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WO2011118671A1 - 組み換え微生物及びこれを用いた脂肪族ポリエステルの製造方法 - Google Patents

組み換え微生物及びこれを用いた脂肪族ポリエステルの製造方法 Download PDF

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WO2011118671A1
WO2011118671A1 PCT/JP2011/057077 JP2011057077W WO2011118671A1 WO 2011118671 A1 WO2011118671 A1 WO 2011118671A1 JP 2011057077 W JP2011057077 W JP 2011057077W WO 2011118671 A1 WO2011118671 A1 WO 2011118671A1
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WO
WIPO (PCT)
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gene
aliphatic polyester
derived
protein
lactic acid
Prior art date
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Application number
PCT/JP2011/057077
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English (en)
French (fr)
Inventor
村松正善
神戸浩美
伊藤正和
嶋村隆
幸田勝典
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyota Motor Corp
Original Assignee
Toyota Motor Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP11759476.2A priority patent/EP2551349A4/en
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Priority to CN201180015803.9A priority patent/CN102844439B/zh
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
    • C12Y208/03001—Propionate CoA-transferase (2.8.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism imparted with a desired function by introducing a predetermined gene into a host microorganism and a method for producing an aliphatic polyester using the same.
  • Aliphatic polyesters are attracting attention as biodegradable plastics that are easily degraded in nature and as “green” plastics that can be synthesized from renewable carbon resources such as sugar and vegetable oils.
  • aliphatic polyesters having a lactic acid skeleton such as polylactic acid are practically used.
  • Patent Document 1 discloses a recombinant E. coli in which a gene encoding an enzyme that converts lactic acid into lactic acid CoA and a gene encoding an enzyme that synthesizes polyhydroxyalkanoic acid using lactic acid CoA as a substrate are introduced into E. coli serving as a host. ing.
  • Clostridium propionicum-derived pct gene is used as a gene encoding an enzyme that converts lactic acid into lactic acid CoA.
  • the phaC2 gene derived from Pseudomonas sp. 61-3 strain is used as a gene encoding an enzyme that synthesizes polyhydroxyalkanoic acid using lactic acid CoA as a substrate.
  • Patent Document 1 it cannot be said that the productivity of aliphatic polyesters such as polylactic acid is sufficient, and various studies are insufficient to improve the productivity.
  • Patent Document 2 (WO 2008/062999) describes the ability to synthesize lactic acid homopolymers or polylactic acid copolymers using lactic acid CoA as a substrate by introducing a specific mutation into the phaC1 gene derived from Pseudomonas sp. 6-19. Attempts have been made to increase
  • the technology for producing an aliphatic polyester such as polylactic acid using a recombinant microorganism as described above accumulates the aliphatic polyester in the microorganism, and crushes the microorganism to recover the desired aliphatic polyester. It was something to do.
  • aliphatic polyesters such as polylactic acid are used in recombinant microorganisms into which a propionyl CoA transferase gene and a polyhydroxyalkanoate synthase gene derived from a predetermined microorganism have been introduced. It was found that it was produced outside the body, and the present invention was completed.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing an aliphatic polyester comprising culturing the recombinant microorganism and recovering the aliphatic polyester from the medium.
  • the gene encoding the protein having the activity of synthesizing polyhydroxyalkanoic acid using hydroxyacyl-CoA as a substrate is a gene derived from Alcanivorax kukumensis, a gene derived from Hyphomonas neptunium, a gene derived from Rhodobacter ero sphaeroides, or a gene derived from Rhozobium etli
  • the method for producing an aliphatic polyester according to (1) which is at least one gene selected from a gene derived from Pseudomonas sp. And a gene derived from Haloarcula marismortui.
  • the gene encoding a protein having an activity of synthesizing polyhydroxyalkanoic acid using hydroxyacyl-CoA as a substrate is a gene shown in the following (a) to (c): Of producing aliphatic polyester.
  • a gene encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18 (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18 A gene encoding a protein having the above-mentioned activity, comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted or added, as shown in SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17 A gene that hybridizes to a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence under stringent conditions and encodes a protein having the above activity (9)
  • Activity to convert lactic acid into lactate CoA for the host microorganism Has the activity of synthesizing polyhydroxyalkanoic acid using hydroxyacyl-CoA as a substrate
  • the gene encoding a protein having an activity of synthesizing polyhydroxyalkanoic acid using hydroxyacyl-CoA as a substrate is a gene shown in the following (a) to (c): Recombinant microorganisms.
  • a gene encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18 (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16 or 18 A gene encoding a protein having the above-mentioned activity, comprising an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted or added, as shown in SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15 or 17 A gene that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence and encodes a protein having the above activity (11)
  • the host microorganism is E. coli (9 ) The recombinant microorganism described.
  • a recombinant microorganism capable of producing an aliphatic polyester outside can be provided. That is, the recombinant microorganism according to the present invention is superior in productivity of aliphatic polyester as compared with conventional recombinant microorganisms. Moreover, the manufacturing method of the aliphatic polyester excellent in productivity can be provided by utilizing the recombinant microorganism concerning this invention.
  • Hyphomonas neptunium-derived PHA synthase gene No. 8
  • Rhodobacter sphaeroides-derived PHA synthase gene No. 1
  • Rhizobium etli-derived PHA synthase gene No. 3
  • Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene No. 8 7 is a characteristic diagram showing the results of measurement of lactic acid dimers in a medium for recombinant Escherichia coli into which any of the PHA synthase gene (No.
  • Hyphomonas neptunium-derived PHA synthase gene No. 8
  • Rhodobacter sphaeroides-derived PHA synthase gene No. 1
  • Rhizobium etli-derived PHA synthase gene No. 3
  • Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene No. 8 7 is a characteristic diagram showing the results of measurement of lactic acid trimer in the medium of recombinant Escherichia coli into which any of the PHA synthase gene (No. 10) derived from Haloarcula marismortui was introduced.
  • Hyphomonas neptunium-derived PHA synthase gene (No. 8), Rhodobacter sphaeroides-derived PHA synthase gene (No. 1), Rhizobium etli-derived PHA synthase gene (No. 3), Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene (No. 8) 7 is a characteristic diagram showing the results of measurement of lactic acid tetramer in the medium of recombinant Escherichia coli into which any of the PHA synthase gene (No. 10) derived from Haloarcula marismortui has been introduced.
  • Hyphomonas neptunium-derived PHA synthase gene (No. 8).
  • Rhodobacter sphaeroides-derived PHA synthase gene No. 1
  • Rhizobium etli-derived PHA synthase gene No. 3
  • Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene No. 8
  • 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring lactic acid pentamers in a medium for recombinant Escherichia coli into which any of the PHA synthase gene (No. 10) derived from Haloarcula marismortui has been introduced.
  • the recombinant microorganism according to the present invention is one in which a propionyl CoA transferase gene (pct gene) and a predetermined polyhydroxyalkanoate synthase gene are introduced into a host microorganism, and produces an aliphatic polyester outside the host microorganism.
  • aliphatic polyester includes not only a high molecular compound having a molecular weight of several thousand to several tens of thousands but also an oligomer having 2 to 5 monomer units (ie, dimer to pentamer). Meaning.
  • the propionyl CoA transferase gene (hereinafter referred to as pct gene) is not particularly limited, and any gene may be used as long as it encodes a protein having an activity of converting lactic acid into lactic acid CoA. can do. That is, as the pct gene, any gene encoding a protein having propionyl CoA transferase activity can be used.
  • the propionyl CoA transferase activity means an activity that catalyzes a reaction in which CoA is transferred to propionic acid.
  • propionyl CoA transferase activity the activity of catalyzing the reaction of transferring CoA from an appropriate CoA substrate to propionic acid is referred to as propionyl CoA transferase activity.
  • This propionyl CoA transferase can transfer CoA from a CoA substrate not only to propionic acid but also to lactic acid.
  • Table 1 shows representative examples of the origin (microorganism name) of the pct gene reported so far, and literature information disclosing the base sequence information encoding it.
  • any of the pct genes reported so far can be used.
  • it can be used even if it is a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the known amino acid sequence of PCT.
  • the term “several” used in connection with the amino acid sequence of pct means 1 to 50, preferably 1 to 25, more preferably 10 or less.
  • the catalytic activity by propionyl CoA transferase can be measured, for example, according to the method described in A. E. Hofmeister et al. (Eur. J. Biochem., 206, 547-552).
  • Examples of the pct gene include a gene derived from Megasphaera elsdenii and a gene derived from Staphylococcus aureus.
  • the base sequence of the coding region in the pct gene derived from Megasphaera elsdenii is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the pct gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of the coding region in the Staphylococcus aureus-derived pct gene is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the protein encoded by the pct gene is shown in SEQ ID NO: 4.
  • These proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 have a propionyl CoA transferase activity, in particular, an activity of synthesizing lactic acid CoA using lactic acid as a substrate.
  • the pct gene is not limited to the one having the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and one or more amino acid sequences are deleted, substituted or substituted in the amino acid sequence. It may contain a protein having an added amino acid sequence and having an activity of converting lactic acid into lactic acid CoA.
  • the plurality of amino acids for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 are used. means.
  • the pct gene is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. It may be an amino acid sequence having similarity and encoding a protein having an activity of converting lactic acid to lactic acid CoA.
  • sequence similarity means a value obtained by default setting using a computer program in which the blast algorithm is implemented and a database storing gene sequence information.
  • the pct gene includes a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to at least a part of the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and contains lactic acid. It may encode a protein having an activity of converting to lactic acid CoA.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, hybridization at 45 ° C.
  • Hybridization can be performed by a conventionally known method such as the method described in J. Sambrook et al. Molecular lonCloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • amino acid deletion, substitution or addition can be performed by modifying the base sequence encoding the transcription factor by a technique known in the art.
  • Mutation can be introduced into a nucleotide sequence by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method or a method according thereto, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant- Mutations are introduced using K, Mutant-G (both trade names, manufactured by TAKARA Bio Inc.) or the like, or using LA PCR-in-vitro Mutagenesis series kits (trade name, manufactured by TAKARA Bio Inc.).
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • 5-bromouracil 2-aminopurine
  • hydroxylamine N-methyl-N'-nitro-N nitrosoguanidine
  • other carcinogenic compounds are representative.
  • a method using a chemical mutagen such as that described above may be used, or a method using radiation treatment or ultraviolet treatment represented by X-rays, alpha rays, beta rays, gamma rays and ion beams may be used.
  • polyhydroxyalkanoate synthase gene (also referred to as PHA synthase gene) includes Alcanivorax borkumensis-derived gene, Hyphomonas neptunium-derived gene, Rhodobacter sphaeroides-derived gene, and Rhizobium etli-derived gene. At least one gene selected from a gene, a gene derived from Pseudomonas sp. And a gene derived from Haloarcula marismortui is used.
  • the PHA synthase gene is a gene encoding a protein having an activity of synthesizing polyhydroxyalkanoic acid using hydroxyacyl CoA as a substrate.
  • the gene derived from Alcanivorax ⁇ ⁇ ⁇ kukumensis it is preferable to use the PHA synthase gene derived from the SK2 strain stored at Accession Number: 700651 in ATCC.
  • a gene derived from Hyphomonas neptunium it is preferable to use a PHA synthase gene derived from a strain stored at Accession Number: 14232 in NBRC.
  • Rhodobacter® sphaeroides it is preferable to use a PHA synthase gene derived from a strain stored in Accession Number: BAA-808D in ATCC (American Type Culture Collection).
  • a gene derived from Rhizobium etli it is preferable to use a PHA synthase gene derived from a CFN strain stored at Accession Number: 15573 in NBRC (NITENBiological Resource Center).
  • a gene derived from Pseudomonas sp. It is preferable to use a PHA synthase gene derived from the 61-3 strain stored in Accession Number: 10015 in JCM (Japan Collection of Microorganisms).
  • a gene derived from Haloarcula marismortui it is preferable to use a PHA synthase gene derived from a strain stored in Accession Number: 8966 in JCM.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene derived from Alcanivorax kukumensis is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene derived from Hyphomonas neptunium (NBRC 14232) is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 8.
  • examples of the gene derived from Rhodobacter sphaeroides include a PHA synthase gene specified by Accession : Number: YP354337 and a PHA synthase gene specified by Accession Number: ABA79557.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene specified by Accession Number: YP354337 is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene specified by Accession Number: ABA79557 is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the nucleotide sequence of the coding region in the PHA synthase gene derived from the Rhizobium etli CFN strain is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene derived from the Pseudomonas sp. 61-3 strain is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the base sequence of the coding region in the PHA synthase gene derived from Haloarcula marismortui is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the PHA synthase gene is not limited to those having a base sequence encoding the amino acid sequence specified by the specific sequence number described above, and one or more amino acid sequences in the amino acid sequence are It may contain a deleted, substituted or added amino acid sequence and encodes a protein having an activity of synthesizing polylactic acid using lactic acid CoA as a substrate.
  • the plurality of amino acids for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 are used. means.
  • the PHA synthase gene is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably, relative to the amino acid sequence specified by the above-mentioned specific sequence number. It may be an amino acid sequence having a sequence similarity of 95% or more and encoding a protein having an activity of synthesizing polylactic acid using lactic acid CoA as a substrate.
  • sequence similarity means a value obtained by default setting using a computer program in which the blast algorithm is implemented and a database storing gene sequence information.
  • the PHA synthase gene includes a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to at least a part of the gene having the base sequence specified by the specific sequence number described above.
  • it may encode a protein having an activity of synthesizing polylactic acid using lactic acid CoA as a substrate.
  • the stringent condition is synonymous with the condition shown in the column of “propionyl CoA transferase gene”.
  • an oligomer of an aliphatic polyester particularly a lactic acid oligomer
  • an oligomer of an aliphatic polyester particularly a lactic acid oligomer
  • oligomers with different degrees of polymerization can be produced depending on the type of PHA synthase gene used.
  • tetramer and pentamer aliphatic polyester oligomers for example, lactic acid oligomers
  • a tetrameric aliphatic polyester oligomer for example, a lactic acid oligomer
  • host microorganisms examples include Pseudomonas bacteria such as Pseudomonas sp. Ralstonia bacteria such as Eutropha, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria, Saccharomyces -Saccharomyces genus yeast, such as Saccharomyces cerevisiae, Candida genus yeast, such as Candida maltosa.
  • Pseudomonas bacteria such as Pseudomonas sp.
  • Ralstonia bacteria such as Eutropha
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli
  • Corynebacterium bacteria Saccharomyces -Saccharomyces genus yeast
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Candida genus yeast such as Candida maltosa.
  • the vector for introducing the above-described gene into the host cell may be any vector that can replicate autonomously in the host, and is preferably in the form of plasmid DNA or phage DNA.
  • vectors for introduction into E. coli include plasmid DNA such as pBR322, pUC18, and pBLuescriptII, and phage DNA such as EMBL3, M13, and ⁇ gtII.
  • vectors for introduction into yeast include YEp13 and YCp50.
  • Inserting both or one of the above-described genes into a vector can be performed using genetic recombination techniques known to those skilled in the art.
  • a promoter capable of regulating transcription Any promoter may be used as long as it can regulate gene transcription in the host.
  • E. coli is used as a host
  • trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like can be used
  • yeast is used as a host
  • gal1 promoter, gal10 promoter and the like can be used.
  • the vector includes a terminator sequence, enhancer sequence, splicing signal sequence, poly A addition signal sequence, ribosome binding sequence (SD sequence), selection marker gene, etc. that can be used in the microorganism into which the gene is to be introduced, if necessary. Can be connected.
  • selectable marker genes include drug resistance genes such as ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, kana machine resistance gene, chloramphenicol resistance gene, and intracellular biosynthesis of nutrients such as amino acids and nucleic acids.
  • examples include genes involved or genes encoding fluorescent proteins such as luciferase.
  • the above vector can be introduced into microorganisms by methods known to those skilled in the art.
  • Examples of a method for introducing a vector into a microorganism include a calcium phosphate method, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a junction transfer method, and a method using calcium ions.
  • a recombinant microorganism obtained by introducing the above-mentioned pct gene and PHA synthase gene into a host microorganism is cultured in a medium containing a carbon source, and an oligomer of aliphatic polyester is produced and accumulated in the culture.
  • an oligomer of aliphatic polyester is produced and accumulated in the culture.
  • the desired aliphatic polyester oligomer can be produced.
  • This recombinant microorganism synthesizes lactic acid from sugar by the metabolic pathway of sugar, and propionyl CoA transferase encoded by the pct gene converts lactic acid into lactic acid CoA.
  • the PHA synthase encoded by the PHA synthase gene synthesizes an oligomer of an aliphatic polyester containing lactic acid as a structural unit using lactic acid CoA as a substrate.
  • the oligomer may be polylactic acid (homopolymer) in which the structural unit is composed only of lactic acid, or may be a lactic acid-based copolymer composed of lactic acid and a hydroxyalkanoic acid other than lactic acid as the structural unit.
  • the oligomers produced in the medium are mainly dimers to pentamers.
  • “mainly” means that 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more of the aliphatic polyester component contained in the medium is the oligomer.
  • hydroxyalkanoic acid other than lactic acid is not added to the medium, or the hydroxyalkanoic acid biosynthetic pathway other than lactic acid in the host microorganism is deleted.
  • a hydroxyalkanoic acid other than lactic acid may be added to the medium.
  • a hydroxyalkanoic acid biosynthetic pathway other than lactic acid may be provided.
  • the recombinant microorganism according to the present invention does not accumulate aliphatic polyester in the microbial cells and produces an oligomer of aliphatic polyester outside the microbial cells. Since the recombinant microorganism according to the present invention accumulates aliphatic polyester outside the cells, it is not necessary to increase the growth efficiency of the cells in order to improve the productivity of the aliphatic polyester. Therefore, the recombinant microorganism according to the present invention can produce an oligomer of an aliphatic polyester at a high yield even when a medium containing a nutrient component capable of growing is used. Therefore, by using the recombinant microorganism according to the present invention, the productivity of the aliphatic polyester oligomer can be achieved at a low cost.
  • the recombinant microorganism according to the present invention produces an aliphatic polyester oligomer outside the cells, and thus can be cultured for a long period of time to produce an aliphatic polyester oligomer. it can.
  • the recombinant microorganism according to the present invention is preferably fed-batch culture in which a part of the medium is extracted and a part of the additional medium and medium components are added while continuing the Iyo.
  • the recombinant microorganism according to the present invention when the recombinant microorganism according to the present invention is cultured to produce an aliphatic polyester oligomer, it is not particularly limited, but it is preferable to use a low-cost medium containing a normal carbon source, for example, a minimal medium.
  • a normal carbon source for example, a minimal medium.
  • the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose.
  • oil-related substances having 4 or more carbon atoms can be used as a carbon source.
  • oils and fats having 4 or more carbon atoms include corn oil, soybean oil, safflower oil, sunflower oil, olive oil, coconut oil, palm oil, rapeseed oil, fish oil, whale oil, pig oil or cow oil, Fatty acids such as butanoic acid, pentanoic acid, hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linolenic acid, linoleic acid or myristic acid or esters of these fatty acids, octanol, lauryl alcohol, oleyl alcohol or Examples include palmityl alcohol and the like, and esters of these alcohols.
  • nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and the like.
  • inorganic substances include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • Cultivation is preferably carried out for 48 hours or more after the above-described pct gene and PHA synthase gene are expressed in the range of 25 to 37 ° C. under aerobic conditions such as shaking culture.
  • antibiotics such as kanamycin, ampicillin, and tetracycline may be added to the medium.
  • a factor that induces transcription from the promoter it is preferable to add a factor that induces transcription from the promoter to the medium, followed by 72 hours or more.
  • a lactic acid oligomer by culturing recombinant Escherichia coli introduced with the above-described pct gene and PHA synthase gene.
  • a lactic acid oligomer can be produced without adding a monomer component constituting the target polymer, such as lactic acid, to the medium, which is advantageous in terms of production cost.
  • oligomers of aliphatic polyester such as lactic acid oligomers may be performed by methods known to those skilled in the art. For example, microorganisms are collected from the culture solution by centrifugation to remove bacterial cell components, and oligomers of aliphatic polyesters such as lactic acid oligomers can be recovered from the medium after removing the bacterial cells according to a conventional method. Confirmation that the recovered oligomer is an aliphatic polyester oligomer such as a lactic acid oligomer may be carried out by an ordinary method such as a gas chromatography method or a nuclear magnetic resonance method.
  • Example 1 Evaluation of various PHA synthase genes In this example, productivity of lactic acid oligomers was evaluated when various PHA synthase genes were expressed together with a pct gene derived from Megasphaera elsdenii.
  • a vector pTV118N-M.E PCT for introducing a pct gene derived from Megasphaera elsdenii was prepared.
  • the genome of M. elsdenii (ATCC17753) was obtained by a conventional method, and the pct gene was obtained by a PCR method.
  • MePCTN: 5'-atgagaaaagtagaaatcattac-3 '(SEQ ID NO: 19) and MePCTC: 5'-ttatttttttcagtcccatgggaccgtcctg-3' (SEQ ID NO: 20) are used as primers for amplifying a DNA fragment containing the pct gene derived from M. elsdenii did.
  • the base sequence of the primer was referred to the sequence described in Patent WO02 / 42418.
  • PCR enzyme KOD plus
  • 94 °C (1min) ⁇ 1 1, (94 °C 0.5min, 50 °C 0.5min, 72 °C 2min) ⁇ 30, (94 °C 2min)
  • the amplified fragment was introduced into the TOPO BluntII vector and sequenced.
  • the reported sequence and base sequence were 97.8% homology, but the amino acid sequence was different at only one position.
  • the expression plasmid pTV118N-M.EPCT was prepared by inserting the M. elsdenii-derived pct gene obtained by PCR as described above between EcoR1-PstI of the pTV118N vector (Takara Bio Inc.).
  • Table 2 shows a list of PHA synthase genes examined in this example.
  • Rhodobacter sphaeroides No1 and Rhodospirillum rubrum No4 a plurality of genes registered under different Accession numbers were found, so these plurality of genes were examined.
  • Class I is a PHA synthase gene with strong activity but high substrate specificity
  • Class II is a PHA synthase gene with low substrate specificity but low activity
  • Class III is a PHA synthase reaction.
  • Is a PHA synthase gene that requires the presence of phaE
  • Class IV is a PHA synthase gene that requires the presence of another phaR in the PHA synthase reaction.
  • DNA fragments containing 19 PHA synthase genes derived from 17 types of microorganisms shown in No1 to No17 are amplified by one PCR or two PCRs, and the DNA fragment is introduced with Megasphaera elsdenii-derived pct gene It was introduced into the pTV188N vector.
  • Tables 1 and 3 show the primers for 1st PCR designed for amplification of DNA fragments.
  • Tables 5 and 6 show 2st PCR primers designed for amplification of DNA fragments.
  • Table 7 and Table 8 show the reaction conditions in PCR using these primers.
  • Table 9 shows reaction liquid compositions A to H under the reaction conditions shown in Tables 7 and 8.
  • PCR IV reaction solution composition: G ′, temperature condition: 94 ° C. 2 minutes ⁇ 94 ° C. 15 seconds, 50 ° C. 30 seconds, 68 ° C. 1 minute 40 seconds ⁇ 5 cycles ⁇ 94 ° C. 15 Second, 60 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute 40 seconds ⁇ 30 cycles ⁇ 68 ° C. for 5 minutes).
  • the purified 2nd PCR product and the pTV118N-PCT-C1 vector were digested with restriction enzymes (XbaI and PstI (Takara Bio)), respectively.
  • restriction enzymes XbaI and PstI (Takara Bio)
  • loading buffer manufactured by TAKARA BIO INC.
  • TAE agarose gel (0.8%, TAE)
  • electrophoresis cut out and purified. Purification was performed according to the protocol using MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • Ligation and transformation were performed according to the protocol using Ligation-Convenience Kit (manufactured by Nippon Gene) and ECOS competent E.coli JM109 (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), respectively.
  • the obtained transformant was cultured in 2 ml of LB-Amp medium, and plasmid extraction was performed using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN).
  • a sequencing reaction was performed using Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), and the sequence was confirmed using a DNA sequencer 3100 Genetic Analyzerna (Applied Biosystems).
  • ligation was performed in the phaC gene because of the simplicity of the experimental operation or the PstI site in the phaC gene (No.4, 6, 10 and 12).
  • -Fusion 2.0-Dry-Down PCR-Cloning Kit (Clontech Laboratories) was used. Other portions were performed in the same manner as described above.
  • the various phaC genes obtained as described above were integrated into pTV118N-M.E PCT to obtain vectors.
  • the obtained vector was introduced into Escherichia coli W3110 competent cell to prepare recombinant Escherichia coli expressing the pct gene derived from Megasphaera elsdenii and any of the above PHA synthase genes.
  • the obtained recombinant Escherichia coli was inoculated in an LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • methanol: sulfuric acid 17: 3 (volume ratio)
  • GC-MS apparatus HP6890 / 5973 manufactured by Hewlett-Packard Company was used.
  • column BD-1 122-1063 (inner diameter: 0.25 mm, length: 60 m, film thickness: 1 ⁇ m) manufactured by Agilent Technologies was used. The temperature was raised at 120 ° C. for 5 minutes, then raised to 200 ° C. at 10 ° C./min, and then raised to 300 ° C. at 20 ° C./min and held for 8 minutes.
  • FIG. 1 The result of measuring the production amount of lactic acid polymer by GC-MS is shown in FIG. As shown in FIG. 1, it was revealed that a lactic acid polymer was produced in a medium in many recombinant E. coli.
  • PHA synthase gene derived from Alcanivorax borkumensis (No. 12) PHA synthase gene derived from Hyphomonas neptunium (No. 8), PHA synthase gene derived from Rhodobacter sphaeroides (No. 1), PHA synthase gene derived from Rhozobium etli (No. 12) 3), recombinant E.
  • Table 10 shows the results of examining the productivity of lactic acid oligomers using an enzyme method component determination kit F-Kit series (Roche Diagnostics).
  • PHA synthase gene derived from Alcanivorax borkumensis No. 12
  • PHA synthase gene derived from Hyphomonas neptunium No. 8
  • PHA synthase gene derived from Rhodobacter sphaeroides No. 1
  • Rhizobium etli Recombinant Escherichia coli introduced with the PHA synthase gene
  • the PHA synthase gene derived from Pseudomonas sp. No. 7
  • the PHA synthase gene derived from Haloarcula marismortui No. 10
  • the PHA synthase gene derived from Alcanivorax borkumensis (No. 12) and the PHA synthase gene derived from Hyphomonas neptunium (No. 8) were found to be excellent in the productivity of lactic acid oligomers in the culture medium.
  • Rhodobacter ⁇ ⁇ ⁇ sphaeroides-derived PHA synthase gene No. 1
  • Rhizobium etli-derived PHA synthase gene No. 3
  • Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene No. 7
  • PHA synthase gene from Haloarcula marismortui No.
  • the ionization method was an electrospray ionization method, and the ionization mode was a negative ion mode.
  • the capillary voltage was 3200 V
  • the cone voltage was 30 V
  • the ion source temperature was 80 ° C.
  • the desolvation temperature was 120 ° C.
  • the sample introduction method was the infusion method (direct introduction), and the sample introduction amount was 5 ⁇ l / min.
  • the number of integrations was 100.
  • Hyphomonas neptunium-derived PHA synthase gene No. 8
  • Rhodobacter sphaeroides-derived PHA synthase gene No. 1
  • Rhizobium etli-derived PHA synthase gene No. 3
  • Pseudomonas sp.-derived PHA synthase gene No. 8
  • Results of measurement of lactic acid dimer, trimer, tetramer and pentamer in the medium of recombinant E. coli introduced with any of the PHA synthase genes No. 10) derived from Haloarcula marismortui Are shown in FIGS. 2, 3, 4 and 5, respectively.
  • lactic acid dimer, trimer, tetramer, pentamer, hexamer and heptamer in the medium of recombinant Escherichia coli introduced with PHA synthase gene (No. 12) derived from Alcanivorax borkumensis were measured.
  • the results are shown in FIGS. 6, 7, 8, 9, 10 and 11, respectively.
  • 6 to 11 show the results of measuring the culture solution (upper), the results of measuring the sample obtained by adding the lactic acid oligomer preparation to be measured to the culture solution (middle stage), and the lactic acid oligomer preparation to be measured.
  • the measurement results (lower part) are also shown.
  • Example 2 In this example, recombinant Escherichia coli introduced with the PHA synthase gene (No. 12) derived from Alcanivorax borkumensis prepared in Example 1 was used, and the difference in productivity of lactic acid oligomers depending on the type of medium was examined.
  • lactic acid oligomers were added to the medium in the same manner as in Example 1 except that M9 medium (hereinafter referred to as M9YE medium) to which yeast extract was added as a medium with high nutritional value and M9 medium was used as a medium with low nutritional value
  • M9YE medium M9 medium
  • the lactic acid oligomer was quantified by GC-MS.
  • the M9 medium contains 6.8 g of Na 2 HPO 4 per liter, 3 g of KH 2 PO 4 , 0.5 g of NaCl and 1 g of NH 4 Cl, 2 ml of 1M MgSO 4 , 100 ml of 20% Glucose, Contains 1 ml of 1% Thiamine and 0.1 ml of 1M CaCl 2 .
  • the result of quantifying the lactic acid oligomer by GC-MS is shown in FIG.
  • the used recombinant Escherichia coli showed the characteristics that the productivity of lactic acid oligomers was superior when a medium with low nutritional value was used. From the results of this Example, it can be determined that the productivity of lactic acid oligomers is also increased for other recombinant Escherichia coli prepared in Example 1 using a medium with low nutritional value such as M9 medium. Therefore, it was clarified that by using the recombinant Escherichia coli prepared in Example 1, a lactic acid oligomer can be produced at a low cost.
  • Example 3 In this example, recombinant Escherichia coli introduced with the PHA synthase gene (No. 12) derived from Alcanivorax borkumensis prepared in Example 1 was used, and the relationship between the culture medium time and the productivity of lactic acid oligomers was examined.
  • lactic acid oligomers were produced in the medium in the same manner as in Example 1 except that the main culture was continued for 192 hours, and the lactic acid oligomers were quantified by GC-MS.
  • FIG. 13 shows the results obtained by sampling the culture solution at 24, 48, 76, 96 and 168 hours from the start of the culture and quantifying the lactic acid oligomer by GC-MS.
  • the recombinant Escherichia coli used disclosed the production of lactic acid oligomers in the culture solution from 48 hours after the start of culture, and the production amount of lactic acid oligomers increased rapidly from around 72 hours. .
  • the recombinant Escherichia coli used maintained a high production amount even after 168 hours from the start of culture.

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Abstract

　組み換え微生物を使用した脂肪族ポリエステルの製造において、脂肪族ポリエステル生産性を向上する。　宿主微生物に対して、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とを導入してなる組み換え微生物を培養し、培地から脂肪族ポリエステルを回収する。

Description

組み換え微生物及びこれを用いた脂肪族ポリエステルの製造方法
　本発明は、宿主微生物に所定の遺伝子を導入することで所望の機能を付与された組み換え微生物及びこれを用いた脂肪族ポリエステルの製造方法に関する。
　脂肪族ポリエステルは、自然界で容易に分解される生分解性プラスチックとして、また糖や植物油などの再生可能な炭素資源から合成することができる“グリーン”プラスチックとして、注目されている。現在、脂肪族ポリエステルとしては、ポリ乳酸等の乳酸骨格を有するものが実用的に利用されている。
　ポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルを組み換え微生物を利用して製造する技術としては、例えば特許文献１（WO 2006/126796）に開示された技術が知られている。特許文献１には、宿主となる大腸菌に、乳酸を乳酸CoAに変換する酵素をコードする遺伝子及び乳酸CoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する酵素をコードする遺伝子を導入した組み換え大腸菌を開示している。特許文献１に開示された技術において、乳酸を乳酸CoAに変換する酵素をコードする遺伝子としては、Clostridium propionicum由来のpct遺伝子を使用している。また、同技術において、乳酸CoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する酵素をコードする遺伝子としては、Pseudomonas sp. 61-3株由来のphaC2遺伝子を使用している。
　但し、特許文献１には、ポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルの生産性が十分とは言えず、また当該生産性を向上させるために種々の検討が不十分である。例えば、特許文献２（WO 2008/062999）には、Pseudomonas sp. 6-19株由来のphaC1遺伝子に特定の変異を導入することで、乳酸CoAを基質として乳酸ホモポリマー又はポリ乳酸コポリマーの合成能を高めようとする試みが開示されている。
　上述したような組み換え微生物を利用してポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルを製造する技術は、当該微生物内に脂肪族ポリエステルを蓄積するものであり、微生物を破砕して目的とする脂肪族ポリエステルを回収するものであった。
WO 2006/126796 WO 2008/062999
　しかしながら、従来、組み換え微生物を利用してポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルを製造する技術は、微生物の内部に脂肪族ポリエステルを蓄積するものであるため生産性が低いといった問題があり、また、微生物を破砕して脂肪族ポリエステルを回収するため煩雑な工程が必要であるといった問題があった。そこで、本発明は、脂肪族ポリエステルの生産性に優れた組換え微生物を提供するとともに、当該組換え微生物を利用した脂肪族ポリエステルの製造方法を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子と所定の微生物由来のポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ遺伝子とを導入した組み換え微生物においてポリ乳酸等の脂肪族ポリエステルが菌体外に生産されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
　（１）　宿主微生物に対して、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とを導入してなる組み換え微生物を培養し、培地から脂肪族ポリエステルを回収することを特徴とする脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（２）　上記脂肪族ポリエステルは、２乃至５量体を主とするオリゴマーであることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（３）　上記脂肪族ポリエステルは、乳酸骨格を有する脂肪族ポリエステルであることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（４）　上記脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸であることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（５）　上記培地は最小培地であることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（６）　上記組み換え微生物を４８時間以上培養した後、上記脂肪族ポリエステルを回収することを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（７）　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、Alcanivorax borkumensis由来の遺伝子、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子、Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子、Rhizobium etli由来の遺伝子、Pseudomonas sp.由来の遺伝子及びHaloarcula marismortui由来の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子であることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
　（８）　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ａ）～（ｃ）に示す遺伝子であることを特徴とする（１）記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質コードする遺伝子
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
　（９）　宿主微生物に対して、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってAlcanivorax borkumensis由来の遺伝子、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子、Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子、Rhizobium etli由来の遺伝子、Pseudomonas sp.由来の遺伝子及びHaloarcula marismortui由来の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を導入してなる組み換え微生物。
　（１０）　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ａ）～（ｃ）に示す遺伝子であることを特徴とする（９）記載の組み換え微生物。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質コードする遺伝子
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
　（１１）　上記宿主微生物は大腸菌であることを特徴とする（９）記載の組み換え微生物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-069688号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、脂肪族ポリエステルを外部に生産できる組み換え微生物を提供することができる。すなわち、本発明に係る組み換え微生物は、従来の組み換え微生物と比較して脂肪族ポリエステルの生産性に優れることとなる。また、本発明に係る組み換え微生物を利用することによって、生産性に優れた脂肪族ポリエステルの製造方法を提供することができる。
各組み換え大腸菌における乳酸重合体の生産量をGC-MSにより測定した結果を示す特性図である。 Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸２量体を測定した結果を示す特性図である。 Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸３量体を測定した結果を示す特性図である。 Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸４量体を測定した結果を示す特性図である。 Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸５量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸２量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸３量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸４量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸５量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸６量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸７量体を測定した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌を使用し、培地の種類による乳酸オリゴマーの生産性の相違を検討した結果を示す特性図である。 Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌を使用し、培地時間と乳酸オリゴマーの生産性との関係を検討した結果を示す特性図である。
　以下、本発明に係る組み換え微生物及びこれを用いた脂肪族ポリエステルの製造方法を詳細に説明する。
　本発明に係る組み換え微生物は、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子（pct遺伝子）と、所定のポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ遺伝子とを宿主微生物に導入したものであり、宿主微生物の外部に脂肪族ポリエステルを生産するものである。なお、本明細書において「脂肪族ポリエステル」とは、分子量が数千から数万といった高分子化合物のみならず、モノマー単位が２～５といった（すなわち、二量体～五量体）オリゴマーも含む意味である。
プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子
　本発明において、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子（以下、pct遺伝子と称する）としては、特に限定されず、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば如何なる遺伝子を使用することができる。すなわち、pct遺伝子は、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする如何なる遺伝子を使用することができる。プロピオニルCoAトランスフェラーゼ活性とは、プロピオン酸にＣｏＡが転移される反応を触媒する活性を意味する。すなわち、適当なCoA基質からプロピオン酸にCoAが転移される反応を触媒する活性をプロピオニルCoAトランスフェラーゼ活性と称する。このプロピオニルCoAトランスフェラーゼは、プロピオン酸のみならず乳酸に対してもCoA基質からCoAを転移することができる。
　表１に、これまでに報告されたpct遺伝子の由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明では、上記表１の他にも、これまでに報告されたpct遺伝子のいずれも利用することができる。また、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ活性を有するかぎり、既知のPCTのアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても利用することができる。なお、pctのアミノ酸配列の関連で使用する用語「数個」とは、１～５０個、好ましくは１～２５個、より好ましくは１０個以下をいう。プロピオニルCoAトランスフェラーゼによる触媒活性は、例えばA. E. Hofmeisterら（Eur. J. Biochem.、第206巻、第547-552頁）に記載された方法に従って測定することができる。
　一例として、pct遺伝子としては、Megasphaera elsdenii由来の遺伝子及びStaphylococcus aureus由来の遺伝子を挙げることができる。Megasphaera elsdenii由来のpct遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号１に示し、当該pct遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、Staphylococcus aureus由来pct遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号３に示し、当該pct遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。これら配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ活性、なかでも乳酸を基質として乳酸CoAを合成する活性を有している。
　また、本発明において、pct遺伝子としては、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものに限定されず、当該アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
　さらに、本発明において、pct遺伝子としては、配列番号２又は４に示すアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列であって、且つ、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、配列類似性の値は、blastアルゴリズムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
　さらにまた、本発明において、pct遺伝子としては、配列番号１又は３に示す塩基配列を有する遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、且つ、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65～70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65～70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
　なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記転写因子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ遺伝子
　本発明では、ポリヒドロキシアルカン酸シンターゼ遺伝子（PHAシンターゼ遺伝子とも称される）としては、Alcanivorax borkumensis由来の遺伝子、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子、Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子、Rhizobium etli由来の遺伝子、Pseudomonas sp.由来の遺伝子及びHaloarcula marismortui由来の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を使用する。特に、PHAシンターゼ遺伝子としては、Alcanivorax borkumensis由来の遺伝子及び/又はHyphomonas neptunium由来の遺伝子を使用することが好ましい。なお、PHAシンターゼ遺伝子とは、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
　ここで、Alcanivorax borkumensis由来の遺伝子としては、ATCCにおいてAccession Number：700651で保管されたSK2株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。また、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子としては、NBRCにおいてAccession Number：14232で保管された株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。
　Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子としては、ATCC（American Type Culture Collection）においてAccession Number：BAA-808Dで保管された株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。Rhizobium etli由来の遺伝子としては、NBRC（NITE Biological Resource Center）においてAccession Number：15573で保管されたCFN株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。Pseudomonas sp.由来の遺伝子としては、JCM（Japan Collection of Microorganisms）においてAccession Number：10015で保管された61-3株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。Haloarcula marismortui由来の遺伝子としては、JCMにおいてAccession Number：8966で保管された株に由来するPHAシンターゼ遺伝子を使用することが好ましい。
　具体的に、Alcanivorax borkumensis（ATCC 700651）に由来するPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号５に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。Hyphomonas neptunium（NBRC 14232）に由来するPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号７に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
　また、Rhodobacter sphaeroides（BAA-808D）由来の遺伝子としては、Accession Number：YP354337で特定されるPHAシンターゼ遺伝子及びAccession Number：ABA79557で特定されるPHAシンターゼ遺伝子を挙げることができる。Accession Number：YP354337で特定されるPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号９に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。Accession Number：ABA79557で特定されるPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号１１に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
　Rhizobium etli CFN株に由来するPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号１３に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。Pseudomonas sp. 61-3株に由来するPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号１５に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。Haloarcula marismortui（JCM 8966）に由来するPHAシンターゼ遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号１７に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。
　また、本発明において、PHAシンターゼ遺伝子としては、上述した具体的な配列番号で特定されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものに限定されず、当該アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、乳酸CoAを基質としてポリ乳酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
　さらに、本発明において、PHAシンターゼ遺伝子としては、上述した具体的な配列番号で特定されるアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列であって、且つ、乳酸CoAを基質としてポリ乳酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで、配列類似性の値は、blastアルゴリズムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
　さらにまた、本発明において、PHAシンターゼ遺伝子としては、上述した具体的な配列番号で特定される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、且つ、乳酸CoAを基質としてポリ乳酸を合成する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。なお、ストリンジェントな条件とは、「プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子」の欄で示した条件と同義である。
　また、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加についても、「プロピオニルCoAトランスフェラーゼ遺伝子」の欄で示した手法を適用することができる。
　特に、本発明に係る組み換え微生物は、上述したPHAシンターゼ遺伝子が導入されたものであるため、脂肪族ポリエステルのオリゴマー、特に乳酸オリゴマーを微生物の体外に生産することができる。ここで、使用するPHAシンターゼ遺伝子の種類によって異なる重合度のオリゴマーを製造することができる。Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子を導入した組み換え微生物によれば、４量体及び５量体の脂肪族ポリエステルのオリゴマー（例えば乳酸オリゴマー）を製造することができる。また、Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子を導入した組み換え微生物によれば、４量体の脂肪族ポリエステルのオリゴマー（例えば乳酸オリゴマー）を製造することができる。
　宿主微生物
　本発明において、宿主微生物としては、例えば、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）61-3株などのシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、Ｒ．ユートロファなどのラルストニア（Ralstonia）属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌、大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリヒア（Escherichia）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、サッカロマイセス・セレビシー（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス（Saccharomyces）属酵母、カンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）などのカンジダ(Candida）属酵母などを挙げることができる。宿主微生物としては、特に大腸菌を使用することが好ましい。
　宿主細胞に上述した遺伝子を導入するためのベクターは、宿主中で自立複製可能なものであればよく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドＤＮＡを、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔＩＩ等のファージＤＮＡ等を、それぞれ挙げることができる。また酵母に導入するためのベクターの例としては、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を挙げることができる。
　上述した遺伝子の両方若しくは一方をベクターへ挿入するは、当業者に知られた遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。また組み換えに際して、転写を調節することのできるプロモーターの下流に、前記遺伝子を連結することが好ましい。プロモーターとしては、宿主中で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを、酵母を宿主として用いる場合には、ｇａｌ1プロモーター、ｇａｌ１０プロモーターなどを用いることができる。
　また、ベクターには、必要に応じて、遺伝子を導入しようとする微生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。
　上記ベクターは、当業者に知られた方法によって、微生物に導入できる。微生物へのベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法等が挙げられる。
脂肪族ポリエステルの製造
　上述したpct遺伝子及びPHAシンターゼ遺伝子を宿主微生物に導入して得られる組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養し、培養物中に脂肪族ポリエステルのオリゴマーを生成蓄積させ、その後、脂肪族ポリエステルのオリゴマーを回収することで、目的とする脂肪族ポリエステルのオリゴマーを製造することができる。この組み換え微生物は、糖の代謝経路によって糖から乳酸を合成し、pct遺伝子によりコードされるプロピオニルCoAトランスフェラーゼが乳酸を乳酸CoAに変換する。そして、この組み換え微生物は、PHAシンターゼ遺伝子によりコードされるPHAシンターゼが乳酸CoAを基質として構成単位として乳酸を含む脂肪族ポリエステルのオリゴマーを合成する。当該オリゴマーとしては、構成単位が乳酸のみからなるポリ乳酸（ホモポリマー）であってもよいし、構成単位として乳酸と乳酸以外のヒドロキシアルカン酸とからなる乳酸系共重合体であってもよい。また、培地中に生産するオリゴマーとしては、主として二量体から五量体である。ここで「主として」とは、培地に含まれる脂肪族ポリエステル成分のうち５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上が上記オリゴマーであるとこと意味する。
　ポリ乳酸（ホモポリマー）を合成する際には、培地中に乳酸以外のヒドロキシアルカン酸を添加しないか、宿主微生物における乳酸以外のヒドロキシアルカン酸生合成経路を欠損させる。一方、構成単位として乳酸と乳酸以外のヒドロキシアルカン酸とからなる乳酸系共重合体を合成する際には、培地中に乳酸以外のヒドロキシアルカン酸を添加すればよく、また、宿主微生物に対して乳酸以外のヒドロキシアルカン酸生合成経路を付与してもよい。
　特に、本発明に係る組み換え微生物は、菌体内に脂肪族ポリエステルを蓄積せず、菌体外部に脂肪族ポリエステルのオリゴマーを製造するものである。本発明に係る組み換え微生物は、脂肪族ポリエステルを菌体外に蓄積するため、脂肪族ポリエステルの生産性を向上させるために菌体の増殖効率を高める必要がない。したがって、本発明に係る組み換え微生物は、生育が可能な程度の栄養成分を含む培地を使用しても、脂肪族ポリエステルのオリゴマーを高生産することができる。よって、本発明に係る組み換え微生物を利用することで、脂肪族ポリエステルのオリゴマーの生産性を低コストで達成することができる。
　これに対して、菌体内に脂肪族ポリエステルを蓄積させる組み換え微生物の場合、脂肪族ポリエステルの生産性を向上させるには、組み換え微生物の増殖効率を高めることで菌体量を高くする方針が取られる。この場合、組み換え微生物の増殖効率を高めるために、栄養価の高い培地を使用する必要があり非常にコスト高となる。また、菌体内に脂肪族ポリエステルを蓄積させる組み換え微生物の場合、菌体内に脂肪族ポリエステルを蓄積した段階の比較的早い時期に培養を終了しなければならい。
　これに対して、本発明に係る組み換え微生物は、菌体外に脂肪族ポリエステルのオリゴマーを製造するため、長期間に亘って培養を継続することができ、脂肪族ポリエステルのオリゴマーを生産することができる。特に、本発明に係る組み換え微生物は、場伊予を継続させながら、培地の一部を抜き出すとともに追加培地や培地成分の一部を追加するフェドバッチ培養とすることが好ましい。
　一方、本発明に係る組み換え微生物を培養して脂肪族ポリエステルのオリゴマーを生産する際、特に限定されないが、通常の炭素源等を含有する低コストな培地、例えば最少培地を使用することが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。また、炭素数４以上の油脂関連物質を炭素源とすることもできる。炭素数４以上の油脂関連物質としては、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸若しくはミリスチン酸等の脂肪酸又はこれらの脂肪酸のエステル、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール若しくはパルミチルアルコール等又はこれらアルコールのエステル等が挙げられる。
　窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
　培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、２５～３７℃の範囲で、上記pct遺伝子及びPHAシンターゼ遺伝子が発現してから好ましくは４８時間以上行うことが好ましい。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。上記pct遺伝子及びPHAシンターゼ遺伝子いずれか或いは両方を誘導性プロモーターの制御下に導入した場合には、当該プロモーターからの転写を誘導する因子を培地に添加し、その後７２時間以上行うことが好ましい。
　特に、上述したpct遺伝子及びPHAシンターゼ遺伝子を導入した組み換え大腸菌を培養し、乳酸オリゴマーを製造することが好ましい。この方法では、培地に乳酸などの、目的とするポリマーを構成するモノマー成分を培地に添加しなくても、乳酸オリゴマーを製造することができ、製造コストの点で有利である。
　なお、乳酸オリゴマー等の脂肪族ポリエステルのオリゴマーの回収は、当業者に公知の方法によって行えばよい。例えば、培養液から遠心分離によって集菌して菌体成分を除去し、菌体を除いた後の培地から定法に従って乳酸オリゴマー等の脂肪族ポリエステルのオリゴマーを回収することができる。回収された乳酸オリゴマー等の脂肪族ポリエステルのオリゴマーであることの確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕種々のPHAシンターゼ遺伝子の評価
　本実施例では、種々のPHAシンターゼ遺伝子について、Megasphaera elsdenii由来のpct遺伝子とともに発現させた場合の乳酸オリゴマーの生産性を評価した。
　先ずMegasphaera elsdenii由来のpct遺伝子を導入するためのベクターpTV118N-M.E PCTを作製した。M. elsdenii(ATCC17753)のゲノムを常法により取得し、PCR法によりpct遺伝子を取得した。M. elsdenii由来のpct遺伝子を含むDNA断片を増幅するためのプライマーとして、MePCTN：5’-atgagaaaagtagaaatcattac-3’（配列番号１９）及びMePCTC：5’-ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’（配列番号２０）を使用した。なお、プライマーの塩基配列は特許WO02/42418に記載されている配列を参考にした。
　ゲノムからpct遺伝子の増幅は以下の条件で行った。PCR (酵素KOD plus)(94℃ 1min)×1, (94℃ 0.5min, 50℃ 0.5min, 72℃ 2min)×30, (94℃ 2min)。増幅断片をTOPO BluntIIベクターに導入し、シークエンスを行った結果、報告されている配列と塩基配列では97.8%のホモロジーであったが、アミノ酸配列では1箇所のみ異なっていた。
　上述したPCRにより得られたM. elsdenii由来のpct遺伝子をpTV118Nベクター(タカラバイオ社製)のEcoR1-PstI間に挿入することで発現プラスミドpTV118N-M.E PCTを作製した。
　次に、本例で検討したPHAシンターゼ遺伝子の一覧を表２に示す。表２中、No1のRhodobacter sphaeroides及びNo4のRhodospirillum rubrumについては、異なるAccession 番号で登録された複数の遺伝子が見いだされているためこれら複数の遺伝子について検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表２において、ClassIとは活性は強いものの基質特異性が高いPHAシンターゼ遺伝子であり、ClassIIとは基質特異性が低いものの活性が弱いPHAシンターゼ遺伝子であり、ClassIIIとはPHAシンターゼ反応に他にphaEが存在していることを必要とするPHAシンターゼ遺伝子であり、ClassIVとはPHAシンターゼ反応に他にphaRが存在していることを必要とするPHAシンターゼ遺伝子である。
　これらNo1～No17に示した17種類の微生物由来の19種類のPHAシンターゼ遺伝子を含むDNA断片を１回のPCR又は２回のPCRによって増幅し、当該DNA断片をMegasphaera elsdenii由来のpct遺伝子が導入されたpTV188Nベクターに導入した。DNA断片の増幅のために設計した、1stPCR用プライマーを表３及び４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
DNA断片の増幅のために設計した、2stPCR用プライマーを表５及び６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、これらプライマーを用いたPCRにおける反応条件を表７及び表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　なお、表７及び８に示した反応条件における反応液組成A～Hまでを表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　なお、No.13のpha遺伝子に関しては、２つの遺伝子（phaR及びphaC)が間に別の遺伝子を挟んで存在するため、１stPCRでそれぞれをクローニングした後に2ndPCRにより一つに繋げた。さらに、ベクターとライゲーションするために、もう一度PCR (反応液組成：Ｇ’、温度条件：94℃2分→94℃15秒、50℃30秒、68℃1分40秒×5サイクル→94℃15秒、60℃30秒、68℃1分40秒×30サイクル→68℃5分)した。
　また、No.2、3及び8のphaC遺伝子については、2ndPCR産物を精製したものとpTV118N-PCT-C1ベクターとをそれぞれ、制限酵素（XbaI及びPstI（タカラバイオ製))で消化し，10×loading Buffer（タカラバイオ（株）製)とともに、アガロースゲル(0.8%、TAE)にロードし電気泳動で分離、切り出し精製を行った。精製はMinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用い、プロトコールに従って行った。ライゲーションおよび形質転換は、それぞれLigation-Convenience Kit（ニッポンジーン製）、ECOS competent E.coli JM109（ニッポンジーン（株）製)を用いてプロトコールに従い行った。得られた形質転換体をLB-Amp培地2mlで培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製)を用いてプラスミド抽出を行った。Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いてシークエンス反応を行い、DNAシークエンサー3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製)を用いて配列の確認を行った。
　さらに、No.1、4～7及び9～17のphaC 遺伝子については、実験操作の簡便性又はphaC遺伝子内にPstIサイトがある（No.4、6、10及び12)ことから、ライゲーションをIn-Fusion 2.0 Dry-Down PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories社製）を使用して行った。他の部分は上記と同様に行った。
　上述のように得られた各種phaC遺伝子をそれぞれpTV118N-M.E PCTに組み込みベクターを取得した。得られたベクターを大腸菌W3110コンピテントセルに導入し、Megasphaera elsdenii由来のpct遺伝子及び上記いずれかのPHAシンターゼ遺伝子を発現する組み換え大腸菌を作製した。得られた組み換え大腸菌は、アンピシリンを含むLB培地に植菌され、37℃で一晩静置培養した。得られたコロニーを、アンピシリンを含むLB液体培地2mLに植菌し、37℃でOD600＝0.6～1.0になるまで試験管内で振とう培養した。これを前培養液とした。
　次に、アンピシリン、2%グルコース及び0.1mMIPTGを含むM9培地200mLに前培養液2mLを添加し、500mLバッフル付き三角フラスコを用いて30℃で48時間、130rpmで回転培養した。
　培養終了後、培養液を50mLコーニングチューブに移し、3000rpm、15分間の条件で集菌し、上清を得た。この培養液200μlを耐圧反応管へ写し、クロロホルムを1.6mL添加した。更に、メタノールと硫酸の混合溶液（メタノール：硫酸＝17:3（体積比））を1.6mL添加し、95℃に設定したウォーターバス内で3時間リフラックスさせた。その後、耐圧反応管を取り出し、室温まで冷却し、内部の溶液を試験管に移した。試験管内に更に超純水を0.8mL添加し、vortexを用いて混合した後、静置した。十分に静置した後、下層のクロロホルム相をパスツールピペットにて分取した。クロロホルム相を0.2μmメッシュの有機溶媒耐性フィルターでろ過し、GC-MS用のバイアル瓶に移し、分析用サンプルとした。
　GC-MS装置としては、ヒューレットパッカード社製のHP6890/5973を使用した。カラムとしては、アジレントテクノロジー社製のBD-1 122-1063（内径：0.25mm、長さ：60m、膜厚：1μm）を使用した。昇温条件は、120℃で5分間保持した後、10℃/minにて200℃まで昇温し、その後、20℃/minで300℃まで昇温して８分間保持する条件とした。
　GC-MSによる乳酸重合体の生産量を測定した結果を図１に示す。図１に示すように、多くの組み換え大腸菌において乳酸重合体を培地中に生産していることが明らかとなった。特に、Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）、Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）を導入した組み換え大腸菌では、乳酸オリゴマーの生産性に優れることが明らかとなった。
　一方、酵素法成分定量キット F-Kitシリーズ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、乳酸オリゴマーの生産性を検討した結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）、Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）を導入した組み換え大腸菌では、乳酸オリゴマーの生産性に優れることが明らかとなった。
　図１及び表１０に示した結果から、培養液中に対する乳酸オリゴマーの生産性に優れると判明したAlcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）、Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌の培養液に如何なる重合度の乳酸オリゴマーが含まれているのか、エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ESI-MS装置）を用いて検討した。測定用の試料は、培養液に等量のメタノールを添加して調整した。
　ESI-MS装置は、Q-TOF（Micromass社製）を用いた。イオン化法は、エレクトロスプレーイオン化法とし、イオン化モードは負イオンモードとした。キャピラリー電圧を3200Vとし、コーン電圧を30Vとし、イオン源温度を80℃とし、脱溶媒温度を120℃とした。試料導入方法はinfusion法（直接導入）とし、試料導入量を5μl/minとした。また、積算回数は100回とした。
　Hyphomonas neptunium由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 8）、Rhodobacter sphaeroides由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 1）、Rhizobium etli由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 3）、Pseudomonas sp.由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 7）及びHaloarcula marismortui由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 10）のいずれかの遺伝子を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸２量体、３量体、４量体及び５量体を測定した結果をそれぞれ図２、図３、図４及び図５に示す。
　また、Alcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌について、培地中の乳酸２量体、３量体、４量体、５量体、６量体及び７量体を測定した結果をそれぞれ図６、図７、図８、図９、図１０及び図１１に示す。なお、図６乃至１１には、培養液を測定した結果（上段）、培養液に測定対象の乳酸オリゴマー標品を添加したサンプルを測定した結果（中段）、及び測定対象の乳酸オリゴマー標品を測定した結果（下段）を併せて示した。
〔実施例２〕
　本実施例では、実施例１で作製したAlcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌を使用し、培地の種類による乳酸オリゴマーの生産性の相違を検討した。
　本実施例では、高栄養価の培地としてyeast extractを添加したM9培地（以下、M9YE培地）と、栄養価の低い培地としてM9培地を使用した以外は実施例１と同様に乳酸オリゴマーを培地中に生産させ、GC-MSによって乳酸オリゴマーを定量した。なお、M9培地は、1lあたりNa2HPO4を6.8g、KH2PO4を3g、NaClを0.5g及びNH4Clを1g含有しており、1M MgSO4を2ml、20％Glucoseを100ml、1％Thiamineを1ml及び1M CaCl2を0.1ml含有している。
　また、M9YE培地におけるyeast extractは、培地1lあたり1g添加した。
　乳酸オリゴマーをGC-MSによって定量した結果を図１２に示す。図１２に示したように、使用した組み換え大腸菌は、栄養価の低い培地を使用したときの方が乳酸オリゴマーの生産性に優れるといった特徴を示した。本実施例の結果から、実施例１で作製した他の組み換え大腸菌についても同様に、例えばM9培地といった栄養価の低い培地を用いても乳酸オリゴマーの生産性が高くなると判断できる。よって、実施例１で作製した組み換え大腸菌を使用することによって、低コストに乳酸オリゴマーを製造できることが明らかとなった。
〔実施例３〕
　本実施例では、実施例１で作製したAlcanivorax borkumensis由来のPHAシンターゼ遺伝子（No. 12）を導入した組み換え大腸菌を使用し、培地時間と乳酸オリゴマーの生産性との関係を検討した。
　本実施例では、本培養を192時間継続した以外は実施例１と同様に乳酸オリゴマーを培地中に生産させ、GC-MSによって乳酸オリゴマーを定量した。培養開始から24時間、48時間、76時間、96時間及び168時間の段階で培養液をサンプリングし、GC-MSによって乳酸オリゴマーを定量した結果を図１３に示す。図１３に示したように、使用した組み換え大腸菌では、培養開始48時間から培養液への乳酸オリゴマーの生産が開示され、72時間を超えた辺りから乳酸オリゴマーの生産量が急激に増加している。また、使用した組み換え大腸菌では、培養開始から168時間を経過しても高い生産量を維持していた。
　本実施例の結果から、実施例１で作製した他の組み換え大腸菌についても同様に、例えば長期間に亘って乳酸オリゴマー生産性が高くなると判断できる。よって、実施例１で作製した組み換え大腸菌を使用することによって、低コストに乳酸オリゴマーを製造できることが明らかとなった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　宿主微生物に対して、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とを導入してなる組み換え微生物を培養し、
    　培地から脂肪族ポリエステルを回収することを特徴とする脂肪族ポリエステルの製造方法。
  2. 　上記脂肪族ポリエステルは、２乃至５量体を主とするオリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  3. 　上記脂肪族ポリエステルは、乳酸骨格を有する脂肪族ポリエステルであることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  4. 　上記脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸であることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  5. 　上記培地は最小培地であることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  6. 　上記組み換え微生物を４８時間以上培養した後、上記脂肪族ポリエステルを回収することを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  7. 　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、Alcanivorax borkumensis由来の遺伝子、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子、Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子、Rhizobium etli由来の遺伝子、Pseudomonas sp.由来の遺伝子及びHaloarcula marismortui由来の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
  8. 　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ａ）～（ｃ）に示す遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の脂肪族ポリエステルの製造方法。
    （ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質コードする遺伝子
    （ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
  9. 　宿主微生物に対して、乳酸を乳酸CoAに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってAlcanivorax borkumensis由来の遺伝子、Hyphomonas neptunium由来の遺伝子、Rhodobacter sphaeroides由来の遺伝子、Rhizobium etli由来の遺伝子、Pseudomonas sp.由来の遺伝子及びHaloarcula marismortui由来の遺伝子から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子を導入してなる組み換え微生物。
  10. 　上記ヒドロキシアシルCoAを基質としてポリヒドロキシアルカン酸を合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ａ）～（ｃ）に示す遺伝子であることを特徴とする請求項９記載の組み換え微生物。
    （ａ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質コードする遺伝子
    （ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
    （ｃ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
  11. 　上記宿主微生物は大腸菌であることを特徴とする請求項９記載の組み換え微生物。
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