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WO2012080987A1 - Nanoparticules comportant au moins un actif et au moins deux polyelectrolytes - Google Patents

Nanoparticules comportant au moins un actif et au moins deux polyelectrolytes Download PDF

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Publication number
WO2012080987A1
WO2012080987A1 PCT/IB2011/055728 IB2011055728W WO2012080987A1 WO 2012080987 A1 WO2012080987 A1 WO 2012080987A1 IB 2011055728 W IB2011055728 W IB 2011055728W WO 2012080987 A1 WO2012080987 A1 WO 2012080987A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polyelectrolyte
group
anionic
polyelectrolytes
cationic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/IB2011/055728
Other languages
English (en)
Inventor
Cécile Bonnet-Gonnet
Rémi Meyrueix
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flamel Technologies SA
Original Assignee
Flamel Technologies SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flamel Technologies SA filed Critical Flamel Technologies SA
Priority to CA2821141A priority Critical patent/CA2821141A1/fr
Priority to CN2011800678423A priority patent/CN103370052A/zh
Priority to US13/328,696 priority patent/US20120156256A1/en
Priority to EP11807787.4A priority patent/EP2651394A1/fr
Priority to JP2013543958A priority patent/JP2014515003A/ja
Publication of WO2012080987A1 publication Critical patent/WO2012080987A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
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    • A61K9/5192—Processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the invention relates to novel nanoparticles formed from at least two specific polyelectrolytes of opposite polarity and at least one active, and formulations comprising such nanoparticles.
  • the active formulations must meet a number of tolerance criteria, be sufficiently concentrated in active ingredients, while having a low viscosity to allow easy injection through a small diameter needle, for example a 27 gauge needle. at 31 G.
  • microparticles capable of releasing the active ingredient over a prolonged period, are more particularly formed from mixing, under specific conditions, two polyelectrolyte polymers (PE1) and (PE2) of opposite polarity, at least one being carrier of hydrophobic groups. This mixture leads to microparticles of size between 1 and 100 ⁇ .
  • microparticle formulations are unsuitable for intravenous administration and may, in the context of subcutaneous administration, cause problems of intolerance.
  • the subcutaneous administration of active ingredients requires that the volume of the injected dose be limited, for example less than or equal to 1 mL, and therefore, that the asset formulation is sufficiently concentrated.
  • This constraint is particularly limiting for peptides or certain small molecules whose therapeutic doses are generally high.
  • the present invention aims precisely to provide new nanoparticles, and new compositions containing the latter, to meet all of the above requirements.
  • the present invention relates, according to a first aspect, to nanoparticles formed of at least one active agent and at least two polyelectrolytes of opposite polarity having a linear polyamino acid backbone and having a degree of polymerization of less than or equal to 2,000. characterized in that: at least one of the two polyelectrolytes carries hydrophobic side groups;
  • At least one of the two polyelectrolytes carries polyalkylene glycol side groups
  • said nanoparticles having a mean diameter ranging from 10 to 100 nm, and comprising an amount of polyalkylene glycol groups such that the weight ratio of the polyalkylene glycol WPAG to the total polymer is greater than or equal to 0.05, in particular is between 0 , 05 and 0.75, in particular between 0.05 and 0.6, in particular between 0.05 and 0.5 and preferably between 0.05 and 0.3.
  • the weight ratio WPAG of polyalkylene glycol relative to the total polymer ranges from 0.1 to 0.75, in particular from 0.15 to 0.6, in particular from 0.15 to 0.5 and preferably from 0 to , 15 to 0.3.
  • the polyelectrolytes considered according to the invention are biocompatible. They are perfectly tolerated and degrade rapidly, that is to say on a time scale of a few days to a few weeks.
  • the invention relates to a composition, in particular a pharmaceutical composition, comprising at least nanoparticles as defined above.
  • the nanoparticles according to the invention are particularly advantageous for transporting proteinaceous, peptide, and / or solubilizing active agents of low molecular weight.
  • nanoparticles according to the invention are advantageously capable of releasing the asset over an extended period of time.
  • the nanoscale size of the particles of the invention is furthermore particularly well suited for administering the active or intravenous formulation of the active ingredients.
  • the present invention thus proves particularly advantageous with regard to the parenteral administration of active agents used for the treatment of cancers.
  • nanoparticles associating two polyelectrolytes answering the aforementioned specificities of the present invention have, to the knowledge of the inventors, never been proposed.
  • the present invention relates to a method for preparing nanoparticles having a mean diameter ranging from 10 to 100 nm, characterized in that it comprises at least the steps consisting of: (1) having an aqueous solution comprising nanoparticles of a first polyelectrolyte in the charged state, bearing hydrophobic side groups, said nanoparticles being non-covalently associated with an active agent;
  • the amount of said polyalkylene glycol moieties being such that the weight ratio of the polyalkylene glycol WPAG to the total polymer is greater than or equal to 0.05
  • said first and second polyelectrolytes having a linear polyamino acid backbone and having a degree of polymerization of less than or equal to 2,000.
  • the aqueous solution (1) is obtained by adding the active agent to an aqueous colloidal solution of the first polyelectrolyte, said active associating non-covalently with the nanoparticles of said first polyelectrolyte.
  • the active nanoparticle formulations according to the invention are also particularly advantageous in several ways.
  • a suspension of nanoparticles according to the invention advantageously has excellent stability.
  • the mixture may further be carried out at high concentrations without impairing the physicochemical properties of the suspension, particularly in terms of viscosity, particle size, colloidal or chemical stability. It is thus possible according to the invention to access a stable suspension of nanoparticles, fluid and sufficiently concentrated.
  • the suspension obtained according to the invention does not require the implementation of a subsequent concentration step.
  • the present invention therefore makes it possible to formulate a fluid suspension, "ready for use", in particular for intravenous administration. In other words, it can be administered in the patient as obtained at the end of the above process.
  • a suspension of nanoparticles according to the invention is readily amenable to lyophilization and reconstitution in aqueous phase, without affecting the properties obtained.
  • suspension of nanoparticles according to the invention can be formed extemporaneously at the time of administration by simple mixing of two suspensions liquids prepared as described above.
  • these suspensions of nanoparticles can easily be stored, allowing to consider a production cost limited to the industrial scale.
  • the active ingredient is used in an aqueous process that does not require excessive temperature, high shear, surfactant or organic solvent, which advantageously makes it possible to avoid any potential degradation of the active ingredient.
  • certain active agents such as peptides and proteins, which can potentially be degraded when they are subjected to the aforementioned conditions.
  • the asset can be a molecule of therapeutic, cosmetic, prophylactic or imaging interest.
  • polyalkylene glycol chains preferably polyethylene glycol (PEG)
  • PEG polyethylene glycol
  • the active agent is chosen from the erythropoietin subgroup, the hemoglobin refinery, their analogues or their derivatives; Pocytocin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, growth factors, blood factors, hemoglobin, cytochromes, prolactin albumin, luliberin (luteinizing hormone releasing hormone or LHRH) or its analogues, such as leuprolide, goserelin, triptorelin, buserelin, nafarelin; LHRH antagonists, LHRH competitors, human growth hormones (GH), porcine or bovine hormones, growth hormone releasing hormone, insulin, somatostatin, glucagon, interleukins or their mixtures, interferons, such as interferon alpha, alpha-2b, beta, beta, or gamma; gastrin, tetragastrin, pentagastrin, urogastrone, secretin, calcitonin, en
  • active ingredients are polysaccharides (for example, heparin) and oligo- or polynucleotides, DNA, RNA, iRNA, antibiotics and living cells, risperidone, zuclopenthixol, fluphenazine, perphenazine, flupentixol, haloperidol, fluspirilene, quetiapine, clozapine, amisulpride, sulpiride, ziprasidone, etc.
  • polysaccharides for example, heparin
  • oligo- or polynucleotides DNA, RNA, iRNA, antibiotics and living cells, risperidone, zuclopenthixol, fluphenazine, perphenazine, flupentixol, haloperidol, fluspirilene, quetiapine, clozapine, amisulpride, sulpiride, ziprasidone, etc.
  • the active ingredient is selected from growth hormone, insulin, calcitonin, fulvestrant and cytokines.
  • the nanoparticles according to the invention comprise at least two polyelectrolytes of opposite polarity.
  • the nanoparticles according to the invention comprise at least one anionic polyelectrolyte and at least one cationic polyelectrolyte.
  • polyelectrolyte in the sense of the present invention, a polymer bearing groups capable of ionizing in water, in particular at pH ranging from 5 to 8, which creates a charge on the polymer.
  • a polyelectrolyte dissociates, showing charges on its skeleton and counter-ions in solution.
  • the carboxylic acid and amine functions of the polyelectrolyte are respectively in the forms -COOH or -COO " and NH 2 or NH 3 + as a function of the pH of the solution, the neutrality being ensured by the counter-cations. and counter-anions present in solution.
  • the compound is likely to be present in a salified form.
  • the choice of salts is within the skill of the skilled person.
  • countercations can in particular, be monovalent metal cations, preferably sodium or potassium ions.
  • the counteranions may in particular be chloride, acetate or ammonium ions.
  • the polyelectrolytes according to the invention may comprise a set of identical or different electrolyte groups.
  • the polyelectrolytes are described throughout the remainder of the description, as they occur at the mixing pH value of the anionic and cationic polyelectrolytes leading to the formation of the nanoparticles according to the invention.
  • the qualification of a "cationic” or “anionic” group is for example considered with regard to the charge borne by this group to this value of the mixing pH of the anionic and cationic polyelectrolytes.
  • the polarity of a polyelectrolyte is defined with respect to the overall load carried by this polyelectrolyte to this pH value.
  • the value of the mixing pH of the anionic and cationic polyelectrolytes leading to the formation of the nanoparticles according to the invention ranges from 5 to 8, preferably from 6 to 7.5.
  • anionic polyelectrolyte means a polyelectrolyte having a negative overall charge at the pH value of the mixture of the two polyelectrolytes.
  • cationic polyelectrolyte means a polyelectrolyte having a positive overall charge at the pH value of the mixture of the two polyelectrolytes.
  • the polyelectrolytes considered according to the invention have a linear polyamino acid backbone, that is to say comprising amino acid residues.
  • the polyelectrolytes according to the invention are biodegradable.
  • polyamino acid covers both natural polyamino acids and synthetic polyamino acids.
  • the polyamino acids are linear polymers, advantageously composed of alpha-amino acids bound by peptide bonds.
  • the polyamino acid chain consists of a homopolymer of alpha-L-glutamate or alpha-L-glutamic acid.
  • the polyamino acid chain consists of a homopolymer of alpha-L-aspartate or of alpha-L-aspartic acid.
  • the polyamino acid chain consists of a copolymer of alpha-L-aspartate / alpha-L-glutamate, alpha-L-aspartic acid / alpha-L-glutamic acid, alpha / beta -L-aspartate or alpha / beta-L-aspartic acid.
  • the polyamino acid chain consists of a homopolymer of poly-L-lysine.
  • polyamino acids are described in particular in WO 03/104303, WO 2006/079614 and WO 2008/135563, the contents of which are incorporated by reference. These polyamino acids may also be of the type described in patent application WO 00/30618.
  • polymers that can be used according to the invention, for example, of poly (alpha-L-glutamic acid), poly (alpha-D-glutamic acid), poly (alpha-D, L-glutamate), poly (acid) gamma-L-glutamic) and poly (L-lysine) of variable masses are commercially available.
  • the poly (L-glutamic acid) can be further synthesized according to the route described in the patent application FR 2801226.
  • the anionic polyelectrolyte considered according to the invention has the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • R a represents a hydrogen atom, a C 2 to C 10 linear acyl group, a branched C 3 to C 10 acyl group, a pyroglutamate group or a hydrophobic group G as defined below;
  • R b represents a group -NHR 5 or a terminal amino acid residue linked by nitrogen and whose carboxyl is optionally substituted by an alkylamino radical -NHR 5 or an alkoxy -OR 6 , wherein:
  • R 5 represents a hydrogen atom, a linear C 1 to C 6 alkyl group
  • R 6 represents a hydrogen atom, a linear C 1 -C 10 alkyl group, a branched C 3 -C 10 alkyl group, a benzyl group or a G group;
  • G represents a hydrophobic group chosen from: octyloxy-, dodecyloxy-, tetradecyloxy-, hexadecyloxy-, octadecyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocopheryl- and cholesteryl-, preferably alpha-tocopheryl-;
  • PAG represents a polyalkylene glycol, preferably having a molar mass ranging from 1.800 to 6.000 g / mol, in particular a polyethylene glycol, in particular with a molar mass ranging from 2,000 to 6,000 g / mol, • Si corresponds to the average number of ungrafted, anionic glutamate monomers at neutral pH,
  • Qi corresponds to the average number of glutamate monomers carrying a polyalkylene glycol group
  • the degree of polymerization DPi (if + pi + qi) is less than or equal to 2,000, in particular less than 700, more particularly from 40 to 450, in particular from 40 to 250, and in particular from 40 to 150,
  • the linking of the monomers of said general formula (I) can be random, of monoblock or multiblock type.
  • the anionic polyelectrolyte considered according to the invention has the following formula ( ⁇ ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • Pi (Pi '+ Pi ") corresponds to the average number of aspartate monomers carrying a hydrophobic group G' and can be optionally zero,
  • sequence of the monomers of said general formula ( ⁇ ) can be random, monoblock or multiblock type.
  • the cationic polyelectrolyte according to the invention has the following formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • R a represents a hydrogen atom, a linear acyl group C2-C1 0, an acyl group branched C3 to C1 0 a pyroglutamate group or a hydrophobic group G as defined below;
  • R represents a group -NHR 5 or a terminal amino acid residue bonded by nitrogen and whose carboxyl is optionally substituted with an alkylamino radical -NHR 5 or an alkoxy -OR 6 , in which:
  • R 5 represents a hydrogen atom, a linear C 1 -C 10 alkyl group, a branched C 3 -C 10 alkyl group, or a benzyl group;
  • R 6 represents a hydrogen atom or a linear C 1 to C 6 alkyl group
  • G represents a hydrophobic group chosen from: octyloxy-, dodecyloxy-, tetradecyloxy-, hexadecyloxy-, octadecyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocopheryl- and cholesteryl-, preferably alpha-tocopheryl-;
  • PAG represents a polyalkylene glycol, preferably having a molar mass ranging from 1.800 to 6.000 g / mol, in particular a polyethylene glycol, in particular with a molar mass ranging from 2,000 to 6,000 g / mol,
  • R 2 represents a cationic group, in particular argininamide linked by the amine function
  • R 3 represents a neutral group chosen from: hydroxyethylamino-, dihydroxypropylamino-linked by the amine function;
  • S2 is the average number of ungrafted, anionic glutamate monomers at neutral pH
  • P2 is the average number of glutamate monomers carrying a hydrophobic group G
  • Q2 corresponds to the average number of glutamate monomers carrying a polyalkylene glycol group
  • R 2 corresponds to the average number of monomers of glutamate carrying a cationic group R 2 ,
  • T 2 corresponds to the average number of monomers of glutamate carrying a neutral group R 3 ,
  • the degree of polymerization DP 2 (s 2 + p 2 + q 2 + r 2 + t 2 ) is less than or equal to 2,000, in particular less than 700, more particularly ranges from 40 to 450, in particular from 40 to 250, and in particular from 40 to 150; the linking of the monomers of said general formula (II) may be random, of monoblock or multiblock type.
  • the cationic polyelectrolyte corresponding to formula (II) is such that the overall charge of the polyelectrolyte (r 2 -s 2 ) is positive.
  • the cationic polyelectrolyte considered according to the invention has the following formula ( ⁇ ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • X " represents a counteranion, in particular a chloride, acetate or ammonium ion,
  • PAG represents a polyalkylene glycol, preferably having a molar mass ranging from 1.800 to 6.000 g / mol, in particular a polyethylene glycol, in particular with a molar mass ranging from 2,000 to 6,000 g / mol,
  • Q 2 corresponds to the average number of lysine monomers carrying a polyalkylene glycol group
  • R 2 corresponds to the average number of ungrafted lysine monomers, cationic at neutral pH, q 2 possibly being zero, and
  • the degree of polymerization DP 2 (q 2 + r 2 ) is less than or equal to 2,000, in particular less than 700, more particularly ranges from 40 to 450, in particular from 40 to 250, and in particular from 40 to 150;
  • the sequence of the monomers of said general formula ( ⁇ ) can be random, monoblock or multiblock type.
  • the average molar mass of the polymers is measured by means of a static light diffusion detector coupled to a size exclusion chromatography equipment.
  • the average molar mass retained is the molar mass at the peak (Mp).
  • the grafted poly (glutamic acid) sample in aqueous solution, is precipitated by addition of 0.1 N hydrochloric acid, lyophilized and then dissolved in N-methylpyrrolidone (NMP) and analyzed.
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • the average peak molar mass is measured by means of an 18-angle static light scattering detector (MALLS) coupled to steric exclusion chromatography equipment in N-methylpyrrolidone having 3 sequential polystyrene-co-chromatographic columns.
  • MALLS 18-angle static light scattering detector
  • the mole fractions x; corresponding to each of the monomer units (grafted or not) AAj constituting the polyelectrolyte are measured by proton NMR in a suitable solvent. Those skilled in the art are able to choose the solvent suitable for the polyelectrolyte to be analyzed and to define the analysis conditions.
  • the polymer sample is freeze-dried, dissolved in deuterated trifluoroacetic acid and then analyzed by means of a 300 MHz NMR spectrometer equipped with a probe to proton ! H.
  • x p is the molar fraction of grafted monomer units with hydrophobic groups which is the average molar grafting rate of the hydrophobic group
  • XPAG the mole fraction of grafted monomeric units by polyalkylene glycol
  • x is the mole fraction of monomer units anionic
  • x c the mole fraction of cationic monomeric units.
  • This average molar mass of a pattern is the average of the molar masses of the units comprising the polyelectrolyte, each being weighted by the molar fraction of this unit.
  • anionic polyelectrolyte and said cationic polyelectrolyte of the nanoparticles according to the invention are such that:
  • At least one of the two polyelectrolytes carries hydrophobic side groups G or G ';
  • At least one of the two polyelectrolytes carries polyalkylene glycol side groups PAG, in particular polyethylene glycol PEG,
  • the quantity of said polyalkylene glycol groups carried by the anionic and / or cationic polyelectrolyte being such that the mass ratio WPAG of polyalkylene glycol relative to the total polymer is greater than or equal to 0.05, in particular is between 0.05 and 0, 75, in particular between 0.05 and 0.6, in particular between 0.05 and 0.5 and preferably between 0.05 and 0.3.
  • WPAG is between 0.1 and 0.75, preferably between 0.15 and 0.6, preferably between 0.15 and 0.5, preferably between 0.15 and 0.35.
  • the weight ratio WPAG after mixing of the anionic and cationic polyelectrolytes can be calculated by the following formula:
  • pAGi and XPAG2 represent the molar fractions of the monomers bearing polyalkylene glycol groups carried respectively by the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte,
  • MpAGi and MPAG2 represent the molar masses of the polyalkylene glycol grafts carried respectively by the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte,
  • - mi and m 2 respectively represent the mass quantities of the solutions before mixing the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte of respective mass concentrations of polymer (before mixing) Ci and C2;
  • - DPi and DP2 respectively represent the degrees of polymerization of the anionic polyelectrolyte and cationic polyelectrolyte
  • - Mi and M2 respectively represent the molar masses of the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • the degree of polymerization of the anionic and cationic polyelectrolytes is between 40 and 250, preferably between 40 and 110;
  • One of the two polyelectrolytes carries polyalkylene glycol side groups, in particular polyethylene glycol groups of molar mass of between 2,000 and 6,000 g / mol, statistically distributed;
  • ⁇ t 2 is zero, that is to say that the cationic polyelectrolyte is devoid of neutral groups; ⁇ the molar ratio Z of the number of cationic groups to the number of anionic groups in the mixture of the two polyelectrolytes is between 0.1 and 2.2, preferably between 0.1 and 2, preferably between 0.4 and 1.5.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • the degree of polymerization of the anionic and cationic polyelectrolytes is between 40 and 250, preferably between 40 and 110;
  • polyalkylene glycol particularly polyethylene glycol moieties with a molar mass between 2,000 and 6,000 g / mol, distributed randomly;
  • ⁇ t 2 is zero, that is to say that the cationic polyelectrolyte is devoid of neutral groups
  • ⁇ the molar ratio Z of the number of cationic groups to the number of anionic groups in the mixture of the two polyelectrolytes is between 0.1 and 2.2, preferably between 0.1 and 2, preferably between 0.4 and 1.5.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • the degree of polymerization of the anionic and cationic polyelectrolytes is between 40 and 250, preferably between 40 and 110;
  • ⁇ the anionic and cationic polyelectrolytes both bear side groups polyalkylene glycol, particularly polyethylene glycol moieties with a molar mass of between 2000-6000 g / mol, distributed randomly; ⁇ t 2 is zero, that is to say that the cationic polyelectrolyte is devoid of neutral groups;
  • ⁇ the molar ratio Z of the number of cationic groups to the number of anionic groups in the mixture of the two polyelectrolytes is between 0.1 and 2.2, preferably between 0.1 and 2, preferably between 0.4 and 1.5.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • ⁇ the mole fraction pi of anionic polyelectrolyte in the hydrophobic groups is from 2 to 22%, particularly 4 to 12%;
  • ⁇ the mole fraction of the cationic polyelectrolyte PAG 2 in polyalkylene glycol groups ranges from 2 to 10%, in particular 2 to 6%.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • ⁇ the XPI mole fraction ranges from 2 to 22%, particularly 4 to 12%;
  • the XPAGI molar fraction varies from 2 to 10%, in particular from 2 to 6%;
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • ⁇ the XPI mole fraction ranges from 2 to 22%, particularly 4 to 12%;
  • ⁇ XPAGI the mole fraction ranges from 2 to 10%, in particular 2 to 6%; ⁇ the xp2 mole fraction ranging from 5 to 20%, in particular 5 to 10%; and
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • ⁇ the XPI mole fraction ranges from 2 to 22%, particularly 4 to 12%;
  • ⁇ the xp2 mole fraction ranging from 5 to 20%, in particular 5 to 10%
  • the mole fraction ranges from 2 to 10%, in particular 2 to 6%.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes are such that:
  • ⁇ the XPI mole fraction ranges from 2 to 22%, particularly 4 to 12%;
  • the mole fraction ranges from 2 to 10%, in particular 2 to 6%;
  • the mole fraction xp2 varies from 5 to 20%, in particular from 5 to 10%, and
  • the mole fraction ranges from 2 to 10%, in particular 2 to 6%.
  • the nanoparticles formed according to the invention have a mean diameter ranging from 10 to 100 nm.
  • the size of the nanoparticles can vary from 10 to 70 nm, in particular from 10 to 50 nm.
  • the size of the nanoparticles can be measured by quasi-elastic light scattering.
  • the size of the particles is characterized by the volume average hydrodynamic diameter, obtained according to measurement methods well known to those skilled in the art, for example using a device of the ALV CGS-3 type.
  • the measurements are carried out with polymer solutions prepared at concentrations of 1 mg / g in 0.15 M NaCl medium and left behind. with stirring for 24 h. These solutions are then filtered on 0.8-0.2 ⁇ , before analyzing them in dynamic light scattering.
  • the diffusion angle is 140.degree.
  • signal acquisition time is 10 minutes. The measurement is repeated 3 times on two solution samples. The result is the average of the 6 measurements.
  • the nanoparticles according to the invention can be obtained by mixing a solution of a first polyelectrolyte with a solution of a second polyelectrolyte of opposite polarity, said first and second polyelectrolytes being such that the weight ratio WPAG of polyalkylene glycol with respect to total polymer is greater than or equal to 0.05.
  • nanoparticles according to the invention may in particular be prepared according to the process comprising at least the steps consisting of:
  • aqueous solution comprising nanoparticles of a first polyelectrolyte in the charged state, bearing hydrophobic side groups, said nanoparticles being non-covalently associated with an active agent
  • the amount of said polyalkylene glycol moieties being such that the weight ratio of the polyalkylene glycol to the total polymer is greater than or equal to 0.05, in particular is between 0.05 and 0.75, in particular between 0.05 and 0.6, in particular between 0.05 and 0.5 and preferably between 0.05 and 0.3;
  • WPAG is between 0.1 and 0.75, preferably between 0.15 and 0.6, preferably between 0.15 and 0.5, preferably between 0.15 and 0.15. and 0.3.
  • said first and second polyelectrolytes are as defined above.
  • the aqueous solution (1) is obtained by adding the active agent to an aqueous colloidal solution of the first polyelectrolyte, said active associating non-covalently with the nanoparticles of said first polyelectrolyte.
  • the aqueous solution (1) has a pH value ranging from 5 to 8, and more particularly about 7.
  • step (2) comprises at least:
  • the first polyelectrolyte is carrying hydrophobic side groups, and able to form spontaneously, when it is dispersed in an aqueous medium of pH ranging from 5 to 8, in particular water, nanoparticles. .
  • Each nanoparticle is thus constituted by one or more chains of polyelectrolytes more or less condensed around these hydrophobic domains.
  • the nanoparticles formed by the first polyelectrolyte, bearing hydrophobic side groups have a mean diameter ranging from 10 to 100 nm, in particular from 10 to 70 nm, and more particularly ranging from 10 to 50 nm.
  • association or “associate” used to describe the relationships between one or more active ingredients and the polyelectrolyte (s), mean that the active (s) are associated with the (x) polyelectrolyte (s) through physical interactions non-covalent, in particular hydrophobic interactions, and / or electrostatic interactions and / or hydrogen bonds and / or via steric encapsulation by polyelectrolytes.
  • the second polyelectrolyte also carries hydrophobic groups and is capable of forming, when it is dispersed in an aqueous medium with a pH ranging from 5 to 8, in particular water, nanoparticles.
  • the molar ratio, denoted by Z, of the number of cationic groups relative to the number of anionic groups in the mixture of the two polyelectrolytes according to the invention is preferably between 0.1 and 2.2, preferably between 0.1 and 2. more particularly between 0.4 and 1.5.
  • the Z ratio reflects the overall load of the nanoparticles and can, in particular, be close to zero, which may be particularly interesting in some applications.
  • the molar ratio Z is between 0.9 and 1.1, illustrating nanoparticles close to neutrality.
  • the molar ratio Z may be defined with regard to the quantities and the nature of the polyelectrolytes introduced during the preparation of the nanoparticles according to the invention, by the following formula:
  • nii and m 2 respectively represent the mass quantities of the solutions before mixing the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte with respective mass concentrations of polymer (before mixing) Ci and C2;
  • DPi and DP 2 respectively represent the degrees of polymerization of the anionic polyelectrolyte and of the cationic polyelectrolyte;
  • - Mi and M2 respectively represent the molar masses of the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte
  • - x C 2 represents the molar fraction of monomers carrying cationic groups in the cationic polyelectrolyte; - x a i and x a 2 respectively represent the molar fractions in monomers bearing anionic groups of the anionic polyelectrolyte and the cationic polyelectrolyte.
  • the nanoparticles can be anionic, cationic or neutral.
  • anionic nanoparticles means nanoparticles whose overall charge at neutral pH is negative; and "cationic nanoparticles", nanoparticles whose overall charge at neutral pH is positive.
  • the nanoparticles according to the invention advantageously have a low overall electrical charge, which generally makes it possible to improve the circulation time after intravenous administration.
  • the overall charge can be measured by any method known to those skilled in the art, such as measuring the Zeta potential at neutral pH.
  • the nanoparticles according to the invention have a Zeta potential at neutral pH ranging from -20 mV to +20 mV, preferably ranging from -15 mV to +15 mV, preferably ranging from -10 mV to +10 mV.
  • the solutions prepared in steps (1) and (2) have a total polyelectrolyte concentration of between 1 and 50 mg / g, preferably between 5 and 50 mg / g, in particular between 7 and 25 mg / g.
  • the nanoparticle suspension obtained at the end of step (2) of the preparation method described above is sufficiently concentrated in nanoparticles, and can be used as it is, without a subsequent concentration step.
  • the nanoparticle suspension obtained according to the process of the invention is suitable for parenteral administration, in particular intravenously.
  • it has a viscosity, measured at 20 ° C. and at a shear rate of 10 sec -1 , ranging from 1 to 500, preferably from 2 to 200 mPa.s.
  • the viscosity can be measured at 20 ° C., using conventional equipment, such as, for example, an imposed stress type rheometer (Gemini, Bohlin) on which a cone-plane type geometry has been installed (4). cm and 2 ° angle), following the manufacturer's instructions.
  • the suspension of nanoparticles obtained at the end of step (2) of the preparation process described above is subjected to one or more concentration steps, in particular by tangential or frontal ultrafiltration, centrifugation. , evaporation or lyophilization.
  • the process according to the invention may comprise a subsequent dehydration step of the suspension of the particles obtained (for example by lyophilization or atomization), in order to obtain them in the form of a dry powder.
  • the nanoparticles according to the invention are stable in freeze-dried form. Moreover, they are easily redispersible after lyophilization. Thus, the suspension of nanoparticles according to the invention can be lyophilized and then reconstituted in aqueous solution, without affecting the properties of the nanoparticles obtained.
  • the present invention also relates to novel pharmaceutical, phytosanitary, food, cosmetic or dietetic preparations prepared from the compositions according to the invention.
  • composition according to the invention can thus be in the form of a powder, a solution, a suspension, a tablet or a capsule.
  • composition of the invention may in particular be intended for the preparation of a medicament.
  • the levels of ⁇ -tocopherol and polyethylene glycol grafting, measured by proton NMR in TFA-d, are 5.3% and 3.8%, respectively.
  • Table 1 describes the characteristics of the anionic polyelectrolyte PAi (the notation pi, qi and si refer to the formula (I) of the description, the notations Xpi, x a i, xpAGi, DPi are those defined in the description).
  • the preparation protocol of the polyelectrolyte complex is as follows:
  • the anionic polyelectrolyte PAi is diluted in a solution of 10 mM NaCl to obtain a mass mass of solution at the mass concentration Ci and is kept under moderate stirring. This solution is then poured, while maintaining the stirring, with a quantity n3 ⁇ 4 of a solution of the cationic polyelectrolyte PCi previously diluted to a mass concentration C2 in a 10 mM NaCl solution.
  • the diameter of the nanoparticles obtained is measured by quasi-elastic light scattering, as described above.
  • the overall ZetaZeta load is measured by measuring the Zeta potential at neutral pH.
  • a quantity mi of a solution of the anionic polyelectrolyte PA 2 at the concentration Ci in a solution of NaCl at 10 mM and a quantity ⁇ 3 ⁇ 4 of a solution of the cationic polyelectrolyte PCi described in a manner similar to Example 3 are prepared in a similar manner to Example 3. in Example 2 previously diluted to a C 2 concentration in a 10 mM NaCl solution. In the same manner as in Example 3, the cationic polymer PCi is added to the anionic polymer PA2.
  • PA3 O and PA grafts are carriers polyglutamate vitamin E and polyethylene glycol moieties. Their synthesis is similar to the PAi synthesis proposed in Example 1.
  • PA4, PA5 and PAs are polyglutamates carrying vitamin E grafts but are free of polyethylene glycol groups. The synthesis of such polymers is described in particular in the international application WO 03/104303 of the applicant.
  • PA 7 is a polyaspartate bearing octadecylamine grafts. The synthesis of this polymer is as follows:
  • Step 1 A polysuccinimide is synthesized according to a protocol analogous to that described in Polymer 1997, 38 (18), 4733-4736 using L-aspartic acid.
  • Step 2 aminolysis with stearylamine and then hydrolysis of the residual polysuccinimide groups, according to a protocol similar to that described in Langmuir 2001, 17, 7501. Table 6 below groups together the characteristics of the anionic polyelectrolytes prepared.
  • ⁇ PC2 is a polyglutamate carrying vitamin E grafts but free of polyethylene glycol groups and free of neutral groups. Its synthesis, similar to the PCi synthesis proposed in Example 2, is described in particular in the international application WO 2008/135563 of the applicant.
  • ⁇ PCe is a polyglutamate carrying vitamin E grafts, free of polyethylene glycol groups and bearing neutral hydroxyethylamino groups. Its synthesis, similar to the synthesis of PC 2 , further comprises a step of grafting ethanolamine. This grafting step is described in the international application WO 2006/079614 of the applicant.
  • PC 7 is a polyglutamate carrying vitamin E grafts and polyethylene glycol groups but free of neutral groups. The synthesis of this polymer is as follows:
  • Step 1 A polyglutamate grafted with 5% vitamin E and 4% polyethylene glycol is synthesized following the protocol of Example 1.
  • the percentage of grafted argininamide, determined by proton NMR in D 2 O, is 84%.
  • PC 3 and PC 4 are polyglutamates free of vitamin E grafts carrying polyethylene glycol groups and neutral hydroxyethylamino groups.
  • the synthesis of PC 4 is as follows:
  • PC3 The synthesis of PC3 is similar to the PC 4, using amounts of appropriate reagents and a mass of polyethylene glycol 3000 g / mol.
  • PC5 is a polyglutamate free of vitamin E grafts but carries polyethylene glycol groups and is free of neutral groups. Its synthesis is similar to the synthesis of PC 3 and PC 4 proposed above, with the exception of ethanolamine grafting which is not carried out for PC5 synthesis.
  • PCs is a polyglutamate free of vitamin E grafts and polyethylene glycol groups but bearing dihydroxypropylamino-neutral groups.
  • the synthesis of this polymer is as follows:
  • the poly (glutamic acid) of DP 100 (62.8 g) is solubilized in 1293 g of NMP at 80 ° C. The resulting solution is cooled to 0 ° C and 69.68 g of isobutyl chloroformate and then 51.6 g of N-methylmorpholine are successively added. The mixture is stirred for 15 min at 0 ° C. In parallel, 26.37 g of argininamide dihydrochloride are suspended in 501.98 g of NMP and 33.2 g of aminopropane diol (APD) and then 10.79 g of triethylamine are added. The suspension obtained is stirred for a few minutes at 20 ° C., cooled to 0 ° C.
  • APD aminopropane diol
  • reaction mixture is stirred for 6 h at 0 ° C. 7.9 g of APD are then added and the reaction mixture is stirred overnight at 0 ° C. After addition of 52 g of a 35% HCl solution, the reaction mixture is dripped into 5.4 L of water and the pH is adjusted to 7-7.5. The solution obtained is purified by diafiltration and concentrated. The percentages of grafted APD and argininamide, determined by proton NMR in D 2 0, are 72 and 18%, respectively.
  • PC9 is a polylysine free of vitamin E grafts but carrying polyethylene glycol groups and free of neutral groups. His synthesis is as follows: 1.5 g of poly-L-lysine are solubilized in 10 ml of a 10 mM Hepes buffer (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid) and the pH is adjusted to 8.1 with sodium hydroxide. 0.1N.
  • the reaction mixture is purified by diafiltration and concentrated.
  • t 2 refers in this case to neutral grafts hydroxyethylamino-
  • t 2 refers in this case to neutral grafts dihydroxypropylamino-
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a solution of 10 mM NaCl to obtain a solution at the concentration Ci.
  • the cationic polyelectrolyte PC is diluted in a solution of 10 mM NaCl to obtain a solution at the concentration C2.
  • the process then differs in the order of addition according to whether the target final mixture is in excess of anionic charge or in excess of cationic charge: for mixtures with anionic charge excess (tests 3.1 to 3.9 in Table 8), a mass ⁇ 3 ⁇ 4 of anionic polyelectrolyte PA at the concentration Ci is placed in a beaker with moderate stirring and a mass m 2 of cationic polyelectrolyte PC at the concentration C 2 is then added.
  • a mass m 2 of cationic polyelectrolyte PC at the concentration C 2 is placed in a beaker with moderate stirring and a mass of the anionic polymer PA at the concentration Ci is then added.
  • Table 8 summarizes the masses and concentrations involved in the mixtures as well as the characteristics of these mixtures.
  • Formulations according to the invention incorporating as an active ingredient recombinant human growth hormone (rhGH).
  • rhGH human growth hormone
  • the rhGH is mixed initially with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / rhGH complex thus obtained is mixed in a second step with the
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a 20 mM phosphate buffer and mixed with a solution containing 4.3 mg / g of rhGH (Biosidus P161) so as to have a PA / rhGH mixture having a concentration C1 of anionic polyelectrolyte PA and a Cpi concentration in rhGH protein.
  • the mixture is left for 12 hours at room temperature
  • a mass mj of this PA / rhGH mixture is added to a mass m 2 of cationic polyelectrolyte at the C 2 concentration.
  • the final mixture has a total concentration of polymer C (calculated as in Example 3) and a protein concentration
  • the non-polyelectrolyte active concentration is determined by analyzing the final mixture by size exclusion chromatography (G4000 + G2000 columns SWXL - PB S buffer diluted to the tenth - flow rate of 0.5 mL / min). In all cases, the peak corresponding to the elution time of the non-associated rhGH is not detected: the fraction of non-associated rhGH is therefore ⁇ 1%.
  • Table 9 describes the masses and concentrations involved in the mixture as well as the characteristics of this mixture.
  • Formulations according to the invention incorporating as active recombinant human growth hormone (rhGH) and concentrated by two methods: ultrafiltration and lyophilization / reconstitution.
  • rhGH human growth hormone
  • Example 7 A fraction of the formulation described in Test 4.2 of Example 7 (with polyelectrolytes PA and PC 2 ) was lyophilized using a benchtop freeze-dryer (CHRIST Alpha 2-4 LP plus) for 24 hours. hours. The lyophilized powder is then dispersed in water so as to have a solution approximately 20 times more concentrated than the solution of the preceding test 4.2. A homogeneous colloidal solution is obtained in less than 5 minutes.
  • Another fraction of the formulation is concentrated by a factor of about 10 by frontal ultrafiltration on a membrane having a cutoff of 10 kDa.
  • Formulations according to the invention incorporating salmon calcitonin (sCT) as active.
  • sCT salmon calcitonin
  • the sCT is mixed at first with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / sCT complex thus obtained is mixed in a second step with the cationic polyelectrolyte PC. More precisely :
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a solution of 10 mM phosphate buffer and mixed with a solution containing 10 mg / g of sCT (Polypeptide Laboratories AB) so as to have a PA / sCT mixture having a concentration C1 in anionic polyelectrolyte PA and a C p concentration in protein sCT.
  • the mixture is stirred for 1 h at room temperature with a magnetic bar.
  • the process then differs in the order of addition according to whether the target final mixture is in excess of anionic charge or in excess of cationic charge:
  • the final mixture has a total polymer concentration C and a protein concentration C p .
  • the non-polyelectrolyte active concentration is determined after separation by ultracentrifugation on ultrafilters with a cut-off of 30 kDa and HPLC filtrate determination. It is in all cases strictly less than 5%.
  • the sCT is mixed at first with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / sCT complex thus obtained is mixed in a second step with the cationic polyelectrolyte PC. More precisely :
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a solution of NaCl at 10 mM
  • PA / sCT mixture having a concentration C1 of anionic polyelectrolyte PA and a concentration C p i of protein sCT.
  • the mixture is stirred for 30 minutes at room temperature.
  • a mass of the preceding mixture PA / sCT is placed in a beaker with moderate stirring and a mass m 2 of cationic polyelectrolyte PC previously diluted with
  • the concentration C 2 is then added to the mixture.
  • the final mixture has a total polymer concentration C and a protein concentration C p .
  • anionic and cationic polyelectrolytes used for this example are respectively the polyelectrolytes PA 4 and PC 7 described in Example 5.
  • Formulations according to the invention incorporating as active recombinant human insulin (INS).
  • INS human insulin
  • the insulin is mixed initially with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / INS complex thus obtained is mixed in a second step with the cationic polyelectrolyte PC. More precisely :
  • INS 0.36 g of INS are dissolved in 9 g of distilled water, the solution is stirred for 10 minutes at 250 rpm with a magnetic bar.
  • the solution is acidified by addition of 2.66 g of a hydrochloric acid solution at 0.1 N, then stirred at 500 rpm for 15 minutes. 3.98 g of a solution of sodium hydroxide at 0.1 N are then added with stirring at 500 rpm, then after 15 minutes are added 3.90 g of distilled water to obtain a final concentration of 17 NDS. , 54 mg / g (taking into account the% of water present in the insulin powder).
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a 10 mM sodium chloride solution and mixed with the insulin stock solution containing 17.54 mg / g of INS (Biocon) so as to have a PA / sCT mixture having a concentration Ci anionic polyelectrolyte PA and a Cp concentration in INS protein.
  • the mixture is stirred for 20 h at room temperature with gentle stirring.
  • the non-polyelectrolyte active concentration is determined after separation by ultracentrifugation on ultrafilters with a 50 kDa cutoff and HPLC filtrate assay. The concentration of non-associated active under these conditions is about 8%.
  • the anionic and cationic polyelectrolytes used for this example are respectively the polyelectrolytes PA 4 and PC 7 described in Example 5.
  • Formulations according to the invention incorporating as active the exenatide.
  • the exenatide is mixed initially with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / exenatide complex thus obtained is mixed in a second step with the cationic polyelectrolyte PC. More precisely :
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a 10 mM NaCl solution and then mixed with a solution containing 10 mg / g of exenatide (Assia Chemical Industries LTD) so as to obtain a PA / exenatide mixture having a concentration C1 in anionic polyelectrolyte PA. and a concentration C p in exenatide.
  • the mixture is stirred for 30 minutes at room temperature with gentle stirring.
  • PA / exenatide is added with moderate stirring a mass m 2 of cationic polyelectrolyte PC previously diluted in a solution of 10 mM NaCl at the concentration C 2 .
  • the final mixture has a total polymer concentration C and 25 C per protein concentration calculated as above.
  • Formulations according to the invention incorporating as active fulvestrant
  • the fulvestrant is mixed initially with the anionic polyelectrolyte PA and the PA / fulvestrant complex thus obtained is mixed in a second step with the cationic polyelectrolyte PC.
  • the anionic polyelectrolyte PA is diluted in a 10 mM NaCl solution and mixed with powdered fulvestrant (ScimoPharm Taiwan) so as to obtain a PA / fulvestrant mixture having a concentration Ci anionic polyelectrolyte PA and a concentration C p i in fulvestrant.
  • the mixture is stirred for 24 h at 30 ° C. with gentle stirring.
  • a mass mi of the preceding mixture PA / fulvestrant is added with stirring to a mass m 2 of cationic polyelectrolyte PC previously diluted in a solution of NaCl at 10 mM at the concentration C 2 .
  • the final mixture has a concentration C in total polymer and a concentration C p in active ingredient calculated as above.
  • Example 5 The characteristics of the anionic and cationic polyelectrolytes used for this example are described in Example 5.
  • Example 3 A fraction of the formulation described in Experiment 1.7 of Example 3 (with PAi and PCi polyelectrolytes) is lyophilized using a benchtop freeze-dryer (CHRIST Alpha 2-4 LP plus). The lyophilized powder is then dispersed in water so as to have a solution approximately 10 times more concentrated than the solution of test 1.7. A homogeneous colloidal solution is obtained in less than 5 minutes.
  • the viscosity is measured at 20 ° C., at a shear rate of 10 sec -1 , using an imposed stress-type rheometer (Gemini, Bohlin) on which a cone-plane geometry has been installed ( 4 cm and 2 ° angle).
  • formulations according to the invention are sufficiently fluid to allow their injection parenterally, and in particular subcutaneously.

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Abstract

La présente invention concerne des nouvelles nanoparticules formées d'au moins un actif et d'au moins deux polyélectrolytes de polarité opposée, caractérisées notamment en ce qu'au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux hydrophobes et au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux polyalkylène glycol, lesdites nanoparticules présentant un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm et comprenant une quantité en groupements polyalkylène glycol telle que le rapport massique w PAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05.

Description

NANOPAR ICULES COMPORTANT AU MOINS UN ACTIF ET AU MOINS DEUX POLYAMINO ACIDES DE CHARGE OPPOSEE
L'invention concerne de nouvelles nanoparticules formées d'au moins deux polyélectrolytes spécifiques de polarité opposée et d'au moins un actif, et les formulations comprenant de telles nanoparticules.
Les formulations d'actif doivent répondre à un certain nombre de critères de tolérance, être suffisamment concentrées en actif, tout en possédant une faible viscosité pour permettre une injection aisée au travers d'une aiguille de faible diamètre, par exemple une aiguille de gauge 27 à 31 G.
Dans ce domaine, la société déposante est parvenue à mettre au point, comme présenté dans le document WO 2008/135561, des suspensions stables et de faible viscosité, constituées de microparticules chargées en principe actif. Ces microparticules, aptes à libérer le principe actif sur une durée prolongée, sont plus particulièrement formées à partir du mélange, dans des conditions spéci iques, de deux polymères polyélectrolytes (PE1) et (PE2) de polarité opposée, l'un au moins étant porteur de groupements hydrophobes. Ce mélange conduit à des microparticules de taille comprise entre 1 et 100 μιη.
Toutefois, les formulations de microparticules ne conviennent pas à une administration intraveineuse et peuvent, dans le cadre d'une administration par voie sous- cutanée, poser des problèmes d'intolérance.
Par conséquent, dans la perspective d'une administration de principes actifs par voie parentérale, notamment intraveineuse ou sous-cutanée, il serait préférable de disposer de suspensions de particules de taille encore plus réduite et notamment, à l'échelle nanométrique.
D'autre part, l'administration sous-cutanée d'actifs exige que le volume de la dose injectée soit limité, par exemple inférieur ou égal à 1 mL, et par conséquent, que la formulation d'actif soit suffisamment concentrée. Cette contrainte est particulièrement limitative pour les peptides ou certaines petites molécules dont les doses thérapeutiques sont généralement élevées.
Par ailleurs, l'obtention d'une suspension concentrée en particules d'actif, à partir d'une suspension diluée, est contraignante, exigeant notamment la mise en œuvre d'une ou plusieurs étapes de concentration, pour conduire à une dose administrable pour le patient. Il demeure donc un besoin de formulations stables de nanoparticules d'actif, suffisamment concentrées, et néanmoins dotées d'une viscosité faible, particulièrement adaptées à une administration par voie parentérale, notamment intraveineuse.
La présente invention vise précisément à proposer de nouvelles nanoparticules, et de nouvelles compositions contenant ces dernières, permettant de donner satisfaction à l'ensemble des exigences précitées.
Contre toute attente, les inventeurs ont découvert qu'il est possible d'obtenir des formulations fluides et concentrées de nanoparticules chargées en actif, à partir d'un mélange de polyélectrolytes spécifiques.
Plus précisément, la présente invention concerne, selon un premier de ses aspects, des nanoparticules formées d'au moins un actif et d'au moins deux polyélectrolytes de polarité opposée possédant un squelette linéaire polyaminoacide et présentant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2.000, caractérisées en ce que : au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux hydrophobes ;
au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux polyalkylène glycol ;
lesdites nanoparticules présentant un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm, et comprenant une quantité en groupements polyalkylène glycol telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05, en particulier est compris entre 0,05 et 0,75, en particulier entre 0,05 et 0,6, notamment entre 0,05 et 0,5 et de préférence entre 0,05 et 0,3.
En particulier, le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total va de 0,1 à 0,75, en particulier de 0,15 à 0,6, notamment de 0,15 à 0,5 et de préférence de 0,15 à 0,3.
Avantageusement, les polyélectrolytes considérés selon l'invention sont biocompatibles. Ils sont parfaitement tolérés et se dégradent rapidement, c'est-à-dire sur une échelle de temps de quelques jours à quelques semaines.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une composition, notamment pharmaceutique, comprenant au moins des nanoparticules telles que définies précédemment. En particulier, les nanoparticules selon l'invention s'avèrent particulièrement avantageuses pour véhiculer des actifs protéiniques, peptidiques, et/ou solubiliser des actifs de faible masse moléculaire.
Par ailleurs, les nanoparticules selon l'invention sont avantageusement aptes à libérer l'actif sur une durée prolongée.
La taille nanométrique des particules de l'invention est en outre particulièrement bien adaptée à une administration de la formulation d'actifs par voie intraveineuse ou sous-cutanée. La présente invention s'avère ainsi particulièrement avantageuse au regard de l'administration par voie parentérale d'actifs utilisés pour le traitement des cancers.
Diverses formulations de polyélectrolytes ont déjà été décrites.
Ainsi, Kabanov et al., Macromolecules, 1996, 29, 6797-6802, décrivent des nanoparticules formées par complexation de deux polyélectrolytes de polarité opposée, et plus précisément du dibloc poly(méthacrylate de sodium)-è-PEO comme polyélectrolyte anionique et du poly(bromure de N-éthyl-4-vinylpyrinidium) comme polyélectrolyte cationique. Toutefois, ce type de polyélectrolytes, non biodégradables, peut difficilement être envisagé pour une administration parentérale.
Kataoka et al., dans les documents Lee Y. and Kataoka ., Soft Matter, 2009, 5, 3810-17 et Osada K. et al, J.R. Soc. Interface, 2009, 6, S325-S339, décrivent des micelles polyioniques, en particulier formées à partir de copolymères blocs poly(éthylène glycol)-polyaminoacide, pour l'administration parentérale de principes actifs, plus particulièrement d'actifs anti-cancéreux comme la doxorubicine.
Sonaje et al., Biomaterials, 2010, 31, 3384-3394, décrivent des complexes polyélectrolytes obtenus par complexation de chitosan avec l'acide p-gamma glutamique, associant l'insuline.
En revanche, des nanoparticules associant deux polyélectrolytes répondant aux spécificités précitées de la présente invention n'ont, à la connaissance des inventeurs, jamais été proposées.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé de préparation de nanoparticules présentant un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant à : (1) disposer d'une solution aqueuse comprenant des nanoparticules d'un premier polyélectrolyte à l'état chargé, porteur de groupements latéraux hydrophobes, lesdites nanoparticules étant associées de manière non covalente à un actif ;
(2) mettre en présence ladite solution (1) avec au moins un second polyélectrolyte de polarité opposée à celle du premier polyélectrolyte, de manière à former lesdites nanoparticules,
avec au moins l'un desdits premier et second polyélectrolytes possédant des groupements latéraux polyalkylène glycol, la quantité desdits groupements polyalkylène glycol étant telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05,
lesdits premier et second polyélectrolytes possédant un squelette linéaire polyaminoacide et présentant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2.000.
En particulier, la solution aqueuse (1) est obtenue par ajout de l'actif à une solution colloïdale aqueuse du premier polyélectrolyte, ledit actif s'associant de manière non covalente aux nanoparticules dudit premier polyélectrolyte.
Les formulations de nanoparticules d'actif selon l'invention s'avèrent également particulièrement avantageuses à plusieurs titres.
Tout d'abord, une suspension de nanoparticules selon l'invention présente avantageusement une excellente stabilité. Le mélange peut en outre être effectué à des concentrations élevées sans nuire aux propriétés physicochimiques de la suspension, en particulier en termes de viscosité, taille des particules, stabilité colloïdale ou chimique. Il est ainsi possible selon l'invention d'accéder à une suspension stable de nanoparticules, fluide et suffisamment concentrée. En particulier, la suspension obtenue selon l'invention ne nécessite pas la mise en œuvre d'étape ultérieure de concentration. La présente invention permet donc de formuler une suspension fluide, « prête à l'emploi », en particulier à une administration par voie intraveineuse. Autrement dit, elle peut être administrable chez le patient telle qu'obtenue à l'issue du procédé précité.
Egalement, une suspension de nanoparticules selon l'invention se prête aisément à une lyophilisation et à une reconstitution en phase aqueuse, sans affecter les propriétés obtenues.
Par ailleurs, la suspension de nanoparticules selon l'invention peut être formée extemporanément au moment de l'administration par simple mélange de deux suspensions liquides préparées comme décrit ci-dessus. Ainsi, ces suspensions de nanoparticules peuvent facilement être stockées, permettant d'envisager un coût de production limité à l'échelle industrielle.
Enfin, l'actif est mis en œuvre dans un procédé aqueux ne nécessitant pas de température excessive, de cisaillement important, de tensioactif, ni de solvant organique, ce qui permet avantageusement d'éviter toute dégradation potentielle de l'actif Une telle caractéristique apparaît particulièrement avantageuse au regard de certains actifs, tels que des peptides et protéines, pouvant potentiellement être dégradés lorsqu'ils sont soumis aux conditions précitées.
ACTIFS
Concernant l'actif, il peut être une molécule d'intérêt thérapeutique, cosmétique, prophylactique ou d'imagerie.
Il est de préférence choisi dans le groupe comprenant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées de façon covalente à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG)], les peptides, les polysaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides, les substances pharmaceutiques synthétiques et leurs mélanges.
Plus préférentiellement, l'actif est choisi dans le sous-groupe des érythropoïétines, le raffîmère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés; Pocytocine, la vasopressine, l'hormone adrénocorticotropique, les facteurs de croissance, les facteurs sanguins, l'hémoglobine, les cytochromes, les albumines prolactine, la lulibérine (hormone de libération de l'hormone lutéinisante ou LHRH) ou ses analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buséréline, nafaréline; les antagonistes de la LHRH, les concurrents de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, l'hormone de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges, les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou gamma; la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, le facteur de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance nerveux (NGF), les facteurs de croissance tels que béclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur stimulant les colonies granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), l'héparinase, la protéine morphogénique de l'os (BMP), le hANP, le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), ses analogues et ses agonistes, en particulier l'exenatide, le VEG-F, l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, les cyclosporines et leurs analogues synthétiques, les modifications et fragments pharmaceutiquement actifs d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques et cellules vivantes, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilene, quétiapine, clozapine, amisulpride, sulpiride, ziprasidone, etc.
Plus particulièrement, l'actif est choisi parmi l'hormone de croissance, l'insuline, la calcitonine, le fulvestrant et les cytokines.
POLYELECTROLYTES
Comme précisé précédemment, les nanoparticules selon l'invention comprennent au moins deux polyélectrolytes de polarité opposée. Autrement dit, les nanoparticules selon l'invention comprennent au moins un polyélectrolyte anionique et au moins un polyélectrolyte cationique.
Par « polyélectrolyte », on entend au sens de la présente invention, un polymère porteur de groupements capables de s'ioniser dans l'eau, en particulier à pH allant de 5 à 8, ce qui crée une charge sur le polymère. Ainsi, en solution dans un solvant polaire comme l'eau, un polyélectrolyte se dissocie, faisant apparaître des charges sur son squelette et des contre-ions en solution.
A titre d'exemple, les fonctions acide carboxylique et aminé du polyélectrolyte se trouvent respectivement sous les formes -COOH ou -COO" et NH2 ou NH3 + en fonction du pH de la solution, la neutralité étant assurée par les contre-cations et contre-anions présents en solution.
Dans le cas où le polyélectrolyte comporte des groupements acides, le composé est susceptible d'être présent sous une forme salifiée. Le choix des sels relève des compétences de l'homme du métier. A titre d'exemple, les contre-cations peuvent notamment être des cations métalliques monovalents, de préférence des ions sodium ou potassium. Dans le cas où le polyélectrolyte comporte des groupements aminés, les contre- anions peuvent notamment être des ions chlorure, acétate ou ammonium.
Les polyélectrolytes selon l'invention peuvent comprendre un ensemble de groupes électrolytes identiques ou différents.
Sauf indication contraire, les polyélectrolytes sont décrits dans toute la suite de la description, tels qu'ils se présentent à la valeur de pH de mélange des polyélectrolytes anionique et cationique conduisant à la formation des nanoparticules selon l'invention. La qualification d'un groupement de « cationique » ou d'« anionique » est par exemple considérée au regard de la charge portée par ce groupement à cette valeur du pH de mélange des polyélectrolytes anionique et cationique. De même, la polarité d'un polyélectrolyte est définie au regard de la charge globale portée par ce polyélectrolyte à cette valeur du pH.
En particulier, la valeur du pH de mélange des polyélectrolytes anionique et cationique conduisant à la formation des nanoparticules selon l'invention va de 5 à 8, de préférence de 6 à 7,5.
Plus particulièrement, on entend par « polyélectrolyte anionique », un polyélectrolyte présentant une charge globale négative à la valeur de pH de mélange des deux polyélectrolytes.
De même, on entend par « polyélectrolyte cationique », un polyélectrolyte présentant une charge globale positive à la valeur de pH de mélange des deux polyélectrolytes.
Par « charge globale » d'un polyélectrolyte, on entend la somme algébrique de toutes les charges positives et négatives portées par ce polyélectrolyte.
Squelette linéaire polyaminoacide
Comme évoqué précédemment, les polyélectrolytes considérés selon l'invention possèdent un squelette linéaire polyaminoacide, c'est-à-dire comprenant des résidus acide aminé.
De manière avantageuse, les polyélectrolytes selon l'invention sont biodégradables. Au sens de l'invention, le terme « polyaminoacide » couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques.
Les polyaminoacides sont des polymères linéaires, composés avantageusement d'alpha-aminoacides liés par des liaisons peptidiques.
II existe de nombreuses techniques synthétiques pour former des polymères à blocs ou statistiques, des polymères à chaînes multiples et des polymères contenant une séquence déterminée d'aminoacides (cf. Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, volume 12, page 786 ; John Wiley & Sons).
L'homme de l'art est à même de par ses connaissances de mettre en œuvre ces techniques pour accéder aux polymères convenant à l'invention. En particulier, il pourra également se référer à l'enseignement des documents WO 96/29991, WO 03/104303, WO 2006/079614, WO 2008/135563 et Kang et al. (Langmuir 2001, 17, 7501-7506).
Selon une variante de réalisation préférée, la chaîne polyaminoacide est constituée d'un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'acide alpha-L-glutamique.
Selon une autre variante de réalisation, la chaîne polyaminoacide est constituée d'un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'acide alpha-L-aspartique.
Selon une autre variante de réalisation, la chaîne polyaminoacide est constituée d'un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate, d'acide alpha-L-aspartique/alpha- L-glutamique, d'alpha/béta-L-aspartate ou d'acide alpha/béta-L-aspartique.
Selon une autre variante de réalisation, la chaîne polyaminoacide est constituée d'un homopolymère de poly-L- lysine.
De tels polyaminoacides sont notamment décrits dans les documents WO 03/104303, WO 2006/079614 et WO 2008/135563 dont le contenu est incorporé par référence. Ces polyaminoacides peuvent également être du type de ceux décrits dans la demande de brevet WO 00/30618.
Ces polymères peuvent être obtenus par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(acide alpha-L-glutamique), poly(acide alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L- glutamate), poly(acide gamma-L-glutamique) et poly(L-lysine) de masses variables sont disponibles commercialement. Le poly(acide-L-glutamique) peut être en outre synthétisé selon la voie décrite dans la demande de brevet FR 2801226.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polyélectrolyte anionique considéré selon l'invention est de formule (I) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000010_0001
dans laquelle :
- Ra représente un atome d'hydrogène, un groupe acyle linéaire en C2 à C10, un groupe acyle ramifié en C3 à C10, un groupe pyroglutamate ou un groupement hydrophobe G tel que défini ci-après ;
- Rb représente un groupe -NHR5 ou un résidu acide aminé terminal lié par l'azote et dont le carboxyle est éventuellement substitué par un radical alkylamino -NHR5 ou un alcoxy -OR6, dans lequel :
· R5 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à
C10, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, ou un groupe benzyle ;
• R6 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à C10, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, un groupe benzyle ou un groupement G ;
- G représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadécényloxy-, tocophéryl- et cholestéryl-, de préférence alpha-tocophéryl-;
- PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol, • Si correspond au nombre moyen de monomères de glutamate non greffés, anioniques à pH neutre,
• i correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement hydrophobe G, et
• qi correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
pi et qi pouvant être éventuellement nuls,
- le degré de polymérisation DPi = (si + pi + qi) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement allant de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150,
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (I) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le polyélectrolyte anionique de formule (I) possède une fraction molaire xpi des monomères porteurs de groupements hydrophobes telle que xpi = pi/(si+pi+qi) varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % et plus particulièrement encore de 4 à 6 %.
Selon un second mode de réalisation particulier, le polyélectrolyte anionique considéré selon l'invention est de formule (Γ) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000011_0001
dans laquelle :
- G' représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyl-, dodécyl-, tétradécyl-, hexadécyl-, octadécyl- et 9-octadécényl-; • Si = (si' + Si ") correspond au nombre moyen de monomères d'aspartate non greffés, anioniques à pH neutre,
• Pi = (Pi' + Pi") correspond au nombre moyen de monomères d'aspartate porteurs d'un groupement hydrophobe G' et peut être éventuellement nul,
- le degré de polymérisation DPi = (si + pi) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement allant de 20 à 450, en particulier de 20 à 250, et notamment de 20 à 150,
l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (Γ) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
Selon un second mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le polyélectrolyte anionique de formule (Γ) possède une fraction molaire xpi des monomères porteurs de groupements hydrophobes telle que xpi = pi/(si+pi) varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 %.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polyélectrolyte cationique selon l'invention est de formule (II) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000012_0001
dans laquelle :
Ra représente un atome d'hydrogène, un groupe acyle linéaire en C2 à C10, un groupe acyle ramifié en C3 à C10, un groupe pyroglutamate ou un groupement hydrophobe G tel que défini ci-après ; R représente un groupe -NHR5 ou un résidu acide aminé terminal lié par l'azote et dont le carboxyle est éventuellement substitué par un radical alkylamino -NHR5 ou un alcoxy -OR6, dans lequel :
• R5 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à Cio, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, ou un groupe benzyle ;
• R6 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à
C10, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, un groupe benzyle ou un groupement G ;
- G représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryl- et cholestéryl-, de préférence alpha-tocophéryl-;
- PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol,
- R2 représente un groupement cationique, en particulier l'argininamide lié par la fonction aminé ;
- R3 représente un groupement neutre choisi parmi : hydroxyéthylamino-, dihydroxypropylamino- liés par la fonction aminé ;
• S2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate non greffés, anioniques à pH neutre,
• P2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement hydrophobe G,
• q2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
· r2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement cationique R2,
• t2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement neutre R3,
s2, p2, q2 et t2 pouvant être éventuellement nuls, et
- le degré de polymérisation DP2 = (s2 + p2 + q2 + r2 + t2) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement varie de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150 ; - l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (II) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
Bien entendu, le polyélectrolyte cationique répondant à la formule (II) est tel que la charge globale du polyélectrolyte (r2-s2) est positive.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le polyélectrolyte cationique de formule (II) possède une fraction molaire xp2 des monomères porteurs de groupements hydrophobes telle que xp2 = p2 / (s2 + p2 + q2 + r2 + 12) varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % et plus particulièrement encore de 4 à 6 %.
Selon un second mode de réalisation particulier, le polyélectrolyte cationique considéré selon l'invention est de formule (ΙΓ) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000014_0001
(ΙΓ) dans laquelle :
- X" représente un contre-anion, en particulier un ion chlorure, acétate ou ammonium,
- PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol,
• q2 correspond au nombre moyen de monomères de lysine porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
• r2 correspond au nombre moyen de monomères de lysine non greffés, cationiques à pH neutre, q2 pouvant être éventuellement nuls, et
- le degré de polymérisation DP2 = (q2 + r2) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement varie de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150 ;
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (ΙΓ) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
Détermination de la masse molaire moyenne et du degré de polymérisation des polyélectrolytes ainsi que des fractions molaires correspondant à chacun des motifs
Au sens de l'invention, la masse molaire moyenne des polymères est mesurée au moyen d'un détecteur de diffusion de lumière statique couplé à un équipement de chromatographie d'exclusion stérique. La masse molaire moyenne retenue est la masse molaire au pic (Mp).
Dans le cas des poly(acide glutamique) greffés, cette analyse est réalisée dans les conditions suivantes :
L'échantillon de poly(acide glutamique) greffé, en solution aqueuse, est précipité par ajout d'acide chlorhydrique 0,1 N, lyophilisé puis dissous dans la N-méthyl- pyrrolidone (NMP) et analysé.
La masse molaire moyenne au pic est mesurée au moyen d'un détecteur de diffusion de lumière statique 18 angles (MALLS) couplé à un équipement de chromatographie d'exclusion stérique dans la N-méthyl-pyrrolidone comportant 3 colonnes chromatographiques séquentielles polystyrène-co-divinylbenzène : 5 μητ/ΙΟΟ 000 Â,
5 um/lO 000 Â et 5 μτα/1 000 Â.
Les fractions molaires x; correspondant à chacun des motifs monomères (greffés ou non) AAj constituant le polyélectrolyte sont mesurées par RMN du proton dans un solvant adapté. L'homme du métier est à même de choisir le solvant adapté au polyélectrolyte à analyser et de définir les conditions d'analyse.
Dans le cas des poly(acide glutamique) greffés correspondant à la formule (I), l'échantillon de polymère est lyophilisé, dissous dans l'acide trifluoroacétique deutéré puis analysé au moyen d'un spectromètre RMN à 300 MHz équipé d'une sonde à proton !H. On détermine en particulier ainsi xp la fraction molaire en motifs monomères greffés par des groupements hydrophobes qui correspond au taux de greffage molaire moyen en groupement hydrophobes, XPAG la fraction molaire de motifs monomères greffés par du polyalkylèneglycol, xa la fraction molaire de motifs monomères anioniques et xc la fraction molaire de motifs monomères cationiques.
Le degré de polymérisation moyen DP est calculé en divisant la masse molaire moyenne d'une chaîne de polymère déterminée par chromatographie d'exclusion stérique comme décrit précédemment, par la masse molaire moyenne Μ d'un motif monomère du polyélectrolyte : DP = MP/MAAm
Cette masse molaire moyenne d'un motif est la moyenne des masses molaires des motifs composant le polyélectrolyte, chacune étant pondérée par la fraction molaire de ce motif. Ainsi pour un polyélectrolyte ayant n motifs monomères différents AA; chacun de masse moyenne M et de fraction molaire x;, la masse moyenne Μ sera donnée par la formule suivante :
Figure imgf000016_0001
Bien entendu, ledit polyélectrolyte anionique et ledit polyélectrolyte cationique des nanoparticules selon l'invention, répondant aux formules (I), (Γ), (II) et (ΙΓ) précitées, sont tels que :
- au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux hydrophobes G ou G' ;
- au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux polyalkylène glycol PAG, en particulier polyéthylène glycol PEG,
la quantité desdits groupements polyalkylène glycol portés par le polyélectrolyte anionique et/ou cationique étant telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05, en particulier est compris entre 0,05 et 0,75, en particulier entre 0,05 et 0,6, notamment entre 0,05 et 0,5 et de préférence entre 0,05 et 0,3. De préférence, WPAG est compris entre 0, 1 et 0,75, de préférence compris entre 0,15 et 0,6, de préférence compris entre 0,15 et 0,5, de préférence compris entre 0,15 et 0,3. Le rapport massique WPAG après mélange des polyélectrolytes anionique et cationique peut être calculé par la formule suivante :
_ (xPAG1 -m, .c, .(DP, I M, )MPAGl ) + (xPAG2./>/ ..c2.(DP2 1 M2 )MPAG2 )
PAG ( \ ( \
{ml .cl )+ {m2.c2 ) dans laquelle :
- pAGi et XPAG2 représentent les fractions molaires des monomères porteurs de groupements polyalkylène glycol portés respectivement par le polyélectrolyte anionique et le polyélectrolyte cationique,
- MpAGi et MPAG2 représentent les masses molaires des greffons polyalkylène glycol portés respectivement par le polyélectrolyte anionique et le polyélectrolyte cationique,
- mi et m2 représentent respectivement les quantités massiques des solutions avant mélange du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique de concentrations massiques respectives en polymère (avant mélange) Ci et C2 ;
- DPi et DP2 représentent respectivement les degrés de polymérisation du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique ;
- Mi et M2 représentent respectivement les masses molaires du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique.
Selon un premier mode de réalisation, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ le degré de polymérisation des polyélectrolytes anionique et cationique est compris entre 40 et 250, de préférence entre 40 et 110 ;
■ un seul des deux polyélectrolytes porte des groupements latéraux hydrophobes, répartis de façon statistique ;
■ un seul des deux polyélectrolytes porte des groupements latéraux polyalkylène glycol, en particulier des groupements polyéthylène glycol de masse molaire comprise entre 2.000 et 6.000 g/mol, répartis de façon statistique ;
■ t2 est nul, c'est-à-dire que le polyélectrolyte cationique est dépourvu de groupements neutres ; ■ le rapport molaire Z du nombre de groupements cationiques par rapport au nombre de groupements anioniques dans le mélange des deux polyélectrolytes est compris entre 0,1 et 2,2, de préférence entre 0,1 et 2, de préférence entre 0,4 et 1,5.
Selon un deuxième mode de réalisation, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ le degré de polymérisation des polyélectrolytes anionique et cationique est compris entre 40 et 250, de préférence entre 40 et 110 ;
■ les polyélectrolytes anionique et cationique portent tous deux des groupements latéraux hydrophobes, répartis de façon statistique ;
■ un seul des deux polyélectrolytes porte des groupements latéraux polyalkylène glycol, en particulier des groupements polyéthylène glycol de masse molaire comprise entre 2.000 et 6.000 g/mol, répartis de façon statistique ;
■ t2 est nul, c'est-à-dire que le polyélectrolyte cationique est dépourvu de groupements neutres ;
■ le rapport molaire Z du nombre de groupements cationiques par rapport au nombre de groupements anioniques dans le mélange des deux polyélectrolytes est compris entre 0,1 et 2,2, de préférence entre 0,1 et 2, de préférence entre 0,4 et 1,5.
Selon un troisième mode de réalisation, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ le degré de polymérisation des polyélectrolytes anionique et cationique est compris entre 40 et 250, de préférence entre 40 et 110 ;
■ les polyélectrolytes anionique et cationique portent tous deux des groupements hydrophobes, répartis de façon statistique ;
■ les polyélectrolytes anionique et cationique portent tous deux des groupements latéraux polyalkylène glycol, en particulier des groupements polyéthylène glycol de masse molaire comprise entre 2.000 à 6.000 g/mol, répartis de façon statistique ; ■ t2 est nul, c'est-à-dire que le polyélectrolyte cationique est dépourvu de groupements neutres ;
■ le rapport molaire Z du nombre de groupements cationiques par rapport au nombre de groupements anioniques dans le mélange des deux polyélectrolytes est compris entre 0,1 et 2,2, de préférence entre 0,1 et 2, de préférence entre 0,4 et 1,5.
Des exemples d'associations particulièrement préférées de polyélectrolytes anionique et cationique selon l'invention sont décrits dans les variantes ci-après.
Selon une première variante de réalisation préférée, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire pi du polyélectrolyte anionique en groupements hydrophobes varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI du polyélectrolyte anionique en groupements polyalkylène-glycol est nulle ;
■ la fraction molaire xp2 du polyélectrolyte cationique en groupements hydrophobes est nulle ; et
■ la fraction molaire PAG2 du polyélectrolyte cationique en groupements polyalkylène-glycol varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
Selon une seconde variante de réalisation préférée, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ;
■ la fraction molaire xp2 est nulle ; et
■ la fraction molaire XPAG2 est nulle.
Selon une troisième variante de réalisation préférée, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ; ■ la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et
■ la fraction molaire XPAG2 est nulle.
Selon une quatrième variante de réalisation préférée, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI est nulle ;
■ la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et
■ la fraction molaire XPAG2 varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
Selon une cinquième variante de réalisation préférée, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ;
" la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et
■ la fraction molaire XPAG2 varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
NANOPARTICULES
Comme précisé précédemment, les nanoparticules formées selon l'invention présentent un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm.
De préférence, la taille des nanoparticules peut varier de 10 à 70 nm, en particulier de 10 à 50 nm.
La taille des nanoparticules peut être mesurée par diffusion quasi-élastique de la lumière.
Test de mesure de la taille des particules par diffusion quasi-élastique de la lumière
La taille des particules est caractérisée par le diamètre hydrodynamique moyen en volume, obtenu selon des méthodes de mesure bien connues de l'homme du métier, par exemple à l'aide d'un appareil de type ALV CGS-3.
De manière générale, les mesures sont réalisées avec des solutions de polymères préparées à des concentrations de 1 mg/g en milieu NaCl 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont ensuite filtrées sur 0,8-0,2 μητ, avant de les analyser en diffusion dynamique de la lumière.
Dans le cas de l'utilisation d'un appareil de type ALV CGS-3, fonctionnant avec un faisceau laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement, l'angle de diffusion est de 140° et le temps d'acquisition du signal est de 10 minutes. La mesure est répétée 3 fois sur deux échantillons de solution. Le résultat est la moyenne des 6 mesures.
Préparation des nanoparticules
Les nanoparticules selon l'invention peuvent être obtenues par mélange d'une solution d'un premier polyélectrolyte avec une solution d'un second polyélectrolyte de polarité opposée, lesdits premier et second polyélectrolytes étant tels que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05.
Les nanoparticules selon l'invention peuvent être notamment préparées selon le procédé comprenant au moins les étapes consistant à :
(1) disposer d'une solution aqueuse comprenant des nanoparticules d'un premier polyélectrolyte à l'état chargé, porteur de groupements latéraux hydrophobes, lesdites nanoparticules étant associées de manière non covalente à un actif ;
(2) mettre en présence ladite solution (1) avec au moins un second polyélectrolyte de polarité opposée à celle du premier polyélectrolyte,
avec au moins l'un desdits premier et second polyélectrolytes possédant des groupements latéraux polyalkylène glycol, la quantité desdits groupements polyalkylène glycol étant telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05, en particulier est compris entre 0,05 et 0,75, en particulier entre 0,05 et 0,6, notamment entre 0,05 et 0,5 et de préférence entre 0,05 et 0,3 ;
lesdits premier et second polyélectrolytes possédant un squelette linéaire polyaminoacide et présentant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2.000, de préférence inférieur à 700, en particulier allant de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150. Selon un mode de réalisation particulier, WPAG est compris entre 0,1 et 0,75, de préférence compris entre 0,15 et 0,6, de préférence compris entre 0,15 et 0,5, de préférence compris entre 0,15 et 0,3.
En particulier, lesdits premier et second polyélectrolytes sont tels que définis précédemment.
Selon un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse (1) est obtenue par ajout de l'actif à une solution colloïdale aqueuse du premier polyélectrolyte, ledit actif s'associant de manière non covalente aux nanoparticules dudit premier polyélectrolyte.
En particulier, la solution aqueuse (1) possède une valeur de pH allant de 5 à 8, et plus particulièrement d'environ 7.
Selon un mode de réalisation particulier, l'étape (2) comprend au moins :
- la préparation d'une solution aqueuse du second polyélectrolyte, en particulier de valeur de pH allant de 5 à 8, et avantageusement de valeur de pH identique à celle de la solution aqueuse (1) ; et
- le mélange de ladite solution aqueuse du second polyélectrolyte avec ladite solution aqueuse (1).
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le premier polyélectrolyte est porteur de groupements latéraux hydrophobes, et apte à former spontanément, lorsqu'il est mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH allant de 5 à 8, notamment l'eau, des nanoparticules.
Sans vouloir être lié par la théorie, on peut avancer que l'association supramoléculaire des groupements hydrophobes pour former des domaines hydrophobes, conduit à la formation de nanoparticules. Chaque nanoparticule est ainsi constituée par une ou plusieurs chaînes de polyélectrolytes plus ou moins condensées autour de ces domaines hydrophobes.
De préférence, les nanoparticules formées par le premier polyélectrolyte, porteur de groupements latéraux hydrophobes, présentent un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm, en particulier de 10 à 70 nm, et plus particulièrement allant de 10 à 50 nm.
Les termes « association » ou « associé » employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs principes actifs et le(s) polyélectrolyte(s), signifient que le ou les actifs sont associés au(x) polyélectrolyte(s) par des interactions physiques non covalentes, en particulier des interactions hydrophobes, et/ou des interactions électrostatiques et/ou des liaisons hydrogène et/ou via une encapsulation stérique par les polyélectrolytes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le second polyélectrolyte est également porteur de groupements hydrophobes et apte à former, lorsqu'il est mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH allant de 5 à 8, notamment l'eau, des nanoparticules.
Le rapport molaire, noté Z, du nombre de groupements cationiques par rapport au nombre de groupements anioniques dans le mélange des deux polyélectrolytes selon l'invention est de préférence compris entre 0,1 et 2,2, de préférence entre 0, 1 et 2, plus particulièrement entre 0,4 et 1 ,5.
Le rapport Z reflète la charge globale des nanoparticules et peut, en particulier, être proche de zéro, ce qui peut s'avérer particulièrement intéressant dans certaines applications.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le rapport molaire Z est compris entre 0,9 et 1,1 , illustrant des nanoparticules proches de la neutralité.
Le rapport molaire Z peut être défini au regard des quantités et de la nature des polyélectrolytes introduits lors de la préparation des nanoparticules selon l'invention, par la formule suivante :
z = (xc2.m2.C2.DP2 /M2 )
(xal ml .Cx .DPX I Mx ) + (xa2.m2.C2.DP2 IM2 )
dans laquelle :
- nii et m2 représentent respectivement les quantités massiques des solutions avant mélange du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique de concentrations massiques respectives en polymère (avant mélange) Ci et C2 ;
- DPi et DP2 représentent respectivement les degrés de polymérisation du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique ;
- Mi et M2 représentent respectivement les masses molaires du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique ;
- xC2 représente la fraction molaire en monomères porteurs de groupements cationiques dans le polyélectrolyte cationique ; - xai et xa2 représentent respectivement les fractions molaires en monomères porteurs de groupements anioniques du polyélectrolyte anionique et du polyélectrolyte cationique. Les nanoparticules peuvent être anioniques, cationiques ou neutres. Au sens de l'invention, on entend par « nanoparticules anioniques », des nanoparticules dont la charge globale à pH neutre est négative ; et par « nanoparticules cationiques », des nanoparticules dont la charge globale à pH neutre est positive.
Par ailleurs, selon un autre aspect de l'invention, les nanoparticules selon l'invention présentent avantageusement une charge électrique globale faible, ce qui permet généralement d'améliorer le temps de circulation après administration intraveineuse.
La charge globale peut être mesurée par toute méthode connue de l'homme de l'art, comme par exemple la mesure du potentiel Zêta à pH neutre.
De préférence, les nanoparticules selon l'invention présentent un potentiel Zêta à pH neutre allant de -20 mV à +20 mV, de préférence allant de -15 mV à +15 mV, de préférence allant de -10 mV à +10 mV.
De préférence, les solutions préparées en étapes (1) et (2) présentent une concentration totale en polyélectrolytes comprise entre 1 et 50 mg/g, de préférence entre 5 et 50 mg/g, en particulier de 7 à 25 mg/g.
De manière avantageuse, la suspension de nanoparticules obtenue à l'issue de l'étape (2) du procédé de préparation décrit ci-dessus, est suffisamment concentrée en nanoparticules, et peut être utilisée telle qu'elle, sans étape ultérieure de concentration.
De manière avantageuse, la suspension de nanoparticules obtenue selon le procédé de l'invention est adaptée à une administration par voie parentérale, en particulier par voie intraveineuse.
De préférence, elle présente une viscosité, mesurée à 20 °C et à une vitesse de cisaillement de 10 s"1, allant de 1 à 500, de préférence de 2 à 200 mPa.s.
La viscosité peut être mesurée à 20 °C, à l'aide d'un appareillage classique, tel que par exemple un rhéo mètre de type contrainte imposée (Gemini, Bohlin) sur lequel a été installée une géométrie de type cône -plan (4 cm et 2° d'angle), en suivant les consignes du fabricant. Selon une autre variante de réalisation, la suspension de nanoparticules obtenue à l'issue de l'étape (2) du procédé de préparation décrit ci-dessus, est soumise à une ou plusieurs étapes de concentration, notamment par ultrafïltration tangentielle ou frontale, centrifugation, évaporation ou lyophilisation.
Selon une autre variante de réalisation, le procédé selon l'invention peut comprendre ultérieurement une étape de déshydratation de la suspension des particules obtenues (par exemple par lyophilisation ou atomisation), afin de les obtenir sous forme de poudre sèche.
De manière avantageuse, les nanoparticules selon l'invention sont stables sous forme lyophilisée. Par ailleurs, elles sont facilement redispersibles après lyophilisation. Ainsi, la suspension de nanoparticules selon l'invention peut être lyophilisée puis reconstituée en solution aqueuse, sans affecter les propriétés des nanoparticules obtenues. La présente invention concerne en outre des nouvelles préparations pharmaceutiques, phytosanitaires, alimentaires, cosmétiques ou diététiques élaborées à partir des compositions selon l'invention.
La composition selon l'invention peut ainsi se présenter sous la forme d'une poudre, une solution, une suspension, un comprimé ou d'une gélule.
La composition de l'invention peut notamment être destinée à la préparation de médicament.
Elle peut être destinée à une administration par voie orale ou par voie parentérale, en particulier par voie parentérale et plus particulièrement par voie sous-cutanée.
L'invention sera mieux expliquée par les exemples ci-après, donnés uniquement à titre d'illustration. EXEMPLES
Exemple 1
Synthèse du polyélectrolyte anionique PA_i : polyglutamate greffé à 5 % de vitamine E et à 4 % en polvéthylène glycol, avec un degré de polymérisation d'environ 100
10 g de poly(acide glutamique) de DP 100 et 0, 19 g de diméthylaminopyridine sont solubilisés dans 160 mL de diméthylformamide (DMF) à 80 °C. Le mélange est agité une nuit à 80 °C, refroidi à 15 °C, puis 1 ,67 g d'a-tocophérol en solution dans 6,5 mL de DMF, 0,285 g de diméthylaminopyridine, 16,2 g de polyéthylène glycol (PEG : MethoxyPEG(CH2)3NH2) de masse 5.000 g/mol en solution dans 32 mL de DMF et 1,8 mL de diisopropylcarbodiimide sont successivement additionnés. Le mélange réactionnel est agité à 15 °C pendant 24 h, puis neutralisé avec de la soude 1 N dans un pied d'eau. La solution obtenue est purifiée par diafiltration et concentrée.
Les taux de greffage en α-tocophérol et en polyéthylène glycol, mesurés par RMN du proton dans le TFA-d, sont respectivement de 5,3 % et 3,8 %.
Le tableau 1 suivant décrit les caractéristiques du polyélectrolyte anionique PAi (les notations pi, qi et si font référence à la formule (I) de la description ; les notations Xpi , xai, xpAGi , DPi sont celles définies dans la description).
Figure imgf000026_0001
Exemple 2
Synthèse du polyélectrolyte cationique PC_i : polyglutamate greffé à 5 % de vitamine E et à 80 % en arginine, avec un degré de polymérisation d'environ 100
La synthèse de ce polymère est décrite notamment dans la demande internationale WO 2008/135563 de la demanderesse.
Le tableau 2 suivant décrit les caractéristiques du polyélectrolyte cationique PCi (les notations p2, q2, r2, s2 et t2 font référence à la formule (II) de la description ; les notations DP2, M2, xp2, xa2, xc2, XPAG2 et MPAG2 sont celles définies précédemment dans la description). TABLEAU 2
Figure imgf000027_0001
Exemple 3
Préparation de particules à base des deux polyélectrolytes PA_i et PC_i pour différentes valeurs de Z.
Le protocole de préparation du complexe polyélectrolyte est le suivant :
Le polyélectrolyte anionique PAi est dilué dans une solution de NaCl 10 mM pour obtenir une masse mi de solution à la concentration massique Ci et est maintenu sous agitation modérée. On verse alors sur cette solution, tout en maintenant l'agitation, une quantité n¾ d'une solution du polyélectrolyte cationique PCi préalablement diluée à une concentration massique C2 dans une solution NaCl 10 mM.
La concentration massique totale C en polyélectrolytes du mélange obtenu est donnée par la formule C = (mi .Ci+m2.C2) (mi+m2).
Le diamètre des nanoparticules obtenues est mesuré par diffusion quasi- élastique de la lumière, tel que décrit précédemment.
La charge globale ZêtaZêta est mesurée par la mesure du potentiel Zêta à pH neutre.
Les valeurs des rapports Z (rapport molaire groupements cationiques/groupement anioniques) et WPAG (rapport massique polyalkylène glycol/polymère total), de la concentration massique totale C en polyélectrolytes dans le mélange, du diamètre et du potentiel Zêta des nanoparticules formées pour différents mélanges des solutions des deux polyélectrolytes PAi et PCi sont rassemblées dans le tableau 3 suivant. TABLEAU 3
Figure imgf000028_0001
Les résultats montrent qu'il est possible d'obtenir, à partir du mélange des polyélectrolytes anionique PAi et cationique PCi conformes à l'invention, des nanoparticules de taille inférieure ou égale à 50 nm, conformément à l'invention.
Exemple 4 (comparatif)
Formulations à base du mélange du polyélectrolyte anionique non greffé par un polyalkylène glycol PA? (polyglutamate greffé à 5 % en vitamine E et avec un degré de polymérisation d'environ 100, sans greffage de polyéthylène glycol) et du polyélectrolyte cationique PCi de l 'exemple 2.
La synthèse de ce polymère est décrite notamment dans la demande internationale WO 03/104303 de la demanderesse.
Le tableau 4 suivant décrit les caractéristiques du polyélectrolyte anionique non pegylé PA2 (les notations pi, qi et si font référence à la formule (I) de la description description ; les notations DPl s M xpl, xai, XPAGI et MPAGI sont celles définies précédemment dans la description).
TABLEAU 4
Caractéristiques Mi
DPi Xpl Xal XPAGI MPAGI (g/mol) (%) (%) (%) (g/mol)
PA2 (p!=5, qi=0, Sl=95) 100 17064 5 95 0 - On prépare d'une manière analogue à l'exemple 3 une quantité mi d'une solution du polyélectrolyte anionique PA2, à la concentration Ci dans une solution de NaCl à 10 mM et une quantité η¾ d'une solution du polyélectrolyte cationique PCi décrit dans l'exemple 2 préalablement diluée à une concentration C2 dans une solution de NaCl à 10 mM. De la même manière que dans l'exemple 3, le polymère cationique PCi est ajouté au polymère anionique PA2.
TABLEAU 5
Figure imgf000029_0001
Les résultats montrent clairement que les nanoparticules obtenues après mélange des polyélectrolytes non porteurs de polyalkylène glycol (WPAG = 0) ont des tailles supérieures à 100 nm, non conformes à l'invention.
Exemple 5
Synthèses d'autres polyélectrolytes anioniques et d'autres polyélectrolytes cationiques, répondant aux formules (I). (Γ) et (II) et (II') selon l'invention
- Synthèse des polyélectrolytes anioniques. PA^ à ΡΑ^ :
• PA3 et PAÔ sont des polyglutamates porteurs de greffons vitamine E et de groupements polyéthylène glycol. Leur synthèse est similaire à la synthèse de PAi proposée dans l'exemple 1.
• PA4, PA5 et PAs sont des polyglutamates porteurs de greffons vitamine E mais sont exempts de groupements polyéthylène glycol. La synthèse de tels polymères est décrite notamment dans la demande internationale WO 03/104303 de la demanderesse.
• PA7 est un polyaspartate porteur de greffons octadécylamine. La synthèse de ce polymère est la suivante :
Etape 1 : un polysuccinimide est synthétisé selon un protocole analogue à celui décrit dans Polymer 1997, 38(18), 4733-4736 en utilisant le L-acide aspartique. Etape 2 : aminolyse avec de la stéarylamine puis hydrolyse des groupements polysuccinimides résiduels, selon un protocole analogue à celui décrit dans Langmuir 2001 , 17, 7501. Le tableau 6 ci-dessous regroupe les caractéristiques des polyélectrolytes anioniques préparés.
TABLEAU 6
Figure imgf000030_0001
- Synthèse des polyélectrolytes cationiques. PC? à PCs :
· PC2 est un polyglutamate porteur de greffons vitamine E mais exempt de groupements polyéthylène glycol et exempt de groupements neutres. Sa synthèse, similaire à la synthèse de PCi proposée dans l'exemple 2, est décrite notamment dans la demande internationale WO 2008/135563 de la demanderesse. · PCe est un polyglutamate porteur de greffons vitamine E, exempt de groupements polyéthylène glycol et porteur de groupements neutres hydroxyethylamino-. Sa synthèse, similaire à la synthèse de PC2, comporte en outre une étape de greffage de l'éthano lamine. Cette étape de greffage est décrite dans la demande internationale WO 2006/079614 de la demanderesse.
• PC7 est un polyglutamate porteur de greffons vitamine E et de groupements polyéthylène glycol mais exempt de groupements neutres. La synthèse de ce polymère est la suivante :
Etape 1 : un polyglutamate greffé à 5 % de vitamine E et à 4 % en polyéthylène glycol est synthétisé en suivant le protocole de l'exemple 1. Etape 2 : le produit de l'étape 1 est acidifié jusqu'à pH=3 puis lyophilisé. 10 g de ce lyophilisât sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 °C. La solution obtenue est refroidie à 0 °C, et 3,15 mL de chloroformiate d'isobutyle, puis 2,7 mL de N- méthylmo holine sont successivement ajoutés. Le mélange est agité 15 min à 0 °C ; on observe la formation d'une suspension laiteuse. En parallèle, 8,36 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 150 mL de NMP et 4,73 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 °C puis refroidie à 0 °C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension d'argininamide, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 °C, puis une nuit à 20 °C. Après ajout de 2,4 mL d'une solution d'HCl IN puis 2,5 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1 ,2 L d'eau. La solution obtenue est purifiée par diafïltration et concentrée.
Le pourcentage d'argininamide greffée, déterminé par RMN du proton dans D20, est de 84 %.
• PC3 et PC4 sont des polyglutamates exempts de greffons vitamine E, porteurs de groupements polyéthylène glycol et de groupements neutres hydroxyethylamino-. La synthèse de PC4 est la suivante :
10 g de poly(acide glutamique) de DP 100 sont solubilisés dans 200 mL de NMP à 80 °C. La solution obtenue est refroidie à 0 °C et 10,5 mL de chloroformiate d'isobutyle puis 9 mL de N-méthylmorpholine sont successivement ajoutés. Le mélange est agité 15 min à 0 °C. En parallèle, 4,75 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 94 mL de NMP et 2,3 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 °C, puis refroidie à 0 °C. A la suspension laiteuse de polymère activé sont ajoutés successivement une solution de 5,46 g de polyéthylèneglycol (PEG) fonctionnalisé par une aminé terminale, de masse 2.000 g/mol (MEPA-20H, vendu par NOF) dans 109 mL de NMP, puis la suspension d'argininamide/triéthylamine et 3,27 g d'éthano lamine (EA). Le mélange réactionnel est agité une nuit à 0 °C. Après l'ajout de 0,93 g d'EA, le mélange réactionnel est agité 5 h à 20 °C. Après ajout de 0,77 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 50 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 500 mL d'eau et le pH est ajusté à 7-7,5 avec de la soude IN. La solution obtenue est purifiée par diafïltration et concentrée. Les pourcentages de PEG 2.000, d'EA et d'argininamide greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 3,70 et 25 %.
La synthèse de PC3 est similaire à celle de PC4, en utilisant des quantités de réactifs adaptées et un polyéthylène glycol de masse 3.000 g/mol.
• PC5 est un polyglutamate exempt de greffons vitamine E mais est porteur de groupements polyéthylène glycol et exempt de groupements neutres. Sa synthèse est similaire à la synthèse de PC3 et PC4 proposée ci-dessus, à l'exception du greffage de Péthanolamine qui n'est pas effectué pour la synthèse de PC5.
• PCs est un polyglutamate exempt de greffons vitamine E et de groupements polyéthylène glycol mais porteur de groupements neutres dihydroxypropylamino-. La synthèse de ce polymère est la suivante :
Le poly(acide glutamique) de DP 100 (62,8 g) est solubilisé dans 1293 g de NMP à 80 °C. La solution obtenue est refroidie à 0 °C et 69,68 g de chloroformiate d'isobutyle puis 51,6 g de N-méthylmorpholine sont successivement ajoutés. Le mélange est agité 15 min à 0 °C. En parallèle, 26,37 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 501,98 g de NMP et 33,2 g d'aminopropanediol (APD) puis 10,79 g de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 °C, refroidie à 0 °C, puis ajoutée à la suspension laiteuse de polymère activé. Le mélange réactionnel est agité pendant 6 h à 0 °C. 7,9 g d'APD sont ensuite ajoutés, puis le mélange réactionnel est agité une nuit à 0 °C. Après ajout de 52 g d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 5,4 L d'eau et le pH est ajusté à 7-7.5. La solution obtenue est purifiée par diafiltration et concentrée. Les pourcentages d'APD et d'argininamide greffés, déterminés par RMN du proton dans D20, sont respectivement de 72 et 18 %.
• PC9 est une polylysine exempte de greffons vitamine E mais porteuse de groupements polyéthylène glycol et exempte de groupements neutres. Sa synthèse est la suivante : 1,5 g de poly-L-lysine sont solubilisés dans 10 mL d'un tampon Hepes 10 mM (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesulfonic acid) et le pH est ajusté à 8,1 avec de la soude 0,1N .
0,628 g d'a-succinimidyloxyglutaryl-ro-methoxy, polyoxyethylene (Sunbright ME-050GS) est alors ajouté et le pH est à nouveau ajusté à 8,1. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant une nuit.
Le mélange réactionnel est purifié par diafiltration et concentré.
Le tableau 7 ci-dessous regroupe les caractéristiques des polymères cationiques
TABLEAU 7
Figure imgf000033_0001
(a) t2 fait référence dans ce cas à des greffons neutres hydroxyéthylamino-
(b) t2 fait référence dans ce cas à des greffons neutres dihydroxypropylamino-
Exemple 6
Formulations issues du mélange de polvélectrolvtes anioniques PA et polvélectrolytes cationiques PC préparés dans l 'exemple 5.
Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de NaCl 10 mM pour obtenir une solution à la concentration Ci .
Le polyélectrolyte cationique PC est dilué dans une solution de NaCl 10 mM pour obtenir une solution à la concentration C2.
Le procédé diffère ensuite dans l'ordre d'ajout selon que le mélange final visé est en excès de charge anionique ou en excès de charge cationique : - pour des mélanges visés avec un excès de charge anionique (essais e 3.1 à e 3.9 dans le tableau 8) une masse η¾ de polyélectrolyte anionique PA à la concentration Ci est placée dans un bêcher sous agitation modérée et une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC à la concentration C2 est alors ajoutée.
- pour des mélanges visés avec un excès de charge cationique (essai e 3.10 dans le tableau 8), une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC à la concentration C2 est placée dans un bêcher sous agitation modérée et une masse mi du polymère anionique PA à la concentration Ci est alors ajoutée.
Le tableau 8 ci-dessous rassemble les masses et concentrations engagées dans les mélanges ainsi que les caractéristiques de ces mélanges.
TABLEAU 8
Figure imgf000034_0001
Les résultats montrent qu'il est possible d'obtenir, à partir du mélange des polyélectrolytes anionique et cationique conformes à l'invention des nanoparticules de taille inférieure à 50 nm. Exemple 7
Formulations selon l'invention incorporant comme actif de l 'hormone de croissance humaine recombinante (rhGH).
La rhGH est mélangée dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique 5 PA et le complexe PA/rhGH ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le
polyélectrolyte cationique PC. Plus précisément :
Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans un tampon phosphate à 20 mM et mélangé à une solution contenant 4,3 mg/g de rhGH (Biosidus P161) de façon à avoir un mélange PA/rhGH ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une 10 concentration Cpi en protéine rhGH. Le mélange est laissé pendant 12 h à température
ambiante sous agitation modérée.
Une masse mj de ce mélange PA/rhGH est ajoutée à une masse m2 de polyélectrolyte cationique à la concentration C2. Le mélange final a une concentration totale en polymère C (calculée comme dans l'exemple 3) et une concentration en protéine
Figure imgf000035_0001
La concentration en actif non associé aux polyélectrolytes est déterminée en analysant le mélange final par chromatographie d'exclusion stérique (colonnes G4000 + G2000 SWXL - tampon PB S dilué au dixième - débit de 0,5 mL/min). Dans tous les cas, le pic correspondant au temps d'élution de la rhGH non associée n'est pas détecté : la 20 fraction de rhGH non associé est donc < 1 %.
Le tableau 9 ci-dessous décrit les masses et concentrations engagées dans le mélange ainsi que les caractéristiques de ce mélange.
25 TABLEAU 9
Essais Polymères mi Ci Cpi m2 c2 CP C Z WpAG Diamètre Zêt
(g) (mg/g) (mg/g) (g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) en volume (m\
(rhGH) (rhGH) (nm) e 4.1 PAe/PCz 10,15 5,00 0,28 18,26 5,01 0, 10 5,01 0,71 0, 14 22 - 1 e 4.2 PAe/PCz 20,21 5,03 0,27 18,26 5,02 0, 14 5,03 0,43 0,20 43 - 6 e 4.3 PAe/PCs 8,70 3,02 0,34 21,42 5,90 0, 10 5,07 0,71 0,07 55 - 2 Les résultats montrent que les formulations selon l'invention incorporant de la protéine rhGH et des polyélectrolytes conformes à l'invention sont composées de nanoparticules de taille inférieure à 50 nm.
Exemple 8
Formulations selon l'invention incorporant comme actif de l'hormone de croissance humaine recombinante (rhGH) et concentrée par deux méthodes : ultrafiltration et lyophilisation/reconstitution.
Une fraction de la formulation décrite dans l'essai e 4.2 de l'exemple 7 (avec les polyélectrolytes PA^ et PC2) est lyophilisée à l'aide d'un lyophilisateur de paillasse (CHRIST Alpha 2-4 LP plus) pendant 24 heures. La poudre lyophilisée est ensuite dispersée dans l'eau de façon à avoir une solution environ 20 fois plus concentrée que la solution de l'essai e 4.2 précédent. Une solution colloïdale homogène est obtenue en moins de 5 minutes.
Une autre fraction de la formulation est concentrée d'un facteur 10 environ par ultrafiltration frontale sur une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa.
Les caractéristiques des solutions avant et après concentration sont rassemblées dans le tableau 10 ci-dessous.
TABLEAU 10
Figure imgf000036_0001
Les résultats montrent clairement que les formulations selon l'invention peuvent aisément être concentrées sans que la taille des particules ne soit modifiée. Exemple 9
Formulations selon l'invention incorporant comme actif la calcitonine du saumon (sCT).
La sCT est mélangée dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique PA et le complexe PA/sCT ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le polyélectrolyte cationique PC. Plus précisément :
Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de tampon phosphate 10 mM et mélangé à une solution contenant 10 mg/g de sCT (Polypeptide Laboratories AB) de façon à avoir un mélange PA/sCT ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une concentration Cpl en protéine sCT. Le mélange est agité pendant 1 h à température ambiante avec un barreau magnétique.
Le procédé diffère ensuite dans l'ordre d'ajout selon que le mélange final visé est en excès de charge anionique ou en excès de charge cationique :
- pour des mélanges visés avec un excès de charge anionique (essais e 5.1 et e 5.2 dans le tableau ci-dessous), une masse η¾ du mélange précédent PA/sCT est placée dans un bêcher sous agitation modérée et une masse n¾ de polyélectrolyte cationique PC préalablement dilué à la concentration C2 est alors ajoutée sur le mélange ;
- pour des mélanges visés avec un excès de charge cationique (essai e 5.3 dans le tableau ci-dessous), une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC préalablement dilué à la concentration C2 est placée dans un bêcher sous agitation modérée et une masse mi du mélange précédent PA/sCT est alors ajoutée sur le mélange.
Le mélange final a une concentration en polymère total C et une concentration en protéine Cp.
La concentration en actif non associé aux polyélectrolytes est déterminée après séparation par ultracentrifugation sur des ultrafïltres ayant un seuil de coupure de 30 kDa et dosage des filtrats par HPLC. Elle est dans tous les cas strictement inférieure à 5 %.
Les caractéristiques des polyélectrolytes anioniques et cationiques utilisés pour cet exemple sont décrites dans l'exemple 5. TABLEAU 11
Figure imgf000038_0001
Exemple 10
Formulations selon l'invention incorporant comme actif la calcitonine du
5 saumon (sCT).
La sCT est mélangée dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique PA et le complexe PA/sCT ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le polyélectrolyte cationique PC. Plus précisément :
Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de NaCl à 10 mM
10 et mélangé à une solution contenant 10 mg/g de sCT (Polypeptide Laboratories AB) de
façon à avoir un mélange PA/sCT ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une concentration Cpi en protéine sCT. Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante.
Une masse mi du mélange précédent PA/sCT est placée dans un bêcher sous 15 agitation modérée et une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC préalablement dilué à
la concentration C2 est alors ajoutée sur le mélange.
Le mélange final a une concentration en polymère total C et une concentration en protéine Cp.
Les polyélectrolytes anioniques et cationiques utilisés pour cet exemple sont 20 respectivement les polyélectrolytes PA4 et PC7 décrits dans l'exemple 5.
TABLEAU 12
Essais Polymères m. Ci Cpi m2 c2 CP C Z WpAG Diamètre Zêl
(g) (mg/g) (mg/g) (g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) en volume (m1
(sCT) (sCT) (nm) e 5.4 PA4/PC7 10,00 1,00 0,10 14,30 6,00 0,040 3,94 2,06 0,36 27 -1: Les résultats montrent que les formulations selon l'invention incorporant de la calcitonine du saumon et des polyélectrolytes selon l'invention sont composées de nanoparticules de taille inférieure à 50 nm. Exemple 11
Formulations selon l'invention incorporant comme actif l'insuline humaine recombinante (INS).
L'insuline est mélangée dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique PA et le complexe PA/INS ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le polyélectrolyte cationique PC. Plus précisément :
Une solution mère d'INS (Biocon) est préparée de la manière suivante :
0,36 g d'INS sont dissous dans 9 g d'eau distillée, la solution est agitée pendant 10 minutes à 250 rpm avec un barreau aimanté. La solution est acidifiée par ajout de 2,66 g d'une solution d'acide chlorhydrique à 0,1 N, puis agitée à 500 rpm pendant 15 minutes. 3,98 g d'une solution d'hydroxyde de sodium à 0,1 N sont alors ajoutés sous agitation à 500 rpm, puis après 15 minutes sont ajoutés 3,90 g d'eau distillée pour obtenir une concentration finale en INS de 17,54 mg/g (compte tenu du % d'eau présent dans la poudre d'insuline).
Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de chlorure de sodium à 10 mM et mélangé à la solution mère d'insuline contenant 17,54 mg/g de INS (Biocon) de façon à avoir un mélange PA/sCT ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une concentration Cp en protéine INS. Le mélange est agité pendant 20 h à température ambiante sous agitation modérée.
Sur une masse de ce mélange PA/INS placée dans un bêcher est ajoutée sous agitation une masse η¾ de polyélectrolyte cationique préalablement dilué à la concentration C2 avec une solution de NaCl à 10 mM. Le mélange final a une concentration en polymère total C (calculée comme précédemment) et une concentration en protéine Cp (calculée comme précédemment).
La concentration en actif non associé aux polyélectrolytes est déterminée après séparation par ultracentrifugation sur des ultrafïltres ayant un seuil de coupure de 50 kDa et dosage des filtrats par HPLC. La concentration en actif non associé dans ces conditions est de 8 % environ. Les polyélectrolytes anioniques et cationiques utilisés pour cet exemple sont respectivement les polyélectrolytes PA4 et PC7 décrits dans l'exemple 5.
TABLEAU 13
Figure imgf000040_0001
5
Les résultats montrent que les formulations selon l'invention incorporant de l'insuline humaine recombinante et des polyélectrolytes selon l'invention sont composées de nanoparticules de taille inférieure à 50 nm.
10 Exemple 12
Formulations selon l 'invention incorporant comme actif l 'exenatide.
L'exenatide est mélangé dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique PA et le complexe PA/exenatide ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le polyélectrolyte cationique PC. Plus précisément :
15 Le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de NaCl à 10 mM puis mélangé à une solution contenant 10 mg/g d' exenatide (Assia Chemical Industries LTD) de façon à obtenir un mélange PA/exenatide ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une concentration Cp en exenatide. Le mélange est agité pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation modérée.
20 A une masse mi du mélange précédent PA/exenatide est ajoutée sous agitation modérée une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC préalablement diluée dans une solution de NaCl à 10 mM à la concentration C2.
Le mélange final a une concentration C en polymère total et une concentration 25 Cp en protéine calculées comme précédemment. TABLEAU 14
Figure imgf000041_0001
Exemple 13
Formulations selon l'invention incorporant comme actif le fulvestrant
Le fulvestrant est mélangé dans un premier temps avec le polyélectrolyte anionique PA et le complexe PA/fulvestrant ainsi obtenu est mélangé dans un deuxième temps avec le polyélectrolyte cationique PC.
Plus précisément, le polyélectrolyte anionique PA est dilué dans une solution de NaCl à 10 mM et mélangé avec du fulvestrant en poudre (ScimoPharm Taiwan) de façon à obtenir un mélange PA/fulvestrant ayant une concentration Ci en polyélectrolyte anionique PA et une concentration Cpi en fulvestrant. Le mélange est agité pendant 24 h à 30°C sous agitation modérée.
Une masse mi du mélange précédent PA/fulvestrant est ajoutée sous agitation à une masse m2 de polyélectrolyte cationique PC préalablement dilué dans une solution de NaCl à 10 mM à la concentration C2.
Le mélange final a une concentration C en polymère total et une concentration Cp en principe actif calculées comme précédemment.
Les caractéristiques des polyélectrolytes anioniques et cationiques utilisés pour cet exemple sont décrites dans l'exemple 5.
TABLEAU 15
Essais Polymères mi Ci Cpi m2 c2 C Z WPAG Diamètre Zêl
(g) (mg/g) (mg/g) (g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) en (m>
(fulvestrant) (fulvestrant) volume
(nm) e 8.1 PA8/PC7 10,45 2,01 0,1 11,50 9,96 0,05 6,18 2.08 0,33 26 10 Exemple 14
Mesures de la viscosité des formulations selon l 'invention.
Une fraction de la formulation décrite dans l'essai e 1.7 de l'exemple 3 (avec les polyélectrolytes PAi et PCi) est lyophilisée à l'aide d'un lyophilisateur de paillasse (CHRIST Alpha 2-4 LP plus). La poudre lyophilisée est ensuite dispersée dans l'eau de façon à avoir une solution environ 10 fois plus concentrée que la solution de l'essai e 1.7. Une solution colloïdale homogène est obtenue en moins de 5 minutes.
La viscosité est mesurée à 20 °C, à une vitesse de cisaillement de 10 s"1, à l'aide d'un rhéomètre de type contrainte imposée (Gemini, Bohlin) sur lequel a été installée une géométrie de type cône-plan (4 cm et 2° d'angle).
TABLEAU 16
Figure imgf000042_0001
Les résultats montrent que les formulations selon l'invention sont suffisamment fluides pour permettre leur injection par voie parentérale, et en particulier par voie sous-cutanée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Nanoparticule formée d'au moins un actif et d'au moins deux polyélectrolytes de polarité opposée possédant un squelette linéaire polyaminoacide et présentant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2.000, caractérisée en ce que : au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux hydrophobes ;
au moins l'un des deux polyélectrolytes est porteur de groupements latéraux polyalkylène glycol ;
lesdites nanoparticules présentant un diamètre moyen allant de 10 à 100 nm, et comprenant une quantité en groupements polyalkylène glycol telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05.
2. Nanoparticule selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par mélange d'une solution d'un premier polyélectrolyte avec une solution d'un second polyélectrolyte de polarité opposée, lesdits premier et second polyélectrolytes étant tels que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05.
3. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport molaire Z du nombre de groupements cationiques par rapport au nombre de groupements anioniques portés par les polyélectrolytes anionique et cationique mis en œuvre est compris entre 0,1 et 2, plus particulièrement entre 0,4 et 1,5.
4. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est compris entre 0,05 et 0,75, en particulier entre 0,05 et 0,6, notamment entre 0,05 et 0,5 et de préférence entre 0,05 et 0,3.
5. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la taille des nanoparticules varie de 10 à 70 nm, de préférence de 10 à 50 nm.
6. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polyélectrolyte porteur de groupements latéraux hydrophobes est apte à former spontanément, lorsqu'il est mis en dispersion dans un milieu aqueux de pH allant de 5 à 8, notamment l'eau, des nanoparticules.
7. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polyélectrolyte anionique est de formule (I) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000044_0001
dans laquelle :
- Ra représente un atome d'hydrogène, un groupe acyle linéaire en C2 à C10, un groupe acyle ramifié en C3 à C10, un groupe pyroglutamate ou un groupement hydrophobe G tel que défini ci-après ;
- Rb représente un groupe -NHR5 ou un résidu acide aminé terminal lié par l'azote et dont le carboxyle est éventuellement substitué par un radical alkylamino -NHR5 ou un alcoxy -OR6, dans lequel :
• R5 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à C10, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, ou un groupe benzyle ;
• R6 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à C10, un groupe alkyle ramifié en C3 à C10, un groupe benzyle ou un groupement G ;
- G représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadécényloxy-, tocophéryl- et cholestéryl-;
- PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol,
• Si correspond au nombre moyen de monomères de glutamate non greffés, anioniques à pH neutre,
• i correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement hydrophobe G, et • qi correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
pi et qi pouvant être éventuellement nuls,
- le degré de polymérisation DPi = (si + pi + qi) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement allant de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150,
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (I) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
8. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit polyélectrolyte anionique est de formule (Γ) suivante ou l'un de ses sels harmaceutiquement acceptables,
Figure imgf000045_0001
dans laquelle :
- G' représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyl-, dodécyl-, tétradécyl-, hexadécyl-, octadécyl- et 9-octadécényl-;
• Si = (si' + Si ") correspond au nombre moyen de monomères d'aspartate non greffés, anioniques à pH neutre,
• Pi = (pi + Pi") correspond au nombre moyen de monomères d'aspartate porteurs d'un groupement hydrophobe G' et peut être éventuellement nul,
- le degré de polymérisation DPi = (si + pi) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement allant de 20 à 450, en particulier de 20 à 250, et notamment de 20 à 150,
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (Γ) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
9. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit polyélectrolyte cationique est de formule (II) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptable,
Figure imgf000046_0001
dans laquelle :
Ra représente un atome d'hydrogène, un groupe acyle linéaire en C2 à do, un groupe acyle ramifié en à do, un groupe pyroglutamate ou un groupement hydrophobe G tel que défini ci-après ;
Rb représente un groupe -NHR5 ou un résidu acide aminé terminal lié par l'azote et dont le carboxyle est éventuellement substitué par un radical alkylamino -NHR5 ou un alcoxy -OR6, dans lequel :
• R5 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à
C10, un groupe alkyle ramifié en à do, ou un groupe benzyle ;
• R6 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle linéaire en Ci à C10, un groupe alkyle ramifié en d à C10, un groupe benzyle ou un groupement G ;
- G représente un groupement hydrophobe choisi parmi : octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryl- et cholestéryl-;
- PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol,
- R2 représente un groupement cationique, en particulier l'argininamide lié par la fonction aminé ;
- R3 représente un groupement neutre choisi parmi : hydroxyéthylamino-, dihydroxypropylamino- liés par la fonction aminé ; • S2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate non greffés, anioniques à pH neutre,
• p2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement hydrophobe G,
• q2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
• Γ2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement cationique R2,
• t2 correspond au nombre moyen de monomères de glutamate porteurs d'un groupement neutre R3,
s2, p2, q2 et t2 pouvant être éventuellement nuls, et
- le degré de polymérisation DP2 = (s2 + P2 + q2 + r2 + t2) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement varie de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150 ;
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (II) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
10. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit polyélectrolyte cationique est de formule (ΙΓ) suivante ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptable,
Figure imgf000047_0001
(ΙΓ) dans laquelle :
• X" représente un contre-anion, en particulier un ion chlorure, acétate ou ammonium, • PAG représente un polyalkylène glycol, de préférence présentant une masse molaire allant de 1.800 à 6.000 g/mol, en particulier un polyéthylène glycol, notamment de masse molaire allant de 2.000 à 6.000 g/mol,
• q2 correspond au nombre moyen de monomères de lysine porteurs d'un groupement polyalkylène glycol,
• r2 correspond au nombre moyen de monomères de lysine non greffés, cationiques à pH neutre,
q2 pouvant être éventuellement nuls, et
- le degré de polymérisation DP2 = (q2 + r2) est inférieur ou égal à 2.000, en particulier inférieur à 700, plus particulièrement varie de 40 à 450, en particulier de 40 à 250, et notamment de 40 à 150 ;
- l'enchaînement des monomères de ladite formule générale (ΙΓ) peut être aléatoire, de type monobloc ou multibloc.
11. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi du polyélectrolyte anionique en groupements hydrophobes varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI du polyélectrolyte anionique en groupements polyalkylène-glycol est nulle ;
■ la fraction molaire xp2 du polyélectrolyte cationique en groupements hydrophobes est nulle ; et
■ la fraction molaire XPAG2 du polyélectrolyte cationique en groupements polyalkylène-glycol varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
12. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 9 à 10, caractérisée en ce que, les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ;
■ la fraction molaire xp2 est nulle ; et
■ la fraction molaire XPAG2 est nulle.
13. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 9, caractérisée en ce que les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ; ■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ;
■ la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et
■ la fraction molaire XPAG2 est nulle.
14. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI est nulle ;
■ la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et
■ la fraction molaire XPAG2 varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
15. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 9, caractérisée en ce que les polyélectrolytes anionique et cationique sont tels que :
■ la fraction molaire xpi varie de 2 à 22 %, en particulier de 4 à 12 % ;
■ la fraction molaire XPAGI varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 % ;
■ la fraction molaire xp2 varie de 5 à 20 %, en particulier de 5 à 10 % ; et ■ la fraction molaire XPAG2 varie de 2 à 10 %, en particulier de 2 à 6 %.
16. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit actif est une molécule d'intérêt thérapeutique, cosmétique, prophylactique ou d'imagerie.
17. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins des nanoparticules telles que définies selon l'une quelconque des revendications précédentes.
18. Procédé de préparation de nanoparticules telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes consistant à :
(1) disposer d'une solution aqueuse comprenant des nanoparticules d'un premier polyélectrolyte à l'état chargé, porteur de groupements latéraux hydrophobes, lesdites nanoparticules étant associées de manière non covalente à un actif ;
(2) mettre en présence ladite solution (1) avec au moins un second polyélectrolyte de polarité opposée à celle du premier polyélectrolyte, de manière à former lesdites nanoparticules,
avec au moins l'un desdits premier et second polyélectrolytes possédant des groupements latéraux polyalkylène glycol, la quantité desdits groupements polyalkylène glycol étant telle que le rapport massique WPAG de polyalkylène glycol par rapport au polymère total est supérieur ou égal à 0,05 ;
lesdits premier et second polyélectrolytes possédant un squelette linéaire polyaminoacide et présentant un degré de polymérisation inférieur ou égal à 2.000.
1 . Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdits premier et second polyélectrolytes sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications 3, 4 et 6 à 15.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 et 19, caractérisé en ce que la solution aqueuse (1) est obtenue par ajout de l'actif à une solution colloïdale aqueuse du premier polyélectrolyte, possédant en particulier une valeur de pH allant de 5 à 8, ledit actif s'associant de manière non covalente aux nanoparticules dudit premier polyélectrolyte.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que l'étape (2) comprend au moins :
- la préparation d'une solution aqueuse du second polyélectrolyte, en particulier de valeur de pH allant de 5 à 8, et avantageusement de valeur de pH identique à celle de la solution aqueuse de l'étape (1) ; et
- le mélange de ladite solution aqueuse du second polyélectrolyte avec ladite solution aqueuse de l'étape (1).
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