[go: up one dir, main page]

WO2012010799A1 - Formulation d'anticorps anti-cd20 - Google Patents

Formulation d'anticorps anti-cd20 Download PDF

Info

Publication number
WO2012010799A1
WO2012010799A1 PCT/FR2011/051741 FR2011051741W WO2012010799A1 WO 2012010799 A1 WO2012010799 A1 WO 2012010799A1 FR 2011051741 W FR2011051741 W FR 2011051741W WO 2012010799 A1 WO2012010799 A1 WO 2012010799A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
composition according
composition
glycine
polysorbate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2011/051741
Other languages
English (en)
Inventor
Laetitia Cohen-Tannoudji
Sylvain Huille
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Publication of WO2012010799A1 publication Critical patent/WO2012010799A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Definitions

  • the invention relates to a stable pharmaceutical formulation of anti-CD20 antibodies.
  • the CD20 antigen is a transmembrane protein present on pre-B lymphocytes as well as on mature B cells.
  • the CD20 antigen is present on the surface of more than 90% of peripheral B lymphocytes and lymphoid organs. It is found on normal and tumor B lymphocytes. More particularly, the CD20 antigen is expressed on more than 90% of non-Hodgkin's lymphoma cells and is absent from hematopoietic stem cells, B-lymphocytes, plasma cells or other healthy tissues.
  • CD20 The role of CD20 in the proliferation and / or differentiation of B lymphocytes is poorly known, however it represents an interesting target of targeted therapy for controlling and killing B cells involved in cancers or autoimmune diseases.
  • a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody designated Rituximab and marketed as Rituxan® or MabThera® This antibody is now conventionally used in the treatment of non-Hodgkin's lymphomas and has many applications in the treatment of B cell-mediated immunological diseases, such as for example malignant tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, autoimmune diseases, Immunes involving an antibody such as autoimmune haemolytic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura and inflammatory diseases such as chronic rheumatoid arthritis or multiple sclerosis.
  • B cell-mediated immunological diseases such as for example malignant tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, autoimmune diseases, Immunes involving an antibody such as autoimmune haemolytic anemia and idiopathic thrombocytopenic purpura and inflammatory diseases such as chronic rheumatoid arthritis or multiple sclerosis.
  • WO 2009/080541 WO 2005/044859, WO 98/56418
  • the application WO 2009/080541 describes in particular a formulation containing an anti-CD20 antibody, histidine, threalose and polysorbate 20.
  • the commercial formulation of Rituxan® contains an anti-CD20 antibody, a citrate buffer, sodium chloride and polysorbate 80.
  • the formulation of Rituxan® is stable for 30 months stored in the refrigerator at 2-8 ° C and protected from light.
  • the ready-to-infuse Rituxan® solution remains physically and chemically stable for 24 hours at 2-8 ° C and for 12 hours at 15 ° C. 25 ° C (Professional Information from the Swiss Compendium of Medicines® MabThera® Roche, 2009).
  • the formulation of Rituxan® remains sensitive to stress of temperature, agitation and oxidation which can cause an early degradation of the product. It would therefore be advantageous to have a formulation containing an anti-CD20 antibody having better stability characteristics, making its use less restrictive, in particular by increasing the storage temperature at 25 ° C instead of 2-8 ° C for the commercial formulation Rituxan®.
  • the invention provides a liquid pharmaceutical composition, comprising an anti-CD20 antibody, a detergent, which is preferably a polysorbate, a buffer and a nonionic osmolality agent, which is preferably mannitol or glycine.
  • a detergent which is preferably a polysorbate
  • a buffer and a nonionic osmolality agent, which is preferably mannitol or glycine.
  • the composition in liquid form has a pH of between 5.0 and 7.0.
  • composition of the invention is free of sodium chloride.
  • the pharmaceutical composition of the invention provides anti-CD20 antibody compositions having chemical and physical stability at room temperature greater than the currently marketed anti-CD20 antibody composition (Rituxan®).
  • novel pharmaceutical composition in liquid form of the invention better withstands the stress conditions, in particular the temperature and oxidation stress conditions, than the reference composition (Rituxan®).
  • composition is less sensitive to the degradation phenomenon of the anti-CD20 antibody and thus benefits from a less restrictive use for the users.
  • the term “pharmaceutical composition” refers to preparations allowing the biological activity of the active ingredients and containing no additional toxic components for the subjects to which the composition is administered.
  • the term “anti-CD20 antibody” includes all forms of antibodies specifically binding to the CD20 antigen. This includes but is not limited to human antibodies, humanized antibodies, genetically engineered antibodies such as monoclonal antibodies, chimeric antibodies, recombinant antibodies, transgenic antibodies as well as fragments of such antibodies as long as the specific binding properties of anti-CD20 antibodies are present.
  • the anti-CD20 antibody used is the EMAB603 antibody as described in the patent application WO2006 / 064121.
  • This antibody is produced by the clone R603 deposited on November 29, 2005 under the registration number CNCM 1-3529 to the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15).
  • antibody fragments includes a portion of an entire antibody, generally at least the antigen-binding portion or variable region thereof.
  • antibody fragments include diabodies, single chain antibody molecules, immunotoxins, and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • the term "monoclonal antibody” as used in the above definition refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population, ie, each of the antibodies in the population are identical, they may have natural mutations present in amount minor. Monoclonal antibodies are highly specific because they are directed against a single antigenic site. In addition, unlike polyclonal antibody preparations that include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single antigenic determinant.
  • the term "monoclonal” used herein indicates the character of the antibody to be obtained from a substantially homogeneous antibody population and does not define the method of producing the antibody. Thus, the defined antibody can be produced by any method described in the prior art.
  • chimeric antibody refers to a monoclonal antibody comprising a variable region, ie, a binding region, a source or species, and at least a portion of a constant region derived from a source or a a different species, generally prepared by recombinant DNA techniques. Chimeric antibodies comprising a murine variable region and a human constant region are preferred.
  • Transgenic antibodies are monoclonal antibodies produced from transgenic animals. Applications WO1995017085 and WO2007048077 describe in particular transgenic antibodies and methods for preparing transgenic antibodies.
  • Humanized antibodies are chimeric antibodies containing a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • the humanized antibodies are, in large part, human immunoglobulins in which hypervariable region residues are replaced by hypervariable region residues of immunoglobulins of nonhuman species such as mice, rats, rabbits or nonhuman primates with specificity. , a desired affinity and capacity.
  • the "hypervariable regions” mentioned above refer to the amino acid residues of an antibody that are responsible for the binding of the antibody-antigen.
  • human antibody includes antibodies having variable regions and constant regions derived from immunoglobulin sequences of human germ lines.
  • recombinant human antibody includes all human antibodies prepared, expressed, created or isolated by recombinant means, such as antibodies isolated from host cells such as NSO, CHO or YB2 / 0 cells or from an animal (for example a transgenic mouse for human immunoglobulin genes or antibodies expressed by means of a recombinant expression vector transfected into a host cell.
  • Such recombinant antibodies have variable regions and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences in a rearranged form. Human recombinant antibodies may be subject to somatic hypermutation in vivo.
  • the amino acid sequences of the VH and VL regions may not exist in the repertoire of human antibody germline in vivo.
  • the term "specific binding" previously used refers to an antibody specifically binding the CD20 antigen.
  • the binding affinity has a KD value of 10 ⁇ 9 mol / L or less (preferably 10 ⁇ 10 mol / L), preferentially with a KD value of 10 ⁇ 10 mol / L or less (preferably 10 ⁇ 12 mol / L). Binding affinity is determined with a standard binding assay, such as surface plasmon resonance (Biacore®).
  • CD20 or “CD20 antigen” refers to all variants, isoforms and homologues of human CD20 species naturally expressed by cells or expressed by cells transfected with the CD20 gene. Binding an antibody of the invention to the CD20 antigen results in the death of CD20 expressing cells (such as a tumor cell) by inactivating CD20.
  • stable composition here means that the formation of aggregates (insoluble or soluble) is minimized, and / or that the chemical degradation is reduced, the pH is maintained and the conformation of the antibody is not substantially modified during the production or storage of the compositions of the invention so that the biological activity and stability of the antibody are maintained.
  • Various analytical techniques measuring the stability of a protein are available in the prior art and are grouped in Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Pubs (1991) and Jones, A Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993) for example. Stability can be measured at a given temperature for a given time.
  • the term "physical stability" of the anti-CD20 antibody refers to the reduction or absence of formation of insoluble or soluble aggregates of the dimeric, oligomeric or polymeric forms of the anti-CD20 antibody, reduction or absence of any structural denaturation of the molecule, as well as the reduction or absence of any precipitation of the molecule. Signs of aggregation, denaturation and / or precipitation are visually identifiable by the color and / or clarity of the solution, or measured by the absorbance at 400 nm, by membrane filtration 0.22 ⁇ , by measurement of dynamic light scattering by steric exclusion chromatography, SDS PAGE or microcalorimetry.
  • the term "chemical stability” refers to the reduction or absence of any chemical modification of the anti-CD20 antibody that may alter its biological activity during storage, in a liquid or solid formulation, under accelerated conditions. For example, the phenomena of hydrolysis, deamidation, and / or oxidation are avoided or delayed. The oxidation of sulfur-containing amino acids is limited. Chemical stability can be assessed by detecting and quantifying the chemically altered forms of the antibody. Chemical alterations can lead to changes in the size and charge of the antibody that can be evaluated, for example, by size exclusion chromatography, ion exchange, SDS PAGE or electrical isofocusing (IEF).
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises an anti-CD20 antibody, a polysorbate, a buffer and mannitol and / or glycine and has a pH of between 5.0 and 7.0.
  • the pH of the composition is maintained between 5.5 and 7.0, preferably between 6.0 and 7.0, more preferably between 6.2 and 6.7, more preferably at about 6.5.
  • the anti-CD20 antibody content in the composition of the invention may be as follows: between 5 and 20 g / l, preferably between 8 and 12 g / l, preferably between 9 and 11 g / L and preferably about 10 g / L.
  • detergent includes, in particular, Pluronic F68 and polysorbates, especially polyoxyethylene sorbitan monolaurate (synonymous with polysorbate 20, sold under the trademark Tween 20 TM) and polyoxyethylene sorbitan monooleate (synonymous with polysorbate 80, sold under the trademark Tween 80 TM). These detergents may be used at concentrations ranging from 70 to 1000 ppm, preferably at a concentration of 100 ppm to 800 ppm, preferably from 300 to 800 ppm, preferably from 500 to 800 ppm and even more preferably at a concentration of about 700 ppm.
  • polysorbate 80 is used.
  • buffer includes a pharmaceutically acceptable buffer.
  • a pharmaceutically acceptable buffer includes, but is not limited to, histidine buffers or preferably a salt of an alkali or alkaline earth metal, or a transition metal.
  • the salts are preferably in citrate, succinate, acetate or phosphate form.
  • trisodium citrate or sodium phosphate may be used.
  • the buffer used is a citrate buffer.
  • the buffer may also, preferably, be a sodium phosphate buffer.
  • Histidine may be added preferentially as an excipient in a lower proportion than the main buffer which is preferably trisodium citrate or sodium phosphate.
  • the buffer concentrations may be between 1 and 100 mM, preferably between 5 mM and 50 mM and still preferably at about 25 mM. Regardless of the buffer used, the pH is adjusted to a value between 5.0 and 7.0 and preferably to about 6.5 by adjusting with a base or an acid known in the prior art or by using buffer component mixtures. adequate or both.
  • non-ionic osmolality agent includes especially sugars such as polyols and sucrose, and nonionic amino acids at pH 5-7, such as proline, glycine, alanine, cysteine isoleucine, leucine, serine, valine, phenylalanine, methionine, asparagine, tyrosine and threonine.
  • the nonionic osmolality agent is mannitol or glycine.
  • Mannitol is preferably used in an amount of about 25 to 500 mM, preferably between 200 and 400 mM, preferably between 270 and 330 and more preferably about 300 mM.
  • Glycine is preferably used in an amount of about 25 to 500 mM, preferably between 200 and 400 mM, preferably between 200 and 330 and more preferably about 240 or 300 mM.
  • the pharmaceutical composition of the invention is free of sodium chloride.
  • the detergent preferably polysorbate 80
  • the buffer preferably citrate or phosphate
  • the nonionic osmolality agent preferably mannitol or glycine
  • composition may comprise:
  • composition may comprise:
  • composition may comprise:
  • an anti-CD20 antibody polysorbate 80;
  • composition may comprise:
  • the pharmaceutical composition comprises:
  • compositions in liquid form, before drying, or after reconstitution in the form of an injectable preparation.
  • composition for pharmaceutical use does not comprise sodium chloride, an ingredient that is nevertheless used in the usual manner as an osmolality agent in pharmaceutical formulations comprising an anti-CD20 antibody.
  • the replacement of sodium chloride with a nonionic osmolality agent offers several advantages.
  • the marked increase in turbidity observed after heating in a formulation containing sodium chloride is avoided when it is replaced by mannitol or glycine, more advantageously with mannitol.
  • the presence of mannitol or glycine in the anti-CD20 antibody solution prevents the aggregation of proteins. Mannitol and glycine improving the stability of the anti-CD20 antibody solution with respect to thermal phenomena.
  • glycine plays a protective role vis-à-vis the oxidation of the anti-CD20 antibody solution. Degradation is more marked with a solution containing sodium chloride.
  • the anti-CD20 antibody solution formulated with glycine as the osmolality agent undergoes less degradation.
  • Glycine improves the stability of the anti-CD20 antibody solution with respect to oxidation phenomena.
  • composition of the invention can be obtained using any conventional technique.
  • the composition of the invention can be obtained by implementing a process comprising mixing the anti-CD20 antibody with a buffer solution, adjusting the pH if necessary, filtration to obtain a liquid form,
  • composition according to the invention may advantageously be subjected to a method for eliminating or inactivating the infectious agents, for example by acid pH or nanofiltration treatment.
  • Figure 1 is a photograph showing the appearance of solutions Fl, F2 and F3 after heating to 57 ° C. The influence of the osmolality agent on the turbidity of the anti-CD20 antibody solutions is observed.
  • Figure 2 shows thermograms showing the denaturation and enthalpy transition temperature values of anti-CD20 antibody solutions in citrate / NaCl, citrate / mannitol or citrate / glycine environment.
  • Figure 3 shows the monitoring of the optical density (OD) turbidity at 400nm, after stability of the formulations at 25 ° C.
  • Figure 4 shows the follow-up of the percentage of kappa / IgG chains, after stability of the formulations at 40 ° C.
  • Figure 5 represents the monitoring of the evolution of the fragment level, after stability of the formulations at 40 ° C.
  • Anti-CD20 LFB-R603 antibody (described in WO2006064121) at an approximate concentration of 10 g / L was formulated with 25 mM sodium citrate buffer pH 6.5, with 700 ppm Tween 80 and with an agent. ionic osmolality, namely NaCl (formulation F1) at 9 g / L or a neutral osmolality agent, namely mannitol at 300 mM (formulation F2) or glycine at 300 mM (formulation F3). These three formulations were then filtered on Milex Durapore 0.22 ⁇ . Then the osmolality and pH values were checked and grouped in Table 1.
  • the determination of the total anti-CD20 antibody concentration was performed for each formulation by measuring the absorbance at 280 nm.
  • the molar extinction coefficient for the anti-CD20 antibody is 1.61 Lg ⁇ .com "1.
  • the turbidity of the solutions was evaluated by measuring the OD at 400 nm, it is an indirect measure of the diffused intensity which makes it possible to follow the phenomena of macroscopic aggregation.
  • the turbidity values obtained are low for the three formulations (Fl: 0.015, F2: 0.016 and F3: 0.015), which means a lack of aggregate.
  • the dynamic light scattering measurement makes it possible to measure the hydrodynamic rays of the proteins and aggregates present in solution. This measurement makes it possible to follow aggregation phenomena at early stages of formation, since the sizes of the detected objects range from nanometer or micron. The percentage of the main population, composed mainly of monomers, can be reported. These are non-quantitative readings, as the intensity of diffusion does not depend solely on the concentration of objects but also on their size. The results showed that solutions Fl, F2 and F3 are all free of even sub-micron aggregates at T0.
  • the set of analyzes at T0 confirms that the three solutions are equivalent with respect to the pH, the osmolality, the concentration and the initial state of aggregation.
  • Example 2 Temperature Stress
  • Thermal stress is used to accelerate the chemical and physical degradation phenomena and to compare the stability of the different formulations.
  • Any macroscopic change in the solution such as the appearance of microbubbles, the change in color, the appearance of filaments or particles, can be identified by visual observation.
  • the tracking of aggregation phenomena only objects larger than 50 ⁇ are detected visually.
  • the values presented in Table 2 confirm the visual observations.
  • the turbidity value makes it possible to establish a classification of the osmolality agents according to their impact on the stability of the solution.
  • the formulation F2 is more stable than the formulation F3, itself much more stable than the formulation F1.
  • Table 2 OD values at 400 nm - Measurement of the turbidity
  • the determination of the amount of aggregated proteins was carried out after membrane filtration 0.22 ⁇ of the heated solution. This step removes aggregates larger than 220 nm. A total protein assay performed in the filtrate was then performed and compared to T0. When heating at 57 ° C, an evaporation phenomenon occurs, this must be taken into account in the interpretation of the concentration obtained after heating and filtration. This phenomenon has the effect of underestimating the percentage of proteins approved. The value obtained takes into account the aggregated proteins that were retained on the membrane during filtration, but also the evaporation of the solution during stress and the amount of non-aggregated proteins on the membrane.
  • Mannitol and glycine are found to be osmolality agents that promote stability of the anti-CD20 antibody solution under heat stress conditions.
  • Oxidation stress makes it possible to measure the stability of a protein solution with respect to the degradation process represented by the oxidation.
  • a strong oxidant, hydrogen peroxide was added to the anti-CD20 antibody solutions at a concentration of 30 mM. The mixtures were incubated for 24 hours at 37 ° C. 3.2 SDS-PAGE analysis
  • the SDS-PAGE electrophoresis technique separates proteins according to their molecular weight. It makes it possible to know if the stress carried out fragments the protein or leads to covalent aggregates.
  • the analysis was carried out under reducing and non-reducing conditions with staining in Coomassie blue. Oxidized solutions were compared to T0 solutions. The amount of protein per well was set at 2 ⁇ g. The size marker used is Mark 12.
  • the various solutions tested have an electrophoretic profile under non-reducing conditions, comprising a majority band at 150 kDa and two band groups at about 130 kDa and 110 kDa.
  • the SDS-PAGE analysis results show that glycine plays a protective role vis-à-vis oxidation with less marked degradation than for solutions containing NaCl or mannitol (Fl and F3).
  • Steric exclusion chromatography in the liquid phase makes it possible to separate the objects according to their hydrodynamic radius.
  • the detection is carried out by measurement of OD at 280 nm.
  • the integration of the UV chromatogram makes it possible to determine the percentages of monomers, dimers, polymers and fragments.
  • Table 4 presents the results. The proportions of each entity obtained for the samples at TO are comparable regardless of the osmolality agent considered. Under oxidation stress, degradation of the anti-CD20 antibody is observed in the presence of NaCl and mannitol (Fl and F3), corresponding to the appearance of new entities (peak 4 and peak 6) and an increase fragments. The F2 solution appears less degraded after oxidation, where only a slight increase in the level of fragments is observed.
  • the microcalorimetry tests were carried out on the Microcal VP-DSC apparatus.
  • the analysis consists in measuring the heat flux released during a controlled temperature sweep in the sample containing the protein compared to its formulation buffer. This heat flux reflects the changes of states of the protein and thus informs on its denaturation. Differences in thermogram profiles tell us about the relative thermal stability of the protein in different formulation environments. Results
  • the anti-CD20 antibody thermograms of the F2 and F3 solutions show the same transitions indicating that the denaturation of the protein proceeds according to the same decoupled mechanism in 4 transitions.
  • the total enthalpy necessary to completely denature the protein is equivalent for these two formulations (952 Kcal / mol for F2 vs 950 Kcal / mol for F3).
  • the profile of the anti-CD20 antibody thermogram in citrate / NaCl formulation is significantly different with the appearance of an additional transition, a decrease in the denaturation start temperature and a decrease in the total enthalpy of denaturation (866 Kcal / mol).
  • the following parameters are evaluated: visual appearance, purity, molecular size distribution (monomers, polymers, dimers and fragments), isoform profile, pH, study of the possible absorption of Polysorbate 80 on the plug, the study of the possible migration of aluminum from the primary packaging, the "free" kappa chains and the total protein concentration.
  • the functional activity of the antibody is evaluated over time. Functional activity is determined by known classical methods those skilled in the art, for example by measuring antibody-mediated cytotoxicity (ADCC), binding to the CD16 receptor.
  • ADCC antibody-mediated cytotoxicity
  • the batches were placed, protected from the light, in enclosures thermostated at 5 ° C, 25 ° C or 40 ° C.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

La demande concerne une composition pharmaceutique, comprenant un anticorps anti-CD20, un détergent comme le polysorbate, un tampon et un agent d'osmolalité non -ionique, comme du mannitol ou de la glycine. La composition possède un pH compris entre 5,0 et 7,0.

Description

Formulation d'anticorps anti-CD20
L'invention concerne une formulation pharmaceutique stable d'anticorps anti-CD20.
L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire présente sur les pré-lymphocytes B ainsi que sur les lymphocytes B matures. L'antigène CD20 est présent à la surface de plus de 90% des lymphocytes B périphériques et des organes lymphoïdes. On le retrouve sur les lymphocytes B normaux et tumoraux. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur plus de 90% des cellules de lymphomes non-Hodgkinien et est absent des cellules souches hématopoïétiques, des pro- lymphocytes B, des cellules du plasma ou des autres tissus sains.
Le rôle de CD20 dans la prolifération et/ou la différenciation des lymphocytes B est mal connu, cependant il représente une cible intéressante de thérapie ciblée pour contrôler et tuer les lymphocytes B impliquées dans des cancers ou des maladies auto-immunes.
IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S a développé un anticorps monoclonal anti-CD20 chimérique désigné le Rituximab et commercialisé sous le nom de Rituxan® ou MabThera®. Cet anticorps est maintenant utilisé classiquement dans le traitement des lymphomes non- Hodgkiniens et a de nombreuses applications dans le traitement des maladies immunologiques médiées par les lymphocytes B, comme par exemple les tumeurs malignes, telles que la leucémie lymphoïde chronique, les maladie-auto-immunes impliquant un anticorps comme l'anémie hémolytique auto-immune et purpura thrombocytopénique idiopathique et les maladies inflammatoires telles que l'arthrite rhumathoïde chronique ou la sclérose en plaques.
Plusieurs formulations d'anticorps anti-CD20 ont été décrites (WO 2009/080541, WO 2005/044859, WO 98/56418). La demande WO 2009/080541 décrit notamment une formulation contenant un anticorps anti-CD20, de l'histidine, du thréalose et du polysorbate 20. La formulation commerciale du Rituxan® contient un anticorps anti-CD20, un tampon citrate, du chlorure de sodium et du polysorbate 80. Selon la notice qui résume des caractéristiques du produit (RCP), la formulation du Rituxan® est stable 30 mois conservée au réfrigérateur à 2-8°C et à l'abri de la lumière. Par ailleurs après dilution dans une solution NaCl 0.9% ou une solution de glucose 5% , la solution de Rituxan® prête à être perfusée reste physiquement et chimiquement stable pendant 24 heures à 2-8°C et pendant 12 heures à 15- 25°C (Information professionnelle du Compendium Suisse des Médicaments® MabThera® Roche, 2009). En particulier, la formulation de Rituxan® reste sensible aux stress de température, d'agitation et d'oxydation pouvant provoquer une dégradation précoce du produit. II serait donc avantageux de disposer d'une formulation contenant un anticorps anti-CD20 présentant de meilleures caractéristiques de stabilité, rendant son utilisation moins contraignante, notamment en augmentant la température de conservation à 25 °C au lieu de 2- 8°C pour la formulation commerciale Rituxan®.
Résumé de l'invention L'invention fournit une composition pharmaceutique liquide, comprenant un anticorps anti- CD20, un détergent, qui est de préférence un polysorbate, un tampon et un agent d'osmolalité non-ionique, qui est de préférence du mannitol ou de la glycine. La composition sous forme liquide possède un pH compris entre 5,0 et 7,0.
Avantageusement, la composition de l'invention est dépourvue de chlorure de sodium. Description détaillée de l'invention
La composition pharmaceutique de l'invention fournit des compositions d'anticorps anti- CD20 possédant une stabilité chimique et physique à température ambiante supérieure à la composition d'anticorps anti-CD20 actuellement commercialisée (Rituxan®).
Notamment, la nouvelle composition pharmaceutique sous forme liquide de l'invention supporte mieux les conditions de stress, en particulier les conditions de stress de température et d'oxydation que la composition de référence (Rituxan®).
La composition est moins sensible au phénomène de dégradation de l'anticorps anti-CD20 et bénéficie donc d'une utilisation moins contraignante pour les utilisateurs.
Le terme « composition pharmaceutique » fait référence aux préparations permettant l'activité biologique des ingrédients actifs et ne contenant aucun composant additionnel toxique pour les sujets auxquels la composition est administrée. Le terme « anticorps anti-CD20 » comprend toutes les formes d'anticorps se liant spécifiquement à l'antigène CD20. Ceci inclut mais n'est pas limité aux anticorps humains, anticorps humanisés, anticorps modifiés génétiquement comme les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques, les anticorps recombinants, les anticorps transgéniques tout comme les fragments de tels anticorps tant que les propriétés de liaison spécifique à l'anticorps anti-CD20 sont présentes. Selon un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CD20 utilisé est l'anticorps EMAB603 tel que décrit dans la demande de brevet WO2006/064121. Cet anticorps est produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15).
Le terme « fragments d'anticorps » comprend une portion d'un anticorps entier, généralement au moins la portion liant l'antigène ou la région variable de celle-ci. Les exemples de fragments d'anticorps inclus les diacorps, les molécules d'anticorps simple chaîne, les immunotoxines et les anticorps multispécifiques formés à partir des fragments d'anticorps.
Le terme « anticorps monoclonal » tel qu'utilisé dans la définition précédente se rapporte à un anticorps obtenu d'une population d'anticorps substantiellement homogène, i.e., chacun des anticorps de la population sont identiques, ils peuvent présenter des mutations naturelles présentes en quantité mineure. Les anticorps monoclonaux sont hautement spécifiques, car ils sont dirigés contre un seul site antigénique. De plus, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui incluent différents anticorps dirigés contre différents déterminants (épitopes), chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul déterminant antigénique. Le terme « monoclonal » employé ici indique le caractère de l'anticorps à être obtenu d'une population d'anticorps substantiellement homogène et ne définit pas la méthode de production de l'anticorps. Ainsi, l'anticorps défini peut être produit par n'importe quelle méthode décrite dans l'art antérieur.
Le terme « anticorps chimérique » se rapporte à un anticorps monoclonal comprenant une région variable, i.e., une région de liaison, d'une source ou d'une espèce et au moins une portion d'une région constante dérivée d'une source ou d'une espèce différente, préparé généralement par des techniques d'ADN recombinant. Les anticorps chimériques comprenant une région variable murine et une région constante humaine sont préférés. Les« anticorps transgénique » sont des anticorps monoclonaux produits à partir d'animaux transgéniques. Les demandes WO1995017085 et WO2007048077 décrivent notamment des anticorps transgéniques et des méthodes de préparation d'anticorps transgéniques.
Les « anticorps humanisé » sont des anticorps chimériques contenant une séquence minimale dérivée d'immunoglobuline non humaine. Les anticorps humanisés sont, en grande partie, des immunoglobulines humaines dans lesquelles des résidus des régions hypervariables sont remplacées par des résidus des régions hypervariables d' immunoglobulines d'espèces non humaines telles que les souris, rats, lapin ou primates non humains possédant une spécificité, une affinité et une capacité désirées. Les « régions hypervariables » mentionnées ci-dessus, renvoient aux résidus d'acides aminés d'un anticorps qui sont responsables de la liaison de l'anticorps-antigène.
Le terme « anticorps humain » inclut les anticorps ayant des régions variables et des régions constantes dérivées de séquences d' immunoglobulines de lignées germinales humaines.
L'expression « anticorps recombinant humain» inclut tous les anticorps humains préparés, exprimés, créés ou isolés par des moyens recombinants, tels que des anticorps isolés de cellules hôtes telles que les cellules NSO, CHO ou YB2/0 ou d'un animal (par exemple une souris) transgénique pour les gènes d'immunoglobulines humaines ou des anticorps exprimés grâce à un vecteur d'expression recombinant transfecté dans une cellule hôte. De tels anticorps recombinants possèdent des régions variables et des régions constantes dérivées de séquences d'immunoglobulines de lignées germinales humaines dans une forme réarrangée. Les anticorps recombinants humains peuvent être sujets à des hypermutations somatiques in vivo. Ainsi, les séquences en acides aminés des régions VH et VL, bien que dérivées ou apparentées à des séquences VH et VL de lignées germinales humaines, peuvent ne pas exister dans le répertoire de lignées germinales d'anticorps humain in vivo. L'expression « liaison spécifique » utilisée précédemment, réfère à un anticorps liant spécifiquement l'antigène CD20. Préférentiellement, l'affinité de liaison a une valeur de KD de 10~9 mol/L ou inférieure (de préférence 10~10 mol/L), préférentiellement avec une valeur de KD de 10~10 mol/L ou inférieure (de préférence 10~12 mol/L). L'affinité de liaison est déterminée avec un essai de liaison standard, tel que la technique de résonnance plasmonique de surface (Biacore®). Le terme « CD20 » ou « antigène CD20 » fait référence à tous les variants, isoformes et homologues d'espèce du CD20 humain naturellement exprimés par les cellules ou exprimés par des cellules transfectées par le gène du CD20. La liaison d'un anticorps de l'invention à l'antigène CD20 entraine la mort des cellules exprimant CD20 (telle qu'une cellule tumorale) en inactivant le CD20.
Le terme « composition stable » signifie ici que la formation d'agrégats (insolubles ou solubles) est minimisée, et/ou que la dégradation chimique est réduite, le pH est maintenu et la conformation de l'anticorps n'est pas substantiellement modifiée pendant la production ou la conservation des compositions de l'invention, de telle sorte que l'activité biologique et la stabilité de l'anticorps soient conservées. Différentes techniques analytiques mesurant la stabilité d'une protéine sont disponibles dans l'art antérieur et sont regroupées dans Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Pubs (1991) et Jones, A Adv. Drug Delivery Rev. 10 : 29-90 (1993) par exemple. La stabilité peut être mesurée à une température donnée pendant un temps donné.
Le terme « stabilité physique » de l'anticorps anti-CD20 se réfère à la réduction ou l'absence de formation d'agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques de l'anticorps anti-CD20, à la réduction ou l'absence de toute dénaturation structurale de la molécule, ainsi qu'à la réduction ou l'absence de toute précipitation de la molécule. Les signes d'agrégation, de dénaturation et/ou de précipitation sont repérables visuellement par la couleur et/ou la clarté de la solution, ou mesurés par l'absorbance à 400 nm, par fïltration sur membrane 0,22 μιη, par mesure de la diffusion dynamique de la lumière, par chromato graphie d'exclusion stérique, par SDS PAGE ou par microcalorimétrie.
Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l'absence de toute modification chimique de l'anticorps anti-CD20 pouvant modifier son activité biologique pendant le stockage, dans une formulation liquide ou solide, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d'hydrolyse, déamidation, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L'oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité chimique peut être évaluée en détectant et quantifiant les formes altérées chimiquement de l'anticorps. Les altérations chimiques peuvent entraîner des modifications de la taille et de charge de l'anticorps pouvant être évaluées, notamment, par chromatographie d'exclusion stérique, échangeuse d'ions, SDS PAGE ou isofocalisation électrique (IEF). La composition pharmaceutique de l'invention comprend un anticorps anti-CD20, un polysorbate, un tampon et du mannitol et/ou de la glycine et possède un pH compris entre 5,0 et 7,0.
De préférence le pH de la composition est maintenu entre 5,5 et 7,0, de préférence entre 6,0 et 7,0, de préférence encore entre 6,2 et 6,7, de préférence encore à environ 6,5.
Dans un mode de réalisation préféré, la teneur en anticorps anti-CD20 dans la composition de l'invention peut être la suivante: entre 5 et 20 g/L, de préférence entre 8 et 12 g/L, préférentiellement entre 9 et 11 g/L et préférentiellement environ 10 g/L.
Le terme « détergent » inclut notamment le Pluronic F68 et les polysorbates, notamment le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane (synonyme de polysorbate 20, vendu sous la marque Tween 20™) et monooléate de polyoxyéthylène de sorbitane (synonyme de polysorbate 80, vendu sous la marque Tween 80™). Ces détergents peuvent être utilisés à des concentrations allant de 70 à 1000 ppm, préférentiellement à une concentration de 100 ppm à 800 ppm, de préférence de 300 à 800 ppm, de préférence de 500 à 800 ppm et encore préférentiellement à une concentration d'environ 700 ppm. De manière préférée, le polysorbate 80 est utilisé.
Le terme « tampon » comprend un tampon pharmaceutiquement acceptable. Un tampon pharmaceutiquement acceptable comprend, sans y être limité, les tampons histidine ou de préférence un sel d'un métal alcalin ou alcalinoterreux, ou d'un métal de transition. Les sels sont de préférence sous forme citrate, succinate, acétate ou phosphate. Par exemple, on peut utiliser un citrate trisodique ou un phosphate de sodium. Préférentiellement, le tampon utilisé est un tampon citrate. Le tampon peut également, de manière préférée, être un tampon phosphate de sodium. L'histidine, peut être ajoutée de manière préférentielle, comme excipient en plus faible proportion que le tampon principal qui est de préférence un citrate trisodique ou un phosphate de sodium. Les concentrations en tampon peuvent être comprises entre 1 et 100 mM, préférentiellement entre 5 mM et 50 mM et toujours préférentiellement à environ 25 mM. Indépendamment du tampon utilisé, le pH est ajusté à une valeur comprise entre 5,0 et 7,0 et préférentiellement à environ 6,5 en ajustant avec une base ou un acide connus dans l'art antérieur ou en utilisant des mélanges de composants tampons adéquats ou les deux. Le terme « agent d'osmolalité non-ionique » inclut notamment des sucres comme les polyols et le saccharose, et les acides aminés non-ioniques à pH 5-7, comme la proline, la glycine, l'alanine, la cystéine, l'isoleucine, la leucine, la sérine, la valine, la phénylalanine, la méthionine, l'asparagine, la tyrosine et la thréonine. De préférence, l'agent d'osmolalité non- ionique est le mannitol ou la glycine.
Le mannitol est de préférence utilisé en quantité d'environ 25 à 500 mM, de préférence, entre 200 et 400 mM, préférentiellement entre 270 et 330 et encore préférentiellement d'environ 300 mM.
La glycine est de préférence utilisée en quantité d'environ 25 à 500 mM, de préférence, entre 200 et 400 mM, préférentiellement entre 200 et 330 et encore préférentiellement d'environ 240 ou 300 mM.
Dans un mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique de l'invention est dépourvue de chlorure de sodium.
De préférence le détergent (de préférence le polysorbate 80), le tampon (de préférence citrate ou phosphate) et l'agent d'osmolalité non-ionique (de préférence le mannitol ou la glycine) sont les seuls excipients de la formulation (qui comprend aussi l'anticorps, et de l'eau).
Dans un exemple de réalisation, la composition peut comprendre :
un anticorps anti-CD20 ;
du polysorbate 80 ;
- du citrate trisodique ;
du mannitol.
Dans un autre exemple de réalisation, la composition peut comprendre :
un anticorps anti-CD20 ;
- du polysorbate 80 ;
du citrate trisodique ;
de la glycine.
Selon un autre exemple, la composition peut comprendre :
- un anticorps anti-CD20 ; du polysorbate 80 ;
du phosphate de sodium;
du mannitol ou de la glycine. Plus particulièrement, la composition peut comprendre :
8 à 12 g/L d'anticorps anti-CD20 ;
- 100 à 1000 ppm de polysorbate 80 ;
1 à 100 mM de citrate trisodique ou 1 à 100 mM de phosphate de sodium;
25 à 500 mM de mannitol ou 25 à 500 mM de glycine ;
à un pH de 5,0 à 7,0.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique comprend :
10 g/L d'anticorps anti-CD20 ;
700 ppm de polysorbate 80 ;
- 25 mM de citrate trisodique ou 25 mM de phosphate de sodium ;
300 mM de mannitol ou 240 ou 300 mM de glycine ;
à un pH de 6,5.
Les concentrations sont déterminées vis à vis des compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable La composition à usage pharmaceutique ne comprend pas de chlorure de sodium, ingrédient pourtant utilisé de manière usuelle comme agent d'osmolalité dans les formulations pharmaceutiques comprenant un anticorps anti-CD20.
Le remplacement du chlorure de sodium par un agent d'osmolalité non-ionique, de préférence du mannitol ou de la glycine, offre plusieurs avantages. D'une part, la nette augmentation de turbidité observée après chauffage dans une formulation contenant du chlorure de sodium est évitée lorsqu'il est remplacé par du mannitol ou de la glycine, de manière plus avantageuse avec du mannitol. La présence de mannitol ou de glycine dans la solution d'anticorps anti- CD20 prévient l'agrégation des protéines. Le mannitol et la glycine améliorant la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 vis-à-vis des phénomènes thermiques. Par ailleurs, la glycine joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'oxydation de la solution d'anticorps anti-CD20. On observe une dégradation plus marquée avec une solution contenant du chlorure de sodium. Ainsi, la solution d'anticorps anti-CD20 formulée avec de la glycine en tant qu'agent d'osmolalité subit moins de dégradation. La glycine améliore la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 vis-à-vis des phénomènes d'oxydation.
La composition de l'invention peut être obtenue en utilisant toute technique usuelle. Notamment la composition de l'invention peut être obtenue en mettant en œuvre un procédé comprenant le mélange de l'anticorps anti-CD20 avec une solution tampon, ajustement du pH si nécessaire, fïltration pour l'obtention d'une forme liquide,
La composition selon l'invention peut être avantageusement soumise à une méthode d'élimination ou d'inactivation des agents infectieux, par exemple par traitement pH acide ou nanofiltration.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures
La Figure 1 est une photo montrant l'aspect des solutions Fl, F2 et F3 après chauffage à 57°C. On observe l'influence de l'agent d'osmolalité sur la turbidité des solutions d'anticorps anti-CD20.
La Figure 2 représente des thermogrammes montrant les valeurs de température de transition de dénaturation et d'enthalpie des solutions d'anticorps anti-CD20 en environnement citrate/NaCl, citrate/mannitol ou citrate/glycine.
La Figure 3 représente le suivi de la turbidité en densité optique (DO) à 400nm, après mise en stabilité des formulations à 25°C.
La Figure 4 représente le suivi du pourcentage des chaînes kappa/IgG, après mise en stabilité des formulations à 40°C.
La Figure 5 représente le suivi de l'évolution du taux de fragments, après mise en stabilité des formulations à 40°C. EXEMPLES :
Exemple 1 : Préparation des solutions et analyses à T0
1.1 Préparation des solutions
De l'anticorps anti-CD20 LFB-R603 (décrit dans la demande WO2006064121) à une concentration approximative de lOg/L a été formulé avec du tampon citrate de sodium à 25 mM pH 6.5, avec 700 ppm de Tween 80 et avec un agent d'osmolalité ionique, à savoir le NaCl (formulation Fl) à 9 g/L ou un agent d'osmolalité neutre, à savoir le mannitol à 300 mM (formulation F2) ou la glycine à 300 mM (formulation F3). Ces trois formulations ont ensuite été filtrées sur Milex Durapore 0,22 μιη. Puis les valeurs d'osmolalité et de pH ont été vérifiées et ont été regroupées dans le tableau 1.
Tableau 1 : Caractéristiques des solutions test
Figure imgf000011_0001
1.2 Mesures de la concentration exacte en anticorps anti-CD20
La détermination de la concentration totale en anticorps anti-CD20 a été réalisée pour chaque formulation par une mesure de l'absorbance à 280 nm. Le coefficient d'extinction molaire pour l'anticorps anti-CD20 est de 1,61 L.g^.com"1.
Les concentrations en protéines totales des trois solutions ont été mesurées et correspondent aux valeurs attendues (Fl : 9,50 g/L, F2 : 9,35 g/L et F3 : 9,42 g/L). il
1.3 Mesures de la turbidité
La turbidité des solutions a été évaluée par mesure de la DO à 400 nm, c'est une mesure indirecte de l'intensité diffusée qui permet de suivre les phénomènes d'agrégation macroscopique. Les valeurs de turbidité obtenues sont faibles pour les trois formulations (Fl : 0,015, F2 : 0,016 et F3 : 0,015), ce qui signifie une absence d'agrégat.
1.4 Mesures de DLS (Dynamic Light Scattering)
La mesure de diffusion dynamique de la lumière permet de mesurer les rayons hydrodynamiques des protéines et des agrégats présents en solution. Cette mesure permet de suivre les phénomènes d'agrégation à des stades précoces de formation, puisque les tailles des objets détectés vont du nanomètre ou micron. Le pourcentage de la population principale, composée essentiellement de monomères, peut être reporté. Il s'agit de relevés non quantitatifs, l'intensité de diffusion ne dépendant pas uniquement de la concentration des objets mais aussi de leur taille. Les résultats ont montré que les solutions Fl, F2 et F3 sont toutes exemptes d'agrégats, même submicroniques, à T0.
1.5 Conclusion
L'ensemble des analyses à T0 confirme que les trois solutions sont équivalentes vis-à-vis du pH, de l'osmolalité, de la concentration et de l'état d'agrégation initial. Exemple 2 : Stress de température
2.1 Conditions de stress
Un stress thermique est utilisé pour accélérer les phénomènes de dégradation chimique et physique et permet de confronter la stabilité des différentes formulations.
Le stress thermique a été réalisé par un chauffage en bain marie à 57° C. Pour chaque formulation, le stress a été réalisé sur 1 mL de solution dans un tube à hémolyse bouché hermétiquement pour limiter l'évaporation, pendant 1 heure (ou 45 minutes) et 3 heures. 2.2 Observations visuelles
Tout changement macroscopique de la solution, tel que l'apparition de microbulles, la modification de la couleur, l'apparition de filaments ou de particules, peut être repéré par observation visuelle. En ce qui concerne le suivi des phénomènes d'agrégation, seuls les objets de taille supérieure à 50 μιη sont détectés visuellement.
Au bout d'une heure de chauffage, une nette augmentation de la turbidité a été observée pour la solution Fl. Les solutions F2 et F3 sont très légèrement turbides. Après 3 heures de chauffage, la tendance est confirmée pour la solution Fl qui demeure turbide. La solution F2 apparaît légèrement plus dégradée que la solution F3 (voir Figure 1). 2.3 Mesure de la turbidité
Les valeurs présentées dans le tableau 2 confirment les observations visuelles. La valeur de turbidité permet d'établir un classement des agents d'osmolalité suivant leur impact sur la stabilité de la solution. La formulation F2 est plus stable que la formulation F3, elle-même nettement plus stable que la formulation Fl. Tableau 2 : Valeurs de DO à 400 nm - Mesure de la turbidité
Figure imgf000013_0001
2.4 Détermination du pourcentage de protéines agrégées
Matériels et méthodes
La détermination de la quantité de protéines agrégées a été effectuée après filtration sur membrane 0,22 μιη de la solution chauffée. Cette étape permet d'enlever les agrégats de plus de 220 nm. Un dosage des protéines totales effectué dans le filtrat a ensuite été réalisé et comparé à T0. Lors d'un chauffage à 57°C, un phénomène d'évaporation apparaît, celui-ci est à prendre en compte dans l'interprétation de la concentration obtenue après chauffage et filtration. Ce phénomène a pour conséquence de sous-estimer le pourcentage en protéines agréées. La valeur obtenue prend en compte les protéines agrégées qui ont été retenues sur la membrane lors de la fïltration, mais aussi l'évaporation de la solution lors du stress et la quantité de protéines non agrégées sur la membrane.
Résultats Les valeurs de concentration en protéines obtenues après 1 h ou 3h de chauffage sont parfois plus élevées qu'à T0 ce qui révèle une forte évaporation lors du stress. Si on prend l'hypothèse que l'évaporation est la même pour toutes les solutions, il est possible de les comparer entre elles à un temps T et non par rapport à T0.
Après 1 heure et 3 heures de chauffage, la présence de mannitol ou de glycine (formulations F2 et F3) prévient l'agrégation des protéines. La solution contenant du NaCl (formulation Fl) est, quant à elle, la plus agrégée avec près de 33% de protéines agrégées (Tableau 3).
Tableau 3 : Concentration d'anticorps anti-CD20 après fïltration des agrégats - Influence de l'agent d'osmolalité
Figure imgf000014_0001
Le mannitol et la glycine se révèlent être des agents d'osmolalité qui favorisent la stabilité de la solution d'anticorps anti-CD20 dans des conditions de stress thermique.
Exemple 3 : Stress d'oxydation
3.1 Conditions de stress
Le stress d'oxydation permet de mesurer la stabilité d'une solution de protéine par rapport au processus de dégradation que représente l'oxydation. Ainsi, un oxydant fort, le peroxyde d'hydrogène, a été ajouté aux solutions d'anticorps anti- CD20 à une concentration de 30 mM. Les mélanges ont été incubés pendant 24 heures à 37°C. 3.2 Analyse SDS-PAGE
Matériels et méthodes
La technique d'électrophorèse SDS-PAGE sépare les protéines selon leur poids moléculaire. Elle permet de savoir si le stress effectué fragmente la protéine ou conduit à des agrégats covalents. L'analyse a été effectuée en conditions réductrices et non réductrices avec une coloration en bleu de Coomassie. Les solutions oxydées ont été comparées aux solutions à T0. La quantité de protéines par puits a été fixée à 2 μg, Le marqueur de taille utilisé est le Mark 12.
Résultats L'analyse des gels d'électrophorèse montre que :
A T0, les différentes solutions testées présentent un profil électrophorétique en conditions non réductrices, comprenant une bande majoritaire à 150 kDa et deux groupes de bandes vers 130 kDa et 110 kDa.
Après 24 heures d'oxydation, on observe l'apparition de bandes à environ 105, 75 et 45 kDa en conditions non réductrices et une intensification des bandes à 70 et 25 kDa environ. La proportion de ces bandes est plus importante pour les solutions d'anticorps anti-CD20 oxydés contenant du NaCl (Fl) et du mannitol (F3). En conditions réductrices, la solution contenant de la glycine (F2) a un profil électrophorétique comparable à celui observé à T0, alors que les solutions contenant du NaCl ou du mannitol (Fl et F3), on observe une augmentation significative de la proportion de la bande à 125 kDa (7%).
Les résultats d'analyse SDS-PAGE montrent que la glycine joue un rôle protecteur vis-à-vis de l'oxydation avec une dégradation moins marquée que pour les solutions contenant du NaCl ou du mannitol (Fl et F3).
3.3 HP-SEC Matériels et méthodes
La chromatographie d'exclusion stérique en phase liquide permet de séparer les objets suivant leur rayon hydrodynamique. La détection est réalisée par mesure de DO à 280 nm. L'intégration du chromatogramme UV permet de déterminer les pourcentages de monomères, dimères, polymères et fragments. Résultats
Le tableau 4 présente les résultats. Les proportions de chaque entité obtenues pour les échantillons à TO sont comparables quel que soit l'agent d'osmolalité considéré. En condition de stress d'oxydation, on remarque une dégradation de l'anticorps anti-CD20 en présence de NaCl et de mannitol (Fl et F3), correspondant à l'apparition de nouvelles entités (pic 4 et pic 6) et une augmentation des fragments. La solution F2 apparaît moins dégradée après oxydation, où seule une légère augmentation du taux de fragments est observée.
Tableau 4 : Résultats d'HP-SEC pour les échantillons à TO oxydés - Résultats d'intégration des chromato grammes UV - Influence de l'agent d'osmolalité
Figure imgf000016_0001
Les résultats des analyses SDS-PAGE et HP-SEC indiquent qu'en condition de stress d'oxydation, la solution d'anticorps anti-CD20 formulée avec de la glycine en tant qu'agent d'osmolalité subit moins de dégradation après 24 heures à 37°C.
Exemple 4 : Microcalorimétrie
Matériels et méthodes Les essais de microcalorimétrie ont été réalisés sur l'appareil Microcal VP-DSC. L'analyse consiste à mesurer le flux de chaleur dégagée au cours d'un balayage contrôlé en température dans l'échantillon contenant la protéine comparativement à son tampon de formulation. Ce flux de chaleur traduit les changements d'états de la protéine et renseigne donc sur sa dénaturation. Les différences de profils des thermogrammes nous renseignent sur la stabilité thermique relative de la protéine dans différents environnements de formulation. Résultats
Les thermogrammes d'anticorps anti-CD20 des solutions F2 et F3, présentés en Figure 2, montrent les mêmes transitions indiquant que la dénaturation de la protéine se déroule suivant le même mécanisme découplé en 4 transitions. L'enthalpie totale nécessaire pour dénaturer complètement la protéine est équivalente pour ces deux formulations (952 Kcal/mol pour F2 vs 950 Kcal/mol pour F3). Le profil du thermogramme d'anticorps anti-CD20 en formulation citrate/NaCl est sensiblement différent avec l'apparition d'une transition supplémentaire, une diminution de la température de début de dénaturation et une diminution de l'enthalpie totale de dénaturation (866 Kcal/mol). Ces éléments signifient que l'anticorps anti-CD20 en milieu citrate/NaCl est moins stable thermiquement dans cette formulation.
Exemple 5 : Stabilité des compositions
Pour étudier la stabilité d'une formulation d'anticorps anti-CD20 selon l'invention à une concentration de 10 mg/ml, des lots ont été placés, à l'abri de la lumière, dans des enceintes à température contrôlée à + 5°C ± 3°C et à + 25°C ± 2°C pour une durée de 24 mois (tableau 5). Tableau 5 : Formulations mises en stabilité
Figure imgf000017_0001
Les paramètres suivants sont évalués: l'aspect visuel, la pureté, la distribution de taille moléculaire (monomères, polymères, dimères et fragments), le profil d'isoformes, le pH, l'étude de l'absorption éventuelle du Polysorbate 80 sur le bouchon, l'étude de la migration éventuelle de l'aluminium à partir du conditionnement primaire, les chaînes Kappa « libres » et la concentration en protéines totales. L'activité fonctionnelle de l'anticorps est évaluée au cours du temps. L'activité fonctionnelle est déterminée par des méthodes classiques connues de l'homme du métier, par exemple en mesurant l'ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), la liaison au récepteur CD 16.
Les résultats montrent que les lots d'anticorps anti-CD20 à 10 mg/ml sont stables 24 mois à + 5°C ± 3°C. Les lots formulés en glycine (lots 2 et 3) sont, de plus, stables 6 mois à + 25 °C ± 2°C.
Exemple 6 : Analyses comparatives
Des comparaisons de stabilité ont été réalisées entre les formulations suivantes (contenant 10mg/ml d'anticorps anti-CD20 R603) :
Tableau 6 : Formulations comparées, mises en stabilité
Figure imgf000018_0001
Les lots ont été placés, à l'abri de la lumière, dans des enceintes thermostatées à 5°C, 25°C ou 40°C.
Les mêmes paramètres que ceux indiqués à l'exemple 5 ont évalués.
Plusieurs paramètres ont montré une nette amélioration avec l'ajout de l'agent d'osmolalité non-ionique (la glycine). Cette amélioration est particulièrement marquante en terme d'agrégation, notamment révélée par une mesure de turbidité (Figure 3), de pourcentage de chaînes Kappa « libres » (Figure 4), et de taux de fragmentation (Figure 5). Dans l'ensemble ces données montrent que l'agent d'osmolalité non-ionique (la glycine) a un effet stabilisant par rapport à la formulation de type Rituxan® permettant un stockage à 25°C plus long et autorise la diminution en titre de surfactant Tween 80.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition liquide pharmaceutique comprenant :
a. un anticorps anti-CD20 ;
b. un détergent ;
c. un tampon ;
d. un agent d'osmolalité non-ionique ;
et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas de chlorure de sodium.
3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, dans laquelle le détergent est du polysorbate, de préférence du polysorbate 80.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'agent d'osmolalité non-ionique est du mannitol ou de la glycine.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le tampon est un tampon citrate ou phosphate.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 1 et 100 mM de citrate trisodique ou de phosphate de sodium.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 8 et 12 g/L d'anticorps anti-CD20.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 100 et 1000 ppm de polysorbate comme détergent.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 25 et 500 mM de mannitol ou de glycine comme agent d'osmolalité non-ionique.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant :
a. lOg/L d'anticorps anti-CD20 ;
b. 700 ppm de polysorbate 80 ;
c. 25 mM de citrate trisodique ;
d. 300 mM de mannitol ;
et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant :
a. lOg/L d'anticorps anti-CD20 ;
b. 700 ppm de polysorbate 80 ;
c. 25 mM de citrate trisodique ;
d. 240 ou 300 mM de glycine ;
et possédant un pH compris entre 5,0 et 7,0.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le pH est d'environ 6,5.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle l'anticorps anti-CD20 est un anticorps monoclonal produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du
Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15).
14. Composition pharmaceutique solide susceptible d'être obtenue par dessication d'une composition liquide selon l'une des revendications 1 à 13.
PCT/FR2011/051741 2010-07-20 2011-07-19 Formulation d'anticorps anti-cd20 Ceased WO2012010799A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1055909 2010-07-20
FR1055909A FR2962908A1 (fr) 2010-07-20 2010-07-20 Formulation d'anticorps anti-cd20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012010799A1 true WO2012010799A1 (fr) 2012-01-26

Family

ID=43530305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2011/051741 Ceased WO2012010799A1 (fr) 2010-07-20 2011-07-19 Formulation d'anticorps anti-cd20

Country Status (3)

Country Link
AR (1) AR082283A1 (fr)
FR (1) FR2962908A1 (fr)
WO (1) WO2012010799A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11633476B2 (en) 2017-05-02 2023-04-25 Merck Sharp & Dohme Llc Stable formulations of programmed death receptor 1 (PD-1) antibodies and methods of use thereof
US12319735B2 (en) 2018-11-07 2025-06-03 Merck Sharp & Dohme Llc Co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017085A1 (fr) 1993-12-20 1995-06-29 Genzyme Transgenics Corporation Production transgenique d'anticorps dans le lait
WO1998056418A1 (fr) 1997-06-13 1998-12-17 Genentech, Inc. Formulation stabilisee renfermant un anticorps
WO2005044859A2 (fr) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Molecules fixatrices d'antigenes presentant une affinite de fixation du recepteur de fc et une fonction effectrice accrues
FR2879204A1 (fr) * 2004-12-15 2006-06-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
WO2006068867A1 (fr) * 2004-12-22 2006-06-29 Genentech, Inc. Polytherapie contre les troubles des lymphocytes b
WO2006076651A2 (fr) * 2005-01-13 2006-07-20 Genentech, Inc. Procede de traitement
WO2007048077A2 (fr) 2005-10-21 2007-04-26 Gtc Biotherapeutics, Inc. Anticorps ayant une meilleure activite cytotoxique cellulaire dependant des anticorps et leurs procedes de production et leur utilisation
WO2009009406A1 (fr) * 2007-07-06 2009-01-15 Smithkline Beecham Corporation Formulations d'anticorps
WO2009080541A1 (fr) 2007-12-21 2009-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Formulation d'anticorps

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995017085A1 (fr) 1993-12-20 1995-06-29 Genzyme Transgenics Corporation Production transgenique d'anticorps dans le lait
WO1998056418A1 (fr) 1997-06-13 1998-12-17 Genentech, Inc. Formulation stabilisee renfermant un anticorps
WO2005044859A2 (fr) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Molecules fixatrices d'antigenes presentant une affinite de fixation du recepteur de fc et une fonction effectrice accrues
FR2879204A1 (fr) * 2004-12-15 2006-06-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
WO2006064121A2 (fr) 2004-12-15 2006-06-22 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoïetiques lymphoïdes de type b
WO2006068867A1 (fr) * 2004-12-22 2006-06-29 Genentech, Inc. Polytherapie contre les troubles des lymphocytes b
WO2006076651A2 (fr) * 2005-01-13 2006-07-20 Genentech, Inc. Procede de traitement
WO2007048077A2 (fr) 2005-10-21 2007-04-26 Gtc Biotherapeutics, Inc. Anticorps ayant une meilleure activite cytotoxique cellulaire dependant des anticorps et leurs procedes de production et leur utilisation
WO2009009406A1 (fr) * 2007-07-06 2009-01-15 Smithkline Beecham Corporation Formulations d'anticorps
WO2009080541A1 (fr) 2007-12-21 2009-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Formulation d'anticorps

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Peptide and Protein Drug Delivery", vol. 247-301, 1991, MARCEL DEKKER, INC.
ANONYMOUS: "Rituxan (Rituximab)", 1 October 2003 (2003-10-01), pages 1 - 2, XP002622308, Retrieved from the Internet <URL:http://patient.cancerconsultants.com/druginserts/Rituximab.pdf> [retrieved on 20110214] *
DAUGHERTY A L ET AL: "Formulation and delivery issues for monoclonal antibody therapeutics", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, ELSEVIER BV, AMSTERDAM, NL, vol. 58, no. 5-6, 7 August 2006 (2006-08-07), pages 686 - 706, XP024892149, ISSN: 0169-409X, [retrieved on 20060807], DOI: DOI:10.1016/J.ADDR.2006.03.011 *
JONES, A, ADV. DRUG DELIVERY REV., vol. 10, 1993, pages 29 - 90
SHIRE ST., GOMBOTZ W., BECHTOLD-PETERS K.: "Current trends in monoclonal antibody development and manufacturing", 1 January 2009, SPRINGER, ISBN: 9780387766423, XP002622309 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11633476B2 (en) 2017-05-02 2023-04-25 Merck Sharp & Dohme Llc Stable formulations of programmed death receptor 1 (PD-1) antibodies and methods of use thereof
US12319735B2 (en) 2018-11-07 2025-06-03 Merck Sharp & Dohme Llc Co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
AR082283A1 (es) 2012-11-28
FR2962908A1 (fr) 2012-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2170388T3 (en) Anti-CD20 antibody formulations
US10308721B2 (en) Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
BE1004226A5 (fr) Immunoglobuline purifiee.
WO2021142002A1 (fr) Anticorps anti-ccr8 et leurs utilisations
TW201402144A (zh) 抗體調配物
US20040156835A1 (en) Protein preparation
CN113423426A (zh) 使用抗FcRn抗体治疗格雷夫斯眼病的方法
TWI825297B (zh) 抗Her2 抗體藥物偶聯物藥物製劑
JP2024544523A (ja) 二重特異性ｂｃｍａ／ｃｄ３抗体を含む安定な製剤
JP7671697B2 (ja) 安定な低粘度抗体製剤およびその使用
FR2939667A1 (fr) Composition d&#39;immunoglobine g comme medicament pour le traitement de l&#39;ictere neonatal par incompatibilite foetomaternelle dans le systeme abo
WO2012010799A1 (fr) Formulation d&#39;anticorps anti-cd20
CA2753700C (fr) Anticorps monoclonal anti-rhesus d
JP2022529502A (ja) 抗ｃｄ３８抗体および製剤
JP2023531315A (ja) 第ｘｉｉ因子抗原結合タンパク質の高濃度製剤
TWI874962B (zh) 莫蘇妥珠單抗之醫藥組成物及其使用方法
FR2775691A1 (fr) Anticorps monoclonaux specifiques de la proteine esm-1, et utilisation de ces anticorps pour la detection de la proteine esm-1
Prandota Idiopathic intracranial hypertension may be caused by reactivation of latent cerebral toxoplasmosis. Effect of various diseases and clinical states
EP3555136A1 (fr) Combinaison d&#39;anticorps anti-cd303 et anti-amhrii
FR3020947A1 (fr) Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations
TW202448927A (zh) 包含雙特異性gprc5d/cd3抗體之組成物
WO2024231860A1 (fr) Compositions pharmaceutiques comprenant un anticorps bcma/cd3 bispécifique à concentration élevée
WO2021074376A1 (fr) Nouveaux anticorps monoclonaux therapeutiques humains et leurs utilisations
EP3802589A1 (fr) Composition d&#39;immunoglobulines humaines concentrées
CN114652824A (zh) 抗egfr和pd-1双特异性抗体制剂与保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11754448

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11754448

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1