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WO2012104516A1 - Modulation de la proliferation des cellules epitheliales de l'unite epidermo-pilo-sebacee via rank - Google Patents

Modulation de la proliferation des cellules epitheliales de l'unite epidermo-pilo-sebacee via rank Download PDF

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Publication number
WO2012104516A1
WO2012104516A1 PCT/FR2012/050119 FR2012050119W WO2012104516A1 WO 2012104516 A1 WO2012104516 A1 WO 2012104516A1 FR 2012050119 W FR2012050119 W FR 2012050119W WO 2012104516 A1 WO2012104516 A1 WO 2012104516A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rank
hair
rankl
growth
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2012/050119
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English (en)
Inventor
George Mueller
Vincent DUHERON
Ifor Williams
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2012104516A1 publication Critical patent/WO2012104516A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
    • A61Q7/02—Preparations for inhibiting or slowing hair growth

Definitions

  • the present invention relates to the modulation of the proliferation of epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous functional unit via the modulation of the receptor activator of NF- ⁇ (RANK, for Receptor Activator of NF-KB).
  • RANK receptor activator of NF- ⁇
  • the present invention finds an application in therapeutics, for example in the treatment of inflammatory diseases of the skin (psoriasis, atypical dermatitis, etc.), alopecia (acceleration of hair loss and / or hair), hirsutism [appearance of male-type hairiness in normally glabrous areas in women (face, neck, thorax, white line, gluteal and intergenitocrural regions)], and in cosmetics, for example in cosmetic compositions and cosmetic processes leading to to modulate the growth of hair and / or hair.
  • inflammatory diseases of the skin psoriasis, atypical dermatitis, etc.
  • alopecia acceleration of hair loss and / or hair
  • hirsutism applying of male-type hairiness in normally glabrous areas in women (face, neck, thorax, white line, gluteal and intergenitocrural regions)
  • cosmetics for example in cosmetic compositions and cosmetic processes leading to to modulate the growth of hair
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • the normal cycle of growth of hair or hair ranges from 2 to 6 years. Each hair grows about 1 centimeter per month during this phase. About 90% of scalp hair is in the growth phase (anagen). About 10% of scalp hair, at one point, is in a rest phase (catagen). After 2 to 3 months, the hair that was at rest falls (telogen) to be replaced by the new regrowth. It is normal to lose a number of hair (less than 60 hairs) each day as part of this cycle. However, some people may have excessive hair loss, for example because of hormonal changes (pregnancy), stress, illness or major surgery, etc .... There are drugs that help to slow down or even prevent the development of baldness common.
  • minoxidil (rogaine®) is a vasodilator originally used exclusively as an oral drug to treat high blood pressure but has had an interesting side effect for hair growth and stops the development of baldness. It was therefore produced in topical form at a concentration of 2 and 5%. Unlike the large number of lotions sold in over-the-counter pharmacies, advertised by many advertisers and sometimes even by the female or male press, only minoxidil (and the much more recent finasteride with which it could synergize) has efficacy that has been clinically proven (which is very different from "tested under medical supervision").
  • Finasteride (propecia®) is a synthetic anti-androgen drug that works by inhibiting 5-alpha reductase type II, the enzyme that converts testosterone to dihydrotestosterone (DHT), to treat benign prostatic hypertrophy, prostate cancer and baldness. It is available by prescription, but has been shown to be ineffective in women. However, like any medicine to combat hair loss, the most common side effect is itchy scalp. In particular, minoxidil can be the cause of allergic reactions, acne, headache, hypertrichosis, but more serious cause hypotension. In particular, finasteride can be the cause of impotence, ejaculation disorders, testicular pain, etc. Moreover, when treatments are discontinued, they usually last for more than 6 months before judging results, hair loss reappears. If no adequate treatment is available for one type of hair loss, other solutions are conceivable: hair weaving, hair prosthesis, hair transplant ...
  • the skin is the largest epithelial surface and its epidermo- pilosebaceous unit includes the epidermis, the hair follicle (HF) and the sebaceous gland.
  • HF therefore has the particularity of undergoing cycles of growth (anagen), regression (catagen) and relative quiescence (telogen) [Paus and Cotsarelis, N. Engl. J. Med., 341: 491-497, 1999] [1], making it an excellent system for the study of epidermal cells (strains) and organ remodeling [Cotsarelis, J. Invest.
  • Each HF is composed of a permanent upper part, which includes the sebaceous gland and the bulge region (hair bulb), and a temporary lower cyclic part.
  • the local balance of stimulators and growth inhibitors of hair / hair is critical for initiating new hair growth [Fuchs, Cell, 137: 81 1-819, 2009; Morgan, Nat. Genet., 40: 1269-1270, 2008; Plikus et al., Int. J. Dev.
  • RANK RANK
  • TNF receptors TNFRSF1 1 a
  • This receptor assembles on the cell surface as a homotrimeric complex to interact with RANKL [references to RANK-RANKL structure: Ta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 20281-20286, 2010; Liu et al., J. Immunol., 184: 6910-6919, 2010] [55, 56].
  • RANKL is a cytokine of the TNF superfamily. It is a transmembrane protein type II (intracellular N-terminal part) that is mainly present in lymphoid organs (stromal cells and activated T cells) and bone tissue where it is expressed on the surface of osteoblasts (cells responsible for bone formation) in the form of a homotrimer [Leibbrandt and Penninger, 2008, supra; Naito et al., Genes Cells, 4: 353-362, 1999] [15, 16].
  • RANKL isoforms of RANKL (about 40-45 kDa each) as well as a soluble form (about 30 kDa), the latter being able to come from an alternative splicing or a proteolytic cleavage of the membrane forms by proteases such as TACE, MT1-MMP, MMP-7 and MMP-14 [Leibbrandt and Penninger, 2008, supra] [15].
  • OPG osteopyrotegerin
  • RANK- or RANKL-deficient mice show increased bone density due to reduced osteoclast formation, but the loss of the RANKL decoy receptor (OPG) leads to lower bone mass due to uncontrolled activation of osteoclasts.
  • OPG RANKL decoy receptor
  • RANK affects a wide variety of epithelial cells of different organs.
  • the present invention is specifically intended to meet this need and the disadvantages of the prior art.
  • mice deficient in L ligand RANK are unable to initiate a new phase of growth of the hair cycle and display a stopped epidermal homeostasis. Moreover, they put in evidence that the administration of an anti-RANKL antibody leads to a retardation of the growth phase of the hair. They have also unexpectedly demonstrated that transgenic mice overexpressing RANK in the hair follicle or the administration of recombinant RANKL activates the hair cycle and epidermal growth.
  • the present invention therefore relates to the use of a RANK ligand for the manufacture of a medicament for modulating the homeostasis and / or growth of the epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit.
  • the present invention also relates to a RANK ligand for use as a medicament for modulating the homeostasis and / or growth of epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit.
  • epidermo-pilosebaceous unit is intended to mean the epithelial cells of the epidermis, of the hair follicle or of the sebaceous gland.
  • the present invention also relates to the use of a RANK ligand for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis or atypical dermatitis, alopecia, and / or hirsutism.
  • a RANK ligand for the manufacture of a medicament for the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis or atypical dermatitis, alopecia, and / or hirsutism.
  • the present invention also relates to a RANK ligand for use as a medicament for the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis or atypical dermatitis, alopecia, and / or hirsutism.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a RANK ligand and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • pharmaceutically acceptable excipient within the meaning of the present invention, any vehicle, which does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient and which is not toxic to the host to which it is administered.
  • the above active ingredients may be formulated as a unit dose for injection into vehicles such as saline solution, dextrose solution, serum albumin solution and Ringer.
  • compositions of the present invention may also comprise minor amounts of additives, such as diluents, lubricants (eg magnesium stearate), disintegrants (eg croscarmellose), stabilizers, excipients, buffers, emulsifiers , adjuvants, solubilizers and preservatives.
  • additives such as diluents, lubricants (eg magnesium stearate), disintegrants (eg croscarmellose), stabilizers, excipients, buffers, emulsifiers , adjuvants, solubilizers and preservatives.
  • Administration of such active ingredients may be intravenous, intramuscular or subcutaneous. Other routes of administration that can establish the desired blood levels of the respective ingredients are understood by the present invention.
  • Said RANK ligand or said pharmaceutical composition can be used to obtain a medicament for treatment for the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis or atypical dermatitis, alopecia, and / or hirsutism .
  • the present invention also relates to a cosmetic or dermatological composition comprising a RANK ligand.
  • Said cosmetic composition of the invention may furthermore comprise, for example, one or more formulation agents chosen from fatty substances, water-soluble active agents, gelling agents, emulsifiers, moisturizing agents, softeners, antioxidants, anti-inflammatories and preservatives. , oils, glycols, perfumes, etc. and any other ingredient usually used in cosmetology.
  • formulation agents chosen from fatty substances, water-soluble active agents, gelling agents, emulsifiers, moisturizing agents, softeners, antioxidants, anti-inflammatories and preservatives.
  • oils, glycols, perfumes, etc. and any other ingredient usually used in cosmetology.
  • Said cosmetic composition of the invention may be in any form known to those skilled in the field of cosmetics, such as, for example, a cream, a milk, a lotion, a gel, a mask, etc., without no particular dosage restrictions other than those for application to the skin.
  • Said cosmetic or dermatological composition may be used to modulate the homeostasis and / or the growth of the epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit. It can in particular be used to cause or stimulate the growth of hair and / or hair, or to delay or inhibit the growth of hair and / or hair.
  • the present invention also relates to a cosmetic method for modulating the growth of hair and / or hair comprising a step of application to the skin of a RANK ligand or a cosmetic or dermatological composition according to the invention.
  • the RANK ligand may be chosen from a RANK agonist: eg RANKL or an analogue thereof (for example other cytokines of the superfamily of the TNF activating RANK), anti-RANK agonists to induce RANK signaling (www.rndsystems.com/pdf/af692.pdf), or a RANK antagonist: eg OPG, anti-RANKL antibody (Amgen Denosumab) [ Kamijo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347: 124-132, 2006] [30], peptides that block RANK [Aoki et al., J. Clin. Invest., 116: 1525-34, 2006] [53], and peptides that antagonize RANK signaling [Ye et al., Nature, 418: 443-7, 2002] [54].
  • a RANK agonist eg RANKL or an analogue thereof (for
  • RANKL is a cytokine of the TNF superfamily. It is a transmembrane protein type II (intracellular N-terminal part) that is mainly present in lymphoid organs and bone tissue where it is expressed on the surface of osteoblasts (cells responsible for bone formation) under the form of a homotrimer [Leibbrandt and
  • the present invention also relates to a method for identifying a candidate molecule for modulating the homeostasis and / or growth of the epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit, said method comprising the following steps:
  • modulation of RANK expression or activity in the presence of the test molecule relative to RANK expression or activity in the absence of said test molecule indicates that the test molecule modulates homeostasis and or the growth of the epithelial cells of the epidermo-pilosebaceous unit.
  • the "preparation of at least one cell” is carried out by any means known to those skilled in the art, for example they are cells or sample cells expressing RANK, cells or sample of cells transfected to express RANK, or even a transgenic non-human animal for RANK.
  • the tissue sample expressing RANK is a section of the skin of a mammal, preferably human.
  • the "contacting” is carried out by any means known to those skilled in the art, for example addition of the test molecule in the culture supernatant, injection (subcutaneous) or topical application (on the epidermis ev in a formulation that allows penetration of the suprabasal layers) of the test molecule.
  • the “determination of the activity or expression of RANK” is carried out by any means known to those skilled in the art, for example by direct visualization of the stimulation or inhibition of hair growth. , the thickness of the epidermis, the melanization of the skin in anagen phase rendering the skin black, and / or the quantification of keratin synthesis mRNA of the hair or epidermis.
  • Figure 1 shows the need for RANK for the anagen phase of HF
  • A The HF of Rankr 1 ' mice are stopped in the telogen phase, whereas the WT mice of the same litter are in the anagen phase at P28
  • B Schematic representation the morphogenesis of and the HF cycle in Rankl - / - mice and control, and the inability of all Rankr 1 ' mice to enter the anagen phase at P28-49
  • C HF Rank ' 1 ' stop in the telogen phase
  • D 5 days after hair removal at P19, the HF are in advanced anagen phase in WT mice but remain in the telogen phase in Rankr 1 ' mice.
  • WT-treated mice show a normal anagen phase.
  • the scale bars represent ⁇ ⁇ , 50 ⁇ in the insets. Sections embedded in paraffin are stained with hematoxylin-eosin.
  • FIG. 2 represents the independence of stem cells and the mesenchymal cell compartment of HF with respect to RANK-signaling (A).
  • Identification of CD34 + (B) and P-cadherin + (SHG) stem cells. in HF in telogen control mouse phase and Rankr 1 ' to P24 by immunofluorescence. The nuclei were coloprened with DAPI. DP dermal papilla. The scale bars represent 20 ⁇ (B)
  • Figure 3 shows the expression of RANK, RANKL and OPG in hair follicle stem cells
  • A Localization of RANK, RANKL and OPG in telogenic WT (B) and stem cell (SHG) stem cells at P24 by immunofluorescence. The nuclei were marked with DAPI.
  • DP dermal papilla. The scale bars represent 20 ⁇ . 6 mice were analyzed for RANK and RANKL, and 6 mice for OPG (B) RT-PCR of Rank, Rankl, Opg and Gapdh in SHG P-cadherin + cells and CD34 + strains sorted by FACS (C).
  • FIG. 4 represents the early entry into the anagen phase in the Rank-Tg mice and in response to the recombinant RANKL (A) HF of WT mice in the II / IIIa phase, whereas the HF of the Rank-Tg mice are already in phase anagen lllc to P24.
  • Scale bars represent ⁇ ⁇ (B) WT mouse HF in the telogen phase, whereas Rank-Tg mouse HF are in the IV / V to P86 anagen phase.
  • Scale bars represent ⁇ ⁇ (C) Schematic representation of hair morphogenesis and telogen phase transitions to anagen of the hair cycle in Rank-Tg and control mice.
  • the graphical representation of 3 out of 4 treated mice, whose HF entered the anagen phase, compared to the control mice remaining in the telogenic phase (E) Image of HF in the anagen phase of a mouse treated with RANKL-GST, whereas they are in the telogen phase in the GST control mouse.
  • the scale bars represent ⁇ ⁇ , 50 ⁇ in the inset. Sections embedded in paraffin were stained with hematoxylin-eosin.
  • Figure 5 shows the regulation of epidermal homeostasis by RANK
  • A Different thicknesses of the Tg mouse skin epidermis, WT, Rankr 1 '4 weeks old, visualized on fixed sections, embedded in paraffin, colored with trichrome Masson. Scale bars represent 20 ⁇
  • B Epidermis thickness measured on 10 randomly chosen images of 4 mice of each genotype per unit of time. The data are an average of the standard deviation (C) identification (arrowheads) of brdLT proliferative interfollicular epidermal cells, stained with eosin. The scale bars represent 20 ⁇ (D) graph showing the number of keratinocytes of the BrdLT epidermis for each mouse.
  • the data are an average of the standard deviation (E) Tg mouse receiving anti-RANKL antibody or injected blank (control) every 3 days from P10 to P45.
  • the skins are analyzed for the HF cycle and the size of the epidermis on sections stained with hematoxylin-eosin.
  • Ladder bars represent 50 ⁇
  • F Schematic representation of the HF stage of 8 treated mice and 7 control mice
  • Figure 6 shows (A) RT-PCR of Rank, Rankl, Opg and Gapdh transcripts in the skin of 5-day and 15-day old mice (B) in situ hybridization for RANK and RANKL mRNA (antisense) or control (RANK sense) at day 5 postpartum (P5) (C) morphogenesis of a normal mouse hair follicle Rank " ' " , displaying an early anagen phase at P5 and a normal hair cycle entry with a catagen II to P15 phase.
  • the scale bars represent ⁇ ⁇
  • D the presence of the 4 types of hair (monotrich, awl, suchene and zigzag) in a Rankr 1 ' mouse aged 45 days.
  • FIG. 7 represents (A) the Rankr 1 ' hair follicles failing to enter the anagen phase at postpartum day 40 (P40) or P45. WT hair follicles are in catagen VII to P40 phase and in second phase telogen to P45 (with the current club hair).
  • the scale bars represent ⁇ ⁇
  • the back skin of the Rankr 1 ' mice and its control of the same WT line were analyzed for the initiation of HF renewal at an age when the Anagen II phase is visible.
  • the scale bars represent 20 ⁇ .
  • Sections embedded in paraffin were stained with hematoxylin-eosin (C) identifying rare RANKL + cells by anti-RANKL immunostaining in WT epidermis at P28 with DAPI counter-labeling.
  • the scale bars represent 10 ⁇ .
  • * non-specific labeling of the corneum stratum
  • the dotted lines indicate the dermo-epidermal junction (D) the immunofluorescent staining of RANK in a skin section at P28 with a DAPI counter-marking.
  • ORS sheath of the external root
  • HF hair follicle
  • ep epidermis.
  • the heads of the arrows point to the bulge of the hair follicle.
  • the scale bars represent 20 ⁇ and 30 ⁇ (right).
  • Figure 8 shows (A) overexpression of RANK (arrowhead) under the control of the S100A8 gene promoter in SHG P-cadherin + cells.
  • the nuclei were marked with DAPI.
  • B bulge
  • DP dermal papilla.
  • the scale bar represents transgenic 20 ⁇
  • B RANK- inducing NF- ⁇ signaling.
  • HEK 293T cells were transiently transfected with the transgenic Rank expression plasmid and a luciferase expression plasmid under the control of NF- ⁇ . Cells were stimulated with recombinant RANKL.
  • NF- ⁇ promoter activity was expressed as the luciferase unit increase factor over cells that only received the NF- ⁇ reporter plasmid.
  • Data are representative of 3 experiments (C) measurements (mean ⁇ SD) of ELISA-soluble OPG and RANKL proteins in skin-organ cultures at the ages indicated in control (WT) and Rank-transgenic (Tg) mice. ) (D) 3-month-old Rank-Tg mice with discrete alopecia compared to control mice (E) stably expressing HEK 293T cells and transfected with the NF- ⁇ reporter plasmid were stimulated with different concentrations of RANKL-GST. Data was expressed as the increase factor of luciferase units compared to unstimulated cells. They represent the average of triplicate and are representative of 3 experiments.
  • Figure 10 shows (A) immunolocalization of cytokeratin 14, cytokeratin 10, loricrin, involucrin, filaggrin and DAPI-nuclear staining of Ran / -transgenic mouse skin, WT and Rank - / -.
  • the scale bars represent 20 ⁇ .
  • the dotted lines indicate the dermal-epidermal junction.
  • ep epithelium
  • B the epidermal barrier test with toluidine blue. The sacrificed 8 week old WT and Tg mice were shaved and their skin cut with scissors at the indicated site, before the toluidine blue penetration test. Note, the Tg mouse is in the anagen phase at 8 weeks, which makes the skin relatively black.
  • Figure 11 shows the sequence of the murine transgenic Rank construct.
  • mice were kept in a closed facility free of parasites and viruses according to the faculty guidelines and with its agreement on animal bioethics (AL / 01/20/1 1/08). Rankr 1 ' mice were identified by lack of teeth, smaller size and genomic DNA PCR (see Table 1 below).
  • An anti-RANKL monoclonal antibody (IK22-5) [Kamijo et al., Biochel. Biophys. Res. Commun., 347: 124-132, Epub 2006 Jun2023, 2006] [30] was injected subcutaneously in Tg mice every 3 days, 10 ⁇ g at P10, 25 ⁇ g of P13 at P28 and 50 ⁇ g of P31 at P45.
  • the skin of the back was fixed in 4% formalin and embedded in paraffin. Sections (6 ⁇ ) were cut, deparaffinized and stained with hematoxylin-eosin or Masson's trichrome (Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France). Alternatively, the skin was frozen in the OCT-Compound (TissueTEK, Delta Microscopy, Toulouse, France) and sections (8 ⁇ ) were cut, fixed in acetone at -20 ° C for 10 min. All sections were blocked with 2% goat or donkey serum (Sigma-Aldrich) and then incubated overnight at 4 ° C with a primary antibody (see Table 2 below) diluted in saline. buffered and 1% blocking serum.
  • the fluorochrome-labeled secondary antibodies (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) were incubated for 1 h at room temperature. For frozen sections, sections were fixed in formalin prior to DAPI staining (Molecular Probes, Invitrogen). Signal amplification of tyramide (PerkinElmer, Courtaboeuf, France) was used to visualize RANK and RANKL in WT mice. To reveal the endogenous alkaline phosphatase of the dermal papilla, the frozen acetone-fixed sections were incubated with BCIP / NBT (Pierce, Thermo Scientific, Illkirch, France) until complete development of the color. RT-PCR
  • RNA of SHG cells and sorted bulge [Greco et al., Cell Stem Cell, 4: 155-169, 2009] [31] were extracted using RNeasy Micro (QIAgen, Courtaboeuf, France).
  • the cDNA was synthesized and amplified using the QuantiTect Whole Transcriptome (QIAgen) protocol.
  • QIAgen QuantiTect Whole Transcriptome
  • the hairs were cut with scissors and depilatory cream (Nair) was applied. After 5 min, the cream-hair emulsion was removed and the skin was incubated for 4h at 37 ° C with 1 mg / ml dispase II (Roche Diagnostic). The epidermis was then carefully removed with a forceps.
  • mice were injected intraperitoneally with 1 mg of BrdU (Sigma-Aldrich) 3h before sacrifice.
  • the back skin tissues were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin.
  • Antigen recovery was performed in citrate buffer boiling at pH 6 for 10 min., And endogenous peroxidase was inhibited in 3% H2O2.
  • the anti-BrdU antibody was incubated overnight at 4 ° C.
  • the sections were then incubated with a rat anti-IgG secondary antibody (H + L) coupled to biotin for 1 hr at room temperature, followed by horseradish-conjugated ABC complex (VectorLabs) for 1 hr.
  • the labeling was revealed with DAB (DiAminoBenzidine) -Ni and quenched with distilled water.
  • the sections were stained with eosin.
  • the skin of the mouse's back was excised and weighed. It was introduced, hair side up, in cell culture medium containing 10% fetal calf serum (Invitrogen), antibiotics and fungicides, in a cell culture incubator for 24 hours at 37 ° C.
  • the acellular culture medium was sterilized by filtration and soluble RANKL and OPG were measured by ELISA (DuoSet ELISA, R & D Systems, Lille, France). The results were normalized to skin weight.
  • the HF cells were released from the whole skin as previously described [Greco et al., 2009, cited above] [31]. They were stained for CD34, revealed by a secondary antibody Alexa6 4 7 of anti-rat goat (Molecular Probes, Invitrogen), fixed, permeabilized and stained for keratin 14, revealed by an anti-rabbit FITC conjugated donkey antibody (Molecular Probes, Invitrogen). The cells were analyzed using a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson Biosciences, Le Pont de Claix, France).
  • the cells were further labeled for P-cadherin followed by streptavidin-APC and sorted on the FACSAria II cell sorter (Becton Dickinson Biosciences) into SHG P-cadherin cells and CD34 + bulge cells.
  • the FACSAria II cell sorter Becton Dickinson Biosciences
  • the transgenic and endogenous Rank murine cDNA was amplified from the Rank-Tg and WT skin cDNA and cloned into pCR3.1 (Invitrogen) under the control of the CMV promoter.
  • HEK 293T cells were transiently transfected using Fugene (Roche) or a stable cell line was obtained under selection by G418.
  • Fugene Fugene
  • G418 a stable cell line was obtained under selection by G418.
  • the reporter vector of NF-KB1-luciferase Panomics, Milan, Italy
  • Luciferase activity was measured 24 hours later, using the manufacturers' instructions (Promega).
  • Rank-Tg and WT mouse skin was weighed and fed, upside down, into a cell culture medium containing 10% fetal calf serum (Invitrogen), antibiotics and fungicides, in a cell culture incubator. for 24h at 37 ° C.
  • the culture medium cell-free was sterilized by filtration.
  • TNF-cc and I L-1 ⁇ ELISA were performed using anti-TNFcc antibodies (BD Biosciences) and the DuoSet ELISA kit (R & D Systems) for IL-1 ⁇ .
  • mice WT and Tg mice aged 8 weeks were shaved and their skin was cut with scissors on the back. It was then dehydrated in successive stages in methanol and, after rehydration, bathed in 0.01% toluidine blue for 1 min. After washing in water, the hairs were completely removed with a depilatory cream (Nair ) and the mice were photographed.
  • Example 2 The stimulation of RANK is not essential for the normal development of HF but is required for the anagen phase of HF
  • Example 3 Stopping in telogen phase in the absence of RANK stimulation does not result from defects in the HF stem cell compartment or a defective HF mesenchyme
  • At least two distinct subpopulations of HF epithelial cells are required for formation of the normal anagen phase, stem cells of the bulge [Cotsarelis, 2006, supra; Panteleyev et al., J. Cell Sci., 14: 3419-3431, 2001] [2,39] and secondary germ cells of hair (SHG) [Greco et al., 2009, supra; Jaks et al.
  • the site of RANK expression in the HF of the telogen phase was determined.
  • Example 5 RANK stimulation triggers entry into anagen phase
  • Tg transgenic
  • S100A8 transgenic
  • This promoter has already been identified as active in human HF [Schmidt et al., J. Invest. Dermatol., 17: 748-750, 2001] [48], and recently found to be transcribed in SHG cells [Greco et al., 2009, cited above] [31].
  • Immunofluorescent staining of the HFs in the telogen phase confirmed that RANK was overexpressed in SHG cells ( Figure 8A). Endogenous RANK was not identified because its visualization required signal amplification.
  • RANKL recombinant RANKL
  • GST glutathione-s-transferase
  • the epidermal turnover rate was determined using the thymidine analogue BrdU.
  • the proliferating BrdLT keratinocytes were virtually absent in Rankl deficient mice but very abundant in the epidermis of Rank-Tg mice (Figure 5C).
  • Quantification of BrdLT interfollicular epithelial cells by cell count on the sections revealed a significant reduction for Rank1-deficient mice and a very significant 8-fold increase for Tg mice ( Figure 5D). Then, the skin of the Tg mice was analyzed for signs of cell activation by measuring the release of TNFcc and IL-1 ⁇ .
  • RANKL plays an important role in the renewal of the epidermis which normally occurs during the anagen phase, a natural source of RANKL, but which is abnormally increased leading to epidermal hyperplasia when RANKL is overproduced.

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Abstract

La présente invention se rapporte à la modulation de l'homéostasie et/ou de la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo- sébacée, via la modulation du récepteur RANK. La présente invention trouve notamment une application en thérapeutique (maladies inflammatoires telles que psoriasis ou dermatite atypique, alopécie, hirsutisme) et en cosmétique (homéostasie et/ou croissance des cheveux et poils).

Description

MODULATION DE LA PROLIFERATION DES CELLULES
EPITHELIALES DE L'UNITE EPIDERMO-PILO-SEBACEE VIA RANK
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à la modulation de la prolifération des cellules épithéliales de l'unité fonctionnelle épidermo-pilo-sébacée via la modulation du récepteur activateur de NF-κΒ (RANK, pour Receptor Activator of NF-KB).
La présente invention trouve une application en thérapeutique, par exemple dans le traitement de maladies inflammatoires de la peau (psoriasis, dermatite atypique, etc .), de l'alopécie (accélération de la chute des cheveux et/ou des poils), de l'hirsutisme [apparition d'une pilosité de type masculine dans des zones normalement glabres chez la femme (visage, cou, thorax, ligne blanche, régions fessières et intergénitocrurales)], et en cosmétique, par exemple dans des compositions cosmétiques et procédés cosmétiques conduisant à moduler la croissance des cheveux et/ou des poils.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Le cycle normal de croissance des cheveux ou poils va de 2 à 6 ans. Chaque cheveu pousse d'environ 1 centimètre par mois au cours de cette phase. Environ 90 % des cheveux du cuir chevelu sont en phase de croissance (anagène). Environ 10% des cheveux du cuir chevelu, à un moment donné, sont dans une phase de repos (catagène). Après 2 à 3 mois, les cheveux qui étaient en repos chutent (télogène) pour être remplacés par la nouvelle repousse. Il est normal de perdre un certain nombre de cheveux (moins de 60 cheveux) chaque jour dans le cadre de ce cycle. Toutefois, certaines personnes peuvent avoir une perte de cheveux excessive, du fait par exemple de changements hormonaux (grossesse), de stress, de maladie ou chirurgie majeure, etc.... Il existe des médicaments qui contribuent à ralentir ou même à empêcher le développement de la calvitie commune. Par exemple, le minoxidil (rogaine®), est un vasodilatateur utilisé à l'origine, exclusivement comme médicament par voie orale pour traiter une pression sanguine élevée mais qui a présenté un effet secondaire intéressant pour le développement de la pilosité et arrêter le développement de la calvitie. Il a donc été produit sous forme topique à une concentration de 2 et 5%. Contrairement au grand nombre de lotions vendues en pharmacie sans ordonnance, vantées par de nombreuses publicités et parfois même, par la presse féminine ou masculine, seul le minoxidil (ainsi que le beaucoup plus récent finastéride avec lequel il serait susceptible de faire synergie) a une efficacité qui ait été médicalement démontrée (ce qui est très différent de "testé sous contrôle médical"). Le finastéride (propecia®) est un médicament anti- androgène synthétique qui agit en inhibant la 5-alpha réductase de type II, l'enzyme qui convertit la testostérone en dihydrotestostérone (DHT), pour soigner l'hypertrophie bénigne de la prostate, le cancer de la prostate et la calvitie. Il est disponible sur ordonnance, mais s'est montré inefficace chez les femmes. Toutefois, comme tout médicament pour combattre la perte de cheveux, l'effet secondaire le plus courant est la démangeaison du cuir chevelu. En particulier, le minoxidil peut être à l'origine de réactions allergiques, d'acné, de maux de tête, d'hypertrichose, mais plus grave causer des accès d'hypotension. En particulier, le finastéride peut être à l'origine d'impuissance, de désordres de l'éjaculation, de douleur des testicules, etc .. Par ailleurs, à l'arrêt des traitements qui s'étalent généralement sur une durée de plus de 6 mois avant de juger des résultats, la perte de cheveux réapparaît. Si aucun traitement adéquat n'est disponible pour un type de chute de cheveux, d'autres solutions sont envisageables : tissage des cheveux, prothèse capillaire, greffe de cheveux...
La peau est la plus grande surface épithéliale et son unité épidermo- pilo-sébacée comprend l'épiderme, le follicule pileux (HF) et la glande sébacée. Le HF a donc la particularité de subir des cycles de croissance (anagène), de régression (catagène) et de quiescence relative (télogène) [Paus et Cotsarelis, N. Engl. J. Med., 341 : 491 -497, 1999] [1 ], ce qui en fait un excellent système pour l'étude des cellules (souches) de l'épiderme et du remodelage d'organes [Cotsarelis, J. Invest. Dermatol., 126 : 1459- 1468, 2006 ; Fuchs, Nature, 445 : 834-842, 2007 ; Blanpain et al., Cell, 128 : 445-458, 2007 ; Watt et Hogan, Science, 287 : 1427-1430, 2000] [2- 5]. Chaque HF est composé d'une partie supérieure permanente, qui inclut la glande sébacée et la région de renflement (bulbe pilaire), et une partie cyclique inférieure temporaire. L'équilibre local des stimulateurs et inhibiteurs de croissance des cheveux/poils est critique pour l'initiation d'une nouvelle croissance des cheveux/poils [Fuchs, Cell, 137 : 81 1 -819, 2009 ; Morgan, Nat. Genêt., 40 : 1269-1270, 2008 ; Plikus et al., Int. J. Dev. Biol., 53 : 857-868, 2009 ; Schneider et al., Curr. Biol., 19 : R132-142, 2009] [6-9]. Curieusement, beaucoup de ces acteurs moléculaires opèrent également dans le développement et le remodelage osseux (e.g. membres de la superfamille TGF- et leurs antagonistes, hormones parathyroïdiennes et protéines Hedgehog) [Klopcic et al., Eur. J. Cell Biol., 86 : 781 -799, 2007 ; Glass et al., Dev. Cell, 8 : 751 -764, 2005 ; Kronenberg, Nature, 423 : 332-336, 2003 ; Aguila et Rowe, Immunol. Rev., 208 : 7-18, 2005 ; Ross et Christiano, J. Clin. Invest., 1 16 : 1 140-1 149, 2006] [10-14].
RANK, initialement identifié en tant que régulateur de la masse osseuse et plus récemment pour son rôle dans l'activation des cellules épithéliales de la glande mammaire, est une protéine transmembranaire de type I (partie N-terminale extracellulaire) appartenant à la superfamille des récepteurs du TNF (TNFRSF1 1 a) qui est surtout exprimée par les ostéoclastes et les cellules dendritiques [Leibbrandt et Penninger, Ann. NY Acad. Sci., 1 143 : 123-150, 2008] [15]. Ce récepteur s'assemble à la surface des cellules sous la forme d'un complexe homotrimérique pour interagir avec RANKL [références quant à la structure RANK-RANKL : Ta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107 : 20281 -20286, 2010 ; Liu et al., J. Immunol., 184 : 6910-6919, 2010] [55, 56].
RANKL est une cytokine de la superfamille du TNF. Il s'agit d'une protéine transmembranaire de type II (partie N-terminale intracellulaire) qui est surtout présente dans les organes lymphoïdes (cellules stromales et lymphocytes T activés) et le tissu osseux où elle est exprimée à la surface des ostéoblastes (cellules responsables de la formation osseuse) sous la forme d'un homotrimère [Leibbrandt et Penninger, 2008, précité ; Naito et al., Gènes Cells, 4 : 353-362, 1999] [15, 16]. Il existe deux isoformes de RANKL (d'environ 40-45 kDa chacune) ainsi qu'une forme soluble (d'environ 30 kDa), cette dernière pouvant provenir d'un épissage alternatif ou d'un clivage protéolytique des formes membranaires par des protéases telles que TACE, MT1 -MMP, MMP-7 et MMP-14 [Leibbrandt et Penninger, 2008, précité] [15].
OPG (ostéop_rotégérine) est exprimé par les ostéoblastes et joue un rôle de récepteur leurre en interagissant avec RANKL [Leibbrandt et Penninger, 2008, précité] [15].
Des souris déficientes en RANK ou RANKL affichent une densité osseuse augmentée en raison d'une formation réduite d'ostéoclastes, mais la perte du récepteur leurre (OPG) de RANKL conduit à une masse osseuse plus faible, du fait d'une activation incontrôlée de RANK [Walsh et Choi, Cytokine Growth Factor Rev., 14 : 251 -263, 2003 ; Tanaka et al., Immunol Rev., 208 : 30-49, 2005] [17, 18]. RANK apparaît aujourd'hui comme un acteur important dans la croissance et la différenciation des cellules épithéliales. Il est requis pour la formation des glandes mammaires en lactation [Fata et al., cell, 103 : 41 -50, 2000 ; Cao et al., Cell, 107 : 763- 775, 2001 ; Beleut et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107 : 2989-2994, 2010] [19-21 ], des cellules épithéliales médullaires du thymus [Rossi et al., J. Exp. Med., 14 : 14, 2007 ; Hikosaka et al., Immunity, 29 : 438-450, 2008 ; Akiyama et al., Immunity, 29 : 423-437, 2008] [22-24], des cellules des microvillosités de l'intestin [Knoop et al., J. Immunol., 183 : 5738-5747, 2009] [25] et a été impliqué dans la croissance et métastase de la prostate [Luo et al., Nature, 18 : 18, 2007 ; Armstrong et al., Prostate, 68 : 92-104, 2008] [26, 27] et des cancers épithéliaux mammaires [Schramek et al., nature, 468 : 98-102, 2010 ; Gonzalez-Suarez et al., Nature, 468 : 103- 107, 2010] [28, 29]. Ainsi RANK affecte une large variété de cellules épithéliales de différents organes.
Actuellement, le développement de produits cosmétiques ou dermatologiques visant à faire repousser ou à contrôler la pousse du cheveu/poil chez l'homme nécessite de la peau chevelue d'un donneur.
Il existe donc un réel besoin de fournir de nouvelles compositions ou méthodologies pour régénérer une peau chevelue/poilue ou un follicule pileux ainsi que de nouvelles molécules permettant d'induire ou réduire la croissance du cheveu / poil, palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'une composition et/ou d'un procédé permettant la repousse ou le contrôle de la pousse du cheveu/poil facilement et en s'affranchissant de la peau d'un donneur, et la réduction des coûts et délais. Description de l'invention
La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin et aux inconvénients de l'art antérieur.
Les Inventeurs ont en effet mis en évidence de manière tout à fait inattendue que des souris déficientes en ligand L de RANK (RANKL) sont incapables d'initier une nouvelle phase de croissance du cycle pilaire et affichent une homéostasie épidermique arrêtée. Par ailleurs, ils ont mis en évidence que l'administration d'un anticorps anti-RANKL conduit à un retardement de la phase de croissance du poil. Ils ont également mis en évidence de manière inattendue que des souris transgéniques surexprimant RANK dans le follicule pileux ou l'administration de RANKL recombinant active(nt) le cycle pilaire et la croissance épidermique.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un ligand de RANK pour la fabrication d'un médicament destiné à moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
La présente invention se rapporte également à un ligand de RANK pour utilisation comme médicament destiné à moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
On entend par « cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo- sébacée » au sens de la présente invention, les cellules épithéliales de l'épiderme, du follicule pileux ou de la glande sébacée.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un ligand de RANK pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que psoriasis ou dermatite atypique, de l'alopécie, et/ou de l'hirsutisme.
La présente invention se rapporte également à un ligand de RANK pour utilisation comme médicament destiné au traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que psoriasis ou dermatite atypique, de l'alopécie, et/ou de l'hirsutisme.
La présente invention a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant un ligand de RANK et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
On entend par « excipient pharmaceutiquement acceptable » au sens de la présente invention, un quelconque véhicule, qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique de l'ingrédient actif et qui n'est pas toxique pour l'hôte auquel il est administré. Par exemple, pour l'administration parentérale, les ingrédients actifs ci-dessus peuvent être formulés sous forme d'unité de doses pour injection dans des véhicules tels que solution saline, solution de dextrose, solution d'albumine sérique et de Ringer.
En plus du véhicule pharmaceutiquement acceptable, les compositions de la présente invention peuvent également comprendre des quantités mineures d'additifs, tels que diluants, lubrifiants (e.g. stéarate de magnésium), désintégrants (e.g. croscarmellose), agents stabilisants, excipients, tampons, agents émulsifiants, adjuvants, agents de solubilisation et agents de conservation.
L'administration de tels ingrédients actifs peut s'effectuer par voie intraveineuse, intra-musculaire ou sous-cutanée. Les autres voies d'administration qui peuvent établir les taux sanguins souhaités des ingrédients respectifs, sont comprises par la présente invention.
Ledit ligand de RANK ou ladite composition pharmaceutique peut être utilisée pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement destiné au traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que psoriasis ou dermatite atypique, de l'alopécie, et/ou de l'hirsutisme.
La présente invention a encore pour objet une composition cosmétique ou dermatologique comprenant un ligand de RANK.
Ladite composition cosmétique de l'invention peut comprendre en outre par exemple un ou plusieurs agents de formulation choisis parmi les corps gras, des actifs hydrosolubles, les gélifiants, les émulsionnants, les agents hydratants, les adoucissants, les antioxydants, les antiinflammatoires, les conservateurs, les huiles, les glycols, les parfums, etc .. et tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétologie.
Ladite composition cosmétique de l'invention peut se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétique, comme par exemple, une crème, un lait, une lotion, un gel, un masque, etc ., sans aucune restriction galénique particulière autre que celle pour l'application sur la peau. Ladite composition cosmétique ou dermatologique peut être utilisée pour moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée. Elle peut notamment être utilisée pour provoquer ou stimuler la croissance des cheveux et/ou des poils, ou encore pour retarder ou inhiber la croissance des cheveux et/ou poils.
La présente invention se rapporte également à un procédé cosmétique destiné à moduler la croissance des cheveux et/ou poils comprenant une étape d'application sur la peau d'un ligand de RANK ou d'une composition cosmétique ou dermatologique selon l'invention.
Quelque soit l'utilisation ou l'application thérapeutique ou cosmétique, à titre d'exemple, le ligand de RANK peut être choisi parmi un agoniste de RANK : e.g. RANKL ou un analogue de celui-ci (par exemple autres cytokines de la superfamille du TNF activant RANK), anticorps anti-RANK agonistes pour induire la signalisation de RANK (www.rndsystems.com/pdf/af692.pdf), ou un antagoniste de RANK : e.g. OPG, anticorps anti-RANKL (Denosumab d'Amgen) [Kamijo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347 : 124-132, 2006] [30], peptides qui bloquent RANK [Aoki et al., J. Clin. Invest., 1 16:1525-34, 2006] [53], et peptides qui antagonisent la signalisation de RANK [Ye et al., Nature, 418:443-7, 2002] [54].
RANKL est une cytokine de la superfamille du TNF. Il s'agit d'une protéine transmembranaire de type II (partie N-terminale intracellulaire) qui est surtout présente dans les organes lymphoïdes et le tissu osseux où elle est exprimée à la surface des ostéoblastes (cellules responsables de la formation osseuse) sous la forme d'un homotrimère [Leibbrandt et
Penninger, 2008, précité ; Naito et al., 1999, précité] [15, 16]. Il existe deux isoformes de RANKL (d'environ 40-45 kDa chacune) ainsi qu'une forme soluble (d'environ 30 kDa), cette dernière pouvant provenir d'un épissage alternatif ou d'un clivage protéolytique des formes membranaires par des protéases telles que TACE, MT1 -MMP, MMP-7 et MMP-14 [Leibbrandt et
Penninger, 2008, précité] [15]. La présente invention se rapporte également à un procédé d'identification d'une molécule candidate pour moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- préparation d'au moins une cellule ou d'un échantillon tissulaire exprimant RANK ;
- mise en contact de ladite au moins une cellule ou dudit échantillon tissulaire avec une molécule test ;
- détermination de l'expression ou l'activité de RANK ;
où une modulation de l'expression ou de l'activité de RANK en présence de la molécule test par rapport à l'expression ou l'activité de RANK en l'absence de ladite molécule test indique que la molécule test module l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
La « préparation d'au moins une cellule » est réalisée par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier, par exemple il s'agit de cellules ou échantillon de cellules exprimant RANK, de cellules ou échantillon de cellules transfectées pour exprimer RANK, voire d'un animal non-humain transgénique pour RANK. De préférence l'échantillon tissulaire exprimant RANK est une section de la peau d'un mammifère, préférentiellement humain.
La « mise en contact » est réalisée par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier, par exemple ajout de la molécule test dans le surnageant de culture, injection (sous-cutanée) ou application topique (sur l'epiderme ev. dans une formulation qui permet une pénétrance des couches suprabasales) de la molécule test.
La « détermination de l'activité ou de l'expression de RANK » est réalisée par n'importe quel moyen connu de l'homme du métier, par exemple par la visualisation directe de la stimulation ou de l'inhibition de la croissance des poils, de l'épaisseur de l'épiderme, la mélanisation de la peau en phase anagène rendant la peau noire, et/ou la quantification de l'ARNm de synthèse de kératine du poil ou de l'épiderme.
D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
La figure 1 représente la nécessité de RANK pour la phase anagène du HF (A) Les HF de souris Rankr1' sont arrêtés en phase télogène, alors que les souris WT de la même portée sont en phase anagène à P28 (B) Représentation schématique de la morphogenèse des et du cycle du HF dans les souris Rankl-/- et contrôle, et l'incapacité de toutes les souris Rankr1' d'entrer en phase anagène à P28-49 (C) Arrêt des HF Rank'1' en phase télogène (D) 5 jours après l'épilation des poils à P19, les HF sont en phase anagène avancée dans les souris WT mais restent en phase télogène dans les souris Rankr1'. Les souris WT traitées à blanc affichent une phase anagène normale. Les barres d'échelle représentent Ι ΟΌμηη, 50μηη dans les encarts. Les sections incluses dans la paraffine sont colorées par l'hématoxyline-éosine.
- La figure 2 représente l'indépendance des cellules souches et du compartiment cellulaire mésenchymateux du HF vis-à-vis de la RANK- signalisation (A) Identification de cellules souches CD34+ (B) et de cellules (SHG) P-cadhérine+ dans des HF en phase télogène de souris contrôle et Rankr1' à P24 par immunofluorescence. Les noyaux ont été coloprés avec DAPI. DP = papille dermique. Les barres d'échelle représentent 20μηη (B)
Cytométrie en flux de cellules souches CD34+ parmi des kératinocytes kératine 14+ dans des H F en phase télogène de souris WT et Rankr1'. Les flèches pointent les cellules kératine 14+ CD34+ dans le quadrant supérieur droit. Le graphe montre le % de cellules CD34+ et kératine 14+ dans 3 souris KO et contrôles de la même portée. *p<0,05 (C) Identification de papille dermique folliculaire par leur activité phosphatase alcaline. Les barres d'échelle représentent 20μηη (D) Renouvellement pilaire Rankr restauré après transplantation sur des souris nude à la semaine 3 et analyse à la semaine 6. Une section de peau Rankr1' montre des HF en phase anagène. L'image est représentative de 5 expérimentations de transplantation. La barre d'échelle représente Ι ΟΌμιτι. La section incluse dans la paraffine a été colorée par l'hématoxyline-éosine.
La figure 3 représente l'expression de RANK, RANKL et OPG dans les cellules souches du follicule pileux (A) Localisation de RANK, RANKL et OPG dans les cellules souches en phase télogène WT (B) et les cellules souches (SHG) à P24 par immunofluorescence. Les noyaux ont été marqués avec DAPI. DP = papille dermique. Les barres d'échelle représentent 20μηη. 6 souris ont été analysées pour RANK et RANKL, et 6 souris pour OPG (B) RT-PCR de Rank, Rankl, Opg et Gapdh dans des cellules SHG P-cadhérine+ et souches CD34+ triées par FACS (C) Mesures (moyenne ± écart-type) de la transcription des gènes Rankl et Opg par q RT-PCR dans la peau entière et (D) de RANKL et OPG solubles par ELISA dans des cultures peau-organe aux âges indiqués, n = nombre de souris par analyse, minimum de 6 souris / point dans le temps. (E) RT- PCR des transcrits de Rank, Rankl, Opg et Gapdh dans l'épiderme et le derme à P28 (F) Immunofluorescence de RANKL et de la kératine 14 sur une section de peau à P28. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. La barre d'échelle représente 50μηη (G) Immunofluorescence de RANKL et GATA-3 d'un HF en phase anagène. Les noyaux ont été colorés avec DAPI. La barre d'échelle représente 30μηη (H) Hybridation in situ pour l'ARNm de RANKL (antisens) ou contrôle (sens) sur de la peau en phase anagène P28.
La figure 4 représente l'entrée précoce en phase anagène dans les souris Rank-Tg et en réponse à RANKL recombinant (A) HF de souris WT en phase anagène ll/llla, alors que les HF de souris Rank-Tg sont déjà en phase anagène lllc à P24. Les barres d'échelle représente Ι ΟΌμιτι (B) HF de souris WT en phase télogène, alors que les HF de souris Rank-Tg sont en phase anagène IV/V à P86. Les barres d'échelle représente Ι ΟΟμηη (C) Représentation schématique de la morphogenèse des poils et des transitions de phase télogène à anagène du cycle pilaire dans des souris Rank-Tg et contrôle. Les flèches rouges pointent à P24 et les flèches bleues pointent à P56, correspondant aux images des panneaux (A) et (B) (D) Souris WT âgées de 8 semaines recevant 2 injections en sous-cutanée de l OO^ig de RANKL-GST ou de contrôle GST avec un d'intervalle de 12h. 6 jours plus tard, la peau noire a été analysée pour la phase anagène. La représentation graphique de 3 souris traitées sur 4, dont les HF sont entrés en phase anagène, par rapport aux souris contrôle restant en phase télogène (E) Image de HF en phase anagène d'une souris traitée par RANKL-GST, alors qu'elles sont en phase télogène dans la souris contrôle GST. Les barres d'échelle représentent Ι ΟΌμηη, 50μηη dans l'encart. Les sections incluses dans la paraffine ont été colorées par l'hématoxyline-éosine.
La figure 5 représente la régulation de l'homéostasie épidermique par RANK (A) Différentes épaisseurs de l'épiderme de la peau de souris Tg, WT, Rankr1' âgées de 4 semaines, visualisées sur des sections fixées, incluses dans la paraffine, colorées au trichrome de Masson. Les barres d'échelle représentent 20μηη (B) Epaisseur d'épiderme mesurée sur 10 images choisies aléatoirement de 4 souris de chaque génotype par unité de temps. Les données sont une moyenne de l'écart-type (C) Identification (têtes de flèches) de cellules de l'épiderme interfolliculaires en prolifération BrdLT, colorées à l'éosine. Les barres d'échelle représentent 20μηη (D) Graphique montrant le nombre de kératinocytes de l'épiderme BrdLT pour chaque souris. Les données sont une moyenne de l'écart-type (E) Souris Tg recevant un anticorps anti- RANKL ou injectées à blanc (contrôle) tous les 3 jours de P10 à P45. Les peaux sont analysées pour le cycle du HF et la taille de l'épiderme sur des sections colorées avec de l'hématoxyline-éosine. Les barres d'échelle représentent 50μηη (F) Représentation schématique du stade du HF de 8 souris traitées et de 7 souris contrôle (G) Mesures de l'épaisseur de l'épiderme de 8 souris traitées et de 7 souris contrôle. Les barres représentent des valeurs moyennes, ep = épiderme. (*p<0,05, **p<0,01 , ***p<0,001 ).
La figure 6 représente (A) la RT-PCR des transcrits de Rank, Rankl, Opg et Gapdh dans la peau de souris âgées de 5 jours et de 15 jours (B) l'hybridation in situ pour l'ARNm de RANK et RANKL (antisens) ou contrôle (RANK sens) au jours 5 postpartum (P5) (C) la morphogenèse d'un follicule pileux normal de souris Rank"'", affichant une phase anagène précoce à P5 et une entrée du cycle pilaire normale avec une phase catagène II à P15. Les barres d'échelle représentent Ι ΟΌμιτι (D) la présence des 4 types de poils (monotriche, alêne, auchène et zigzag) dans une souris Rankr1' âgée de 45 jours.
- La figure 7 représente (A) les follicules pileux Rankr1' ne parvenant pas à entrer en phase anagène au jour 40 post partum (P40) ou P45. Les follicules pileux WT sont en phase catagène VII à P40 et en seconde phase télogène à P45 (avec les cheveux club actuels). Les barres d'échelle représentent Ι ΟΌμιτι (B) les follicules pileux Rankr1' ne parvenant pas à entrer en phase anagène à P25. La peau du dos des souris Rankr1' et son contrôle de la même lignée WT ont été analysés pour l'initiation du renouvellement du HF à un âge où la phase anagène II est visible. Les barres d'échelle représentent 20Όμηη. Les sections incluses dans la paraffine ont été colorées avec l'hématoxyline-éosine (C) l'identification de rares cellules RANKL+ par un immunomarquage anti-RANKL dans l'épiderme WT à P28 avec un contre-marquage DAPI. Les barres d'échelle représentent 10μηη. * = marquage non spécifique du corneum stratum, les lignes pointillées indiquent la jonction dermo-épidermique (D) le marquage immunofluorescent de RANK dans une section de peau à P28 avec un contre-marquage DAPI. ORS = gaine de la racine externe, HF = follicule pileux, ep = épiderme. Les têtes des flèches pointent le renflement du follicule pileux. La barre d'échelle représente 20μηη (E) les sections de peau de souris WT à P28 montrant les cellules souches du renflement du follicule pileux doublement marqué cc6-RANK et CD34-RANK (flèches). Les noyaux ont été marqués avec DAPI. ep = épiderme, les têtes des flèches pointent le renflement. Les barres d'échelle représentent 20μηη et 30μηη (droite).
La figure 8 représente (A) la surexpression de RANK (tête de flèche) sous le contrôle du promoteur de gène S100A8 dans les cellules SHG P-cadhérine+. Les noyaux ont été marqués avec DAPI. B=renflement, DP=papille dermique. La barre d'échelle représente 20μηη (B) RANK- transgénique induisant la signalisation NF-κΒ. Les cellules HEK 293T ont été transfectées de manière transitoire avec le plasmide d'expression de Rank transgénique et un plasmide d'expression de la luciférase sous le contrôle de NF-κΒ. Les cellules ont été stimulés avec RANKL recombinant. L'activité du promoteur NF-κΒ a été exprimée comme le facteur d'augmentation des unités luciférase par rapport aux cellules ayant seulement reçu le plasmide rapporteur NF-κΒ. Les données sont représentatives de 3 expérimentations (C) les mesures (moyenne ±écart- type) des protéines OPG et RANKL solubles par ELISA dans des cultures peau-organe, aux âges indiqués dans les souris contrôle (WT) et Rank- transgénique (Tg) (D) les souris Rank-Tg âgées de 3 mois présentant une alopécie discrète par rapport aux souris de même portée contrôle (E) les cellules HEK 293T exprimant de manière stable RANK et transfectées avec le plasmide rapporteur NF-κΒ ont été stimulées avec différentes concentrations de RANKL-GST. Les données ont été exprimées comme le facteur d'augmentation des unités luciférase par rapport aux cellules non stimulées. Elles représentent les moyennes de triplicatas et sont représentatives de 3 expérimentations.
La figure 9 représente (A) l'immunolocalisation de RANK endogène de kératinocytes basaux dans des souris Ran/ -transgénique (Tg) et WT. Le contrôle a été réalisé via une immunoglobuline de chèvre antigène-non spécifique. Les noyaux ont été colorés par DAPI. Les barres d'échelle représentent 10μηη. * = coloration non spécifique du corneum stratum, les lignes pointillées indiquent la jonction dermo-épidermique (B) le TNFcc et l'IL-Ι β mesurés par ELISA dans les surnageants de cultures peau-organe de 24h de souris Rank-Tg et WT à des âges différents. Les niveaux en cytokine ont été normalisés au poids de peau. Chaque point de données représente une souris et les barres d'échelles représentent la valeur moyenne (± écart-type des barres verticales). (**p<0,01 ) (C) l'immunomarquage des cellules T CD3+ (flèches) dans la peau de souris Rank-Tg et WT. Le contre-marquage a été réalisé ave DAPI. Un marquage non spécifique du corneum stratum est indiqué par un astérisque. Les lignes pointillées indiquent la jonction dermo-épidermique. Les images sont représentatives d'au moins 3 souris de chaque groupe. Les barres d'échelle représentent 20μηη (D) la récupération cellulaire augmentée de kératinocytes épidermiques primaires de souris Rank-Tg âgées de 3 semaines par rapport aux contrôles WT, 15 jours après l'ensemencement d'un milieu de croissance de kératinocytes à faible teneur en calcium. Les données sont l'écart-type moyen de doublons et sont représentatives de 3 expérimentations . (p<0, 01 )
La figure 10 représente (A) l'immunolocalisation de la coloration des cytokératine 14, cytokératine 10, loricrine, involucrine, filaggrine et DAPI-nucléaire de la peau de souris Ran/ -transgénique, WT et Rank-/-. Les barres d'échelle représentent 20μηη. Les lignes pointillées indiquent la jonction dermo-épidermique. ep = épithélium (B) le test de la barrière épidermique avec le bleu de toluidine. Les souris WT et Tg âgées de 8 semaines sacrifiées ont été rasées et leur peau coupée avec des ciseaux au site indiqué, avant le test de pénétration du bleu de toluidine. A noter, la souris Tg est en phase anagène à 8 semaines, ce qui rend la peau relativement noire. La figure 1 1 représente la séquence de la construction Rank transgénique murine.
EXEMPLES
Exemple 1 : Matériel et Méthodes
Animaux
Les souris ont été maintenues dans un établissement fermé exempt de parasites et de virus suivant les lignes directrices de faculté et avec son accord de bioéthique animale (AL/01/20/1 1/08). Les souris Rankr1' ont été identifiées par le manque de dents, une taille plus petite et une PCR d'ADN génomique (cf. tableau 1 ci-dessous).
Tableau 1
Figure imgf000018_0001
Les échantillons de peau des souris Rankr [Rossi et al., 2007, précité] [22] ont été aimablement fournies par Graham Anderson, Université de Birmingham, UK. Les souris Rank-Tg ont été génotypées par PCR (figure 1 1 et tableau 1 ). Pour la transplantation de peau, les poils ont été coupés, la peau a été excisée et transplantée chez les souris nude (Harlan, Gannat, France) et suturée. Un jet cicatrisant a été appliqué. Une épilation de la peau a été réalisée sur les souris anesthésiées. 100 μg de RANKL-glutathione-s-transférase (GST) ou de contrôle GST ont été injectés en sous-cutanée au niveau de la région du cou de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines à 12 heures d'intervalle. Un anticorps monoclonal anti-RANKL (IK22-5) [Kamijo et al., Biochel. Biophys. Res. Commun., 347 : 124-132, Epub 2006 Jun2023, 2006] [30] a été injecté en sous-cutanée dans les souris Tg tous les 3 jours, 10 μg à P10, 25 μg de P13 à P28 et 50 μg de P31 à P45.
Histologie-immunofluorescence
La peau du dos a été fixée dans de la formaline 4% et inclus dans la paraffine. Des sections (6 μηη) ont été coupées, déparaffinées et colorées par l'hématoxyline-éosine ou le trichrome de Masson (Sigma-AIdrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France). Alternativement, la peau a été congelée dans l'OCT-Compound (TissuTEK, Delta Microscopie, Toulouse, France) et des sections (8 μιτι) ont été coupées, fixées dans l'acétone à -20°C pendant 10 min. Toutes les sections ont été bloquées avec du sérum de chèvre ou d'âne 2% (Sigma-AIdrich) et puis incubées toute une nuit à 4°C avec un anticorps primaire (cf. tableau 2 ci-dessous) dilué dans une solution saline tamponnée et sérum bloquant 1 %.
Tableau 2
Facteur
Clone et
Cible Espèce Conjugaison Application* Vendeur de désignation
dilution
Santa cruz,
RANK# N20 SC- CliniSciences,
Chèvre Purifié IF (congelé) 1/200 endogène 7626 Montrouge,
France
RANK R&D Systems
Chèvre AF 692 Purifié IF (congelé) 1/200 transgénique Lille, France
RANKL# Chèvre AF 462 Purifié IF (congelé) R&D Systems 1/100
Alexis,
Axxora,
OPG Souris OPG4-1 Ascite IF (congelé) 1/2000
Coger, Paris,
France
eBioscience,
CliniSciences,
CD34 Rat 14-0341 Purifié IF/FACS 1/150
Montrouge,
France 1/100
P-cadhérine Chèvre BAF 761 Biotine IF/FACS R&D Systems
1/20000
HG3-31 SC-
GATA-3 Souris Purifié IF Santa Cruz 1/200
268
Abcam, Paris,
Intégrine a6 Rat 19765 Purifié IF 1/50
France
Covance,
Eurogentec,
Filaggrine Lapin PRB-417P Purifié IF 1/2000
Seriaing,
Belgium
Kératine 10 Lapin PRB-159P Purifié IF Covance 1/2000
Kératine 14 Lapin PRB-155P Purifié IF/FACS Covance 1/2000
Loricrine Lapin PB-145P Purifié IF Covance 1/2000
Involucrine Lapin PRB-140C Purifié IF Covance 1/2000
AbC1 17- AbCys, Paris,
BrdU Rat Purifié IHC 1/100
7513 France
BD
CD3e Rat 145-2C1 1 Purifié IHC 1/200
Biosciences
* (IF) immunofluorescence, (FACS) trieur de cellules activé par fluorescence, (IHC) immunohistochimie
# Réhaussement du signal avec le système d'amplification Tyramide (Dupont) de RANK endogène et RANKL endogène dans les HF en phase télogène et l'épiderme
Les anticorps secondaires marqués au fluorochrome (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France) ont été incubés pendant 1 h à température ambiante. Pour les sections congelées, les sections ont été fixées dans la formaline avant coloration DAPI (Molecular Probes, Invitrogen). L'amplification du signal de la tyramide (PerkinElmer, Courtaboeuf, France) a été utilisée pour visualiser RANK et RANKL dans les souris WT. Pour révéler la phosphatase alcaline endogène de la papille dermique, les sections congelées fixées à l'acétone ont été incubées avec BCIP/NBT (Pierce, Thermo Scientific, lllkirch, France) jusqu'au développement complet de la couleur. RT-PCR
L'ARN des cellules SHG et du renflement triées [Greco et al., Cell Stem Cell, 4 : 155-169, 2009] [31 ] ont extraites en utilisant le RNeasy Micro (QIAgen, Courtaboeuf, France). L'ADNc a été synthétisé et amplifié en utilisant le protocole QuantiTect Whole Transcriptome (QIAgen). Pour la séparation épiderme-derme, les poils ont été coupés avec des ciseaux et de la crème dépilatoire (Nair) a été appliquée. Après 5 min., l'émulsion crème-poil a été retirée et la peau a été incubée pendant 4h à 37°C avec 1 mg/ml de dispase II (Roche Diagnostic). L'épiderme a alors été soigneusement retirée avec une pince. L'épiderme, le derme ou la peau entière congelés rapidement a été broyé en utilisant un pilon ou mortier rempli d'azote liquide, placé dans de la glace sèche. L'ARN a été extrait de la poudre obtenu par le TRI Reagent® (Ambion, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) et nettoyé par RNeasy (QIAgen). L'ADNc a été synthétisé en utilisant les amorces ImProm-ll RT et oligo(dT)i5 (Promega, Charbonnières-les-Bains, France). Des PCR classique et en temps réel ont été réalisées avec des amorces spécifiques de gènes (cf. tableau 3 ci- dessous).
Tableau 3
RANK sens 5 -TGCGTGCTGCTCGTTCCA
antisens 5 -TGCCAGGATCCACCGCCACCAG (262 pb)
RANKL sens 5 -AGCATCGCTCTGTTCCTGT
antisens 5 -TCGTGCTCCCTCC I I I CATC (592 pb)
PCR sens 5 -CAGCATCGCTCTGTTCCTGT
(en temps réel) antisens 5 -GCAGTGAGTGCTGTCTTCTGA
sonde 5 -TCGAGCGCAGATGGATCCTAACAGAA
OPG sens 5 -TGATGAGTTGTGTATTGCAGC
antisens 5 -TCTTACACTCTCGGCATTC (485 pb)
PCR sens 5 -CGAGGACCACAATGAACAAGTG
(en temps réel) antisens 5 -TGGGTTGTCCATTCAATGAGT
sonde 5 -CTGTGCTGCGCACTCCTGTGCT
GAPDH sens 5 -TCCATGACAACTTTGGTATCGTGG
antisens 5 -GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGAC (695 pb) Les réactions de PCR en temps réel ont été menées en utilisant Eurogentec qCR MasterMix Plus Low ROX sur un thermocycleur Stratagen MX4000. Les valeurs CT des gènes cibles ont été normalisées à la GAPDH et β-actine (amorces Applied Biosystems). Le facteur d'expression a été calculé en utilisant un outil logiciel d'expression relative (REST) (http://www.gene-quantification.de/rest.html).
Prolifération cellulaire
Pour visualiser les cellules en prolifération, les souris ont été injectées en intrapéritonéale avec 1 mg de BrdU (Sigma-AIdrich) 3h avant le sacrifice. Les tissus de peau du dos ont été fixés dans du paraformaldéhyde 4% et inclus dans la paraffine. La récupération de l'antigène a été réalisée dans un tampon citrate bouillant à pH 6 pendant 10 min., et la peroxydase endogène a été inhibée dans H2O2 3%. L'anticorps anti-BrdU a été incubé toute la nuit à 4°C. Puis, les sections ont été incubées avec un anticorps secondaire anti-lgG de rat (H+L) couplé à la biotine pendant 1 h30 à température ambiante, suivi par le complexe ABC conjugué au raifort (VectorLabs) pendant 1 h30. Le marquage a été révélé avec DAB (DiAminoBenzidine)-Ni et arrêté avec de l'eau distillée. Les sections ont été colorées avec de l'éosine.
ELISA
La peau du dos de souris a été excisée et pesée. Elle a été introduite, côté poil vers le haut, en milieu de culture cellulaire contenant du sérum de veau fœtal 10% (Invitrogen), des antibiotiques et fongicides, dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24h à 37°C. Le milieu de culture acellulaire a été stérilisé par filtration et RANKL et OPG solubles ont été mesurés par ELISA (DuoSet ELISA, R&D Systems, Lille, France). Les résultats ont été normalisés au poids de peau.
Cvtométrie en flux
Les cellules du HF ont été libérées de la peau entière comme précédemment décrit [Greco et al., 2009, précité] [31 ]. Elles ont été colorées pour CD34, révélées par un anticorps secondaire Alexa647 de chèvre anti-rat (Molecular Probes, Invitrogen), fixées, perméabilisées et colorées pour la kératine 14, révélées par un anticorps d'âne conjugué au FITC anti-lapin (Molecular Probes, Invitrogen). Les cellules ont été analysées en utilisant un cytomètre en flux FACSCalibur (Becton Dickinson Biosciences, Le Pont de Claix, France). Pour le tri, les cellules ont été en plus marquées pour la P-cadhérine suivi par la streptavidine-APC et triées sur le trieur de cellules FACSAria II (Becton Dickinson Biosciences) en cellules SHG P-cadhérine et cellules du renflement CD34+.
Hybridation in situ
L'hybridation in situ de l'ARNm de RANK et RANKL a été réalisée en utilisant des sondes ARNm sens et antisens marquées à la digoxigénine-UTP, comme précédemment décrit [Mueller et al., J. Immunol., 167 : 5052-5060, 2001 ] [32]. Le signal a été développé avec du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) et du nitro bleu de tétrazolium (NBT ; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, USA) pendant 1 à 2 jours à température ambiante dans le noir.
Mesure de la signalisation RANK
L'ADNc murin Rank transgénique et endogène a été amplifié de l'ADNc de peau Rank-Tg et WT et cloné dans pCR3.1 (Invitrogen) sous le contrôle du promoteur CMV. Les cellules HEK 293T ont été transfectées de manière transitoire en utilisant Fugene (Roche) ou une lignée cellulaire stable a été obtenue sous la sélection par G418. Pour la mesure de la signalisation NF-κΒ, le vecteur rapporteur de la NF-KB1 -luciférase (Panomics, Milan, Italie) a été transfecté de manière transitoire et 24h plus tard RANKL-GST a été ajouté. L'activité de la luciférase a été mesurée 24h plus tard, en utilisant les instructions des fabricants (Promega).
Production des cvtokines de la peau
La peau de souris Rank-Tg et WT a été pesée et introduite, côté poil vers le haut, dans un milieu de culture cellulaire contenant du sérum de veau fœtal 10% (Invitrogen), des antibiotique et fongicides, dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24h à 37°C. Le milieu de culture acellulaire a été stérilisé par filtration. Des ELISA TNF-cc et I L-1 β ont été réalisées en utilisant des anticorps anti-TNFcc (BD Biosciences) et le kit ELISA DuoSet (R&D Systems) pour IL-1 β.
Culture primaire de kératinocytes
Les poils de souris Rank-Tg et WT âgées de 21 jours ont été retirés
(crème Nair) et digérés avec la dispase II (Roche) pendant 18h à 4°C. L'épiderme a été décollé et trypsinisé (Gibco-lnvitrogen) pendant 30 min. à température ambiante pour libérer les kératinocytes basaux. Ces cellules ont alors été placées en culture dans un milieu de croissance de kératinocytes à faible teneur en calcium (CnT 57, CelInTec, Berne, Suisse) à une densité cellulaire initiale de 6x103 cellules/cm2. Les cultures ont été conservées sous CO2 5%/humidité 95% à 37°C pendant 15 jours avec un changement de milieu tous les 4 jours. Les cellules ont été détachés avec la trypsine et comptabilisées.
Test de la barrière épidermique
Des souris WT et Tg âgées de 8 semaines ont été rasées et leur peau a été coupée avec des ciseaux au niveau du dos. Elle a alors été déshydratée par étapes successives dans du méthanol et, après réhydratation, baignée dans du bleu de toluidine 0,01 % pendant 1 min.. Après lavage dans l'eau, les poils ont été complètement retirés avec une crème dépilatoire (Nair) et les souris ont été photographiées.
Exemple 2 : La stimulation de RANK n'est pas indispensable pour le développement normal du HF mais est requise pour la phase anagène du HF
De nombreux régulateurs moléculaires du cycle du follicule pileux (HF) commandent également le développement du HF [Schmidt-Ullrich et Paus, Bioessays, 27 : 247-261 , 2005] [33]. Par conséquent, l'importance de la stimulation de RANK dans la morphogenèse du HF a été étudiée.
L'expression de l'ARNm de RANK, RANKL et OPG a été analysée par RT-PCR dans la peau totale de souris sauvages (WT), 5 (P5) et 15 (P15) jours après la naissance, et il a été trouvé que les gènes étaient transcriptionnellement actifs (figure 6A). L'hybridation in situ de l'ARNm de RANK et RANKL à P5 a montré que les gènes ont été transcrits dans l'épiderme et la HF (figure 6B). Cela a confirmé de précédentes données quant à l'expression de RANK et RANKL dans l'épiderme et HF embryonnaires [Kartsogiannis et al., Bone, 25 : 525-534, 1999] [34]. La morphogenèse de HF de souris Rankr1' et souris contrôle de la même portée a été comparée. A P5, les HF de la peau du dos des souris WT étaient en morphogenèse HF postnatale, et à P15 ont commencé à entrer en phase catagène. Exactement le même phénomène a été observé dans les souris Rankr1' (figure 6C), dont la morphogenèse H F postnatale et le phénotype des cheveux macroscopique ont semblé impossibles à distinguer de ceux des souris WT la même portée [Paus et al., J. Invest. Dermatol., 1 13 : 523-532, 1999] [35]. En outre, les quatre types de cheveux (monotriche, poinçon, auchène et zigzag) ont été formés (figure 6D). Cela a démontré que la stimulation par RANK n'est pas indispensable pour la morphogenèse du HF.
Puis, il a été étudié si l'absence de stimulation par RANK a affecté le cycle de renouvellement du HF avec une entrée dans la phase de croissance du cheveu à environ P24 dans les souris C57BL/6 [Muller- Rover et al., J. Invest. Dermatol., 1 17 : 3-15, 2001 ] [36]. De manière frappante, les HF des souris Rankr1' ne sont pas entrés en phase anagène de P28 à P49, alors que les souris WT de la même portée ont depuis longtemps procédé en phase anagène ou ont déjà atteint leur seconde phase catagène (figure 1A,B et figure 7A). Egalement à P25, il n'y a aucun signe d'initiation de la phase anagènes, démontrant un réel blocage du cycle HF, plutôt que l'apparition d'une phase de croissance considérablement réduite, ratée (figure 7B). Comme attendu, étant donné que RANKL est le seul ligand de RANK [Bossen et al., J. Biol. Chem., 281 : 13964-13971 , 2006] [37], les souris Rank'1' ont également omis d'effectuer la transition de la phase télogène à la phase anagène (figure 1 C).
Dans la mesure où l'épilation des cheveux peut provoquer expérimentalement une activation du cycle pilaire [Wilson et al., Differentiation, 55 : 127-136, 1994] [38], ce stimulus a été testé sur les souris Rankr1'. 5 jours après l'épilation pilaire, des souris contrôles âgées de 24 jours étaient en phase anagène avancée, mais les souris déficientes pour Rankl sont toujours restées en phase télogène (figure 1 D). Ainsi, en l'absence de stimulation de RANK par RANKL, le HF des souris a été arrêté dans la première phase télogène postnatale et a été incapable d'entrer en phase de croissance anagène.
Exemple 3 : l'arrêt en phase télogène en l'absence de stimulation de RANK ne résulte pas de défauts du compartiment des cellules souches du HF ou d'un mésenchyme du HF défectueux
Au moins deux sous-populations distinctes de cellules épithéliales du HF sont nécessaires pour la formation de la phase anagène normale, les cellules souches du renflement [Cotsarelis, 2006, précité ; Panteleyev et al., J. Cell Sci., 1 14 : 3419-3431 , 2001 ] [2, 39] et les cellules germinales secondaires des cheveux (SHG) [Greco et al., 2009, précité ; Jaks et al.,
Nat. Genêt., 40 : 1291 -1299, 2008] [31 , 40]. Par conséquent, la présence de ces cellules dans des animaux Rankr1' a été étudiée.
L'immunofluorescence pour CD34, un marqueur des cellules souches murines du renflement (aussi appelées cellules souches du follicule pileux) [Tumbar et al., Science, 303 : 359-363, 2004] [41 ], a montré que le renflement a été préservé dans le HF de la phase télogène des souris Rankr1' (figure 2A). Leur quantification par cytométrie en flux a révélée que la quantité a seulement été légèrement réduite (figure 2B). L'immunofluorescence pour la cadhérine-P [Greco et al., 2009, précité] [31], a montré que les cellules SHG étaient également présentes (figure 2A). Ainsi, l'absence de RANKL n'a pas suffisamment dépiété ces cellules pour expliquer l'arrêt du HF en phase télogène.
Le développement de la phase anagène nécessite également des signaux inductifs de la papille dermique (DP) folliculaire mésenchymateuse [Jahoda et Reynolds, Dermatol. Clin., 14 : 573-583, 1996] [42]. Par conséquent, sa présence a été étudiée par histochimie utilisant l'enzyme phosphatase alcaline [Handjiski et al., Br. J. Dermatol., 131 : 303-310, 1994] [43]. L'activité de l'enzyme dans la bonne position sous le HF a révélé la présence de DP morphologiquement et enzyme- histochimiquement normales dans les souris Rankr1' (figure 2C). Cela a démontré que le HF de la phase télogène des souris Rankr1' contenait tous les éléments cellulaires requis pour la transition télogène-anagène.
Il a alors été étudié si l'arrêt du cycle pilaire peut être sauvé. Pour ce faire, la peau rasée de souris Rankr1' âgées de 21 jours, dont les HF étaient tous en phase télogène, a été transplantée sur des souris nude du même âge. Comme RANKL est produit au cours de la cicatrisation par néo-vascularisation et par les kératinocytes épidermiques activés [Loser et al., Nat. Med., 12 : 1372-1379, 2006 ; Collin-Osdoby et al., J. Biol. Chem., 276 : 20659-20672, 2001 ] [44, 45], on pourrait s'attendre à ce que le destinataire RANKL soit synthétisé et complémentes la déficience génétique. La repousse pilaire et le développement de la phase anagène de la peau greffée ont été suivis. Il a été observé qu'en 10 jours à la fois la peau transplantée des souris Rankr1' et WT a acquis une apparence noire, signe de phase anagène, et qu'en 3 semaines tous les transplants ont présenté une repousse pilaire complète (figure 2D). Les sections de peau ont confirmé que les HF des souris déficientes pour Rankl étaient en phase anagène. Ces résultats ont établi que le compartiment des cellules souches épithéliales et le mésenchyme du HF inductif des HF des souris Rankl"'" étaient fonctionnels. Exemple 4 : RANK est exprimé par les cellules souches épithéliales du HF
Afin de mieux comprendre comment RANK régule la transition télogène-anagène, le site de l'expression de RANK dans les HF de la phase télogène a été déterminé.
Un marquage immunofluorescent a localisé RANK au niveau du renflement et des cellules SHG (figure 3A). RANKL et le récepteur OPG leurre de RANKL sont également exprimés au niveaux de ces sites (figure 3A). L'immunoréactivité de RANK et RANKL a été faible, nécessitant une amplification du signal, alors que le récepteur OPG a pu être facilement visualisé sans amplification. Cela concorde avec des résultats de profil génétique publiés, qui ont démontré une transcription abondante de Opg dans les cellules épithéliales murines du renflement [Morris et al., Nat. Biotechnol., 22 : 41 1 -417, 2004 ; Greco et al., 2009, précité] [46, 31]. RANK, RANKL ou le récepteur OPG ont été indétectables dans le DP. Une RT-PCR de cellules CD34+ et P-cadhérine+, qui ont été isolées et triés par FACS [Greco et al., 2009, précité] [31 ], a confirmé l'activité transcriptionnelle de Rank, Rankl et Opg dans les cellules épithéliales du renflement CD34+ et les cellules épithéliales SHG P-cadhérine+ (figure 3B).
II a ensuite été étudié si l'expression de RANKL et OPG a changé au cours du cycle pilaire en mesurant leur ARNm par qRT-PCR dans la peau totale. L'expression du gène de OPG a été maximale du début au milieu de la phase télogène, alors que celle de RANKL a culminé en début de phase anagène (figure 3C). Comme RANKL et OPG sont des protéines solubles, leur niveau en protéine a été mesuré par ELISA dans surnageant d'une culture de peau de 24h. La figure 3G a démontré que les niveaux de protéines RANKL et OPG reflétaient les changements en ARNm avec des niveaux maximums de OPG à la phase télogène suivis par un pic de RANKL. Pour découvrir le site de l'expression de RANKL au cours de son pic, une RT-PCT a été réalisée sur l'épiderme et derme séparés (figure
3E). Il a été montré que l'expression de RANKL est restreinte au derme. Un marquage immunofluorescent anti-RANKL/kératine 14 de la peau entière a révélé la présence de RANKL dans le HF inférieur (figure 3F) et un co-marquage avec GATA-3, un marqueur de la gaine de la racine interne du HF [Kaufman et al., Gènes Dev., 17 : 2108-2122, 2003] [47], a démontré que RANKL était localisé au niveau de la gaine de la racine interne et de la cuticule(figure 3G). Du fait que RANKL est une protéine soluble et que la détection au niveau de ces sites pourrait être la conséquence d'une liaison à des composants extracellulaires, son ARNm a été visualisé sur des sections par hybridation in situ (figure 3H). De nouveau, l'activité du gène RANK a été identifiée dans le HF inférieur. Il n'y a aucune expression de RANKL dans l'épiderme sauf pour quelques rares cellules RANKL+, en accord avec de précédents résultats [Loser et al., 2006, précité] [44] (figure 7C).
Dans la peau en phase anagène, RANK a été identifié dans le renflement, la gaine de la racine externe et l'épiderme (figure 7D). Un double-marquage de RANK avec CD34 et l'intégrine cc6, deux parqueurs des cellules du renflement [Morris et al., 2004, précité ; Tumbar et al., 2004, précité] [46, 41 ], a validé l'expression de RANK dans les cellules souches du renflement en phase anagène (figure 7E). Pris ensemble, ces résultats ont démontré que RANK, RANKL et OPG étaient exprimés par les cellules du renflement et les cellules SHG. Comme la cycle pilaire progresse de la phase télogène à la phase anagène, l'expression de OPG diminue mais celle de RANKL augmente. Cela a démontré qu'à la transition de phase télogène-anagène plus de RANKL OPG-libre était disponible pour lier RANK et conduire les cellules souche du HF en prolifération.
Exemple 5 : La stimulation de RANK déclenche l'entrée en phase anagène
Afin d'examiner plus avant l'importance de l'activation par RANK de l'induction de la phase anagène, une souris transgénique (Tg) pour Rank sous le contrôle du promoteur du gène S100A8. Ce promoteur a déjà été identifié comme actif dans le HF humain [Schmidt et al., J. Invest. Dermatol., 1 17 : 748-750, 2001 ] [48], et, récemment, a été trouvé transcrit dans les cellules SHG [Greco et al., 2009, précité] [31]. Un marquage immunofluorescent des HF en phase télogène a confirmé que RANK était surexprimé dans les cellules SHG (figure 8A). RANK endogène n'a pas été identifié du fait que sa visualisation nécessitait une amplification du signal. L'expression de la construction RANK Tg dans les cellules embryonnaires humaines de rein (HEK) 293T a montré que RANK était localisé à la surface cellulaire et qu'il activait la signalisation NF-κΒ comme attendu [Anderson et al., Nature, 390 : 175-179, 1997] [49] (figure 8B). La production de RANKL et OPG a également été suivie dans ces souris, par ELISA de cultures de peau de la semaine 3 à 5. Les souris Tg ont affiché une augmentation de RANKL en particulier pendant son pic de production en phase anagène, mais ont montré un niveau de OPG réduit (figure 8C). Ainsi, avec une surexpression de RANK dans le HF et un ratio activation RANK-RANKL / OPG plus favorable, un engagement accru de RANK du de HF était attendu.
En effet, il a été montré que la première entrée en phase anagène a été avancé de 1 à 2 jours (figure 4A,C). Par ailleurs, deux cycles de phase anagène prématurés évoluant rapidement ont eu lieu aux semaines 8 et 1 1 , alors que les souris contrôles de même portée étaient en phase télogène (figure 4B,C). Les souris Tg âgées de 3 mois ont montré une légère alopécie (figure 8D), similaire à celle d'autres souris mutantes avec un cycle de HF anormalement rapide [Mecklenburg et al., Exp. Dermatol.,
14 : 561 -570, 2005] [50].
Afin de savoir si le renouvellement pilaire pouvait être prématurément induit dans des souris WT par stimulation de RANK, un RANKL recombinant (r) a été injecté en sous-cutané à des souris âgées de 8 semaines en phase télogène. La fonctionnalité de RANKLr fusionnée à l'étiquette glutathione-s-transférase (GST) a été confirmée par signalisation NF-κΒ dans des cellules HEK 293T exprimant RANK (figure 8E). les souris contrôle ont reçu seulement GST. L'analyse de cycle pilaire 6 jours après l'injection a révélé que 3 souris sur 4 ont répondu à RANKLr-GST par une phase anagène prématurée (figure 3F, G). Ces résultats soutiennent l'importance de la stimulation de RANK comme un signal d'entrée du cycle pilaire crucial.
Exemple 6 : RANKL régule l'homéostasie épidermique
Comme des animaux Rank-Tg ont exprimé plus de RANKL soluble mais moins de OPG dans la peau, il a été étudié si cela pourrait affecter l'épiderme. Premièrement, l'expression de RANK dans l'épiderme a été analysée dans les souris Tg et il a été trouvé qu'il était exprimé par les kératinocytes basaux (figure 9A). La détection de RANK Tg était exclue, du fait que l'anticorps est dirigé contre le peptide N-terminal, qui est absent de la construction ADNc (figure 1 1 ). Il est évident que l'épithélium Rank-Tg a été considérablement épaissi (figure 5A,B). Au contraire, la taille de l'épiderme des souris déficiente en Rankl a été légèrement mais significativement réduite (figure 5A,B). Par conséquent, le taux de renouvellement de l'épiderme a été déterminé en utilisant l'analogue de la thymidine BrdU. Les kératinocytes BrdLT en prolifération ont été pratiquement absents dans les souris déficientes en Rankl mais très abondantes dans l'épiderme des souris Rank-Tg (figure 5C). La quantification des cellules épithéliales interfolliculaires BrdLT par comptage de cellules sur les sections ont mis en évidence une réduction significative pour les souris déficientes en Rankl et une augmentation de 8 fois très significative pour les souris Tg (figure 5D). Ensuite, la peau des souris Tg a été analysée pour des signes d'activation cellulaire en mesurant la libération de TNFcc et d'IL-1 β. Comme montré dans la figure 9B, il y a eu une petite mais significative augmentation en THFcc et I L-1 β dans la peau de souris Tg à P21 et P30, respectivement. Cependant, il n'y a eu aucune infiltration de cellules T CD3+ non dermiques (figure 9C) et la culture de kératinocytes à P21 a résulté en 3 fois plus de récupération de cellules après 2 semaines par rapport au WT (figure 9D). Cela soutient une prolifération cellulaire autonome améliorée dans les souris Tg, encore que, du fait d'une production augmentée de cytokines inflammatoires, leur contribution au renouvellement accéléré de l'épiderme ne peut pas être formellement exclue. Sauf pour la kératine 14, qui s'est étendue au-delà de sa restriction normale dans les animaux Tg et qui est probablement secondaire à la vitesse élevée de prolifération [Hobbs et al., J. Invest. Dermatol., 123 : 503-515, 2004 ; Pasparakis et al., Nature, 417 : 861 -866, 2002] [51 , 52], la différenciation de l'épiderme dans les deux modèles murins a été normale à en juger par l'expression de la kératine 10, la loricrine, l'involucrine et la filagrine (figure 10A). Par ailleurs, il n'y a pas eu de pénétration de bleu de toluidine (figure 10B), démontrant une fonction normale de la barrière de la peau. Finalement, les souris Tg ont été traitées avec un anticorps monoclonal anti-RANKL. Comme montré dans la figure 5E,F,G, cela a entraîné un retard dans le cycle pilaire et une épaisseur épidermique significativement réduite.
Ensemble, ces données ont démontré que RANKL joue un rôle important dans le renouvellement de l'épiderme qui intervient normalement au cours de la phase anagène, une source naturelle de RANKL, mais qui est anormalement augmenté conduisant à une hyperplasie épidermique lorsque RANKL est surproduit.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Utilisation d'un ligand de RANK pour la fabrication d'un médicament destiné à moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
2. Utilisation selon la revendication 1 , où les cellules épithéliales sont des cellules de l'épiderme, du follicule pileux ou de la glande sébacée.
3. Utilisation d'un ligand de RANK pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de maladies inflammatoires de la peau choisies dans le groupe comprenant le psoriasis et la dermatite atypique, de l'alopécie et/ou de l'hirsutisme.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le ligand de RANK est RANKL.
5. Composition pharmaceutique comprenant au moins un ligand de RANK et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
6. Composition selon la revendication 5, où ledit ligand de RANK est RANKL.
7. Utilisation d'une composition pharmaceutique telle que définie dans la revendication 5 ou 6 pour la fabrication d'un médicament de maladies inflammatoires de la peau choisies dans le groupe comprenant le psoriasis, la dermatite atypique, de l'alopécie et/ou de l'hirsutisme.
8. Composition cosmétique ou dermatologique comprenant au moins un ligand de RANK et un agent de formulation acceptable.
9. Composition selon la revendication 8, où ledit ligand de RANK est RANKL.
10. Utilisation cosmétique d'une composition telle que définie dans la revendication 8 ou 9 pour moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
1 1 . Utilisation cosmétique selon la revendication 10, pour provoquer ou stimuler la croissance des cheveux et/ou des poils.
12. Utilisation cosmétique selon la revendication 10, pour retarder ou inhiber la croissance des cheveux et/ou poils.
13. Procédé cosmétique destiné à moduler la croissance des cheveux et/ou des poils comprenant une étape d'application sur la peau d'un ligand de RANK ou d'une composition cosmétique ou dermatologique telle que définie dans la revendication 8 ou 9.
14. Procédé d'identification d'une molécule candidate pour moduler l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- préparation d'au moins une cellule ou d'un échantillon tissulaire exprimant RANK ;
- mise en contact de ladite au moins une cellule ou dudit échantillon tissulaire avec une molécule test ;
- détermination de l'expression ou l'activité de RANK ;
où une modulation de l'expression ou de l'activité de RANK en présence de la molécule test par rapport à l'expression ou l'activité de RANK en l'absence de ladite molécule test indique que la molécule test module l'homéostasie et/ou la croissance des cellules épithéliales de l'unité épidermo-pilo-sébacée.
15. Procédé selon la revendication 14, où l'échantillon tissulaire est une section de la peau.
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