WO2012060594A2

WO2012060594A2 - 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물

Info

Publication number: WO2012060594A2
Application number: PCT/KR2011/008205
Authority: WO
Inventors: 전라옥; 류재하; 천예진; 박병현
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Chonbuk National University; Sookmyung Womens University SWU
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Chonbuk National University; Sookmyung Womens University SWU
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-10-31
Publication date: 2012-05-10
Anticipated expiration: 2013-05-05
Also published as: WO2012060594A3; KR20120048250A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적 으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적 으로 허용가능한 염은 섬유아세포형 윤활막세포와 교원질 유도 관절염 마우스 모델 에서 염증성 질환을 유발하는 NF-κB의 활성을 감소시키고, 부종 및 통증을 효과적 으로 저해함으로써, 류마티스 관절염 등의 염증성 질환을 예방 및 치료하는 데 유 용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의명칭】

티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물 【기술분야】

<1> 본 발명은 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유 효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다.

<2>

【배경기술】

<3> 류마티스 관절염 (RA)이란 윤활막 조직 내로 염증 세포가 침투하여 관절을 파괴하는 만성적이고 진행성인 자가면역질환으로， 비가역적 관절손상， 만성통증， 강직과 기능적 손상을 일으키는 만성 염증성 전신질환이다 (Smolen JS, Aletaha D, Koeller M, Weisman MH, Emery P (2007) New thera ies for treatment of rheumatoid arthritis. Lancet 370(9602)： 1861-1874).

<4>

<5> 이러한 관절 염증에 관련된 주요 전사 경로 중 하나는 nuclear factor- κ

B(NF- B) 경로이다 (Mclnnes IB, Schett G (2007) Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol 7(6)： 429-442) .

<6> 구체적으로， 관절 내에서 섬유아세포형 윤활막 세포 (fibroblast-like synoviocytes: FLS) 및 염증세포는 인터루킨— 1β (ILᅳ 1β) 및 종양 괴사 인자 -α (TNFa)와 같은 염증성 사이토카인을 생산한다. 이러한 사이토카인은 NF-κΒ를 활 성화시키고 또한 이에 의해 사이토카인의 발현이 증가함으로써 염증을 심화시킨다 .

<?> 염증성 매개체의 예로는 사이토카인， RANTES 및 와 ENA— 78과 같은 케모카인 및 유착 분자 (adhesion molecule)를 포함한다.

<8>

<9> 또한， FLS 내의 NF-κΒ 활성은 매트릭스 메탈로프로테이나제 (醒 P)의 발현을 증가시킴으로서 류마티스 관절염의 증상에 영향을 미친다.

<ιο> 현재 20 여종 이상의 MMP가 보고되어 있고， 이중 醒 P-1과匪 P-3는 조직 파괴 의 주효소로 알려져 있다 (Campbell IK, Gerondakis S, O'Donnell K, Wicks IP (2000) Distinct roles for the NF- κ Bl (p50) and c— Rel transcription factors in infla隱 atory arthritis. J Clin Invest 105(12) ： 1799-1806) .

<ii> NF-κΒ는 류마티스 관절염 환자들 및 교원질유도 관절염 (collagen- induced arthritis, CIA) 마우스의 윤활막 조직에서 정상 대조군의 윤활막과 비교 시 활성 이 증가되는 것으로 보고되었으며 (Handel ML, McMorrow LB, Gravallese EM (1995) Nuclear factor- B in rheumatoid synovium. Local izat ion of p50 and p65. Arthritis Rheum 38(12)： 1762-1770； Hah YS, Lee YR, Jun JS, Lim HS, Kim HO, Jeong YG et al . (2010) A20 suppresses inflammatory responses and bone destruction in f ibroblast-1 ike synoviocytes and col lagen- induced arthritic mice. Arthritis Rheum 62(8): 2313-2321)， 이러한 NF-κΒ의 활성화는 현재 임상적 으로 사용되는 글루코코르티코이드， 아스피린， 금 염 , 레플루노미드， 메토트렉사이 트 등의 여러 항류머티즘 약물에 의해 억제된다 (Tomita T, Takeuchi E, Tomita N, Mor ishita R, Kaneko , Yamamoto K et al . (1999) Suppressed severity of col lagen- induced arthritis by in vivo transfect ion of nuclear factor Β decoy o 1 i godeoxynuc 1 eot i des as a gene therapy. Arthritis Rheum 42(12): 2532- 2542).

<i2> 또한， 관절 내의 NF-κΒ 유인 올리고뉴클레오티드 (NF-κΒ decoy olionucleotide) 또는 우성적인 음성 ΙκΒ 카이네이즈 β (dominant negative I Β kinase β)의 아데노바이러스 유전자 전이의 주입은 마우스 내의 교원질유도 관절 염 (CIA)올 억제한다 (Hah YS, Lee YR, Jun JS, Lim HS, Kim HO, Jeong YG et al. (2010) A20 suppresses inflammatory responses and bone destruct ion in fibroblastᅳ like synoviocytes and col lagen- induced arthritic mice. Arthritis Rheum 62(8)： 2313-2321).

<13> 따라서 관절 염증에 관련된 주요 전사 경로로서 염증세포 활성화에 관여하 는 NF-κΒ의 활성을 억제함으로써 류마티스 관절염을 포함하는 염증성 질환을 효과 적으로 치료 또는 개선시킬 수 있다.

<14>

<15> 이에 본 발명자들은， NF-κΒ의 활성을 억제하는 화합물을 개발하기 위하여 연구하던 중， 1-(4-(2— (10-H-페녹사진 -10-일)에록시)페닐) -3-메틸티오우레아가 섬 유아세포형 윤활막세포 (FLS)와 교원질유도 관절염 마우스 모델에서 NF-κΒ의 활성 을 감소시키고, 부종 및 통증을 억제하는 활성을 확인함으로써， NF-κΒ 관련 염증 성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 알아내고， 본 발명을 완성 하였다.

16> 【발명의 내용】

【기술적 과제】

<17> 본 발명의 목적은 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공 하는데 있다.

<18> 본 발명의 다른 목적은 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가 능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물 을 제공하는데 있다.

<19>

【기술적 해결방법】

<20> 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 티오우 레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염 증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<21> 또한， 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물을 유효성분 으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

<22> [화학식 1]

【유리한 효과】

<25> 본 발명에 따른 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 은 섬유아세포형 윤활막세포와 교원질유도 관절염 마우스 모델에서 염증성 질환을 유발하는 NF-κΒ의 활성을 감소시키고， 부종 및 통증을 효과적으로 저해함으로써， 류마티스 관절염 등의 염증성 질환을 예방 및 치료하는 데 유용하게 사용할 수 있 다.

<26>

【도면의 간단한 설명】

<27> 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 NF-κΒ DNA 결합 저해 활성을 전기 이동 교대 분석 (electrophoretic mobiloty shift assay, EMSA)에 의해 분석 한 그래프이다.

<28> 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 p65 및 p50의 결합 저해 및 Ικ

Βα 분해 저해활성을 나타내는 웨스턴 블롯 분석이다.

<2 > 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 ΙΚΚα 및 ΐΚΚβ의 인산화 저해 활성을 나타내는 웨스턴 블롯 분석이다.

<30> 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 MMP-1 및 ΜΜΡ— 3의 저해활성을 효소결합면역흡착검사 ( enzyme- 1 inked immunosorbent assay, ELISA)법으로 즉정한 결과이다.

<3i> 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 ENA-78 및 RANTES의 저해활성을 효소결합면역흡착검사 (enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)법으로 측정한 결과이다. 도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 섬유아세포형 윤활막세포 (FLS) 증식 저해활성을 BrdU 함입 분석 (BrdU incorporation assay)홀 이용하여 측정한 결과이다.

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모델 에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 사진이다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따론 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모델 에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 관절염 발생율의 결과이다.

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모델 에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 임상평가 (clinical score) 결과이다. 도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 뒷발의 부종을 측정한 결과이다.

도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 MMP-1 및 ffiP-3의 저해활성을 나타내는 웨스턴블롯 분석 결과이다.

도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 방사선사진이다.

도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 방사성 점수 그래프이다.

도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 관절염 증상 개선 효과를 나타내는 조직병리학적 사진이다.

도 15는 본.발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 파골세포 분화를 나타내는 사진이다. <42> 도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 파골세포 수를 계수한 그래프이다.

<43> 도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 NF-κΒ DNA 결합 저해 활성을 전기 이동 교대 분석에 의해 분석한 그래프 이다.

<44> 도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 p65 및 p50의 결합 저해 및 ΙκΒα 분해 저해활성을 나타내는 웨스턴 블 롯 분석 결과이다. _,

<45> 도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 관절 조직 내의 사이토카인의 생성 저해활성올 나타내는 결과이다.

<46> 도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 교원질유도 관절염 마우스 모 델에서의 혈청 내의 사이토카인의 생성 저해활성을 나타내는 그래프이다.

<47>

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

<48> 이하， 본 발명을 상세히 설명한다.

<49>

<50> 본 발명은 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조 성물을 제공한다: <51> 【화학식 1】

<52> 상기 화합물의 일반 화학명은 1-메틸 -3-[4-(2-페녹사진 -10-일에톡시)페닐]티 오우레아 (1-methyl—3— [ 4一 ( 2-phenoxaz i n_ 10— y 1 ethoxy ) pheny 1 ] t h i our ea )이다.

<53>

<54> 본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며， 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산， 질산， 인산， 황산, 브롬화수소산, 요드 화수소산ᅳ 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이 트， 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트， 방향 족 산류， 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러 한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트， 피로설페이트， 바이설페이트, 설파이트， 바이설파이트， 니트레이트, 포스페이트， 모노하이드로겐 포스페이트， 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트， 피로포스페이트 클로라이드， 브로마이드， 아이오다이 드， 플루오라이드， 아세테이트， 프로피오네이트, 데카노에이트， 카프릴레이트， 아 크릴레이트， 포메이트， 이소부티레이트， 카프레이트， 헵타노에이트， 프로피올레이 트， 옥살레이트, 말로네이트ᅳ 석시네이트， 수베레이트, 세바케이트， 푸마레이트， 말리에이트， 부틴— 1,4-디오에이트， 핵산 -1，6_디오에이트， 벤조에이트， 클로로벤조 에이트， 메틸벤조에이트， 디니트로 벤조에이트， 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조 에이트， 프탈레이트， 테레프탈레이트， 벤젠설포네이트, 를루엔설포네이트， 클로로 벤젠설포네이트， 크실렌설포네이트， 페닐아세테이트， 페닐프로피오네이트， 페닐부 티레이트， 시트레이트， 락테이트， β-하이드록시부티레이트， 글리콜레이트， 말레이 트， 타트레이트， 메탄설포네이트， 프로판설포네이트, 나프탈렌 -1-설포네이트， 나프 탈렌 -2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법， 예를 들면， 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수흔화성 유기 용매， 예를 들면 메탄 올, 에탄을, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또 한 이 흔합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한， 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알 칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산 화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과 하고， 여액을 증발， 건조시켜 얻는다. 이때， 금속 염으로는 나트륨， 칼륨 또는 칼 슴염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한， 이에 대옹하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염 (예， 질산은)과 반웅시켜 얻는다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이의 이성질체 또는 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 또는 수화 물을 모두 포함한다. <59>

<60> 또한， 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 시판되는 것을 사용하거나 유기합성분야에서 알려진 통상의 합성방법을 이용하여 합성된 것을 사용할 수 있 다.

<6i> 일례로， 본 발명에 따른 화합물은 문헌 [Cheon YJ, Gim HJ, Jang HR, Ryu JH,

J eon R (2010) Synthesis of heterocyte-1 inked thioureas and their inhibitory activities of NO product ion in LPS activated macrophages. Bull Korean Chem Soc 31(1)： 27-30.]의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

<62>

<63> 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 염증 질환의 주요 신호전달계 중 하 나인 NFᅳ κΒ의 활성을 감소시키고 ΙκΒα의 분해를 감소시키며 다양한 사이토카인 생성을 억제하는 활성을 나타냄으로써, 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사 용될 수 있다.

<64> 이때 상기 염증성 질환은 천식， 치주염， 구내염， 복막염， 위염， 장염， 관절 염， 류마티스 관절염， 신장염， 간염 및 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택 되는 어느 하나일 수 있으며， 류마티스 관절염인 것이 바람직하다.

<65>

<66> 또한， 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환 또는 이의 합병증의 치료방법을 제공한다. 나아가， 본 발명은 대사성 질환 또는 이의 합병증의 예방 또는 치료에 사용 되는 상기 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가 능한 염을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아 니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제， 환제， 경 /연질 캅셀제， 액제， 현탁 제， 유화제， 시럽제 , 과립제， 엘릭시르제 (elixirs) 등이 있는데 , 이들 제형은 상 기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제ᅳ 증량제， 습윤제， 붕해제， 활택 제， 결합제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕 해제로는 한천， 전분， 알긴산 또는 이의 나트륨염， 무수인산일수소 칼슘염 등이 사 용될 수 있고， 활택제로는 실리카， 탈크， 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염， 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트， 전분 페이스트， 젤라틴， 트라가칸스， 메틸샐를로오스， 나트륨 카복시 메틸셀를로오스， 폴리비닐피를리딘， 저치환도 하이드록시프로필셀를로오스 등이 사 용될 수 있다. 이외에도 락토즈， 덱스트로오스， 수크로오스, 만니를， 소르비를， 셀 를로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며， 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 흔합물， 흡수제， 착색제， 향미제， 감미제 등을 함께 사용할 수 있다. <72> 또한， 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며 , 비경 구 투여는 피하주사제， 정맥주사제， 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하 는 방법에 의한다. 이때， 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 안정제 또는 완층제와 함께 물에 서 흔합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고， 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여 형으로 제조할 수 있다.

<73>

<74> 상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제， 안정화제， 수화제 또는 유화 촉진 저 1， 삼투압 조절을 위한 염， 완충제 등의 보조제， 및 기타 치료적으로 유용한 물질 을 함유할 수 있으며 , 통상적인 방법인 흔합， 과립화 또는 코탕 방법에 따라 제제 화할 수 있다. 필요한 경우， 본 발명에 따른 상기 조성물은 기타의 약제， 예를 들 면， 다른 치료제와 조합하여 투여할 수도 있다.

<75>

<76> 본 발명의 상기 조성물올 단위 용량 형태로 제형화하는 경우， 유효성분으로 서 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 약 0.1 ~ 1,500 mg의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중， 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나， 성인 치 료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 ~ 500 mg 범위가 보 통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로 분리하여 하루 에 보통 약 5 ~ 300 mg의 전체 투여량이면 층분할 것이나， 일부 환자의 경우 더 높 은 일일 투여량이 바람직할 수 있다. -^

<77>

<78> 본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체， 부형 제 및 회석제를 더 포함할 수 있다.

<79> 본 발명에 따른 조성물은， 각각 통상의 방법에 따라 산제， 과립제， 정제， 캡 슐제， 현탁액, 에멀견， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형， 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체， 부형제 및 회석제로는 락토즈， 덱스트로즈, 수크로스， 솔비를， 만니를， 자일리를, 에리스리를， 말티를， 전분， 아카시아 고무, 알지네이트， 젤라틴, 칼슘 포스페이트， 칼슘 실리케이트， 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 미정질 샐를로스， 폴리비 닐 피롤리돈， 물， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트 , 탈크， 마그 네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

<80> 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제 결합제, 습윤제， 붕해 제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며^'， 이러한 고형제제 는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 탄산칼슴

(calcium carbonate), 슈크로스 (sucrose) 또는 락토오스 ( lactose)， 젤라틴 등을 섞 어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트， 탈크 같은 윤활 제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제， 시럽제 등 이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조 제제， 좌제가 포함된다. 비수성용제， 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴 리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을레이트와 같은 주사 가 능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로 골， 트원 (tween) 61， 카카오지, 라우린지， 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다. <81> 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며， 비경구 투여법이 라면 어느 것이나 사용 가능하고， 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나， 전신 투 여가 더 바람직하며， 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

<82> 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서， 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로， 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루 에 한번 투여할 수도 있고， 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<83>

<84> 또한， 상기 화학식 1로 표시되는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하 는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

<85> 본 발명에 따른 조성물은 염증 질환의 주요 신호전달계 중 하나인 NF-ΚΒ의 활성을 감소시키고 ΙκΒα의 분해를 감소시키며 다양한 사이토카인 생성을 억제하 는 활성을 나타냄으로써， 염증 질환의 예방 및 개선을 목적으로 상기 화학식 1의 화합물을 식품， 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

<86> <87> 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식 품의 예로는 드링크제， 육류， 소시지 빵， 비스킷， 떡， 초콜릿， 캔디류， 스낵류, 과자류， 피자， 라면， 기타 면류， ¾류， 아이스크림류를 포함한 낙농제품， 각종 스 프， 음료수， 알코을 음료 및 비타민 복합제， 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

<88> 본 발명의 화학식 1의 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있 다. 유효 성분의 흔합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결 정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은^' 전체 식품 중량의

0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며， 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상 의 양으로도 사용될 수 있다.

<89> 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같 이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어， 포도당, 과당 등; 디사 카라이드， 예를 들어 말토스， 슈크로스 등 ; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트 린， 시클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미게 (사카린， 아 스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 여러 가지 영양제， 비타민 , 광물 ( 전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈， 초콜 릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점저 1， _PH 조절제, 안정화제， 방부제， 글리세린， 알코을， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

단， 하기의 실시예는 본 발명올 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 1-메틸 -3-[4-(2-페녹사진 -10-일에특시)페닐]티오우레아 (1- methyl-3-[4-(2-phenoxazin-10-ylethoxy)phenyl ] thiourea)^) 제조

화합물은 문헌 [Cheon YJ, Gim HJ, Jang HR, Ryu JH, J eon R (2010) Synthesis of heterocyte一 linked thioureas and their inhibitory activities of NO product ion in LPS activated macrophages . Bull Korean Chem Soc 31(1): 27- 30.]의 방법으로 제조하였다.

<98> 구체적으로， 출발 분자인 페녹사진을 N-하이드록시에틸화시킨 후， 그 결과 생성된 알코을을 메실화시킴으로써 대응되는 메실레이트를 얻었다.

<99> 상기 메실레이트와 P-니트로페닐의 알킬화 반웅을 염기 존재하에서 수행하여 니트로 화합물을 얻고 이를 수소기압 하에서 팔라듐촉매를 사용한 수소화반웅으로 아민으로 환원시킨다. 이후 상기 아민을 메틸 이소티오시아네이트와 축합반응시켜 화학식 1의 목적화합물을 얻었다.

<ιοο> 수득한 상기 화학식 1의 화합물을 디메틸 설폭사이드에 50 mM로 용해시켜 사 용하였다.

<10)>

<102> <실시예 1>류마티스 관절염-섬유아세포형 윤활막세포 (RA-FLS) 내의 NF-KB 활성 측정

<103> 본 발명에 따른 화합물이 배양된 RA-FLS 내 NF-KB 신호 전달에 미치는 영향 을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<104>

<i05> (1) ?1체 RA-FLS의 분리 및 배양

<i06> RA-FLS는 전체 관절 교체 수술 또는 윤활막 절제술을 받는 류마티스 관절염 을 가진, 미국 류머티스학과의 개정된 기준올 만족하는 12명의 환자의 1차 윤활막 조직으로부터 분리되었다. 세포들은 추가 배양 후 세포 분화 4—8 (passages four to eight)에 있는 것을 사용하였다. 세포들은 37^°C 및 C0₂를 함유하는 인큐베이 터에서 10% 소 태아혈청 (FBS), 2 mM 글루타민， 100 units/ml 페니실린， 100 yg/ml 스트랩토마이신， 및 2.5 yg/ml 암포테리신 B가 첨가된 높은 글루코스 함유 둘베코 변형 이글 배지 (high glucose-containing Dulbecco' s modified Eagle' s medium) 에서 배양되었다 ·

<107> 모든 환자들로부터 고지에 입각한 동의를 얻었고， 연구 계획은 전북대학병원 윤리위원회에 의해 승인되었다.

<108>

<109> (2) TNFa 유도 NF-κΒ 활성 측정

<ιιο> 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 FLS (2><10^&)에 제조예 1에서 제조된 화 합물 10 μΜ을 1 시간 동안 전처리한 후， TNFa (10 ng/ml)로 처리하였다. <ιιι> 3시간 동안 배양 후 NF-κΒ DNA 결합 활성을 전기 이동 기동성 교대 분석

(EMSA)에 의해 분석하였다.

<ιΐ2> 구체적으로， 상기 RA-FLS (2X10⁶)을 PBS에 넣고 원심분리법에 의해 두번 세 척한 후， 5분간 500 g의 펠렛으로 타정하였다. 다음으로 상기 펠렛을 CytoBuster 단백질 추출 완충액 (Novagen, Madison, WI， USA)에 용해시켰다. NEᅳ PER 핵 및 세포 질 추출제 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 세포질 및 핵 추출물을 제조하 였다.

<H3> RA-FLS로부터 제조된 핵 추출물은 내생 단백질 활성을 저해하기 위해 프로테 이나제 저해제 칵테일 (Calbiochem, San Diego, CA, USA)을 처리하였다. <Π4> 이후, K -사슬 결합사이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 (5'-

CCGGTTMCAGAGGGGGCnTCCGAG-3')를 합성하여 겔 지연 (gel retardation) 분석을 위한 프로브 (probe)로서 사용하였다. 이후 두 대응 가닥은 열처리하여 α-32Ρ- dCTP로 표지하였다. 표지된 올리고뉴클레오티드， 10 의 핵 추출물, 및 결합 완 층액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 500 mM KC1 , 10 mM EDTA, 50% 글리세를， 100 ng Poly[dI-dC], 1 mM 디티오트레이틀)을 흔합하여 최종 부피가 20 μ I 가 되도록 한 다음， 상온에서 30 분 동안 배양하였다. 다음으로 반응 흔합물을 4% 폴리아크릴아 미드 겔상에서 전기영동하여 분석하였다. 상기 겔은 건조시켜 방사능사진법으로 측 정하였다. NF-κΒ에 대한 DNA-단백질 상호작용의 특징은 비표지된 올리고뉴클레오 티드를 50배 초과하여 사용한 경쟁 분석에 의해 확인하였다.

<115> 측정 결과를 도 1에 나타내었다 .

<Π6> 도 1에 나타낸 바와 같이 , NF-κΒ 공통배열에 대한 p65 서브유닛의 결합 활 성은 TNFa 자극이 없는 세포에 비해 TNFa 유도된 RA-FLS에서 증가하였다. 이와는 반대로， 본 발명에 따른 화합물이 처리된 RA-FLS로부터 제조된 핵 추출물에는 핵 자리 옮김 (shifting) 및 NF-κΒ의 DNA 결합이 현저하게 감소되는 것으로 나타났 다.

<117> 따라서， 본 발명에 따른 티오우레아계 화합물은 염증 세포를 활성화시키는

NF-κΒ의 DNA 결합을 효과적으로 저해하기 때문에， NF-κΒ의 활성에 의해 유발되는 류마티스 관절염 등의 염증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<118>

<!19> <실시예 2>류마티스 관절염-섬유아세포형 윤활막세포 (RA-FLS) 내의 여러 단 백질의 활성 측정

<i2()> 본 발명에 따른 화합물이 배양된 RA-FLS 내 ΙκΒα 및 ΙΚΚ 단백질에 미치는 영향올 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<ΐ2ΐ> 류마티스 관절염 환자로부터 분리한 FLS(2X10⁶)에 제조예 1에서 제조된 화 합물 10 μΜ를 1시간 동안 전처리한 후ᅳ TNFa (10 ng/ml)로 처리하였다.

<122> 3 시간 동안 배양 후 p65, p50, I κΒα , IKK a , ΙΚΚβ， ρ-ΙΚΚα , ρ-ΙΚΚβ , 醒 Ρ-1 및 ΜΜΡ-3 단백질의 결합 활성을 웨스턴블롯에 의해 분석하였다.

<123> 구체적으로， RA-FLS(2X10⁶)를 단백질 추출용액 (Pro-Prep, Intron

Biotechnology, Sungnam, Korea)에 프로테아제 및 인산화제 저해제와 함께 넣고 균 질화시켰다. 30 의 단백질이 함유된 균질화물을 10% 소듬 도데실 설페이트 -폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 이동시켰다. β-액틴 (β-actin) 및 증식성 세포 핵 항원 (PCNA)는 각각 세포질 단백 질 및 핵 단백질용 로딩 컨트롤 (loading control)로서 사용되었다.

<124> p50, p65, I κΒα , PCNA, 및 β-액틴 (모두 Santa Cruz Biotechnology 제，

Santa Cruz, CA, USA), IKK α, ΙΚΚβ , p-IKKa , 및 p— Ι Κβ (모두 Cell Signaling 제， Beverly, MA, USA)에 대한 1 yg/ml의 1차 항체를 이용하여 블롯이 분석되었 다.

<125> 분석 결과를 도 2 내지 도 3에 나타내었다.

<126> 도 2는 p50, _P65 및 IicBa에 대한 웨스턴블롯 분석 결과이고， 도 3은 IKK α , ΙΚΚβ , ρ-ΙΚΚα , 및 ρ-ΙΚΚβ에 대한 웨스턴블롯 분석 결과이다. <i27> 상기 ΙκΒα 는 ΙκΒβ와는 달리 RA-FLS 내에서 사이토카인 유도 NF-κΒ 활 성화에 주로 참여한다 (Lee et al .， 2009) . 따라서 , 본 발명자들은 TNF α 처리에 따른 세포질 일부에서 ΙκΒα 단백질 분해를 관찰하였다.

<128> 그 결과， 도 2에 나타낸 바와 같이, TNFa 자극이 없는 .세포에 비해 TNFa

유도된 RA-FLS에서 p65 및 p50 서브유닛의 핵 이동이 증가하였으며， 세포질 내 I κ Βα 분해는 증가하는 것으로 나타났다. 그러나， 본 발명에 따른 화합물이 처리된 RA-FLS로부터 제조된 핵 추출물에는 ΙκΒα단백질 분해가 현저하게 억제되는 것으 로 나타났다.

<129>

<13(» 다음으로， 본 발명자들은 ΙκΒ 인산화에 필요한 ΙΚΚ 활성화에 대하여 웨스턴 블롯을 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, TNFa 자극이 없는 세포에는 본 발 명에 따른 화합물은 IKK 활성화에 아무런 영향을 미치지 않았으나， TNFa 유도된 RA-FLS에서는 ΙΚΚα 및 ΙΚΚβ의 인산화를 감소시키는 것으로 나타났다.

<13!> 따라서， 본 발명의 화합물은 ΙκΒα단백질 분해를 저해하고， ΙΚΚα 및 ΙΚΚβ

의 활성을 저해함으로써 이후 NF-κΒ의 활성을 저해하는 것으로 사료된다.

<132>

<133> <실시예 3>류마티스 관절염-섬유아세포형 윤활막세포 (RA-FLS) 내의 MMP 활 성 및 케모카인 생성 축정

<134> 본 발명에 따른 화합물이 배양된 RA-FLS 내 丽 P 활성 및 케모카인 생성에 미 치는 영향올 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. .

<135> 류마티스 관절염 환자로부터 FLS에 제조예 1에서 제조된 화합물 10 μΜ를 48 시간 동안 전처리한 후， TNFa (10 ng/ml)로 24시간 동안 노출시켰다.

<136> 무세포 배양 상청액 내 MMP-1 및 MMP-3, 및 ENA-78 및 RANTES의 존재를 단백 질 결합 면역흡착제법 (ELISA)으로 평가하였다.

<137> 구체적으로， 상청액 내의 謹 TES, ENA-78, 및 匪 P-3 준위를 Quantikine

ELISA 키트 (R&D Systems 제， Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였으며，醒 P-1은 플루오로카인 E 인간 활성 MMP-1 형광 분석 키트 (R&D Systems 제)를 이용 하여 제조사가 권장하는 방법에 따라 형광분석함으로써 정량화하였다.

##

<138> 측정치는 평균土표준오차 (SEM)로 나타내었으며， 이때， p < 0.01 vs. 비처 리 대조군; "pO.01 vs. TNFa이다. <139> 측정 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다 .

<140> 도 4에 나타난 바와 같이， TNFa와 함께 RA-FLS를 배양했을 때는 상청액 내 匪 P-1생산은 3.4배 증가하고，應 P-3의 생산은 3.5배 증가하는 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 화합물을 전처리한 경우에는 TNFa 매개된 MMP— 1 및 MMP-3 생산은 각각 68.4% 및 77.8% 감소되었다.

<i4i> 또한， 케모카인 생산에 있어서는 도 5에 나타낸 바와 같이， TNFa와 함께

RA-FLS를 배양했을 때는 상청액 내 RANTES 생산은 5.1배 증가하고， ENA-78의 생산 은 13.3배 증가하는 것으로 나타났으나， 본 발명에 따른 화합물을 전처리한 경우에 는 TNFa 매개된 케모카인 생산은 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.

<142> 따라서, 본 발명에 따른 티오우레아계 화합물은 TNFa 매개된 薩 P군 및 케모 카인 생산을 현저하게 저해하므로, 류마티스 관절염 등의 염증 질환의 예방 및 치 료에 유용하게 사용될 수 있다.

<143>

<144> <실시예 4> 류마티스 관절염-섬유아세포형 윤활막세포 (RA-FLS) 내의 TNFa 유도 세포증식 측정

<i45> TNFa는 생체 외 (in vitro) 조건에서 RA-FLS의 증식을 촉진시키며， NF-κΒ를 포함하는 신호 전달 경로를 통해 작용하는 것으로 알려져 있다 (Youn et al. , 2002) .

<ΐ46> 따라서， 본 발명에 따른 화합물이 RA-FLS 내의 TNFa 유도 세포증식에 미치 는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. ·

<147> 류마티스 관절염 환자로부터 FLS 1X10⁵)에 제조예 1에서 제조된 화합물 10 μΜ를 1 시간 동안 전처리한 후， TNFa (10 ng/ml)로 72시간 동안 노출시켰다.

<]48> 세포 증식은 BrdU 함입 분석을 이용하여 측정하였으며， 이는 세포 증식 효소 가 링크된 면역흡착제 분석 (BrdU 키트; Amersham Biosciences, Pi scat away, NJ, USA)으로서， 제조자가 권장하는 방법에 따라 DNA 합성 동안 BrdU의 함입을 측정하 기 위해 사용되었다.

<149> 구체적으로， 72 시간 동안 TNFa로 처리한 후， BrdU (10 μΜ)를 상기 배양된 배지에 2시간 동안 첨가하여， BrdU 표지된 세포를 고정시키고， 상온에서 30분 동안 접착액에 DNA를 넣고 변성시켰다. 이후， 상기 세포를 상온에서 2시간 동안 퍼옥시 다제 결합된 항 BrdU 항체로 배양시켰다. 그 결과 생성된 면역복합체를 3，3',5，5',- 테트라메틸벤지딘 기질 반웅을 이용하여 검출하였으며， 흡광도를 405 nm에서 측정 하였다.

<i50> 측정치는 평균土표준오차 (SEM)로 나타내었으며， 이때， p < 0.01 vs. 비처 리 대조군; "pO.Ol vs. TNFa이다. <151> 측정 결과를 도 6에 나타내었다.

<152> 도 6에 나타낸 바와 같이， 72 시간 동안 TNFa 처리후 세포 증식 활성은 대 조군에 비하여 141.3 土 2.4%로 현저하게 증가하였다 (ρθ.01). · 그러나 본 발명에 따른 화합물을 첨가할 경우， TNFa-처리 RA-FLS의 증식 활성을 110.6±4.7%로 감소 시킴을 알 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화합물 자체로는 TNFa 유도 증식 활성 에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

<153> 따라서， 본 발명에 따른 화합물은 TNF 유도 A-FLS 내에서 NF-κΒ의 활성을 저해하여 이로 인한 RA-FLS의 증식 활성을 감소시키므로 NF-κΒ에 의해 유발되는 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료에 유용하게 사 용될 수 있다.

<154>

<155> <실시예 5>교원질유도 관절염 마우스 모델에서의 본 발명에 따른 티오우레 아계 화합물의 효과

<156> 본 발명에 따른 화합물의 생체 내 염증 질환에 대하여 미치는 효과를 알아보 기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<157>

<158> (1) 교원질 유도 관절염 마우스 제조 <i59> 오리엔트 바이오 (한국， 서울)에서 병원균 없는 수컷 DBA/1 마우스를 구입하 였다. 마우스들은 층류 캐비닛에서 12시간 빛 /어둠 순환으로， 표준 실험실 사료로 자유급식을 유지하면서 사육되었다. 이 실험에서 사용된 모든 실험은 전북대학교에 있는 연구용 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인 하에 이루어졌다.

<160> 이후， 수컷 DBA/1 마우스 (7-9주령)를 150 의 소의 Π형 교원질

(collagen)으로 면역화시키고， 동량의 완전 프로인트 면역보강제 (complete Freund's adjuvant , Chondrex, Redmond, WA, USA)로 유화시켰다.

<161> 1차 면역화 날짜를 0일로 정의하였다.

<162> 이후 상기 마우스들은 20일째에 화학식 1의 화합물 (100 y l의 옥수수유 내

5 mg/kg 체중)의 또는 담체를 단회 복강내 주사하였다. 그런 다음， 21일째에 동량 의 프로인트 면역보강제로 유화된 소의 Π형 교원질에 의해 활성화시켰다.

<163>

<164> (2) 교원질 유도 관절염 마우스의 관절염 증상 관찰

<165> 이후 시간이 지남에 따라 마우스의 관절염 증상을 관찰하껴 도 7 및 도 8에 나타내었다.

<166> 도 7은 본 발명에 따른 화합물을 투여하지 않거나 투여 후의 관절염 증상을 관찰한 사진이고， 도 8은 본 발명에 따른 화합물을 투여하지 않거나 투여 후의 21 일째부터 44일째까지의 상기 마우스의 관절염의 누적발생율을 백분율로서 나타낸 그래프이다.

<167> 도 7에 나타낸 바와 같이， 담체가 주입된 마우스는 교원질에 의해 관절염의 증상이 유도되어 붓고， 홍반이 생기며， 발목 경직이 일어나는 데 반하여 본 발명에 따른 화합물을 주입한 마우스는 정상 마우스와 같이 관절염의 증상이 나타나지 않 았다.

<168> 또한, 도 8에 나타낸 바와 같이， 담체가 주입된 마우스는 교원질에 의해 관 절염의 증상이 유도되어 44일 후에는 90% 이상이 관절염이 발생하였으나， 본 발명 에 따른 화합물을 투여한 마우스는 관절염의 누적발생율이 20%. 이하로 매우 낮은 것으로 나타났다.

<169>

<170> (3) 교원질 유도 관절염 마우스의 관절염 지수 측정

<i7i> 21일째부터 44일째까지의 임상적 관절염 점수를 도 9에 나타내었다.

<172> 상기 임상적 점수는 각 마디마다 0-3의 범위로 결정하였다: 0급， 붓기 없음;

1급， 붓고 홍반생김; 2점， 현저히 부음; 3급， 심하게 부음 및 /또는 관절 경직.

<173> 또한， 뒷발 두께로서 가장 넓은 곳에서 발목 관절을 가로질러 위치한 곳을 전기 캘리퍼스로 측정하였다. 0일에서 특정 시간 후에 관절염성 발목의 직경 증가 를 발 두께 지수로 정의하였고， 이 측정치는 백분율로서 나타내었다. 21일째부터 44일째까지의 발 두께 지수를 도 10에 나타내었다.

<174> 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이， 담체가 주입된 마우스는 교원질에 의해 관절염의 증상이 유도되어 시간이 지날수록 임상적 관절염 점수가 증가하는 것으로 나타났고， 발 두께 지수 또한 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 본 발 명에 따른 화합물을 투여한 마우스는 관절염 증상이 완화되는 것으로 나타났다.

<175>

<176> (4) 교원질 유도 과절염 마우스의 조직병리학 평가 <177> 45일째에 담체 또는 본 발명에 따른 화합물을 투여한 마우스들을 회생시킨다 음， 뒷발의 윤활막 조직을 각 동물로부터 조직 끝부분까지 회수하여， 다음과 같은 실험을 수행하였다.

<178> 1) MMP군 측정

<!79> 상기 담체 또는 본 발명에 따른 화합물을 투여한 마우스의 관절 조직의 MMP-

1 및 丽 P-3 단백질의 결합 활성을 웨스턴블롯에 의해 분석하였다.

<!80> 구체적으로， 상기 관절 조직을 단백질 추출용액 (Pro-Prep, Intron

Biotechnology, Sungnam, Korea)에 프로테아제 및 인산화제 저해제와 함께 넣고 균 질화시켰다. 30 yg의 단백질이 함유된 균질화물을 10% 소듐 도데실 설페이트 -폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 이동시켰다. β-액틴 (β-actin)는 세포질 단백질용 로딩 컨트롤로서 사용되었다.

<i8i> MMP-1 및 ΜΜΡ-3 단백질 (모두 R&D Systems제)에 대한 1 yg/ml의 1차 항체를 이용하여 블롯이 분석되었다.

<182> 분석 결과를 도 11에 나타내었다.

<183> 도 11에 나타낸 바와 같이， 본 발명에 따른 화합물의 첨가는 MMPᅳ 1 및 MMP-3

단백질의 결합을 억제하는 것으로 나타났다.

<184>

<185> 2) 교원질 유도 관절염 마우스의 발 관찰

<186> 45일째에 담체 또는 본 발명에 따른 화합물을 투여한 마우스들의 뒷발을 절 단한 다음 방사선 사진으로 촬영하여 도 12에 나타내었다 .

<187> 상기 방사진 사진으로는 직접 검출 플랫 패널 배열 디자인을 기반으로 하는 유방조영술 영상화기 (Mamiranat Novat i onDR , Siemens Medical Solutions, Er 1 angen , Germany)를 이용하여 30 kVp 및 90 mA의 노출 세팅으로 발의 평면 방사선사진을 얻 었다.

<188> 모든 영상은 상술한 점수 시스템 (Joosten LA, He 1 sen 廳， Saxne T, van De

Loo FA, Heinegard D, van Den Berg WB (1999) ILᅳ 1 α β blockade prevents cartilage and bone destruction in murine type II col lagen- induced arthritis, whereas TNF- a blockade only ameliorates joint inflammation. J Immunol 163(9)： 5049-5055.)에 따라 평가하였다.

<189> 관절 파괴 및 골 부식 정도는 0-5점 내에서 평가되었으며， 이때 0 = 손상 없 음; 1 = 하나의 광점으로 측정되는 약한 골 손상; 2 = 하나의 지역 내에 2-4개의 점이 존재하는 보통 변화; 3 = 많은 지역 내에 2-4개의 점이 존재하는 현저한 변 화; 4 = 관절에 영향을 미치는 심각한 부식, 및 5 = 관절의 완전 부식이다.

<190> 평균 방사성 점수는 도 13에 나타내었다.

<i9i> 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이， 담체가 주입된 마우스는 관절 파괴， 관절 변이， 및 전체 발목 범위에 대하여 비가역적 골 증식이 일어나는 전형적인 교원질 유도 관절염을 나타내었으나， 본 발명에 따른 화합물을 주입한 경우에는 골 파괴가 현저히 감소하였으며， 평균 방사성 점수 또한 현저히 줄어든 것으로 나타났다.

<192>

<193> 3) 윤활막 조직 염색

<194> 45일째에 담체 또는 본 발명에 따른 화합물을 투여한 마우스들의 뒷발을 절 단하여 형광현미경 관찰을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 사프라닌 -0 또는 TRAP 로 염색하였다.

<195> 염색된 부분은 형광현미경으로 관찰하여 도 14에 나타내었다.

<1%> 도 14에 있어서, 각 사프라닌 0 염색된 부분의 네모 영역은 TRAP 염색된 부 분에서 더 높은 배율로 확대하여 나타냈으며， 이때 TB는 경골 (tibia), TL은 복사뼈 (talus)를 나타낸다. 형광현미경의 배율은 헤마록실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 사 프라닌 -0 염색은 100배， TRAP 염색은 200배이다.

<197> 도 14에 나타난 바와 같이， 담체가 주입된 마우스의 발목 관절은 윤활액 증 식， 연골 손상, 판누스 (pannus) 형성， 및 골 부식이 나타났으나， 본 발명에 따른 화합물을 주입한 경우에는 관절염에 대하여 현저한 개선이 일어난 것으로 나타났 다.

<198>

<199> 4) 파골세포 분화

<200> 구체적으로， 상기 관절 조직을 본 발명의 화학식 1의 화합물의 제시된 농도 에서 BMM를 M-CSF (30 ng/ml) 및 RANKL (50 ng/ml)로 4일 동안 배양하였다. 세포들 을 3.7% 포르말린으로 고정시키고， 0.1% Triton X-100을 투과시킨 후， TRAP 용액으 로 염색하였다.

<20i> 파골세포는 타트레이트 저항성 산 인산화제 (TRAP)의 활성에 따라 변색됨으 로써 시각화된다. 이를 형광현미경으로 관찰하여 도 15에 나타내었으며, TRAP-양성 세포를 파골세포로서 계수하여 도 16에 나타내었다.

<202> 측정치는 평균士표준오차 (SEM)로 나타내었으며， 이때， p < 0.01 vs. 비처 리 대조군이다.

<203> 파골세포는 M-CSF 및 RANKL의 존재하에서 마우스 B匪으^부터 생성된다. 그 러나， 도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물을 주입시 농도 에 의존하여 상기 파골세포 분화가 감소됨을 알 수 있다.

<204>

<2(⁾5> <실시예 6>교원질 유도 관절염 마우스 모델에서의 본 발명에 따른 티오우레 아계 화합물의 NF-κΒ 신호 전달 억제 측정

<206> 마우스들은 20일째에 화학식 1의 화합물 (100 μ ΐ의 옥수수유 내 5 mg/kg 체 중)의 또는 담체를 단일 복강내 주사하였다. 그런 다음， 21일째에 동량의 프로인트 면역보강제로 유화된 소의 Π형 교원질에 의해 활성화시켰다. 이후, 관절 균질화물 을 24일째에 제조하였다.

<207> 상기 관절 균질화물을 가지고 NF-κΒ DNA 결합 활성을 실시예 1과 동일한 방 법으로 전기 이동 기동성 교대 분석 (EMSA)에 의해 분석하여 도 17에 나타내었고， p65, p50, 및 Ι κΒα 단백질의 결합 활성을 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴블 롯에 의해 분석하여 도 18에 나타내었다. PCNA 및 β-액틴은 핵 단백질 및 세포질 단백질용 로딩 컨트롤로서 사용되었다.

<208> 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이， 생체 내 실험에 있어서도 상기 생체 외 실험과 마찬가지로 담체를 투여한 마우스에서는 관절염이 발생하여 NF-KB 활성이 증가하고, Ι κΒα의 분해가 일어나나， 본 발명에 따른 화합물올 투여시 NF- KB 활 성 및 ΙκΒα의 분해가 감소됨을 알 수 있다.

<209> <210> <실시예 7>교원질 유도 관절염 마우스 모델에서의 본 발명에 따른 티오우레 아계 화합물의 전염증성 사이토카인 생산 억제 측정

<2ΐι> 마우스들은 20일째에 화학식 1의 화합물 (100 μΐ의 옥수수유 내 5 mg/kg 체 중)의 또는 담체를 단일 복강내 주사하였다. 그런 다음， 21일째에 동량의 프로인트 면역보강제로 유화된 소의 Π형 콜라겐에 의해 활성화시켰다. 이후， 45일째에 상기 마우스들의 뒷발 및 혈청을 수집하여 관절 균질화물 및 혈청 내 다양한 사이토카인 (TNF α , IL-Ιβ , RANKL, IL-17 등)을 특정 효소 결합된 면역흡착제 분석 (ELISA)으 로 측정하여 각각 도 19 및 도 20에 나타내었다. -

<212> 도 19에 나타낸 바와 같이， 담체 투여된 교원질 유도 관절염 마우스와 비교 하여 본 발명에 따른 화합물이 투여된 마우스의 관절 조직에서는 TNFa, IL-Ιβ , RANKL 및 IL-17의 현저한 감소가 나타났다. 류마티스 관절염은 시스템적인 자가면 역 질환이므로 도. 20에 나타낸 바와 같이， TNFa 및 IL-Ιβ 준위는 혈청에서도 측 정되었고， 본 발명에 따른 화합물이 투여된 마우스의 혈청은 관절 조직에서 나타난 바와 같이 TNFa 및 IL-Ιβ 준위를 현저하게 감소시킴을 알 수 있다.

<213> 따라서 , 본 발명에 따른 화합물은 TNFa 및 IL-Ιβ과 같은 사이토카인의 생 성을 효과적으로 억제하므로 류마티스 관절염과 같은 염증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<214>

<215> <제제예 1> 정제의 제조 (직접 가압)

<216> 화학식 1의 화합물 5.0 rag

<2i7> 락토오스 14.1 rag <2i > 크로스포비돈 USNF 0.8 mg

<2i > 마그네슘 스테아레이트 0.1 mg

<220> 통상적인 정제의 제조 방법에 따라， 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하 여 균일하게 흔합하고 가압하여 정제를 제조하였다.

<221>

<222> <제제예 2> 정제의 제조 (습식 조립)

<223> 화학식 1의 화합물 5.0 rag

<224> 락토오스 16.0 mg

<225> 녹말 4.0 mg

<226> 프리솔베이트 80 0.3 mg

<227> 실리콘 다이옥사이드 2.7 mg

<228> 마그네슘 스테아레이트 2.0 mg

<229> 화학식 1의 화합물을 체로 친 후, 락토오스와 녹말을 흔합하였다. 이후， 폴 리솔베이트를 순수한 물에 녹인 녹인 후， 적당량을 활성성분， 락토오스 및 녹말 흔 합물에 첨가한 다음 미립화하였다. 건조 후에 미립을 제질한 후， 콜로이달 실리콘 다이옥사이드 및 마그네슘 스타아레이트와 흔합하였다. 미립을 가압하여 정제를 제 조하였다.

<230>

<231> <제제예 3> 캅샐제의 제조

<232>

<233> *화학식 1의 화합물 5.0 mg <234> 락토오스 14.8 Illg

<235> 폴리비 닐피를리돈 10.0 nig

<236> 마그네슘 스테아레이트 0.2 lllg

<237> 통상적 인 캅샐제의 제조 방법 에 따라， 상기 성 분들을 제시 된 함량으로 첨가 하여 균일하게 흔합한 후 적 절한 크기 의 젤라틴 갑셀에 층진하여 목적하는 캅셀제 를 제조하였다 .

<238>

<239> <제제예 4> 주사제의 제조

<240> 화학식 1의 화합물 100 nig

<24i> 만니를 180 mg

<242> Na₂HP0₄ · 12H₂0 26 mg

<243> 증류수 2974 mg

<244> 통상적 인 주사제의 제조 방법에 따라， 상기 성분들을 제시 된 함량으로 함유 시 켜 주사제를 제조하였다 .

<245>

<246> <제제예 5> 건강식품의 제조

<247> 화학식 1의 화합물 1000 mg

<248> 비타민 흔합물 적 량

<249> 비타민 A 아세테 이트 70 ! g

<250> 비 타민 E 1.0 rag 비타민 0.13 rag

비타민 B2 0.15 rag

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μ

비타민 C 10 nig

비오틴 10 ig

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 mg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 흔합물 적량

황산제 1철 1.75 mg - 산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 rag

제 1인산칼륨 15 nig

제 2인산칼슘 55 rag

구연산칼륨 90 nig

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 nig

상기의 비타민 및 미네랄 흔합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분 ¬¬직한 실시예로 흔합 조성하였지만 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무 방하며， 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 과립을 제 조하고， 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<271>

<272> <제제예 6> 건강 음료의 제조

<273> 화학식 1의 화합물 1000 nig

<274> 구연산 1000 mg

<275> 올리고당 100 g

<276> 매실농축액 2 g

<277> 타우린 1 g-

<278> 정제수를 가하여 전체 900 mi

<279>

<280> 통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 약 1시간 동 안 85에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 21 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 넁장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

<281> 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만 수요계층이나， 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따 라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<282>

<283> <제제예 7> 기타 건강식품의 제조

<284> 7-1. 음료의 제조

<285> 꿀 522 nig 05 치옥토산아미드 5 nig

니코틴산아미드 10 mg

염산리보플라빈나트륨 3 mg

염산피리독신 2 nig

이노시를 30 mg

오르트산 50 mg

화학식 1의 화합물 0.48~1.28 mg

물 200 nd

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

7-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36~76.76 %

화학식 1의 화합물 0.24 0.64 %

후르츠향 1 ¾>

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉 ¾올 제조하였

7-3. 캔디의 제조

설탕 50-60 % <306> 물엿 39.26-49.66 %

<307> 화학식 1의 화합물 0.24-0.64 %

<308> 오렌지향 0.1 %

<309> 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

<310>

<3ΐι> 7-4. 밀가루 식품의 제조

<312> 화학식 1의 화합물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고， 이 흔합물을 이용하여 빵， 케이크， 쿠키， 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식 품을 제조하였다.

<313>

<314> 7-5. 유제품 (dairy oroducts)의 제조

<315> 화학식 1의 화합물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고， 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<316>

<317> 7-6. 선식의 제조

<318> 현미， 보리， 참쌀， 율무를 공지의 방법으로 알파화 시켜서 건조한 것을 배전 한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 검은콩， 검정깨， 들깨도 공지 의 방법으로 찌서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하 였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명의 화학식 1의 화합물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

<319> <320> 30 %

<321> 율무 15 %

<322> 보리 20 %

<324> 검정콩 7 %

<325> 검은깨 7 %

<326> 화학식 1의 화합물 3 %

<327> 영 0.5 %

<329>

Claims

【청구의 범위】【청구항 11 화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물:

[화학식 1]

【청구항 2]

제 1항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 NF-i B의 활성을 감소 시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

【청구항 3】

제 1항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 ΙΚΚα 및 ΙΚΚ 의 활성 의 활성 및 I_KBa의 분해를 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

【청구항 4】

제 1항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 TNFa 매개된 醒 P-1 및 丽 P-3 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

【청구항 5】

제 1항에 있어서， 상기 염증성 질환은 천식， 치주염， 구내염， 복막염， 위염， 장염， 관절염， 류마티스 관절염， 신장염， 간염 및 퇴행성 질환으로 이루어진 군으 로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물,

【청구항 6】

제 5항에 있어서， 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 염중성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.

【청구항 7】

화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물:

[화학식 1]

【청구항 8)

제 7항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 NF— κΒ의 활성을 감소 시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물.

【청구항 9】

제 7항에 있어서 , 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 ΙΚΚα 및 ΙΚΚβ의 활성 의 활성 및 ΙκΒα의 분해를 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물.

【청구항 10】

제 7항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 TNFa 매개된 匪 P-1 및 丽 P-3 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식 품 조성물.

【청구항 11】

제 7항에 있어서， 상기 염증성 질환은 천식， 치주염， 구내염， 복막염， 위염， 장염， 관절염， 류마티스 관절염， 신장염， 간염 및 퇴행성 질환으로 이루어진 군으 로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강식품 조성물.

【청구항 12]

제 11항에 있어서， 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하 는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강식품 조성물.

【청구항 13]

화학식 1로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환 또는 이의 합병증의 치료방법 .

[화학식 1]

【청구항 14】

대사성 질환 또는 이의 합병증의 예방 또는 치료에 사용되는 하기 화학식 1 로 표시되는 티오우레아계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.

[화학식 1]