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WO2013057293A1 - Méthode de quantification de marqueurs rénaux par dosage urinaire - Google Patents

Méthode de quantification de marqueurs rénaux par dosage urinaire Download PDF

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Publication number
WO2013057293A1
WO2013057293A1 PCT/EP2012/070821 EP2012070821W WO2013057293A1 WO 2013057293 A1 WO2013057293 A1 WO 2013057293A1 EP 2012070821 W EP2012070821 W EP 2012070821W WO 2013057293 A1 WO2013057293 A1 WO 2013057293A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pathology
renal
marker
urothelial
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2012/070821
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre GALICHON
Eric RONDEAU
Isabelle BROCHERIOU
Yi-Chun XU-DUBOIS
Alexandre HERTIG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP12773001.8A priority patent/EP2768973A1/fr
Priority to CA2851752A priority patent/CA2851752A1/fr
Priority to JP2014536271A priority patent/JP2014532394A/ja
Priority to US14/353,262 priority patent/US20140378334A1/en
Publication of WO2013057293A1 publication Critical patent/WO2013057293A1/fr
Priority to IL232057A priority patent/IL232057A0/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • the field of the invention is that of uronephrology. More specifically, the invention relates to a method for in vitro diagnosis of pathologies of the urinary system.
  • Renal diseases can reach the different structural compartments of the kidney: vessels, glomeruli, tubules, interstitium. These disorders lead to acute and / or chronic renal failure, their ultimate evolution being the complete destruction of the functional units of the kidney, replaced by an expansion of the extracellular matrix, that is to say renal fibrosis.
  • the renal diseases can touch the native kidneys or the allografts after a kidney transplant. In France, an estimated 3000 new cases of transplant patients per year (kidney, heart, liver, marrow, lung ).
  • the systematic follow-up of the transplant patients made it possible to study the early stages of renal diseases evolving towards fibrosis.
  • the expression in renal tissue of epithelial-mesenchymal (MP) transition markers allows early detection of fibrosing renal tissue disease, which can be caused by ischemia, rejection and / or toxicity of immunosuppressive agents, cyclosporine A (CsA) in particular (Slattery et al., Am J Pathol 2005 Aug; 167 (2): 395-407; Hertig et al., American Journal of Transplantation 2006, Galichon et al., Fibrogenesis Tissue Repair 2011, Galichon et al, Transplantation, 2011).
  • CsA cyclosporine A
  • TEM is a dynamic process in which cells lose their epithelial characteristics and acquire mesenchymal characteristics. These changes affect both the morphology of the cell and its operation. When it reaches the renal tubular cells, it shows a progression to fibrosis and chronic renal failure (Hertig et al., J Am Soc Nephrol 2008). It is therefore necessary to monitor the occurrence of this phenomenon in transplant patients in order to adapt or modify the immunosuppressive treatment.
  • the reference method used for the detection and monitoring of any renal pathology is biopsy.
  • the biopsy involves taking a carrot of tissue in the kidney transcutaneously, transvenously, or surgically. This sample is then subjected to histological examination for signs of possible pathology (destruction, cellular infiltration or hypertrophy of the glomerular, tubular, vascular or interstitial compartments).
  • the sampling is not without risk for the patient. Many complications are observed such as hematuria, renal insufficiency on an obstacle or even anuria, the appearance of hematomas in the perirenal region, the appearance of arteriovenous fistulas, and, more rarely, the haemorrhage, the loss graft, death. In addition to the risks associated with any invasive procedure, it is possible to perform the biopsy in a region that is not representative of the overall state of the kidney and therefore to underestimate or overestimate the patient's actual situation as a result of this sampling.
  • the invention particularly aims to overcome these disadvantages of the prior art.
  • an object of the invention is to provide, in at least one embodiment, a method for early diagnosis of renal pathologies or pathologies having renal effects.
  • Another object of the invention is to implement, in at least one embodiment, a non-invasive diagnostic method.
  • the invention also aims to implement, in at least one embodiment, a reliable and accurate diagnostic method.
  • Another object of the invention is to implement, in at least one embodiment, a simple diagnostic method to achieve.
  • Another object of the invention is to implement, in at least one embodiment, a more economical diagnostic method.
  • Another object of the invention is to implement, in at least one embodiment, a method of monitoring the efficiency and tolerance of a treatment.
  • Another object of the invention is to implement, in at least one embodiment, a less painful diagnostic method for the patient.
  • such a method comprises the following steps:
  • the invention is based on the use of the cells and microparticles contained in the urine in order to extract the genetic material and to compare the expression of a gene of interest, correlated with a pathology, with the expression of a gene specific for urinary cells not affected by the pathology.
  • Urine contains a small amount of urothelial cells, derived from the normal renewal of the epithelium of urinary excretory pathways. It may also contain, in a variable amount, depending in particular on the presence of a renal pathology, leucocytes, tubular or renal glomerular cells, blood ... as well as microparticles.
  • microparticles are meant the complex vesicular structures that can be released by most cells during activation or apoptosis processes. They are composed of a double layer of phospholipids exposing transmembrane proteins and receptors and contain cytosolic components such as enzymes, transcription factors and A Nm from their parent cells.
  • urothelial cells refers to the transitional epithelial cells that make up human purothelium, from the pelvis to the urethra. These cells have various forms: cylindrical, kite, umbrella, balloon.
  • specific marker of urothelial cells means a gene specifically expressed by urothelial cells or urothelial microparticles, whether inside the cells or on their surface, and the level of synthesis by said cell is independent of the pathologies that may be affect the kidney cells. This notion is therefore different from the notion of housekeeping gene in which the expression is ubiquitous, whatever the cell type, the function of the cell or its state.
  • One of the contributions of the invention is therefore the normalization of the expression of the gene of interest by the expression of a gene independent of the affected cell types.
  • This normalization step makes it possible to determine an expression threshold of the pathological marker with respect to a urinary marker independent of the quantitative and qualitative variations of urinary cells of renal origin. It is then possible to know if this marker is expressed in a significant way or, on the contrary, very weak.
  • This feature provides a reliable, accurate diagnostic test that more accurately reflects the patient's state of health.
  • the method according to the invention can be used for diagnostic purposes or to monitor the evolution of a pathology.
  • working from a urine sample has many advantages: the sample is easily accessible;
  • the sample is non-invasive and painless
  • this standardization process can be applied to various pathologies, renal or non-renal, since these pathologies modify the expression and / or the quantity of urothelial cells and / or microparticles excreted and present in the urine.
  • the invention further relates to an in vitro diagnostic method wherein step b) comprises detecting the transcript of said at least one urothelial cell specific marker and / or urothelial microparticles and said at least one transcription product. marker of said pathology.
  • the study of transcription products is more reliable than the study of the presence of a gene in the genome of the cell. It is indeed known that the presence of a gene in the genome of a cell is not necessarily correlated with its expression in said cell, the regulation of the expression of a particular gene being subjected to many parameters. The detection of the transcription product thus makes it possible to obtain a more precise and reliable result.
  • step b) is implemented by means of a nucleic acid amplification technique chosen from the group comprising RT-PCR, quantitative PCR and PCR. in end point, semi-quantitative PCR or their combination.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • RT-PCR Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Quantitative PCR also known as real-time PCR, is understood to mean the in vitro replication technique of a targeted DNA fragment that furthermore makes it possible to measure the initial quantity of this target fragment.
  • Semi-quantitative PCR differs from quantitative PCR in that PCR is interrupted in several points, to evaluate the amount of initial DNA. This type of PCR is useful when the amount of DNA is unusually low. End-point PCR combines the Northern blot technique with conventional PCR to evaluate the initial amount of DNA through comparison of agarose gel bands.
  • the invention further relates to an in vitro diagnostic method wherein step b) is carried out using a nucleic acid hybridization technique selected from the group consisting of in situ hybridization (ISH), fluorescence-labeled in situ hybridization (FISH), biochip, Northern blot or Southern Blot.
  • a nucleic acid hybridization technique selected from the group consisting of in situ hybridization (ISH), fluorescence-labeled in situ hybridization (FISH), biochip, Northern blot or Southern Blot.
  • the invention also relates to an in vitro diagnostic method in which step b) is implemented via a nucleic acid sequencing method.
  • the invention further relates to an in vitro diagnostic method wherein said pathology is renal pathology and is selected from the group consisting of renal fibrosis, phenotypic change of renal epithelial cells, graft rejection, cancer, glomerular diseases (diabetes, extramembranous glomerulonephritis, minimal glomerular lesions, segmental and focal hyalinosis ...), tubular diseases (acute tubular necrosis, expression of epithelial-mesenchymal transition markers, atrophy, cell rejection, excretory tract obstruction, etc.) , interstitial diseases (inflammation, fibrosis), vascular diseases of the kidney (arterial hypertension, thrombotic microangiopathy, humoral rejection, etc.).
  • renal pathology is renal pathology and is selected from the group consisting of renal fibrosis, phenotypic change of renal epithelial cells, graft rejection, cancer, glomerular diseases (diabetes, extramembranous glomerulonep
  • TEM epithelio-mesenchymal transition
  • Epithelial phenotypic changes are markers of TEM (eg, vimentin and ⁇ -catenin in tubular epithelium) that can be studied in tissues in clinical situations (Hertig A et al., Early Epithelial phenotypic changes predict graft Brooks, J Am Soc Nephrol, 19 (2008) 1584-1591).
  • Another object of the invention is a method in which said patient has received an organ transplant and said renal pathology is the presence of interstitial fibrosis, tubular atrophy or epithelial-mesenchymal transition markers in the renal graft.
  • the method according to the invention thus makes it possible to detect effectively and early the occurrence of a renal pathology such as inflammation or TEM, inducing epithelial phenotypic changes in the kidney.
  • the invention also relates to an in vitro diagnostic method in which at least one genetic marker specific for said renal pathology is selected from the group comprising the human genes of CD45 (SEQ ID 1), CD68 (SEQ ID 2), and VIM (SEQ ID NO: 3) as well as genes having a sequence homology of at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, of preferably at least 99% with these.
  • the human gene CD45 also has the symbol PTPRC (Protein Tyrosine Phosphatase Receptor type C).
  • PTPRC Protein Tyrosine Phosphatase Receptor type C
  • the inventors have surprisingly discovered that the expression of these genes is considerably increased in the urine of clinically stable kidney transplant patients, but whose biopsy of the graft demonstrates the presence of phenotypic epithelial changes.
  • This over-expression is correlated with the presence of epithelial phenotypic changes, occurring during an epithelial-mesenchymal transition, and tubulointerstitial involvement on renal allograft biopsies, these biopsies being performed as part of a systematic screening three months after transplantation. It is possible, within the meaning of the invention, to search for the expression of only one gene, a marker specific for a pathology.
  • markers for clear cell carcinoma include the search for racemase, caveolin-1 (SEQ ID 29), ROR1 (SEQ ID 30), CD10 (SEQ ID 31), keratin 7 , vimentin (SEQ ID 3), TP53 (SEQ ID 26) in the context of monitoring renal cancer.
  • a "homologous sequence” or a "sequence homology" between two nucleotide sequences is determined by the linear comparison of the nucleotide sequences by the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), a blastn algorithm available on the NCBI site:
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • database human genome + transcripts (human genomic plus transcript) (Human G + T);
  • blastn Somewhat similar sequences
  • said pathology is a pathology modifying the quantity of cells and / or microparticles excreted in the urine.
  • said pathology modifying the quantity of cells and / or microparticles excreted in the urine is chosen from the group comprising glomerular diseases such as segmental and focal hyalinosis, tubular diseases such as acute tubular necrosis and epithelial phenotypic changes. , cell rejection and interstitial diseases such as acute rejection of a graft, Sjögren's disease and sarcoidosis.
  • glomerular diseases such as segmental and focal hyalinosis
  • tubular diseases such as acute tubular necrosis and epithelial phenotypic changes.
  • cell rejection and interstitial diseases such as acute rejection of a graft, Sjögren's disease and sarcoidosis.
  • the method according to the invention makes it possible to reliably, rapidly and noninvasively detect the development of non-renal diseases by collecting a urine sample from the patient, since these pathologies modify the gene expression profile. and / or the amount of cells excreted in the urine.
  • Tubular necrosis results in an increase in the number of tubular cells in the urine, due to a large desquamation of the walls of the renal tubular epithelium.
  • Segmental or focal hyalinosis is accompanied by a large amount of podocytes in the urine.
  • the increase in the number of leucocytes is a sign of an acute rejection of a graft.
  • said at least one marker specific for urothelial cells is selected from the group comprising the human genes of uroplakin 1A (SEQ ID 4), uroplakin 1 B (SEQ ID 5), uroplakin 2 (SEQ ID 6 ), uroplakin 3A (SEQ ID 7), uroplakin 3B (SEQ ID 8), uroplakin 3BL (SEQ ID 9), BcasI (SEQ ID 10), CEP152 (SEQ ID 11), CRABP2 (SEQ ID 12), DNASE1 (SEQ ID 13), KRT20 (SEQ ID 14), PLEKHF1 (SEQ ID 15), PLEKHG4B (SEQ ID 16), RCN1 (SEQ ID 17), SEMA5B (SEQ ID 18), SULT2A1 (SEQ ID 19), ), TFF1 (SEQ ID NO: 20), VILL (SEQ ID NO: 21), ZNF720 (SEQ ID NO: 22) as well as genes having a sequence homology of at least 80%,
  • urothelial cells express these genes. These genes are specifically and consistently expressed by urothelial cells and / or microparticles, independently of renal pathologies. Of course, these genes are present in the genetic material contained in the nucleus of each cell of the body. However, not all genes are expressed in the same way by all cells in the body. In other words, not all genes are transcribed from DNA to mRNA and then translated from mRNA to protein in all cells in the human body. However, the inventors have discovered that among the cells and the microparticles contained in the urine, these genes are specifically expressed by the urothelial cells and this, steadily.
  • genes linked to a pathology specifically affecting the renal cells or modifying their quantity in the urine are thus constitute reference frames of choice for the normalization of genes linked to a pathology specifically affecting the renal cells or modifying their quantity in the urine.
  • the inventors wish to emphasize that the aforementioned genes can, in fact, be detected in other cell types, for example when this detection is based on the simple search for the presence of a gene in the total DNA and not on the genes expressed by a cell type. These genes can also be expressed by other cell types.
  • their interest in the present invention is related to the fact that, of all the cell types that can be found in a urine sample of a patient, only urothelial cells express these genes, regardless of pathological conditions.
  • the concept of specific marker of urothelial cells, or urothelial microparticles is to be distinguished from the concept of household gene.
  • household genes are genes expressed by all cells, regardless of their cell type and function.
  • specific marker of urothelial cells corresponds to genes expressed solely by urothelial cells among all the cells likely to end up in a urine sample.
  • said at least one specific marker for urothelial cells or urothelial microparticles is chosen from the group of genes comprising the human genes UPK1A, UPK1B, UPK2 and UPK3A as well as genes having a sequence homology of at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 99% with these.
  • Normalization means the elimination of bias due to measurement or manipulation errors, and independent of biological variation. The standardization step therefore makes it possible to produce more reliable results. Normalizing by using specific genes of the cells affected by the pathology sought makes it possible to eliminate the bias linked to the proportion of these same cells in the urine sample. Indeed, the quantitative and The quality of the urine is not fixed either because of the urinary flow or because of the disease. The risk of underestimating the real progression of the pathology in the patient is therefore real, and could be harmful for its therapeutic management.
  • normalization is a logarithmic scale (which corresponds to the raw result) on a linear scale in two steps:
  • the operator should measure the optical densities of each migration band with any standard software (Image J TM, UN-SCAN-IT Gel TM) and report back to determine the expression threshold of the gene of interest in the patient.
  • the expression threshold is then calculated as follows:
  • the invention also relates to an in vitro diagnostic method further comprising a step of comparing the expression threshold of said marker of a renal pathology to a threshold of expression unchanged by the disease.
  • the invention further comprises an in vitro diagnostic kit for the detection of pathologies from a urine sample from a patient comprising at least one pair of primers for detecting in said sample at least one pathology-specific marker and at least one pair of primers for detecting at least one urothelial-specific marker.
  • said pathology is a renal fibrosis or a phenotypic change of the renal epithelial cells
  • said at least one marker specific for a renal pathology is selected from the group comprising the human genes of CD45, CD68 and VIM.
  • said at least one specific marker for urothelial cells is selected from the group comprising the human genes of uroplakin 1A, uroplakin 1B, uroplakin 2, uroplakin 3A, uroplakin 3B, uroplakin 3BL, Bcas1, CEP 152, CRABP2, DNASE1, KRT20, PLEKHF1, PLEKHG4B, RCN1, SEMA5B, SULT2A1, TFF1, VILL, ZNF720 as well as genes having a sequence homology of at least 80 %, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, preferably at least 99% with these.
  • Another object of the invention is the use of the in vitro diagnostic kit for the detection of a renal pathology, said renal pathology being a fibrin or a phenotypic change of renal epithelial cells.
  • Figure 1 presents a graph showing the correlation of the TEM scores with the GAPDH standardized vimentin urinary PCR (VIM) results.
  • FIG. 2 illustrates the correlation of the same TEM scores with the same urine PCR results for vimentin (VIM), when the latter are normalized by the UPK1A uroplakin 1A gene.
  • Figure 3 presents a graph showing the correlation of the TEM scores with the GAPDH normalized CD68 urinary PCR results.
  • FIG. 4 shows the correlation of the same TEM scores with the same urinary PCR results for CD68, when the latter are normalized by the UPK1A uroplakin 1A gene.
  • Figure 5 shows the correlation of the TEM scores with the results of urinary CD45 PCR, standardized by GAPDH.
  • FIG. 6 describes the correlation of the same TEM scores with the same CD45 urinary PCR results, when the latter are normalized by the UPK1 A uroplakin A gene.
  • Figure 7 is a graph showing the number of identified genes corresponding to the terms “kidney” and “intercellular junction” as a function of the normalization method.
  • Figure 8 is a graph showing the significance of gene enrichment for the term "kidney” and the term “intercellular junction” as a function of the normalization method.
  • the general principle of the invention rests on the comparison of the expression of a gene correlated with a pathological phenomenon, designated as a marker of a pathology or pathological marker, on the expression of a reference gene whose level of Expression in urothelial cells is independent of the cells affected by the pathology.
  • the latter is designated as a specific marker for urothelial cells.
  • Example 1 Diagnosis of renal graft epithelial phenotypic changes by the method according to the invention.
  • the urine sample is centrifuged at 2000 rpm for 20 min at room temperature (T amb ). A volume of 2 ml of supernatant is stored at -80 ° C. The remainder of the supernatant is removed. The pellet, containing the cells and the minerals, is taken up in a volume of 15 ml of PBS1X buffer solution. The cell suspension is again centrifuged to remove the debris for 10 min, at 2000 rpm, T amb - The supernatant is removed, the pellet is drained by inversion of the tube before being resuspended in 150 ⁇ l of lysis buffer RLT, supplemented per 1% by volume of ⁇ -mercaptoethanol (14.3 M solution).
  • the RLT buffer is provided by Qiagen Laboratories, in the RNeasy® micro kit. At this stage, the lysate thus obtained can be stored at -80 ° C or can be directly used to carry out RNA extraction.
  • mRNAs messenger RNAs
  • Indicator markers for pathology, fibrosis or MMT do not are usually expressed only when these phenomena appear. Studying their transcription is therefore more relevant than looking for their presence in the genome.
  • the ARs are extracted from the cell lysate, prepared as previously described, using the RNeasy® micro kit (Qiagen) according to the protocol provided by the manufacturer. Specifically, the protocol followed is the protocol "Fabrics obtained by microdissection". Briefly, a volume of 70% sterile ethanol is added to the homogenized lysate, as indicated in the protocol. The lysate is deposited, wholly or partly, in an RNeasy® column, supplied with the kit. The columns are centrifuged for 15 seconds, at a rotation speed greater than 10,000 rpm, at 4 ° C. The effluent is eliminated. The column is washed with RW1 buffer, supplied with the kit. The RNAs are eluted and then recovered in 14 ⁇ l of water devoid of RNAse.
  • RNA reverse transcription of previously extracted RNAs is performed using the QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen). Briefly, the previously produced RNA solution is supplemented with gDNA Wipeout Buffer, provided in the kit, before being incubated at 42 ° C for 2 min. This step makes it possible to eliminate the residual genomic DNA.
  • the retro-transcriptional mixture contains the nucleic bases (RT Primer Mix), the retro-transcriptase (Quantiscript® Reverse Transcriptase) and the reaction buffer (Quantiscript® RT Buffer). It is added to the RNA solution. The mixture is incubated for 15 min at 42 ° C for retro-transcription. The mixture is then incubated for 3 min at 95 ° C to inactivate the retro-transcriptase.
  • the complementary DNA solution thus prepared may be stored or diluted to l / 10th before analysis. 4. Quantitative PCR.
  • Quantitative PCR is used to evaluate the initial amount of transcirption products in cells. It thus makes it possible to determine whether a gene is overregulated or underregulated.
  • the primer pairs used are provided by Roche Laboratories:
  • Vimentin is a protein belonging to the family of intermediate filaments. The gene symbol encoding it is VIM. She participates in the cytoskeleton.
  • CD45 or PTPRC, is a transmembrane protein tyrosine phosphatase, normally expressed by leukocytes.
  • CD68 is a glycoprotein, normally expressed by macrophages and monocytes.
  • VIM vimentin
  • CD68 CD45
  • PPRC fibrotic graft lesions
  • the GAPDH gene is used as a reference household gene, it is expressed in all cell types nucleated without distinction.
  • the uroplakin 1A gene is used as a reference gene, specific for urothelial cells.
  • the amplification program is as follows:
  • the plate containing the amplified DNA is removed from the automaton and stored at 4 ° C.
  • the raw results are retrieved from the PLC for normalization. 5. Standardization
  • the raw results are normalized according to the reference method used to calculate the amount of initial DNA, during a quantitative PCR. Briefly, the results of each patient were standardized and then linearized as follows:
  • GPDH household gene
  • the Cp being the number of amplification cycles before detection of the fluorescent signal by the apparatus.
  • Figures 1 and 2 show the correlation of the quantitative PCR results on the vimentin gene, correlated with the TEM scores. According to Figure 1, the coefficient of
  • Figure 4 shows that normalization with uroplakin greatly improves the test.
  • the slope of the regression line becomes positive and the expression of CD68 is positively regulated during phenotypic epithelial changes. This result is consistent with the anatomopatho logical examination on control biopsies.
  • test improves considerably when uroplakin is used as a reference gene for standardization of results.
  • vimentin CD68 and CD45 (PTPRC) is positively regulated in the phenomena of TEM in the kidney. This corresponds to what is actually observed in immunohistochemistry on patients' biopsies.
  • the method according to the invention reflects the actual situation of the patient. It also makes it possible to accurately and reliably monitor and diagnose the occurrence of epithelial phenotypic changes in the kidney.
  • Example 2 Detection of Urine-Expressed Genes in 26 Patients With or Without Epithelial Phenotypic Changes on Graft Biopsy and comparing the results obtained according to the conventional normalization method and the method according to the invention.
  • Example 1 Twenty-six clinically stable patients had a urine sample as described in Example 1, before biopsy of the graft. Of the 26 patients analyzed, 12 had no evidence of EMT while 14 had the signs. Cell pellets were prepared from these urine samples as described in Example 1. These cell pellets were then sent to Miltenyi Biotech Gmbh for RNA extraction, reverse transcription in complementary DNA, amplification, incorporation of fluorescent label. of DNA, quality controls, and hybridization on Agilent® complementary DNA chips. These chips make it possible to study quantitatively the expression of genes representing all the human genes. The transcriptome of each patient was therefore analyzed on a chip. In other words, a chip corresponds to a patient.
  • the expression level of the genes is expressed in fluorescence intensity after adjustment on internal fluorescence controls present on each chip: these are the raw data.
  • the median here corresponds to the brightness emitted and recorded for the gene located at the median of the list of genes analyzed on the complementary DNA chip.
  • a normalization by the median makes it possible to eliminate the biases related to the preparation of each of the chips.
  • An example of bias related to the preparation of the chip is the amount of fluorescent label incorporated into the patient's DNA or the temperature at which the chip is exposed. Normalization by the median is performed by applying to each gene tested on the complementary DNA chip for a given patient the following formula:
  • x represents each gene tested on the complementary DNA chip separately tested in this model the blood and SFN covariates are respectively the average value of the hemoglobin genes and the average value of the laminate from the expression measurements delivered by the complementary DNA chip of a given individual.
  • the setting of the blood and the layer in the covariate makes it possible to take into account contamination of the sample by blood and / or non-renal epithelial cells.
  • the inventors have observed on the one hand the enrichment of the term "kidney” in the UP TISSUE database in order to evaluate the consistency of the results obtained by the implementation of the normalization method according to the invention with respect to the studied organ, and on the other hand the enrichment of the term "intercellular junction” (GO: 000591 l ⁇ cell-cell junction) in the database GOTERM CC FAT to evaluate the coherence of the results with respect to the studied pathology, here ⁇ .
  • the method according to the invention has thus demonstrated its effectiveness for the early detection of the appearance of phenotypic changes.
  • Other applications than the detection of the TEM are possible thanks to the method according to the invention.
  • the detection of acute rejection of a renal graft can be diagnosed by the method according to the invention.
  • the pathological markers sought will be markers related to the activation of immune cells in the kidney, such as granzyme B (SEQ ID 23), perforin (SEQ ID 24), interferons or Fas-Ligand ( SEQ ID 25).
  • tubular, podocytic or inflammatory cells could be used by means of the method according to the invention for the diagnosis of any renal disease.
  • the evolution of a renal cancer in a patient could also be monitored by means of the method according to the invention by virtue of the detection of markers TP53 (SEQ ID 26), MIB 1 (SEQ ID 27), AgNOR, CD44 (SEQ ID 28). ), racemase, CD 10 (SEQ ID 31), keratin 7, vimentin, caveolin-1 (SEQ ID 29) and rol (SEQ ID 30).

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Abstract

L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro de pathologies rénales chez un patient. Selon l'invention, un tel procédé comprend les étapes suivantes : a) obtention d'un échantillon d'urine provenant dudit patient, b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie rénale et d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales, et c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie rénale par normalisation dudit au moins un marqueur de ladite pathologie rénale par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales.

Description

Méthode de quantification de marqueurs rénaux par dosage urinaire.
1. Domaine de l'invention
Le domaine de l'invention est celui de l'uronéphrologie. Plus précisément, l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de pathologies du système urinaire.
2. Art antérieur
Les maladies rénales peuvent atteindre les différents compartiments structurels du rein : les vaisseaux, les glomérules, les tubules, l'interstitium. Ces atteintes conduisent à l'insuffisance rénale aiguë et/ou chronique, leur évolution ultime étant la destruction complète des unités fonctionnelles du rein, remplacées par une expansion de la matrice extracellulaire, c'est-à-dire la fibrose rénale. À ces atteintes du rein correspondent diverses étiologies : obstruction des voies excrétrices, inflammation, auto -immunité, allergie, maladies de dépôts, hypertension, diabète, vasculopathies, ischémie, toxicité... Les maladies rénales peuvent toucher les reins natifs ou les allogreffes après une transplantation rénale. En France, on estime à 3000 nouveaux cas de patients greffés par an (rein, cœur, foie, moelle, poumon...). Le suivi systématique des patients transplantés a permis d'étudier les temps précoces des maladies rénales évoluant vers la fibrose. L'expression dans le tissu rénal de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), permettent de détecter précocement une maladie fïbrosante des tissus rénaux, qui peut être causée par l ' ischémie, le rej et, ou la toxicité des immunosuppresseurs, la cyclosporine A (CsA) en particulier (Slattery and al, Am J Pathol. 2005 August; 167(2): 395-407 ; Hertig et al, American Journal of Transplantation 2006, Galichon et al, Fibrogenesis Tissue Repair 2011 ; Galichon et al,. Transplantation, 2011).
La TEM est un processus dynamique au cours duquel des cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales et acquièrent des caractéristiques mésenchymateuses. Ces modifications affectent à la fois la morphologie de la cellule ainsi que son fonctionnement. Lorsqu'elle atteint les cellules tubulaires rénales, elle témoigne d'une évolution vers la fibrose et l'insuffisance rénale chronique (Hertig et al, J Am Soc Nephrol 2008). Il est donc nécessaire de surveiller l'apparition de ce phénomène chez les patients ayant subi une transplantation afin d'adapter ou modifier le traitement immunosuppresseur.
A l'heure actuelle, la méthode de référence mise en œuvre pour la détection et la surveillance de toute pathologie rénale est la biopsie. La biopsie consiste à prélever une carotte de tissu dans le rein par voie transcutanée, transveineuse, ou chirurgicale. Cet échantillon est ensuite soumis à un examen histologique pour détecter des signes éventuels de pathologie (destruction, infiltration cellulaire ou hypertrophie des compartiments glomérulaire, tubulaire, vasculaire ou interstitiel).
Cette méthode comprend toutefois de multiples inconvénients. Le prélèvement n'est pas sans risque pour le patient. De nombreuses complications sont observées comme l'hématurie, l'insuffisance rénale sur obstacle voire l'anurie, l'apparition d'hématomes dans la région périrénale, l'apparition de fistules artérioveineuses, et de manière plus rare l'hémorragie, la perte du greffon, le décès. Outre les risques liés à tout geste invasif, il est possible de réaliser la biopsie dans une région non représentative de l'état global du rein et par conséquent de sous- estimer ou surestimer la situation réelle du patient du fait de cet échantillonnage.
De plus, dans la mesure où les biopsies ne peuvent être réalisées systématiquement à intervalles rapprochés, cette méthode ne permet pas non plus de détecter précocement l'apparition d'une pathologie. Par ailleurs, pratiquer une biopsie rénale est une opération coûteuse, complexe, invasive et pénible pour le patient.
Il est donc nécessaire de trouver une méthode de diagnostic non-invasive, simple, économique, fiable, précoce et présentant le moins de risque possible pour le patient.
3. Objectifs de l'invention
L'invention a notamment pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur.
Plus précisément, un objectif de l'invention est de fournir, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic précoce des pathologies rénales ou des pathologies ayant des répercussions rénales.
Un autre objectif de l'invention est de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic non invasif.
L'invention a encore pour objectif de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic fiable et précis.
Un autre objectif de l'invention est de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic simple à réaliser.
Un autre objectif de l'invention est de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic plus économique. Un autre objectif de l'invention est de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de suivi de l'efficacité et la tolérance d'un traitement.
Enfin, un autre objectif de l'invention est de mettre en œuvre, dans au moins un mode de réalisation, un procédé de diagnostic moins douloureux pour le patient.
4. Exposé de l'invention
Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints, en tout ou partie, à l'aide d'un procédé de diagnostic in vitro de pathologies chez un patient.
Selon l'invention, un tel procédé comprend les étapes suivantes :
a) obtention d'un échantillon urinaire provenant dudit patient,
b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie et d' au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales, et
c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par normalisation dudit marqueur de ladite pathologie par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales.
Ainsi, l'invention repose sur l'utilisation des cellules et des microparticules contenues dans l'urine afin d'en extraire le matériel génétique et de comparer l'expression d'un gène d'intérêt, corrélé à une pathologie, avec l'expression d'un gène spécifique des cellules urinaires non touchées par la pathologie.
L'urine contient en effet une petite quantité de cellules urothéliales, provenant du renouvellement normal de l'épithélium des voies excrétrices urinaires. Elle peut également contenir, en quantité variable, en fonction notamment de la présence d'une pathologie rénale, des leucocytes, des cellules tubulaires ou glomérulaires rénales, du sang ...ainsi que des microparticules.
On entend par « microparticules » les structures vésiculaires complexes qui peuvent être libérées par la plupart des cellules au cours de processus d'activation ou d'apoptose. Elles sont composées d'une double couche de phospholipides exposant des protéines transmembranaires et des récepteurs et renferme des composants cytosoliques comme des enzymes, des facteurs de transcription et de l'A Nm provenant de leurs cellules mères. On entend par « cellules urothéliales » les cellules épithéliales transitionnelles composant Purothélium humain, du bassinet jusqu'à l'urètre. Ces cellules ont des formes diverses : cylindriques, en cerf- volant, en parapluie, en ballonnet.
On entend par « marqueur spécifique des cellules urothéliales » un gène spécifiquement exprimé par les cellules urothéliales ou microparticules urothéliales, que ce soit à l'intérieur des cellules ou à leur surface, et dont le niveau de synthèse par ladite cellule est indépendant des pathologies pouvant affecter les cellules rénales. Cette notion est donc différente de la notion de gène de ménage (housekeeping gene en anglais) dont l'expression est ubiquitaire, quelque soit le type cellulaire, la fonction de la cellule ou son état.
Bien que rares, il est possible, avec les méthodes de biologie moléculaire et de biochimie actuelles, d'extraire les acides nucléiques et les protéines des cellules et des microparticules contenues dans l'échantillon d'urine du patient. Afin d'éliminer le biais lié à la quantité de cellules et de microparticules dans l'échantillon, il est d'usage d'exprimer l'expression du gène d'intérêt en fonction de l'expression d'un gène de ménage tel que les gènes de la GAPDH (glycerladéhyde 3-phosphate deshydrogenase), l'ARN ribosomial 18S, la cyclophiline A ou B, la β-caténine ou encore l ' HPRT (Hypoxantine-guanine PhosphoRibosylTransférase) (Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction, S.A.Bustin, Journal of Molecular Endocrinology, 2000, 25, 169-193).
Cependant, cette méthode ne tient pas compte de la spécificité cellulaire des pathologies. Ainsi, la modification de l'expression d'un gène lié à une pathologie affectant un type cellulaire précis peut être masquée par l'importante expression du gène de ménage, provenant des autres types cellulaires présents dans l'urine.
Un des apports de l'invention est donc la normalisation de l'expression du gène d'intérêt par l'expression d'un gène indépendant des types cellulaires affecté. Cette étape de normalisation permet de déterminer un seuil d'expression du marqueur pathologique par rapport à un marqueur urinaire indépendant des variations quantitatives et qualitatives des cellules urinaires de provenance rénale. Il est alors possible de savoir si ce marqueur est exprimé de manière importante ou, au contraire, très faible. Cette caractéristique permet d'obtenir un test diagnostique fiable, précis et reflétant plus exactement l'état de santé du patient. Ainsi, le procédé selon l'invention peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour surveiller l'évolution d'une pathologie. De plus, travailler à partir d'un échantillon d'urine présente de nombreux avantages : l'échantillon est facilement accessible;
le prélèvement est non invasif et indolore,
le prélèvement est économique.
La simplicité de cette méthode permet également d'être mise en œuvre dans tous types de laboratoires d'analyse, sans faire appel à des compétences techniques particulières ou du matériel autre que celui habituellement utilisé. L'absence d'investissement particulier pour la mise en œuvre de cette méthode permet ainsi de diminuer les coûts d'analyse.
Enfin, ce procédé de normalisation peut s'appliquer à différentes pathologies, rénales ou non rénales, dès lors que ces pathologies modifient l'expression et/ou la quantité de cellules et/ou de microparticules urothéliales excrétées et présentes dans l'urine.
L'invention concerne en outre un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) comprend la détection du produit de transcription dudit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales et du produit de transcription dudit au moins un marqueur de ladite pathologie.
L'étude des produits de transcription est plus fiable que l'étude de la présence d'un gène dans le génome de la cellule. Il est en effet notoire que la présence d'un gène dans le génome d'une cellule n'est pas nécessairement corrélable à son expression dans ladite cellule, la régulation de l'expression d'un gène particulier étant soumise à de nombreux paramètres. La détection du produit de transcription permet donc d'obtenir un résultat plus précis et plus fiable.
Un autre objet de l'invention est un procédé dans lequel l'étape b) est mise en œuvre au moyen d'une technique d' amplification d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant la RT-PCR, la PCR quantitative, la PCR en point final, la PCR semi-quantitative ou leur combinaison.
On entend par PCR (Polymerase Chain Reaction), ou réaction de polymérisation en chaîne, la technique consistant à répliquer in vitro un fragment d'ADN ciblé en de nombreuses copies. On entend par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), ou réaction de polymérisation en chaîne suite à une transcription inverse, la synthèse in vitro d'ADN complémentaire à partir d'ARN messagers extraits. On entend par PCR quantitative, également appelée PCR en temps réel, la technique de réplication in vitro d'un fragment d'ADN ciblé permettant en outre de mesurer la quantité initiale de ce fragment cible. La PCR semi-quantitative se distingue de la PCR quantitative en ce que la PCR est interrompue en plusieurs points, permettant d'évaluer la quantité d'ADN initiale. Ce type de PCR est utile lorsque la quantité d'ADN est inhabituellement faible. LA PCR en point final associe la technique du Northern Blot à la PCR classique afin d'évaluer la quantité initiale d'ADN grâce à la comparaison des bandes sur gel d'agarose.
Ces méthodes, peu coûteuses à mettre en œuvre, présentent l'avantage de fournir un résultat rapide et fiable, compatible avec les exigences d'un test diagnostique.
L'invention concerne en outre un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) est mise en œuvre au moyen d'une technique d'hybridation d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant l'hybridation in situ (ISH), l'hybridation in situ avec marquage par fluorescence (FISH), la biopuce, le Northern Blot ou le Southern Blot.
L'invention concerne également un procédé de diagnostic in vitro dans lequel l'étape b) est mise en œuvre via une méthode de séquençage des acides nucléiques.
L'invention a encore pour un objet un procédé de diagnostic in vitro dans lequel ladite pathologie est une pathologie rénale et est choisie dans le groupe comprenant une fîbrose rénale, un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, un rejet de greffon, un cancer, les maladies glomérulaires (diabète, glomérulonéphrite extramembraneuse, lésions glomérulaires minimes, hyalinose segmentaire et focale...), les maladies tubulaires (nécrose tubulaire aiguë, expression de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse, atrophie, rejet cellulaire, obstruction des voies excrétrices..), les maladies interstitielles (inflammation, fîbrose), les maladies vasculaires du rein (hypertension artérielle, microangiopathie thrombotique, rejet humoral..).
On entend par « transition épithélio-mésenchymateuse » (TEM) est un processus biologique qui permet à une cellule épithéliale polarisée, interagissant normalement avec la membrane basale, d'engager de multiples transformations biochimiques qui lui permettent d'acquérir un phénotype de cellule mésenchymateuse, incluant une capacité migratoire augmentée, caractère invasif, résistance accrue à l'apoptose, et augmentation massive des composants de la matrice extracellulaire (Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial- mesenchymal transition, J Clin Invest. 119 (2009) 1420-1428). Les changements phénotypiques épithéliaux sont les marqueurs de TEM (par exemple, la vimentine et la β- caténine dans l'épithélium tubulaire) que l'ont peut étudier dans les tissus en situation clinique (Hertig A et al. Early epithelial phenotypic changes predict graft fîbrosis, J Am Soc Nephrol. 19 (2008) 1584-1591). Un autre objet de l'invention est un procédé au cours duquel ledit patient a reçu une greffe d'organe et ladite pathologie rénale est la présence de fibrose interstitielle, une atrophie tubulaire ou de marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse dans le greffon rénal.
Le procédé selon l'invention permet donc de détecter efficacement et précocement la survenue d'une pathologie rénale comme l'inflammation ou la TEM, induisant des changements phénotypiques épithéliaux dans le rein.
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro dans lequel au moins un marqueur génétique spécifique de ladite pathologie rénale est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45 (SEQ ID 1), CD68 (SEQ ID 2), et VIM (SEQ ID 3) ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
A titre de précision, le gène humain CD45 a également pour symbole PTPRC (Protein Tyrosine Phosphatase Receptor type C). Dans la description qui va suivre, le gène humain de CD45 ou PTRPC sera indifféremment désigné par le symbole CD45 ou PTPRC.
Les inventeurs ont découvert de façon surprenante que l'expression de ces gènes est considérablement augmentée dans les urines de patients greffés du rein cliniquement stables, mais dont la biopsie du greffon met en évidence la présence de changements phénotypiques épithéliaux. Cette sur-expression est corrélable à la présence de changements phénotypiques épithéliaux, survenant lors d'une transition épithélio-mésenchymateuse, et de l'atteinte tubulo- interstitielle sur les biopsies d'allogreffe rénale, ces biopsies étant effectuées dans le cadre d'un dépistage systématique trois mois après la transplantation. Il est possible, au sens de l'invention, de ne rechercher l'expression que d'un seul gène, marqueur spécifique d'une pathologie. Il est toutefois préférable, afin d'affiner le diagnostic, de rechercher une combinaison de différents gènes dont l'expression dans les urines rend compte de la présence d'une pathologie rénale particulière. On peut citer à titre d'exemple, la recherche de l'expression des gènes de CD45, ou PTPRC, et CD68, normalisée par l'uroplakine, pour détecter la présence de cellules inflammatoires dans le greffon. On peut également rechercher l'expression de certains marqueurs tumoraux. On peut citer, à titre d'exemple de marqueurs pour le carcinome à cellules claires, la recherche de la racemase, la caveolin-1 (SEQ ID 29), ROR1 (SEQ ID 30), CD10 (SEQ ID 31), kératine 7, vimentine (SEQ ID 3), TP53 (SEQ ID 26) dans le cadre de la surveillance d'un cancer rénal. On détermine une « séquence homologue » ou une « homologie de séquence » entre deux séquences nucléotidiques par la comparaison linéaire des séquences nucléotidiques par le logiciel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), algorithme blastn disponible sur le site du NCBI :
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlas t&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome).
Les paramètres choisis pour cette analyse sont les suivants :
- base de données (database): génome humain + transcrits (human genomic plus transcript) (Human G +T) ;
- pas d'exclusion des modèles ou des échantillons de séquence environnementaux ;
- optimisation du programme : blastn (Somewhat similar séquences) ;
- requêtes courtes (short queries) = paramètres automatiques pour la séquence d'entrée (automatically adjust parameters for input séquence) ;
- seuil (expect treshold) = 10 ;
- longueur de séquence (word size) = 11 ;
- appariement maximum (max match in a query range) = 0 ;
Concernant les paramètres d'enregistrement des résultats (scoring parameters), les paramètres sont fixés par défaut (match/mismatch scores = 2-3 ; gap costs = existence : 5, extension : 2). Enfin, aucun filtre n'est appliqué. Les paramètres étant en anglais sur le site, les noms exacts des paramètres sont indiqués entre parenthèses.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite pathologie est une pathologie modifiant la quantité de cellules et/ ou de microparticules excrétées dans l'urine.
Préférentiellement, ladite pathologie modifiant la quantité de cellules et/ou de microparticules excrétées dans l'urine est choisi parmi le groupe comprenant les maladies glomérulaires telle que la hyalinose segmentaire et focale, les maladies tubulaires tels que la nécrose tubulaire aiguë, les changements phénotypiques épithéliaux, le rejet cellulaire et les maladies interstitielles tels que le rejet aigu d'un greffon, la maladie de Sjôgren et la sarcoïdose.
Ainsi le procédé selon l'invention permet de détecter de manière fiable, rapide et non invasive le développement de maladies non rénales grâce à la collecte d'un échantillon d'urine du patient, dès lors que ces pathologies modifient le profil d'expression génique et/ou la quantité de cellules excrétées dans l'urine. La nécrose tubulaire se traduit par une augmentation du nombre de cellules tubulaires dans les urines, due à une importante desquamation des parois de l'épithélium tubulaire rénal. La hyalinose segmentaire ou focale s'accompagne d'une importante quantité de podocytes dans l'urine. L'augmentation du nombre de leucocytes est signe d'un rejet aigu d'un greffon.
Avantageusement, ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine 1A (SEQ ID 4), l'uroplakine 1 B (SEQ ID 5), l'uroplakine 2 (SEQ ID 6), l'uroplakine 3A (SEQ ID 7), l'uroplakine 3B (SEQ ID 8), l'uroplakine 3BL (SEQ ID 9), Bcasl (SEQ ID 10), CEP152 (SEQ ID 11), CRABP2 (SEQ ID 12), DNASE1 (SEQ ID 13), KRT20 (SEQ ID 14), PLEKHF1 (SEQ ID 15), PLEKHG4B (SEQ ID 16), RCN1 (SEQ ID 17), SEMA5B (SEQ ID 18), SULT2A1 (SEQ ID 19), TFF1 (SEQ ID 20), VILL (SEQ ID 21), ZNF720 (SEQ ID 22) ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%>, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
Parmi les cellules présentes dans les urines, seules les cellules urothéliales expriment ces gènes. Ces gènes sont spécifiquement et constamment exprimés par les cellules et/ou les microparticules urothéliales, indépendamment des pathologies rénales. Bien sûr, ces gènes sont présents dans le matériel génétique contenu dans le noyau de chaque cellule de l'organisme. Toutefois, tous les gènes ne sont pas exprimés de la même manière par toutes les cellules de l'organisme. Autrement dit, tous les gènes ne sont pas transcrits de l'ADN à l'ARNm puis traduits de l'ARNm en protéine dans toutes les cellules composant le corps humain. Cependant, les inventeurs ont découvert que, parmi les cellules et les microparticules contenues dans l'urine, ces gènes sont spécifiquement exprimés par les cellules urothéliales et ce, de manière constante. Ils constituent donc des référentiels de choix pour la normalisation de gènes liés à une pathologie affectant spécifiquement les cellules rénales ou modifiant leur quantité dans les urines. Les inventeurs tiennent à souligner que les gènes précités peuvent, de fait, être détectés dans d'autres types cellulaires, par exemple lorsque cette détection est basée sur la simple recherche de la présence d'un gène dans l'ADN total et non sur les gènes exprimés par un type cellulaire. Ces gènes peuvent également être exprimés par d'autres types cellulaires. Toutefois, leur intérêt dans la présente invention est lié au fait que, parmi tous les types cellulaires que l'on peut trouver dans un échantillon d'urine d'un patient, seules les cellules urothéliales expriment ces gènes, indépendamment des conditions pathologiques. Par conséquent, au sens de l'invention, la notion de marqueur spécifique des cellules urothéliales, ou de microparticules urothéliales, est à distinguer de la notion de gène de ménage. En effet, les gènes de ménage sont des gènes exprimés par toutes les cellules, quelque soit leur type cellulaire et leur fonction. A l'opposé, ce qu'on entend « marqueur spécifique des cellules urothéliales » correspond à des gènes exprimés uniquement par les cellules urothéliales parmi l'ensemble des cellules susceptibles de se retrouver dans un échantillon d'urine.
Par ailleurs, ces gènes ont été identifiés par les inventeurs comme permettant d'obtenir une excellente corrélation statistique (p value < 0,01) par rapport au procédé de normalisation par les gènes ménagers (ARN 18S, GAPDH...). La valeur p, ou p value en anglais, obtenue pour chaque gène est indiquée dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 - Marqueurs spécifiques des cellules urothéliales
Figure imgf000012_0001
De préférence, ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales ou des microparticules urothéliales est choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes humains UPK1A, UPK1B, UPK2 et UPK3A ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%>, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
On entend par « normalisation » l'élimination des biais liés à des erreurs de mesure ou de manipulation, et indépendants des variations biologiques. L'étape de normalisation permet donc de produire des résultats plus fiables. Normaliser en utilisant des gènes spécifiques des cellules affectées par la pathologie recherchée permet d'éliminer le biais lié à la proportion de ces mêmes cellules dans l'échantillon urinaire. En effet, la composition quantitative et qualitative de l'urine n'est pas fixe soit du fait du débit urinaire, soit du fait de la maladie. Le risque de mésestimer la progression réelle de la pathologie chez le patient est donc réel, et pourrait se révéler dommageable pour sa prise en charge thérapeutique.
À titre d'exemple, lorsque la technique de PCR quantitative a été utilisée, la normalisation constitue en un passage de l'échelle logarithmique (qui correspond au résultat brut) à une échelle linéaire en deux étapes :
(1) Cp marqueur spécifique de cellules urothéliales— Cp marqueur pathologique— ^Cp, le Cp, ou crossing point, étant le nombre de cycles d'amplification avant détection du signal fluorescent par l'appareil.
(2) Niveau d'expression du marqueur pathologique normalisé = 2 ACp
Lorsqu'une migration sur gel est mise en œuvre pour la visualisation des résultats, comme c'est le cas pour la PCR classique suivie d'une migration sur gel d'agarose, ou pour les techniques de Northern et Southern Blot, l'opérateur devra mesurer les densités optiques de chaque bande de migration avec tout logiciel usuel (Image J™, UN-SCAN-IT Gel™) et en faire le rapport pour déterminer le seuil d'expression du gène d'intérêt chez le patient. Le seuil d'expression se calcule alors comme suit :
Niveau d'expression du marqueur pathologique normalisé = densité optique marqueur pathologique/ densité optique marqueur cellules urothéliales.
L'invention a encore pour objet un procédé de diagnostic in vitro comprenant en outre une étape de comparaison du seuil d'expression dudit marqueur d'une pathologie rénale à un seuil d'expression inchangé par la maladie.
La comparaison avec un patient sain permet de constater l'influence positive ou négative d'une pathologie sur la régulation de l'expression d'un gène, normalement exprimé. Elle s'effectue comme suit :
(ACp patient - ACp sain)
Régulation d un gene = 2
Outre la comparaison avec un patient sain, il est possible de surveiller l'évolution d'un greffon ou d'un état pathologique grâce au procédé selon l'invention. Il est en effet possible de conserver les résultats précédents d'un patient et de les utiliser comme référentiel. Cette normalisation interne permet d'éliminer les biais dus aux différences interindividuelles. Elle permet également le suivi médical du patient et la surveillance de sa maladie ou du greffon.
L'invention comprend en outre un kit de diagnostic in vitro pour la détection de pathologies à partir d'un échantillon urinaire provenant d'un patient comprenant au moins un couple d'amorces pour la détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur spécifique d'une pathologie et au moins un couple d'amorces pour la détection d'au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales.
Avantageusement, ladite pathologie est une fîbrose rénale ou un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, et ledit au moins un marqueur spécifique d'une pathologie rénale est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et VIM.
Dans un mode de réalisation d'avantage préféré, ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine 1A, l'uroplakine 1B, l'uroplakine 2, l'uroplakine 3 A, l'uroplakine 3B, l'uroplakine 3BL, Bcasl, CEP 152, CRABP2, DNASE1, KRT20, PLEKHF1, PLEKHG4B, RCN1, SEMA5B, SULT2A1, TFF1, VILL, ZNF720 ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%>, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation du kit de diagnostic in vitro pour la détection d'une pathologie rénale, ladite pathologie rénale étant une fîbrose ou un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales.
5. Liste des figures
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel, donné à titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des dessins annexés, parmi lesquels :
la figure 1 présente un graphique représentant la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de la vimentine (VIM), normalisé par la GAPDH.
- la figure 2 illustre la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour la vimentine (VIM), lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine 1A UPK1A.
la figure 3 présente un graphique représentant la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de CD68, normalisé par la GAPDH.
- la figure 4 montre la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour CD68, lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine 1A UPK1A. la figure 5 représente la corrélation des scores de TEM avec les résultats de PCR urinaire de CD45, normalisé par la GAPDH.
la figure 6 décrit la corrélation des mêmes scores de TEM avec les mêmes résultats de PCR urinaire pour CD45 , lorsque ces derniers sont normalisés par le gène de l'uroplakine 1 A UPK1 A.
la figure 7 est un graphique représentant le nombre de gènes identifiés correspondant aux termes « rein » et « la jonction intercellulaire » en fonction de la méthode de normalisation.
la figure 8 est un graphique représentant la signifïance de l'enrichissement en gène du terme « rein » et du terme « jonction intercellulaire » en fonction de la méthode de normalisation.
6. Description d'un mode de réalisation de l'invention
Le principe général de l'invention repose sur la comparaison de l'expression d'un gène corrélé à un phénomène pathologique, désigné comme marqueur d'une pathologie ou marqueur pathologique, à l'expression d'un gène de référence dont le niveau d'expression dans les cellules urothéliales est indépendant des cellules affectées par la pathologie. Ce dernier est désigné comme marqueur spécifique des cellules urothéliales. Exemple 1 : Diagnostic des changements phénotypiques épithéliaux du greffon rénal grâce au procédé selon l'invention.
Afin d'évaluer la sensibilité du procédé de diagnostic selon l'invention, on effectue des biopsies rénales sur des patients ayant subi une transplantation d'organe et traités à la CsA. Parallèlement, un échantillon de leur urine est collecté. Dans ces échantillons, des marqueurs associés à un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales sont recherchés par PCR quantitative. Afin de démontrer la supériorité du procédé selon l'invention, les résultats de PCR quantitative seront normalisés en fonction d'un gène de référence uro thé liai, conformément au procédé selon l'invention, et en fonction d'un gène de ménage, conformément à la méthode classique et décrite dans la littérature.
Les biopsies de contrôle des patients greffés sont analysées par le laboratoire d'anatomopathologie de l'hôpital Tenon (Paris). L'expression protéique de la vimentine et de la β-caténine, marqueurs de TEM, est recherchée selon les méthodes d'immunohistochimie bien Λ Λ
14
connues de l'homme de l'art. Le score de TEM est déterminé en fonction du pourcentage de tubules rénaux exprimant les marqueurs de TEM, c'est-à-dire la vimentine et la β-caténine (Hertig et al, American Journal of Transplantation 2006). Ces scores s'expriment comme suit : score = 0 : pas de TEM;
- score = 1 : <10% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; score = 2 : 10-24% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; score = 3 : 25-50% des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM; score = 4 : >50%> des tubules rénaux sur la biopsie présentent les marqueurs de TEM. On considère que le patient est positif pour la TEM dès que le score est supérieur ou égal à 2.
1. Prélèvement d'urine et préparation du lysat cellulaire
On prélève, chez ces patients, 50 ml d'urine fraîche dans un tube Falcon®. Le prélèvement est effectué dans les trois semaines précédant la biopsie afin d'éviter la présence d'hématie dans les urines. Les patients choisis ne présentent aucune trace d'infection urinaire, et n'avaient pas de diurèse résiduelle avant la transplantation. La première miction de la journée n'est pas utilisée.
L'échantillon urinaire est centrifugé à 2000 rpm pendant 20 min, à température ambiante (Tamb). Un volume de 2 ml de surnageant est stocké à -80°C. Le reste du surnageant est éliminé. Le culot, contenant les cellules et les minéraux, est repris dans un volume de 15 ml de solution tampon PBS1X. La suspension cellulaire est à nouveau centrifugée pour éliminer les débris pendant 10 min, à 2000 rpm, Tamb- Le surnageant est éliminé, le culot est égoutté par retournement du tube avant d'être resuspendu dans 150 μΐ de tampon de lyse RLT, supplémenté par 1% volumique de β-mercapto-éthanol (solution à 14,3 M). Le tampon RLT est fourni par les laboratoires Qiagen, dans le kit RNeasy® micro. A cette étape, le lysat ainsi obtenu peut être conservé à -80°C ou être directement utilisé pour procéder à l'extraction d'ARN.
2. Extraction des ARN
Les ARN messagers (ARNm) sont extraits à partir des cellules présentes dans l'échantillon urinaire. Les marqueurs indicateurs de pathologie, de fibrose ou de la TEM ne sont généralement exprimés que lorsque ces phénomènes apparaissent. Étudier leur transcription est donc plus pertinent que rechercher leur présence dans le génome.
Les AR sont extraits à partir du lysat cellulaire, préparé comme décrit précédemment, grâce au kit RNeasy® micro (Qiagen) conformément au protocole fourni par le fabricant. Plus précisément, le protocole suivi est le protocole « Tissus obtenus par microdissection ». Brièvement, un volume d'éthanol 70% stérile est ajouté au lysat homogénéisé, conformément aux indications du protocole. Le lysat est déposé, en tout ou partie, dans une colonne RNeasy®, fournie avec le kit. Les colonnes sont centrifugées 15 secondes, à une vitesse de rotation supérieure à 10 000 rpm, à 4°C. L'effluent est éliminé. La colonne est lavée par du tampon RW1, fourni avec le kit. Les ARN sont élués, puis récupérés dans 14 μΐ d'eau dénuée de RNAse.
3. Synthèse de l'ADN complémentaire.
La transcription reverse des ARN extraits précédemment est réalisée à l'aide du kit QuantiTect® Reverse Transcription (Qiagen). Brièvement, la solution d'ARN produite précédemment est additionnée de tampon gDNA Wipeout Buffer, fourni dans le kit, avant d'être incubé à 42°C, pendant 2 min. Cette étape permet d'éliminer l'ADN génomique résiduel. Le mélange rétro-transcriptionnel contient les bases nucléiques (RT Primer Mix), la rétro- transcriptase (Quantiscript® Reverse Transcriptase) et le tampon réactionnel (Quantiscript® RT Buffer). Il est ajouté à la solution d'ARN. Le mélange est incubé 15 min, à 42°C, pour que la rétro-transcription s'effectue. Le mélange est ensuite incubé 3 min, à 95°C, afin d'inactiver la rétro -transcriptase. La solution d'ADN complémentaire ainsi prête peut être conservée ou diluée au l/10eme avant analyse. 4. PCR quantitative.
La PCR quantitative est utilisée pour évaluer la quantité initiale de produits de transcirption dans les cellules. Elle permet ainsi de déterminer si un gène est sur-régulé ou sous-régulé.
Brièvement, on prépare un mélange réactionnel contenant :
- 5 μΐ de SYBR® Green Master Mix 2X (Laboratoires Roche) / puits,
0,25 μΐ de chaque amorce à 10 μΜ (Laboratoires Roche) / puits,
1,5 μΐ d'eau stérile / puits. Λ r
16
7 μΐ de ce mélange réactionnel sont déposés par puits, dans une plaque de 96 puits (Laboratoires Roche). 3 μΐ d'ADN complémentaire de chaque patient, dilué au l/10eme, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite centrifugée à 1500 g, pendant 2 min, avant d'être introduite dans l'automate LightCycler 480 (Laboratoires Roche) pour amplification.
Les couples d'amorces utilisés sont fournis par les laboratoires Roche :
Tableau 2- Séquences des couples d'amorces des gènes humains de la vimentine, CD45 (ou PTPRC), GAPDH et uroplakine 1 A
Figure imgf000018_0001
La vimentine est une protéine, appartenant à la famille des filaments intermédiaires. Le symbole du gène la codant est VIM. Elle participe au cytosquelette. CD45, ou PTPRC, est une protéine tyrosine phosphatase transmembranaire, normalement exprimée par les leucocytes. CD68 est une glycoprotéine, normalement exprimée par les macrophages et les monocytes.
Les gènes de la vimentine (VIM), CD68 et CD45 (PTPRC), ici nos gènes d'intérêt, semblent être particulièrement surexprimés dans les tubules rénaux et/ou l'interstitium rénal lors des atteintes fibrosantes du greffon, qui se manifestent aussi en immunohistochimie par la présence de TEM dans les biopsies rénales. Le gène de la GAPDH est utilisé comme gène de ménage de référence, il est exprimé dans tous les types cellulaires nucléés sans distinction. Le gène de l'uroplakine 1A est utilisé comme gène de référence, spécifique aux cellules urothéliales.
Le programme d'amplification est le suivant :
1 cycle de préincubation (5 min à 95 °C)
45 cycles d'amplification (15 secondes à 60°C; 15 secondes à 72°C)
1 courbe de fusion (5 secondes à 96°C, 1 min à 60°C, puis chauffage lent de
0,06°C/s pour parvenir à 96°C avec 10 acquisitions /°C). 1 cycle de refroidissement (30 secondes à 40°C).
La plaque contenant l'ADN amplifié est retirée de l'automate, puis conservée à 4°C. Les résultats bruts sont récupérés depuis l'automate pour normalisation. 5. Normalisation
Les résultats bruts sont normalisés selon la méthode de référence utilisée pour calculer la quantité d'ADN initiale, lors d'une PCR quantitative. Brièvement, les résultats de chaque patient ont été normalisés puis linéarisés comme suit:
par rapport à un gène de ménage (GAPDH) :
Cp GAPDH - Cp gène d'intérêt = ACp,
Gène d'intérêt / GAPDH = 2 ACp
- par rapport à l'uroplakine, marqueur spécifique des cellules urothéliales :
Cp UPK - Cp gène d'intérêt = ACp,
Gène d'intérêt / uroplakine = 2 Δ("Ρ
le Cp étant le nombre de cycles d'amplification avant détection du signal fluorescent par l'appareil.
6. Résultats
Les figures 1 et 2 présentent la corrélation des résultats de PCR quantitative sur le gène de la vimentine, en corrélation avec les scores de TEM. Selon la figure 1, le coefficient de
2
corrélation R est très faible et la pente de la droite de régression est nulle. Il est donc impossible de relier de manière concluante l'expression de la vimentine à la présence de changement phénotypique épithéliaux dans les cellules rénales. Toutefois, la normalisation des résultats par l 'uroplakine, conformément au procédé selon l 'invention, améliore significativement le coefficient de régression. De plus, la pente de la droite de régression devient positive, corrélant ainsi de manière claire et sans équivoque l'expression du gène de la vimentine à des scores de TEM de plus en plus élevés. Ces résultats sont alors cohérents avec les résultats de biopsies.
De même, d'après la figure 3, la pente de la droite de régression reliant l'expression de CD68 avec la présence de la TEM est très faible. Ceci signifierait que l'expression de CD68 n'est pas corrélée à l'apparition de changements phénotypiques épithéliaux dans le rein. Or, l'expression de CD68 est positivement régulée dans les affections fïbrosantes rénales (Anders et al, Kidney Int., 2011). Il est donc manifeste que la méthode classique de normalisation par un gène de ménage conduit à de faux négatifs.
A contrario, la figure 4 montre que la normalisation par l'uroplakine améliore considérablement le test. La pente de la droite de régression devient positive et l'expression de CD68 est positivement régulée lors des phénomènes de changements phénotypiques épithéliaux. Ce résultat concorde avec l'examen anatomopatho logique sur les biopsies de contrôle.
Concernant l'expression de CD45 (PTPRC), la surexpression de CD45 (PTPRC) dans le tissu rénal est associée à une évolution défavorable des allogreffes de rein (Scherer et al, Nephrol Dial. Transplant. , 2009). La comparaison des figures 5 et 6 permet de constater que le test par PCR à partir d'urines est considérablement amélioré lorsque la normalisation est effectuée par l'uroplakine.
En conclusion, la normalisation des résultats par rapport à la GAPDH ne permet pas de discriminer efficacement les patients présentant une TEM des patients « sains », et ce, quel que soit le gène d'intérêt étudié. Comme l'indiquent les pentes, respectivement nulle et négative, des droites de régression des figures 1 et 3, la normalisation par le gène ménager GAPDH, conduit à l'obtention de faux négatifs. Le clinicien ne peut donc se fier aux résultats de ce type d'analyse. Le recours à une biopsie de confirmation reste alors inévitable.
Le test s'améliore considérablement lorsque l'uroplakine est utilisé comme gène de référence pour la normalisation des résultats. D'après les figures 2, 4 et 6, l'expression de la vimentine, CD68 et CD45 (PTPRC) est positivement régulée dans les phénomènes de TEM dans le rein. Ceci correspond à ce qui est effectivement observé en immunohistochimie sur les biopsies des patients. Ainsi, le procédé selon l'invention reflète la situation réelle du patient. Il permet également de surveiller et diagnostiquer avec précision et fiabilité l'apparition de changements phénotypiques épithéliaux dans le rein.
Il est donc clair que le procédé selon l'invention permet d'obtenir des résultats fiables, précis et cohérents avec la situation réelle du patient. De plus, ce procédé est indolore pour le patient, rapide, simple et économique à mettre en œuvre. Il est de plus parfaitement adapté à la surveillance de l'apparition d'une TEM chez un patient ayant subi une greffe d'organe.
Exemple 2: Détection des gènes exprimés dans les urines de 26 patients présentant ou non des changements phénotypiques épithéliaux sur la biopsie du greffon et comparaison des résultats obtenus selon le procédé de normalisation classique et le procédé selon l'invention.
Vingt-six patients cliniquement stables ont eu un prélèvement urinaire comme décrit à l'exemple 1, avant biopsie du greffon. Sur les 26 patients analysés, 12 ne présentaient aucun signe de TEM tandis que 14 en présentaient les signes. Des culots cellulaires ont été préparés à partir de ces échantillons urinaires comme décrit à l'exemple 1. Ces culots cellulaires ont ensuite été adressés à la société Miltenyi Biotech Gmbh pour extraction des ARN, transcription inverse en ADN complémentaire, amplification, incorporation de marqueur fluorescent de l'ADN, contrôles qualités, et hybridation sur puces à ADN complémentaire Agilent®. Ces puces permettent d'étudier quantitativement l'expression de gènes représentant la totalité des gènes humains. Le transcriptome de chaque patient a donc été analysé sur une puce. Autrement dit, une puce correspond à un patient. Le niveau d'expression des gènes est exprimé en intensité de fluorescence après ajustement sur des témoins de fluorescence internes présents sur chaque puce : ce sont les données brutes. La médiane correspond ici à la luminosité émise et enregistrée pour le gène situé à la médiane de la liste des gènes analysés sur la puce à ADN complémentaire .
Une normalisation par la médiane permet d'éliminer les biais liés à la préparation de chacune des puces. Un exemple de biais lié à la préparation de la puce est la quantité de marqueur fluorescent incorporé à l'ADN du patient ou la température à laquelle la puce est exposée. La normalisation par la médiane s'effectue en appliquant à chaque gène testé sur la puce à ADN complémentaire pour un patient donné la formule suivante:
Valeur normalisée = (valeur brute) / (médiane des valeurs de tous les gènes testé sur la puce) Un modèle linéaire généralisé de famille binomiale a été créé en utilisant le logiciel R :
model<-glm(EPC~x, family=binomial, offset=sang+SFN) où :
- model est le modèle
- EPC est la variable catégorielle binaire prédite (présence ou non de Changements Phénotypiques Epithéliaux sur la biopsie)
- x représente chaque gène testé sur la puce à ADN complémentaire testé séparément dans ce modèle - les covariables sang et SFN sont respectivement la valeur moyenne des gènes de l'hémoglobine et la valeur moyenne de la stratifme à partir des mesures d'expression livrées par la puce à ADN complémentaire d'un individu donné.
La mise en covariable du sang et de la stratifme permet de prendre en compte les contaminations du prélèvement par du sang et/ou des cellules épithéliales non rénales.
La signifïcativité (valeur p) de l'amélioration de la prédiction de la variable EMT par l'introduction de x dans le modèle est fournie par la commande suivante :
anova(model,test= "Chisq")[2,5] .
Les gènes dont la p-value obtenue est < 0.05 ont été sélectionnés pour chaque méthode de normalisation, et utilisés comme listes de gènes pour une étude fonctionnelle d'enrichissement par le logiciel DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov). La totalité des gènes évalués par la puce à ADN complémentaire a été utilisé comme liste de référence (background). Ces résultats sont présentés aux figures 7 et 8, ainsi que dans le tableau 3 ci-dessous : Tableau 3 - Enrichissement des termes « rein » et « jonction intercellulaire » en fonction de la méthode de normalisation.
Valeur p
Nombre de
Base de Coefficient ajustée par la
Normalisation Terme gènes
donnée d'enrichissement méthode de identifiés
Bonferroni aucune UP TISSUE Kidney 8 2,68 7,15E-01
GO:0005911~
GOTERM C
aucune cell-cell 1 2,31 l,00E+00
C FAT
junction
médiane UP TISSUE Kidney 172 0,90 l,00E+00
GO:0005911~
GOTERM C
médiane cell-cell 22 0,80 l,00E+00
C FAT
junction
18S UP TISSUE Kidney 220 1,15 9,98E-01
GO:0005911~
GOTERM C
18S cell-cell 24 1,01 l,00E+00
C FAT
junction
UPK1A UP TISSUE Kidney 222 1,42 l,13E-05
GO:0005911~
GOTERM C
UPK1A cell-cell 57 2,70 l,39E-09
C FAT
junction Les inventeurs ont observé d'une part l'enrichissement du terme « rein » (kidney) dans la base de données UP TISSUE pour évaluer la cohérence des résultats obtenus par la mise en œuvre du procédé de normalisation selon l'invention par rapport à l'organe étudié, et d'autre part l'enrichissement du terme « jonction intercellulaire» (GO :000591 l~cell-cell junction) dans la base de données GOTERM CC FAT pour évaluer la cohérence des résultats par rapport à la pathologie étudiée, ici ΓΕΜΤ.
Le tableau 3 et les figures 7 et 8 qui en sont tirées permettent de montrer que la normalisation par l'uroplakine 1 A permet d'obtenir l'enrichissement le plus significatif pour ces deux termes, enrichissement qui reste significatif uniquement pour la normalisation par l'uroplakine 1 A lorsqu'on applique la correction par la méthode de Bonferroni pour prendre en compte les tests multiples. La normalisation par uroplakine 1 A permet d'identifier le plus grand nombre de gènes appartenant à ces deux termes comme associés à la présence de Changements Phénotypiques Epithéliaux dans la biopsie rénale. 7. Applications
Le procédé selon l'invention a ainsi démontré son efficacité pour la détection précoce de l'apparition de changements phénotypiques. D'autres applications que la détection de la TEM sont réalisables grâce au procédé selon l'invention. La détection du rejet aigu d'un greffon rénal peut être diagnostiquée grâce au procédé selon l'invention. En ce cas, les marqueurs pathologiques recherchés seront des marqueurs liés à l'activation des cellules immunitaires dans le rein, tels que le granzyme B (SEQ ID 23), la perforine (SEQ ID 24), les interferons ou le Fas-Ligand (SEQ ID 25).
La détection de cellules tubulaires, podocytaires ou inflammatoires pourrait être utilisée grâce au procédé selon l'invention pour le diagnostic de toute maladie rénale. L'évolution d'un cancer rénal chez un patient pourrait également être surveillée grâce au procédé selon l'invention grâce à la détection des marqueurs TP53 (SEQ ID 26), MIB 1 (SEQ ID 27), AgNOR, CD44 (SEQ ID 28), racemase, CD 10 (SEQ ID 31), kératine 7, vimentine, caveoline-1 (SEQ D 29) et rorl (SEQ ID 30).

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de diagnostic in vitro de pathologies chez un patient comprenant les étapes suivantes :
a) obtention d'un échantillon urinaire provenant dudit patient,
b) détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur de ladite pathologie et d' au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales, et
c) détermination d'un seuil d'expression dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par normalisation dudit au moins un marqueur de ladite pathologie par ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales.
Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape b) comprend la détection du produit de transcription dudit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales et du produit de transcription dudit au moins un marqueur de ladite pathologie.
Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'étape b) est mise en œuvre au moyen d'une technique d'amplification d'acides nucléiques choisie parmi le groupe comprenant la RT-PCR, la PCR quantitative, la PCR en point final, la PCR semi-quantitative ou leur combinaison.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite pathologie est une pathologie rénale choisie parmi le groupe comprenant une fïbrose rénale, un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales, un rejet de greffon, un cancer, les maladies glomérulaires, les maladies tubulaires, les maladies interstitielles et les maladies vasculaires du rein.
Procédé selon la revendication 4 dans lequel ledit au moins un marqueur spécifique de ladite pathologie rénale est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et VIM ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%>, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel ladite pathologie est une pathologie modifiant la quantité de cellules ou de microparticules excrétées dans l'urine.
Procédé selon la revendication 6 dans lequel ladite pathologie modifiant la quantité de cellules urothéliales ou de microparticules urothéliales excrétées dans l'urine est choisie parmi le groupe comprenant la hyalinose segmentaire et focale, la nécrose tubulaire aiguë, les changements phénotypiques épithéliaux, le rejet aigu du greffon, la maladie de Sjôgren, la sarcoïdose.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel ledit au moins un marqueur spécifique des cellules urothéliales et/ou des microparticules urothéliales est choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de l'uroplakine 1A, l'uroplakine 1B, l'uroplakine 2, l'uroplakine 3A, l'uroplakine 3B, l'uroplakine 3BL, Bcasl, CEP152, CRABP2, DNASE1, KRT20, PLEKHF1, PLEKHG4B, RCN1, SEMA5B, SULT2A1, TFF1, VILL, ZNF720 ainsi que les gènes présentant une homologie de séquence d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%, de préférence d'au moins 95%, de préférence d'au moins 99% avec ceux-ci.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 comprenant en outre une étape de comparaison dudit seuil d'expression dudit marqueur d'une pathologie normalisé à un seuil d'expression de gène dont l'expression n'est pas modifiée par la maladie.
Kit de diagnostic in vitro pour la détection d'un changement phénotypique des cellules épithéliales rénales à partir d'un échantillon urinaire provenant d'un patient comprenant au moins un couple d'amorces pour la détection, dans ledit échantillon, d'au moins un marqueur spécifique d'une pathologie choisi parmi le groupe comprenant les gènes humains de CD45, CD68 et VIM et au moins un couple d'amorces pour la détection de l'uroplakine 1A. Utilisation du kit de diagnostic in vitro selon la revendication 10 pour la détection d'une pathologie rénale, ladite pathologie rénale étant des changements phénotypiques épithéliaux du rein.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755148A (zh) * 2016-04-29 2016-07-13 冯宾 一种检测骨关节炎的试剂盒及其方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3098147A1 (fr) * 2018-05-11 2019-11-14 Laboratory Corporation Of America Holdings Compositions et methodes pour detecter une fibrose renale
CN109055534B (zh) * 2018-09-13 2021-08-03 南京市妇幼保健院 用于诊断压力性尿失禁的血清lncRNA标志物、引物组、试剂盒及应用
US11216742B2 (en) 2019-03-04 2022-01-04 Iocurrents, Inc. Data compression and communication using machine learning

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2810677A1 (fr) * 2000-06-27 2001-12-28 Urogene Procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate et kit de mise en oeuvre
WO2002028999A2 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Gene Logic, Inc. Profils d'expression genique dans les cellules granulocytaires
WO2010083121A1 (fr) * 2009-01-15 2010-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Panel de biomarqueurs pour le diagnostic et la prédiction d'un rejet de greffon
US20100196426A1 (en) * 2008-02-01 2010-08-05 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis and prognosis of medical diseases and conditions

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60137208D1 (de) * 2000-03-24 2009-02-12 Cell Genesys Inc Menschliche zellspezifische urotheliale regulatorische sequenzen der transkription des uroplakins, dessen vektoren und verwendungsverfahren
US20030099996A1 (en) * 2001-10-18 2003-05-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. VELP2, a vascular endothelial cell specific and LIM domain containing molecule and uses therefor
WO2009061847A2 (fr) * 2007-11-05 2009-05-14 University Of Rochester Procédés de diagnostic et de traitement de troubles pelviens douloureux par l'intermédiaire de la bêta-caténine
US20110262921A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Sabichi Anita L Test for the Detection of Bladder Cancer

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2810677A1 (fr) * 2000-06-27 2001-12-28 Urogene Procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate et kit de mise en oeuvre
WO2002028999A2 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Gene Logic, Inc. Profils d'expression genique dans les cellules granulocytaires
US20100196426A1 (en) * 2008-02-01 2010-08-05 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis and prognosis of medical diseases and conditions
WO2010083121A1 (fr) * 2009-01-15 2010-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Panel de biomarqueurs pour le diagnostic et la prédiction d'un rejet de greffon

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERS ET AL., KIDNEY INT., 2011
ANONYMOUS: "GeneCards Report for TFF1", 1 May 2012 (2012-05-01), XP055028740, Retrieved from the Internet <URL:http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TFF1&search=tff1> [retrieved on 20120601] *
ANONYMOUS: "Using endogenous control genes in real-time RT-PCR", 2012, XP055028741, Retrieved from the Internet <URL:http://www.qiagen.com/products/pcr/quantitect/housekeepinggenes.aspx> [retrieved on 20120601] *
D ANGLICHEAU ET AL: "Discovery and Validation of a Molecular Signature for the Noninvasive Diagnosis of Human Renal Allograft Fibrosis.", TRANSPLANTATION, 15 May 2012 (2012-05-15), XP055028802, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22592886> [retrieved on 20120604] *
DAVID M. SMALLEY ET AL: "Isolation and Identification of Potential Urinary Microparticle Biomarkers of Bladder Cancer", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 7, no. 5, 2 May 2008 (2008-05-02), pages 2088 - 2096, XP055047675, ISSN: 1535-3893, DOI: 10.1021/pr700775x *
GALICHON ET AL., FIBROGENESIS TISSUE REPAIR, 2011
GALICHON ET AL., TRANSPLANTATION, 2011
GOMEZ-ALAMILLO C ET AL: "Analysis of Urinary Gene Expression of Epithelial-Mesenchymal Transition Markers in Kidney Transplant Recipients", TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, ELSEVIER INC, ORLANDO, FL; US, vol. 42, no. 8, 1 October 2010 (2010-10-01), pages 2886 - 2888, XP027429381, ISSN: 0041-1345, [retrieved on 20101021], DOI: 10.1016/J.TRANSPROCEED.2010.07.051 *
HERTIG A ET AL.: "Early epithelial phenotypic changes predict graft fibrosis", JAM SOC NEPHROL., vol. 19, 2008, pages 1584 - 1591
HERTIG ET AL., AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION, 2006
HERTIG ET AL., JAM SOC NEPHROL, 2008
JONATHON OLSBURGH ET AL: "Uroplakin gene expression in normal human tissues and locally advanced bladder cancer", THE JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 199, no. 1, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 41 - 49, XP055028760, ISSN: 0022-3417, DOI: 10.1002/path.1252 *
KALLURI R; WEINBERG RA.: "The basics of epithelial- mesenchymal transition", J CLIN INVEST., vol. 119, 2009, pages 1420 - 1428
L MENGUAL ET AL: "Gene Expression Signature in Urine for Diagnosing and Assessing Aggressiveness of Bladder Urothelial Carcinoma: online supplementary material", 1 May 2010 (2010-05-01), XP055028748, Retrieved from the Internet <URL:http://clincancerres.aacrjournals.org/content/suppl/2010/04/20/1078-0432.CCR-09-3373.DC1/Supplementary_Data.pdf> [retrieved on 20120601] *
L. MENGUAL ET AL: "Gene Expression Signature in Urine for Diagnosing and Assessing Aggressiveness of Bladder Urothelial Carcinoma", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 16, no. 9, 1 May 2010 (2010-05-01), pages 2624 - 2633, XP055028747, ISSN: 1078-0432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-3373 *
M HANKE ET AL: "Detailed Technical Analysis of Urine RNA-Based Tumor Diagnostics Reveals ETS2/Urokinase Plasminogen Activator to Be a Novel Marker for Bladder Cancer: online supplementary material", CLINICAL CHEMISTRY, 1 January 2007 (2007-01-01), XP055028758, Retrieved from the Internet <URL:http://www.clinchem.org/content/53/12/2070/suppl/DC1> [retrieved on 20120601] *
M. HANKE ET AL: "Detailed Technical Analysis of Urine RNA-Based Tumor Diagnostics Reveals ETS2/Urokinase Plasminogen Activator to Be a Novel Marker for Bladder Cancer", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 53, no. 12, 2007, pages 2070 - 2077, XP055028752, ISSN: 0009-9147, DOI: 10.1373/clinchem.2007.091363 *
MAHA YEHIA ET AL: "Predictors of chronic allograft nephropathy from protocol biopsies using histological and immunohistochemical techniques", NEPHROLOGY, vol. 11, no. 3, 1 June 2006 (2006-06-01), pages 261 - 266, XP055028782, ISSN: 1320-5358, DOI: 10.1111/j.1440-1797.2006.00561.x *
OSAMU HOTTA ET AL: "Urinary macrophages as activity markers of renal injury", CLINICA CHIMICA ACTA, vol. 297, no. 1-2, 1 July 2000 (2000-07-01), pages 123 - 133, XP055028749, ISSN: 0009-8981, DOI: 10.1016/S0009-8981(00)00239-4 *
PIERRE GALICHON ET AL: "Epithelial to mesenchymal transition as a biomarker in renal fibrosis: are we ready for the bedside?", FIBROGENESIS & TISSUE REPAIR, vol. 4, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 11, XP055028750, ISSN: 1755-1536, DOI: 10.1186/1755-1536-4-11 *
S.A.BUSTIN: "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction", JOURNAL OF MOLECULAR ENDOCRINOLOGY, vol. 25, 2000, pages 169 - 193
SCHERER ET AL., NEPHROL DIAL. TRANSPLANT., 2009
See also references of EP2768973A1
SLATTERY, AM J PATHOL., vol. 167, no. 2, August 2005 (2005-08-01), pages 395 - 407

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755148A (zh) * 2016-04-29 2016-07-13 冯宾 一种检测骨关节炎的试剂盒及其方法
CN105755148B (zh) * 2016-04-29 2019-03-29 冯宾 一种检测骨关节炎的试剂盒及其方法

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