is thus a microfluidic
  • Filter element for separating certain sample components from a biological sample fluid, comprising
  • filter molecules immobilized on the filter material for the particular sample components, wherein the filter material is interspersed with the capture molecules.
  • the specific capture molecules such as antibodies or enzymes, but also polynucleic acids, polymers, etc. are on the surface of the
  • Filter material immobilized so that the desired sample components are bound to the capture molecules when flowing through the sample liquid.
  • the deposition of the sought sample components is distributed over the entire filter material, since the filter material is interspersed with the capture molecules and thus faces the sought sample components an extremely high number of possible binding sites.
  • the filter element of the invention operates extremely efficient and highly specific.
  • the pores of the filter material are dimensioned so that components of the sample liquid, which do not interact with the catcher molecules, can pass the filter substantially. A mechanical filtration through the pure filter material therefore plays a minor role.
  • sample constituents is understood to mean all desired specific constituents of the biological sample fluid which can be purposefully separated with the aid of the microfluidic filter element. These are in particular both pathogenic and non-pathogenic cells or viruses and their constituents, such as, for example, endotoxins, nucleic acids, proteins or other cellular constituents.
  • the sample components can be separated very efficiently and highly specifically from a biological sample fluid.
  • Sample components and the remaining components of the sample be comparable. This is partly due to the fact that a mechanical filtration is completely dispensed with and thus the pores of the filter can be chosen to be relatively large, so that a much higher throughput is possible. In addition, due to the large pores, filtration of large quantities of sample fluid is possible without the filter tending to clog.
  • Microfluidic filter element according to the invention thus represents a clear further development of known microfluidic filter systems, since they were hitherto only suitable for low throughput quantities.
  • the use of beads can be dispensed with.
  • the use of immobilized capture molecules that permeates the entire filter material enables highly specific filtration compared to conventional filters or methods based on hydrodynamic effects. On a dilution of the sample fluid in advance of the filtration can be dispensed with.
  • the binding of the particular sample components to the capture molecules may be accomplished by suitable solutions, e.g. appropriate buffer solutions are repealed.
  • suitable solutions e.g. appropriate buffer solutions are repealed.
  • the filter element can be rinsed both with the original filter flow and in the opposite direction.
  • other buffer solutions that allow the specific binding of the desired
  • the term substrate is understood in the following to mean a carrier material in which the individual constituents of the microfluidic filter element are arranged.
  • the microfluidic filter element has at least one filter chamber arranged in the substrate, which forms a cavity in which the actual filter material is arranged. This filter material in turn is with the immobilized capture molecules to bind the desired
  • microfluidic filter element this is composed of a plurality of superimposed substrates in which at least one filter chamber and the channels for supplying the biological sample fluid and for deriving the remaining after the filtering process
  • Filter material in the filter chamber can be flowed transversely over a large area.
  • the multi-layer substrate structure is also advantageous in the production, since the individual chambers and channel components can be better matched by their arrangement in different layers.
  • the microfluidic filter element is constructed from a substrate having at least one filter chamber and channels for supplying the biological sample fluid and for deriving the remaining components of the biological sample fluid after the filtering process, and the filter material is flowed laterally.
  • the microfluidic filter element has at least one further channel, at least one valve and / or at least one collecting chamber for the remaining components of the biological sample fluid.
  • the further channels are used, for example, for rinsing with buffer solutions or for eluting the bound sample components.
  • the valves regulate the flow rates within the channels.
  • individual or all channels can be equipped separately with valves. Since the filter effect does not depend crucially on the flow rate, it is possible for generating the flow use cheap, integrated pumps, such as peristaltic pumps that produce, for example, no continuous flow. Alternatively, however, are also external, ie outside the
  • Microfluidic system mounted, pumps for controlling the flow rate possible. Furthermore, within the substrate one or more collection chambers for the remaining components of the biological
  • the microfluidic filter element has channels with a height and a width of in each case 5 ⁇ m to 5 mm, preferably 50 ⁇ m to 2 mm, and the filter element is altogether for receiving a biological sample fluid having a volume of 1 ⁇ m to 20 ml , preferably 10 ⁇ to 10 ml.
  • the capture molecules are selected from the group of proteins, preferably antibodies or enzymes, polynucleic acids, preferably DNA or RNA, and polymers.
  • proteins preferably antibodies or enzymes, polynucleic acids, preferably DNA or RNA, and polymers.
  • catcher molecules are possible.
  • the catcher molecules are, for example, by silanization,
  • APTES Aminopropyltriethoxysilane
  • the catcher molecules are in each case specific to the sought
  • Sample components are matched and enter into a reversible or irreversible binding with these.
  • a direct implementation of the sought sample components by the capture molecules is possible. This is the case, for example, when the capture molecule is an enzyme which filters a particular enzyme substrate from the sample fluid.
  • Immobilization of the catcher molecules is carried out according to common methods such as Example of silanization.
  • the filter material is complete with the
  • Filter material selected from the group of fibers, preferably silica fibers; Membranes, preferably capillary membranes of a polymer material or cellulose; Beds of particles, preferably of colloids, more preferably of silica, polymethyl methacrylate or melamine; and metal meshes, preferably transmission electron microscopy grids.
  • Filter material to be immobilized.
  • different methods are used depending on the filter material.
  • the surface available for the interaction must be as large as possible.
  • every material comes with controllable
  • beds of particles such as colloids for use in the filter element according to the invention are suitable.
  • the function of the colloids is to produce a filter with adjustable pore size.
  • the actual separation of the desired sample components continues to take place via the catcher molecules.
  • silica polymethyl methacrylate or melamine are used.
  • the filter material consists of metal nets or metal grids in the manner as they are for example for
  • TEM grids are commercially available and have defined hole sizes of approx.
  • the filter element several 100 ⁇ to about 10 ⁇ on.
  • the superimposition of several networks or grids is provided in a further embodiment of the filter element.
  • the particles and metal mesh are coated with gold or platinum.
  • the filter material has a thickness of 100 ⁇ to 10 mm, preferably 30 ⁇ to 7 mm, more preferably 50 ⁇ to 5 mm and a pore size of 0.5 to 1000 ⁇ , preferably 1 to 500 ⁇ , particularly preferably 5 to 300 ⁇ , on.
  • the minimum thickness of the filter material is dictated by the thickness of a single TEM grid.
  • the pores of the filter material are dimensioned so that components of the sample liquid that do not contain any of the sample components sought can pass the filter substantially. In the case of bacteria in whole blood, this results in e.g. a minimum pore size of several ⁇ . Larger pores reduce the fluid resistance. At the same time, however, the efficiency of the filter material is lowered. This results depending on the application
  • the size of the filter chamber is adjusted in advance to the desired filter material and its extent. However, the diameter of the filter chamber is generally between 1 and 30 mm.
  • the substrate consists of a polymer, preferably a polycarbonate,
  • the substrate has a thickness of 0.2 to 8 mm, preferably 0.5 to 3 mm and an outer dimension of 10 x 10 to 100 x 100 mm 2 . Again, the dimensions of the substrate must be adapted to use in a microfluidic system.
  • microfluidic filter element takes place in a lab-on-chip system or in a purification tube.
  • Sample volumes (microliters) facilitated.
  • the application not only relates to the field of classical microfluidics, but also to other applications in which such a purification is to be achieved, e.g. by means of purification tubes.
  • Such art-known kit systems based on purification tubes are often used in in vitro diagnostics.
  • Fig. 1 shows schematically the filter principle of the filter element according to the invention
  • Fig. 2 shows the filter element according to the invention in plan view
  • FIG. 3 shows the microfluidic filter element as a layer system comprising a plurality of substrates 1
  • Fig. 1 shows schematically the filter principle of the filter element according to the invention using the example of a fiber filter.
  • catcher molecules 13 are immobilized.
  • the particular sample components 14 are separated by binding from the sample fluid.
  • Other sample components 15 pass through the filter material 12 due to the large pores in the filter material 12 substantially unhindered.
  • the figure is based on the example of a 13-functionalized fiber filter. In doing so, a biological sample fluid, e.g. Blood, bacteria 14 filtered.
  • the filter material 12 can pass largely unhindered. However, the principle can be applied to a variety of applications.
  • Fig. 2 shows a simple realization of the filter element according to the invention.
  • the channels for supplying the biological sample fluid 2 and for deriving the remaining after the filtering process components of the biological sample fluid 3, more channels 4/5 for the supply and removal of the buffer solution, as well as in the channels 21 3, 4/5 placed valves 6 / II 8/9 arranged.
  • the substrate 1 has a filter chamber 1 1 with therein befindlichem filter material 12 and a collecting chamber 10. With closed valves 8/9 sample fluid is introduced via channel 2 into the filter chamber 1 1 and flows through the
  • Filter material 12 laterally. While the specific sample components 14 bind to the respective capture molecules 13, the remaining
  • Sample liquid from the filter material 12 to remove can with a appropriate buffer solution rinsed.
  • the valves 8/9 are opened and the valves 6/7 are closed so that the channels 4/5 are opened.
  • the other sample components 15 can now be removed.
  • the sought-after specific sample components 14 can be further
  • the concentrated sample components 14 may be placed directly on the filter material 12 for analysis and diagnostics, e.g. for a PCR analysis, continue to be used.
  • 3 shows the microfluidic filter element as a layer system comprising a plurality of substrates 1. With this construction, a transverse flow through the filter material 12 becomes possible.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden von Probenbestandteilen aus einem biologischen Probenfluid, das mindestens ein Substrat, diverse Kanäle, mindestens eine im Substrat angeordnete Filterkammer mit Filtermaterial, sowie am Filtermaterial immobilisierte Fängermoleküle aufweist, die das Filtermaterial durchsetzen.

Description

Beschreibung Titel
Mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden von Probenbestandteilen aus einem biologischen Probenfluid
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Filterelement zum
Abscheiden von Probenbestandteilen aus einem biologischen Probenfluid.
Zur Diagnose und Wahl der richtigen Therapie vieler Krankheiten ist der Nachweis bestimmter Probenbestandteile, z.B. pathogener Zellen, Bakterien, Viren, Endotoxinen oder anderer, den Nachweismethoden zugänglichen Molekülen, aus verschiedenen Probenflüssigkeiten wie zum Beispiel Blut, Urin oder Sputum unabdingbar. In der Vergangenheit wurden zum Nachweis von Zellen, z.B. von Bakterien, meistens mikrobiologische Verfahren eingesetzt. Bei diesen zellkulturbasierten Bestimmungen handelt es sich jedoch um sehr zeitaufwändige Verfahren, da die Anzucht der Kulturen und deren Auswertung zwei bis drei Tage benötigen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten ist es außerdem eine notwendige Voraussetzung, dass die zu detektierenden
Bestandteile des Probenfluids von diesem abgetrennt werden können. Die oftmals geringe Konzentration dieser Bestandteile stellt jedoch eine
Herausforderung bei der Isolierung dar.
Um die nachzuweisenden Bestandteile abzutrennen, werden im Stand der Technik eine Vielzahl von unterschiedlichen Filtern eingesetzt, die je nach Größe der abzutrennenden Bestandteile einerseits sowie der restlichen im Probenfluid befindlichen Bestandteile andererseits ausgewählt werden. Die Größe der zu detektierenden Bestandteile der Probe muss sich demnach ausreichend von den restlichen Bestandteilen der Probenflüssigkeit unterscheiden. Im Fall von Bakterien in Vollblut ist diese Voraussetzung nicht erfüllt, da die Größe der Bakterien mit der Größe der zellulären Bestandteile des Blutes vergleichbar ist. Eine Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems sind Mikrokanal-basierte Abtrennverfahren, welche die unterschiedlichen hydrodynamischen
Eigenschaften, beispielsweise von Erythrozyten und Bakterien, ausnutzen. Eine weitere bekannte Möglichkeit der Filtrierung bieten analytenspezifische Bindungsmoleküle, die an diversen Filtermaterialien immobilisiert vorliegen. Die GB-2401942 A offenbart ein Filterelement zur Verwendung in einem
Detektionsassay, bei dem an der Oberfläche einer porösen Membran spezifische Bindungsmoleküle immobilisiert sind. Die gewünschten Zielkomponenten werden mithilfe der Bindungsmoleküle abgefangen und so auf der Unterseite der Membran fixiert.
Eine weitere Möglichkeit ist die Abtrennung spezifischer Probenbestandteile aus einem Probenfluid mit Hilfe von funktionalisierten Beads von wenigen
Mikrometern Durchmesser. Hierzu werden beispielsweise Antikörper auf der Beadoberfläche immobilisiert. Nach Zugabe der Beads zum Probenfluid binden diese an den zugehörigen Antigenen und sammeln auf diese Weise die gewünschten Probenbestandteile, wie zum Beispiel pathogene Zellen, ein. Die Abtrennung der Beads inklusive der pathogenen Zellen aus dem Probenfluid erfolgt anschließend durch Filtrierung oder, im Falle von magnetischen Beads, durch äußere Magnetfelder.
Offenbarung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein mikrofluidisches
Filterelement zum Abscheiden bestimmter Probenbestandteile aus einem biologischen Probenfluid, aufweisend
mindestens ein Substrat,
mindestens eine im Substrat angeordnete Filterkammer,
mindestens einen im Substrat angeordneten Kanal zum Zuführen des biologischen Probenfluids und mindestens einen im Substrat
angeordneten Kanal zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids,
in der Filterkammer angeordnetes Filtermaterial und
am Filtermaterial immobilisierte Fängermoleküle für die bestimmten Probenbestandteile, wobei das Filtermaterial mit den Fängermolekülen durchsetzt ist. Die spezifischen Fängermoleküle wie zum Beispiel Antikörper oder Enzyme, aber auch Polynukleinsäuren, Polymere, etc. sind auf der Oberfläche des
Filtermaterials immobilisiert, so dass beim Durchfließen der Probenflüssigkeit die gesuchten Probenbestandteile an die Fängermoleküle gebunden werden. Dabei erfolgt das Abscheiden der gesuchten Probenbestandteile verteilt über das gesamte Filtermaterial, da das Filtermaterial mit den Fängermolekülen durchsetzt ist und somit den gesuchten Probenbestandteilen eine extrem hohe Zahl an möglichen Bindungsstellen gegenübersteht. Aufgrund dieser Eigenschaft arbeitet das erfindungsgemäße Filterelement extrem effizient und hochspezifisch. Die Poren des Filtermaterials sind dabei so dimensioniert, dass Bestandteile der Probenflüssigkeit, die nicht mit den Fängermolekülen wechselwirken, den Filter im Wesentlichen passieren können. Eine mechanische Filtrierung durch das reine Filtermaterial spielt demnach eine untergeordnete Rolle.
Unter dem Begriff der bestimmten Probenbestandteile werden alle gewünschten spezifischen Bestandteile des biologischen Probenfluids verstanden, die mithilfe des mikrofluidischen Filterelements gezielt separiert werden können. Dies sind insbesondere sowohl pathogene als auch nicht-pathogene Zellen oder Viren sowie deren Bestandteile wie zum Beispiel Endotoxine, Nukleinsäuren, Proteine oder weitere zelluläre Einzelbestandteile.
Mit dem erfindungsgemäßen mikrofluidischen Filterelement lassen sich die Probenbestandteile aus einem biologischen Probenfluid sehr effizient und hochspezifisch separieren. Dabei können die Größe der zu filtrierenden
Probenbestandteile und der restlichen Bestandteile der Probe vergleichbar sein. Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass auf eine mechanische Filtrierung komplett verzichtet wird und somit die Poren des Filters relativ groß gewählt werden können, so dass ein sehr viel höherer Durchsatz möglich ist. Außerdem ist aufgrund der großen Poren eine Filtrierung großer Mengen an Probenfluid möglich, ohne dass der Filter zum Verstopfen neigt. Das
erfindungsgemäße mikrofluidische Filterelement stellt somit eine deutliche Weiterentwicklung bekannter mikrofluidischer Filtersysteme dar, da diese bisher nur für geringe Durchsatzmengen geeignet waren. Ebenso kann auf den Einsatz von Beads verzichtet werden. Durch den Einsatz der immobilisierten Fängermoleküle, die das gesamte Filtermaterial durchsetzen, ist eine hochspezifische Filtrierung im Vergleich zu herkömmlichen Filtern oder Methoden, die auf hydrodynamischen Effekten beruhen, möglich. Auf eine Verdünnung des Probenfluids im Vorfeld der Filtrierung kann dabei verzichtet werden.
Der Verzicht auf Beads spart außerdem weitere Verfahrensschritte zum Mischen bzw. Trennen der Beads mit dem bzw. vom Probenfluid und dem damit verbundenen zusätzlichen Einsatz von Filtern bzw. externer Magnetfelder ein. Hierdurch entstehen enorme Kosteneinsparungen im Vergleich zu
herkömmlichen Systemen zur Handhabung von Beads.
Die Bindung der bestimmten Probenbestandteile an die Fängermoleküle kann durch geeignete Lösungen, z.B. geeignete Pufferlösungen, aufgehoben werden. Dabei lässt sich das Filterelement sowohl mit dem ursprünglichen Filterfluss als auch in entgegengesetzter Richtung ausspülen. Im Gegensatz dazu können andere Pufferlösungen, die die spezifische Bindung der gewünschten
Probenbestandteile an die Fängermoleküle nicht beeinflussen, über den Filter gespült werden, ohne die gewünschten Probenbestandteile auszuspülen.
Hierdurch kann eine weitere Aufreinigung der Probenbestandteile erreicht werden.
Unter dem Begriff Substrat wird im Folgenden ein Trägermaterial verstanden, in dem die einzelnen Bestandteile des mikrofluidischen Filterelements angeordnet sind. Das mikrofluidische Filterelement weist mindestens eine im Substrat angeordnete Filterkammer, die einen Hohlraum bildet, in dem das eigentliche Filtermaterial angeordnet ist, auf. Dieses Filtermaterial wiederum ist mit den immobilisierten Fängermolekülen zur Bindung der gewünschten
Probenbestandteile durchsetzt. Zur Filterkammer führt mindestens ein innerhalb des Substrats angeordneter Kanal zum Zuführen des biologischen Probenfluids und mindestens ein Kanal zum Ableiten der nach dem Filtervorgang
verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids. In einer Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements ist dieses aus mehreren übereinander geschichteten Substraten aufgebaut, in denen mindestens eine Filterkammer und die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluids und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen
Bestandteile des biologischen Probenfluids zumindest teilweise in
unterschiedlichen Substratschichten angeordnet sind und das Filtermaterial transversal angeströmt wird.
Durch den Aufbau aus mehreren Substratschichten wird ein transversales Anströmen erst möglich, da die Kanäle zum Zuführen des biologischen
Probenfluids und zum Ableiten der verbliebenen Bestandteile des Probenfluids auf unterschiedlichen Ebenen liegen, so dass das dazwischenliegende
Filtermaterial in der Filterkammer großflächig transversal angeströmt werden kann. Der mehrschichtige Substrataufbau ist außerdem in der Herstellung von Vorteil, da die einzelnen Kammern und Kanalkomponenten durch ihre Anordnung in unterschiedlichen Schichten besser aufeinander abgestimmt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform ist das mikrofluidische Filterelement aus einem Substrat mit mindestens einer Filterkammer und Kanälen zum Zuführen des biologischen Probenfluids und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids aufgebaut und wird das Filtermaterial lateral angeströmt. Diese vereinfachte Ausführungsform erlaubt das Arbeiten in einer Ebene, was für verschiedene Anwendungen im mikrofluidischen Bereich von Vorteil sein kann.
In einer weiteren Ausführungsform weist das mikrofluidische Filterelement mindestens einen weiteren Kanal, mindestens ein Ventil und/oder mindestens eine Auffangkammer für die verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids auf.
Wie bereits oben erwähnt, werden die weiteren Kanäle zum Beispiel zum Spülen mit Pufferlösungen oder zum Eluieren der gebundenen Probenbestandteile verwendet. Die Ventile regulieren die Flussraten innerhalb der Kanäle. Dazu können einzelne oder aber alle Kanäle separat mit Ventilen ausgestattet sein. Da die Filterwirkung nicht entscheidend von der Flussrate abhängt, ist es möglich, zur Erzeugung des Flusses günstige, integrierte Pumpen einzusetzen, z.B. peristaltische Pumpen, die beispielsweise keinen kontinuierlichen Fluss erzeugen. Alternativ sind jedoch auch extern, d.h. außerhalb des
mikrofluidischen Systems angebrachte, Pumpen zur Steuerung der Flussrate möglich. Des Weiteren können innerhalb des Substrats eine oder mehrere Auffangkammern für die verbleibenden Bestandteile des biologischen
Probenfluids angeordnet sein. Darüber hinaus sind auch Auffangkammern für die Pufferlösungen oder die bereits eluierten spezifischen Probenbestandteile denkbar.
In einer der Ausführungsformen weist das mikrofluidische Filterelement Kanäle mit einer Höhe und einer Breite von jeweils 5 μηη bis 5 mm, vorzugsweise 50 μηη bis 2 mm, auf und das Filterelement ist insgesamt zur Aufnahme eines biologischen Probenfluids mit einem Volumen von 1 μΙ bis 20 ml, vorzugsweise 10 μΙ bis 10 ml, ausgelegt.
Generell sind die Abmessungen jedoch leicht dem zu untersuchenden
Probenfluid und den darin enthaltenen Bestandteilen anzupassen.
In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements sind die Fängermoleküle ausgewählt aus der Gruppe von Proteinen, vorzugsweise Antikörpern oder Enzymen, Polynukleinsäuren, vorzugsweise DNA oder RNA, und Polymeren. Es sind jedoch auch andere Fängermoleküle möglich. Die Fängermoleküle sind beispielsweise durch Silanisierung,
Aminopropyltriethoxysilan (APTES), kovalente Bindungen mittels einer
EDC/NHS-Chemie oder Protein A immobilisiert.
Die Fängermoleküle sind in jedem Fall spezifisch auf die gesuchten
Probenbestandteile abgestimmt und gehen mit diesen eine reversible oder auch irreversible Bindung ein. Darüber hinaus ist auch eine direkte Umsetzung der gesuchten Probenbestandteile durch die Fängermoleküle möglich. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn es sich bei dem Fängermolekül um ein Enzym handelt, das ein bestimmtes Enzymsubstrat aus dem Probenfluid filtriert. Die
Immobilisierung der Fängermoleküle erfolgt nach gängigen Methoden wie zum Beispiel der Silanisierung. Dabei ist das Filtermaterial komplett mit den
Fängermolekülen durchsetzt ist.
In einer Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements ist das
Filtermaterial ausgewählt aus der Gruppe von Fasern, vorzugsweise Silicafasern; Membranen, vorzugsweise Kapillarmembranen aus einem Polymermaterial oder Cellulose; Schüttungen aus Partikeln, vorzugsweise aus Kolloiden, besonders bevorzugt aus Silica, Polymethylmethacrylat oder Melamin; und Metallgittern, vorzugsweise Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern.
Wie bereits dargestellt müssen zur Separation der gewünschten
Probenbestandteile aus dem Probenfluid spezifische Fängermoleküle im
Filtermaterial immobilisiert werden. Hierzu kommen, je nach Filtermaterial, unterschiedliche Verfahren zum Einsatz. Im Sinne einer hohen Effizienz des Filters muss die für die Wechselwirkung zur Verfügung stehende Oberfläche möglichst groß sein. Als Filter kommt jedes Material mit kontrollierbaren
Porengrößen in Frage. Hierzu eignen sich insbesondere Faserfilter,
vorzugsweise auf Silicabasis, oder Membranfilter, die sowohl als
Porenmembranfilter oder aber als Kapillarmembranfilter aus Polymermaterial oder Cellulose hergestellt sein können. Neben den klassischen Filtermaterialien eignen sich jedoch auch Schüttungen aus Partikeln wie zum Beispiel Kolloide für die Anwendung in dem erfindungsgemäßen Filterelement. Die Funktion der Kolloide besteht dabei darin, einen Filter mit einstellbarer Porengröße zu erzeugen. Die eigentliche Separation der gewünschten Probenbestandteile erfolgt aber weiterhin über die Fängermoleküle. Als bevorzugte Materialien werden hier Silica, Polymethylmethacrylat oder Melamin eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Filtermaterial aus Metall- Netzen oder Metall-Gittern in der Art, wie sie beispielsweise für die
Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt werden. Die sogenannten TEM- Grids sind kommerziell erhältlich und weisen definierte Lochgrößen von ca.
mehreren 100 μηη bis ca. 10 μηη auf. Auch das Übereinanderlegen mehrerer Netze oder Gitter ist in einer weiteren Ausführungsform des Filterelements vorgesehen. In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements sind die Partikel und Metallgitter mit Gold oder Platin beschichtet. Dadurch kann die Funktionalität des Filtermaterials erhöht und eine Kopplung von Fängermolekülen vereinfacht werden.
In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements weist das Filtermaterial eine Dicke von 100 μηη bis 10 mm, vorzugsweise 30 μηη bis 7 mm, besonders bevorzugt 50 μηη bis 5 mm und eine Porengröße von 0,5 bis 1000 μηη, vorzugsweise 1 bis 500 μηι, besonders bevorzugt 5 bis 300 μηι, auf.
Im Falle der erwähnten TEM-Grids wird die minimale Dicke des Filtermaterials durch die Dicke eines einzelnen TEM-Grid vorgegeben.
Die Poren des Filtermaterials sind so dimensioniert, dass Bestandteile der Probenflüssigkeit, die keine der gesuchten Probenbestandteile enthalten, den Filter im Wesentlichen passieren können. Im Falle von Bakterien in Vollblut ergibt sich damit z.B. eine minimale Porengröße von mehreren μηη. Größere Poren verringern den fluiden Widerstand. Gleichzeitig wird damit jedoch die Effizienz des Filtermaterials gesenkt. Daraus ergeben sich je nach Anwendung
Porengrößen bis zu mehreren 100 μηη. Die Größe der Filterkammer wird im Vorfeld dem gewünschten Filtermaterial und dessen Ausmaß angepasst. Der Durchmesser der Filterkammer liegt jedoch im Allgemeinen zwischen 1 und 30 mm.
In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements besteht das Substrat aus einem Polymer, vorzugsweise einem Polykarbonat,
Polypropylen, Cycloolefin-Copolymer, Copolymer oder Polymethylmethacrylat; einem Glas oder einem Silizium enthaltenden Material.
In Prinzip sind jedoch alle Materialien, die sich durch Extrudieren, Tiefziehen oder Prägen im Mikromaßstab formen lassen, geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements weist das Substrat eine Dicke von 0,2 bis 8 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3 mm und ein Außenmaß von 10 x 10 bis 100 x 100 mm2 auf. Auch hier gilt, dass das Substrat in seinen Abmessungen dem Einsatz in einem mikrofluidischen System angepasst sein muss.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung erfolgt die Verwendung des zuvor beschriebenen mikrofluidischen Filterelements in einem Lab-on-Chip-System oder in einem Aufreinigungsröhrchen.
Mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Filterelements wird somit der Übergang vom Bereich großer Probenvolumina (Milliliter) in den Bereich kleiner
Probenvolumina (Mikroliter) erleichtert. Dabei bezieht sich die Anwendung nicht nur auf den Bereich der klassischen Mikrofluidik, sondern auch auf andere Anwendungen, bei denen eine derartige Aufreinigung erreicht werden soll, z.B. mittels Aufreinigungsröhrchen. Solche aus dem Stand der Technik bekannten Kit-Systeme, die auf Aufreinigungsröhrchen basieren, werden häufig in der In- vitro-Diagnostik eingesetzt.
Zeichnungen
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Filterelements werden durch die Abbildungen veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Abbildungen nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. In den Abbildungen werden folgende Bezugszeichen verwendet:
Substrat 1
Kanal zum Zuführen 2
des biologischen Probenfluids
Kanal zum Ableiten nach dem Filtervorgang 3
verbliebener Bestandteile des biologischen Probenfluids
weitere Kanäle 4,5
Ventile 6, 7, 8, 9
Auffangkammer 10
Filterkammer 1 1
Filtermaterial 12
Fängermoleküle 13 spezifische Probenbestandteile 14 sonstige Probenbestandteile 15
Fig. 1 zeigt schematisch das Filterprinzip des erfindungsgemäßen Filterelements
Fig. 2 zeigt das erfindungsgemäße Filterelement in Draufsicht
Fig. 3 zeigt das mikrofluidische Filterelement als ein Schichtsystem aus mehreren Substraten 1
Fig. 1 zeigt schematisch das Filterprinzip des erfindungsgemäßen Filterelements am Beispiel eines Faserfilters. Am Filtermaterial 12 sind Fängermoleküle 13 immobilisiert. An diesen immobilisierten Fängermolekülen 13 werden die bestimmten Probenbestandteile 14 durch Bindung aus dem Probenfluid separiert. Sonstige Probenbestandteile 15 passieren das Filtermaterial 12 aufgrund der großen Poren im Filtermaterial 12 im Wesentlichen ungehindert. Die Abbildung ist an das Beispiel eines mit Antikörpern 13 funktionalisierten Faserfilters angelehnt. Dabei werden aus einem biologischen Probenfluid, z.B. Blut, Bakterien 14 filtriert. Die sonstigen Probenbestandteile 15, z.B.
Erythrozyten, können das Filtermaterial 12 weitestgehend ungehindert passieren. Das Prinzip lässt sich jedoch auf eine Vielzahl von Anwendungen übertragen.
Fig. 2 zeigt eine einfache Realisierung des erfindungsgemäßen Filterelements. Ausgehend von einem Polymersubstrat 1 werden in diesem Substrat 1 die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluid 2 und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids 3, weitere Kanäle 4/ 5 für das Zu- und Abführen der Pufferlösung, sowie in den Kanäle 21 3, 4/ 5 platzierte Ventile 6/ II 8/ 9 angeordnet. Außerdem weist das Substrat 1 eine Filterkammer 1 1 mit darin befindlichem Filtermaterial 12 sowie eine Auffangkammer 10 auf. Bei geschlossenen Ventilen 8/ 9 wird Probenfluid über Kanal 2 in die Filterkammer 1 1 eingebracht und durchströmt das
Filtermaterial 12 lateral. Während die spezifischen Probenbestandteile 14 an den entsprechenden Fängermolekülen 13 binden, werden die restlichen
Probenbestandteile 15 der Probenflüssigkeit über den Kanal 3 in die
Auffangkammer 10 geleitet. Um alle restlichen Bestandteile 15 der
Probenflüssigkeit aus dem Filtermaterial 12 zu entfernen, kann mit einer entsprechenden Pufferlösung nachgespült werden. Dazu werden die Ventile 8/ 9 geöffnet und die Ventile 6/ 7 geschlossen, so dass die Kanäle 4/ 5 geöffnet werden. Durch Spülen mit der Pufferlösung durch die Kanäle 4/ 5 können nun die sonstigen Probenbestandteile 15 entfernt werden. Auf gleichem Wege lassen sich auch die gesuchten spezifischen Probenbestandteile 14 zur weiteren
Verarbeitung aus dem Filtermaterial 12 eluieren. Alternativ können die konzentrierten Probenbestandteile 14 direkt auf dem Filtermaterial 12 zur Analyse und Diagnostik, z.B. für eine PCR-Analyse, weiterverwendet werden. Fig. 3 zeigt das mikrofluidische Filterelement als ein Schichtsystem aus mehreren Substraten 1. Mit diesem Aufbau wird ein transversales Durchströmen des Filtermaterials 12 möglich.

Claims

Ansprüche
1 . Mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden bestimmter
Probenbestandteile (14) aus einem biologischen Probenfluid, aufweisend mindestens ein Substrat (1 ),
mindestens eine im Substrat (1 ) angeordnete Filterkammer (1 1 ), mindestens einen im Substrat (1 ) angeordneten Kanal (2) zum Zuführen des biologischen Probenfluids und mindestens einen im Substrat (1 ) angeordneten Kanal (3) zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids,
in der Filterkammer (1 1 ) angeordnetes Filtermaterial (12) und
am Filtermaterial (12) immobilisierte Fängermoleküle (13) für bestimmte Probenbestandteile (14), wobei das Filtermaterial (12) mit den
Fängermolekülen (13) durchsetzt ist.
2. Mikrofluidisches Filterelement nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Filterelement aus mehreren übereinander geschichteten
Substraten (1 ) aufgebaut ist, die mindestens eine Filterkammer (1 1 ) und die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluids (2) und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids (3) zumindest teilweise in unterschiedlichen Substratschichten angeordnet sind und das Filtermaterial (12) transversal angeströmt wird.
3. Mikrofluidisches Filterelement nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass das Filterelement aus dem Substrat (1 ) mit der mindestens einer Filterkammer (1 1 ) und den Kanälen zum Zuführen des biologischen Probenfluid (2) und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluid (3) aufgebaut ist und das Filtermaterial (12) lateral angeströmt wird.
4. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filterelement mindestens einen weiteren Kanal (4, 5), mindestens ein Ventil (6, 7, 8, 9) und/ oder mindestens eine Auffangkammer (10) für die verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids aufweist.
5. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanäle (2,3,4,5) eine Höhe und eine Breite von jeweils 5 μηη bis 5 mm, vorzugsweise 50 μηη bis 2 mm, aufweisen und das Filterelement insgesamt zur Aufnahme eines biologischen
Probenfluids mit einem Volumen von 1 μΙ bis 20 ml, vorzugsweise 10 μΙ bis
10 ml, ausgelegt ist.
6. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe von Antikörpern, Enzymen, Polynukleinsäuren und Polymeren.
7. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtermaterial (12) ausgewählt ist aus der Gruppe von Fasern, vorzugsweise Silicafasern; Membranen, vorzugsweise Kapillarmembranen aus einem Polymermaterial oder Cellulose; Schüttungen aus Partikeln, vorzugsweise aus Kolloiden, besonders bevorzugt aus Silica, Polymethylmethacrylat oder Melamin; und Metallgittern, vorzugsweise Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern.
8. Mikrofluidisches Filterelement nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel und Metallgitter mit Gold oder Platin beschichtet sind.
9. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtermaterial (12) eine Dicke von 100 μηη bis 10 mm, vorzugsweise 30 μηη bis 7 mm, besonders bevorzugt 50 μηη bis 5 mm, und eine Porengröße von 0,5 bis 1000 μηη, vorzugsweise 1 bis 500 μηη, besonders bevorzugt 5 bis 300 μηη, aufweist.
10. Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (1 ) aus einem
Kunststoffpolymer, vorzugsweise einem Polycarbonat, Polypropylen, Cycloolefin-Copolymer, Copolymer oder Polymethylmethacrylat; einem Glas oder einem Silizium enthaltendem Material besteht.
1 1 . Mikrofluidisches Filterelement nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (1 ) eine Dicke von 0,2 bis 8 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3 mm und ein Außenmaß von 10 x 10 bis 100 x 100 mm2 aufweist.
12. Verwendung eines mikrofluidischen Filterelements nach einem der
Ansprüche 1 bis 1 1 in einem mikrofluidischen Lab-on-Chip-System oder einem Aufreinigungsröhrchen.
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