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WO2012121071A1 - VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター - Google Patents

VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター Download PDF

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WO2012121071A1
WO2012121071A1 PCT/JP2012/055027 JP2012055027W WO2012121071A1 WO 2012121071 A1 WO2012121071 A1 WO 2012121071A1 JP 2012055027 W JP2012055027 W JP 2012055027W WO 2012121071 A1 WO2012121071 A1 WO 2012121071A1
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WO
WIPO (PCT)
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vector
gene
rna
rnas
cells
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2012/055027
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English (en)
French (fr)
Inventor
水口　裕之
和史 形山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a highly safe gene therapy vector and an adenovirus vector that can be effectively used in life science research.
  • the present invention also relates to an adenovirus vector production / amplification cell capable of producing and / or amplifying the adenovirus vector.
  • Ad vectors Adenoviral vectors
  • Ad vectors have the highest gene transfer efficiency among existing gene therapy vectors and can be transferred to a wide range of cell types with a wide range of infections, so they are used in approximately 25% of gene therapy clinical research worldwide.
  • Ad vectors When an Ad vector is administered to a living body, (1) an innate immune reaction elicited by a vector particle constituent protein or vector genomic DNA occurs within several hours after the administration of the vector, and (2) derived from a foreign gene product and virus introduced by the vector. An acquired immune response to the protein is induced within a few days. Therefore, the development of Ad vectors that can avoid these immune reactions is urgently needed to develop highly safe gene therapy methods.
  • Ad vector development aimed at avoiding innate immune reactions:
  • various inflammatory mediators such as IL-6, IL-12, TNF, RANTES, MIP-2, and IFN- ⁇ / ⁇ / ⁇ are produced within 3 hours of administration.
  • Over 90% of systemically administered Ad vectors migrate to the liver (parenchymal cells and non-parenchymal cells including Kupffer cells), but many inflammatory cytokines are secreted primarily in the spleen, not in the liver. Therefore, an Ad vector that suppresses migration to the spleen has low production of inflammatory cytokines.
  • Non-patent Document 1 Koizumi et al. , 2007
  • IL-6 is hardly produced in the triple-modified Ad vector in which the binding properties to CAR, integrin, and heparan sulfate are deleted (Non-patent Document 2: Koizumi et al., 2006).
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • Ad vector development aimed at avoiding acquired immune reactions: When an Ad vector is administered to a living body, it usually shows transient gene expression for several weeks to several months. However, immunodeficient mice show gene expression over a long period of time from several months to more than one year (in some cases, a lifetime), so that transgenic cells are eliminated by the action of acquired immune responses centered on cellular immunity. This is considered to be a cause of transient expression of the Ad vector.
  • Conventional Ad vectors are designed to eliminate viral protein production by removing the E1 gene region essential for virus growth and viral protein production. There is a slight production of protein, which can be the target of the acquired immune system. The immunological properties of the foreign gene product introduced by the vector also affect the activation of the acquired immune system.
  • a gutted Ad vector has been developed in which all viral genomes other than the viral origin of replication and the region necessary for packaging have been removed.
  • this vector When this vector is used, long-term gene expression is observed even in normal mice (Non-patent Document 3: Dudley et al., 2004; Non-patent Document 4: Palmer et al., 2003).
  • the gutted Ad vector is a big problem that mass production is difficult and that a helper virus necessary for vector production is mixed, which is a big obstacle in drug development that should ensure uniformity.
  • an anti-Ad antibody is produced in an individual administered with an Ad vector, the effect is attenuated by systemic administration of the vector after the second time.
  • Non-patent literature 5 Roberts et al., 2006; Non-Patent Document 6: Sakurai et al., 2003).
  • VA-RNAs Virus-associated RNAs
  • VA-RNA I and / or VA-RNA II Virus-associated RNAs encoded by the Ad vector are recognized by innate immune receptors in the cytoplasm, and then induce interferon production, intracellular signals
  • IPS-1 interferon-beta promoter stimulator ⁇ 1
  • VA-RNAs It has been reported that it plays an important role in the immune reaction caused by the Ad vector (Non-patent Document 7: Yamaguchi et al., 2010).
  • VA-RNAs are untranslated RNA polymerase III transcripts having a length of about 160 bases.
  • VA-RNA I having a large transcription amount reaches ⁇ 10 8 molecules per cell during Ad replication.
  • VA-RNA I plays a central role in inhibiting activation of protein kinase R (protein kinase R: PKR) as an antiviral response of host cells during Ad replication, and in the absence of VA-RNA I It is known that PKR is activated and phosphorylation of the translation initiation factor eIF-2 ⁇ is induced, resulting in inhibition of viral mRNA translation.
  • protein kinase R protein kinase R
  • Ad in which the VA-RNAs gene has been mutated in viral therapy using restricted growth type Ad
  • Patent Documents 1 and 2 a virus for achieving selective replication in tumor cells is shown for the use of Ad to exert a cytocidal effect.
  • the virus lacks the VA-RNAs gene and has a genetic mutation that selectively expresses one or more genes in the E1a group, E1b group, and E4 group in tumor cells.
  • the promoter that controls one or more genes of the E1a group, the E1b group, and the E4 group has a mutation.
  • Ad from which VA-RNAs and the E1 gene region have been removed is not disclosed.
  • there is no report that the VA-RNAs of the Ad vector have been modified for the purpose of avoiding the side effects of the Ad vector.
  • RNA interference RNA interferance: RNAi
  • target therapeutic
  • siRNA double-stranded RNA
  • RNAi small interfering RNA
  • VA-RNAs remarkably suppress the RNAi effect by shRNA
  • VA-RNA I inhibits RNAi effect by competing with exportin5 for nuclear export of pre-miRNA and shRNA precursor, and binds to Dicer It has been reported that the function is inhibited, and as a result, the production of siRNA and mature miRNA is inhibited (Non-patent document 8: Andersson, MG et al., 2005, Non-patent document 9: Lu, S). . Et al., 2004).
  • the specific suppression of target gene expression by RNAi is one of the major issues in conducting research using RNAi, such as how to introduce a siRNA-expressing vector into a target cell.
  • MicroRNA plays an important role in the control of gene expression.
  • miRNA is transcribed from DNA as Pri-miRNA in the nucleus and becomes a hairpin double-stranded RNA (dsRNA) precursor. dsRNA moves into the cytoplasm, and mature miRNA is produced by the action of Dicer. The generated miRNA is incorporated into a RISC (RNA-induced silencing complex) complex and involved in gene function control.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • An object of the present invention is to provide an Ad vector that is highly safe and exhibits a gene transfer efficiency equal to or higher than that of a conventional Ad vector, that is, an Ad vector that can be effectively used in gene therapy and life science research. . Furthermore, it is an object to provide an Ad vector production / amplification cell capable of producing and / or amplifying the Ad vector.
  • the present inventors have solved the above problems by using an Ad vector in which the VA-RNAs gene is modified so that VA-RNAs are not expressed in the Ad vector genome.
  • the present invention was completed.
  • the above-mentioned problem is caused by a cell in which the E1 gene product used for the production and / or amplification of the Ad vector is constitutively expressed and the gene is introduced so that the VA-RNAs of the Ad genome are constitutively expressed.
  • the present invention was completed.
  • this invention consists of the following. 1. An Ad vector, wherein the E1 gene region is deleted from the Ad genome, and the VA-RNAs gene is modified so that VA-RNAs are not expressed. 2. 2. The Ad vector according to item 1, wherein the VA-RNAs gene is a VA-RNA I gene and / or a VA-RNA II gene. 3. 3.
  • the shRNA expression or miRNA expression vector contains a sequence capable of generating a desired siRNA or mature miRNA.
  • Ad vector production capable of amplifying the Ad vector according to any one of 1 to 8 above, wherein a part or all of the nucleotide sequence constituting the VA-RNAs gene of the Ad genome is introduced. -Cells for amplification. 10.
  • a method for producing an Ad vector comprising introducing the Ad vector genomic DNA sequence for producing the Ad vector according to any one of 1 to 8 above into the cell according to 9 or 10 above. 12 9. An RNAi induction method using the Ad vector according to item 7 or 8. 13. A kit comprising an Ad vector plasmid for producing the Ad vector according to any one of 1 to 8 above, and the Ad vector production / amplification cell according to 9 or 10 above. 14 A kit comprising the Ad vector according to any one of 1 to 8 above and the Ad vector production / amplification cell according to 9 or 10 above.
  • the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified can suppress the Ad vector genomic DNA amplification in cells except for special cells, and can effectively introduce a desired gene into the cells.
  • conventional Ad vectors lack the E1 gene region, they are theoretically produced and / or amplified only in special cells that express the E1 gene product.
  • vector genomic DNA is amplified independently of the E1 gene in certain cells.
  • transcription of the viral protein coding gene remaining in the vector genome occurs independently of the E1 gene.
  • Amplification of the Ad vector genome independent of the E1 gene also increases the amount of viral protein expression that adversely affects cells.
  • the Ad vector with the modified VA-RNAs gene of the present invention has markedly suppressed replication of the Ad vector genome, the generation of CPE and the presentation of viral antigens are suppressed as a result, and inflammation and unnecessary immune reactions are suppressed. Is done. Therefore, the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified can be said to be a vector whose safety has been drastically increased while maintaining the characteristics of an Ad vector with good gene transfer efficiency.
  • the gene expression period can be expected to be extended.
  • the RNAi effect induced by the shRNA expression Ad vector was not as high as expected.
  • the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the invention is modified RNAi is effectively induced without suppressing the generation of mature miRNA or siRNA.
  • the Ad vector modified with the VA-RNAs gene of the present invention is useful as a gene transfer tool for improving the safety of gene therapy and life science research, and developing an shRNA-expressing Ad vector with high knockdown effect of the target gene can do.
  • an Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified can be prepared from an Ad vector genomic DNA sequence in which the VA-RNAs gene is modified.
  • Ad vectors can be amplified.
  • FIG. 4 is a photograph showing production and amplification of a conventional FG-Ad vector and an Ad ⁇ VR vector of the present invention in HEK293 cells. Amplification of the FG-Ad vector is observed, but amplification of the Ad ⁇ VR vector is not observed.
  • Example 1 It is the figure which confirmed the expression induction of VA-RNAVAI in VR293 cells.
  • Example 2 It is a photograph figure which shows production and amplification of Ad ⁇ VR vector in VR293 cells.
  • Example 2 It is the photograph which confirmed amplification of Ad ⁇ VR vector by PCR method.
  • Example 1 It is the photograph which confirmed the expression of VA-RNA II and VA-RNA II for the FG-Ad vector and the Ad ⁇ VR vector of the present invention. In Ad ⁇ VR vector, expression of VA-RNA I and VA-RNA II was not observed.
  • Example 2 It is the figure which confirmed the gene transfer efficiency in A549 cell and SK * HEP-1 cell about Ad (DELTA) VR vector.
  • Example 4 It is the figure which confirmed the expression of Ad-derived mRNA by the FG-Ad vector and the Ad ⁇ VR vector of the present invention in HUVEC cells. In the figure, simply showing Ad means FG-Ad. (Experimental example 4) It is a figure which shows the process which acts on the gene expression suppression of shRNA and VA-RNAs. Example 3 It is a figure which shows the plasmid for constructing shRNA expression Ad vector.
  • A) is pAdHM4-U6-shLuc-CG (FG-Ad-shLuc) containing VA-RNAs
  • B) is pAd ⁇ VR-U6-shLuc-CG (Ad ⁇ ) in which the expression of VA-RNAs is suppressed.
  • Example 3 It is a figure which shows the structure of VR-shLuc).
  • Example 3 It is the figure which confirmed the relative luciferase activity when FG-Ad-shLuc or Ad (DELTA) VR-shLuc was transfected into the SK * HEP1-Luc cell.
  • Example 3 It is the figure which confirmed the relative luciferase activity when FG-Ad-shLuc or Ad (DELTA) VR-shLuc was transfected into the SK * HEP1-Luc cell.
  • Ad means an adenovirus
  • Ad vector means a vector containing characteristic gene information of Ad.
  • Ad vector plasmid refers to a plasmid encoding an Ad vector genome.
  • Ad genome refers to the entire genetic information of Ad, that is, all of the DNA sequence included in Ad
  • Ad vector genome refers to the entire genetic information of Ad vector, that is, the DNA sequence included in Ad vector. Say everything.
  • the Ad vector of the present invention is characterized in that the E1 gene region of the Ad genome is deleted and the VA-RNAs gene is modified so that VA-RNAs are not expressed.
  • the Ad that can be used in the Ad vector of the present invention is not particularly limited as long as it can achieve the function as a vehicle for inserting a target DNA sequence into various types of cells in vivo or in vitro.
  • each of Ad of type 2, type 5, type 11 and type 35 using human as a host, monkey Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad and avian Ad other than human as host.
  • the deletion of the E1 gene region means that the DNA sequence encoding the E1 gene in the Ad genome is completely deleted.
  • the E1 gene region specifically corresponds to positions 342 to 3523 in the human type 5 Ad genome (GenBank Accession Number: M73260, M29978), for example.
  • the Ad vector of the present invention requires that the VA-RNAs gene is modified so that VA-RNAs are not expressed in addition to the deletion of the E1 gene region.
  • the modification of the VA-RNAs gene may be any modification as long as VA-RNAs are not expressed, and is not particularly limited. If VA-RNAs are not expressed, for example, a part or all of the DNA sequence encoding VA-RNAs may be deleted, or any of the DNA sequences encoding VA-RNAs is substituted. Or may be added.
  • VA-RNAs gene means VA-RNA I gene and / or VA-RNAVAII gene. “VA-RNAs do not express” may mean that only one of VA-RNA-I and VA-RNA II does not express.
  • the modification of the VA-RNAs gene may be at least one modification selected from the following 1) to 4), for example.
  • it may be a deletion of part or all of the consensus sequence of the internal promoter region of the VA-RNA II gene, deletion of part or all of the consensus sequence of the internal promoter region of the VA-RNA II gene, etc. .
  • Ad is human type 5 Ad
  • the region of the DNA sequence encoding VA-RNAs is 10620 to 11038 (SEQ ID NO: 1) in the human type 5 Ad genome (GenBank Accession No: M73260, M29978)
  • the region of the DNA sequence encoding VA-RNA I is 10620-1079 (SEQ ID NO: 2)
  • the region of the DNA sequence encoding VA-RNA II is 10876-11038 of the human type 5 Ad genome ( SEQ ID NO: 3).
  • the region that may be deficient is, for example, the following (a), (b), (c), (d), (e), (b) and (c), ( Combinations of b) and (e), (c) and (d), and (d) and (e) can be mentioned.
  • the region where the gene may be deficient is not limited to the above combination, but is mutated so that VA-RNAs are not transcribed to RNA polymerase III by deleting the sequence containing the internal promoter of VA-RNAs. May be added.
  • 10620-1079 deletion of all genes of VA-RNA I.
  • the Ad vector of the present invention may lack, for example, the E3 gene region in addition to the above-mentioned E1 region gene.
  • the E3 gene region refers to a region corresponding to 28133-30808 or 27865-30995 in the human type 5 Ad genome (GenBank Accession No .: M73260, M29978).
  • the deletion of the E3 gene region may be a partial or complete deletion of the DNA sequence encoding the E3 gene.
  • a foreign gene expression cassette can be inserted into a region lacking the E1 gene or a region lacking the E3 gene. Any gene that can be expressed as a foreign gene can be inserted.
  • the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified can be used, for example, as a gene therapy vector or a vector as a gene introduction tool in life science research.
  • the present invention also extends to vectors for gene therapy and vectors for gene transfer tools.
  • a vector for a gene therapy vector or a gene introduction tool for example, it can be used as an expression vector for shRNA or miRNA.
  • RNAi effect induced by the shRNA expression Ad vector is not as high as expected, considering the high gene expression efficiency of the Ad vector. It is done.
  • VA-RNAs remarkably suppress the RNAi effect by shRNA (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • VA-RNA I also inhibits the export of pre-miRNA and shRNA precursors by competing with exportin5 and inhibits its function by binding to Dicer, resulting in the generation of mature miRNA and siRNA. Has been reported to inhibit.
  • Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified does not compete with exportin5 for nuclear export of shRNA precursors or pre-miRNA, nor does it compete with and bind to Dicer. It can also be referred to as an expression vector for shRNA or miRNA without inhibiting the function of mature miRNA (see FIG. 12).
  • the Ad genome capsid protein refers to a surface protein of the viral genome, and specifically includes fiber, hexon, penton base, pIX (protein IX) and the like.
  • the fiber protein is composed of a knob, a shaft, and a tail, and is also called a fiber knob, a fiber shaft, and a fiber tail.
  • the Ad vector plasmid of the present invention refers to a plasmid that encodes the Ad vector genome, and may be any plasmid that encodes the genome of the Ad vector having the above-described configuration and can function as an Ad vector plasmid. .
  • a part of the DNA sequence encoding for example, fiber, hexon, penton base, pIX, etc. may be deleted from the Ad genome.
  • a part of the DNA sequence encoding the knob, shaft, tail, etc. may be deleted from the fiber protein.
  • An Ad vector can be prepared by introducing an Ad vector genomic DNA sequence into a specific cell to form Ad vector particles.
  • the present invention also extends to a method for producing the Ad vector of the present invention.
  • Conventional Ad vectors can be prepared using cells that constantly express the E1 gene product of Ad, such as HEK293 cells.
  • HEK293 cells are a cell line established by transforming human fetal kidney cells with the E1 gene of human type 5 Ad, and constantly express the E1 gene product.
  • the Ad vector of the present invention that is, the Ad vector particle of the present invention, cannot be obtained by transfecting the conventionally used HEK293 cells with the Ad vector plasmid of the present invention.
  • a cell for producing the Ad vector of the present invention is a cell capable of inducing the expression of Ad VA-RNAs in a cell that constantly expresses the Ad E1 gene product. It is necessary to be.
  • VA-RNAs are VA-RNA I and / or VA-RNA II.
  • VA-RNA I can be constitutively expressed for Ad VA-RNA I and / or VA-RNA II against cells that constitutively express Ad E1 gene product.
  • a cell line established by transforming part or all of the gene and / or VA-RNA II gene is used. Examples of cells that constantly express the E1 gene product of Ad include HEK293 cells.
  • the present invention also extends to Ad vector production / amplification cells for producing the Ad vector of the present invention.
  • Ad is human type 5 Ad
  • any one selected from the region of the DNA sequence encoding VA-RNA I for example, among the DNA sequences encoding VA-RNA I in human type 5 Ad
  • the human 10620-1079 (SEQ ID NO: 2) of type 5 Ad genome may be introduced.
  • / or any one selected from a region of a DNA sequence encoding VA-RNA II for example, among DNA sequences encoding VA-RNA II in human type 5 Ad, 10876 to 11038 of the human type 5 Ad genome. (SEQ ID NO: 3) may be introduced.
  • the transformed cell can be used as the Ad vector production / amplification cell of the present invention.
  • the method for introducing each sequence for preparing the Ad vector production / amplification cell of the present invention can be a method known per se.
  • a desired viral vector genome such as a lentiviral vector genome can be prepared by incorporating a necessary sequence into a vector and incorporating it into a cell that constantly expresses the E1 gene product of Ad.
  • the present invention also extends to an RNAi induction method characterized by using the above-mentioned Ad vector.
  • shRNA or miRNA By inserting shRNA or miRNA into the Ad vector of the present invention, the function of siRNA or mature miRNA can be exhibited.
  • inducing RNAi RNA interference
  • RNAi refers to suppression of gene expression by siRNA or mature miRNA.
  • the present invention also extends to a kit comprising an Ad vector plasmid for producing the Ad vector of the present invention and the above-described Ad vector production / amplification cells.
  • the Ad vector of the present invention can be easily prepared.
  • the Ad vector of the present invention can be easily amplified, and the Ad vector of the present invention can be used effectively. .
  • the present invention may be a kit including the Ad vector of the present invention and the above-described Ad vector production / amplification cells.
  • the kit By using the kit, the Ad vector of the present invention can be easily amplified, and the Ad vector of the present invention can be used effectively.
  • Ad ⁇ VR vector preparation of an Ad vector that does not express VA-RNAs (Ad ⁇ VR vector)
  • Ad ⁇ VR vector preparation of an Ad vector that does not express VA-RNAs
  • VA-RNAs in this example is used to mean “VA-RNA I and VA-RNA II”.
  • the vector of the present invention is referred to as “Ad ⁇ VR vector”
  • the conventional Ad vector is referred to as “FG-Ad vector”.
  • Each prepared vector has a structure including a gene of GFP, which is a fluorescent protein, and the structure of each vector is shown in FIG.
  • the Ad ⁇ VR vector plasmid lacking the E1 region (342-3523) and the 10667-10703 region and the 10925-10944 region of the genome. was prepared (FIG. 2). Specifically, based on the vector plasmid pAdHM4 capable of inserting a foreign gene into the E1 deletion region, a DNA sequence comprising a VA-RNAs coding sequence in which a part of the internal promoter region of VA-RNA-I and VA-RNA II is deleted and PAdHM4 linearized in the vicinity of the VA-RNAs coding sequence was co-introduced into E. coli BJ5183 strain (Qbiogene) by electroporation to produce homologous recombination to obtain pAdHM4 ⁇ VR.
  • a shuttle plasmid containing a cytomegalovirus (CMV) promoter and a GFP gene as a foreign gene, ie, pHMCMV-GFP was constructed according to a conventional method.
  • Each gene expression shuttle plasmid was cleaved with I-CeuI / PI-SceI and ligated with pAdHM4 ⁇ VR cleaved with I-CeuI / PI-SceI to construct a vector plasmid, ie, pAdHM4 ⁇ VR-CMV GFP.
  • Ad ⁇ VR vector plasmid the vector plasmid prepared in this example
  • FG-Ad vector plasmid a plasmid for preparing an FG-Ad vector.
  • Ad ⁇ VR vector plasmid constructed in 1) above was linearized by cutting with the restriction enzyme PacI present at the end of the viral genome, and transferred to HEK293 cells using the transfection reagent SuperFect TM (Qiagen). Transfected.
  • FG-Ad vector plasmid was transfected by the same technique. After culturing for about 10 days, amplification of the Ad vector was confirmed, but it was confirmed that the Ad ⁇ VR vector was not amplified in HEK293 cells (FIG. 3).
  • Example 2 Construction of Ad ⁇ VR vector production / amplification cells (VR293 cells)
  • amplification was almost achieved in HEK293 cells capable of amplifying conventional FG-Ad vectors. Since it was confirmed that the cells did not, an attempt was made to produce a cell capable of constructing an Ad ⁇ VR vector.
  • a VA-RNA I expression control lentiviral vector (LV-H1tetO-VRI-ERP) containing a cassette that expresses VA-RNA I under the control of the tetracycline-dependent H1 promoter was prepared, introduced into HEK293 cells, and doxycycline ( VR293 cells capable of inducing expression with doxycycline (DOX) were prepared.
  • VA-RNA I in VR293 cells was confirmed by Northern blotting (FIG. 4).
  • the Ad ⁇ VR vector plasmid constructed in Example 1 above was transfected into VR293 cells by the same method as in Example 1, and doxycycline was added to induce the expression of VA-RNA I. It was confirmed that the VR vector was amplified (FIG. 5).
  • Example 1 Confirmation of Ad ⁇ VR Vector Amplification Regarding the Ad ⁇ VR vector amplified in VR293 cells according to Example 2 and the FG-Ad vector amplified in HEK293 cells, the vicinity of the DNA sequence encoding VA-RNAs Amplified by PCR.
  • the amplified product by PCR was treated with the restriction enzyme RsrII, and Ad ⁇ VR vector and FG-Ad vector were confirmed.
  • the Ad ⁇ VR vector prepared in Example 1 lacks a part of the recognition site for the restriction enzyme RsrII in the VA-RNA II gene. Not digested.
  • FIG. 6 shows the results of electrophoresis of each amplified vector using a 2% agarose gel.
  • the Ad ⁇ VR vector did not change in molecular weight even after treatment with the restriction enzyme RsrII, and it was confirmed that the Ad ⁇ VR vector was amplified in VR293 cells.
  • VA-RNA I and VA-RNA II Confirmation of expression of VA-RNAs (VA-RNA I and VA-RNA II) after transduction
  • 0.1 MOI was transduced into HEK293 cells with Ad ⁇ VR vector or FG-Ad vector and cultured for 24 hours
  • the expression of VA-RNA I and VA-RNA II was confirmed.
  • the expression of VA-RNA I and VA-RNA II was confirmed by Northern blotting.
  • expression of VA-RNA I and VA-RNA II was not observed in cells transduced with Ad ⁇ VR vector (FIG. 7).
  • Amplification of the Ad vector genome independent of the E1 gene may increase the expression level of the therapeutic gene, but also increases the expression level of viral proteins that adversely affect the cells. As a result, some cells cause CPE, which triggers inflammation and immune response, and in many cases, amplification of the Ad vector genome independent of the E1 gene is not desired.
  • the Ad ⁇ VR vector of the present invention does not undergo E1 gene-independent genome amplification, and the Ad vector genome does not replicate. As a result, generation of CPE and presentation of viral antigens are suppressed, resulting in inflammation and unnecessary immune responses. Is suppressed.
  • the expression level of the therapeutic gene can be freely controlled by selecting a promoter for controlling the expression of the foreign gene mounted on the foreign gene expression cassette.
  • VA-RNAs may inhibit RNAi induction by shRNA.
  • shRNA In the suppression of the target gene by shRNA, first, the transcribed shRNA is transported to the cytoplasm by Exportin5 and cleaved into siRNA by Dicer. Then, it is taken up by RISC and suppresses the target gene.
  • RISC RNAi induction by Dicer
  • a part of VA-RNAs is also transported to the cytoplasm by Exportin5 like shRNA, and is taken up by RISC after cleavage by Dicer (see FIG. 12). In these processes, it has been reported that VA-RNAs competitively inhibit shRNA knockdown.
  • the Ad vector plasmid and Ad vector were prepared as follows. That is, shLuc expression plasmid pHM5-U6-shLuc (Mizuguchi, et al. Hum Gene Ther., 2007, 18 (1), p.740-80) was treated with SmaI and ligated with an XbaI linker. By ligating a DNA fragment obtained by treating this with XbaI / SphI and a DNA fragment obtained by treating GFP expression plasmid pHM18-CG (Non-patent Document 7) with XbaI / SphI, plasmid pHM18-U6-shLuc-CG was obtained. Obtained.
  • the obtained plasmid pHM18-U6-shLuc-CG was treated with SphI / KpnI-treated DNA fragment and pHM5 (Mizuguchi, et al. Hum Gene Ther., 1999, 10 (12), p.2013-7).
  • the plasmid pHM5-U6-shLuc-CG was obtained by ligating the DNA fragment treated with the enzyme.
  • the obtained plasmid pHM5-U6-shLuc-CG was ligated with the DNA fragment treated with I-CeuI / PI-SceI, and the DNA fragment treated with I-CeuI / PI-SceI with pAdHM4 and pAd ⁇ VR to obtain the plasmid ⁇ pAdHM4 -U6-shLuc-CG "and" pAd ⁇ VR-U6-shLuc-CG "were obtained (see FIG. 13).
  • the Ad ⁇ VR vector plasmid pAd ⁇ VR-shLuc-CG was linearized by cutting with restriction enzyme PacI is present recognition sites at both ends of the Ad genome, the VR293 cells using Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) Transfected and prepared.
  • VR293 cells were prepared by the method described in Example 2. After transfection, the cells were cultured in a normal medium for 4 days, and then further cultured for 9 days in a medium containing Dox (50 ng / ml) as a transduction reagent. Thereafter, the cells were collected, and the cells were destroyed by freezing and thawing.
  • Luc expressing cells were prepared as follows. Specifically, SK HEP-1 cells were seeded in a 12-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, and the next day, a culture supernatant 1 containing a luciferase-expressing lentiviral vector (LV-EVLuP; also equipped with a Venus gene encoding a fluorescent protein) ml was allowed to act. After culturing for 2 days, the virus infection efficiency was confirmed by flow cytometry (FACS). After culturing and scaling up, luciferase-expressing SK HEP-1 cells (SK HEP-1-Luc cells) were obtained by sorting Venus positive cells with FACSAria TM (Becton Dickinson Co., Ltd.).
  • LV-EVLuP luciferase-expressing lentiviral vector
  • SK HEP-1-Luc cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / wel in a 96-well black plate, and the following day, each Ad vector was allowed to act at 1, 3 and 10 MOI at 37 ° C. for 90 minutes. After culturing for 36 hours, luciferase activity was measured using Pica Gene LT 2.0 (Toyo Ink).
  • the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified suppresses Ad vector genome amplification in cells except for special cells, and effectively puts the desired gene into the cells. Can be introduced. Since conventional Ad vectors lack the E1 region, they are theoretically amplified only in special cells that express the E1 gene product. However, it is known that the vector genome is amplified independently of the E1 gene in certain cells. In addition, it is known that transcription of the viral protein coding gene remaining in the vector genome occurs independently of the E1 gene. Amplification of the Ad vector genome independent of the E1 gene also increases the amount of viral protein expression that adversely affects cells. As a result, some cells may experience CPE, which can trigger inflammation and immune responses.
  • the Ad vector genome does not replicate in the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified, the generation of CPE and the presentation of viral antigens are suppressed as a result, and inflammation and unnecessary immune reactions are suppressed. Therefore, the Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified does not cause E1 gene-independent genome amplification, and the safety is drastically increased while maintaining the characteristics of Ad vector with high gene transfer efficiency. It can be called a vector (see FIGS. 9 to 11). In addition, since the possibility that the transgenic cells are eliminated due to the attenuation of the immune response is reduced, the gene expression period can be expected to be extended.
  • the Ad vector deficient in the VA-RNAs of the invention RNAi is effectively induced without suppressing the generation of mature miRNA or siRNA. Based on the above, the Ad vector deficient in VA-RNAs of the present invention is useful as a gene introduction tool in improving the safety of gene therapy and life science research, and develops an shRNA expression Ad vector with a high knockdown effect of the target gene be able to.
  • an Ad vector in which the VA-RNAs gene of the present invention is modified can be prepared from an Ad vector genomic DNA sequence in which the VA-RNAs gene is modified.
  • Ad vectors can be amplified.

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Abstract

　本発明は、安全性が高く、かつ従来のAdベクターと同等以上の遺伝子導入効率を示すAdベクター、即ち遺伝子治療及び生命科学研究で効果的かつ安全に使用可能なAdベクターを提供する。さらには、当該Adベクターを増幅しうるAdベクター産生・増幅用細胞を提供する。Adベクターゲノムにおいて、VA-RNAs（VA-RNA I及び／又はVA-RNA II）が発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターによる。また、Adベクター産生・増幅用細胞は、Adベクター増幅に使用するE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞においてAdゲノムのVA-RNAsを発現するよう遺伝子を導入した細胞による。

Description

VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター
　本発明は、安全性の高い遺伝子治療用ベクター及び生命科学研究で効果的に使用可能なアデノウイルスベクターに関する。また、当該アデノウイルスベクターを産生及び／又は増幅しうるアデノウイルスベクター産生・増幅用細胞に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１１－０４８０１３号優先権を請求する。
　近年、様々な疾患に対する遺伝子治療法の開発が試みられている。遺伝子治療法開発の鍵は、安全かつ効率良く治療遺伝子を目的の組織や細胞へと送達する技術開発であるが、克服すべき問題点も多く残されているのが現状である。
　アデノウイルスベクター（以下、「Adベクター」という。）は、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。Adベクターは既存の遺伝子治療用ベクターの中では最も遺伝子導入効率に優れ、感染域が広く広範な細胞種に遺伝子導入が可能であることから、全世界の遺伝子治療臨床研究の約25 %で使用されている。また、遺伝子の機能解析を目的とした基礎研究の分野でも広く用いられ、今や生命科学研究全般に必要不可欠な基盤技術となっている。しかしながら、1999年に米国ペンシルバニア大学でオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の遺伝子治療臨床研究の経過中、一人の男性患者が大量のAdベクターの全身投与後に多臓器不全を呈し死亡するという事故が起こったことが報告されており、大量に投与されたAdベクターにより免疫反応の過剰な活性化が起こり、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome: SIRC）が生じたことが原因と考えられている。
　Adベクターを生体に投与した場合、（１）ベクター粒子構成タンパク質或いはベクターゲノムDNAにより惹起される自然免疫反応がベクター投与後数時間以内に、（２）ベクターにより導入された外来遺伝子産物及びウイルス由来タンパク質に対する獲得免疫反応が数日以内に誘導される。したがって、これらの免疫反応を回避できるAdベクターの開発が、安全性の高い遺伝子治療法を開発する上で急務とされている。
　上記（１）自然免疫反応、（２）獲得免疫反応を回避するベクターとして、以下のような研究がなされている。
（１）自然免疫反応の回避を目的とするAdベクター開発：
　Adベクターをマウスに全身投与した場合には、IL-6、IL-12、TNF、RANTES、MIP-2、IFN-α/β/γなどの各種炎症メディエーターが投与3時間以内に産生される。全身投与されたAdベクターの90 %以上は肝臓（実質細胞とクッパー細胞をはじめとする非実質細胞）に移行するが、多くの炎症性サイトカインは肝臓ではなく、主に脾臓で分泌される。したがって、脾臓への移行性を抑えたAdベクターは、炎症性サイトカインの産生が低い。例えば、ポリリジンでファイバーを修飾したAdベクターでは脾臓への移行性が減少する結果、血中へ分泌されるIL-6は約4分の1にまで減少する（非特許文献１：Koizumi et al., 2007）。また、CAR、インテグリン、ヘパラン硫酸との結合性を欠損させたトリプル改変Adベクターにおいては、IL-6はほとんど産生されない（非特許文献２：Koizumi et al., 2006）。興味深いことに、従来のAdベクターを投与した場合に生じるAST（aspartate aminotransferase）、ALT（alanine aminotransferase）などの肝障害マーカーの産生も、ポリリジン型ベクターやトリプルAd改変ベクターではほとんど起こらず安全性が高いことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
（２）獲得免疫反応の回避を目的とするAdベクター開発：
　Adベクターを生体に投与すると、通常、数週間から数ヶ月間の一過性の遺伝子発現を示す。しかしながら、免疫不全マウスにおいては、数ヶ月から1年以上（場合によっては一生涯）にわたる長期間の遺伝子発現を示すことから、細胞性免疫を中心とする獲得免疫反応の働きにより遺伝子導入細胞が排除されることが、Adベクターの一過性の発現の原因と考えられている。従来のAdベクターは、ウイルスの増殖やウイルスタンパク質の産生に必須のE1遺伝子領域を除去することで、ウイルスタンパク質の産生が生じないように設計されているが、E1遺伝子非依存的に他のウイルスタンパク質の産生がわずかに起こり、これが獲得免疫系のターゲットとなり得る。また、ベクターにより導入された外来遺伝子産物の免疫学的特性も獲得免疫系の活性化に影響を与える。特に、E1遺伝子非依存的にウイルスタンパク質が産生される問題を克服する為に、ウイルスゲノムの複製開始起点とパッケージングに必要な領域以外の全てのウイルスゲノムを除去したgutted Adベクターが開発されており、本ベクターを用いた場合は、通常のマウスにおいても長期間の遺伝子発現が認められる（非特許文献３：Dudley et al., 2004; 非特許文献４：Palmer et al., 2003)。しかしながら、gutted Adベクターは大量生産が困難なことやベクター作製に必要なヘルパーウイルスが混入してしまうことが大きな問題であり、均一性を担保すべき医薬品開発において大きな障害となってしまう。その他、Adベクターを投与された個体では抗Ad抗体が産生されるため、２回目以降のベクター全身投与ではその効果が減弱してしまう。主要キャプシドタンパク質のヘキソンに対する抗体が主体であるため、ヘキソン改変ベクターや異なった血清型（サブグループBに属する11型や35型）に属するAdをベースにしたベクターが開発されている（非特許文献５：Roberts et al., 2006; 非特許文献６：Sakurai et al., 2003）。
　Adベクターを用いることによる免疫反応を伴う副作用として、特にAdベクター投与直後に生じるインターフェロン産生等の自然免疫応答が問題となっている。Adベクターにコードされるvirus associated RNAs（VA-RNAs; VA-RNA I及び／又はVA-RNA II）が細胞質内で自然免疫受容体に認識され、その後インターフェロンの産生を誘導すること、細胞内シグナル分子として、ミトコンドリア外膜上の膜タンパク質の１種であるIPS-1（interferon-beta promoter stimulator 1）が、自然免疫応答などの過程に重要な役割を果たしていることを明らかにし、VA-RNAsがAdベクターにより生じる免疫反応において重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献７：Yamaguchi et al., 2010)。
　ヒトAdは51種類の血清型に分けられ、一般に用いられているAdベクターは5型Adを基盤としているが、全ての血清型のAdは、VA-RNAsを産生することが知られている。VA-RNAsは、約160塩基長の非翻訳RNAポリメラーゼIII転写産物であり、特に転写量が多いVA-RNA Iは、Ad複製時には細胞あたり～108分子にも達する。VA-RNA IはAd複製時に、宿主細胞の抗ウイルス反応としてのプロテインキナーゼＲ(protein kinase R:PKR)の活性化を阻害する中心的な働きをしており、VA-RNA I非存在下ではPKRが活性化し、翻訳開始因子のeIF-2αのリン酸化が誘導され、結果としてウイルスmRNAの翻訳が阻害されることが知られている。
　制限増殖型Adを利用したウイルス療法において、VA-RNAs遺伝子が変異したAdについて開示がある（特許文献１、２）。ここでは、殺細胞効果を発揮させるためのAdの使用に関し、腫瘍細胞における選択的な複製を達成するためのウイルスが示されている。当該ウイルスは、VA-RNAs遺伝子を欠失しているほか、E1a群、E1b群及びE4群の１つ以上の遺伝子が腫瘍細胞において選択的に発現するような遺伝的変異を与えており、具体的にはE1a群、E1b群及びE4群の１つ以上の遺伝子を調節するプロモーターに変異を有することが開示されている。しかしながら、VA-RNAs及びE1遺伝子領域を除去したAdは開示されていない。また、Adベクターの副作用を回避することを目的として、AdベクターのVA-RNAsを改変させたという報告はない。
　遺伝子治療や遺伝子導入による実験系は、目的（治療用）遺伝子の発現や、二本鎖RNA（small interfering RNA：siRNA）によって配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNA interferance：RNAi）が注目されており、目的遺伝子の発現を抑制することによって、治療や遺伝子の機能解析を行う研究が盛んに行われている。RNAiを誘導する目的で使用するshRNA（short hairpin RNA）発現Adベクターの場合、Adベクターによる高い遺伝子発現効率を考慮に入れると、そのshRNA発現Adベクターにより誘導されるRNAi効果は予想されたほど高くないことが認められる。VA-RNAsがshRNAによるRNAi効果を顕著に抑制することや、VA-RNA Iはpre-miRNAやshRNA前駆体の核外輸送をexportin5と競合することでRNAi効果を阻害することや、Dicerに結合することでその機能を阻害し、結果として、siRNAや成熟miRNAの生成を阻害することが報告されている（非特許文献８：Andersson, M.G. et al., 2005、非特許文献９：Lu, S. et al., 2004）。RNAiによる標的遺伝子の特異的な発現抑制は、siRNAを発現するベクターをいかに目的の細胞に導入するかというデリバリーの問題が、RNAiを利用した研究を行う上で大きな課題のひとつとなっている。また、マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている。miRNAは、核内ではPri-miRNAとしてDNAから転写され、ヘアピン二本鎖RNA（dsRNA）前駆体となる。dsRNAは細胞質内に移行し、Dicerの作用により成熟したmiRNAが生成される。生成したmiRNAはRISC（RNA-induced silencing complex）複合体に取込まれ、遺伝子機能制御に関与する。miRNAを発現するベクターをいかに目的の細胞に導入するかという問題についても大きな課題のひとつとなっている。
Koizumi, N. et al., J Immunol 178, 1767-1773 (2007) Koizumi, N. et al., Hum Gene Ther 17, 264-279 (2006) Dudley, R.W. et al., Hum Gene Ther 15, 145-156 (2004) Palmer, D. et al., Mol Ther 8, 846-852 (2003) Roberts, D.M. et al., Nature 441, 239-243 (2006) Sakurai, F. et al., Gene Ther 10, 1041-1048 (2003) Yamaguchi, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 107, 17286-17291 (2010) Andersson, M.G. et al., J Virol, 79(15), 9556-65 (2005) Lu, S. et al., J Virol, 78(23), 12868-76 (2004)
特表2005-526099号公報 特開2010-184940号公報
　本発明は、安全性が高く、かつ従来のAdベクターと同等以上の遺伝子導入効率を示すAdベクター、即ち遺伝子治療及び生命科学研究で効果的に使用可能なAdベクターを提供することを課題とする。さらには、当該Adベクターを産生及び／又は増幅しうるAdベクター産生・増幅用細胞を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、Adベクターゲノムにおいて、VA-RNAsが発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターを用いることによって、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。さらには、Adベクターの産生及び／又は増幅に使用するE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞に、AdゲノムのVA-RNAsを恒常的に発現するよう遺伝子を導入した細胞により、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Adゲノムのうち、E1遺伝子領域を欠損し、さらにVA-RNAsが発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されていることを特徴とするAdベクター。
２．VA-RNAs遺伝子が、VA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子である前項１に記載のAdベクター。
３．VA-RNAs遺伝子の改変が、以下の１）～４）より選択される少なくとも一つの改変であることを特徴とする前項１又は２に記載のAdベクター：
１）VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損；
２）VA-RNA IをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損；
３）VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損；
４）VA-RNA IIをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損。
４．VA-RNAs遺伝子の改変が、以下の１）～２）より選択される少なくとも一つの改変であることを特徴とする前項３に記載のAdベクター：
１）VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損；
２）VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損。
５．Adがヒト5型Adであり、当該ヒト5型Adゲノムの10667～10703領域及び／又は10925～10944領域を欠損していることを特徴とする、前項１～４のいずれか１に記載のAdベクター。
６．さらに、E3遺伝子領域を欠損していることを特徴とする、前項１～５のいずれか１に記載のAdベクター。
７．AdベクターがshRNA発現用又はmiRNA発現用ベクターである、前項１～６のいずれか１に記載のAdベクター。
８．shRNA発現用又はmiRNA発現用ベクターが、所望のsiRNA又は成熟miRNAを生成しうる配列を含む、前項７に記載のAdベクター。
９．AdゲノムのVA-RNAs遺伝子を構成する塩基配列のうち、一部若しくは全体が導入されていることを特徴とする、前項１～８のいずれか１に記載のAdベクターが増幅しうるAdベクター産生・増幅用細胞。
１０．VA-RNAs遺伝子が、VA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子である、前項９に記載のAdベクター産生・増幅用細胞。
１１．前項９又は１０に記載の細胞に、前項１～８のいずれか１に記載のAdベクターを作製するためのAdベクターゲノムDNA配列を導入することを特徴とするAdベクターの作製方法。
１２．前項７又は８に記載のAdベクターを用いることを特徴とする、RNAi誘導方法。
１３．前項１～８のいずれか１に記載のAdベクターを作製するためのAdベクタープラスミドと、前項９又は１０に記載のAdベクター産生・増幅用細胞を含むキット。
１４．前項１～８のいずれか１に記載のAdベクターと、前項９又は１０に記載のAdベクター産生・増幅用細胞を含むキット。
　本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターは、特殊な細胞を除いて細胞内でのAdベクターゲノムDNA増幅が抑制され、かつ効果的に所望の遺伝子を細胞内に導入することができる。従来のAdベクターはE1遺伝子領域を欠失しているため、理論的にはE1遺伝子産物を発現する特殊な細胞でのみ産生及び／又は増幅する。しかしながら、ある種の細胞中ではE1遺伝子非依存的にベクターゲノムDNAが増幅することが知られている。また、E1遺伝子非依存的にベクターゲノムに残存するウイルスタンパクコード遺伝子の転写が起こることが知られている。E1遺伝子非依存的にAdベクターゲノムが増幅することで細胞に悪影響を及ぼすウイルスタンパクの発現量も増えてしまう。その結果、CPE(cytopathic effect) や免疫系へのウイルス抗原提示が起こってしまう細胞もあるため、それらが炎症や免疫反応の引き金となってしまう。しかしながら、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターはAdベクターゲノムの複製が著しく抑制されているため、結果としてCPEの発生やウイルス抗原の提示が抑制され、炎症や不要な免疫反応が抑制される。したがって、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターは、遺伝子導入効率の良いAdベクターの特性を保持したまま、安全性を飛躍的に上昇させたベクターということができる。また、免疫応答の減弱により、遺伝子導入細胞が排除される可能性が低くなることから、遺伝子発現期間の延長も期待することができる。
　 RNAiを誘導する目的で使用するshRNA発現Adベクターは、Adベクターによる高い遺伝子発現効率を考慮に入れると、従来ではshRNA発現Adベクターにより誘導されるRNAi効果は予想されたほど高くなかったが、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターによれば、成熟miRNAやsiRNAの生成が抑制されることなく、効果的にRNAiが誘導される。上記により、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されたAdベクターは遺伝子治療の安全性向上や生命科学研究における遺伝子導入ツールとして有用であり、目的遺伝子のノックダウン効果が高いshRNA発現Adベクターを開発することができる。
　さらに、本発明のAdベクター産生・増幅用細胞によれば、VA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターゲノムDNA配列から本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターを作製することができ、さらに当該Adベクターを増幅することができる。
Adベクター作製用プラスミドの構造を模式的に示す図である。（Ａ）は従来型（FG: first generation）のAdベクタープラスミド（FG-Adベクタープラスミド）を示し、（Ｂ）は、本発明のVA-RNAsコード領域を欠損させたAdベクタープラスミド（Ad△VRベクタープラスミド）を示す。 Ad△VRについて、ヒト5型Adゲノムのうち特にVA-RNAコード領域における欠損部位を具体的に示す図である。（実施例１） HEK293細胞での従来型FG-Adベクター及び本発明のAd△VRベクターの産生・増幅を示す写真図である。FG-Adベクターの増幅は認められるが、Ad△VRベクターの増幅は認められない。（実施例１） VR293細胞におけるVA-RNA Iの発現誘導を確認した図である。（実施例２） VR293細胞でのAd△VRベクターの産生・増幅を示す写真図である。（実施例２） Ad△VRベクターの増幅をPCR法により確認した写真図である。（実験例１） FG-Adベクター及び本発明のAd△VRベクターについて、VA-RNA I及びVA-RNA IIの発現を確認した写真図である。Ad△VRベクターでは、VA-RNA I及びVA-RNA IIの発現は認められなかった。（実験例２） Ad△VRベクターについて、A549細胞及びSK HEP-1細胞における遺伝子導入効率を確認した図である。E1遺伝子非特異的なAdベクターゲノムの増幅が起こりにくいことが報告されているSK HEP-1細胞において、FG-Adベクターと同程度の発現効率を認め、従来型と遜色のない発現効率が確認された。（実験例３） 各種細胞でのFG-Adベクター及び本発明のAd△VRベクターのゲノム増幅を示す図である。E1遺伝子非依存的増幅を確認した図である。（実験例４） A549細胞でのFG-Adベクター及び本発明のAd△VRベクターによるAd由来mRNAの発現を確認した図である。図中、単にAdと示しているのは、FG-Adを意味する。（実験例４） HUVEC細胞でのFG-Adベクター及び本発明のAd△VRベクターによるAd由来mRNAの発現を確認した図である。図中、単にAdと示しているのは、FG-Adを意味する。（実験例４） shRNA及びVA-RNAsの遺伝子発現抑制に及ぼす過程を示す図である。（実施例３） shRNA発現Adベクターを構築するためのプラスミドを示す図である。（Ａ）はVA-RNAsを含むpAdHM4-U6-shLuc-CG（FG-Ad-shLuc）であり、（Ｂ）は、VA-RNAsの発現が抑制されたpAdΔVR-U6-shLuc-CG（Ad△VR-shLuc)の構造を示す図である。（実施例３） FG-Ad-shLuc又はAd△VR-shLucをSK HEP1-Luc細胞にトランスフェクションしたときの、相対的ルシフェラーゼ活性を確認した図である。（実施例３）
　本明細書において、「Ad」とはアデノウイルスを意味し、「Adベクター」とは、Adの特徴的な遺伝子情報を含むベクターを意味する。また、「Adベクタープラスミド」とは、Adベクターゲノムをコードしたプラスミドをいう。「Adゲノム」は、Adが有する遺伝情報の全体、即ちAdに含まれるDNA配列のすべてをいい、「Adベクターゲノム」は、Adベクターが有する遺伝情報の全体、即ちAdベクターに含まれるDNA配列のすべてをいう。
　本発明のAdベクターは、Adゲノムのうち、E1遺伝子領域を欠損し、さらにVA-RNAsが発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されていることを特徴とする。
　本発明のAdベクターに使用可能なAdは、in vivo又はin vitroで目的のDNA配列を種々のタイプの細胞へ挿入するビークルとしての機能を達成しうるAdであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする2型、5型、11型、35型の各Ad、ヒト以外を宿主とするサルAd、マウスAd、イヌAd、ヒツジAd及びトリAdなどが挙げられる。
　本発明において、E1遺伝子領域を欠損しているとは、AdゲノムのうちE1遺伝子をコードするDNA配列を完全に欠損していることを意味する。E1遺伝子領域とは、例えばヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、具体的には342～3523番目に相当する。
　本発明のAdベクターは、E1遺伝子領域の欠損の他、さらにVA-RNAsが発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されていることを要する。VA-RNAs遺伝子の改変とは、VA-RNAsが発現しないのであれば、どのような改変であってもよく、特に限定されない。VA-RNAsが発現しないのであれば、例えば、VA-RNAsをコードするDNA配列の一部若しくは全部が欠損していてもよいし、VA-RNAsをコードするDNA配列の何れかが置換していてもよいし、若しくは付加していてもよい。ここにおいてVA-RNAs遺伝子は、VA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子を意味する。VA-RNAsが発現しないとは、VA-RNA I及びVA-RNA IIのうち、いずれか一方のみが発現しないものであってもよい。
　VA-RNAs遺伝子の改変として、例えば以下の１）～４）より選択される少なくとも一つの改変であってもよい。
１）VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損。
２）VA-RNA IをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損。
３）VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損。
４）VA-RNA IIをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損。
　具体的には、VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損、VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損等であってもよい。
　例えば、Adがヒト5型Adの場合は、VA-RNAsをコードするDNA配列の領域は、ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において10620～11038（配列番号１）であり、VA-RNA IをコードするDNA配列の領域は、同様に10620～10779（配列番号２）であり、VA-RNA IIをコードするDNA配列の領域は、当該ヒト5型Adゲノムの10876～11038（配列番号３）である。本発明のAdベクターにおいて、欠損していてもよい領域は、例えば以下の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)の他、(b)と(c)、(b)と(e)、(c)と(d)、(d)と(e)の組み合わせが挙げられる。遺伝子が欠損していてもよい領域は、上記の組み合わせに限定されるものではなく、VA-RNAsの内部プロモーターを含む配列を欠損することで、VA-RNAsがRNAポリメラーゼIIIに転写されないように変異を加えたものであってもよい。
(a)10620～11038を欠損：VA-RNA IとIIの両方を含む全遺伝子を欠損。
(b)10620～10779を欠損：VA-RNA Iの全遺伝子を欠損。
(c)10876～11038を欠損：VA-RNA IIの全遺伝子を欠損。
(d)10667～10703を欠損：VA-RNA Iの内部プロモーター領域の一部若しくは全部を欠損＝VA-RNA Iが発現しない。
(e)10925～10944を欠損：VA-RNA IIの内部プロモーター領域の一部若しくは全部を欠損＝VA-RNA IIが発現しない。
　本発明のAdベクターは、上述のE1領域遺伝子の他に、例えばE3遺伝子領域を欠損していてもよい。E3遺伝子領域とは、ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、具体的には28133～30808又は27865～30995に相当する部位をいう。本発明において、E3遺伝子領域の欠損は、E3遺伝子をコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損であってもよい。本発明のAdベクターにおいて、E1遺伝子を欠損した領域やE3遺伝子を欠損した領域には、外来遺伝子発現カセットを挿入することができる。外来遺伝子として、発現させたい遺伝子であればどのような遺伝子であっても、挿入することができる。
　本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されているAdベクターは、例えば、遺伝子治療用ベクターや生命科学研究における遺伝子導入ツールとしてのベクターとして使用することができる。本発明は、遺伝子治療用ベクターや遺伝子導入ツール用のベクターにも及ぶ。遺伝子治療用ベクターや遺伝子導入ツール用のベクターとして、例えばshRNA又はmiRNAの発現用ベクターとして使用することができる。
　RNA干渉を誘導する目的で使用するshRNA発現Adベクターの場合、Adベクターによる高い遺伝子発現効率を考慮に入れると、そのshRNA発現Adベクターにより誘導されるRNAi効果は予想されたほど高くないことが認められる。近年、VA-RNAsがshRNAによるRNAi効果を顕著に抑制することが報告された（非特許文献８、９）。また、VA-RNA Iはpre-miRNAやshRNA前駆体の核外輸送をexportin5と競合することで阻害することや、Dicerに結合することでその機能を阻害し、結果として成熟miRNAやsiRNAの生成を阻害することが報告された。しかしながら、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変されているAdベクターは、shRNA前駆体やpre-miRNAの核外輸送をexportin5と競合することも、Dicerに競合して結合することもないので、siRNAや成熟miRNAの機能を阻害することなく、shRNA又はmiRNAの発現用ベクターということができる（図１２参照）。
　本発明において、Adゲノムのキャプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー(Fiber)、ヘキソン(Hexon)、ペントンベース、pIX（プロテインIX）などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。
　本発明のAdベクタープラスミドは、Adベクターゲノムをコードしたプラスミドをいい、上記の構成からなるAdベクターのゲノムをコードしたプラスミドであって、Adベクタープラスミドとしての機能を発揮しうるものであればよい。そのような機能を発揮しうるのであれば、Adゲノムのうち、例えばファイバー、ヘキソン、ペントンベース、pIXなどをコードするDNA配列の一部を欠損していても良い。具体的には、ファイバータンパク質のうち、ノブ、シャフト、テールなどをコードするDNA配列の一部が欠損するものであってもよい。
　Adベクターは、AdベクターゲノムDNA配列を特定の細胞に導入し、Adベクター粒子を形成させることにより、作製することができる。本発明は、本発明のAdベクターの作製方法にも及ぶ。従来のAdベクターは、AdのE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞、例えばHEK293細胞を用いて作製することができる。HEK293細胞は、ヒト胎児腎細胞をヒト5型AdのE1遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、E1遺伝子産物を恒常的に発現している。しかしながら、本発明のAdベクター、即ち本発明のAdベクター粒子は、従来用いられてきたHEK293細胞に本発明のAdベクタープラスミドをトランスフェクションしても得ることができない。
　本発明のAdベクターを作製するための細胞、即ちAdベクター産生・増幅用細胞は、AdのE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞に、さらにAdのVA-RNAsを発現誘導可能な細胞であることが必要である。ここでVA-RNAsとは、VA-RNA I及び／又はVA-RNA IIである。そのような細胞として、AdのE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞に対して、さらにAdのVA-RNA I及び／又はVA-RNA IIを恒常的に発現しうるようVA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子の一部又は全部を形質転換させて樹立された細胞株が用いられる。AdのE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞として、例えばHEK293細胞が挙げられる。本発明は、本発明のAdベクターを作製するためのAdベクター産生・増幅用細胞にも及ぶ。
　例えば、Adがヒト5型Adの場合は、VA-RNA IをコードするDNA配列の領域から選択されるいずれか、例えばヒト5型AdにおけるVA-RNA IをコードするDNA配列のうち、当該ヒト5型Adゲノムの10620～10779（配列番号２）を導入していてもよい。及び／又は、VA-RNA IIをコードするDNA配列の領域から選択されるいずれか、例えばヒト5型AdにおけるVA-RNA IIをコードするDNA配列のうち、当該ヒト5型Adゲノムの10876～11038（配列番号３）を導入していてもよい。上記配列の導入により、形質転換された細胞を本発明のAdベクター産生・増幅用細胞とすることができる。本発明のAdベクター産生・増幅用細胞を作製するための各配列の導入方法は、自体公知の方法によることができる。所望のウイルスベクターゲノム、例えばレンチウイルベクタースゲノムに、必要な配列を組み込んだものをベクターとし、AdのE1遺伝子産物を恒常的に発現している細胞に組み込むことにより、作製することができる。
　本発明は、上述のAdベクターを用いることを特徴とする、RNAi誘導方法にも及ぶ。本発明のAdベクターにshRNA又はmiRNAを挿入することで、siRNAや成熟miRNAの機能を発揮させることができる。本明細書では、RNAi（RNA干渉）を誘導することの意味を広義に解釈し、siRNAや成熟miRNAの機能を発揮させるよう誘導させることを含む。すなわち、RNAiとはsiRNAや成熟miRNAにより、遺伝子の発現抑制させることをいう。
　本発明は、本発明のAdベクターを作製するためのAdベクタープラスミドと上述のAdベクター産生・増幅用細胞を含むキットにも及ぶ。当該キットを用いることによって、本発明のAdベクターを容易に作製することができ、さらには本発明のAdベクターを容易に増幅することができ、本発明のAdベクターを有効に利用することができる。
　さらに本発明は、本発明のAdベクターと、上述のAdベクター産生・増幅用細胞を含むキットであってもよい。当該キットを用いることによって、本発明のAdベクターを容易に増幅させることができ、本発明のAdベクターを有効に利用することができる。
　以下に実施例及び実験例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）Ad△VRベクタープラスミド（pAdHM4△VR-CMV GFP）の構築
　本実施例では、VA-RNAsが発現しないAdベクター（Ad△VRベクター）の作製について説明する。本実施例における「VA-RNAs」は、「VA-RNA I及びVA-RNA II」の意味で用いられる。本実施例において、本発明のベクターを「Ad△VRベクター」、従来型のAdベクターを「FG-Adベクター」という。以下についても同様である。作製した各ベクターは、蛍光タンパク質であるGFPの遺伝子等を含む構造であり、各ベクターの構造を各々図１に示す。
　本実施例では、ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、当該ゲノムのうちE1領域（342～3523）並びに10667～10703領域と10925～10944領域を欠損したAd△VRベクタープラスミド（pAdHM△VR）を作製した（図２）。具体的には、E1欠損領域に外来遺伝子を挿入できるベクタープラスミドpAdHM4を元に、VA-RNA I及びVA-RNA IIの内部プロモーター領域の一部分を欠損させたVA-RNAsコード配列を含むDNA配列及びVA-RNAsコード配列の近傍で線状化したpAdHM4をエレクトロポレーションによって大腸菌BJ5183株（Qbiogene社）に共導入し、相同組換えを生じさせることでpAdHM4△VRを得た。
　サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含み、外来遺伝子としてGFP遺伝子を含むシャトルプラスミド、即ちpHMCMV-GFPを常法に従い構築した。各遺伝子発現用シャトルプラスミドを各々I-CeuI/PI-SceIで切断し、I-CeuI/PI-SceIで切断したpAdHM4△VRとライゲーションし、ベクタープラスミド、即ちpAdHM4△VR-CMV GFPを構築した。以下、本実施例で作製したベクタープラスミドを、「Ad△VRベクタープラスミド」という。同様に、FG-Adベクター作製用プラスミドを、「FG-Adベクタープラスミド」という。
２）Adベクターの作製
　上記１）で構築したAd△VRベクタープラスミドをウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して線状化し、トランスフェクション試薬SuperFectTM(Qiagen社)を用いてHEK293細胞へトランスフェクションした。対照として、FG-Adベクタープラスミドを同手法によりトランスフェクションした。約10日間培養後、Adベクターの増幅を確認したが、HEK293細胞では、Ad△VRベクターが増幅しないことが確認された（図３）。
（実施例２）Ad△VRベクター産生・増幅用細胞（VR293細胞）の構築
　実施例１で構築したAd△VRベクタープラスミドの場合は、従来のFG-Adベクターを増幅しうるHEK293細胞ではほとんど増幅しないことが確認されたため、Ad△VRベクターを構築しうる細胞の作製を試みた。テトラサイクリン依存性H1プロモーターの制御下でVA-RNA Iを発現するカセットを含むVA-RNA I発現制御用レンチウイルスベクター(LV-H1tetO-VRI-ERP)を作製し、HEK293細胞に導入し、ドキシサイクリン（doxycycline, DOX）にて発現誘導可能なVR293細胞を作製した。
　VR293細胞でのVA-RNA Iの発現は、ノーザンブロット法により確認した（図４）。上記実施例１で構築したAd△VRベクタープラスミドを、実施例１と同手法によりVR293細胞にトランスフェクションした後にドキシサイクリンを添加することでVA-RNA Iの発現を誘導したところ、細胞内でAd△VRベクターが増幅することが確認された（図５）。
（実験例１）Ad△VRベクター増幅の確認
　実施例２によりVR293細胞にて増幅したAd△VRベクターとHEK293細胞にて増幅したFG-Adベクターについて、VA-RNAsをコードするDNA配列の近傍をPCRの手法により増幅した。PCRによる増幅産物について、制限酵素RsrIIにより処理を行い、Ad△VRベクターとFG-Adベクターを確認した。実施例１で作製したAd△VRベクターは、図２に示すように、VA-RNA II遺伝子内の、制限酵素RsrIIの認識部位の一部を欠損しているため、理論上、制限酵素RsrIIでは消化されない。増幅された各ベクターについて、2%アガロースゲルにより電気泳動を行った結果を図６に示した。Ad△VRベクターは、制限酵素RsrII処理後も分子量の大きさが変わらず、VR293細胞内でAd△VRベクターが増幅することが確認された。
（実験例２）形質導入後のVA-RNAs（VA-RNA I及びVA-RNA II）の発現確認
　Ad△VRベクター又はFG-AdベクターをHEK293細胞に0.1 MOI形質導入し、24時間培養したときの、VA-RNA I及びVA-RNA IIの発現を確認した。VA-RNA I及びVA-RNA IIの発現は、ノーザンブロット法により確認した。その結果、Ad△VRベクターにて形質導入した細胞ではVA-RNA I及びVA-RNA IIの発現は認められなかった（図７）。
（実験例３）形質導入効率の確認
　Ad△VRベクター又はFG-Adベクターを、ヒト肺癌由来A549細胞及び肝癌由来SK HEP-1細胞に5 MOI形質導入し、24時間培養した。その結果を図８に示した。ここで、A549細胞内では、FG-Adベクターのほうが一見高い導入効果を示しているように見える。しかしながら、A549細胞では、E1遺伝子非依存的にAdベクターゲノムの増幅が認められ、その効率も高いことが既知である。その結果、A549細胞ではFG-Adベクターゲノムが効率良く増幅する一方でAd△VRベクターゲノムの増幅は起こらず、その結果形質導入もFG-Adベクターで多く認められたものと考えられる。一方、SK HEP-1細胞では、E1遺伝子非依存的にAdベクターゲノムの増幅が生じにくいことが既知である。このように、E1遺伝子非依存的なAdベクターゲノムの増幅が生じにくい細胞ではFG-AdベクターとAd△VRベクターでは同程度の遺伝子導入が認められる。本発明のAd△VRベクターによれば、E1遺伝子非依存的なAdベクターゲノムの増幅が認められる細胞内においても不要なAdベクターゲノムの増幅は抑制され、さらに従来のFG-Adベクターによる形質導入と同程度の形質導入効率が得られることが確認された。
（実験例４）E1遺伝子非依存的なAdベクターゲノムの増幅の確認
　A549細胞（ヒトII型肺胞上皮由来）、HeLa細胞（ヒト子宮頸癌由来）、SK HEP-1細胞（ヒト肝癌由来）及びHUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）について、Ad△VRベクター又はFG-Adベクターを0.1 MOI形質導入したときの経時的なAdベクターゲノムの増幅を図９に示した。
　また、A549細胞及びHUVEC細胞に、Ad△VRベクター又はFG-Adベクターを0.5又は5 MOI形質導入し、24時間培養したときの、Ad由来のタンパク（E4, E2a, Hexon, plX, fiber）発現を各mRNAにより確認した。内部標準として、GAPDHについても測定した。その結果、各細胞にAd△VRベクターを形質導入した場合の各タンパクの発現は、FG-Adベクターを導入した場合に比べて明らかに低かった（図１０、１１）。
　E1遺伝子非依存的にAdベクターゲノムが増幅することで、治療用遺伝子の発現量も増加する可能性があるが、細胞に悪影響を及ぼすウイルスタンパクの発現量も増えてしまう。その結果、CPEが起こってしまう細胞もあり、それらが炎症や免疫反応の引き金となってしまうため、多くの場合、E1遺伝子非依存的なAdベクターゲノムの増幅は望まれない。しかしながら、本発明のAd△VRベクターはE1遺伝子非依存的なゲノム増幅が起こらず、Adベクターゲノムが複製しないため、結果としてCPEの発生やウイルス抗原の提示が抑制され、炎症や不要な免疫反応が抑制される。なお、治療用遺伝子の発現量は、外来遺伝子発現カセットに搭載する外来遺伝子発現制御のためのプロモーターの選択により、自由に制御することが可能である。
（実施例３）shRNA発現AdΔVRベクターについて
　VA-RNAsの新たな特徴として、VA-RNAsがshRNAによるRNAi誘導を阻害している可能性が報告されている。shRNAによる標的遺伝子の抑制において、まず、転写されたshRNAはExportin5によって細胞質に輸送され、DicerによりsiRNAへと切断される。その後、RISCにとりこまれ標的遺伝子を抑制する。一方、VA-RNAsも転写後、その一部がshRNAと同様にExportin5によって細胞質に輸送され、Dicerによる切断の後、RISCにとりこまれる（図１２参照）。これらの過程において、VA-RNAsが競合的にshRNAによるノックダウンを阻害しているのではないかと報告されている。
　しかしながら、shRNA発現Adベクターにおいて実際に上述のような現象が起こっているかは明らかとされていない。そこで、本実施例ではルシフェラーゼ（Luc）に対するshRNA（shLuc）発現AdΔVRベクター（AdΔVR-shLuc）を作製し、VA-RNAs発現がルシフェラーゼに対するRNAi効果に及ぼす影響を確認した。ルシフェラーゼに対するRNAi効果は、ルシフェラーゼ発現細胞によるルシフェラーゼ発現抑制を確認することで評価した。
　Adベクタープラスミド及びAdベクターの作製は以下のように行った。即ち、shLuc発現プラスミドpHM5-U6-shLuc（Mizuguchi, et al. Hum Gene Ther., 2007, 18(1), p.740-80）をSmaI処理し、XbaIリンカーとライゲーションした。これをXbaI/SphI処理して得られたDNA断片と、GFP発現プラスミドpHM18-CG（非特許文献７）をXbaI/SphIで処理したDNA断片をライゲーションすることによりプラスミドpHM18-U6-shLuc-CGを得た。
　その後、得られたプラスミドpHM18-U6-shLuc-CGをSphI/KpnI処理したDNA断片と、pHM5 （Mizuguchi, et al. Hum Gene Ther., 1999, 10(12), p.2013-7）を同酵素で処理したDNA断片をライゲーションすることによりプラスミドpHM5-U6-shLuc-CGを得た。
　その後、得られたプラスミドpHM5-U6-shLuc-CGをI-CeuI/PI-SceI処理したDNA断片と、pAdHM4及びpAdΔVRをI-CeuI/PI-SceI処理したDNA断片をライゲーションすることによりプラスミド「pAdHM4-U6-shLuc-CG」及び「pAdΔVR-U6-shLuc-CG」を得た（図１３参照）。
　具体的には、AdΔVRベクタープラスミドpAdΔVR-shLuc-CGを、Adゲノムの両末端に認識部位が存在する制限酵素PacIで切断することにより線状にし、LipofectamineTM2000 (Invitrogen) を用いてVR293細胞にトランスフェクションし、作製した。VR293細胞は、実施例２に記載の方法で作製した。トランスフェクション後、4日間通常の培地で培養し、その後形質導入試薬であるDox (50ng/ml) を含む培地でさらに9日間培養した。その後、細胞を回収し、凍結融解で細胞を破壊した。その後、遠心分離し、得られた上清を二次感染（2nd infection）として、新たなVR293細胞に作用させた。AdΔVRベクターを作用させるVR293細胞数を3倍に増加させ、この操作を数回繰り返すことによりAdΔVRベクターを大量に調製した。精製は、塩化セシウムの密度勾配遠心法によって行った。
　Luc発現細胞は以下のように作製した。即ち、SK HEP-1細胞を12穴プレートに1×105cells/wellで播種し、翌日、ルシフェラーゼ発現レンチウイルスベクター（LV-EVLuP；蛍光タンパク質をコードするVenus遺伝子も搭載）含有培養上清1 mlを作用させた。2日間培養後、ウイルス感染効率をフローサイトメトリー（FACS）で確認した。培養を続けスケールアップ後、Venus陽性細胞をFACSAriaTM（ベクトン・ディッキンソン株式会社）にてソーティングによってルシフェラーゼ発現SK HEP-1細胞（SK HEP-1-Luc細胞）を得た。
　AdΔVRベクターによるルシフェラーゼ発現抑制効果は以下の方法により評価した。即ち、SK HEP-1-Luc細胞を96穴ブラックプレートに1×104cells/welで播種し、翌日に各Adベクターを1、3、10 MOIで37℃、90分間作用させた。36時間培養後、Pica Gene LT 2.0 (東洋インキ) を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
　AdΔVR-shLuc-CGによるルシフェラーゼ発現抑制効率をSK HEP-1-Luc細胞を用いて検討したところ、FG-Ad-shLuc-CG（通常のE1欠損Adベクターにルシフェラーゼ遺伝子に対するshRNAカセットを搭載したベクター）作用群と比較して、AdΔVR-shLuc-CG作用群において有意に高いノックダウン効率を示した（図１４）。本結果から、VA-RNAsはshRNA発現AdベクターにおけるRNAi効果を阻害していることが示され、AdΔVAベクターはshRNA発現による標的遺伝子ノックダウンに向けた基盤ベクターとして有用であることが示された。
　以上詳述したように、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターは、特殊な細胞を除いて細胞内でのAdベクターゲノム増幅が抑制され、かつ効果的に所望の遺伝子を細胞内に導入することができる。従来のAdベクターはE1領域を欠失しているため、理論的にはE1遺伝子産物を発現する特殊な細胞でのみ増幅する。しかしながら、ある種の細胞中ではE1遺伝子非依存的にベクターゲノムが増幅することが知られている。また、E1遺伝子非依存的にベクターゲノムに残存するウイルスタンパク質コード遺伝子の転写が起こることが知られている。E1遺伝子非依存的にAdベクターゲノムが増幅することで細胞に悪影響を及ぼすウイルスタンパクの発現量も増えてしまう。その結果、CPEが起こってしまう細胞もあり、それらが炎症や免疫反応の引き金となってしまう。しかしながら、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターはAdベクターゲノムが複製しないため、結果としてCPEの発生やウイルス抗原の提示が抑制され、炎症や不要な免疫反応が抑制される。したがって、本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターはE1遺伝子非依存的なゲノム増幅が起こらず、遺伝子導入効率の良いAdベクターの特性を保持したまま、安全性を飛躍的に上昇させたベクターということができる（図９～１１参照）。また、免疫応答の減弱により、遺伝子導入細胞が排除される可能性が低くなることから、遺伝子発現期間の延長も期待することができる。
　RNAiを誘導する目的で使用するshRNA発現Adベクターは、Adベクターによる高い遺伝子発現効率を考慮に入れると、従来ではshRNA発現Adベクターにより誘導されるRNAi効果は予想されたほど高くなかったが、本発明のVA-RNAsを欠損させたAdベクターによれば、成熟miRNAやsiRNAの生成が抑制されることなく、効果的にRNAiが誘導される。上記により、本発明のVA-RNAsを欠損させたAdベクターは遺伝子治療の安全性向上や生命科学研究における遺伝子導入ツールとして有用であり、目的遺伝子のノックダウン効果が高いshRNA発現Adベクターを開発することができる。
　さらに、本発明のAdベクター産生・増幅用細胞によれば、VA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターゲノムDNA配列から本発明のVA-RNAs遺伝子が改変したAdベクターを作製することができ、さらに当該Adベクターを増幅することができる。

Claims (14)

  1. アデノウイルスゲノムのうち、E1遺伝子領域を欠損し、さらにVA-RNAsが発現しないようにVA-RNAs遺伝子が改変されていることを特徴とするアデノウイルスベクター。
  2. VA-RNAs遺伝子が、VA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子である請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
  3. VA-RNAs遺伝子の改変が、以下の１）～４）より選択される少なくとも一つの改変であることを特徴とする請求項１又は２に記載のアデノウイルスベクター：
    １）VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損；
    ２）VA-RNA IをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損；
    ３）VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域の一部若しくは全部の欠損；
    ４）VA-RNA IIをコードするDNA配列の一部若しくは全部の欠損。
  4. VA-RNAs遺伝子の改変が、以下の１）～２）より選択される少なくとも一つの改変であることを特徴とする請求項３に記載のアデノウイルスベクター：
    １）VA-RNA I遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損；
    ２）VA-RNA II遺伝子の内部プロモーター領域のコンセンサス配列の一部若しくは全部の欠損。
  5. アデノウイルスがヒト5型アデノウイルスであり、当該ヒト5型アデノウイルスゲノムの10667～10703領域及び／又は10925～10944領域を欠損していることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１に記載のアデノウイルスベクター。
  6. さらに、E3遺伝子領域を欠損していることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１に記載のアデノウイルスベクター。
  7. アデノウイルスベクターがshRNA発現用又はmiRNA発現用ベクターである、請求項１～６のいずれか１に記載のアデノウイルスベクター。
  8. shRNA発現用又はmiRNA発現用ベクターが、所望のsiRNA又は成熟miRNAを生成しうる配列を含む、請求項７に記載のアデノウイルスベクター。
  9. アデノウイルスゲノムのVA-RNAs遺伝子を構成する塩基配列のうち、一部若しくは全体が導入されていることを特徴とする、請求項１～８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクターが増幅しうるアデノウイルスベクター産生・増幅用細胞。
  10. VA-RNAs遺伝子が、VA-RNA I遺伝子及び／又はVA-RNA II遺伝子である、請求項９に記載のアデノウイルスベクター産生・増幅用細胞。
  11. 請求項９又は１０に記載の細胞に、請求項１～８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクターを作製するためのアデノウイルスベクターゲノムDNA配列を導入することを特徴とするアデノウイルスベクターの作製方法。
  12. 請求項７又は８に記載のアデノウイルスベクターを用いることを特徴とする、RNAi誘導方法。
  13. 請求項１～８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクターを作製するためのアデノウイルスベクタープラスミドと、請求項９又は１０に記載のアデノウイルスベクター産生・増幅用細胞を含むキット。
  14. 請求項１～８のいずれか１に記載のアデノウイルスベクターと、請求項９又は１０に記載のアデノウイルスベクター産生・増幅用細胞を含むキット。
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