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WO2011139032A2 - 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물 - Google Patents

표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물 Download PDF

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WO2011139032A2
WO2011139032A2 PCT/KR2011/002805 KR2011002805W WO2011139032A2 WO 2011139032 A2 WO2011139032 A2 WO 2011139032A2 KR 2011002805 W KR2011002805 W KR 2011002805W WO 2011139032 A2 WO2011139032 A2 WO 2011139032A2
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primer
group
seq
target gene
gene
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황선영
신수경
신지영
이주형
박선민
홍선표
김석준
김수옥
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Genematrix Inc
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a primer composition for amplifying a gene region in which various variations of a target gene exist, a method for amplifying a target gene using the same, a PCR amplification kit including the same, and a method for genotyping a target gene using the same.
  • Primer composition capable of amplifying a gene region in which a large number of mutations in a target gene exist easily and efficiently without omission and precisely analyzing a plurality of genotypes while satisfying specificity and sensitivity, and a method for amplifying a target gene using the same It relates to a PCR amplification kit comprising and a method for genotyping a target gene using the same.
  • the present invention generates amplification products having the same gene sequence except for the gene sequence to be analyzed, ie, "genetic analysis sequence" when amplifying a gene region in which a large number of mutations in a target gene exist.
  • the present invention relates to a primer composition for reducing genotyping peaks that appear in genotyping by mass polymorphism and facilitating genotyping, a target gene amplification method using the same, a PCR amplification kit including the same, and a genotyping method of the target gene using the same. .
  • Genotyping of living organisms is widely used in relation to disease risk, diagnosis, prediction or treatment. For example, by analyzing the mutation of a specific gene of a specific person, it is possible to predict the degree of disease risk and to induce prevention in advance.
  • genetic variation analysis of other infectious agents such as viruses, that cause infections in living organisms, may be used to analyze whether the virus is resistant to a particular therapeutic drug, and the genotyping may be used to identify specific infectious agents. By predicting the response to a therapeutic drug, for example resistance, the patient can develop a personalized treatment.
  • genotyping methods have increased, with the possibility that the human genome map can be completed to provide a broader estimate of disease risk, diagnose or predict disease, and predict response to drugs. Elevated. However, in order to clarify the relationship between genetic mutations and diseases of humans and other organisms, it is necessary not only to analyze a large number of sequence information, but also to analyze various and many sequence variations accurately and effectively while satisfying both specificity and sensitivity. You should be able to.
  • PCR polymerase chain reaction method using DNA polymerase
  • the method can design a primer that can bind to the template to amplify only the desired region of the gene.
  • a primer is designed by determining a region to be amplified from a gene and determining a nucleotide sequence that can complementarily bind to the nucleotide sequence of the 3 'end of the determined region.
  • a method for amplifying a gene region in which a large number of mutations are generally used is a method of designing a primer including a mixed base or designing and mixing several primers.
  • the third base is adenine (A) or cytosine (C), and 15
  • the first base is designed using a mixed base corresponding to guanine (G) or adenine (A).
  • primers having the following sequences can be designed for the type A gene and the type B gene.
  • Another method is to design and mix primer A specific for type A gene and primer B specific for type B gene, wherein primer A is bound to type A gene and primer B is bound to type B gene.
  • This method may be effective when there are several gene mutations in the target gene, but in the case of dozens or more of the gene mutations in the target gene, a false positive problem occurs when amplifying a gene region in which multiple mutations of the target gene exist.
  • primer A is bound to type A gene and primer B is bound to type B gene, but it is amplified by primer A and primer B. May occur.
  • PCR-SSCP (Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5: 8874-8879) amplifies a sequence containing the base to be analyzed, separates it into individual chains, and then polyacrylamide Electrophoresis is performed on the gel.
  • the secondary structure of the DNA chain is changed by one base difference, it is a method of investigating base variation according to the electrophoretic movement speed difference caused by this difference. That is, in the PCR-SSCP method, only bases to be analyzed are replicated by the template, and the rest of the sequences must be identical, so that accurate base mutations can be investigated. If multiple products having different sequences are amplified, it may cause incorrect results.
  • RFMP Method Restriction Enzyme Fragment Mass Polymorphism
  • RFMP method is a genotyping method that amplifies a sequence containing a base to be analyzed, cuts it with restriction enzymes, and measures the molecular weight of the fragment. If several products having different sequences are amplified, several molecular weights in one template are amplified. This measurement problem arises.
  • the RFMP method is a method of analyzing the genotype by analyzing the molecular weight of the fragment of the amplified product of the gene region to be analyzed, so that the analysis becomes complicated and difficult when there are many molecular weight peaks in the mass spectrometry graph. Therefore, in the case of genotyping by RFMP method, when amplifying a gene region in which a large number of mutations of a target gene exist, a mass spectrometry peak is produced by mixing a plurality of primers in a 1: 1 correspondence for each genotype. Are more difficult to analyze and are more likely to cause analysis errors.
  • a primer that simply and efficiently amplifies the gene region in which a large number of mutations exist is precisely omitted without a primer that satisfies both the sensitivity and specificity of the trade-off relationship. Providing a technology that provides a need is urgently required.
  • the present invention can easily and efficiently amplify a gene region in which a large number of mutations of a target gene exist, without missing a primer, and precisely analyze a plurality of genotypes while satisfying specificity and sensitivity. It is an object to provide a composition, a method for amplifying a target gene using the same, a PCR amplification kit including the same, and a method for genotyping a target gene using the same.
  • each specific primer is designed and used, and mixed, and the gene sequence to be analyzed (hereinafter, referred to as "genetic analysis sequence").
  • the primer composition enables amplification to have the same gene sequence, thereby enabling PCR in various nucleotide sequences, and at the same time, enabling accurate nucleotide sequence or nucleotide mutation analysis, and a target gene amplification method using the same.
  • a PCR amplification kit including the same and a method for genotyping a target gene using the same.
  • the present invention generates an amplification product having the same gene sequence except for the gene sequence to be analyzed, ie, "genotypeable sequence" when amplifying a gene region in which a plurality of mutations of a target gene exist.
  • the present inventors have a 1: 1 correspondence for each genotype when amplifying a gene region in which a large number of mutations of a target gene exist. It is difficult to design primers that satisfy both specificity and sensitivity because it is difficult to design primers to minimize the type of primers used, and accurate sequencing is possible when all sequences except the sequencing region are amplified with the same sequence. With this in mind, the present invention has been completed.
  • the primer composition for amplifying a gene region in which various variations of the target gene of the present invention are present is not a technique applicable only to the restriction enzyme fragment mass polymorphism described as an example in the Examples of the present invention, and PCR amplification products It should be understood as a basic technology that can be applied to various types of genotyping techniques, for example, genotyping techniques such as microarray chips.
  • the restriction enzyme fragment mass polymorphism used in the specification of the present invention refers to a restriction enzyme that recognizes a nucleotide sequence site where a mutation is located after amplifying a gene to be analyzed by PCR.
  • RFMP method refers to a restriction enzyme that recognizes a nucleotide sequence site where a mutation is located after amplifying a gene to be analyzed by PCR.
  • the mass of the cleaved gene fragment is changed according to the presence or absence of a change in base, and this means a method of analyzing the genotype by measuring the mass difference of the cleaved gene fragment (Korea Patent No. 10-0477766 and Article 10). 10-0642829).
  • restriction enzyme recognition sequence used in the specification of the present invention is a sequence recognized simultaneously or adjacently by different restriction enzymes when performing the "RFMP method” described above, and may not match the sequence to be cut. It means the sequence which can be.
  • the restriction enzymes FokI and BtsCI used as an example in the embodiments of the present invention described below recognize the GGATG sequence, but the cleavage positions are 9th / 13th and 2nd / 0th from the 3 'end of the recognition sequence, respectively.
  • a base followeded by a base.
  • the two restriction enzymes that can be used in the present invention to recognize the restriction enzyme recognition sequence may be any restriction enzyme that can be used for the purpose of the present invention, that is, restriction enzymes having the same optimum temperature or different optimum temperature, and It is more preferable to have a different optimum temperature among them.
  • Restriction enzymes having a relatively low optimum temperature include, for example, FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII or BaeI.
  • Restriction enzymes having a relatively high optimum temperature for example, BtsCI , BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI, or ApoI and the like (see Korean Patent Nos. 10-0477766 and 10-0642829).
  • TP Trigger Primer
  • first primer group refers to a primer that is specific for each template containing a genotyping sequence of a target gene.
  • primer refers to a primer that mixes the primer concentration in a low concentration to the PCR reaction so as to be exhausted at the beginning of the PCR reaction.
  • Amplification Primer (AP; also referred to as the second primer group) determines the genotypical sequence by aligning the gene sequences of the target gene.
  • a primer prepared by selecting a primer binding moiety, which specifically binds to a specific template, preferably 1 to 2 nucleotide sequences near the 3 'end, and successively up to 3 nucleotide sequences allow various templates and mismatches.
  • the primer is designed to be complementary to bind and refers to a primer that mixes the primer concentration with a high concentration in the PCR reaction so that the PCR amplification product by the trigger primer is produced as a template.
  • TP trigger primers
  • AP amplification primer
  • genotype-analyzing sequence refers to a gene region in which a large number of mutations of a target gene to be analyzed exist, and specifically distinguishes the genotype of the target gene from other genotypes.
  • a primary means a sequence (base sequence or amino acid sequence).
  • a first primer group comprising at least one primer each specific for at least one template including a genotyping sequence which is a genetic variation base sequence to be analyzed of the target gene;
  • At least one primer designed based on the selection of the primer having the most common nucleotide sequences among the primers of the first primer group, and specifically binding to the template or 1 to 2 nucleotide sequences near the 3 'end Or a second primer group comprising at least one primer that continuously binds to and complementarily binds up to three nucleotide sequences.
  • the first primer group is provided at a low concentration in the amplification reactant so as to be exhausted at the initial stage of the amplification reaction of the template, and the second primer group is an amplification product by the first primer group. It is characterized in that it is provided in a high concentration to the amplification reaction to produce a final amplification product as a template.
  • the concentration of the first primer group provided to the amplification reaction reacts with the template at an early stage of the amplification reaction of the template (e.g., 10 to 15 PCR heavy cycles) and brings the amplification product of the template to a constant concentration. After amplification it is advisable to adjust the concentration so that it is exhausted.
  • the primer concentration of the first primer group is preferably 1/2 to 1/20 and more preferably 1/8 to 1/16 of the primer concentration of the second primer group, but is not limited thereto. It can change according to.
  • the number of primers of the first primer group provided in the amplification reaction product is not limited, but the total primers of the first primer group and the second primer group provided in the amplification reaction product are used.
  • the concentration is preferably within 2 ⁇ M.
  • the primer of the first primer group has 4 or more bases complementary to the template in the base sequence at the 3 'end and in the other base sequences more than three consecutively Bonding is difficult when bases mismatch with the template.
  • each primer of the first primer group is designed such that a base sequence in which a mutation exists complementarily binds to the template, and the other base sequences are consensus sequences of the second primer. It is designed in the same manner as the primer of the group, it is preferable to design the same primer length.
  • the final amplification product is characterized in that the amplified to have the same gene sequence in the portion except for the genotyping sequence.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 10
  • the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26
  • the primer of the second primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 48
  • the second Primer of the primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
  • the primer of the first primer group does not necessarily need to be provided as a pair of forward primer and reverse primer, for example, when only the reverse primer is provided, the second primer Paired with a group of forward primers, an amplification reaction occurs.
  • Primers of the second primer group are provided to the amplification reaction in a combination of a forward primer and a reverse primer.
  • a PCR amplification kit comprising a primer composition for amplifying a gene region in which various variations of a target gene of an embodiment of the present invention, genotyping sequence that is a genetic variation base sequence of the target gene is analyzed
  • a first primer group including at least one primer each specific for at least one template included and at least one primer having the most common nucleotide sequence among the primers of the first primer group selected As a primer of, at least one primer that specifically binds to the template or has 1 to 2 sequences or up to 3 consecutive sequences mismatched with the template and complementarily binds to the 3 'end.
  • a second primer group a polynucleotide template, a DNA polymerase, dNTPs and buffer solutions.
  • the first primer group is provided at low concentration in the amplification reactant to be exhausted at the beginning of the amplification reaction of the template, and the second primer group is amplified by the first primer group. It is characterized in that the product is provided as a template in a high concentration to the amplification reaction to produce a final amplification product.
  • the concentration of the first primer group provided to the amplification reaction reacts with the template at an early stage of the amplification reaction of the template (e.g., 10 to 15 PCR heavy cycles) and brings the amplification product of the template to a constant concentration. After amplification it is advisable to adjust the concentration so that it is exhausted.
  • the primer concentration of the first primer group is preferably 1/2 to 1/20 and more preferably 1/8 to 1/16 of the primer concentration of the second primer group, but is not limited thereto. It can change according to.
  • the number of primers of the first primer group provided to the amplification reaction is not limited, but the total primers of the first primer group and the second primer group provided to the amplification reaction product.
  • the concentration of is preferably within 2 ⁇ M.
  • the final amplification product is characterized in that the amplified to have the same gene sequence in the portion except for the genotyping sequence.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 10
  • the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26
  • the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 48
  • Primers of the two-primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
  • the primer of the second primer group is provided to the amplification reaction in a combination of a forward primer and a reverse primer.
  • At least one primer designed based on the selection of the primer having the most common nucleotide sequences among the primers of the first primer group, and specifically binding to the template or 1 to 2 near the 3 'end; Preparing a second primer group comprising at least one primer sequence having three base sequences or up to three consecutive sequence mismatches with the template;
  • PCR amplification by adding at least one primer of the first primer group and at least one primer of the second primer group to an amplification reaction comprising a polynucleotide template, a DNA polymerase, dNTPs, and a buffer solution Performing the reaction.
  • At least one primer of the first primer group complementary to the template binds to the amplification reaction at the beginning of the PCR amplification reaction and exhausts all primers of the first primer group;
  • the first primer group is added to the amplification reactant at a low concentration, and the second primer group is added at a higher concentration than the first primer group. It is characterized by.
  • the primer concentration of the first primer group added to the amplification reactant in step (c) is preferably 1/2 to 1/20 of the primer concentration of the second primer group, and 1/8 to 1 / 16 is more preferred, but is not limited thereto and may vary depending on reaction conditions.
  • the concentration of the total primers of the first primer group and the second primer group added to the amplification reactant in step (c) is preferably within 2 ⁇ M.
  • the primer of the first primer group is at least one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 10
  • a primer of the second primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7.
  • the primers of the first primer group are at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26.
  • the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • the primer of the first primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 48
  • the primer of the second primer group is at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
  • the primers of the second primer group are added to the amplification reaction in a combination of a forward primer and a reverse primer.
  • a polynucleotide having a genotypable sequence which is a gene mutation base sequence to be analyzed of the target gene, amplified by the step (a), and having the same gene sequence in a portion other than the genotypable sequence;
  • the fragment after restriction enzyme cleavage comprises a mutation position base, and the number of bases of the fragment is characterized in that 2 to 32.
  • the primers of the first primer group are SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: At least one primer selected from the group consisting of 10, wherein the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7.
  • the primers of the first primer group are represented by SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26.
  • At least one primer selected from the group consisting of, and the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • the primer of the first primer group is a group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 48 At least one primer selected from, and the primer of the second primer group is characterized in that at least one primer selected from the group consisting of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
  • the primer of the second primer group for amplifying the target gene amplified in the step (a) is provided by a combination of a forward primer and a reverse primer.
  • the present invention uses a trigger primer (TP) and an amplification primer (AP) in PCR, so that the gene sequence to be analyzed when amplifying a gene region in which there are many mutations (hereinafter, referred to as "genetic analysis sequence"). Except for), an amplification product having the same gene sequence is generated, thereby enabling PCR in various nucleotide sequences, and at the same time enabling accurate sequencing or nucleotide variation analysis.
  • TP trigger primer
  • AP amplification primer
  • genotyping is facilitated by reducing the number of mass spectrometry peaks generated by genotyping by restriction enzyme fragment mass polymorphism by generating an amplification product having the same gene sequence except for "genotyping sequence".
  • the present invention can be used in various fields, such as the bio, medical and pharmaceutical fields that require analysis of base variations.
  • Figure 1 is a method for PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention can be easily and efficiently amplified without omission and precisely analyze a plurality of genotypes It is a schematic diagram explaining.
  • Figure 2 is a maldi-tope mass spectrometry graph of HPV 59 genotype obtained by performing the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention.
  • Figure 3 is a maldi-tope mass spectrometry graph of HPV 16 genotype obtained by performing the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention.
  • Figure 4 is a maldi-tope mass spectrometry graph of HPV 51 genotype obtained by performing the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention.
  • Figure 5 is a maldi-tope mass spectrometry graph of HPV 68 genotype obtained by performing the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention.
  • TP trigger primer
  • AP amplification primer
  • FIG. 8 shows the trigger primer (TP) and amplification primer (TP) of the present invention when the 236th codon of HBV polymerase that causes adefovir resistance upon base mutation is a wild type HBV genotype encoding amino acid asparagine (Asn) with AAC.
  • Figure 9 shows the trigger primer (TP) and amplification primer (TP) of the present invention when the 236th codon of HBV polymerase that causes adefovir resistance at the time of base mutation is a mutant HBV genotype encoding amino acid threonine (Thr) with ACT. Maldi-tope mass spectrometry graph of mutant HBV genotype obtained by performing RFMP method after PCR amplification using AP).
  • HPV Human Papillomavirus genotyping known to cause human cervical cancer was performed using the restriction enzyme fragment mass polymorphism (hereinafter referred to as "RFMP method") as described above. .
  • RFMP method restriction enzyme fragment mass polymorphism
  • HPV is a DNA virus belonging to the papova virus family, an icosahedron consisting of 72 outer capsomers, and 7,900 nucleotide sequences of double circular DNA. HPV is divided into 120 different subtypes depending on the similarity of the sequences that make up the genome. About 30 of these 120 subtypes are known to infect the lower genital organs, and HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, and HPV- depending on the risk of developing cervical epithelial tumors and cervical cancer.
  • the genome structure of HPV is divided into the early transcription region E (late gene region), the late transcription region L (late gene region), and the non-expressed region LCR (long control region).
  • E early gene region
  • L late gene region
  • LCR long control region
  • E6 and E7 genes in early transcription sites are known to play an important role in carcinogenesis by being expressed during HPV staying in the genome of infected cells.
  • the high-risk HPV genes E6 and E7 bind to proteins expressed in the tumor suppressor genes p53 and rb (retinoblastoma), respectively, to inactivate these proteins, resulting in cell cycles. Inhibition of cell cycle control and apoptosis mechanisms transforms normal cells of the cervix into cancer cells.
  • HPV belonging to low-risk groups such as HPV-6 and HPV-11 have a poor ability to inactivate proteins expressed in tumor suppressor genes, making it difficult to cause cervical cancer (Barbosa MS et al., In vitro biological activities of the E6 and E7 genes vary among HPVs of different oncogenic potential.J. Virol., 65: 292-298, 1991).
  • the primer binding moiety is selected to prepare a pair of amplification primers (AP).
  • the amplification primer (AP) is designed to bind complementarily, preferably 1 to 2 nucleotide sequences near the 3 'end, and 3 nucleotide sequences are mismatched with various HPV DNA templates.
  • TP trigger primers
  • the sequence (5 ' ⁇ 3') of the template DNA amplified by the primer in the high risk group HPV gene to be analyzed is as follows.
  • the underlined sequences of the template DNA sequences of HPV are the sites to which primers 1 to 6 below bind.
  • the underlined portion of each HPV template DNA sequence is the site where the forward primer binds, and the underlined portion of the back of each HPV template DNA sequence is the site where the reverse primer binds.
  • Bases in lowercase letters are "genotype analytical sequences".
  • Primer 1 5'- GCACAGGG CCAC AAggatgAATGG-3 '(24mer) (SEQ ID NO: 5)
  • primer 1 of the forward primers is an amplification primer (AP) and primer 2 is a trigger primer (TP).
  • primer 3 of the reverse primers is an amplification primer (AP)
  • primers 4 to primer 6 is a trigger primer (TP).
  • the forward primer was designed complementary to the HPV DNA template with 5 bases in the 3 'end sequence
  • the reverse primer designed complementary to the HPV DNA template with 7 bases in the 3' end sequence.
  • the lowercased sequences in the primers are restriction enzyme recognition sequences of FokI and BtsCI. In this example, restriction enzyme recognition sequences of FokI and BtsCI are inserted in order to use the RFMP method.
  • primer 1 was designed to be a forward amplification primer (AP) with 5 nucleotide sequences of 3 'terminus consistent for all HPV genotypes
  • primer 2 was forward trigger primer (TP) complementary to HPV 59 DNA template.
  • AP forward amplification primer
  • TP forward trigger primer
  • primer 3 is designed as a reverse amplification primer (AP) 7 base sequence of the 3 'end when the HPV 16 DNA template, based on the 7 base sequence of the 3' end for all HPV genotype 1 It was designed to allow complementary binding while permitting mismatching of the two base sequences to the three base sequences as consecutive as possible.
  • Primer 4 is a reverse trigger primer (TP) that is complementary to HPV 34, HPV 59 and HPV 73 and differs from primer 3 in that the fourth base (A) and the sixth base (T) at the 3 'end are different from the primer 3 Designed with (see base in bold).
  • Primer 5 is a reverse trigger primer (TP) that is complementary to HPV 51, HPV 70 and HPV 82 and specifically designed with the fourth base (T) at the 3 'end different from that of Primer 3 (in bold).
  • Primer 6 was designed specifically as a reverse trigger primer (TP) complementary to HPV 39 and HPV 68, with the fourth base at the 3 'end being mutated differently from primer 3 ( Base in bold).
  • PCR buffer (1x) MgSO 4 2 mM, dNTP 200 mM, Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, 10966-026) 0.5 U, primer 1 and primer 3 0.4 ⁇ M each, primer 0.05 ⁇ M 2 and Primer 4, 0.025 ⁇ M of Primer 5 and Primer 6, respectively, and 100 ng of HPV DNA to be analyzed were added, and the total reaction volume was adjusted to 25 ⁇ l.
  • PCR reaction was performed under the following conditions (corresponding to step (A) of Figure 1).
  • TP complementary trigger primers
  • primers 2 and 4 were used as the HPV 59 DNA template
  • primers 1 and 5 were used as the HPV 51 DNA template
  • primers 1 and 6 were combined as the HPV 68 DNA template to generate the following amplification products.
  • primer 1 and primer 3 are combined to produce the following amplification products.
  • the sequence of HPV DNA fragment produced by initial PCR reaction (10-15 cycles) in each HPV DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • the trigger primer (TP) specific for each HPV DNA template binds (in the case of HPV 16 DNA
  • the amplification primer (AP) acts as a trigger primer (TP) and binds to the HPV 16 DNA template).
  • TP the low-priority trigger primers
  • Another amplification primer (AP) is bound to the HPV DNA template to be amplified (step (B) of Figure 1).
  • an amplification primer for all HPV genotypes, 7 nucleotides at the 3 'end are complementary, allowing 1 to 2 nucleotide sequences and mismatching to 3 nucleotide sequences as continually as possible. It is designed to be combined with a high concentration than the trigger primer (TP) when PCR amplification is possible.
  • TP trigger primer
  • the "genotype analytical sequence” is replicated by various HPV DNA templates, and the other sequences (sequences except the base sequences indicated by brackets ([]) in the base sequences below) are amplified primers (AP). It is duplicated by and have the same nucleotide sequence (step (C) of Figure 1). In the final PCR amplification product, the amplification product by the amplification primer (AP) is mostly occupied, and the amplification product by the trigger primer (TP) is present in a trace amount that does not affect the analysis results.
  • the sequence of each HPV DNA fragment finally produced in each HPV DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • the region shown in lowercase in the sequence generated by the PCR is a restriction enzyme recognition sequence
  • the underlined region is the sequence of the fragment generated by cleavage by the restriction enzyme
  • the site indicated in square brackets ([]) is "genotype analysis possible” Sequence ".
  • PCR amplification using trigger primer (TP) and amplification primer (AP) was performed only for HPV 59, HPV 16, HPV 51, and HPV 68. It will be readily understood by those skilled in the art that PCR amplification using trigger primers (TP) and amplification primers (AP) can also be applied to low risk group HPV.
  • the product amplified by the PCR was subjected to FokI (NEB R109L) 1 U, BtsCI (NEB R0647S) 1 U, 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, and 1 mM DTT ( PH 7.9) at 25 ° C is added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • TEAA triethylammonium acetate
  • ACN acetonitrile
  • the molecular weight of the fragments produced by the reaction was analyzed by Maldi-Top Mass Spectrometry, as shown in FIGS. 2 to 5, and the results of analysis for various HPVs are summarized in Table 1 as molecular weights. .
  • the genotype of HPV can be determined based on the results in Table 1 below.
  • Table 1 shows the molecular weights of the fragments predicted based on the product amplified by the amplification primer (AP), and is different from the molecular weight of the fragment by the product amplified by the trigger primer (TP).
  • the respective trigger primers (TP) were mixed at the reaction concentration or higher, the molecular weights of the fragments by the amplification primers (AP) and the molecular weights of the fragments by the trigger primers (TP) were simultaneously observed.
  • the trigger primer (TP) was mixed below the reaction concentration, the analysis of the HPV gene was not performed.
  • the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and the amplification primer (AP) of the present invention can easily and efficiently amplify a plurality of variant genes without omission and can accurately analyze a plurality of genotypes. There is this.
  • PCR amplification using the trigger primer (TP) and amplification primer (AP) of the present invention can be used for various genotyping.
  • HLA Human Leukocyte Antigen
  • AP amplification primer
  • Example 2 was performed on human genomic DNA.
  • HLA-DQB1 gene sequences were aligned to determine the "genotype analytical sequence" and a primer binding portion was selected to prepare a pair of amplification primers (AP).
  • AP a primer binding portion
  • TP trigger primers
  • PCR was performed using a mixture of high concentration amplification primer (AP) and low concentration trigger primer (TP) designed and manufactured as described above.
  • the sequence (5 ' ⁇ 3') of the template DNA amplified by the primer in the HLA-DQB1 allele to be analyzed is as follows.
  • the underlined sequences of the HLA-DQB1 allele template DNA sequences are the sites to which primers 7 to 10 bind below.
  • the underlined portion of each HLA-DQB1 allele template DNA sequence is the site to which the forward primer binds, and the underlined portion of the back of each HLA-DQB1 allele template DNA sequence is the site to which the reverse primer binds.
  • Bases in lowercase letters are "genotype analytical sequences".
  • the primer 7, which is a forward primer, is an amplification primer (AP), and the primer 9, which is a forward primer, becomes a trigger primer (TP).
  • primer 8 which is a reverse primer is an amplification primer (AP)
  • primer 10 which is a reverse primer is a trigger primer (TP).
  • the forward primer designed 4 bases complementary to the HLA-DQB1 DNA template at the 3 'end, and the reverse primers designed 7 complementary to the HLA-DQB1 DNA template at the 3' end.
  • the lowercased sequences in the primers are restriction enzyme recognition sequences of FokI and BtsCI. In this example, restriction enzyme recognition sequences of FokI and BtsCI are inserted in order to use the RFMP method.
  • primer 7 is a forward amplification primer (AP) designed to match four sequences at the 3 'end for all HLA-DQB1 genotypes
  • primer 9 is a forward trigger complementary to the HLA-DQB1 * 0201 DNA template.
  • AP forward amplification primer
  • primer 9 is a forward trigger complementary to the HLA-DQB1 * 0201 DNA template.
  • AP forward amplification primer
  • TP primer
  • primer 8 was designed as a reverse amplification primer (AP) for all 7 HLA-DQB1 genotypes except HLA-DQB1 * 0201 genotypes, and 7 primers of the 3 'terminal were matched, and primer 10 was HLA-DQB1 * 0201 DNA.
  • AP reverse amplification primer
  • TP reverse trigger primer
  • the trigger primer (TP) complementary to each HLA-DQB1 template is combined and PCR amplified to generate an amplification product (corresponding to step (A) of FIG. 1).
  • primers 9 and 10 bind to a DNA template of HLA-DQB1 * 0201 type to produce an amplification product as shown below.
  • the sequence of the HLA-DQB1 * 0201 DNA fragment generated by the initial PCR reaction (10-15 cycles) in the HLA-DQB1 * 0201 type DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • amplification is performed by combining trigger primers (TP) specific to HLA-DQB1 * 0201 type, and during the PCR amplification process, all of the trigger primers (TP) put into the initial concentration are exhausted, and each HLA-DQB1 DNA fragment is depleted.
  • an amplification primer (AP) different from the trigger primer (TP) is bound to the HLA-DQB1 DNA template for amplification. (Step (B) of Figure 1).
  • an amplifying primer (AP) this allowed seven nucleotide sequences at the 3 'end to mismatch 1 to 2 nucleotide sequences, as well as 3 nucleotide sequences as consecutive as possible, for all HLA-DQB1 genotypes. It is designed to complementarily bind and is possible because it was put in a higher concentration than the trigger primer (TP) when PCR amplification.
  • TP trigger primer
  • each HLA-DQB1 DNA fragment finally produced in each HLA-DQB1 DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • the region shown in lowercase in the sequence generated by the PCR is a restriction enzyme recognition sequence
  • the underlined region is the sequence of the fragment generated by cleavage by the restriction enzyme
  • the site indicated in square brackets ([]) is "genotype analysis possible” Sequence ".
  • the production principle of the amplification product is the same as in Example 1.
  • PCR amplification using the trigger primer (TP) and the amplification primer (AP) was performed only for HLA-DQB1 * 0501, HLA-DQB1 * 0201, HLA-DQB1 * 0401, and HLA-DQB1 * 0301.
  • TP trigger primer
  • AP amplification primer
  • the molecular weights of the fragments produced by the reaction were analyzed by Maldi-Top Mass Spectrometry, as shown in FIGS. 6 and 7, and summarized the analysis results for various HLA-DQB1 alleles. 2 is shown.
  • the genotype of HLA-DQB1 can be determined based on the results in Table 2 below.
  • Table 2 below shows the molecular weights of the fragments predicted based on the product amplified by the amplification primer (AP), which is different from the molecular weight of the fragment by the product amplified by the trigger primer (TP).
  • AP amplification primer
  • TP the trigger primer
  • Table 2 shows the molecular weights of the fragments predicted based on the product amplified by the amplification primer (AP), which is different from the molecular weight of the fragment by the product amplified by the trigger primer (TP).
  • FIG. 6 shows a maldi-tope mass spectrometry graph of genotype when the human HLA-DQB1 gene is hetero (0201/0501), and FIG. 7 shows that the human HLA-DQB1 gene is hetero (0301 / 0401), the Maldi-Top Mass Spectrometry graph of genotypes is shown. Analysis of these maldi-tope mass spectrometry graphs shows that in the amplification product according to the present embodiment, only the molecular weight of the fragments by the amplification primers (AP) was confirmed.
  • AP amplification primers
  • the RFMP method after PCR amplification using the trigger primer (TP) and the amplification primer (AP) of the present invention can easily and efficiently amplify a plurality of variant genes without omission and can accurately analyze a plurality of genotypes. There is this.
  • Nucleotide mutations appear in the DNA polymerase gene of hepatitis B virus that causes hepatitis B in humans. Base mutations in some of these sites cause resistance to Adefovir, a therapeutic agent for hepatitis B, and amino acids A181V / T, N236T, and the like have been reported as causative mutations. Meanwhile, in order to further confirm whether PCR amplification using the trigger primer (TP) and the amplification primer (AP) of the present invention can be used for various genotyping, hepatitis B virus genotyping with adefovir drug resistance was triggered. PCR amplification using amplification primers (AP) and RFMP. Example 3 was performed on HBV DNA.
  • a pair of amplification primers were prepared for the 236th amino acid sequence analysis of the DNA polymerase gene of hepatitis B virus, and were subjected to various HBV DNA templates for the 237th amino acid sequence and the 238th amino acid sequence.
  • AP amplification primers
  • TP trigger primers
  • the template DNA sequence (5 ' ⁇ 3') amplified by a primer in the HBV gene to be analyzed is as follows.
  • the underlined sequences of the template DNA sequences of the HBV are sites to which the primers 11 to 19 below bind.
  • the underlined portion of each HBV template DNA sequence is the site where the forward primer binds, and the underlined portion of the back of each HBV template DNA sequence is the site where the reverse primer binds.
  • Bases in lowercase letters are "genotype analytical sequences".
  • the forward primer primer 11 is an amplification primer (AP)
  • primer 12 of the reverse primers is an amplification primer (AP)
  • primers 13 to 19 are trigger primers (TP).
  • AP amplification primer
  • AP amplification primer
  • TP trigger primers
  • the forward primer was designed complementary to the HBV DNA template with 19 bases in the 3 'end sequence
  • the reverse primer was designed complementary to the HBV DNA template with 12 bases in the 3' end sequence.
  • the lowercased sequences in the primers are FokI restriction enzyme recognition sequences.
  • the restriction enzyme recognition sequences of FokI are inserted to use the RFMP method.
  • primer 11 was designed to match 19 bases at the 3 'end for all HBV genotypes as forward amplification primers (AP), and primer 12 was based on HBV # 1 DNA template as reverse amplification primers (AP).
  • 12 nucleotide sequences of 3 'terminus are designed to be identical, but for all HBV genotypes, 12 nucleotide sequences of 3' terminus are mismatched with 1 to 2 nucleotide sequences and as much as 3 nucleotide sequences as possible. It was designed to allow for complementary combinations while allowing.
  • primer 13 is a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 2 and specifically designed with the fifth base (G) at the 3 'end differently from the primer 12 (see the base in bold).
  • TP reverse trigger primer
  • Primer 14 is a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 3, and specifically designed a fourth base sequence (C) at the 3 'end differently from that of Primer 12 (base in bold)
  • Primer 15 is a reverse trigger primer (TP) that is complementary to HBV # 4 and specifically designed with the fourth base sequence (G) at the 3 'end different from that of primer 12 (in bold).
  • Base 16 is a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 5, and the second base sequence (T) at the 3 'end is different from that of primer 12 to specifically design
  • Primer 17 is a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 6, and the second base sequence (T) and the fifth base sequence (G) at the 3 'end are Differently designed and specifically designed for mutation (see bold base)
  • primer 18 is a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 7, the second base sequence (T) and the fourth at the 3 'end.
  • the base sequence (C) was specifically designed by mutating it from the primer 12 (see the bolded base)
  • the primer 19 was a reverse trigger primer (TP) complementary to HBV # 8, and the 3 'terminal was used.
  • the second nucleotide sequence of (T) and the fourth nucleotide sequence of (G) was specifically designed by giving a mutation different from the primer 12 (see bold base).
  • the total reaction volume was 25 ⁇ l. .
  • PCR reaction was performed under the following conditions (corresponding to step (A) of Figure 1).
  • TP complementary trigger primers
  • primer 11 and primer 13 for HBV # 2 DNA template, primer 11 and primer 14 for HBV # 3 DNA template, primer 11 and primer 15 for HBV # 4 DNA template, primer 11 and primer 16 for HBV # 5 DNA template, Primer 11 and Primer 17 for the HBV # 6 DNA template, Primer 11 and Primer 18 for the HBV # 7 DNA template, and Primer 11 and Primer 19 for the HBV # 8 DNA template were combined to generate the following amplification products
  • primers 11 and 12 which are amplification primers (AP), are combined from the initial reaction to generate the following amplification products.
  • the sequence of the HBV DNA fragment generated by the initial PCR reaction (10-15 cycles) in each HBV DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • a trigger primer (TP) specific to each HBV DNA template binds (in the case of HBV # 1 DNA, an amplification primer (AP) acts as a trigger primer (TP) and binds to an HBV # 1 DNA template).
  • TP a trigger primer
  • AP amplification primer
  • TP binds to an HBV # 1 DNA template.
  • all of the low-priority trigger primers (TP) are exhausted and each HBV DNA fragment is amplified to a certain concentration.
  • Amplification is performed by binding an amplification primer (AP) to a HBV DNA template, which is different from that in some sequences (step (B) of FIG. 1).
  • an amplification primer for all HBV genotypes, 12 nucleotide sequences of the 3 'end are complementary, allowing for mismatching of 1 to 2 nucleotide sequences and 3 nucleotide sequences as maximally as possible. It is designed to be combined with a high concentration than the trigger primer (TP) when PCR amplification is possible.
  • TP trigger primer
  • the "genotype-resolvable sequence” is replicated by various HBV DNA templates and the other sequences (sequences except the base sequences indicated by brackets ([]) in the base sequences below) are amplified primers (AP). It is duplicated by and have the same nucleotide sequence (step (C) of Figure 1). In the final PCR amplification product, the amplification product by the amplification primer (AP) is mostly occupied, and the amplification product by the trigger primer (TP) is present in a trace amount that does not affect the analysis results.
  • the sequence of each HBV DNA fragment finally produced in each HBV DNA template is as follows (5 ' ⁇ 3').
  • the region shown in lowercase in the sequence generated by the PCR is a restriction enzyme recognition sequence
  • the underlined region is the sequence of the fragment generated by cleavage by the restriction enzyme
  • the site indicated in square brackets ([]) is "genotype analysis possible” Sequence ".
  • the production principle of the amplification product is the same as in Example 1.
  • PCR amplification using trigger primer (TP) and amplification primer (AP) was performed only for HBV # 1 to HBV # 8.
  • trigger primer (TP) and amplification primer It will be readily understood by those skilled in the art that PCR amplification using AP can be applied.
  • the molecular weights of the fragments produced by the reaction were analyzed by Maldi-Top Mass Spectrometry, as shown in FIGS. 8 and 9, and the analysis results for various HBVs are summarized in Table 3 as molecular weights. .
  • the genotype of HBV can be determined based on the results in Table 3 below.
  • Table 3 below shows the molecular weights of the fragments predicted based on the product amplified by the amplification primer (AP), which is different from the molecular weight of the fragment by the product amplified by the trigger primer (TP).
  • AP amplification primer
  • TP the molecular weight of the fragments by the amplification primers
  • TP the molecular weight of the fragments by the trigger primers
  • FIG. 8 shows a Maldi-Top Mass Spectrometry graph when the 236th codon of HBV polymerase that causes adefovir resistance upon base mutation is a wild type HBV genotype encoding amino acid asparagine (Asn) as AAC.
  • 9 shows the Maldi-Top Mass Spectrometry graph when the 236th codon of the HBV polymerase that causes adefovir resistance at the time of base mutation is a mutant HBV genotype encoding the amino acid threonine (Thr) with ACT. Is shown.

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Abstract

본 발명의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물은, 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군과, 상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군을 포함한다.

Description

표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물
본 발명은 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 간편하고 효율적으로 누락없이 정확히 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 특이도와 민감도를 만족시키면서 정밀하게 분석할 수 있는 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 분석하고자 하는 유전자 서열, 즉 "유전자형 분석 가능 서열"을 제외하고는 동일한 유전자 서열을 가진 증폭 산물을 생성하여 제한효소 절편 질량 다형성법에 의한 유전자형 분석시 나타나는 질량분석 피크의 숫자를 줄여 유전자형 분석을 용이하게 하는 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 관한 것이다.
생명체의 유전자형 분석은 질병에 대한 위험도, 진단, 예진 또는 치료방법의 제시 등과 관련하여 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들어, 특정인의 특정 유전자에 대한 변이분석을 통하여 질병에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 질병을 사전에 예방하도록 유도할 수 있다. 또한, 생명체에 감염을 일으키는 다른 감염체, 예를 들어, 바이러스 등의 유전자 변이 분석을 통하여 해당 바이러스가 특정 치료 약물에 대해 내성을 갖는지 여부를 분석할 수 있고, 이러한 유전자형 분석을 통하여 감염체의 특정 치료 약물에 대한 반응, 예를 들어 내성반응을 예측함으로써 환자 개인별 맞춤형 치료방법을 개발할 수 있다.
인간의 게놈(genome) 지도가 완성되어 질병에 대한 위험도의 측정, 질병의 진단 또는 예진, 그리고 약물에 대한 반응의 예측을 보다 광범위하게 할 수 있다는 가능성이 제시되면서, 유전자형 분석 방법에 대한 관심이 더욱 고조되었다. 그러나 인간을 비롯한 생명체의 유전자 변이와 질병과의 관계를 명확하게 규명하기 위해서는 많은 수의 염기서열정보를 분석하여야 할 뿐만 아니라, 다양하고 많은 서열의 변이들을 특이도와 민감도를 모두 만족시키면서 정확하고 효과적으로 분석할 수 있어야 한다.
염기서열 또는 염기의 변이를 분석하기 위하여 여러 가지 방법들이 있으나 이 모든 방법들을 사용하기 이전에 기본적으로 많은 양의 유전자 시료를 수득하여야 한다. 현재 연구자들이 유전자 시료를 수득하기 위하여 가장 보편적으로 사용하는 방법은 DNA 중합효소를 이용한 중합효소연쇄반응방법(이하, "PCR"이라 함)이다. 상기 방법은 주형과 결합할 수 있는 프라이머를 설계하여 유전자의 원하는 부위만을 증폭시킬 수 있다. 유전자로부터 증폭하고자 하는 영역을 결정하고, 결정한 부위의 3' 말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하여 프라이머를 설계한다.
그러나, 유전자형 분석을 위해 선정된 표적 유전자의 변이가 많이 존재하는 유전자 영역에서는 프라이머 설계가 쉽지 않다. 즉, PCR을 수행하기 위한 프라이머를 합성할 때에는 세심한 주의와 시간이 요구되며 프라이머의 비특이적 혼성화에 의한 위양성 산물이 생성되는 문제점이 있다. 특히, 표적 유전자의 유전자형이 수개만 존재하는 것이 아니라 수십개 내지는 100개 넘게 존재하는 경우에는 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 모두 정확하게 증폭하고 유전자형을 특이도와 민감도를 모두 충족시키면서 분석하는 것이 매우 어렵다. 예를 들어, 인유두종바이러스(Human Papillomavirus: HPV, 이하 HPV로 기술함)는 80개 이상의 변종이 알려져 있으며, 아형까지 포함하면 대략 120여개까지 이른다.
이와 같이 표적 유전자의 유전자형이 수십개 이상 존재하는 경우, 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역에 대해 정밀하게 다수 개의 프라이머들을 설계하는 것이 어려울 뿐만아니라 특정 변이를 갖는 유전자 영역에 대해서는 증폭이 이루어지지 않아 해당 유전자형을 음성으로 판정하게 되는 위음성의 문제가 발생하거나 사용되는 프라이머의 종류가 많아짐에 따라 전술한 바와 같은 프라이머의 비특이적 혼성화에 의한 위양성 문제가 더욱 심각하게 된다. 즉, 표적 유전자의 유전자형이 수십개 이상 존재하는 경우, 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 정밀하게 증폭하는 다수 개의 프라이머의 설계는 민감도와 특이도의 관점에서 서로 트레이드 오프(trade off) 관계이기 때문에 민감도와 특이도를 모두 만족시키는 프라이머를 제공하는 것이 어려운 것이 현실이다.
이와 관련하여 일반적으로 변이가 많이 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 사용하는 방법으로는 혼합 염기(mixed base)가 포함된 프라이머를 설계하거나 여러 개의 프라이머를 설계하여 혼합하는 방법이 있다.
우선, 혼합 염기(mixed base)가 포함된 프라이머는 다음과 같이 분석대상이 되는 A형 유전자 및 B형 유전자가 있다고 가정할 때, 3번째 염기는 아데닌(A)이나 사이토신(C), 그리고 15번째 염기는 구아닌(G)이나 아데닌(A)에 해당하는 혼합 염기를 이용하여 설계한 것이다.
A형 유전자: 5' - ggA ttc ggg ccc gaG tct - 3'
B형 유전자: 5' - ggC ttc ggg ccc gaA tct - 3'
즉, A형 유전자 및 B형 유전자에 대해서는 아래와 같은 서열을 가지는 프라이머를 설계할 수 있는 것이다.
5' - ggM ttc ggg ccc gaR tct - 3' (R = A/G, M = A/C로 약속하여 표기함)
그러나, 혼합 염기(mixed base)를 많이 사용하게 되면 프라이머의 Tm 값이 높아질 뿐만 아니라, 주형의 서열과는 다른 염기가 합성될 수도 있어 하나의 주형에서 혼합 염기를 사용한 만큼 염기서열이 다른 여러 개의 생성물이 증폭되는 문제가 발생하게 된다. 따라서, 전술한 PCR 증폭산물의 위양성 문제를 근복적으로 해결할 수 없다.
또 다른 방법으로는 A형 유전자에 특이적인 프라이머 A와, B형 유전자에 특이적인 프라이머 B를 각각 설계하여 혼합하는 방법으로서, A형 유전자에는 프라이머 A 가 결합하고, B형 유전자에는 프라이머 B가 결합하여 PCR 증폭산물을 생성하는 방법이 있다. 이 방법은 표적 유전자의 유전자 변이가 몇 개인 경우에는 유효할 수 있으나, 표적 유전자의 유전자 변이가 수십개 이상 존재하는 경우에는 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역 증폭시 위양성 문제가 발생한다. 즉, 극단적으로 예를 들면 위의 예에서 A형 유전자에는 프라이머 A가 결합하고 B형 유전자에는 프라이머 B가 결합하여 증폭될 것으로 예측하였으나 하나의 주형에 대해 프라이머 A 및 프라이머 B에 의한 생성물이 모두 증폭되는 경우가 발생할 수 있다. 이는 초기 미량의 주형의 농도에서는 특이적인 프라이머만이 주형과 결합이 가능하지만, 일정 농도의 생성물이 증폭된 이후에는 비특이적인 프라이머도 증폭된 생성물과 결합이 가능하게 되고, 결국 하나의 주형에 대해 여러 개의 프라이머를 혼합할 수 밖에 없어 염기서열이 다른 여러 개의 생성물이 증폭되는 문제가 발생하게 된다.
따라서, 염기서열 분석을 하기 위해 선행되는 PCR에서 변이가 많이 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 혼합 염기를 이용한 프라이머를 이용하거나, 여러 개의 특이적인 프라이머를 동일한 농도로 혼합하는 등의 방법을 이용하는 경우 주형에 비특이적인 프라이머로 인한 복제로 인해 주형의 정확한 염기서열 분석이 불가능하다. 즉, 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때에는 각각의 유전자형에 대해 1:1 대응관계로 프라이머를 설계하여서는 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 프라이머 설계가 어렵고, 반면에 사용되는 프라이머 종류를 최소화하면 위양성율 문제는 어느 정도 해결가능하지만 특정 변이에 대해서는 증폭하지 못하는 민감도 저하 문제가 발생할 수 밖에 없는 것이다.
한편, 하나의 주형에서 서열이 다른 여러 개의 생성물이 증폭되면 이후 염기서열 분석 시 잘못된 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어 PCR-SSCP(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)는 분석하고자 하는 염기를 포함하는 서열을 증폭한 후, 각각의 체인으로 분리시킨 다음, 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 수행한다. 이때, 1개의 염기 차이에 의하여 DNA 체인의 2차 구조가 달라지므로 이 차이에 기인한 전기영동 이동속도 차이에 따라 염기변이 여부를 조사하는 방법이다. 즉, PCR-SSCP 방법에서는 분석하고자 하는 염기만이 주형에 의해 복제되고 나머지 서열은 모두 동일하여야 정확한 염기변이 조사가 가능한데, 서열이 다른 여러 개의 생성물이 증폭되면 잘못된 결과를 초래할 수 있는 것이다.
또한, 본 출원인은 유전자 변이 검출방법들을 개선한 소위 "제한효소 절편 질량 다형성법(RFMP 방법)"이라는 새로운 유전자형 검사방법을 개발한 바가 있는데, 그 예가 대한민국 등록특허 제10-0477766호와 제10-0642829호에 개시되어 있다. RFMP 방법은 분석하고자 하는 염기를 포함하는 서열을 증폭한 후 제한효소로 절단하여 그 절편의 분자량을 측정하는 유전자형 분석 방법인데, 만약 서열이 다른 여러 개의 생성물이 증폭이 되면 하나의 주형에서 여러 개의 분자량이 측정되는 문제가 발생하게 된다. 또한, RFMP 방법은 분석 대상이 되는 유전자 영역의 증폭된 산물에 대한 절편의 분자량을 분석하여 유전자형을 분석하는 방법이므로 질량분석 그래프에서 많은 분자량 피크들이 존재하면 분석이 복잡하고 어려워 진다. 따라서, RFMP 방법을 통해 유전자형을 분석하는 경우에는 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 각각의 유전자형에 대해 1:1 대응관계로 프라이머를 다수 개 제작하여 혼합하게 되면 질량 분석 피크가 많아져 분석이 어렵게 되고 분석 오류가 발생할 가능성이 크게 된다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 간편하고 효율적으로 누락없이 정밀하게 증폭하는 프라이머로서 서로 트레이드 오프(trade off) 관계인 민감도와 특이도를 모두 만족시키는 프라이머를 제공하는 기술의 제공이 절실히 요구되고 있다고 하겠다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 간편하고 효율적으로 누락없이 정확히 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 특이도와 민감도를 만족시키면서 정밀하게 분석할 수 있는 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 분석하고자 하는 유전자 서열 영역의 주변 염기서열에 변이가 많이 존재할 경우 각각의 특이적인 프라이머를 설계하여 혼합하여 이용하되, 분석하고자 하는 유전자 서열(이하, "유전자형 분석 가능 서열"이라 함)을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭함으로써 유전자 변이가 다양한 염기서열 부분에서의 PCR이 가능하게 함과 동시에 정확한 염기서열 또는 염기변이 분석이 가능하게 하는 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 분석하고자 하는 유전자 서열, 즉 "유전자형 분석 가능 서열"을 제외하고는 동일한 유전자 서열을 가진 증폭 산물을 생성하여 제한효소 절편 질량 다형성법에 의한 유전자형 분석시 나타나는 질량분석 피크의 숫자를 줄여 유전자형 분석을 용이하게 하는 프라이머 조성물, 이를 이용한 표적 유전자 증폭 방법 및 이를 포함하는 PCR 증폭 키트 그리고 이를 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때에는 각각의 유전자형에 대해 1:1 대응관계로 프라이머를 설계하여서는 특이도와 민감도를 모두 만족시키는 프라이머 제작이 어렵기 때문에 사용되는 프라이머 종류를 최소화하고 주형에서 염기서열 분석 영역을 제외한 나머지 서열은 모두 동일한 서열을 갖게 증폭되는 경우 정확한 염기서열 분석이 가능한 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
한편, 본 발명의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물은 하기 본 발명의 실시예에서 일례로서 설명하고 있는 제한효소 절편 질량 다형성법에만 적용가능한 기술이 아니고, PCR 증폭산물을 이용하여 유전자형을 분석하는 다양한 기술, 예를 들어 마이크로어레이 칩과 같은 유전자형 분석 기술에 적용될 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "제한효소 절편 질량 다형성법(이하, "RFMP 방법"이라 함)"이란 분석 대상 유전자를 PCR을 통해 증폭시킨 후에 변이가 위치한 염기서열 부위를 인식하는 제한효소를 이용하여 절단을 하면 염기의 변이 유무에 따라 절단된 유전자 절편의 질량이 달라지게 되는데, 이러한 절단된 유전자 절편의 질량 차이를 측정하여 유전자형을 분석하는 방법을 의미한다(대한민국 등록특허 제10-0477766호와 제10-0642829호 참조).
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 "제한효소 인지서열"이란 용어는 전술한 "RFMP 방법"을 수행할 때 서로 다른 제한효소에 의해 동시에 또는 인접하여 인지되는 서열로서, 절단되는 서열과 일치하지 않을 수 있는 서열을 의미한다. 구체적으로 후술하는 본 발명의 실시예들에서 일례로서 사용된 제한효소 FokI과 BtsCI은 모두 GGATG 서열을 인지하나 절단되는 위치는 인지서열의 3' 말단으로부터 각각 9번째/13번째와 2번째/0번째 염기의 다음이다. 한편, 제한효소 인지서열을 인지하는 본 발명에서 사용될 수 있는 두 제한효소는 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 모든 제한 효소, 즉 서로 같은 최적온도 또는 서로 다른 최적 온도를 갖는 제한 효소가 가능하며, 그 중에서도 서로 다른 최적온도를 가지고 있는 것이 더욱 바람직하다. 상대적으로 낮은 최적온도를 갖는 제한효소로는 예를 들어 FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII 또는 BaeI 등이 있으며, 상대적으로 높은 최적온도를 갖는 제한효소로는 예를 들어 BtsCI, BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI, 또는 ApoI 등이 있다(대한민국 등록특허 제10-0477766호와 제10-0642829호 참조).
또한, 본 발명의 상세한 설명 전반에 있어서 사용되는 "트리거 프라이머(Trigger Primer, TP; 제1프라이머 군으로도 호칭됨)"라는 용어는 표적 유전자의 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 주형에 각각 특이적인 프라이머로서, PCR 반응 초기에 모두 소진되도록 프라이머 농도를 PCR 반응물에 저농도로 혼합하는 프라이머를 의미한다.
또한, 본 발명의 상세한 설명 전반에 있어서 사용되는 "증폭 프라이머(Amplification Primer, AP; 제2프라이머 군으로도 호칭됨)"라는 용어는 표적 유전자의 유전자 염기서열을 정렬하여 유전자형 분석가능 서열을 결정하고 프라이머 결합부분을 선택하여 준비된 프라이머로서, 특정 주형과 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 바람직하게는 1∼2개의 염기서열, 연속적으로 3개까지의 염기서열이 다양한 주형과 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계되고 상기 트리거 프라이머에 의한 PCR 증폭산물을 주형으로 하여 PCR 최종 증폭 산물이 생성되도록 프라이머 농도를 PCR 반응물에 고농도로 혼합하는 프라이머를 의미한다. 통상은 다수의 표적 유전자들의 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 주형들의 3' 말단 근처의 서열에 대해 각각 특이적인 프라이머, 즉 트리거 프라이머(TP)를 여러 개 제작하고, 이러한 트리거 프라이머들(TP) 중 공통서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하여 증폭 프라이머(AP)로 결정하게 된다.
그리고, 본 발명의 상세한 설명 전반에 있어서 사용되는 "유전자형 분석 가능 서열"이란 용어는 분석 대상이 되는 표적 유전자의 변이가 많이 존재하는 유전자 영역으로서 해당 표적 유전자의 유전자형을 다른 유전자형과 특이적으로 구별해 주는 서열(염기서열 또는 아미노산 서열)을 의미한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물은,
상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군과,
상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 제1프라이머 군은 상기 주형의 증폭 반응 초기에 모두 소진되도록 증폭 반응물에 저농도로 제공되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 의한 증폭 산물을 주형으로 하여 최종 증폭 산물이 생성되도록 상기 증폭 반응물에 고농도로 제공되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 증폭 반응물에 제공되는 제1프라이머 군의 농도는 상기 주형의 증폭 반응 초기(예를 들어, 10 내지 15 PCR 중폭 싸이클)에서 상기 주형과 결합하고 상기 주형의 증폭 산물을 일정 농도로 증폭한 후에는 모두 소진되도록 농도를 조정하는 것이 좋다. 예를 들어, 상기 제1프라이머 군의 프라이머 농도는 상기 제2프라이머 군의 프라이머 농도의 1/2 ~ 1/20이 바람직하고 1/8 ~ 1/16이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 반응 조건에 따라 변화할 수 있는 것이다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 증폭 반응물에 제공되는 상기 제1프라이머 군의 프라이머 개수에는 제한이 없으나 상기 증폭 반응물에 제공되는 상기 제1프라이머 군과 상기 제2프라이머 군의 총 프라이머의 농도는 2μM 이내인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 3' 말단의 염기서열에서 4개 이상의 염기가 상기 주형과 상보적이어야 하고 그 외의 염기서열에서도 연속적으로 3개를 초과하는 염기가 상기 주형과 미스매칭될 경우 결합이 어렵다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 제1프라이머 군의 각각의 프라이머는 변이가 존재하는 염기서열이 상기 주형과 상보적으로 결합하도록 설계하고 그 외의 염기서열은 공통 서열로서 상기 제2프라이머 군의 프라이머와 동일하게 설계되며, 프라이머 길이 역시 동일하게 설계하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 최종 증폭 산물은 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 일실시예의 프라이머 조성물에 있어서, 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 반드시 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 한 쌍으로 제공될 필요는 없고, 예를 들어 리버스 프라어머만 제공하는 경우 상기 제2프라이머 군의 포워드 프라이머와 쌍을 이루어 증폭 반응이 일어나게 된다. 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 상기 증폭 반응물에 제공된다.
또한, 본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 포함하는 PCR 증폭 키트는, 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군과, 상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군과, 폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함한다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 제1프라이머 군은 상기 주형의 증폭 반응 초기에 모두 소진되도록 증폭 반응물에 저농도로 제공되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 의한 증폭 산물을 주형으로 하여 최종 증폭 산물이 생성되도록 상기 증폭 반응물에 고농도로 제공되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 증폭 반응물에 제공되는 제1프라이머 군의 농도는 상기 주형의 증폭 반응 초기(예를 들어, 10 내지 15 PCR 중폭 싸이클)에서 상기 주형과 결합하고 상기 주형의 증폭 산물을 일정 농도로 증폭한 후에는 모두 소진되도록 농도를 조정하는 것이 좋다. 예를 들어, 상기 제1프라이머 군의 프라이머 농도는 상기 제2프라이머 군의 프라이머 농도의 1/2 ~ 1/20이 바람직하고 1/8 ~ 1/16이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 반응 조건에 따라 변화할 수 있는 것이다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 증폭 반응물에 제공되는 상기 제1프라이머 군의 프라이머 개수에는 제한이 없으나 상기 증폭 반응물에 제공되는 상기 제1프라이머 군과 상기 제2프라이머 군의 총 프라이머의 농도는 2μM 이내인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 최종 증폭 산물은 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 PCR 증폭 키트에 있어서, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 상기 증폭 반응물에 제공된다.
또한, 본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 이용한 표적 유전자 증폭 방법은,
(a) 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군을 준비하는 단계와,
(b) 상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군을 준비하는 단계와,
(c) 폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함하는 증폭 반응물에 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머와 상기 제2프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머를 첨가하여 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계와.
(d) 상기 PCR 증폭 반응 과정 초기에 상기 주형에 상보적인 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머가 결합하여 증폭반응이 이루어지고 상기 제1프라이머 군의 프라이머가 모두 소진되는 단계와,
(e) 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머에 의해 증폭된 증폭 산물을 주형으로 하여 상기 제2프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머에 의해 증폭반응을 추가로 수행하는 단계와,
(f) 상기 유전자형 분석 가능 서열을 포함하고 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 최종 증폭 산물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 제1프라이머 군은 상기 증폭 반응물에 저농도로 첨가되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 비해 고농도로 첨가되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 (c) 단계에서 상기 증폭 반응물에 첨가되는 상기 제1프라이머 군의 프라이머 농도는 상기 제2프라이머 군의 프라이머 농도의 1/2 ~ 1/20이 바람직하고 1/8 ~ 1/16이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않으며 반응 조건에 따라 변화할 수 있는 것이다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 증폭 반응물에 첨가되는 상기 제1프라이머 군과 상기 제2프라이머 군의 총 프라이머의 농도는 2μM 이내인 것이 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자 증폭 방법에 있어서, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 상기 증폭 반응물에 첨가된다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법은,
(a) 전술한 바와 같은 표적 유전자 증폭 방법에 의해 상기 표적 유전자를 증폭하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계에 의해 증폭된, 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열을 포함하고 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제한효소로 절단하여 절단된 후의 절편의 염기의 수가 제한된 범위 이내이면서 변이위치 염기를 포함하는 2가지 이상의 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 절편을 생성하는 단계와,
(c) 상기 절단된 절편의 분자량을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 제한효소 절단 후의 절편은 변이위치 염기를 포함하고, 상기 절편의 염기의 수는 2개 내지 32개인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 일실시예의 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자 증폭을 위한 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 제공된다.
본 발명에 따르면, 표적 유전자의 다수의 변이가 존재하는 유전자 영역을 간편하고 효율적으로 누락없이 정밀하게 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 특이도와 민감도를 만족시키면서 정밀하게 분석할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 PCR에서 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용함으로써, 변이가 많이 존재하는 유전자 영역을 증폭할 때 분석하고자 하는 유전자 서열(이하, "유전자형 분석 가능 서열"이라 함)을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가진 증폭산물이 생성되도록 함으로써 유전자 변이가 다양한 염기서열 부분에서의 PCR이 가능하게 함과 동시에 정확한 염기서열 또는 염기변이 분석이 가능하게 한다.
추가로, 본 발명에 따르면 "유전자형 분석 가능 서열"을 제외하고는 동일한 유전자 서열을 가진 증폭 산물을 생성하여 제한효소 절편 질량 다형성법에 의한 유전자형 분석시 나타나는 질량분석 피크의 숫자를 줄여 유전자형 분석을 용이하게 하는 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 염기변이의 분석을 필요로 하는 바이오, 의학 및 약학 분야 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭에 있어서 다수의 변종 유전자들을 간편하고 효율적으로 누락없이 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 정밀하게 분석할 수 있는 방법을 설명하는 개략도이다.
도 2는 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 HPV 59 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 3은 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 HPV 16 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 4는 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 HPV 51 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 5는 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 HPV 68 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 6은 인간의 HLA-DQB1 유전자가 헤테로(0201/0501)인 경우, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 헤테로(0201/0501)유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 7은 인간의 HLA-DQB1 유전자가 헤테로(0301/0401)인 경우, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 헤테로(0301/0401)유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 8은 염기변이 시에 아데포비어 내성을 유발하게 하는 HBV 중합효소의 236번째 코돈이 AAC로 아미노산 아스파라진(Asn)을 코딩하는 야생형 HBV 유전자형인 경우, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 야생형 HBV 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 9는 염기변이 시에 아데포비어 내성을 유발하게 하는 HBV 중합효소의 236번째 코돈이 ACT로 아미노산 트레오닌(Thr)을 코딩하는 돌연변이형 HBV 유전자형인 경우, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 수행하여 얻은 돌연변이형 HBV 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1. HPV(Human Papillomavirus) 유전자형 분석
인간의 자궁경부암을 유발하는 것으로 알려진 인유두종 바이러스(Human Papillomavirus, "HPV"라고 약칭함) 유전자형 분석을 전술한 바와 같은 제한효소 절편 질량 다형성법(이하, "RFMP 방법"이라 함)을 이용하여 수행하였다. 본 실시예 1은 HPV DNA를 대상으로 실시하였다.
HPV는 파포바 바이러스(papova virus) 계열에 속하는 DNA 바이러스로서 72개의 외각 단위단백질체(capsomer)로 이루어진 20면체이며 7,900 개의 염기서열이 이중 원형 DNA로 이루어져 있다. HPV는 게놈(genome)을 구성하고 있는 염기서열의 유사성에 따라 120 여종의 다른 아형으로 나누어진다. 이들 120 여종의 아형 중 30여 종이 하부 생식기에 감염되는 것으로 알려져 있으며, 자궁경부 상피내 종양과 자궁경부암을 유발하는 위험 정도에 따라 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-57, HPV-58, HPV-59, HPV-67, HPV-68, HPV-73, HPV-74 등의 고위험군(high risk type)과 HPV-2a, HPV-3, HPV-6, HPV-10, HPV-11, HPV-32, HPV-34, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44. HPV-54, HPV-55, HPV-61, HPV-69, HPV-70등의 저위험군(low risk type)으로 나누어진다(Munoz N et al., N Engl J Med, 2003, 348(6): 518-27). 따라서, HPV의 유전자형 분석 및 검사에 있어서 다양한 변이를 분석하기 위해 검사대상이 되는 수십종의 HPV DNA에 대해 모두 증폭이 이루어져야 하는 어려움이 있고, 그리고 고위험군 검사에 있어서의 특이도와 민감도를 모두 충족시키는 것이 특히 어렵다.
한편, HPV의 게놈 구조는 크게 초기전사부위 E (early gene region)와 후기전사부위 L (late gene region), 그리고 발현되지 않는 부위인 LCR (long control region)으로 나누어지며, HPV의 게놈 구조는 발병의 양상과 위험 정도, 예후에 커다란 영향을 끼친다. 특히 초기전사부위 중 E6와 E7 유전자는 HPV가 감염 세포의 게놈 내로 들어가 머물러 있는 동안 발현(expression)되어 발암에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 고위험군에 속하는 HPV의 E6와 E7 유전자는 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53과 rb(retinoblastoma) 유전자에서 발현되는 단백질들과 각각 결합하여 이들 단백질들을 불활성화시키며, 그 결과 세포주기(cell cycle)의 조절과 세포사멸(apoptosis) 기전이 저해됨으로써 자궁경부의 정상세포가 암세포로 변형된다. 이에 반해 HPV-6, HPV-11 등의 저위험군에 속하는 HPV의 경우 종양억제 유전자들에서 발현되는 단백질들을 불활성화시키는 능력이 떨어지므로 자궁경부암을 유발하기 어려운 것으로 알려져 있다(Barbosa M. S. et al., In vitro biological activities of the E6 and E7 genes vary among HPVs of different oncogenic potential. J. Virol., 65: 292-298, 1991).
따라서, E6와 E7 유전자와 같은 표적 유전자 내의 변이를 검출하여 유전자형을 정확히 분석하면 고위험군 HPV의 감염여부를 검사할 수 있고 이에 따라 자궁경부암의 유발원인을 사전에 탐지할 수 있다. 이하의 실시예에서는 본 출원인이 개발한 RFMP 방법에 전술한 바와 같은 트리거 프라이머 및 증폭 프라이머를 사용하여 HPV 유전자형을 분석하는 방법을 설명한다.
1. PCR 증폭
약 80여종의 HPV 유전자 염기서열을 정렬하여 "유전자형 분석가능 서열"을 결정하고 프라이머 결합부분을 선택하여 한 쌍의 증폭 프라이머(AP)를 제작한다. 즉, 증폭 프라이머(AP)는 3' 말단 근처에서 바람직하게는 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열이 다양한 HPV DNA 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계한다. 예를 들어, 3' 말단 근처의 무작위한 서열에 대해 다양한 HPV DNA 주형에 각각 특이적인 프라이머, 즉 트리거 프라이머(TP)를 여러 개 제작하고, 이러한 트리거 프라이머들(TP) 중 공통서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하여 증폭 프라이머(AP)로 결정하는 것이다. 이와 같이 설계제작된 고농도의 증폭 프라이머(AP)와 저농도의 트리거 프라이머(TP) 혼합물을 이용하여 PCR을 실시하였다.
분석대상이 되는 고위험군 HPV 유전자에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.
HPV 59
GCTCAGGGTTTAAACAATGGtatatgttggcacaatcaattgtTTTTAACAGTTGTAGATACTACTCGCAGCACCAATCTT (서열번호 1)
HPV 16
GCACAGGGCCACAATAATGGcatttgttggggtaaccaactaTTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATG (서열번호 2)
HPV 51
GCGCAGGGTCACAATAATGGcatttgctggaacaatcagcttTTTATTACCTGTGTTGATACTACCAGAAGTACAAATTTA (서열번호 3)
HPV 68
GCACAGGGACACAACAATGGtatttgttggcataatcaattaTTTCTTACTGTTGTGGATACCACTCGCAGTACCAATTTT (서열번호 4)
HPV의 주형 DNA 서열들 중 밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 1 내지 프라이머 6이 결합하는 부위들이다. 각각의 HPV 주형 DNA 서열의 앞쪽에 밑줄친 부분은 포워드 프라이머가 결합하는 부위이고, 각각의 HPV 주형 DNA 서열의 뒤쪽에 밑줄친 부분은 리버스 프라이머가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 "유전자형 분석가능 서열"이다.
* 포워드 프라이머들(forward primers)
프라이머 1. 5'- GCACAGGG CCAC AAggatgAATGG - 3' (24mer) (서열번호 5)
프라이머 2. 5'- GCACAGGG TTTA AAggatgAATGG - 3' (24mer) (서열번호 6)
* 리버스 프라이머들(reverse primers)
프라이머 3. 5'- GTAGTATCAACAACggatgTAA C AAA - 3' (26mer) (서열번호 7)
프라이머 4. 5'- GTAGTATCAACAACggatgT T A A AAA - 3' (26mer) (서열번호 8)
프라이머 5. 5'- GTAGTATCAACAACggatgTAA T AAA - 3' (26mer) (서열번호 9)
프라이머 6. 5'- GTAGTATCAACAACggatgTAA G AAA - 3' (26mer) (서열번호 10)
HPV 16 DNA 주형을 기준으로 할 때, 상기 포워드 프라이머들 중 프라이머 1은 증폭 프라이머(AP)이고, 프라이머 2는 트리거 프라이머(TP)가 된다. 또한, 상기 리버스 프라이머들중 프라이머 3은 증폭 프라이머(AP)이고, 프라이머 4 내지 프라이머 6은 트리거 프라이머(TP)가 된다. 포워드 프라이머는 3' 말단의 서열에서 5개의 염기를 HPV DNA 주형에 상보적으로 설계하였고, 리버스 프라이머는 3' 말단의 서열에서 7개의 염기를 HPV DNA 주형에 상보적으로 설계하였다. 상기 프라이머들에서 소문자로 표기된 서열은 FokI 및 BtsCI의 제한효소 인지서열로서, 본 실시예에서는 RFMP 방법을 이용하기 위해 FokI 과 BtsCI의 제한효소 인지서열을 삽입한 것이다.
예를 들어, 프라이머 1은 포워드 증폭 프라이머(AP)로서 모든 HPV 유전자형에 있어서 3' 말단의 5개 염기서열이 일치하게 설계하였고, 프라이머 2는 HPV 59 DNA 주형에 상보적인 포워드 트리거 프라이머(TP)로서 HPV 59 DNA 주형이 연속적으로 4개 이상의 염기서열(총 4개; 굵은 글씨로 표시한 염기서열 참조)에서 프라이머 1의 포워드 증폭 프라이머(AP)와 미스 매칭되어 상보적이지 않기 때문에 HPV 59에 대해서만 특별히 특이적으로 설계하였다.
그리고, 프라이머 3은 리버스 증폭 프라이머(AP)로서 HPV 16 DNA 주형을 기준으로 할 때 3' 말단의 7개 염기서열이 일치하게 설계하되, 모든 HPV 유전자형에 대해서도 3' 말단의 7개 염기서열이 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열과의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하였다. 프라이머 4는 HPV 34, HPV 59 및 HPV 73에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 네 번째 염기(A) 및 여섯 번째 염기(T)를 상기 프라이머 3과는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였다(굵은 글씨로 표시한 염기 참조). 프라이머 5는 HPV 51, HPV 70 및 HPV 82에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 네 번째 염기(T)를 상기 프라이머 3과는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였고(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 6은 HPV 39 및 HPV 68에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 네 번째 염기(G)를 상기 프라이머 3과는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였다(굵은 글씨로 표시한 염기 참조).
PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO4 2 mM, dNTP 200 mM, 백금 Taq 폴리머라아제(Platinum Taq Polymerase)(Invitrogen, 10966-026) 0.5U, 프라이머 1과 프라이머 3을 각각 0.4 μM, 프라이머 2와 프라이머 4를 각각 0.05 μM, 프라이머 5와 프라이머 6을 각각 0.025 μM, 분석대상이 되는 HPV DNA 100 ng을 넣고, 총 반응부피를 25㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다(도 1의 (A) 단계에 해당).
94℃ 5분,
94℃ 15초 45℃ 15초 72℃ 15초 (45 cycles),
72℃ 5분
초기 PCR 반응에 의해서는 각각의 HPV 주형에 상보적인 트리거 프라이머(TP)가 결합하여 PCR 증폭되어 증폭 산물이 생성된다(도 1의 (A) 단계에 해당). 이때, HPV 59 DNA 주형에는 프라이머 2 및 프라이머 4, HPV 51 DNA 주형에는 프라이머 1 및 프라이머 5, 그리고 HPV 68 DNA 주형에는 프라이머 1 및 프라이머 6이 결합하여 아래와 같은 증폭 산물이 생성되고, HPV 16 DNA 주형에는 초기 반응부터 증폭 프라이머(AP)인 프라이머 1 및 프라이머 3이 결합하여 아래와 같은 증폭 산물이 생성된다. 각각의 HPV DNA 주형에서 초기 PCR 반응(10~15 cycle)에 의해 생성되는 HPV DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HPV 59
GCACAGGGTTTAAAggatgAATGG[tatatgttggcacaatcaattgt]TTT T TAAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 11)
HPV 16
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTT G TTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 12)
HPV 51
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTT A TTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 13)
HPV 68
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTT C TTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 14)
한편, 각각의 HPV DNA 주형에 특이적인 트리거 프라이머(TP)가 결합(HPV 16 DNA의 경우는 증폭 프라이머(AP)가 트리거 프라이머(TP) 역할을 하여 HPV 16 DNA 주형에 결합)하여 증폭이 이루어지는데, PCR 증폭과정에서 초기에 저농도로 넣은 트리거 프라이머(TP)가 모두 소진되고 각각의 HPV DNA 단편이 일정 농도로 증폭된 이후에는 각각의 HPV DNA 단편의 프라이머 결합서열 일부에 있어서 트리거 프라이머(TP)와 다른 증폭 프라이머(AP)가 HPV DNA 주형에 결합하여 증폭이 이루어지게 된다(도 1의 (B) 단계). 이는 증폭 프라이머(AP)인 프라이머 3의 최초 설계시 모든 HPV 유전자형에 대해서 3' 말단의 7개 염기서열이 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열과의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하였고 PCR 증폭시 트리거 프라이머(TP) 보다 고농도로 넣었기 때문에 가능한 것이다.
이로써 본 실시예에 따르면, "유전자형 분석가능 서열"만이 다양한 HPV DNA 주형에 의해 복제되고 그 외의 서열(아래의 염기서열에서 대괄호로([]) 표시된 염기서열을 제외한 서열)은 증폭 프라이머(AP)에 의해 복제되어 동일한 염기서열을 가지게 된다(도 1의 (C) 단계). 최종 PCR 증폭 생성물은 증폭 프라이머(AP)에 의한 증폭 생성물이 대부분을 차지하게 되고 트리거 프라이머(TP)에 의한 증폭 생성물은 분석결과에 영향을 미치지 못할 정도의 미량만이 존재한다. 각각의 HPV DNA 주형에서 최종적으로 생성되는 각각의 HPV DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HPV 59
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatatgttggcacaatcaattgt]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 15)
HPV 16
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 16)
HPV 51
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 17)
HPV 68
GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC (서열번호 18)
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "유전자형 분석가능 서열"이다.
한편, 본 실시예에서는 HPV 59, HPV 16, HPV 51, HPV 68에 대해서만 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 실시하였으나, 전술한 HPV 타입 중 기타 여러 종류의 고위험군 HPV 및/또는 저위험군 HPV에 대해서도 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 응용할 수 있음을 본 발명이 속한 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
상기 PCR을 통해 증폭된 생성물에 FokI(NEB R109L) 1 U, BtsCI(NEB R0647S) 1 U, 50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM 트리스-아세테이트(Tris-acetate), 10 mM 마그네슘 아세테이트, 및 1 mM DTT(25℃에서 PH 7.9)를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다.
제한효소로 처리한 상기 용액으로부터 절단된 DNA 절편을 순수분리한 후, 분리된 DNA 절편의 분자량을 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제한효소에 의해 절단된 DNA 절편의 순수 분리를 위해 Oasis (Waters) C18 이온 수지 교환 컬럼 (C18 reverse phase column chromatography)을 이용할 수 있다. 먼저, 상기 제한효소로 처리한 용액에 0.15M 트리에틸암모늄아세테이트(TEAA, pH 7.6) 70 ㎕를 넣어 1분간 둔다. 컬럼에 100% 아세토니트릴(ACN; Sigma, USA)과 0.1M TEAA 1 ㎖을 통과시켜 레진(Resin)을 활성화시킨 후, 상기 제한효소로 처리한 용액과 0.15M TEAA와의 혼합액 100 ㎕, 0.1M TEAA 2 ㎖ 및 3차 증류수 1 ㎖를 차례로 완전히 통과시킨다. 수집 플레이트(Collection Plate) 위에 상기 컬럼을 위치시키고, 70% ACN 100 ㎕을 넣어 통과시킨다. 용출액이 수집 플레이트에 모아지면, 상기 수집 플레이트를 120℃에서 60분간 건조시킨다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리(MALDI-TOF Mass Spectrometry)
말디 매트릭스(MALDI matrix)[22.8 ㎎ 암모늄 시트레이트, 148.5 ㎎ 히드록시피콜린산(hydroxypicolinic acid), 1.12 ㎖ 아세토니트릴, 7.8 ㎖ H2O] 4 ㎕를 말디-토프 매스 스펙트로메트리(Biflex IV, Bruker)의 앵커 칩 플레이트(Anchor chip plate)에 미리 점적(dotting)한 후, 37℃에서 30분 동안 건조시킨다. 정제 및 탈염 과정을 거친 수집 플레이트의 샘플에 3차 증류수를 10 ㎕을 넣어 녹여낸 후, 건조된 말디 매트릭스 위에 2 ㎕ 점적하고, 말디 매트릭스를 다시 37℃에서 30분 동안 건조시킨 후, 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한다. 분석방법은 말디-토프 매스 스펙트로메트리의 매뉴얼을 따른다.
상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한 결과는 도 2 내지 도 5에 도시되는 바와 같고, 다양한 HPV에 대한 분석결과를 정리하여 분자량으로서 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1의 결과를 기초로 HPV의 유전자형을 결정할 수 있다.
하기 표 1은 증폭 프라이머(AP)에 의해 증폭된 생성물을 토대로 예측한 절편들의 분자량을 나타낸 것이고, 트리거 프라이머(TP)에 의해 증폭된 생성물에 의한 절편의 분자량과는 차이가 있다. 본 실시예에 따르면 각각의 트리거 프라이머(TP)를 반응 농도 이상 혼합하였을 때는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량과 트리거 프라이머(TP)에 의한 절편의 분자량이 동시에 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 트리거 프라이머(TP)를 반응 농도 이하로 혼합하였을 때는 해당 HPV 유전자의 분석이 이루어지지 않았다.
한편, 도 2 내지 도 5에 도시된 HPV 59, HPV 16, HPV 51 및 HPV 68 유전자형의 말디-토프 매스 스텍트로메트리 그래프를 분석하면 본 실시예에 따른 증폭산물에서는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량만이 확인되는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법은 다수의 변종 유전자들을 간편하고 효율적으로 누락없이 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 정밀하게 분석할 수 있는 장점이 있다.
표 1
Figure PCTKR2011002805-appb-I000001
실시예 2. HLA(Human Leukocyte Antigen)-DQB1 유전자형 분석
한편, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭이 다양한 유전자형 분석에 이용가능한지 여부를 추가로 확인하였다. 이를 위해인간의 면역 반응과 관련된 주요 조직적합성 항원인 HLA(Human Leukocyte Antigen)-DQB1 유전자형 분석을 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 이용하여 수행하였다. 실시예 2는 인간의 게놈 DNA를 대상으로 수행하였다.
1. PCR 증폭
약 100여종의 HLA-DQB1 유전자 염기서열을 정렬하여 "유전자형 분석가능 서열"을 결정하고 프라이머 결합부분을 선택하여 한 쌍의 증폭 프라이머(AP)를 제작하였다. 또한, HLA-DQB1 *0201 타입의 3' 말단과 5' 말단의 특이적인 서열에 대해 HLA-DQB1 *0201 DNA 주형과 상보적으로 결합할 수 있도록 한 쌍의 트리거 프라이머(TP)를 설계하였다. 이와 같이 설계제작된 고농도의 증폭 프라이머(AP)와 저농도의 트리거 프라이머(TP) 혼합물을 이용하여 PCR을 실시하였다.
분석대상이 되는 HLA-DQB1 대립유전자에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.
HLA-DQB1 *0501
TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcggggtgtgaccagacACATCTATAACCGAGAGGAGTACGTGCGCTTCGAC (서열번호 19)
HLA-DQB1 *0201
TGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCgcgtgcgtcttgtgagcagaaGCATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGAC (서열번호 20)
HLA-DQB1 *0401
TGTGCTACTTCACCAACGGGACCGAGCtcgtgcggggtgtgaccagatACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGAC (서열번호 21)
HLA-DQB1 *0301
TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcgttatgtgaccagatACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCACGCTTCGAC (서열번호 22)
HLA-DQB1 대립유전자 주형 DNA 서열들 중 밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 7 내지 프라이머 10이 결합하는 부위들이다. 각각의 HLA-DQB1 대립유전자 주형 DNA 서열의 앞쪽에 밑줄친 부분은 포워드 프라이머가 결합하는 부위이고, 각각의 HLA-DQB1 대립유전자 주형 DNA 서열의 뒤쪽에 밑줄친 부분은 리버스 프라이머가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 "유전자형 분석가능 서열"이다.
프라이머 7. 5'- TGTGCTACTTCACCAACggatgGAC G GAGC - 3' (30mer)
(서열번호 23)
프라이머 8. 5'- GCGTGCGTACTCCTCTCGGTggatgATAGATGT - 3' (33mer)
(서열번호 24)
프라이머 9. 5'- TGTGCTACTTCACCAACggatgGAC A GAGC - 3' (30mer)
(서열번호 25)
프라이머 10. 5'- GCGCACGATCTCTTCTCGGTggatgATAGATGC - 3' (33mer)
(서열번호 26)
포워드 프라이머인 프라이머 7은 증폭 프라이머(AP)이고, 포워드 프라이머인 프라이머 9는 트리거 프라이머(TP)가 된다. 또한, 리버스 프라이머인 프라이머 8은 증폭 프라이머(AP)이고, 리버스 프라이머인 프라이머 10은 트리거 프라이머(TP)가 된다. 포워드 프라이머는 3' 말단의 서열에서 4개의 염기를 HLA-DQB1 DNA 주형에 상보적으로 설계하였고, 리버스 프라이머는 3' 말단의 서열에서 7개의 염기를 HLA-DQB1 DNA 주형에 상보적으로 설계하였다. 상기 프라이머들에서 소문자로 표기된 서열은 FokI 및 BtsCI의 제한효소 인지서열로서, 본 실시예에서는 RFMP 방법을 이용하기 위해 FokI 과 BtsCI의 제한효소 인지서열을 삽입한 것이다.
예를 들어, 프라이머 7은 포워드 증폭 프라이머(AP)로서 모든 HLA-DQB1 유전자형에 있어서 3' 말단의 4개 염기서열이 일치하게 설계하였고, 프라이머 9는 HLA-DQB1 *0201 DNA 주형에 상보적인 포워드 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 1개 염기서열(A; 굵은 글씨로 표시한 염기서열 참조)에서 프라이머 7의 포워드 증폭 프라이머(AP)와 상보적이지 않기 때문에 HLA-DQB1 *0201에 대해서 특별히 특이적으로 설계하였다.
또한, 프라이머 8은 리버스 증폭 프라이머(AP)로서 HLA-DQB1 *0201 타입을 제외한 모든 HLA-DQB1 유전자형에 있어서 3' 말단의 7개 염기서열이 일치하게 설계하였고, 프라이머 10은 HLA-DQB1 *0201 DNA 주형에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 1개의 염기서열과 5' 말단의 5개의 염기서열을 특이적으로 설계하였다.
PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO4 2 mM, dNTP 200 mM, 백금 Taq 폴리머라아제(Platinum Taq Polymerase)(Invitrogen, 10966-026) 0.5U, 프라이머 7과 프라이머 8을 각각 0.4 μM, 프라이머 9와 프라이머 10을 각각 0.025 μM, 인간 DNA 100 ng을 넣고, 총 반응부피를 25㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다(도 1의 (A) 단계에 해당).
94℃ 5분,
94℃ 15초 45℃ 15초 72℃ 15초 (45 cycles),
72℃ 5분
초기 PCR 반응에 의해서는 각각의 HLA-DQB1 주형에 상보적인 트리거 프라이머(TP)가 결합하여 PCR 증폭되어 증폭 산물이 생성된다(도 1의 (A) 단계에 해당). 예를 들어, HLA-DQB1 *0201 타입의 DNA 주형에는 프라이머 9 및 프라이머 10이 결합하여 아래와 같은 증폭 산물이 생성된다. HLA-DQB1 *0201 타입의 DNA 주형에서 초기 PCR 반응(10~15 cycle)에 의해 생성되는 HLA-DQB1 *0201 DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HLA-DQB1 *0201
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACAGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa]GCATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGTGCGC (서열번호 27)
한편, HLA-DQB1 *0201 타입에 특이적인 트리거 프라이머(TP)가 결합하여 증폭이 이루어지는데, PCR 증폭과정에서 초기에 저농도로 넣은 트리거 프라이머(TP)가 모두 소진되고 각각의 HLA-DQB1 DNA 단편이 일정 농도로 증폭된 이후에는 각각의 HLA-DQB1 DNA 단편의 프라이머 결합서열 일부에 있어서 트리거 프라이머(TP)와는 일부 서열이 다른 증폭 프라이머(AP)가 HLA-DQB1 DNA 주형에 결합하여 증폭이 이루어지게 된다(도 1의 (B) 단계). 이는 증폭 프라이머(AP)인 프라이머 8의 최초 설계시 모든 HLA-DQB1 유전자형에 대해서 3' 말단의 7개 염기서열이 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열과의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하였고 PCR 증폭시 트리거 프라이머(TP) 보다 고농도로 넣었기 때문에 가능한 것이다.
이로써 본 실시예에 따르면, "유전자형 분석가능 서열"만이 다양한 HLA-DQB1 DNA 주형에 의해 복제되고 그 외의 서열(아래의 염기서열에서 대괄호로([]) 표시된 염기서열을 제외한 서열)은 증폭 프라이머(AP)에 의해 복제되어 동일한 염기서열을 가지게 된다(도 1의 (C) 단계). 최종 PCR 증폭 생성물은 증폭 프라이머(AP)에 의한 증폭 생성물이 대부분을 차지하게 되고 트리거 프라이머(TP)에 의한 증폭 생성물은 분석결과에 영향을 미치지 못할 정도의 미량만이 존재한다. 각각의 HLA-DQB1 DNA 주형에서 최종적으로 생성되는 각각의 HLA-DQB1 DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HLA-DQB1 *0501
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcggggtgtgaccagac]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC (서열번호 28)
HLA-DQB1 *0201
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa]ACATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGCACGC (서열번호 29)
HLA-DQB1 *0401
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[tcgtgcggggtgtgaccagat]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC (서열번호 30)
HLA-DQB1 *0301
TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcgttatgtgaccagat]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC (서열번호 31)
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "유전자형 분석가능 서열"이다. 상기 증폭 생성물의 생성 원리는 실시예 1과 동일하다.
한편, 본 실시예에서는 HLA-DQB1 *0501, HLA-DQB1 *0201, HLA-DQB1 *0401, HLA-DQB1 *0301에 대해서만 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 실시하였으나, 전술한 HLA-DQB1 타입 중 기타 여러 종류의 대립유전자에 대해서도 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 응용할 수 있음을 본 발명이 속한 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한 결과는 도 6 및 도 7에 도시되는 바와 같고, 다양한 HLA-DQB1 대립유전자에 대한 분석결과를 정리하여 분자량으로서 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2의 결과를 기초로 HLA-DQB1의 유전자형을 결정할 수 있다.
하기 표 2는 증폭 프라이머(AP)에 의해 증폭된 생성물을 토대로 예측한 절편들의 분자량을 나타낸 것이고, 트리거 프라이머(TP)에 의해 증폭된 생성물에 의한 절편의 분자량과는 차이가 있다. 본 실시예에 따르면 트리거 프라이머(TP)를 0.025 μM 이상 혼합하였을 때는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량과 트리거 프라이머(TP)에 의한 절편의 분자량이 동시에 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 트리거 프라이머(TP)를 0.025 μM 이하로 혼합하였을 때는 해당 HLA-DQB1 유전자의 분석이 이루어지지 않았다.
한편, 도 6에는 인간의 HLA-DQB1 유전자가 헤테로(0201/0501)인 경우의 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프가 도시되어 있고, 도 7에는 인간의 HLA-DQB1 유전자가 헤테로(0301/0401)인 경우의 유전자형의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프가 도시되어 있다. 이들 말디-토프 매스 스텍트로메트리 그래프를 분석하면 본 실시예에 따른 증폭산물에서는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량만이 확인되는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법은 다수의 변종 유전자들을 간편하고 효율적으로 누락없이 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 정밀하게 분석할 수 있는 장점이 있다.
표 2
Figure PCTKR2011002805-appb-I000002
실시예 3. B형 간염 바이러스(hepatitis B virus) DNA 중합효소의 아데포비어에 대한 내성 관련 염기변이 분석
인간에게 B형 간염을 유발시키는 B형 간염바이러스의 DNA 중합효소 유전자 내에는 염기변이가 많이 나타난다. 이들 부위 중 일부의 염기변이에 의하여 B형 간염의 치료제인 아데포비어(Adefovir)에 대한 내성이 발생하는데, 아미노산 A181V/T, N236T 등이 원인 돌연변이로 보고되고 있다. 한편, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭이 다양한 유전자형 분석에 이용가능한지 여부를 추가로 확인하기 위해 아데포비어 약제 내성을 가진 B형 간염 바이러스 유전자형 분석을 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법을 이용하여 수행하였다. 실시예 3은 HBV DNA를 대상으로 실시하였다.
1. PCR 증폭
B형 간염바이러스의 DNA 중합효소 유전자 내의 236번째 아미노산 염기서열 분석을 위해 한 쌍의 증폭 프라이머(AP)를 제작하였고, 다형성을 가지는 237번째 아미노산, 238번째 아미노산 염기서열에 대해 다양한 HBV DNA 주형에 각각 특이적인 프라이머, 즉 트리거 프라이머(TP)를 여러 개 설계하였다. 이와 같이 설계제작된 고농도의 증폭 프라이머(AP)와 저농도의 트리거 프라이머(TP) 혼합물을 이용하여 PCR을 실시하였다.
분석대상이 되는 HBV 유전자에서 프라이머에 의해 증폭되는 주형 DNA 서열(5'→3')은 하기와 같다.
HBV # 1 (일반형)
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTAATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 32)
HBV # 2
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTACTAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 33)
HBV # 3
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTGATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 34)
HBV # 4
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTCATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 35)
HBV # 5
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATAATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 36)
HBV # 6
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATACTAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 37)
HBV # 7
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATGATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 38)
HBV # 8
TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATCATAAAACCAAACGTTGGG
(서열번호 39)
HBV의 주형 DNA 서열들 중 밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 11 내지 프라이머 19가 결합하는 부위들이다. 각각의 HBV 주형 DNA 서열의 앞쪽에 밑줄친 부분은 포워드 프라이머가 결합하는 부위이고, 각각의 HBV 주형 DNA 서열의 뒤쪽에 밑줄친 부분은 리버스 프라이머가 결합하는 부위이다. 소문자로 표기된 염기는 "유전자형 분석가능 서열"이다.
* 포워드 프라이머
프라이머 11. 5'- TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT - 3' (39mer)
(서열번호 40)
* 리버스 프라이머들
프라이머 12. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTAGG - 3' (27mer) (서열번호 41)
프라이머 13. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTA G TAGG - 3' (27mer) (서열번호 42)
프라이머 14. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTAT C AGG - 3' (27mer) (서열번호 43)
프라이머 15. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTAT G AGG - 3' (27mer) (서열번호 44)
프라이머 16. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTA T G - 3' (27mer) (서열번호 45)
프라이머 17. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTA G TA T G - 3' (27mer) (서열번호 46)
프라이머 18. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTAT C A T G - 3' (27mer) (서열번호 47)
프라이머 19. 5'- CCCAACGTTTggatgGGTTTTAT G A T G - 3' (27mer) (서열번호 48)
HBV #1 DNA 주형을 기준으로 할 때, 포워드 프라이머인 프라이머 11은 증폭 프라이머(AP)이고, 상기 리버스 프라이머들 중 프라이머 12는 증폭 프라이머(AP)이며, 프라이머 13 내지 프라이머 19는 트리거 프라이머(TP)가 된다. 포워드 프라이머는 3' 말단의 서열에서 19개의 염기를 HBV DNA 주형에 상보적으로 설계하였고, 리버스 프라이머는 3' 말단의 서열에서 12개의 염기를 HBV DNA 주형에 상보적으로 설계하였다. 상기 프라이머들에서 소문자로 표기된 서열은 FokI 제한효소 인지서열로서, 본 실시예에서는 RFMP 방법을 이용하기 위해 FokI의 제한효소 인지서열을 삽입한 것이다.
예를 들어, 프라이머 11은 포워드 증폭 프라이머(AP)로서 모든 HBV 유전자형에 있어서 3' 말단의 19개 염기서열이 일치하게 설계하였고, 프라이머 12는 리버스 증폭 프라이머(AP)로서 HBV # 1 DNA 주형을 기준으로 할 때 3' 말단의 12개 염기서열이 일치하게 설계하되, 모든 HBV 유전자형에 대해서도 3' 말단의 12개 염기서열이 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열과의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하였다.
그리고, 변종 HBV의 경우 DNA의 3' 말단에서 일반형 HBV와는 다른 염기서열을 갖고 있는 점을 감안하여 프라이머 13 내지 19는 HBV DNA의 237번째 아미노산 염기서열 및 238번째 아미노산 염기서열에 대한 변이별 특이적인 프라이머로서 설계하였다. 즉, 프라이머 13는 HBV # 2에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 다섯 번째 염기(G)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였고(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 14는 HBV # 3에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 네 번째 염기 서열(C)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였으며(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 15는 HBV # 4에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 네 번째 염기 서열(G)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였고(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 16은 HBV # 5에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 두 번째 염기 서열(T)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였으며(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 17은 HBV # 6에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 두 번째 염기 서열(T) 및 다섯 번째 염기 서열(G)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였고(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 프라이머 18은 HBV # 7에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 두 번째 염기 서열(T) 및 네 번째 염기 서열(C)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였으며(굵은 글씨로 표시한 염기 참조), 마지막으로 프라이머 19는 HBV # 8에 상보적인 리버스 트리거 프라이머(TP)로서 3' 말단의 두 번째 염기 서열(T) 및 네 번째 염기 서열(G)을 상기 프라이머 12와는 다르게 변이를 주어 특이적으로 설계하였다(굵은 글씨로 표시한 염기 참조).
PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO4 2 mM, dNTP 200 mM, 백금 Taq 폴리머라아제(Platinum Taq Polymerase)(Invitrogen, 10966-026) 0.5U, 프라이머 11과 프라이머 12를 각각 0.4 μM, 프라이머 13과 프라이머 14를 각각 0.07 μM, 프라이머 15와 프라이머 16을 각각 0.04 μM, 프라이머 17, 18 및 19는 각각 0.05 μM, 분석대상이 되는 HBV DNA 100 ng을 넣고, 총 반응부피를 25㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다(도 1의 (A) 단계에 해당).
94℃ 5분,
94℃ 15초 45℃ 15초 72℃ 15초 (45 cycles),
72℃ 5분
초기 PCR 반응에 의해서는 각각의 HBV 주형에 상보적인 트리거 프라이머(TP)가 결합하여 PCR 증폭되어 증폭 산물이 생성된다(도 1의 (A) 단계에 해당). 이때, HBV # 2 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 13, HBV # 3 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 14, HBV # 4 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 15, HBV # 5 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 16, HBV # 6 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 17, HBV # 7 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 18, 그리고 HBV # 8 DNA 주형에는 프라이머 11 및 프라이머 19가 결합하여 아래와 같은 증폭 산물이 생성되고, HBV # 1 DNA 주형에는 초기 반응부터 증폭 프라이머(AP)인 프라이머 11 및 프라이머 12가 결합하여 아래와 같은 증폭 산물이 생성된다. 각각의 HBV DNA 주형에서 초기 PCR 반응(10~15 cycle)에 의해 생성되는 HBV DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HBV # 1 (일반형)
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 49)
HBV # 2
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTACTAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 50)
HBV # 3
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTGATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 51)
HBV # 4
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTCATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 52)
HBV # 5
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 53)
HBV # 6
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATACTAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 54)
HBV # 7
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATGATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 55)
HBV # 8
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATCATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 56)
한편, 각각의 HBV DNA 주형에 특이적인 트리거 프라이머(TP)가 결합(HBV # 1 DNA의 경우는 증폭 프라이머(AP)가 트리거 프라이머(TP) 역할을 하여 HBV #1 DNA 주형에 결합)하여 증폭이 이루어지는데, PCR 증폭과정에서 초기에 저농도로 넣은 트리거 프라이머(TP)가 모두 소진되고 각각의 HBV DNA 단편이 일정 농도로 증폭된 이후에는 각각의 HBV DNA 단편의 프라이머 결합서열 일부에 있어서 트리거 프라이머(TP)와는 일부 서열이 다른 증폭 프라이머(AP)가 HBV DNA 주형에 결합하여 증폭이 이루어지게 된다(도 1의 (B) 단계). 이는 증폭 프라이머(AP)인 프라이머 12의 최초 설계시 모든 HBV 유전자형에 대해서 3' 말단의 12개 염기서열이 1∼2개의 염기서열, 최대한 연속적으로 3개의 염기서열과의 미스매칭을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있도록 설계하였고 PCR 증폭시 트리거 프라이머(TP) 보다 고농도로 넣었기 때문에 가능한 것이다.
이로써 본 실시예에 따르면, "유전자형 분석가능 서열"만이 다양한 HBV DNA 주형에 의해 복제되고 그 외의 서열(아래의 염기서열에서 대괄호로([]) 표시된 염기서열을 제외한 서열)은 증폭 프라이머(AP)에 의해 복제되어 동일한 염기서열을 가지게 된다(도 1의 (C) 단계). 최종 PCR 증폭 생성물은 증폭 프라이머(AP)에 의한 증폭 생성물이 대부분을 차지하게 되고 트리거 프라이머(TP)에 의한 증폭 생성물은 분석결과에 영향을 미치지 못할 정도의 미량만이 존재한다. 각각의 HBV DNA 주형에서 최종적으로 생성되는 각각의 HBV DNA 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
HBV # 1 (일반형)
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 57)
HBV # 2
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 58)
HBV # 3
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 59)
HBV # 4
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 60)
HBV # 5
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 61)
HBV # 6
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 62)
HBV # 7
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 63)
HBV # 8
TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG (서열번호 64)
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "유전자형 분석가능 서열"이다. 상기 증폭 생성물의 생성 원리는 실시예 1과 동일하다.
한편, 본 실시예에서는 HBV # 1 부터 HBV # 8에 대해서만 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 실시하였으나, 전술한 다른 변종 HBV에 대해서도 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭을 응용할 수 있음을 본 발명이 속한 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
상기 반응에 의해 생성된 절편들의 분자량을 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한 결과는 도 8 및 도 9에 도시되는 바와 같고, 다양한 HBV에 대한 분석결과를 정리하여 분자량으로서 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3의 결과를 기초로 HBV의 유전자형을 결정할 수 있다.
하기 표 3은 증폭 프라이머(AP)에 의해 증폭된 생성물을 토대로 예측한 절편들의 분자량을 나타낸 것이고, 트리거 프라이머(TP)에 의해 증폭된 생성물에 의한 절편의 분자량과는 차이가 있다. 본 실시예에 따르면 각각의 트리거 프라이머(TP)를 반응 농도 이상 혼합하였을 때는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량과 트리거 프라이머(TP)에 의한 절편의 분자량이 동시에 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 트리거 프라이머(TP)를 반응 농도 이하로 혼합하였을 때는 해당 HBV 유전자의 분석이 이루어지지 않았다.
한편, 도 8에는 염기변이 시에 아데포비어 내성을 유발하게 하는 HBV 중합효소의 236번째 코돈이 AAC로 아미노산 아스파라진(Asn)을 코딩하는 야생형 HBV 유전자형인 경우의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프가 도시되어 있고, 도 9에는 염기변이 시에 아데포비어 내성을 유발하게 하는 HBV 중합효소의 236번째 코돈이 ACT로 아미노산 트레오닌(Thr)을 코딩하는 돌연변이형 HBV 유전자형인 경우의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프가 도시되어 있다. 이들 말디-토프 매스 스텍트로메트리 그래프를 분석하면 본 실시예에 따른 증폭산물에서는 증폭 프라이머(AP)에 의한 절편의 분자량만이 확인되는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 트리거 프라이머(TP)와 증폭 프라이머(AP)를 이용한 PCR 증폭 후 RFMP 방법은 다수의 변종 유전자들을 간편하고 효율적으로 누락없이 증폭할 수 있고 다수의 유전자형을 정밀하게 분석할 수 있는 장점이 있다.
표 3
Figure PCTKR2011002805-appb-I000003
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (28)

  1. 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물에 있어서,
    상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군과,
    상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군을 포함하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1프라이머 군은 상기 주형의 증폭 반응 초기에 모두 소진되도록 증폭 반응물에 저농도로 제공되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 의한 증폭 산물을 주형으로 하여 최종 증폭 산물이 생성되도록 상기 증폭 반응물에 고농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 최종 증폭 산물은 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 증폭 반응물에 제공되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물.
  8. 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 포함하는 PCR 증폭 키트에 있어서,
    상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군과,
    상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군과,
    폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함하는 PCR 증폭 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1프라이머 군은 상기 주형의 증폭 반응 초기에 모두 소진되도록 증폭 반응물에 저농도로 제공되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 의한 증폭 산물을 주형으로 하여 최종 증폭 산물이 생성되도록 상기 증폭 반응물에 고농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 최종 증폭 산물은 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 증폭 반응물에 제공되는 것을 특징으로 하는 PCR 증폭 키트.
  15. 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 이용한 표적 유전자 증폭 방법에 있어서,
    (a) 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열이 포함된 적어도 하나의 주형에 각각 특이적인 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제1프라이머 군을 준비하는 단계와,
    (b) 상기 제1프라이머 군의 프라이머들 중 공통 염기서열이 가장 많은 프라이머 하나를 선정하고 이를 기준으로 하여 설계된 적어도 하나의 프라이머로서, 상기 주형에 특이적으로 결합하거나 3' 말단 근처에서 1∼2개의 염기서열 또는 연속적으로 3개까지의 염기서열이 상기 주형과 미스매칭되면서 상보적으로 결합하는 적어도 하나의 프라이머를 포함하는 제2프라이머 군을 준비하는 단계와,
    (c) 폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함하는 증폭 반응물에 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머와 상기 제2프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머를 첨가하여 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계와.
    (d) 상기 PCR 증폭 반응 과정 초기에 상기 주형에 상보적인 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머가 결합하여 증폭반응이 이루어지고 상기 제1프라이머 군의 프라이머가 모두 소진되는 단계와,
    (e) 상기 제1프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머에 의해 증폭된 증폭 산물을 주형으로 하여 상기 제2프라이머 군의 적어도 하나의 프라이머에 의해 증폭반응을 추가로 수행하는 단계와,
    (f) 상기 유전자형 분석 가능 서열을 포함하고 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 가지도록 증폭된 최종 증폭 산물을 수득하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 이용한 표적 유전자 증폭 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 제1프라이머 군은 상기 증폭 반응물에 저농도로 첨가되고, 상기 제2프라이머 군은 상기 제1프라이머 군에 비해 고농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 증폭 반응물에 첨가되는 상기 제1프라이머 군의 프라이머 농도는 상기 제2프라이머 군의 프라이머 농도의 1/2 ~ 1/20인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 증폭 반응물에 첨가되는 상기 제1프라이머 군의 프라이머 농도는 상기 제2프라이머 군의 프라이머 농도의 1/8 ~ 1/16인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 상기 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 상기 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 상기 증폭 반응물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 증폭 방법.
  23. 표적 유전자의 다양한 변이가 존재하는 유전자 영역을 증폭하기 위한 프라이머 조성물을 이용한 표적 유전자의 유전자형 분석방법에 있어서,
    (a) 청구항 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 표적 유전자 증폭 방법에 의해 상기 표적 유전자를 증폭하는 단계와,
    (b) 상기 (a) 단계에 의해 증폭된, 상기 표적 유전자의 분석 대상이 되는 유전자 변이 염기서열인 유전자형 분석 가능 서열을 포함하고 상기 유전자형 분석 가능 서열을 제외한 부분에서는 동일한 유전자 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 제한효소로 절단하여 절단된 후의 절편의 염기의 수가 제한된 범위 이내이면서 변이위치 염기를 포함하는 2가지 이상의 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 절편을 생성하는 단계와,
    (c) 상기 절단된 절편의 분자량을 측정하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제한효소 절단 후의 절편은 변이위치 염기를 포함하고, 상기 절편의 염기의 수는 2개 내지 32개인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HPV 유전자인 경우에 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 6, 서열번호 8 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 7로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HLA-DQB1 유전자인 경우에 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자가 HBV 유전자인 경우에 제1프라이머 군의 프라이머는 서열번호 42 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머이고, 제2프라이머 군의 프라이머는 서열번호 40 및 서열번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
  28. 제23항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 증폭되는 상기 표적 유전자 증폭을 위한 제2프라이머 군의 프라이머는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 제공되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 유전자형 분석방법.
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