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WO2013069749A1 - 生物由来の生理活性物質の測定方法 - Google Patents

生物由来の生理活性物質の測定方法 Download PDF

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WO2013069749A1
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Kowa Co Ltd
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    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate

Definitions

  • the above beads can adsorb, carry or bind a protein (eg, coagulogen) in AL, can be uniformly dispersed in the reaction system, and hinder or enhance the gel formation process by a predetermined physiologically active substance.
  • the one that does not do is selected.
  • the material of the beads is not particularly limited.
  • alumina, titania, polystyrene latex resin, silica, silicon resin, cellulose resin, polyvinyl alcohol resin And hydroxyapatite and examples thereof include alumina, titania, polystyrene latex resin, silica, and cellulose resin.
  • an adsorbing material that adsorbs a predetermined physiologically active substance an organic compound with high selectivity that has an excellent ability to adsorb a predetermined physiologically active substance such as endotoxin, or a predetermined physiologically active substance such as endotoxin that is not highly selective. Any inorganic substance having excellent adsorption ability may be used.
  • the predetermined fluorescent dye is not particularly limited, but examples of the fluorescent dye include those of fluoresceins, rhodamines, coumarins, pyrenes, and cyanines as in the case of using an AL-bound bead reagent. These fluorescent dyes can be used as appropriate.
  • the above-described inorganic fluorescent dye group can be used as fine particles that emit fluorescence in addition to a method of binding onto a substance involved in aggregation or gelation. Therefore, by forming the fine particles by the inorganic fluorescent dye group, the fine particles can be given a function of generating predetermined fluorescence.
  • RITC was adsorbed on alumina beads, but a fluorescent dye (RITC or FITC) was previously bound to aminosilane (isothiocyanate group and aminosilane amino group were bound), and then A method of fixing a silane bonded to a fluorescent dye to a bead may be used by utilizing the coupling action of silane.

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Abstract

　生物由来の生理活性物質の測定方法において、より精度良く、前記生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定が可能であり、また、ＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化の過程を視覚的に観察可能とする技術を提供する。ＡＬ試薬と所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、この混和液を攪拌しながら混和液中の蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、試料中の生理活性物質の検出または濃度測定を行う、生物由来の生理活性物質の測定方法についてのものである。測定対象試料および／またはＡＬ試薬の中において凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光を発生する機能を付与し、混和液における前記凝集またはゲル化に関わる物質からの蛍光を測定または観察して混和液における凝集またはゲル化を検出する。

Description

生物由来の生理活性物質の測定方法
　本発明は、エンドトキシンやβグルカンなど、ＡＬとの反応によって凝集またはゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法に関する。
　エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。一方で、敗血症患者血液中のエンドトキシンを測定することにより、重篤なエンドトキシンショックの予防や治療に寄与することもある。
　また、βグルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。βグルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲における真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
　ところで、カブトガニの血球抽出物（以下、「ＡＬ :Amoebocyte lysate」ともいう。）の中には、エンドトキシンやβグルカンなどによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンやβグルカンとが反応する際には、それらの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＡＬの特性を用いて、エンドトキシンやβグルカンを高感度に検出することが可能である。近年、このことを利用して、エンドトキシンなどの検出または濃度測定にＡＬを用いる方法が考案されている。
　このエンドトキシンやβグルカンなどの、ＡＬによって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、「所定生理活性物質」ともいう。）の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）を行う方法としては、以下のものが知られている。例えば、所定生理活性物質がＡＬに作用して試料が濁る反応を測定する比濁法、所定生理活性物質が作用して活性化したＡＬ中の酵素により添加した合成基質が分解して発色する反応を測定する比色法などである。しかしながら、低濃度の所定生理活性物質が作用した際のＡＬ自体の濁りや合成基質による発色はきわめて微弱であるので、これらの測定法における生理活性物質の測定下限は必ずしも充分に低いとは言えなかった。
　一方、透析液の中には測定感度が従来の比濁法や比色法では不足してしまう事例が発生している。そのため、更なる高感度化を図った測定法の確立が急務となっている。高感度化を図った測定法としては、比濁法を発展させて試料を攪拌する方法（攪拌比濁法）、攪拌した試料中に形成されるゲル微粒子を光散乱法によって検出する方法（光散乱法）、ＡＬを微粒子上に結合させて凝集反応を増強した方法（ＡＬ結合ビーズ法）などが報告されている。
　しかしながら、上記の所定生理活性物質の測定方法においては、光源としてレーザー光源やＬＥＤ光源を用いて明室中で測定するために、周囲光の影響により測定精度が低下する場合があった。また、試料中の所定生理活性物質とＡＬ試薬中のＡＬとの反応に基づく凝集、ゲル化の過程を視覚的に観察することは困難であった。
特開２００９－１５０７２３号公報 国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
　本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含むＡＬ試薬と所定生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと所定生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の所定生理活性物質を検出しまたは所定生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法において、より精度良く、所定生理活性物質の検出または濃度の測定が可能であり、また、ＡＬと所定生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化の過程を視覚的に観察可能とする技術を提供することである。
　上記課題を解決するための本発明は、所定生理活性物質を含む試料とＡＬ試薬との混和液を生成し、この混和液を攪拌しながら該混和液中の蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、試料中の生理活性物質の検出または濃度測定を行う、生物由来の生理活性物質の測定方法についてのものである。そして、測定対象試料および／またはＡＬ試薬の中における前記凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光を発生する機能を付与し、前記混和液における前記凝集またはゲル化に関わる物質の蛍光を測定または観察して前記混和液における前記凝集またはゲル化を検出することを最大の特徴とする。
　より詳細には、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含むＡＬ試薬と所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
　前記試料および／または前記ＡＬ試薬の中において前記凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光を発生する機能を付与し、色素を結合させ、
　前記混和液における前記凝集またはゲル化に関わる物質からの蛍光を測定または観察して前記混和液における前記凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする。
　すなわち、本発明においては、所定生理活性物質を含む試料および／またはＡＬ試薬の中において蛋白質の凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光を発生させる機能を付与しておく。そうすると、蛋白質の凝集またはゲル化が生じた際には、蛋白質の凝集またはゲル化に関わる物質からの蛍光の状態を観察することで、凝集またはゲル化のメカニズムを視覚的に観察することが可能である。また、凝集またはゲル化が生じた部分においては蛍光強度が増加するので、蛍光強度を測定することで蛋白質の凝集またはゲル化を検出することが可能となる。
　なお、蛍光色素は、蛍光色素同士がより近付いた場合に、蛍光色素間で互いにエネルギーのやりとりが生じ、蛍光の照射量が増加する傾向がある。よって、本発明においては、凝集またはゲル化により蛍光色素同士が近づいた際には、その部分からの蛍光強度が増加することとなり、より高感度に、ＡＬと所定生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することが可能となる。また、蛍光または蛍光強度を測定する際には、通常、周囲を暗闇にする。従って、本発明においては、バックグラウンドノイズを低減することができ、より高精度に、ＡＬと所定生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することが可能となる。
　なお、本発明において、試料および／またはＡＬ試薬の中において凝集またはゲル化に関わる物質とは、コアギュロゲンなどＡＬに含まれる蛋白質の他、ＡＬ結合ビーズ法におけるビーズや、エンドトキシンを吸着した微粒子を含む。
　また、本発明においては、前記ＡＬに含まれる所定の蛋白質を、前記ＡＬ試薬中に分散可能なビーズに結合させ、
　前記蛋白質が結合した前記ビーズが分散した前記ＡＬ試薬であるＡＬ結合ビーズ試薬と前記試料とを混和させ、
　ＡＬ結合ビーズ試薬と前記試料との混和液における蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで前記生理活性物質の検出または濃度の測定を行う、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
　前記ビーズに所定の蛍光色素を予め結合させ、あるいは、前記ビーズを所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記ビーズに所定の蛍光を発生する機能を付与するようにしてもよい。
　ここで、ＡＬ中に含まれる蛋白質をビーズの上に結合させた状態で所定生理活性物質を作用させると、ＡＬ単体に所定生理活性物質を作用させた場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成することが分かっている。これは、ビーズ上の蛋白質（例えばコアギュロゲン）がＡＬ中の酵素カスケードにより水解されコアギュリンとなり、これらが自ら凝集、ゲル化するとともにビーズ同士を会合させることによる。
　本発明においては、このビーズに蛍光色素を予め結合させ、あるいは、前記ビーズを所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記ビーズに所定の蛍光を発生する機能を付与するようにしてもよい。これによれば、ＡＬ単体および／または所定生理活性物質に所定の蛍光を発生する機能を付与し両者を混和した場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成させることができ、この凝集塊の生成を蛍光で検出または観察することが可能となる。なお、ビーズが多孔質の場合や、ナノ１次粒子が会合して大きな２次粒子になっている場合は、蛍光色素と結合させた際に、表面だけではなく粒子の内部も蛍光標識される。従って、本発明においてビーズに蛍光色素を結合させるとは、ビーズの表面に蛍光色素を結合させる場合と、ビーズの内部に蛍光色素を結合させる場合とを含む。
　また、本発明においては、所定の蛍光色素は、特に限定されないが、従来より生体分子の染色に使用されている蛍光色素として、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類のものを挙げることができ、これらの蛍光色素を適宜用いることができる。
　また、4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）、ウンベリフェロン、9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、2-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、サイバーグリーン (SG、SYBR Green)、臭化エチジウム、スチルベン (stilbene)、ナイルブルー（Nile blue、Nile blue A）、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナフタセン(5,12-Bis(phenylethynyl)naphthacene)、ピラニン(Pyranine)、ペリレン (perylene)、ボディピー（boron-dipyrromethene）、メロシアニン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein,GFP）、ルシフェリン (luciferin)、ルブレン、ルマジンタンパク質 (Lumazine protein、LumP)などを用いてもよい。また、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、有機色素分子をシリカ（二酸化ケイ素）粒子内部に固定化した蛍光色素であるＱＵＡＲＴＺ ＤＯＴ（登録商標）等を用いてもよい。
　また、例えば無機蛍光色素としては、ZnS：Ag、(ZnCd)S：Cu、(ZnCd)S：Ag、Zn2SiO4：Mn、Cd2B2O5：Mn、(SrMg)3(PO4)2：Mn、YVO3：En、CaWO4、Y2O2：Eu、Y2O2：Mg、Y2O2：Ti、ZnS：Ag、ZnS：Al、ZnS：Cu、ZnS：Al、Y2O2S：Eu、(SrCaBaMg)5(PO4)3Cl：Eu、LaPO4：Ce、LaPO4：Tb、Y2O3：Eu、Ca10(PO4)6FCl:Sb、Ca10(PO4)6FCl:Mn、BaMgAl10O17:Eu、Zn2SiO4：Mn、YBO3：Eu、GdBO3：Eu、CaWO4、Gd2O2S:Tb、YTaO4：Nb、SrTaO4：Nb、Y202：Eu、Y202：Mg、Y202：Tiなどを挙げることができる（ここに列挙した無機蛍光色素を以下、無機蛍光色素群ともいう）。なお、上記の無機蛍光色素群は、凝集またはゲル化に関わる物質の上に結合させる使用法の他、蛍光を発するビーズそのものとして使用することも可能である。従って、上記の無機蛍光色素群によって前記ビーズを形成することにより、ビーズに所定の蛍光を発生する機能を付与することができる。
　また、上記において所定の蛋白質は、エンドトキシンなどの所定生理活性物質と反応して凝集しまたはゲル化する特性を有するものであり、少なくともコアギュロゲンを含む。また、セリンプロテアーゼ等の他の蛋白質を含んでいてもよい。また、本発明においてゲル化（ゲルの生成）とは、上記のビーズ同士の会合による凝集塊の生成、ビーズに結合または吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の生成、ＡＬ試薬と試料との混和液のゲル化、の少なくともいずれかを含んだ現象を意味している。
　また、上記のビーズとしては、ＡＬ中の蛋白質（例えばコアギュロゲン）を吸着、担持あるいは結合でき、反応系内に均一に分散可能であり、且つ、所定生理活性物質によるゲル生成過程を妨げたり亢進したりしないものが選定される。ビーズの素材は特に限定されるものではないが、上記の無機蛍光色素群の他、蛍光色素を結合させる場合には、アルミナ、チタニア、ポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、シリコン樹脂、セルロース樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ハイドロキシアパタイトなどが例示でき、アルミナ、チタニア、ポリスチレンラテックス樹脂、シリカ、セルロース樹脂を例示できる。
　ビーズの大きさは、凝集により早期に検出または観察可能となる条件と、調製時のハンドリングの容易さ、系内への分散のし易さなどから、０．０５μｍから５０μｍの範囲であるものが用いられる。そして、０．１μｍから３０μｍの範囲であることがさらに望ましい。ビーズに所定生理活性物質を結合させるには、静電的、親水的、あるいは、疎水的に所定生理活性物質を吸着させる方法と、化学的に結合させる方法とが考えられる。
　また、本発明においては、前記混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因して凝集またはゲル化する蛋白質に、所定の蛍光色素を結合させることにより、該蛋白質に所定の蛍光を発生する機能を付与するようにしてもよい。すなわち、上記のＡＬ結合ビーズ試薬を用いた測定において、所定の蛍光色素をビーズに結合する代わりに、あるいは、所定の蛍光色素をビーズに結合することに加えて、混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因して凝集またはゲル化する蛋白質に、所定の蛍光色素を結合させることで、凝集またはゲル化のメカニズムを、より詳細に蛍光分布や蛍光量に反映させることができる。
　その結果、より精度良く、所定生理活性物質の測定をすることが可能となり、より詳細に、凝集またはゲル化のメカニズムを視覚的に観察することが可能となる。また、ＡＬ結合ビーズ試薬を用いずに、ＡＬ試薬と所定生理活性物質を含む試料とを混和させて所定生理活性物質の測定を行う場合にも、ＡＬと前記生理活性物質との反応に起因して凝集またはゲル化する蛋白質に所定の蛍光色素を結合することで、より精度良く、所定生理活性物質の測定をすることが可能となり、より詳細に、凝集またはゲル化のメカニズムを視覚的に観察することが可能となる。　
　なお、前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。そうすれば、所定生理活性物質とＡＬとの反応によって凝固酵素が生成され、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成し、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化するという過程を、より詳細に観察することが可能となり、上記過程における所定生理活性物質の測定をより精度よく行うことが可能となる。
　また、本発明においては、前記生理活性物質を吸着可能な微粒子を前記試料中に分散させることで前記生理活性物質を前記微粒子に吸着させた後に前記試料から前記微粒子を分離し、
　前記ＡＬ試薬と前記生理活性物質が吸着された前記微粒子との混和液を生成し、
　前記ＡＬ試薬と前記微粒子との混和液における前記微粒子の凝集またはゲル化を検出する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
　前記微粒子に所定の蛍光色素を予め結合させ、あるいは、前記微粒子を所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記微粒子に所定の蛍光を発生する機能を付与するようにしてもよい。
　この場合には、機械的な外力に対して十分な強度を有する素材を含有する微粒子と、所定生理活性物質を含有する試料とを混合し、所定生理活性物質を微粒子上に吸着させる。その際の試料は、所定生理活性物質の濃度が極めて低い特性および／または、ＡＬの反応に影響する干渉物質を含む特性を有していてもよい。その後、自然沈降あるいは、遠心分離、フィルタろ過などの操作によって所定生理活性物質が吸着した微粒子を分離回収し、必要に応じ、所定生理活性物質を含まない液体で微粒子を洗浄する。そして、微粒子とＡＬとを反応させて凝集反応を惹起し、所定生理活性物質の測定を行う。
　そして、本発明においては、この微粒子に蛍光色素を予め結合させ、あるいは、この微粒子を所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記微粒子に所定の蛍光を発生する機能を付与するようにしてもよい。これによれば、試料中の所定生理活性物質を微粒子上に濃縮させることが可能であるので、結果的により精度良くまたは、より短時間で、生物由来の生理活性物質の蛍光による検出または濃度の測定が可能となる。また、より短時間で、前記ＡＬ試薬と前記微粒子との混和液における前記微粒子の凝集またはゲル化を蛍光により観察することが可能となる。
　なお、ここにおいても、微粒子が多孔質の場合や、ナノ１次粒子が会合して大きな２次粒子になっている場合は、蛍光色素と結合させた際に、表面だけではなく粒子の内部も蛍光標識される。従って、本発明において微粒子に蛍光色素を結合させるとは、微粒子の表面に蛍光色素を結合させる場合と、微粒子の内部に蛍光色素を結合させる場合とを含む。
　本発明において前記微粒子は、パイロセップ、ポリミキシンＢ、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、アミノシラン、キトサン、抗エンドトキシン抗体、抗エンドトキシンアプタマー、ランダムペプチドライブラリ中の素材、アルミナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイトなどの金属酸化物質、カオリン、モンモリロナイト、酸化マンガン、雲母などの天然あるいは合成鉱物より選定された一または複数の素材からなるようにするとよい。
　すなわち、所定生理活性物質を吸着する吸着素材としては、エンドトキシンなどの所定生理活性物質の吸着能力が優れた選択性の高い有機化合物、あるいは、選択性は高くないがエンドトキシンなどの所定生理活性物質の吸着能力の優れた無機物質のいずれであってもよい。有機化合物としては、パイロセップ、ポリミキシンＢ、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、アミノシラン、キトサン、抗エンドトキシン抗体、抗エンドトキシンアプタマー、ランダムペプチドライブラリより選定されたエンドトキシン吸着ペプチド（例えば特開２００９－１１８８５４号公報に例示されている、ＸＹＳＳＳ（Ｘ＝Ｋ、Ｒ、又はＨ））などが挙げられる。また、無機物質としては、アルミナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイトなどの金属酸化物質、カオリン、モンモリロナイト、酸化マンガン、雲母などの天然あるいは合成鉱物が挙げられる。
　上記の有機化合物は可能であれば素材自体を粒状化しても良いし、有機性、あるいは、無機性の結合担体の微粒子上に静電吸着、あるいは化学結合させて粒子化しても良い。すなわち、本発明において前記微粒子は、担体微粒子に前記生理活性物質を選択的に吸着する吸着素材を結合させて形成されるようにしてもよい。
　この場合の吸着素材は、パイロセップ、ポリミキシンＢ、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、アミノシラン、キトサン、抗エンドトキシン抗体、抗エンドトキシンアプタマー、ランダムペプチドライブラリ中の素材、より選定された一または複数の素材であってもよい。
　また、この場合の有機性の担体微粒子としては、ポリスチレンラテックス、ポリエチレン、ナイロン、セルロース、アガロース、ポリビニルアルコール、アクリル樹脂などの微粒子が挙げられる。また、無機性の担体微粒子としては、アルミナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、ハイドロキシアパタイトなどの単体、あるいはそれらの複合素材微粒子（例えば、シリカアルミナやアルミナチタニアなど）、カオリン、モンモリロナイト、酸化マンガン、雲母などの天然あるいは合成鉱物微粒子などが挙げられる。
　これらの微粒子は、自然沈降、あるいは、簡単な操作で分離回収が可能なことが望まれる。非常に小さな粒径では微粒子の回収が難しい。逆に大きな粒径では、（１）用水への微粒子の分散性が低い。（２）微粒子の吸着有効表面積が低い。（３）粒子内部への所定生理活性物質の侵入がしづらい。という理由から所定生理活性物質の吸着能力が低くなる。（４）所定の生理活性物質が吸着した後の微粒子を洗浄しなくてはならない場合、微粒子内部の水を排出しにくいため洗浄効果が低くなる。さらに、所定生理活性物質を吸着した微粒子をＡＬと反応させて共凝集を惹起するに当たっては、粒径をなるべく小さくすることが測定時間の短縮につながる。これらのことから、微粒子の粒径としては、５ｎｍから５０μｍ、さらに１０ｎｍから２０μｍであることが望ましい。
　また、この場合においても、所定の蛍光色素は、特に限定されないが、ＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と同様、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類のものを挙げることができ、これらの蛍光色素を適宜用いることができる。
　また、4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）、ウンベリフェロン、9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、2-クロロ-9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン、サイバーグリーン (SG、SYBR Green)、臭化エチジウム、スチルベン (stilbene)、ナイルブルー（Nile blue、Nile blue A）、5,12-ビス(フェニルエチニル)ナフタセン(5,12-Bis(phenylethynyl)naphthacene)、ピラニン(Pyranine)、ペリレン (perylene)、ボディピー（boron-dipyrromethene）、メロシアニン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein,GFP）、ルシフェリン (luciferin)、ルブレン、ルマジンタンパク質 (Lumazine protein、LumP)などを用いてもよい。また、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、有機色素分子をシリカ（二酸化ケイ素）粒子内部に固定化した蛍光色素であるＱＵＡＲＴＺ ＤＯＴ（登録商標）等を用いてもよい。
　また、上記した無機蛍光色素群は、この場合においても、凝集またはゲル化に関わる物質の上に結合させる使用法の他、蛍光を発する微粒子そのものとして使用することも可能である。従って、上記の無機蛍光色素群によって前記微粒子を形成することにより、微粒子に所定の蛍光を発生する機能を付与することができる。
　また、本発明において前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβグルカンであってもよい。そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、βグルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。
　なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
　本発明にあっては、カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含むＡＬ試薬と所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法において、より精度良く、前記生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定が可能であり、また、ＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化の過程を視覚的に観察することが可能となる。
本発明の実施例における蛍光測定装置の概略構成を示した図である。 本発明の実施例においてエンドトキシンを蛍光ＡＬ結合ビーズ法で測定した場合の、光透過率の時間的変化を示すグラフである。 本発明の実施例においてエンドトキシンを蛍光ＡＬ結合ビーズ法で測定した場合の、蛍光分布の時間的変化を示す図である。 本発明の実施例においてエンドトキシンを蛍光ＡＬ結合ビーズ法で測定した場合の、所定時刻における蛍光分布の画像の例である。 本発明の実施例においてエンドトキシンを蛍光ＡＬ結合ビーズ法で測定した場合の、蛍光強度の時間的変化を示す図である。 本発明の実施例においてエンドトキシンをエンドトキシン吸着性微粒子に結合させ、さらに蛍光色素を結合した上で、ＡＬ試薬と混和した場合の、光透過率の時間的変化を示すグラフである。 本発明の実施例においてエンドトキシンをエンドトキシン吸着性微粒子に結合させ、さらに蛍光色素を結合した上で、ＡＬ試薬と混和した場合の、蛍光分布の時間的変化を示す図である。
　以下に、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下の説明においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明するが、以下の説明はβグルカンを始め他の生物由来の生理活性物質にも適用可能である。
　本実施の形態においては、エンドトキシンとＡＬとの反応により生成されたコアギュリンの凝集またはゲル化を検出することで、エンドトキシンの測定を行う際に、コアギュリンの凝集またはゲル化に関わる物質（例えば、コアギュロゲンなどのＡＬ中の蛋白質、ＡＬ結合ビーズ、エンドトキシンが結合された微粒子など）に所定の蛍光を発生する機能を付与しておく。より具体的には、コアギュリン等の凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光色素を結合させておくか、ＡＬ結合ビーズ、エンドトキシンが結合された微粒子を無機蛍光色素によって形成させておく。そして、蛋白質の凝集またはゲル化が生じた際には、蛍光色素あるいは、蛍光を発するビーズや微粒子自体からの蛍光の強度を測定し、または蛍光分布を観察する。こうすることで、コアギュリンの凝集またはゲル化のメカニズムを視覚的に観察することができる。また、凝集またはゲル化が生じた部分においては蛍光強度が増加するので、蛍光強度を測定することで蛋白質の凝集またはゲル化を検出することが可能となる。
　図１には、本実施の形態における蛍光測定装置１１の概略構成の一例を示す。この蛍光測定装置１１は、蛍光ＡＬ結合ビーズ法で、例えば比濁測定装置を用いてエンドトキシンを測定中の試料を所定の時刻においてサンプリングし、その時刻における混和液中の蛍光分布を測定するための装置である。蛍光測定装置１１に使用される励起光源１２には波長４８８ｎｍのアルゴンレーザー光源が用いられている。しかしながらアルゴンレーザー光源の他に、キセノンランプとフィルタ、ダイクロイックミラーの組み合わせで構成された励起光源を用いてもよい。光源１２から照射された励起光は、入射光学系１３で絞られ、試料セル１４に入射する。この試料セル１４には蛍光ＡＬ結合ビーズ法における試料とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル１４に入射した光は、混和液中の蛍光色素が吸着された粒子（アルミナビーズ及び、コアギュロゲンまたはコアギュロゲンが変化したコアギュリン）において蛍光を励起する。
　試料セル１４の、入射光軸の側方には出射光学系１５が配置されている。この出射光学系１５には、蛍光色素がフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣともいう。）の場合で５３５ｎｍ、ローダミンイソチオシアネート（以下、ＲＩＴＣともいう。）の場合で５８０～６００ｎｍの波長の蛍光が出射される。また、出射光学系１５の光軸の延長上には、試料セル１４内の混和液中の粒子から発生し出射光学系１５で試料セル１４内の蛍光分布画像が結像される結像素子１６が配置されている。結像素子１６には、結像素子１６に結像された画像から画像中の蛍光強度の合計値を演算する演算装置１８及び、結像素子１６に結像された画像を表示する表示装置１９が電気的に接続されている。
　(製造例１)
　次に、ビーズに赤色の蛍光色素を結合した蛍光ＡＬ結合ビーズの製造例について説明する。ビーズとしては電気化学工業株式会社製のアルミナビーズＡＳＦＰ－２０（ビーズ径２０ｎｍ）を用いた。また、赤色の蛍光色素としては、ＲＩＴＣを用いた。ビーズに赤色の蛍光色素を結合させる際には、アルミナビーズが分散した懸濁液にＲＩＴＣ溶液を混和し攪拌することによってビーズにＲＩＴＣを吸着させた。
　また、本製造例においては、ＡＬに含まれる蛋白質であるコアギュロゲンに緑色の蛍光色素を結合させ、緑色の蛍光色素で標識されたコアギュロゲンを上記の赤色の蛍光色素で標識されたビーズに吸着させた。その際には、両親和性の溶媒であるジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯともいう。）にＦＩＴＣを溶かした溶液と、ＡＬ試薬（和光純薬製ＥＳ－ＩＩマルチ試薬）とを混和し攪拌し、コールドエタノール法によって余分なＤＭＳＯ、ＦＩＴＣを除去することで、ＡＬ試薬中のコアギュロゲンのアミノ基と、ＦＩＴＣにおけるイソチオシアネートとを結合させ、緑色の蛍光色素と結合したＡＬ試薬を調製した。
　そして、ＲＩＴＣが吸着されたアルミナビーズＡＳＦＰ－２０を、ガラスチューブに小分けにしてガラスチューブの開口部をアルミ箔で覆い、さらに、数本をまとめてガラスビーカーに入れて、その開口部をさらにアルミ箔で覆い、２５０℃で３０分間乾熱処理をして、混入の恐れがあるエンドトキシンを完全に失活させた。これを規定の濃度になるように分散液に分散させてエンドトキシン選択性はないが吸着能力を持つビーズを調製した。
　さらに、ＲＩＴＣが結合されたアルミナビーズＡＳＦＰ－２０を、その濃度が３０ｍｇ／ｍＬになるように、注射用蒸留水に分散させた。そして、ＦＩＴＣが吸着されたＡＬ試薬（和光純薬製ＥＳ－ＩＩマルチ試薬）５００μＬに対してＲＩＴＣが吸着されたＡＳＦＰ－２０の分散液５００μＬを加えてよく混合させた。その後、１回注射用水で洗浄した上で注射用水１ｍＬに分散させ、ＦＩＴＣが吸着したコアギュロゲンと結合した、ＲＩＴＣが吸着したアルミナビーズ（蛍光ＡＬ結合ビーズ）を得た。
　なお、上記の実施例では、アルミナビーズに、ＲＩＴＣを吸着させたが、蛍光色素（ＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ）を、予めアミノシランに結合（イソチオシアネート基とアミノシランのアミノ基を結合）しておき、その後、シランのカップリング作用を利用して、ビーズに、蛍光色素と結合したシランを固定するといった方法でもよい。
　（製造例２）
　次に、エンドトキシン及び蛍光色素と結合した微粒子（以下、蛍光エンドトキシン結合微粒子ともいう。）の製造例について説明する。この製造例では、微粒子としてのチタニアナノ粒子（Ｐ２５：１００ｍｇ／ｍＬ）１００μＬと、ＤＭＳＯ中に分散させたＦＩＴＣ(１ｍｇ／ｍＬ)１００μＬとを混和した。そして、３０分攪拌してＦＩＴＣをチタニアナノ粒子上に吸着させた。次に、ＦＩＴＣが吸着したチタニアナノ粒子を注射用蒸留水で３回洗浄して分離した後、注射用蒸留水で１ｍＬに懸濁した。
　次に、上記の微粒子を含んだ懸濁液１００μＬと、ポリＬリジン（０．１％）溶液９００μＬとを混和し、１時間室温で攪拌させて微粒子にポリＬリジンを吸着させた。その後、注射用蒸留水で３回洗浄して分離し、さらに、微粒子濃度で０．２ｍｇ/ｍＬになるように０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液に懸濁した。そして、上記の懸濁液１００μＬとエンドトキシン溶液（０．００１ＥＵ／ｍＬ）１ｍＬとを混和し、２０分間攪拌して反応させた。その後、遠心分離して微粒子を回収し、得られた微粒子を０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液５０μＬに分散させた。
　（実施例１）
　製造例１で得られた蛍光ＡＬ結合ビーズを使用し、まずは、攪拌比濁法によって、試薬とエンドトキシンを含む試料を混和させた際の光透過率の変化について測定した（興和製ＥＸ－１００を使用）。本測定においては、製造例１で得られた蛍光ＡＬ結合ビーズを２０ｍＬになるように注射用生理食塩水に懸濁させた。これから、１００μＬをとり、ＡＬ試薬に混合させ、さらに、０．０１ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシンを含有する水溶液１００μＬと混和させて合計容量を２００μＬとした。そして、混和液をＥＸ－１００にセットし、攪拌開始後の光透過率の変化を測定した。
　また、対照（コントロール）のため、蛍光ＡＬ結合ビーズではなく、製造例１で調整した、緑色の蛍光色素ＦＩＴＣと結合したコアギュロゲンを含む蛍光ＡＬ試薬のみを用いた場合についても測定した。具体的には、蛍光ＡＬ試薬を２０ｍＬになるように注射用生理食塩水に懸濁させた。この懸濁液から１００μＬをとり、ＡＬ試薬に混合させ、さらに、０．０１ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシンを含有する水溶液１００μＬと混和させて合計容量を２００μＬとした。そして、混和液をＥＸ－１００にセットし、攪拌開始後の光透過率の変化を測定した。
　光透過率の測定中に、上記の蛍光ＡＬ結合ビーズを用いた場合と、蛍光ＡＬ試薬を用いた場合における混和液を適切な時間間隔でサンプリングし、蛍光測定装置１１で蛍光の分布を観察した。また、蛍光測定装置１１で観察された画面における合計の蛍光強度を画像処理によって演算し取得した。
　図２には、蛍光ＡＬ結合ビーズを用いた場合と、蛍光ＡＬ試薬を用いた対照例（コントロール）の場合における、混和液の光透過率の時間的変化を示す。横軸は攪拌開始後の経過時間、縦軸は、攪拌開始時の光透過率を１００（％）とした場合の、攪拌開始後の光透過率を示す。また、本実施例では、光透過率が初期値に対して±５％変化した時点を持って、凝集開始時間と定義している。
　図２において、コントロールの場合は、攪拌開始後２５分経過前後から、凝集が開始し光透過率の低下が始まっていることが分かる。一方、蛍光ＡＬビーズ法においては、２０分経過前から逆に光透過率が急激に増加し、３０分経過後前後において再び急激に低下していることが分かる。図２から分かるように、蛍光ＡＬビーズ法においては、凝集開始時間は１７～１８分、コントロールにおいては約３２～３３分となっている。
　次に、図３には、本測定例によって得られた蛍光分布の画像の時間的変化を示す。各画像は、蛍光ＡＬ結合ビーズ法におけるビーズ及びコアギュロゲンが変化したコアギュリンの凝集に起因して発生する蛍光の分布と、対照例におけるコアギュリンの凝集に起因して発生する蛍光の分布とを示したものである。蛍光ＡＬ結合ビーズ法による画像に記載された数値は、攪拌開始からの経過時間である。蛍光ＡＬ結合ビーズ法による画像と対応するコントロールによる画像は、対応する蛍光ＡＬ結合ビーズ法による画像と同時間において得られたものである。蛍光ＡＬ結合ビーズ法においては、図２における光透過率の急増時に相当する１８分経過時位から、凝集したビーズからの蛍光による輝点が明確になり始め、光透過率がピークを迎える３０分経過後においては、凝集したビーズを中心とし、その周囲にコアギュリンが凝集することにより蛍光の分布が拡大している。その後、時間の経過に伴って蛍光の分布がさらに増加している。
　一方、コントロールにおいては、蛍光ＡＬ結合ビーズ法による蛍光分布に比較して蛍光による輝点が現れる時間も遅く、その蛍光の分布が広がっていく過程は、蛍光ＡＬ結合ビーズ法と比較して遅くなっていることが分かる。
　なお、図３は白黒写真であるため分かりづらいが、蛍光ＡＬ結合ビーズ法においては、攪拌開始後２分の段階で既に赤い輝点が現れており、輝点の数が時間の経過とともに増加している。ここで、２０分までに表れる輝点は赤い蛍光色素によるものが中心で、まず蛍光ＡＬ結合ビーズの凝集塊が生じて蛍光を発していることが分かる。そして、その後、蛍光分布が拡大していく過程は緑色の蛍光色素によるものが中心であり、ビーズの凝集塊の回りにコアギュリンによる凝集が発生して各ビーズの凝集塊を架橋し、包み込むというメカニズムを観察することができた。
　また、コントロールに関する図２の光透過率変化と図３の蛍光分布を見ると、光透過率変化は、攪拌経過後２０分程度まで変化していないが、蛍光分布においては、攪拌経過後２分後から輝点が現れており、輝点の数が２０分経過前に増加していることが分かる。このように、蛍光分布を視覚的に観察することで、光透過率の測定では得られない情報を得ることが可能である。
　次に、上記の方法で得られた蛍光の分布から、蛍光ＡＬ結合ビーズ法におけるビーズの凝集を定量化する方法について説明する。
　図４には、図３で得られた蛍光画像を画像処理し、蛍光の受光部分を黒く表示して蛍光分布を明確化した画像を示す。この画像は、図３における反応開始後３０分における蛍光画像から得られたものである。そして、例えば図４の画像における蛍光強度を積分した値をこの時間における蛍光強度とすることで、蛍光ＡＬ結合ビーズ法におけるビーズの凝集を定量化することが可能である。
　図５には、横軸に攪拌開始からの時間、縦軸に上記の蛍光強度（の積分値）を取った場合の、蛍光ＡＬ結合ビーズ法と、コントロールにおける蛍光強度の変化を示す。これによれば、光透過率による測定と同様に、蛍光ＡＬ結合ビーズ法では１７～１８分経過後から蛍光強度が急激に増加していることが分かる。また、蛍光ＡＬ結合ビーズ法により、コントロールと比較して高い蛍光強度が得られていることが分かる。このように蛍光ＡＬ結合ビーズ法において、より短時間に高感度でエンドトキシンを測定できることが分かる。
　なお、製造例１及び実施例１においては、ビーズとビーズの表面に吸着する蛋白質の両方に蛍光色素を結合させて、エンドトキシンと蛍光ＡＬ結合ビーズのＡＬとの反応に起因する凝集またはゲル化を測定することとした。しかしながら、本発明においては、ビーズのみに蛍光色素を結合させあるいは、ビーズ自体を自ら蛍光を発する素材で形成した上で、蛍光ＡＬ結合ビーズ法を実施してもよい。これは、ビーズのみから蛍光が照射されるようにしても、充分に凝集、ゲル化のメカニズムを観察することが可能であるとともに、エンドトキシンの測定を行うのに充分な蛍光強度を得ることができるからである。これによれば、最も工程が複雑となる、蛋白質と蛍光色素を結合させる作業を省略することができ、より容易に蛍光によるエンドトキシンの測定を行うことが可能となる。
　（実施例２）
　次に、製造例２で得られた蛍光エンドトキシン結合微粒子を使用し、まずは、攪拌比濁法（興和製ＥＸ－１００を使用）によって、蛍光エンドトキシン結合微粒子を含む試料とＡＬ試薬とを混和させた際の光透過率の変化について測定した。本測定においては、製造例２で得られた蛍光エンドトキシン結合微粒子を分散させた分散液５０μＬと、ＡＬ試薬５０μＬとを混和させ、１００μＬとした。そして、攪拌開始後の光透過率の変化をＥＸ－１００によって測定した。また、適切な時間間隔で、光透過率の測定中の混和液をサンプリングし、蛍光測定装置１１で蛍光の分布を観察した。
　図６には、蛍光エンドトキシン結合微粒子を用いた場合（以下、「蛍光エンドトキシン結合微粒子法」ともいう。）における、光透過率の時間的変化を示す。横軸は攪拌開始後の経過時間、縦軸は攪拌開始時の光透過率を１００（％）とした場合の、攪拌開始後の光透過率を示す。図６より、蛍光エンドトキシン結合微粒子法においても、攪拌開始から２０分経過後から光透過率が急激に増加し、３０分経過前後において再び急激に低下していることが分かる。
　次に、図７には、本測定例によって得られた蛍光分布の画像を示す。各画像は、蛍光エンドトキシン結合微粒子法における微粒子の凝集に起因して発生する蛍光の分布を示したものである。蛍光エンドトキシン結合微粒子法においても、図６で見られた光透過率の急増時である２０分経過後位から、蛍光による輝点が明確になり始め光透過率がピークを迎える３０分経過後においては、蛍光の分布が拡大している。その後、時間の経過に伴って蛍光の分布がさらに拡大していることが分かる。
１１・・・蛍光測定装置
１２・・・励起光源
１３・・・入射光学系
１４・・・試料セル
１５・・・出射光学系
１６・・・結像素子
１８・・・演算装置
１９・・・表示装置

Claims (6)

  1. 　カブトガニの血球抽出物であるＡＬを含むＡＬ試薬と所定の生物由来の生理活性物質を含む試料の混和液を生成し、該混和液を攪拌しつつ、該混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因する蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
    　前記試料および／または前記ＡＬ試薬の中において前記凝集またはゲル化に関わる物質に所定の蛍光を発生する機能を付与し、
    　前記混和液における前記凝集またはゲル化に関わる物質からの蛍光を測定または観察して前記混和液における前記凝集またはゲル化を検出することで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定することを特徴とする、生物由来の生理活性物質の測定方法。
  2. 　前記ＡＬに含まれる所定の蛋白質を、前記ＡＬ試薬中に分散可能なビーズに結合させ、
    　前記蛋白質が結合した前記ビーズが分散した前記ＡＬ試薬であるＡＬ結合ビーズ試薬と前記試料とを混和させ、
    　ＡＬ結合ビーズ試薬と前記試料との混和液における蛋白質の凝集またはゲル化を検出することで前記生理活性物質の検出または濃度の測定を行う、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
    　前記ビーズに所定の蛍光色素を予め結合させ、あるいは、前記ビーズを所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記ビーズに所定の蛍光を発生する機能を付与することを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
  3. 　前記混和液におけるＡＬと前記生理活性物質との反応に起因して凝集またはゲル化する蛋白質に、所定の蛍光色素を結合させることにより、該蛋白質に所定の蛍光を発生する機能を付与することを特徴とする請求項１または２に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
  4. 　前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
  5. 　前記生理活性物質を吸着可能な微粒子を前記試料中に分散させることで前記生理活性物質を前記微粒子に吸着させた後に前記試料から前記微粒子を分離し、
    　前記ＡＬ試薬と前記生理活性物質が吸着された前記微粒子との混和液を生成し、
    　前記ＡＬ試薬と前記微粒子との混和液における前記微粒子の凝集またはゲル化を検出する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
    　前記微粒子に所定の蛍光色素を予め結合させ、あるいは、前記微粒子を所定の無機蛍光色素により形成することにより、前記微粒子に所定の蛍光を発生する機能を付与することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
  6. 　前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβグルカンであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
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