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WO2012150314A1 - Méthode de génération de protéines - Google Patents

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WO2012150314A1
WO2012150314A1 PCT/EP2012/058185 EP2012058185W WO2012150314A1 WO 2012150314 A1 WO2012150314 A1 WO 2012150314A1 EP 2012058185 W EP2012058185 W EP 2012058185W WO 2012150314 A1 WO2012150314 A1 WO 2012150314A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sac7d
sequence
sso7d
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2012/058185
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric PECORARI
Charles Tellier
Barbara MOURATOU
Ghislaine Behar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Nantes
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Nantes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Nantes filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2012150314A1 publication Critical patent/WO2012150314A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the invention relates to the field of ligand generation that can be used for affinity chromatography for the purification or isolation of biological compounds, and especially immunoglobulins.
  • the affinity chromatography is carried out using a resin on which is immobilized a molecule (ligand) having the property of binding specifically to that which one wants to isolate.
  • This ligand may already be present in the resin, because of the nature of the resin used. This is the case of the dextran component Sephadex TM, a resin normally used for gel filtration.
  • Sephadex TM a resin normally used for gel filtration.
  • a specific ligand must generally be attached to a resin which, as such, does not have affinity for the molecule of interest.
  • antibodies can be bound to resins so that they acquire affinity for the corresponding antigens.
  • the principle of affinity chromatography comprises the steps of bringing into contact a mixture containing the molecule of interest and the resin containing the ligand, under conditions favorable to ligand-specific molecule binding.
  • the molecules for which the ligand has no affinity will not bind to the resin and are then eluted, while the molecules of interest remain bound to the column because of their affinity for the ligand.
  • This step may be carried out in various ways, in particular by modifying the conditions to which the resin-molecule of interest complex is exposed, in order to reduce the stability of the ligand-molecule interaction of interest.
  • the solvent composition can be modified to lower the affinity or add a competitor ligand.
  • the molecules of interest are then detached from the resin, and can be isolated in the desorption solvent.
  • the application WO 2008/068637 describes the use of a library based on the Sac7d protein to obtain ligands having an affinity for targets of interest. This application exemplifies the use of this library to obtain proteins having an affinity for the PulD protein.
  • the method described in WO 2008/068637 comprises the generation of combinatorial libraries containing a plurality of DNA molecules having all the same sequence, except for the presence of certain random mutations leading to the production of a protein mutated to certain predetermined amino acids.
  • the base skeleton is a Sac7d protein, as defined above, and in which mutations are introduced to generate a variability at the amino acids K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, T40, R42, A44, S46. Variability can also be introduced on other amino acids, such as V26, G27, K28, M29, S31, R42, A44, S46, E47 and K48. These amino acids are based on the sequence of Sac7d, as represented by SEQ ID No. 1.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to "carry" the mutations observed on the polypeptides selected by the method of WO 2008/068637 of the Sac7d protein to other proteins while maintaining a good affinity for the target, and that It is thus also possible to improve the properties of the ligands thus obtained.
  • the document EP 1930342 describes the principle of the introduction of mutations in the Sac7d protein, in order to modify the specificity of binding and to allow the binding to other ligands (such as protein ligands) than the natural ligand (DNA ).
  • WO 2007/01 1891 describes polymerases fused to a DNA binding domain, in particular of the Sac7d protein family. Mutations can be made in this DNA binding domain.
  • Mouratou et al is the scientific article related to EP 1930342, which discloses the use of a Sac7d library for identifying a protein binding to PulD.
  • Geta et al J. Mol Biol, 201 1, 409, 601-16 describes the use of Sso7d to generate proteins binding to various targets.
  • WO 03/006496 describes the principle of mutating a number of residues of neocarzinostatin or homologous proteins (macromycin, actinoxantine, kedarcidin, protein C-1027) to modify the binding specificity of these proteins. This document is similar to Heyd et al (Biochemistry, 2003, 42, 5674-83). The teaching of this document is thus close to the teaching of documents EP 1930342, WO 2007/01 1891, Mouratou et al, and Geta et al cited above.
  • Peet et al (Chemistry and Biotechnology, 1998, 5, 13-21) describes the mutation of certain amino acids in the RXR protein, leading to a change in specificity. It thus approaches the documents EP 1930342, WO 2007/01 1891, Mouratou et al and Geta et al, cited above.
  • Zahnd et al J. Biol Chem, 2006, 281, 35167-75 discloses the selection of "DARPins” proteins binding to the epithelial growth factor receptor (Her2). These proteins are selected by screening two different combinatorial libraries using the "Ribosome Display” technique. The authors of this document do not consider the use of other skeletons, nor the possibility of wearing identified mutations on another skeleton. In this respect, it is interesting to note that the mutations observed on the first two Repeated sequences of the proteins obtained through the N3C library are different from the mutations observed for the corresponding regions of N2C.
  • the invention thus relates to a method for generating new proteins, when one is in possession of a mutant of a protein of the Sac7d family (as defined above, which notably comprises the Sac7d proteins, Sso7d, Sac7e, Ssh7b, SSh7a, DBP7 and Sis7), having a recognition site of a molecule of interest.
  • Sac7d family as defined above, which notably comprises the Sac7d proteins, Sso7d, Sac7e, Ssh7b, SSh7a, DBP7 and Sis7
  • the amino acids forming said recognition site are identified by comparison of the sequence of said mutant with the sequence of the corresponding wild-type Sac7d family protein, and identification of the mutated amino acids with respect to the wild-type sequence. This can notably be done by using adapted software such as the BLAST software (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., (1990), J Mol Biol 215 (3): 403-410), which is adapted for the comparison of two sequences, which is available on the NCBI website.
  • BLAST software Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., (1990), J Mol Biol 215 (3): 403-410
  • the next step is to integrate these amino acids into another protein of the Sac7d family instead of wild amino acids located in the same place as those of the initial protein.
  • the alignment as shown in FIG. 1 can be used for this purpose.
  • the use of this method thus makes it possible to transfer the ability to recognize the molecule of interest carried by the initial protein to another protein, which can lead to an improvement in other properties of the newly obtained protein.
  • the inventors have shown that it has been possible to improve the alkaline resistance of an immunoglobulin ligand by transferring the Sac7d skeleton recognition site to the Sso7d backbone, while maintaining an affinity quite satisfactory for immunoglobulins.
  • the invention thus relates to a method for generating a nucleic acid encoding a protein having an affinity for a molecule of interest, comprising the steps of:
  • the invention also relates to a method for generating a protein having an affinity for a molecule of interest, comprising the steps of: a) comparing the sequence of an initial mutant of a protein of the Sac7d family, said mutant having an affinity for said molecule of interest, with the sequence of the corresponding wild-type protein of the Sac7d family
  • the Sac7d family is a family of 7 kDa DNA-binding proteins isolated from extremophilic bacteria. These proteins and this family are described in particular in WO 2008/068637. Thus, in the context of the present invention, a protein belongs to the Sac7d family when it has a sequence corresponding to the sequence SEQ ID No. 8.
  • a mutant of a Sac7d family protein has a sequence based on SEQ ID NO: 8, but in which at least 3, preferably at least 5, more preferably at least 8, even more preferably at least 10 amino acids have been mutated with respect to SEQ ID No. 8.
  • the sequence of a mutant of a protein of the Sac7d family has no more than 16 amino acids different from the amino acids of SEQ ID NO: 8.
  • the differences are observed in the amino acids selected from K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, M29, S31, T33, T41, R43, A45, S46, G27, K28, E48 and K49 of SEQ. ID N ° 8.
  • a mutant of a protein of the Sac7d family can be obtained by any mutation method known in the art.
  • Sac7d The Sac7d family comprises, in particular, Sac7d (Sulfolobus acidocaldarius), Sso7d (S. solfactaricus), Sac7e (S. acidocaldarius), Ssh7b (S. shibatae), SSh7a (S. shibatae), DBP7 (S. tokodaii) and Sis7 ( S. islandicus) whose sequences are represented by SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 7 respectively.
  • said protein of the Sac7d family is the Sac7d protein whose wild-type sequence is represented by SEQ ID No. 1.
  • said other protein of the family is selected from the group consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family consisting of the family
  • Sac7d is the Sso7d protein whose wild-type sequence is represented by SEQ ID No. 2.
  • step a) of the methods according to the invention is carried out on the basis of the sequences as indicated above.
  • step c) The determination of the sequence of the nucleic acid or of the polypeptide to be synthesized in step c) is carried out in particular by using FIG. 1 which shows the alignment of the wild protein sequences of the Sac7d family. It is therefore easy to identify the amino acids that must be mutated in the other proteins of the Sac7d family.
  • nucleic acid or polypeptide The synthesis of the nucleic acid or polypeptide is carried out according to methods known in the art.
  • the nucleic acids can be produced by chemical synthesis.
  • polypeptides according to the invention may be produced by solid phase chemical synthesis or by genetic recombination.
  • This synthesis For example, a chemical synthesizer can be made with an automatic peptide synthesizer of the Applied Biosystems type, mod. 433A. It can be carried out for example in Fmoc chemistry which uses the fluoremylmethyloxycarbonyl group for the temporary protection of the ⁇ -amino function of the amino acids.
  • polypeptides according to the invention by genetic engineering, in particular by integrating a nucleic acid sequence encoding said polypeptide into an expression vector.
  • This expression vector is then introduced into a host cell (bacteria such as Escherichia coli are particularly suitable), which is cultured under culture conditions allowing the synthesis of the polypeptide (inducible promoters can in particular be used upstream of the polypeptide in the expression vector).
  • bacteria bacteria such as Escherichia coli are particularly suitable
  • the synthesized polypeptide is then recovered, and any type of N- or C-terminal molecules of the polypeptide can be grafted.
  • polypeptides produced by the methods according to the invention can also be coupled to other proteins. This coupling can be carried out by the production of a fusion protein (the polypeptides according to the invention being localized at the N- or C-terminal of the fusion protein in one or more examples linked in tandem) or by chemical coupling.
  • a binding peptide can be used when coupling between two proteins, which may optionally contain a recognition site for a protease, such as the Tobacco Etch Virus (TEV) protease that recognizes the ENLYFQG site (SEQ ID N ° 9).
  • TSV Tobacco Etch Virus
  • reporter protein which has a characteristic allowing it to be observed in the laboratory (fluorescence, detectable enzyme activity).
  • reporter proteins it is possible to note the green fluorescent protein (GFP), the luciferase, GUS protein, (beta-glucuronidase), lacZ protein ( ⁇ -galactosidase), alkaline phosphatase.
  • the polypeptides produced by the methods according to the invention can also be coupled to one or more attachment units (elements which can be fixed or fixed in particular to a solid support or to another compound for detection or capture) in order to obtain a reagent.
  • attachment units elements which can be fixed or fixed in particular to a solid support or to another compound for detection or capture
  • CBD chitin binding domain
  • peptide tags His * 6, FLAG, HA, myc, etc.
  • tags that allow detection or capture without post-translational modification, or tags that require post-translational modification such as AviTag can be cited.
  • proteins such as avidin, streptavidin.
  • solid supports such as magnetic beads, agarose beads or latex, ELISA supports, affinity columns on which the polypeptides according to the invention are coupled.
  • polypeptides produced by the methods according to the invention are particularly interesting for isolating targets of interest by affinity chromatography.
  • a ligand there are pre-prepared resins on which a ligand can be coupled. These are specialized resins intended solely for this purpose. They generally have an easily activatable chemical group located at the end of a spreader arm. Various resins exist with various activatable groups depending on the chemical nature of the ligand that is to be used: cyanogen bromide or p-nitrophenyl for coupling a ligand with an amine, hydrazine for an aldehyde, a thiol for another thiol, etc. In this case, the polypeptides are preferably coupled using an agarose resin (such as the Sepharose TM resin) activated by N-hydroxy-succinimide (NHS).
  • an agarose resin such as the Sepharose TM resin
  • NHS N-hydroxy-succinimide
  • Figure 1 Alignment of the Ssh7b, Sis7, Sso7d, Ssh7a, DBP7, Sac7d and Sac7e protein sequences.
  • FIG. 1 D1 Sac7d and D1 Sso7d D1 protein binding activity against various IgGs by ELISA
  • Figure 3 Specificity test of D1 proteins Sac7d and D1 Sso7d by Western Blot. Legend: 1: IgG alone; 2: hLgG + DMEM; 3: DMEM; M: size marker; 4: hlgG; 5: hLgG + extract from E. coli; 6: extract from E. coli
  • Figure 4 Competition for IgG recognition with Protein A and CD64. Characterization of the epitope recognized by D1 Sac7d and D1 Sso7d by the method of successive injections on a surface covered with IgG.
  • Fig.A Successive injections of the analytes.
  • Fig.B co-injection of the analytes.
  • the C3 measurements are indicative only to show a significant effect when the epitopes are at least overlapping.
  • Figure 5 Stability of D1 Sac7d (5.A.) and D1 Sso7d (5.B.) Proteins at Alkaline pH
  • Figure 6 Affinity Chromatography with a column to which D1 Sso7d protein is attached.
  • Fig 6.A Purification of IgG present in DMEM + fetal calf serum.
  • Fig 6.B Purification of IgG present in an extract of E. coli.
  • Fig 6.C Comparison of the purification of IgGI in the form of ascites injected into a D1 Sso7d column and a Protein A column.
  • M size marker
  • Inj sample injected on the column
  • FT fraction not retained by the column
  • EL fraction eluted from the column
  • the immunoglobulins used in this study were purchased from
  • hlgG i.e., whole human IgG IgG-containing IgG1, hlgG2, hlgG3, hlgG4: reference 56834
  • hlGG1 reference: I5029
  • hlGG2, hlgG3, hlgG4 mouse IgG, rat, sheep, goat, rabbit, pig and hlgA.
  • the cloning and expression vector of the affinity proteins (D1 Sac7d and D1 Sso7d) pFP1001 allows the expression of proteins with an N-terminal polyhistidine tag and is a derivative of the pQE30 vector (Qiagen) in which the stop codon TGA has been replaced by two TAATGA stop codons by PCR.
  • oligonucleotides were used T7C (SEQ ID NO: 13: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC), SDAJV1RGS (SEQ ID NO: 14: AG AC C AC AAC G GTTTC C CTCTAG AAATAAT-TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGAGAGGATCG), SCIib2.1 (SEQ ID N 15: GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGAT- CCGTCAAGGTGAAATTC) SCIib3.2 (SEQ ID NO: 16: GGATCCGTCAAGG- TGAAATTCAAATATAAAGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC) SCIib3.3 (SEQ ID NO: 17: CTTGCCGTTGTCGTCGTAGGTAAASNNCA- CSNNSNNSNNSN N ACG CCAAACTTTCTTG ATCTTACTAGTGTCCACTTC)
  • the protein was fused to a spacer.
  • the sequence of this spacer, corresponding in part to the TolA protein of £. coli was first introduced into the vector pFP1001 by performing PCR with Taq polymerase from a colony of E. coli. coli (strain DH5a) and oligonucleotides tolA_coli_F (SEQ ID NO: 20: GAGAAAGGATCCCTTTATATGGCCTCGGGGGCCGAGT-TCGAATCTGGTGGCCAGAAGCAAGCTGAAGAGGCGGCAGCG) and tolA_coli_R (SEQ ID No.
  • the final assembly product corresponds to the Sac7d library with all the necessary 5'- and 3'- regions for its use in ribosome display selection as previously described (Hanes et al., 1998, Schaffitzel et al., 1999). ).
  • the target protein was biotinylated.
  • Biotinylation was performed by incubating a 10 ⁇ l solution of the Fc fragment of human IgG (Bethyl Iboratories) with 20 molar excess of sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin, Pierce) in a PBS buffer pH7.4 on ice for 1 h.
  • the biotinylated Fc buffer was then exchanged using a microcentrifuge column (Pierce) equilibrated with TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl).
  • the degree of biotinylation was determined using the HABA assay (Sigma) as being about 2 biotin molecules per Fc molecule.
  • the biotinylated proteins were alternately fixed in turn to immobilized neutravidin or streptavidin at the bottom of the Maxisorp ELISA plate (Nunc) and the ribosome display selections were made at 4 ° C as described by Binz et al. (Binz, HK, P.
  • the selected clone groups were translated in vitro and tested by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) using IgG directly immobilized at the bottom of the Maxisorp ELISA plate.
  • Bovine serum albumin (BSA) was used as a non-specific protein as a negative control. Detection of IgG binding was performed using the RGS His specific antibody to the RGS- (His) * 6 tag present at the N-terminus of proteins, conjugated to peroxidase (Qiagen) and a 1-in-1 solution. mg / ml o-Phenylenediamine substrate (Sigma) and absorbance at 450 nm was measured. All incubation steps were performed in TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) containing 0.1% Tween 20.
  • RT-PCR products of the selected sequence groups were cloned into the pFP1001 vector using BamHI and HindIII restriction sites and the resulting vectors were used to transform the E. coli strain. coli DH5a Iq. Clones were then transplanted from the Petri plates to inoculate a deep-well deep-well 96-well plate containing in each of its wells 1.4 ml of LB culture medium (ampicillin 100 ⁇ g ml, kanamycin 25 ⁇ g / ml, glucose 1%).
  • the proteins were extracted with 50 ⁇ l of BugBuster (Novagen) containing the DNase I at 5 ⁇ / ⁇ (Sigma) per well with stirring at 750 rpm for 30 min, then 250 ⁇ l of TBS pH 7.4 (20 m Tris-HCl, 150 mM NaCl) was added. Cell debris was then removed by centrifugation (2000g).
  • affine proteins based on their dissociation time for human IgG
  • the clones were expressed in E. coli strain DH5a Iq.
  • Two hundred microliters of a preculture of the night (LB medium, ampicillin 100 ⁇ g ml, kanamycin 25 ⁇ g ml, glucose 1%, 37 ° C) in a deep-well plate were used to inoculate 1 .3 ml culture (2YT, ampicillin 100 ⁇ g ml, kanamycin 25 ⁇ g ml, glucose 0.1%, 37 ° C, 750 rpm) in "deep-well" plate.
  • the cells were harvested by centrifugation (2000 g) and the proteins were extracted in "deep-well” by resuspension of the cells in 1 ml of TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) containing 25 mM imidazole, BugBuster and DNase I at 5 ⁇ g ml. After stirring for 1 h at room temperature, the deep-well plate was centrifuged to remove cell debris.
  • the supernatants were purified with microspin columns containing 100 ⁇ l of "Ni-Fast Flow Chelating Sepharose" resin (GE Healthcare) equilibrated with TBS loading buffer pH 7.4 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) containing 25 mM d imidazole. The resin was then washed 4 times with the loading buffer, and the proteins were then eluted with 150 ⁇ l of TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) containing 250 mM imidazole.
  • the cells were harvested by centrifugation and resuspended in 30 ml of TBS pH 7.4 lysis buffer (20 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 ⁇ g / ml I DNAse I, Lysozyme at 0.5 g / ml) at room temperature containing imidazole at 25 mM.
  • the cells were lysed with a sonicator and cell debris was removed by a centrifugation step.
  • the proteins were purified on a 1 ml HiTrap chelation column (GE Healthcare) equilibrated with TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris, 500 mM NaCl) containing 25 mM imidazole.
  • Calibration of this molecular sieve column was performed by injecting Aprotinin (6.5 kDa), Cytochrome C (12.4 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), and alcohol dehydrogenase (150 kDa) as calibration standards for molecular weights.
  • the SPR signal was measured using a BIAcore 3000 device at
  • Human IgG or IgG1 (1500-2000 RU) were immobilized on the measuring cells of a CM5 chip.
  • the run buffer was HBSEP pH 7.4 (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, containing 0.005% P20 surfactant).
  • the regeneration of the chip was carried out with a 10 mM glycine buffer, pH 3.0.
  • the screening and classification of the clones as a function of their IgG dissociation time were carried out using the purified proteins on IMAC micro-columns (see above) diluted 1/5 in the running buffer before their injections for the measurements. kinetics at a flow rate of 60 ⁇ / min.
  • D1 Sso7d Fifty microliters of D1 Sso7d (at 2 mg / ml in NaHCO 3 0.1M pH7.5) were mixed with 3 ⁇ l of Alexa 680 succinimidyl ester (at 10 mg / ml in dimethyl sulfoxide) and incubated for 1 hour at room temperature. room temperature with stirring. The labeling was stopped by desalting the reaction mixture with a desalting micro-column (Pierce) equilibrated in TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris, 150 mM NaCl).
  • IgG Ten micrograms of hlgG were loaded onto a non-reducing 8% SDS-PAGE gel. IgG mixed with exogenous proteins were prepared with DMEM + 10% calf serum (ie, 40% DMEM at final concentration in the loaded sample) or with a crude E. coli extract prepared at room temperature. from strain DH5a Iq ⁇ ie, equivalent to a 5X initial culture concentrated in the loaded sample). Proteins from each sample were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane.
  • HlgG detection was performed by incubating the nitrocellulose membrane with D1 Sac7d and D1 Sso7d proteins labeled with AlexaFlor 680 at 1 g / ml in TBS buffer pH 7.4 (20 mM Tris, 150 mM NaCl) containing 0.1% Tween-20 and 1% BSA for 1 hour at room temperature. The bands were detected using an Odyssey infrared reader (LI-COR).
  • Human IgG1 (1600 RU) were immobilized by the amine coupling chemistry in a cell of a CM5 chip.
  • the D1 Sac7d, D1 Sso7d and Protein A proteins were incubated independently with buffer solutions at pH 1, 2, 3, 1 1, 12 or 13 at the final concentrations of 10 ⁇ , respectively. 125 ⁇ and 4 ⁇ .
  • the pH deactivation kinetics was stopped by neutralizing 5 ⁇ l of protein / buffer mixture in 245 ⁇ l of SPR HBSEP pH 7.4 running buffer (20 mM Hepes, 150 ⁇ g). NaCl mM, and 0.005% P20).
  • Ig mixed with exogenous proteins were prepared with DMEM culture medium + 10% calf serum (/ .e., 40% DMEM at a final concentration in the loaded sample) or with a crude extract of E coli prepared from strain DH5a Iq ( ' .e., equivalent to a 5X initial culture concentrated in the loaded sample).
  • the unbound proteins were washed with 5 ml of PBS run buffer pH 7.4 (500 mM NaCl) and the Ig were eluted with acidic pH jump using 5 ml of a 100 mM glycine buffer (pH 2.5, 150 mM NaCl). The degree of purity of the eluted proteins was checked by loading the eluted fractions on a 12% reducing SDS-PAGE gel.
  • Human IgG1 (200 RU) were immobilized by the amine coupling chemistry in a cell of a CM5 chip.
  • the run buffer was HBSEP pH 7.4 (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, containing 0.005% P20 surfactant).
  • the regeneration of the chip was carried out with a 10 mM glycine buffer, pH 2.5.
  • the flow rate set for these experiments is 40 ⁇ / ⁇ , the combination is measured for 3 min.
  • Two types of experiments were performed by binding competition with natural ligands of the Fc fragment: Protein A (Sigma), CD64 (R & D Systems).
  • the analytes were injected in pairs successively on the lgG1 chip. After injection of the first analyte (analytel) a short dissociation period was observed and then the second analyte (analyte2) was injected onto the formed complex and the resulting response (RU) compared to the observed RU after injection analyte2 at the same concentration without injection of the first analyte.
  • the concentrations used of the analytes were: 500nM for Protein A, C3, D1 Sso7d and D1 Sac7d, 9nM for CD64.
  • the second analyte that was injected was a mixture of the first analyte (identical concentration) and the second analyte.
  • D1 Sso7d was injected at 1 ⁇ on the chip, then co-injected the mixture D1 Sso7d (1 ⁇ ) and Protein A (500 nM).
  • the response (RU) of the second analyte is compared with the injection of the latter after stroke buffer injection and the result expressed as a percentage.
  • the concentrations used for the analytes were 500nM for Protein A, 1 ⁇ for D1 Sso7d, D1 Sac7d and C3, and 45nM for CD64.
  • a polypeptide (named D1 Sac7d) with affinity for immunoglobulins (recognition of the Fc fragment of immunoglobulins) has been characterized.
  • the sequence of this protein is given by SEQ ID No. 10.
  • the selections were performed using the Fc fragment prepared from a polyclonal human antibody group as the target.
  • a flat ELISA plate sensitized alternately turn-to-turn with streptavidin or neutravidin was used to immobilize the biotinylated Fc and seven rounds of selection were performed. Enrichment of Fc-affected sac7d variants was followed by ELISA during selection, whereas no binding could be detected on BSA used as a negative control.
  • the dissociation constant (K D) of purified clone C3 monomeric and for hIGgl was measured by SPR as 7.4 10 "8 M or 74 nM.
  • the D1 protein therefore has a better binding to immunoglobulins than the C3 protein.
  • Sso7d (SEQ ID NO: 2) is a homolog of Sac7d (SEQ ID NO: 1) which is more stable at about 10 ° C than Sac7d (Edmondson et al., (2001) Methods Enzymol, 334, 129-45) .
  • D1 Sso7d (SEQ ID No. 11) was generated by gene synthesis (GeneCust) with the following modifications to that of D1 Sac7d (SEQ ID No. 10):
  • SAB bovine serum albumin
  • the affinity of the protein D1 Sso7d determined by SPR is 1500 nM, a sufficient affinity for its use as capture reagent in affinity chromatography.
  • This result demonstrates that it is possible to transfer a recognition site of an affine protein having a Sac7d skeleton to create a new one on the basis of a Sso7d framework, while preserving the specificity of the initial molecule.
  • This recognition site transfer can also be performed for the other proteins of the Sac7d family, all of which have sequence and conformation similarities.
  • the human IgGs were mixed with eukaryotic cell culture medium (DMEM 10% fetal calf serum), or with crude E. coli extract. After migration on SDS-PAGE gel and nitrocellulose membrane transfer, detection of IgG was performed with the labeled proteins.
  • DMEM 10% fetal calf serum
  • Figure 3 shows that D1 Sac7d does not recognize any protein contained in DMEM, but binds to certain E. coli. Surprisingly,
  • D1 Sso7d is more specific since it virtually only recognizes IgG.
  • Protein A and CD64 receptor are natural ligands of the Fc fragment and for which the region of Fc that is bound is known. The inventors used these ligands as competitors to determine by SPR if they could exert an inhibitory effect on the binding of D1 Sso7d and D1 Sac7d on hlGG1 (FIG. 4).
  • the active fraction of D1 Sac7d or D1 Sso7d were studied by SPR after various incubation times at pH 1, 2, 3, 1 1, 12 and 13.
  • D1 Sso7d is significantly more resistant than D1 Sac7d to alkaline pH. ( Figure 5) Indeed, there is almost 100% activity after 24h at pH 13 for D1 Sso7d, while under the same conditions D1 Sac7d is almost inactivated. D1 Sso7d seems as stable as Protein A under these conditions.
  • C3 (or another protein identified by screening the same library as C3) is significantly less stable than D1 Sso7d or D1 Sac7d at pH greater than 1 (not shown). Moreover, D1 Sac7d and D1 Sso7d retain the acidophilic properties of wild proteins and are little or not altered by overnight treatments with acidic pH.
  • An affinity column was prepared by immobilizing D1 Sso7d on an agarose resin by amine chemistry.
  • D1 Sso7d is clearly capable of retaining the human IgG1, IgG2 and IgG4 subtypes, and could also retain IgG3, which was not detected under the operating conditions of the ELISA.
  • the D1 Sso7d affinity chromatography purification system was compared to the standard antibody purification system based on Protein A chromatography.
  • the SDS-PAGE gel of Figure 6.C shows the eluted fraction corresponding to IgG1 contained in ascites are at least as pure as if using a protein A column under the same conditions. Both systems are therefore comparable.
  • the C3 column is almost deactivated by 0.1 M NaOH (pH 13), while the D1 Sso7d column is still functional at 90% ( Figure 7).
  • the D1 Sso7d column has a resistance to 0.1M NaOH equivalent to that of the commercial Protein A.
  • the protein thus obtained also has slightly different properties of the starting protein (stability, specificity, etc.).

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Abstract

L'invention se rapporte au domaine de la génération de ligands pour une protéine d'intérêt transfert des sites de liaison d'un ligand de ladite protéine d'intérêt dans un autre squelette protéique.

Description

MÉTHODE DE GÉNÉRATION DE PROTÉINES
L'invention se rapporte au domaine de la génération de ligands utilisables pour la chromatographie d'affinité pour la purification ou l'isolement de composés biologiques, et notamment d'immunoglobulines.
La chromatographie d'affinité est effectuée en utilisant une résine sur laquelle est immobilisée une molécule (ligand) ayant la propriété de se lier spécifiquement à celle qu'on veut isoler. Ce ligand peut être déjà présent dans la résine, du fait de la nature de la résine utilisée. C'est le cas du dextran composant le Sephadex™, une résine normalement utilisée pour la filtration sur gel. Toutefois, on doit généralement fixer un ligand spécifique sur une résine qui ne présente pas, en tant que telle, d'affinité pour la molécule d'intérêt. Ainsi, on peut lier des anticorps sur des résines afin que celles-ci acquièrent une affinité pour les antigènes correspondants.
Le principe de la chromatographie d'affinité comprend les étapes de mise en présence un mélange contenant la molécule d'intérêt et la résine contenant le ligand, dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique. Les molécules pour lesquelles le ligand ne présente pas d'affinité ne se fixeront pas sur la résine et sont alors éluées, tandis que les molécules d'intérêt restent liées à la colonne du fait de leur affinité pour le ligand.
Lorsque toutes les molécules sans affinité sont complètement éluées, on libère les molécules d'intérêt restées attachées au ligand (désorption). On peut effectuer cette étape de différentes façons, notamment en modifiant les conditions auxquelles est exposé le complexe résine-molécules d'intérêt, pour diminuer la stabilité de l'interaction ligand-molécule d'intérêt. Ainsi, on peut modifier la composition du solvant pour diminuer l'affinité ou ajouter un ligand compétiteur. Les molécules d'intérêt se détachent alors de la résine, et peuvent être isolées dans le solvant de désorption.
La demande WO 2008/068637 décrit l'utilisation d'une banque basée sur la protéine Sac7d pour obtenir des ligands présentant une affinité pour des cibles d'intérêt. Cette demande exemplifie notamment l'utilisation de cette banque pour obtenir des protéines présentant une affinité pour la protéine PulD.
La méthode décrite dans WO 2008/068637 comprend la génération de banques combinatoires contenant une pluralité de molécules d'ADN ayant toutes la même séquence, sauf la présence de certaines mutations aléatoires menant à la production d'une protéine mutée à certains acides aminés prédéterminés.
Dans le cadre de WO 2008/068637, le squelette de base est une protéine Sac7d, telle que définie plus haut, et dans laquelle on introduit des mutations pour générer une variabilité aux acides aminés K7, Y8, K9, K21 , K22, W24, V26, M29, S31 , T33, T40, R42, A44, S46. On peut aussi introduire une variabilité sur d'autres acides aminés, comme V26, G27, K28, M29, S31 , R42, A44, S46, E47 et K48. Ces acides aminés sont basés sur la séquence de Sac7d, telle que représentée par SEQ ID N° 1.
Les inventeurs ont démontré qu'il est possible de « porter » les mutations observées sur les polypeptides sélectionnés par la méthode de WO 2008/068637 de la protéine Sac7d vers d'autres protéines en maintenant une bonne affinité pour la cible, et qu'il est ainsi également possible d'améliorer les propriétés des ligands ainsi obtenus.
Ainsi, le document EP 1930342 décrit le principe de l'introduction de mutations dans la protéine Sac7d, afin de modifier la spécificité de liaison et de permettre la liaison à d'autres ligands (tels que des ligands protéiques) que le ligand naturel (ADN).
Le document WO 2007/01 1891 décrit des polymérases fusionnées à un domaine de liaison de l'ADN, notamment de la famille de la protéine Sac7d. Des mutations peuvent être effectuées dans ce domaine de liaison à l'ADN.
Le document Mouratou et al (Proc Natl Acad Sci, 2007, 104, 17983-8) est l'article scientifique lié à EP 1930342, qui décrit l'utilisation d'une banque de Sac7d pour identifier une protéine se liant à PulD.
Le document Geta et al (J. Mol. Biol, 201 1 , 409, 601 -16) décrit l'utilisation de Sso7d pour générer des protéines se liant à des cibles diverses.
Tous ces documents décrivent donc qu'il est possible de modifier la spécificité de liaison de protéines de la famille Sac7d, notamment par introduction de mutations dans certains acides aminés et criblage des banques de protéines mutées. Cette stratégie est utilisée en tant qu'alternative aux anticorps (voir Binz et al (Nature Biotechnology, 2005, 23, 1257-68, ou la revue de Gronwall et al (Journal of Biotechnology, 2009, 140, 254-69)).
Le document WO 03/006496 décrit le principe de muter un certain nombre de résidus de la néocarzinostatine ou de protéines homologues (macromycine, actinoxantine, kédarcidine, protéine C-1027) afin de modifier la spécificité de liaison de ces protéines. Ce document est à rapprocher de Heyd et al (Biochemistry, 2003, 42, 5674-83). L'enseignement de ce document est ainsi proche de l'enseignement de des documents EP 1930342, WO 2007/01 1891 , Mouratou et al, et Geta et al cités ci-dessus.
Le document Su et al (Blood, 2010, 1 16, 496-7, abrégé) décrit l'alignement de deux séquences protéiques, et la génération de diverses chimères par introduction de résidus de la première protéine (Facteur XI) dans la seconde protéine (prékallikréine). Les résultats sont mitigés, et ne permettent pas, en particulier de conclure que l'on a transféré les propriétés du Facteur XI dans la seconde protéine.
Le document Budhu et al (J. Mol. Biol, 2001 , 305, 939-49) étudie les protéines CRABP-I et CRABP-II, et identifie certains résidus impliqués dans l'interaction de CRABP-II avec les récepteurs à l'acide rétinoïque. Les auteurs ont identifié trois résidus nécessaires pour induire cette interaction, et ont montré que CRABP- peut gagner l'aptitude à interagir avec les récepteurs à l'acide rétinoïque si ces résidus sont transférés de CRABP-II vers CRABP-I.
Le document Peet et al (Chemistry and Biotechnology, 1998, 5, 13-21 ) décrit la mutation de certains acides aminés dans la protéine RXR, menant à un changement de spécificité. Il se rapproche donc des documents EP 1930342, WO 2007/01 1891 , Mouratou et al et Geta et al, cités ci-dessus.
Le document Souriau et al (Biochemistry, 2005, 44, 7143-55) décrit qu'il est possible d'intégrer des épitopes de certains antigènes dans le peptide Min-23 et de permettre la reconnaissance de ces épitopes par leurs anticorps. Les auteurs ont également créé une banque combinatoire qui leur a permis, après criblage, d'identifier des protéines se liant à divers ligands. Ce document a donc un enseignement proche de celui des documents EP 1930342, WO 2007/01 1891 , Mouratou et al et Geta et al, cités ci-dessus.
Le document Zahnd et al (J. Biol. Chem, 2006, 281 , 35167-75) décrit la sélection de protéines « DARPins » se liant au récepteur du facteur de croissance épithélial (Her2). Ces protéines sont sélectionnées par criblage de deux banques combinatoires différentes en utilisant la technique du « Ribosome Display ». Les auteurs de ce document n'envisagent pas l'utilisation d'autres squelettes, ni la possibilité de porter les mutations identifiées sur un autre squelette. A ce propos, il est intéressant de noter que les mutations observées sur les deux premières séquences répétées des protéines obtenues grâce à la banque N3C sont différentes des mutations observées pour les régions correspondantes de N2C.
Le document Moon et al (Molécules and cells, 2010, 30, 149-54) décrit l'étude des résidus permettant la spécificité de liaison des protéines GLP-1 et GI P à leurs récepteurs. Des peptides recombinants dans lesquels des acides aminés de GLP-1 ont été introduits dans le squelette de GIP ont été dessinés. On peut toutefois noter que ces peptides ne contiennent pas l'extrémité C-terminale de GIP (voir Table I), ou que les propriétés des peptides ne sont pas parfaitement transposées lors de la transposition des acides aminés.
L'invention se rapporte ainsi à une méthode de génération de nouvelles protéines, lorsque l'on est en possession d'un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d (telle que définie ci-dessus, qui comprend notamment les protéines Sac7d, Sso7d, Sac7e, Ssh7b, SSh7a, DBP7 et Sis7), présentant un site de reconnaissance d'une molécule d'intérêt.
On identifie les acides aminés formant ledit site de reconnaissance par comparaison de la séquence dudit mutant avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d, et identification des acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage. Ceci peut notamment être effectué par l'utilisation de logiciels adaptés tel le logiciel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., (1990), J Mol Biol 215 (3): 403-410), qui est adapté pour la comparaison de deux séquences, et qui est disponible notamment sur le site du NCBI.
L'étape suivante est d'intégrer ces acides aminés au sein d'une autre protéine de la famille Sac7d à la place des acides aminés sauvages localisés au même endroit que ceux de la protéine initiale. On peut utiliser pour cela l'alignement tel que présenté à la Figure 1 .
L'utilisation de cette méthode permet ainsi de transférer la capacité de reconnaître la molécule d'intérêt, portée par la protéine initiale, à une autre protéine, ce qui peut mener à une amélioration d'autres propriétés de la protéine nouvellement obtenue. Ainsi, les inventeurs ont montré qu'il avait été possible d'améliorer la résistance aux conditions alcalines d'un ligand des immunoglobulines en transférant le site de reconnaissance du squelette de Sac7d vers le squelette de Sso7d, tout en maintenant une affinité tout à fait satisfaisante pour les immunoglobulines. L'invention se rapporte ainsi à une méthode de génération d'un acide nucléique codant pour une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de :
a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d
b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt
c) synthétiser un acide nucléique codant pour une autre protéine de la famille Sac7d, mais dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.
L'invention se rapporte aussi à une méthode de génération d'une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d
b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt
c) synthétiser un polypeptide présentant la séquence d'une autre protéine de la famille Sac7d, dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés. La famille Sac7d correspond à une famille de protéines de 7 kDa liant l'ADN isolées de bactéries extrémophiles. Ces protéines et cette famille sont notamment décrites dans WO 2008/068637. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, une protéine appartient à la famille Sac7d lorsqu'elle présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 8.
Un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d présente une séquence basée sur SEQ ID N° 8, mais dans laquelle au moins 3, de préférence au moins 5, de façon plus préférée au moins 8, de façon encore plus préférée au moins 10 acides aminés ont été mutés par rapport à SEQ ID N° 8. La séquence d'un mutant d'une protéine de la famille de Sac7d ne présente pas plus de 16 acides aminés différents des acides aminés de SEQ ID N° 8.
De préférence, les différences sont observées dans les acides aminés choisis parmi K7, Y8, K9, K21 , K22, W24, V26, M29, S31 , T33, T41 , R43, A45, S46, G27, K28, E48 et K49 de SEQ ID N° 8.
Un mutant d'une protéine de la famille Sac7d peut être obtenu par toute méthode de mutation connue dans l'art.
De préférence, il est obtenu par la mise en œuvre de la méthode décrite dans WO 2008/068637, ce qui permet d'assurer qu'il présente une affinité pour une cible d'intérêt.
La famille Sac7d comprend notamment les protéines Sac7d (Sulfolobus acidocaldarius), Sso7d (S. solfactaricus), Sac7e (S. acidocaldarius), Ssh7b (S. shibatae), SSh7a (S. shibatae), DBP7 (S. tokodaii) et Sis7 (S. islandicus) dont les séquences sont représentées par SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 7 respectivement.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite protéine de la famille Sac7d est la protéine Sac7d dont la séquence sauvage est représentée par SEQ ID N° 1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite autre protéine de la famille
Sac7d est la protéine Sso7d dont la séquence sauvage est représentée par SEQ ID N° 2.
La comparaison effectuée à l'étape a) des méthodes selon l'invention est réalisée sur la base des séquences telles qu'indiquées ci-dessus.
La détermination de la séquence de l'acide nucléique ou du polypeptide à synthétiser à l'étape c) est réalisée notamment en utilisant la figure 1 qui présente l'alignement des séquences sauvages de protéines de la famille Sac7d. On peut donc aisément identifier les acides aminés que l'on doit muter dans les autres protéines de la famille Sac7d.
La synthèse de l'acide nucléique ou du polypeptide est réalisée selon des méthodes connues dans l'art.
Les acides nucléiques peuvent être produits par synthèse chimique.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être produits par synthèse chimique en phase solide ou par recombinaison génétique. Cette synthèse chimique peut être réalisée par exemple avec un synthétiseur automatique de peptide du type Applied Biosystems, mod. 433A. Elle peut être réalisée par exemple en chimie Fmoc qui utilise le groupement fluoremylméthyloxycarbonyle pour la protection temporaire de la fonction a-aminique des acides aminés.
II est toutefois préféré de produire les polypeptides selon l'invention par génie génétique, en particulier en intégrant une séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression. Ce vecteur d'expression est alors introduit dans une cellule hôte (les bactéries telles Escherichia coli sont particulièrement adaptées), qui est cultivée dans des conditions de culture permettant la synthèse du polypeptide (on peut notamment utiliser des promoteurs inductibles en amont du polypeptide dans le vecteur d'expression. Le polypeptide synthétisé est alors récupéré. On peut alors greffer tout type de molécules en N- ou C-terminal du polypeptide.
L'homme du métier connaît les méthodes de production de polypeptides, qui sont notamment décrites dans l'ouvrage de Sambrook, Fritsch et Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nde édition.
On peut également coupler les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention à d'autres protéines. Ce couplage peut être effectué par la production d'une protéine de fusion (les polypeptides selon l'invention étant localisés en N- ou C- terminal de la protéine de fusion en un ou plusieurs exemplaires enchaînés en tandem) ou par couplage chimique.
On peut utiliser un peptide de liaison lorsque l'on effectue un couplage entre deux protéines, qui peut éventuellement contenir un site de reconnaissance pour une protéase, telle que la protéase du Tobacco Etch Virus (TEV) qui reconnaît le site ENLYFQG (SEQ ID N° 9).
On peut ainsi coupler une protéine rapporteuse (qui possède une caractéristique lui permettant d'être observé en laboratoire (fluorescence, activité enzymatique détectable). Parmi les protéines rapporteurs on peut noter la protéine fluorescente verte (green fluorescent protein en anglais ou GFP), la luciférase, la protéine GUS, (bêta-glucuronidase), la protéine lacZ (β-galactosidase), la phosphatase alcaline.
On peut également coupler les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention à une ou plusieurs unités de fixation (éléments pouvant se fixer ou être fixés notamment à un support solide ou à un autre composé pour une détection ou une capture) pour obtenir un réactif multi spécifique. On peut citer le domaine de fixation à la chitine (CBD), un domaine de fixation à l'ADN ou à une hormone. De la même façon on peut citer des étiquettes peptidiques (His*6, FLAG, HA, myc, etc.) qui permettent une détection ou une capture sans modification post- traductionelle, ou des étiquettes qui nécessitent une modification post- traductionnelle telles que AviTag (biotinylation spécifique par l'enzyme BirA) ou l'étiquette de phosphorylation (phosphorylation spécifique par la créatine kinase II). En tant qu'unité de fixation, on peut citer des protéines telles que l'avidine, la streptavidine. On peut également citer des supports solides telles que des billes magnétiques, des billes agarose ou encore de latex, des supports ELISA, des colonnes d'affinité sur lesquelles sont couplées les polypeptides selon l'invention.
Les polypeptides produits par les méthodes selon l'invention sont particulièrement intéressants pour isoler des cibles d'intérêt par chromatographie d'affinité.
On peut ainsi fixer de façon covalente un des polypeptides produit par une méthode selon l'invention à un support polymérique hydrophile (tel que la Sepharose 4B) utilisé en chromatographie liquide, notamment en utilisant un bras flexible fixé en N- ou C-terminal. Ce polypeptide, ainsi fixé, peut encore interagir avec les immunoglobulines et est capable de retenir ces protéines sur la matrice polymérique. Elles peuvent ensuite être détachées par une acidification du milieu.
Il existe des résines préparées d'avance sur lesquelles on peut coupler un ligand. Ce sont des résines spécialisées destinées uniquement à cet usage. Elles possèdent généralement un groupement chimique facilement activable localisé au bout d'un bras écarteur. Diverses résines existent avec divers groupements activables selon la nature chimique du ligand qu'on veut utiliser : bromure de cyanogène ou p-nitrophényle pour coupler un ligand avec une aminé, hydrazine pour un aldéhyde, un thiol pour un autre thiol, etc .. Dans le cas présent, on couple les polypeptides de préférence en utilisant une résine agarose (telle que la résine Sepharose™) activée par le N-hydroxy-succinimide (NHS).
Description des figures
Figure 1 : Alignement des séquences des protéines Ssh7b, Sis7, Sso7d, Ssh7a, DBP7, Sac7d et Sac7e.
Figure 2 : Activité de fixation des protéines D1 Sac7d et D1 Sso7d contre diverses IgG par ELISA
Figure 3 : Test de spécificité des protéines D1 Sac7d et D1 Sso7d par Western Blot. Légende : 1 : IgG seule; 2 : hlgG + DMEM; 3 : DMEM; M : marqueur de taille; 4 : hlgG; 5 : hlgG + extrait d'E. coli ; 6 : extrait d'E. coli
Figure 4 : Compétition pour la reconnaissance des IgG avec la Protéine A et CD64. Caractérisation de l'épitope reconnu par D1 Sac7d et D1 Sso7d par la méthode des injections successives sur une surface recouverte d'IgG.
Fig 4.A : injections successives des analytes.
Fig 4.B : co-injection des analytes.
Les mesures avec C3 sont données à titre indicatif pour montrer un effet significatif lorsque les épitopes sont au moins chevauchants.
Figure 5 : Stabilité des protéines D1 Sac7d (5.A.) et D1 Sso7d (5.B.) à pH alcalin Figure 6 : Chromatographie d'affinité avec une colonne sur laquelle est fixée la protéine D1 Sso7d.
Fig 6.A : purification d'IgG présentes dans du DMEM + sérum fœtal de veau.
Fig 6.B : purification d'IgG présentes dans un extrait d'E. coli.
Fig 6.C : Comparaison de la purification d'IgGI sous forme d'ascites injectées dans une colonne D1 Sso7d et une colonne Protéine A.
Légende : M : marqueur de taille, Inj : échantillon injecté sur la colonne, FT: fraction non retenue par la colonne, EL : fraction éluée de la colonne
Figure 7 : Résistance d'une colonne d'affinité D1 Sso7d aux conditions de pH élevées
Exemples
Les exemples ci-dessous illustrent un mode de réalisation de l'invention dans lequel on porte des mutations obtenues sur un polypeptide présentant une affinité pour les immunoglobulines et obtenu par criblage d'une banque combinatoire basée sur le squelette Sac7d, vers un squelette Sso7d. Les résultats ont été obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants.
Matériels et Méthodes
Immunoglobulines
Les immunoglobulines utilisées dans cette étude ont été achetées chez
Fluka AG (Buchs, Switzerland): hlgG (i.e., ensemble des IgG de sérum humain contenant les hlgG1 , hlgG2, hlgG3, hlgG4 : référence 56834); et chez Sigma- Aldrich: hlgG1 (référence : I5029), hlgG2, hlgG3, hlgG4, IgG de souris, rat, mouton, chèvre, lapin, porc and hlgA.
Biologie moléculaire générale Les enzymes et tampons étaient de New England Biolabs (USA) ou de Fermentas (Lithuanie). Les oligonucleotides étaient de Eurofins-MWG (Allemagne). Toutes les PCRs (reactions de polymérisation en chaîne) on été réalisées en utilisant la polymerase Vent sauf indication contraire dans le texte.
Vecteur d'expression pFP1001
Le vecteur de clonage et d'expression des protéines d'affinité (D1 Sac7d et D1 Sso7d) pFP1001 permet l'expression de protéines avec une étiquette N- terminale polyhistidine et est un dérivé du vecteur pQE30 (Qiagen) dans lequel le codon stop TGA a été remplacé par deux codons stop TAATGA par PCR.
Construction de la banque combinatoire
La génération des banques combinatoires a été réalisée sur un squelette Sac7d, selon le principe décrit dans WO 2008/068637 A2 (pages 13 et 14). en, introduisant une diversification des résidus 26, 27, 28, 29, 31 , 42, 44, 46, 47, 48 de Sac7d, selon le protocole suivant.
La banque a été construite par assemblage d'oligonucléotides et par des étapes de PCR d'assemblage. Avec une PCR en une seule étape utilisant une combinaison de quatre oligonucléotides standards et de trois oligonucléotides dégénérés codant des triplets NNS (où N = A, C, T ou G, et S = C or G), un produit ADN incluant la région flanquante 5'- nécessaire pour le ribosome display et la diversification du gène de Sac7d a été obtenu. Pour cette banque, les oligonucléotides suivants ont été utilisés T7C (SEQ ID N° 13: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC), SDAJV1RGS (SEQ ID N° 14: AG AC C AC AAC G GTTTC C CTCTAG AAATAAT- TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGAGAGGATCG), SCIib2.1 (SEQ ID N° 15: GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGAT- CCGTCAAGGTGAAATTC), SCIib3.2 (SEQ ID N° 16: GGATCCGTCAAGG- TGAAATTCAAATATAAAGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC), SCIib3.3 (SEQ ID N° 17: CTTGCCGTTGTCGTCGTAGGTAAASNNCA- CSNNSNNSNNSN N ACG CCAAACTTTCTTG ATCTTACTAGTGTCCACTTC) , SCIib3.4 (SEQ ID N° 18: TAATAACTCTTTCG G GG CATCTTTCTCG CTCACS N N G- CCSNNGCCGGTCTTGCCGTTGTCGTCGTAGG), SCIib2.5 (SEQ ID N° 19: CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTT TCGGGGCATC).
Pour améliorer l'accessibilité de la protéine exposée par le ribosome à des ligands potentiels, la protéine a été fusionnée à un espaceur. La séquence de cet espaceur, correspondant en partie à la protéine TolA d'£. coli a d'abord été introduite dans le vecteur pFP1001 en réalisant une PCR avec la polymérse Taq à partir d'une colonie d'E. coli (souche DH5a) et les oligonucléotides tolA_coli_F (SEQ ID N° 20: GAGAAAGGATCCCTTTATATGGCCTCGGGGGCCGAGT- TCGAATCTGGTGGCCAGAAGCAAGCTGAAGAGGCGGCAGCG) et tolA_coli_R (SEQ ID N° 21 TGCATTAAGCTTTTTTTCAGCAGCTTCAGTTGCCGCT- TTCTTTC). Le produit de PCR obtenu a ensuite été cloné dans le vecteur pFP1001 en utilisant les sites de restriction BamH\ et Hind\\\. Un clone avec la séquence attendue a été utilisé pour obtenir le vecteur pFP1001 -TolA. Dans un second temps, pour obtenir l'espaceur en grande quantité, ce vecteur a ensuite été utilisé comme matrice pour une PCR d'amplification avec les oligonucléotides SClink (SEQ ID N° 22: GCGGAACGCGAGAAAAAGCTTTATATGGCCTCG- GGGGCC) and tolAk (SEQ ID N° 23: CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCA- GTTGCCGCTTTCTTTCT) (ce dernier encodant la région flanquante 3'- nécessaire pour le ribosome display). Finalement, ce produit de PCR a été assemblé avec l'espaceur tolA par PCR d'assemblage en utilisant les oligonucléotides tolAk et T7B (SEQ ID N° 24: ATAC G AAATTAATAC G ACTC ACTATAG G G AG AC C A- CAACGG).
Le produit final d'assemblage correspond à la banque de Sac7d avec toutes les régions nécessaires en 5'- et 3'- pour son utilisation en sélection par ribosome display comme précédemment décrit (Hanes et al., 1998; Schaffitzel et al., 1999).
Tours de sélection par ribosome display
Pour les expériences de sélection, la protéine cible a été biotinylée. La biotinylation a été réalisée en incubant une solution à 10 μΜ du fragment Fc des IgG humaines (Bethyl Iboratories) avec 20 excès molaire de sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido) hexanoate (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine, Pierce) dans un tampon PBS pH7.4 sur la glace pendant 1 h. Le tampon des Fc biotinylés a ensuite été échangé en utilisant une micro colonne à centrifuger (Pierce) équilibrée avec du tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM). Le degré de biotinylation a été déterminé en utilisant le dosage HABA (Sigma) comme étant d'environ 2 molécules de biotine par molécule de Fc. Les protéines biotinylées ont été fixées alternativement de tour en tour à de la neutravidine ou de la streptavidine immobilisées en fond de plaque ELISA Maxisorp (Nunc) et les sélections par ribosome display ont été réalisées à 4°C comme décrit par Binz et al. (Binz, H. K., P. Amstutz, et al. (2004). Nat Biotechnol 22(5): 575-582) avec les modifications suivantes : après chaque tour de sélection, l'ARNm élué a été retro-transcrit en ADNc et amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides SDA_MRGS et ScepRev (TCGGCCCCCGAGGCC-ATATAAAGCTTTTTCTC) (SEQ ID N° 25). Ce produit PCR a été dessalé sur une colonne Nucleospin Extractll (Macherey-Nagel) et utilisé pour une PCR d'assemblage avec le fragment d'ADN TolAlinker (voir ci- dessus). Ceci a généré la construction entière nécessaire pour le ribosome display avec des régions flanquantes 5'- et 3'- nouvellement ajoutées dans le but de minimiser la perte de clones en raison d'une dégradation des extrémités de l'ARNm durant leur manipulation. Le progrès des sélections a été vérifié en suivant les quantités de produits de RT-PCR obtenues de tour en tour.
Analyse des groupes de sélection et des clones isolés
Après cinq, six et sept tours de sélection, les groupes de clones sélectionnés ont été traduits in vitro et testés par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) en utilisant les IgG directement immobilisées en fond de plaque ELISA Maxisorp. L'albumine de sérum bovin (SAB) a été utilisée comme protéine non spécifique en tant que contrôle négatif. La détection de la fixation sur les IgG a été réalisée en utilisant l'anticorps RGS His spécifique de l'étiquette RGS-(His)*6 présent en N-terminal des protéines, conjugué à la peroxydase (Qiagen) et une solution à 1 mg/ml du substrat o-Phenylenediamine (Sigma) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée. Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM) contenant du Tween 20 à 0.1 %.
Les produits de RT-PCR des groupes de séquences sélectionnées ont été clonés dans le vecteur pFP1001 en utilisant les sites de restrictions BamHI et Hindi 11 et les vecteurs obtenus ont été utilisés pour transformer la souche d'E. coli DH5a Iq. Des clones ont ensuite été repiqués des plaques de Pétri pour inoculer une plaque à 96 puits profonds de type « deep-well » contenant dans chacun de ses puits 1.4 ml de milieu de culture LB (ampicilline 100 μg ml, kanamycine 25 Mg/ml, glucose 1 %). Après une culture sur la nuit à 37°C et agitation à 250 tpm, 0.2 ml de chaque puits de cette plaque mère a été utilisé pour inoculer une autre plaque « deep-well » contenant 1 .3 ml de milieu de culture 2YT (ampicilline 100 g/ml, kanamycine 25 Mg/ml, glucose 0.1 %) par puits. La plaque a ensuite été incubée à 37°C pendant 2-3h avec agitation (750 tpm). L'expression a été induite par l'addition d'IPTG à 0.5 mM et incubation pendant une nuit à 30°C avec agitation (750 tpm). Les cellules centrifugées (2000g) et les surnageants éliminés. Les protéines ont été extraites avec 50 μΙ de BugBuster (Novagen) contenant de la DNase I à 5 μς/ηιΙ (Sigma) par puits avec une agitation à 750 tpm pendant 30 min, puis 250 μΙ de TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 m M, NaCI 150 m M) ont été ajoutés. Les débris cellulaires ont été ensuite éliminés par centrifugation (2000g).
Pour le criblage par ELISA, 100 μΙ de chaque surnageant a été utilisé pour tester la liaison au fragment Fc en utilisant la SAB comme contrôle négatif, selon le même protocole que celui utilisé pour les protéines traduites in vitro. Les clones positifs ont été séquencés selon les méthodes standard de séquençage.
Production des protéines affines pour le criblage par résonance plasmonigue de surface (SPR)
Pour réaliser le criblage des protéines affines sur la base de leur temps de dissociation pour les IgG humaines, les clones ont été exprimés dans la souche d' E. coli DH5a Iq. Deux cent microlitres d'une préculture de la nuit (milieu LB, ampiciline 100 μg ml, kanamycine 25 μg ml, glucose 1 %, 37°C,) dans une plaque « deep-well » ont été utilisés pour inoculer 1 .3 ml de culture (2YT, ampiciline 100 μg ml, kanamycine 25 μg ml, glucose 0.1 %, 37°C, 750 tpm) en plaque « deep- well ». L'expression a été induite à une DO 600 = 1 .0 en ajoutant de l'IPTG à 0.5 mM et les cultures ont été incubées pendant une nuit à 30°C (750 tpm). Les cellules ont été récoltées par centrifugation (2000 g) et les protéines ont été extraites dans les « deep-well » par resuspension des cellules dans 1 .0 ml de tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM) contenant 25 mM d'imidazole, du BugBuster et de la DNase I à 5μg ml. Après 1 h d'agitation à température ambiante, la plaque deep-well a été centrifugée pour éliminer les débris cellulaires. Les surnageants ont été purifiés avec des colonnes microspin contenant 100 μΙ de résine « Ni-Fast Flow Chelating Sepharose » (GE Healthcare) équilibrée avec du tampon de charge TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM) contenant 25 mM d'imidazole. La résine a ensuite été lavée 4 fois avec le tampon de charge, puis les protéines ont été éluées avec 150 μΙ de tampon TBS pH 7.4 (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM) contenant 250 mM d'imidazole.
Production des protéines D1Sac7d et de D1Sso7d à grande échelle
Les protéines d'affinité ont été exprimées dans la souche E. coli DH5a Iq E. coli comme décrit ci-après. Quinze millilitres d'une préculture de la nuit (milieu LB, ampicilline 100 μg ml, kanamycine 25 μg ml, glucose 1 %, 37°C) ont été utilisés pour inoculer 500 ml de culture (2YT, ampiciline 100 μg ml, kanamycine 25 μg ml, glucose 0.1 %, 37°C). L'expression a été induite à une DO 600 = 0.8-1.1 par addition d'IPTG à 0.5 mM et les cultures ont été incubées pendant une nuit à 30°C (220 tpm). Les cellules ont été récoltées par centrifugation et resuspendues dans 30 ml de tampon TBS pH 7.4 de lyse (Tris 20 mM, NaCI 500 mM, DNAse I à 5 μ g/m I , Lysozyme à 0.5 g/ml) à température ambiante contenant de l'imidazole à 25 mM. Les cellules ont été lysées avec un sonicateur et les débris cellulaires ont été éliminés par une étape de centrifugation. Les protéines ont été purifiées sur une colonne de chélation HiTrap de 1 ml (GE Healthcare) équilibrée avec du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCI 500 mM) contenant 25 mM d'imidazole. L'élution a été réalisée avec du TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCI 500 mM) contenant 250 mM d'imidazole. Les protéines ont ensuite été purifiées avec une station « Biologie Duoflow system » (Biorad) connectée à une colonne de chromatographie d'exclusion Superdex 75 16/60 (GE Healthcare). La colonne avait été équilibrée avec du TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCI 500 mM). La calibration de cette colonne de tamis moléculaire a été réalisée en injectant de l'Aprotinin (6.5 kDa), du Cytochrome C (12.4 kDa), de l'Anhydrase carbonique (29 kDa), de la sérum albumine bovine (66 kDa), et de l'alcool déhydrogenase (150 kDa) comme standards de calibration pour les poids moléculaires.
Mesure de l'affinité de D1Sac7d et D1Sso7d par résonance plasmonigue de surface (SPR)
Le signal SPR a été mesuré en utilisant un appareil BIAcore 3000 à
25°C. Les IgG ou lgG1 humaines (1500-2000 RU) ont été immobilisées sur les cellules de mesure d'une puce CM5. Le tampon de course était du HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, NaCI 150 mM, contenant 0.005% de surfactant P20). La régénération de la puce a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 3.0.
Le criblage et le classement des clones en fonction de leur temps de dissociation des IgG ont été réalisés en utilisant les protéines purifiées sur micro colonnes IMAC (voir ci-dessus) diluées au 1/5 dans le tampon de course avant leurs injections pour les mesures cinétiques à un débit de 60 μΙ/min.
Les mesures pour la détermination d'affinité ont été réalisées avec les protéines d'affinités purifiées par IMAC et tamis moléculaire injectées à huit dilutions de 2 en 2 en partant d'une solution à 125 nM (D1 Sac7d) et d'une solution à 5 μΜ (D1 Sso7d). Le traitement des données à été réalisée avec les logiciels Scrubber2 (Biologie software) et BIAeval (BIAcore) en utilisant le modèle de liaison « steady state » (D1 Sso7d) ou le modèle cinétique de liaison 1 :1 de Langmuir et un ajustement global (Karlsson and Fait, 1997, J Immunol Methods 200(1 -2): 121 - 133). Etude de la spécificité par ELISA
Cent microlitres d'une solution à 10 μΜ de D1 Sso7d ou de D1 Sac7d purifiés ont été utilisés pour les ELISA afin de tester leur liaison aux immunoglobulines (ou à la SAB comme contrôle négatif) immobilisées en fond de plaque Maxisorp. La détection de la fixation sur le Fc des IgG a été réalisée en utilisant l'anticorps anti-RGS(His)*6 conjugué à la peroxydase (Qiagen) et une solution à 1 mg/ml du substrat o-Phenylenediamine (Sigma) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée. Toutes les étapes d'incubation ont été réalisées avec du tampon TBS pH 7.4 contenant 0.1 % de Tween 20.
Marquage de D1Sac7d et D1Sso7d avec l'AlexaFluor 680
Cinquante microlitres de D1 Sso7d (à 2 mg/ml dans NaHC03 0.1 M pH7.5) ont été mélangés à 3 μΙ d'Alexa 680 succinimidyl ester (à 10 mg/ml dans du dimethyl sulfoxide) et ont été incubés 1 h à température ambiante sous agitation. Le marquage a été arrêté en dessalant le mélange réactionnel avec une micro colonne de dessalage (Pierce) équilibrée dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCI 150 mM).
Etude la spécificité par Western blot
Dix microgrammes de hlgG ont été chargés sur une gel SDS-PAGE non réducteur 8%. Les hlgG mélangées avec des protéines exogènes ont été préparées avec du milieu de culture DMEM + 10 % de sérum de veau (i.e., 40 % de DMEM en concentration finale dans l'échantillon chargé) ou avec un extrait brut de E. coli préparé à partir de la souche DH5a Iq {i.e., équivalent à une culture initiale 5X concentrée dans l'échantillon chargé). Les protéines de chaque échantillon ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur membrane de nitrocellulose. La détection des hlgG a été réalisée en incubant la membrane de nitrocellulose avec les protéines D1 Sac7d et D1 Sso7d marquées avec l'AlexaFlor 680 à 1 g/ml dans du tampon TBS pH 7.4 (Tris 20 mM, NaCI 150 mM) contenant 0.1 % de Tween-20 et 1 % de BSA pendant 1 h à température ambiante. Les bandes ont été détectées en utilisant un lecteur infra rouge Odyssey (LI-COR).
Cinétique de désactivation de D1Sso7d, D1Sac7d et de la Protéine A par SPR
Des lgG1 humaines (1600 RU) ont été immobilisées par la chimie de couplage des aminés dans une cellule d'une puce CM5. Les protéines D1 Sac7d, D1 Sso7d et la Protéine A ont été incubées indépendamment avec des solutions tampon à pH 1 , 2, 3, 1 1 , 12 ou 13 aux concentration finales respectives de 10 μΜ, 125 μΜ et 4μΜ. Les solutions utilisées étaient pour pH 1 = HCI 0,1 M, pH 2 = NaH2P04 50 m M, pH 3 = NaH2P04 50 m M, pH 1 1 = methylamine 50 m M, pH 12 = Na2HP04 50 mM, pH 13 = NaOH 0,1 M. La cinétique de désactivation par le pH a été arrêtée en neutralisant 5 μΙ de mélange protéine/tampon dans 245 μΙ de tampon de course SPR HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, 150 NaCI mM, et 0.005% de P20). La fraction de protéine résiduelle capable de se fixer aux hlgG, après différents temps d'exposition aux différents pH, a été mesurée par SPR en injectant D1 Sac7d à 200 nM, D1 Sso7d à 2.5 μΜ et la Protéine A à 80 nM à un débit de 50 μΙ/min. La régénération a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 2.5.
Chromatographie d'affinité en utilisant D1Sso7d
Un millilitre de D1 Sso7d (à 10 mg/ml) purifié par IMAC et tamis moléculaire a été dialysé sur la nuit contre un tampon PBS pH 7.4 et a été injecté sur une colonne « HiTrap NHS-activated HP » de 1 ml (GE Healthcare) préalablement équilibrée avec 6 ml de HCI 1 mM. L'immobilisation a été réalisée à température ambiante pendant 1 h. Après lavage de la colonne et désactivation des groupements réactifs restant avec de l'ethanolamine 0.5 M (NaCI 0.5 M, pH 8.3) et de l'acétate 0.1 M (NaCI 0.5 M, pH 4) pendant 30 min à température ambiante, la colonne a été équilibrée avec du tampon PBS pH 7.4 (NaCI 500 mM). La colonne était prête à son utilisation pour les purifications.
Environ 125 μg de chaque IgG ou IgA ont été injectés sur la colonne de D1 Sso7d. Les Ig mélangées à des protéines exogènes ont été préparées avec du milieu de culture DMEM + 10 % de sérum de veau (/'.e., 40 % de DMEM en concentration finale dans l'échantillon chargé) ou avec un extrait brut de E. coli préparé à partir de la souche DH5a Iq ('.e., équivalent à une culture initiale 5X concentrée dans l'échantillon chargé). Les protéines non retenues ont été lavées avec 5 ml de tampon de course PBS pH 7.4 (NaCI 500 mM) et les Ig ont été éluées avec un saut de pH acide en utilisant 5 ml d'un tampon glycine à 100 mM (pH 2.5, NaCI 150 mM). Le degré de pureté des protéines éluées à été vérifié en chargeant les fractions éluées sur un gel SDS-PAGE 12% réducteur.
Pour tester la capacité à purifier les lgG1 humaines dans des conditions classiquement rencontrées, 1 ml d'une production d'IgGI humaine (soit environ 0.4 mg) produite sous forme d'ascite chez la souris a été chargé sur la colonne de D1 Sso7d préalablement équilibrée dans du tampon PBS pH 7.4. Les protéines non retenues ont été lavées avec 10 ml de tampon de course PBS pH 7.4 et les Ig ont été éluées avec un saut de pH acide en utilisant 5 ml de tampon glycine à 100 mM (pH 2.5, NaCI 150 mM). A titre de comparaison, une colonne de protéine A commerciale « HiTrap Protein A HP » (GE Healthcare, réf. 17-402-03) a été utilisée dans les mêmes conditions. Le degré de pureté des protéines éluées a été vérifié en chargeant les fractions éluées sur un gel SDS-PAGE 12% réducteur.
Recherche de l'épitope reconnu par compétition suivie par SPR
Des lgG1 humaines (200 RU) ont été immobilisées par la chimie de couplage des aminés dans une cellule d'une puce CM5. Le tampon de course était du HBSEP pH 7.4 (Hepes 20 mM, NaCI 150 mM, contenant 0.005% de surfactant P20). La régénération de la puce a été réalisée avec un tampon glycine à 10 mM, pH 2.5. Le débit fixé pour ces expériences est de 40 μί/Γπίη, l'association est mesurée pendant 3 min. Deux types d'expérience ont été réalisés par compétition de fixation avec des ligands naturel du fragment Fc : la Protéine A (Sigma), CD64 (R&D Systems).
Dans une première série d'expériences les analytes ont été injectés deux à deux successivement sur la chip lgG1. Après l'injection du premier analyte (analytel ) une courte période de dissociation a été observée puis le second analyte (analyte2) a été injecté sur le complexe formé et on a comparé la réponse obtenue (RU) par rapport à la RU observée après injection de I'analyte2 à la même concentration sans injection du premier analyte. Les concentrations utilisées des analytes étaient les suivantes : 500nM pour la Protéine A, C3, D1 Sso7d et D1 Sac7d, 9 nM pour CD64.
Dans une deuxième série d'expériences les analytes ont été injectés successivement mais sans laisser de phase de dissociation après la fixation du premier partenaire (co-injection). Le second analyte qui a été injecté était un mélange du premier analyte (concentration identique) et du second analyte. Par exemple, si on voulait mesurer la compétition entre D1 Sso7d et la Protéine A, D1 Sso7d était injecté à 1 μΜ sur la puce, puis en co-injection le mélange D1 Sso7d (1 μΜ) et la Protéine A (500 nM). La réponse (RU) du second analyte est comparée à l'injection de ce dernier après injection de tampon de course et le résultat exprimé en pourcentage. Les concentrations utilisées des analytes étaient les suivantes : 500nM pour la Protéine A, 1 μΜ pour D1 Sso7d, D1 Sac7d et C3, et 45 nM pour CD64.
Résultats Exemple 1 : Isolement et caractérisation d'un polypeptide présentant une affinité pour les IgG humaines
Un polypeptide (nommé D1 Sac7d) présentant une affinité pour les immunoglobulines (reconnaissance du fragment Fc des immunoglobulines) a été caractérisé. La séquence de cette protéine est donnée par SEQ ID N° 10.
Pour isoler des variants capables de se fixer sur des IgG humaines indépendamment de de leurs régions hypervariables, les sélections ont été réalisées en utilisant le fragment Fc préparé à partir d'un groupe anticorps humain polyclonal comme cible. Une plaque ELISA plate sensibilisée alternativement de tour en tour avec de la streptavidine ou de la neutravidine a été utilisée pour immobiliser le Fc biotinylé et sept tours de sélection ont été réalisés. L'enrichissement en variants de sac7d affins pour le Fc a été suivi par ELISA pendant la sélection, alors qu'aucune fixation ne pouvait être détectée sur la SAB utilisée comme contrôle négatif.
Après sous-clonage dans le vecteur d'expression pFP1001 , 96 variants ont été testés par ELISA pour leur capacité à reconnaître le fragment Fc. Environ 95% des clones montraient un rapport signal/bruit supérieur à 10.
L'ensemble de ces 96 clones a alors été soumis à un second criblage en évaluant leur vitesse de dissociation (koff) des hlgG1 résonance plasmonique de surface SPR. Le clone D1 Sac7d présentait la vitesse de dissociation la plus lente (0,0278s"1) de tous les clones testés ce qui reflétait probablement l'affinité la plus élevée pour ce groupe de clones.
Le clone D1 Sac7d (SEQ ID N° 10) présentant la vitesse de dissociation la plus lente, la constante de dissociation (KD) de ce clone purifié et monomérique pour la hIGgl a été ensuite déterminée précisément par SPR comme étant de 3.3 10"8 M, soit 33 nM.
La mise en œuvre de la méthode de sélection décrite plus haut sur une banque combinatoire telle que décrite dans WO 2008/068637 (dans laquelle les acides aminés K7, Y8, K9, K21 , K22, W24, V26, M29, S31 , T33, T40, R42, A44, S46 sont mutés) a permis de caractériser la protéine C3 (SEQ ID N° 12) qui présente la meilleure affinité pour les IgG pour les clones issus de cette banque.
La constante de dissociation (KD) du clone C3 purifié et monomérique pour la hIGgl a été mesurée par SPR comme étant de 7.4 10"8 M, soit 74 nM. La protéine D1 présente donc une meilleure liaison aux immunoglobulines que la protéine C3.
Exemple 2 : Transfert du site de reconnaissance du squelette Sac7d sur l'ossature de Sso7d
Sso7d (SEQ ID N° 2) est un homologue de Sac7d (SEQ ID N° 1 ) qui est plus stable d'environ 10°C que Sac7d (Edmondson et al., (2001 ) Methods Enzymol, 334, 129-45).
Les inventeurs ont émis l'hypothèse que cette stabilité thermique pourrait mener à une meilleure stabilité à pH élevé. Les études publiées jusqu'à présent (Bedell et al., (2005). Biochemistry. 44, 915-25 ; Kahsai et al., (2005), Biochemistry, 44, 13500-9 ; McCrary et al., (1996), J Mol Biol, 264, 784-805 ; McCrary et al., (1998), J Mol Biol 276, 203-24 ; Clark et al., (2007), J Mol Biol 372, 992-1008) ne se sont jamais intéressées à la stabilité de ces protéines à des pH supérieurs à 10.
Sac7d et Sso7d de type sauvage (= WT) ont les séquences représentées par SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2.
La séquence de D1 Sso7d (SEQ ID N° 1 1 ) a été générée par synthèse de gène (GeneCust) en apportant les modifications suivantes à celle de D1 Sac7d (SEQ ID N° 10) :
1 ) mutations : V2A, K3T, T17I, D36E, N37G, D56Q
2) insertion : G entre G38 et K39
3) délétions : A59, C60, A61 Exemple 3 : Profil de spécificité par ELISA et affinité par résonance plasmonique de surface (SPR)
Pour caractériser D1 Sac7d et D1 Sso7d, leurs activités de fixation contre diverses IgG ont été testées par ELISA (Figure 2).
Les résultats montrent que D1 Sac7d et D1 Sso7d utilisés à la même concentration sont, dans ces conditions opératoires, tout deux spécifiques des IgG humaines et fixent fortement les IgG humaines d'isotypes 1 et 2, faiblement l'isotype 4 et pas l'isotype 3. Leur spécificité de reconnaissance est étroite puisque aucune IgG d'espèce autre qu'humaine n'est reconnue parmi celles testées.
La SAB (sérum albumine de bovin) n'est pas reconnue non plus (contrôle négatif) quelle que soit la forme de D1 (Sac7d ou Sso7d). Cependant, on observe une meilleure reconnaissance des lgG4 pour D1 Sso7d que pour D1 Sac7d. Comparées à la protéine C3 (SEQ ID N° 12), les formes de D1 ont le même profil de reconnaissance, sauf pour les IgG de porc que seul C3 est capable de reconnaître. D1 a donc une spécificité plus stricte que C3.
L'affinité de la protéine D1 Sso7d déterminée par SPR est de 1500 nM, une affinité suffisante pour son utilisation comme réactif de capture en chromatographie d'affinité.
Ce résultat démontre qu'il est possible de transférer un site de reconnaissance d'une protéine affine ayant un squelette Sac7d pour en créer une nouvelle sur la base d'une ossature Sso7d, en conservant la spécificité de la molécule initiale. Ce transfert de site de reconnaissance peut également être réalisé pour les autres protéines de la famille Sac7d, qui présentent toutes des similitudes de séquences et de conformation.
Exemple 4 : Spécificité déterminée par Western blot
Afin de déterminer le degré de spécificité des protéines D1 Sac7d et
D1 Sso7d, ces protéines purifiées ont été marquées avec le fluorophore Alexa680 pour être utilisées comme réactif d'immuno détection en Western blot.
Les IgG humaines ont été mélangées à du milieu de culture pour cellules eucaryotes (DMEM 10% sérum de veau fœtal), ou à de l'extrait brut de E. coli. Après migration sur gel SDS-PAGE et transfert sur membrane de nitrocellulose, la détection des IgG a été réalisée avec les protéines marquées.
La figure 3 montre que D1 Sac7d ne reconnaît aucune protéine contenue dans le DMEM, mais se lie à certaines protéines d'E. coli. De façon surprenante,
D1 Sso7d est plus spécifique puisqu'il ne reconnaît pratiquement que les IgG.
Exemple 5 : Caractérisation de l'épitope reconnu par D1 Sac7d et D1 Sso7d
La protéine A et le récepteur CD64 sont des ligands naturels du fragment Fc et pour lesquels la région du Fc qui est liée est connue. Les inventeurs ont utilisé ces ligands comme compétiteurs pour déterminer par SPR s'ils pouvaient exercer un effet inhibiteur sur la fixation de D1 Sso7d et D1 Sac7d sur les hlgG1 (Figure 4).
Par injection successive des analytes (Figure 4.A), la fixation de D1 Sso7d ne semble pas être modifiée par la fixation de CD64 et l'est très faiblement par la fixation de la Protéine A. Ces résultats sont confirmés par les expériences de co- injection des analytes (Figure 4.B). D1 Sac7d et D1 SSo7d semblent reconnaître le même épitope sur le fragment Fc, qui est clairement différent de celui reconnu par CD64 ou par C3. L'épitope reconnu semble aussi différent de celui reconnu par la Protéine A, la faible inhibition de fixation exercée par la Protéine A s'expliquant probablement par un léger encombrement stérique comme on l'observe entre la Protéine A et CD64 qui reconnaissent pourtant deux épitopes éloignés du fragment Fc.
Exemple 6 : Stabilité de D1 Sac7d et D1 Sso7d à pH acides et alcalins
La fraction active de D1 Sac7d ou D1 Sso7d ont été étudiées par SPR après différents temps d'incubation à pH 1 , 2, 3, 1 1 , 12 et 13.
On observe que D1 Sso7d est nettement plus résistant que D1 Sac7d aux pH alcalins. (Figure 5) En effet, on observe quasiment 100% d'activité après 24h à pH 13 pour D1 Sso7d, alors que dans les mêmes conditions D1 Sac7d est quasiment inactivé. D1 Sso7d semble aussi stable que la Protéine A dans ces conditions.
On observe que C3 (ou une autre protéine identifiée par criblage de la même banque que C3) est nettement moins stable que D1 Sso7d ou D1 Sac7d à pH supérieur à 1 1 (non montré). Par ailleurs, D1 Sac7d et D1 Sso7d conservent les propriétés acidophiles des protéines sauvages et sont peu ou pas altérées par des traitements d'une nuit aux pH acides.
La stabilité alcaline de D1 Sso7d semble donc permettre une utilisation en chromatographie d'affinité qui peut nécessiter des étapes de régénérations et de décontaminations à la soude 0.1 M ou plus.
Exemple 7 : Chromatographie d'affinité avec D1 Sso7d
Une colonne d'affinité a été préparée en immobilisant D1 Sso7d sur une résine d'agarose par la chimie des aminés.
Cette colonne a ensuite été mise en contact avec des IgG humaines d'isotypes 1 , 2, 3, 4, des IgG d'espèces (chèvre, souris lapin, rat, mouton et porc), et des IgA humaines, de façon indépendante.
L'analyse par SDS-PAGE des fractions protéiques non retenues et retenues a permis de conclure que D1 Sso7d est clairement capable de retenir les sous-types lgG1 , lgG2 et lgG4 humaines, et pourrait également retenir les lgG3, ce qui n'avait pas été détecté dans les conditions opératoires de l'ELISA.
Parmi les IgG animales, seule celle du rat est faiblement retenue sur la colonne, aucune autre n'est retenue. De même, aucune IgA humaine n'a été retenue sur la colonne.
Des IgG humaines mélangées à du DMEM + sérum de veau fœtal ou à de l'extrait brut d'E. coli ont été injectées sur une colonne D1 Sso7d. L'analyse par SDS-PAGE a montré que la colonne permet de séparer les IgG humaines de toutes les protéines contenues dans le DMEM complété de sérum de veau fœtal (Figure 6.A)
Pour les IgG humaines mélangées à un extrait brut d'E. coli, les conditions de séparation optimales nécessitent une force ionique élevée dans le tampon PBS de purification (500 mM NaCI final), comme c'est souvent le cas pour les purifications par chromatographie d'affinité (Figure 6.B).
Le système de purification par chromatographie d'affinité avec D1 Sso7d a été comparé au système standard de purification des anticorps basé sur une chromatographie avec la Protéine A.
Pour évaluer la qualité de purification que l'on peut atteindre avec une colonne de D1 Sso7d dans un cas pratique, celle-ci a été utilisée pour purifier une lgG1 humaine produite chez la souris sous forme d'ascite.
Le gel SDS-PAGE de la figure 6.C montre la fraction éluée correspondante aux lgG1 contenues dans l'ascite sont au moins aussi pures que si on utilise une colonne de protéine A dans les mêmes conditions. Les deux systèmes sont donc comparables.
Exemple 8 : Résistance d'une colonne d'affinité D1 Sso7d aux conditions de pH élevés
Pour évaluer le gain de stabilité obtenue entre C3 et D1 Sso7d, les colonnes C3 et D1 Sso7d ont été soumises à des cycles de purification d'IgGI humaines alternativement à des cycles de 15 min décontamination à la soude 0.1 M (CIP) :
Après 26 cycles de 15 min de traitement (soit 6h30 en temps cumulé), la colonne C3 est quasiment désactivée par NaOH 0,1 M (pH 13), alors que la colonne D1 Sso7d est encore fonctionnelle à 90% (Figure 7). Ainsi, la colonne de D1 Sso7d a une résistance à NaOH 0.1 M équivalente à celle de la Protéine A commerciale. Les résultats présentés ci-dessus montrent donc qu'il est possible de transférer des mutations observées dans la séquence Sac7d (reconnaissant une cible d'intérêt) vers une autre protéine de la même famille, en conservant la reconnaissance de la cible d'intérêt.
La protéine ainsi obtenue présente par ailleurs des propriétés un peu différentes de la protéine de départ (stabilité, spécificité...).

Claims

Revendications
Méthode de génération d'un acide nucléique codant pour une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de : a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d
b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt
c) synthétiser un acide nucléique codant pour une autre protéine de la famille Sac7d, mais dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.
Méthode de génération d'une protéine présentant une affinité pour une molécule d'intérêt, comprenant les étapes de :
a) comparer la séquence d'un mutant initial d'une protéine de la famille de Sac7d, ledit mutant présentant une affinité pour ladite molécule d'intérêt, avec la séquence de la protéine sauvage correspondante de la famille Sac7d
b) identifier les acides aminés mutés par rapport à la séquence sauvage correspondante, qui représentent le site de reconnaissance de ladite molécule d'intérêt
c) synthétiser un polypeptide présentant la séquence d'une autre protéine de la famille Sac7d, dans laquelle les acides aminés sauvages localisés à la même position que ceux mutés dans le mutant initial ont été remplacés par lesdits acides aminés mutés.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine de la famille Sac7d présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID N° 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine de la famille Sac7d est la protéine Sac7d dont la séquence est représentée par SEQ ID N° 1 .
Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite autre protéine de la famille Sac7d est la protéine Sso7d dont la séquence est représentée par SEQ ID N° 2.
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