[go: up one dir, main page]

WO2011105527A1 - 神経成長促進剤 - Google Patents

神経成長促進剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2011105527A1
WO2011105527A1 PCT/JP2011/054234 JP2011054234W WO2011105527A1 WO 2011105527 A1 WO2011105527 A1 WO 2011105527A1 JP 2011054234 W JP2011054234 W JP 2011054234W WO 2011105527 A1 WO2011105527 A1 WO 2011105527A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
shp
antibody
pir
trk receptor
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/054234
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
俊英 山下
幸 藤田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2011105527A1 publication Critical patent/WO2011105527A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a nerve growth promoter, and in particular, to a nerve growth promoter containing an inhibitor of SHP-1 or SHP-2 as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for screening an active ingredient candidate for a nerve growth promoter.
  • the present inventor has conducted basic research and development research that leads to overcoming aftereffects of the nervous system, and has already inhibited at least one of bone morphogenetic protein, bone morphogenetic protein receptor, and signal factor downstream of the receptor.
  • NgR Nogo receptor
  • PIR-B Pigmentar immunoglobulin-like receptor B
  • myelin-derived axon regeneration inhibitor a major histocompatibility complex class I receptor
  • the signaling pathway downstream of PIR-B leading to neurite outgrowth inhibition is unknown. Therefore, it was expected to contribute significantly to the development of new nerve growth promoters by elucidating the signal transduction pathway by binding of PIR-B and myelin-derived axon regeneration inhibitor and finding the key factors. .
  • PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science 322, 967-970 (2008).
  • the present invention elucidates a signal transduction pathway downstream of PIR-B, which is a receptor for an inhibitor of myelin-derived axon regeneration, a novel nerve growth promoter, a pharmaceutical composition for improving sequelae caused by central neuropathy, and nerve growth It is an object of the present invention to provide a method for screening an active ingredient candidate substance for an accelerator.
  • a nerve growth promoter comprising an inhibitor of SHP-1 or SHP-2 as an active ingredient.
  • (A) Substance that inhibits binding of SHP-1 or SHP-2 to Trk receptor B) Substance that inhibits Trk receptor tyrosine phosphatase activity of SHP-1 or SHP-2
  • the substance that inhibits the binding of SHP-1 or SHP-2 to a Trk receptor is any of the following (a) to (f): 2] The nerve growth promoter according to 2.
  • A a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof containing tyrosine at position 490 (b) in the sequence portion other than tyrosine at position 490 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • Peptide consisting of an amino acid sequence or a partial sequence containing tyrosine at position 532 (d) In the sequence portion other than tyrosine at position 532 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to several amino acids are deleted or substituted Or consisting of an added amino acid sequence or a partial sequence containing tyrosine at position 532, and SHP-1 Peptide that binds to SHP-2 (e)
  • a pharmaceutical composition for improving sequelae caused by central nervous disorder comprising the nerve growth promoter according to any one of [1] to [5].
  • Use of SHP-1 and / or SHP-2 for screening an active ingredient of a nerve growth promoter is any one of the following (A) to (C).
  • A Substance that inhibits binding of SHP-1 or SHP-2 to Trk receptor
  • B Substance that inhibits Trk receptor tyrosine phosphatase activity of SHP-1 or SHP-2
  • C SHP- 1 or a substance that inhibits the expression of SHP-2 [10] contacting the test substance with the intracellular domain of Trk receptor and SHP-1 and / or SHP-2, the intracellular domain of Trk receptor and SHP
  • a method for screening a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoting agent comprising the step of confirming the binding state with -1 or SHP-2.
  • the method includes contacting a test substance with an intracellular domain of a Trk receptor and SHP-1 and / or SHP-2, and confirming a phosphorylation state of the intracellular domain of the Trk receptor.
  • a screening method for a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoter characterized by the above.
  • a method for improving sequelae due to central nervous disorder comprising a step of administering an effective amount of the nerve growth promoter according to any one of [1] to [5] to a mammal.
  • a novel nerve growth promoter can be provided.
  • the nerve growth promoter is useful for improving sequelae caused by central nervous system disorders.
  • the active ingredient candidate substance of a nerve growth promoter can be obtained by the screening method of the present invention.
  • Immunoprecipitation was performed using a cell lysate of COS-7 cells transiently transfected with HA-tagged full-length TrkA (HA-TrkA FL) expression vector or full-length PIR-B (PIR-B FL) expression vector or both. And (b) shows the results of immunoprecipitation using an anti-HA antibody, (a) shows the results of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody, and (b) shows the results of immunoprecipitation using an anti-HA antibody.
  • FIG. Cell lysis of COS-7 cells transiently transfected with a protein (HA-TrkB T1) expression vector or full-length PIR-B expression vector added with an HA tag to TrkB lacking most of the intracellular domain
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of immunoprecipitation and Western blotting using a liquid as a sample.
  • A shows the results of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody.
  • B shows the results of immunization using an anti-HA antibody. It is a figure which shows the result of having performed sedimentation.
  • FIG. 6 shows the results of immunoprecipitation (using anti-Myc antibody) and Western blotting using a cell lysate of COS-7 cells transfected as a sample.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoprecipitation and Western blotting using a cell lysate prepared with or without treatment of cerebellar granule cells with MAG-Fc.
  • A shows anti-PIR-B antibody
  • B is a diagram showing the results of immunoprecipitation using an anti-TrkB antibody or a control antibody (anti-IgG antibody).
  • Cerebellar granule cells derived from wild-type (WT) mice and p75KO mice were treated with or without MAG-Fc, and cell lysates prepared as samples were used for immunoprecipitation (using anti-PIR-B antibody) and Western blotting.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoprecipitation and Western blotting using a cell lysate prepared by treating cerebellar granule cells with or without MAG-Fc as a sample, (a) shows anti-PIR-B antibody or As a result of immunoprecipitation using a control antibody (anti-IgG antibody), (b) shows the results of immunoprecipitation using an anti-SHP-2 antibody or a control antibody.
  • COS-7 cells transfected with HA-tagged TrkB expression vector and PIR-B expression vector, or cerebellar granule cells treated with or without MAG-Fc were used as samples for immunoprecipitation ( FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Western blotting using an anti-TrkB antibody or a control antibody (anti-IgG antibody), (a) shows the results of COS-7 cells, and (b) shows the results of cerebellar granule cells. It is. It is a figure which shows the result of having examined the phosphorylation level of the Trk receptor by the presence or absence of MAG-Fc stimulation using a cerebellar granule cell.
  • FIG. 4 shows the results of examining the phosphorylation level of Trk receptor with or without MAG-Fc stimulation after pretreatment of cerebellar granule cells with SHP inhibitor NSC-87877.
  • FIG. 3 shows the results of examining the phosphorylation level of Trk receptor with or without MAG-Fc stimulation using cerebellar granule cells transfected with SHP-1 or SHP-2 siRNA.
  • A shows SHP-
  • B shows the results of using SHP-2 siRNA. It is a figure which shows the result of having examined the phosphorylation level of the Trk receptor by the presence or absence of MAG-Fc stimulation using the cerebellar granule cell derived from a wild type (WT) mouse
  • FIG. 5 shows the results of measuring the length of neurites with and without MAG-Fc stimulation using cerebellar granule cells transfected with SHP-1 and / or SHP-2 siRNA.
  • FIG. 2 is a graph comparing the lengths of neurites, and (b) is a photomicrograph showing the morphology of a typical cell. It is a figure which shows the result of having measured the length of the neurite by the presence or absence of MAG-Fc stimulation using the cerebellar granule cell pre-processed with K252a. It is a figure which shows the result of having measured the length of the neurite by the presence or absence of MAG-Fc stimulation using the cerebellar granule cell which transfected TrkBsiRNA1, TrkBsiRNA2, or control siRNA.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the length of neurites with and without MAG-Fc stimulation using cerebellar granule cells pretreated with TAT-TrkA484-497 or TAT-TrkA481-494, (a) shows TAT- The results of TrkA484-497, (b) is a diagram showing the results of TAT-TrkA481-494. It is a figure which shows the result of having examined the phosphorylation level of the Trk receptor by the presence or absence of MAG-Fc stimulation using the cerebellar granule cell derived from a wild type (WT) mouse and a p75KO mouse
  • WT wild type
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoprecipitation and Western blotting as samples, (a) shows the results of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody, and (b) shows the results of immunoprecipitation using an anti-HA antibody. It is a figure which shows the result of having performed.
  • FIG. 6 shows the results of immunoprecipitation (using anti-Myc antibody) and Western blotting using a cell lysate of COS-7 cells transfected as a sample. Cerebellar granule cells were treated with MAG-Fc or Nogo-Fc or OMgp, and cell lysates prepared without treatment were used for immunoprecipitation (using anti-PIR-A / B antibody) and Western blotting. It is a figure which shows a result.
  • FIG. 3 is a view showing the results of immunoprecipitation (using anti-PIR-A / B antibody) and Western blotting using a lysate as a sample.
  • FIG. 3 is a view showing the results of immunoprecipitation (using anti-PIR-A / B antibody) and Western blotting using a lysate as a sample.
  • FIG. 3 is a view showing the results of immunoprecipitation (using anti-PIR-A / B antibody) and Western blotting using a lysate as a sample. It is a figure which shows the result of having performed immunoprecipitation (using an anti-PIR-B antibody) and Western blotting, using a cell lysate prepared with or without treating cerebellar granule cells with MAG-Fc.
  • FIG. 3 shows the results of confirming the expression of SHP-1 and SHP-2 by Western blotting after transfecting SHP-1 siRNA, SHP-2 siRNA or control siRNA into the vitreous of an optic nerve injury model mouse.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of comparing and comparing the SHP-1 siRNA, the SHP-2 siRNA or the control siRNA into the vitreous of an optic nerve injury model mouse, and quantifying axonal regeneration from an optic nerve tissue specimen.
  • Nogo MAG and OMgp, which are known as inhibitors of regeneration of the central nervous system of adult mammals, bind to its receptor PIR-B, and neurites (axons) of the central nervous system.
  • PIR-B receptor for the central nervous system
  • neurites axons of the central nervous system.
  • Trk tropomyosin-receptor-kinase
  • the present invention provides a nerve growth promoter containing an inhibitor of SHP-1 or SHP-2 as an active ingredient.
  • the inhibitor of SHP-1 or SHP-2 of the present invention may be a substance that inhibits the function of SHP-1 or SHP-2, and may be any substance that inhibits the expression of SHP-1 or SHP-2.
  • the inhibitor of SHP-1 or SHP-2 may be any one of the inhibitors, but a substance that simultaneously inhibits both SHP-1 and SHP-2 is preferable.
  • SHPs will be referred to as “SHPs”.
  • inhibitors of SHPs include substances that inhibit the binding of SHPs to Trk receptors, substances that inhibit the Trk receptor tyrosine dephosphorylating enzyme activity of SHPs, substances that inhibit the expression of SHPs, and the like. Include low molecular weight compounds, peptides, antibodies, nucleic acids, and the like.
  • Examples of the substance that inhibits the binding between SHPs and the Trk receptor include any of the following peptides (a) to (f).
  • A a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof containing tyrosine at position 490 (b) in the sequence portion other than tyrosine at position 490 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • Peptide consisting of an amino acid sequence or a partial sequence containing tyrosine at position 532
  • D In the sequence portion other than tyrosine at position 532 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to several amino acids are deleted or substituted Or consisting of an added amino acid sequence or a partial sequence containing
  • the “peptide” in the present invention means a peptide in which two or more amino acids are bonded by peptide bonds, and the number of amino acids to be bonded is not limited. That is, the “peptide” in the present invention includes a polypeptide.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence (accession number: NM_001012331, NP_001012331.1) of human Trk receptor A (hereinafter, Trk receptor A is simply referred to as “TrkA”).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence (accession number: NM_006180, NP_006171.2) of human Trk receptor B (hereinafter, Trk receptor B is simply referred to as “TrkB”).
  • Trk receptor C is simply referred to as “TrkC”.
  • SHP-1 is known to form a complex at the position of tyrosine 490 of human TrkA (Marsh, HN, et al. J Cell Biol 163, 999-1010-10 (2003)), and in human TrkB In tyrosine at position 532 and human TrkC, it is presumed that tyrosine at position 515 is involved in binding to SHPs.
  • a full-length human TrkA or a fragment (partial fragment) containing tyrosine at position 490, a full-length human TrkB or a fragment containing tyrosine at position 532, human TrkC Or a fragment containing tyrosine at position 515 can be preferably used as a peptide that inhibits the binding between SHPs and the Trk receptor.
  • the number of amino acid residues in the fragment is not particularly limited, but is preferably 20 or less, more preferably 15 or less, still more preferably 10 or less, and particularly preferably 5 or less.
  • human TrkA, human TrkB, and human TrkC have binding properties to SHPs, they may have mutations in the sequence portions other than tyrosine at 490, 532, and 515, respectively.
  • the peptides (b), (d), and (f) can also be suitably used as peptides that inhibit the binding between SHPs and the Trk receptor.
  • “one to several amino acids have been deleted, substituted or added” means that the number can be deleted, substituted or added by known mutant peptide production methods such as site-directed mutagenesis (preferably Means that 10 or less, more preferably 7 or less, and still more preferably 5 or less) amino acids are deleted, substituted or added.
  • suitable peptides that inhibit the binding between SHPs and the Trk receptor include, for example, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. .
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 corresponds to positions 481 to 494 of SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 corresponds to positions 484 to 497 of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 may have the aforementioned mutations as long as they have binding properties with SHPs.
  • non-human mammal Trk receptors and fragments thereof having binding ability to SHPs can also be suitably used as peptides that inhibit the binding of SHPs to Trk receptors.
  • the peptides (a) to (f) above can be obtained by (I) constructing a recombinant expression vector of a desired peptide by a known genetic engineering technique, introducing the peptide into an appropriate host cell, and expressing it as a recombinant protein. Can be manufactured. Alternatively, it can be produced by (II) in vitro transcription / translation system. Alternatively, it can be produced by (III) a solid phase synthesis method (Fmoc method, Boc method) or a liquid phase synthesis method according to a known general peptide synthesis protocol.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester is, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, for example, phenyl, ⁇ - C 6-12 aryl group such as naphthyl, for example, benzyl, C 7 - 14 aralkyl such as ⁇ - naphthyl -C 1-2 alkyl group such as a phenyl -C 1-2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl
  • a pivaloyloxymethyl group which is widely used as an oral ester, can be mentioned.
  • the peptide of the present invention has a carboxyl group or a carboxylate other than the C-terminus, these groups may be amidated or esterified.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 2-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl, etc.) ),
  • the N-terminal side is cleaved in vivo, and the resulting glutamyl group is pyroglutamine oxidized, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (eg, —OH, —SH, amino group) Imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) may be protected with an appropriate protecting group (for example, C 1-6 acyl group such as C 2-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl, etc.).
  • an appropriate protecting group for example, C 1-6 acyl group such as C 2-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl, etc.
  • the peptides (a) to (f) may form a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt include hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, Salts with acids such as oxalic acid, malic acid, citric acid, oleic acid, palmitic acid; salts with alkali or alkaline earth metals such as sodium, potassium, calcium, or aluminum hydroxides or carbonates; And salts with triethylamine, benzylamine, diethanolamine, t-butylamine, dicyclohexylamine, arginine and the like.
  • Examples of the substance that inhibits the binding between SHPs and Trk receptor include, for example, an antibody against SHPs or an antibody against Trk receptor, which inhibits the binding between SHPs and Trk receptor, and Trk receptor tyrosine dephosphorylation of SHPs
  • Examples thereof include antibodies that inhibit oxidase activity.
  • Such an antibody can be prepared by a known method using SHP-1 or a fragment thereof, SHP-2 or a fragment thereof, or Trk receptor or a fragment thereof as an immunogen. What is necessary is just to confirm that the obtained antibody inhibits the coupling
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Further, it may be a complete antibody molecule or an antibody fragment (for example, Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, scFv, etc.) that can specifically bind to an antigen.
  • a polyclonal antibody can be prepared and obtained, for example, as follows. That is, an antigen is dissolved in PBS, and a mammal (mouse, rat, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with an immunogen mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) if desired.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • the immunization method is not particularly limited, for example, a method of subcutaneous injection or intraperitoneal injection once or a plurality of times at appropriate intervals is preferable.
  • blood can be collected from the immunized animal, serum can be separated, and the polyclonal antibody fraction can be purified.
  • a monoclonal antibody can be obtained by fusing immune cells (eg, spleen cells) obtained from the immunized mammal with myeloma cells to obtain a hybridoma, and collecting the antibody from the hybridoma culture.
  • an antibody gene can be cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host cell, and a recombinant monoclonal antibody can be produced using gene recombination techniques. Furthermore, it can also be prepared using a phage display method.
  • the antibody is preferably a human chimeric antibody or a humanized antibody.
  • a human chimeric antibody refers to an antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody derived from a non-human animal, and a heavy chain constant region and a light chain constant region of a human antibody.
  • a humanized antibody is obtained by grafting a CDR (complementarity determining region) of an antibody derived from a non-human animal into a CDR of a human antibody, and is also referred to as a CDR-grafted antibody, a reconstituted antibody, or the like.
  • the FR (framework region) of the humanized antibody is selected so that CDR forms a favorable antigen-binding site.
  • amino acid sequence of FW in the variable region of the antibody may be substituted so that the CDR of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • the amino acid sequence of the constant region of a human antibody can be obtained from a known database (Protein Data Bank etc.).
  • SHPs examples include siRNA (short interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), antisense oligonucleotides, and the like of the SHP-1 gene or SHP-2 gene.
  • SHP-1 gene examples include a human SHP-1 gene (accession number: NM_002831) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a mouse SHP-1 gene (accession number) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • NM_013545 human SHP-2 gene consisting of the base acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (accession number: NM_002834), mouse SHP-2 gene consisting of the base acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (accession number: NM_011202) ) And the like, but is not limited thereto.
  • the base sequences of SHP genes derived from various organisms can be easily obtained from known databases (GenBank etc.).
  • An siRNA is a double-stranded RNA having a length of about 20 bases (for example, about 21 to 23 bases) or less, and by expressing such siRNA in a cell, a gene (this In the invention, the expression of the SHP-1 gene or SHP-2 gene) can be suppressed.
  • shRNA is a single-stranded RNA that contains a partially palindromic base sequence, so that it has a double-stranded structure in the molecule and a short hairpin structure having a protruding portion at the 3 ′ end. It refers to the above molecules.
  • shRNA is introduced into the cell, it is degraded into a length of about 20 bases (typically, for example, 21 bases, 22 bases, 23 bases) in the cell and becomes a target in the same manner as siRNA.
  • Expression of a gene in the present invention, SHP-1 gene or SHP-2 gene
  • the siRNA and shRNA may be in any form as long as it can suppress the expression of the SHP-1 gene or the SHP-2 gene.
  • siRNA or shRNA can be artificially chemically synthesized.
  • antisense and sense RNA can be synthesized in vitro from template DNA using T7 RNA polymerase and T7 promoter.
  • the antisense oligonucleotide may be any nucleotide that is complementary to or hybridizes to a continuous 5 to 100 nucleotide sequence in the DNA sequence of the SHP-1 gene or SHP-2 gene. It may be. Moreover, it may be modified as long as the function is not hindered.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized by conventional methods, for example, can be easily synthesized by a commercially available DNA synthesizer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for ameliorating sequelae caused by central nervous system disorders, comprising the nerve growth promoter of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition for ameliorating sequelae caused by a central nervous system disorder containing an inhibitor of SHP-1 or SHP-2 as an active ingredient.
  • central nervous system disorders include cerebrovascular disorders, brain trauma, spinal cord injury, and the like.
  • cerebrovascular disorder include stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage and the like.
  • sequelae caused by central nervous system disorders include motor dysfunction, sensory dysfunction, and language impairment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by using an inhibitor of SHPs as an active ingredient and appropriately blending a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • oral preparations such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches, etc. can do.
  • What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • the inhibitor of SHPs is a peptide or antibody
  • a parenteral route of administration such as intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous Or it is preferable to administer locally.
  • injections or infusions containing antibodies can be used as solutions, suspensions or emulsions.
  • the solvent include distilled water for injection, physiological saline, glucose solution and isotonic solution (for example, solutions of sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, propylene glycol, etc.) Can be used.
  • this injection or infusion may contain stabilizers, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, soothing agents, buffers, preservatives, preservatives, pH adjusters and the like.
  • a stabilizer for example, albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol, propylene glycol, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium thiosulfate, EDTA sodium, sodium citrate, dibutylhydroxytoluene, etc. should be used. Can do.
  • solubilizers include alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (registered trademark), HCO-50, etc.) Etc.
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80 (registered trademark), HCO-50, etc.
  • Etc. can be used.
  • the suspending agent for example, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • emulsifier for example, gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • the soothing agent for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • the buffer for example, phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, and the like can be used.
  • Preservatives include, for example, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, boron Sand or the like can be used.
  • preservative for example, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • pH adjuster for example, hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid and the like can be used.
  • the inhibitor of SHPs is a nucleic acid (siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, etc.)
  • it can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • a non-viral vector form a method for introducing nucleic acid molecules using liposomes (liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc.), microinjection method, gene gun (Gene Gun ), A method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier (metal particle) can be used.
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • DNA expressing siRNA or shRNA is added to DNA viruses or RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus, SV40, etc.
  • a gene can be introduced into a cell or tissue by introducing and infecting the cell or tissue with this recombinant virus.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined in consideration of the purpose, the severity of the disease, the patient's age, weight, sex, medical history, type of active ingredient, and the like.
  • an average human having a body weight of about 65 to 70 kg is used as a subject, it is preferably about 0.02 to 4000 mg, more preferably about 0.1 to 200 mg per day.
  • the total daily dose may be a single dose or divided doses.
  • the present invention includes a method for improving sequelae caused by a central nervous disorder, which comprises the step of administering an effective amount of the nerve growth promoter of the present invention.
  • the present invention includes the use of the nerve growth promoter of the present invention described above for producing a pharmaceutical composition for improving sequelae caused by central nervous system disorders.
  • the present invention includes the nerve growth promoter of the present invention described above for use in improving sequelae caused by central nervous system disorders.
  • the novel findings regarding the signal transduction pathway found by the present inventors have revealed that inhibitors of SHP-1 or SHP-2 are useful as active ingredients of nerve growth promoters. That is, it was revealed that SHP-1 and / or SHP-2 can be used for screening an active ingredient of a nerve growth promoter. Accordingly, the present invention includes the use of SHP-1 and / or SHP-2 for screening active ingredients of nerve growth promoters.
  • the inhibitor of SHP-1 or SHP-2 that can be an active ingredient of a nerve growth promoter is not particularly limited, and examples thereof include the following (A) to (C).
  • A Substance that inhibits binding of SHP-1 or SHP-2 to Trk receptor
  • B Substance that inhibits Trk receptor tyrosine phosphatase activity of SHP-1 or SHP-2
  • C SHP- Substances that inhibit the expression of 1 or SHP-2
  • the present invention comprises a step of contacting a test substance with an intracellular domain of a Trk receptor and SHP-1 and / or SHP-2, and a binding state between the intracellular domain of the Trk receptor and SHP-1 or SHP-2
  • a method for screening a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoting agent comprising the step of: By this screening method, a substance that inhibits the binding between SHP-1 or SHP-2 and the Trk receptor can be screened.
  • the present invention also comprises a step of contacting a test substance, the intracellular domain of the Trk receptor, and SHP-1 and / or SHP-2, and a step of confirming the phosphorylation state of the intracellular domain of the Trk receptor.
  • the screening method of the active ingredient candidate substance of the nerve growth promoter characterized by including is provided. By this screening method, a substance that inhibits the Trk receptor tyrosine phosphatase activity of SHP-1 or SHP-2 can be screened.
  • the method for bringing the test substance into contact with the intracellular domain of the Trk receptor and SHP-1 and / or SHP-2 is not particularly limited.
  • a reaction system containing (1) Trk receptor or a fragment containing the intracellular domain of Trk receptor and (2) SHP-1 or SHP-2 or both is prepared, and a test substance is added thereto The method of doing is mentioned.
  • the contact time and the contact temperature are not particularly limited and may be appropriately selected. Moreover, it is preferable to provide a control group that does not contact the test substance.
  • the intracellular domain of the Trk receptor used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the intracellular domain of the Trk receptor, and a full-length Trk receptor or a fragment containing the intracellular domain of the Trk receptor is preferable. Can be used.
  • the Trk receptor A has positions 434 to 790 of SEQ ID NO: 1
  • the Trk receptor B has positions 455 to 838 of SEQ ID NO 2
  • the Trk receptor C has positions 454 to 838 of SEQ ID NO 3.
  • Position 839 corresponds to the intracellular domain.
  • the Trk receptor or the fragment containing the intracellular domain of the Trk receptor, SHP-1 and SHP-2 used in the screening method of the present invention can be obtained using, for example, a known genetic recombination technique.
  • the method for confirming the binding state between the intracellular domain of the Trk receptor and SHP-1 or SHP-2 is not particularly limited, and a known method may be appropriately selected and used.
  • the ELISA method can be suitably used.
  • the method for confirming the phosphorylation state of the intracellular domain of the Trk receptor is not particularly limited, and a known method may be appropriately selected and used.
  • the phosphorylation state of the intracellular domain of the Trk receptor can be easily confirmed by using a commercially available anti-phosphotyrosine antibody.
  • a substance that inhibits the binding between the intracellular domain of the Trk receptor and SHP-1 or SHP-2 is promoted for nerve growth. It can be selected as an active ingredient candidate substance of the agent. Further, as a result of confirming the phosphorylation state of the intracellular domain of the Trk receptor, a substance that inhibits the dephosphorylation of the intracellular domain of the Trk receptor can be selected as a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoter. Inhibition does not require complete inhibition, and binding activity to the intracellular domain of Trk receptor inherent to SHP-1 or SHP-2, or dephosphorylation of the intracellular domain of Trk receptor Any substance that attenuates oxidation activity may be used.
  • test substance Based on the binding activity level or dephosphorylation activity level of the control not in contact with the test substance, if the test substance has reduced these activity levels, determine that it is a candidate substance for the active ingredient of nerve growth promoter. Can do.
  • the present invention includes a step of contacting a test substance with a cell capable of confirming the expression level of SHP-1 and / or SHP-2, and an expression level of SHP-1 and / or SHP-2 in the cell in contact with the test substance And a method of screening a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoting agent, comprising comparing the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 in a cell not in contact with the test substance provide.
  • a substance that inhibits the expression of SHP-1 or SHP-2 can be screened.
  • Cells capable of confirming the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 include cell lines expressing SHP-1 and / or SHP-2, and expressing SHP-1 and / or SHP-2. And cells into which a vector for a reporter assay of SHP-1 and / or SHP-2 has been introduced.
  • Cell lines expressing SHP-1 and / or SHP-2 include, but are not limited to, COS-7, HEK293, Hela, PC12 and the like.
  • Examples of nerve cells expressing SHP-1 and / or SHP-2 include cerebral cortical cells, hippocampal cells, cerebellar cells and the like, and these primary cultured cells can be preferably used.
  • a method for bringing a cell capable of confirming the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 into contact with a test substance is not particularly limited, and examples thereof include a method of culturing cells using a culture solution to which a test substance is added. It is done. Alternatively, the contact may be made in vivo (see Example 1 (7-1), FIG. 29).
  • the expression level can be expressed by the protein level of SHP-1 and / or SHP-2, the mRNA level of SHP-1 and / or SHP-2, the reporter expression level of the reporter assay, and the like.
  • the amount of protein, the amount of mRNA, the amount of reporter expression, etc. can be quantified by appropriately selecting a known method. Comparing the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 in the cells in contact with the test substance and the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 in the cells not in contact with the test substance, If the expression level of SHP-1 and / or SHP-2 in the contacted cells is reduced, the test substance can be determined as a candidate substance for an active ingredient of a nerve growth promoter.
  • a test substance that reduces the expression level to 50% or less, more preferably a test substance that reduces the expression level to 25% or less is determined as an active ingredient candidate substance for a nerve growth promoter.
  • Example 1 [Experimental materials and experimental methods]
  • Animals C57BL / 6J mice (8 weeks old) were purchased from Charles River Laboratories and bred at the Osaka University graduate School of Medicine / Animal Experiment Facility.
  • PIR-B ⁇ / ⁇ mice are described in Ujike et al. (Ujike, A., et al. Impaired dendritic cell maturation and increased T (H) 2 responses in PIR-B ( ⁇ / ⁇ ) mice. Nat Immunol 3, 542-548. (2002).)
  • a C57BL / 6J mouse strain carrying the third exon disruption of the target p75 gene was used. This strain was originally obtained from the Jackson Laboratory. All experimental procedures were approved by the organizing committee of Osaka University.
  • TAT-TrkA peptide 481-494 (TAT-QGHIIENPQYFSDA: SEQ ID NO: 4), TAT-TrkA peptide 484-497 (TAT-IIENPQYFSDACVH: SEQ ID NO: 5) and TAT fusion control peptide (TAT-HVCAESFYQPNEII: SEQ ID NO: 6) Synthesized (Sigma-Aldrich).
  • CHO cells that stably secrete human MAG-Fc were provided by Mr. Endo of Kobe University. The cells were cultured using a serum-free medium. After culturing for 3 days, the medium was collected, and MAG-Fc was purified using protein A sepharose beads.
  • anti-HA antibody HA-7, 1: 5000, Sigma-Aldrich
  • anti-c-Myc antibody 9E10, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology
  • biotin-labeled anti-TrkB antibody 1: 2500, R & D systems
  • Anti-SHP-1 antibody 1: 1000, BD Transduction Laboratories
  • anti-SHP-2 antibody 1: 1000, BD Transduction Laboratories
  • anti- ⁇ tubulin antibody (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology
  • anti-neutral Class III ⁇ tubulin antibody 1: 5000, Covance Laboratories
  • anti-p75 antibody (1: 1000, Promega)
  • anti-SHP-1 antibody As polyclonal antibodies, anti-SHP-1 antibody, anti-SHP-2 antibody, anti-Trk antibody, anti-TrkB antibody, anti-PIR-B antibody (above 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology)
  • Anti-PIR-B antibody (1 mg / mL, R & D systems) and anti-PIR-A / B antibody (1: 1000, BD Pharmingen) were used.
  • HRP-labeled anti-mouse, anti-rabbit, anti-rat IgG secondary antibody Santa Cruz Biotechnology
  • streptavidin peroxidase (Roche Applied Science)
  • Alexa488 or 568-labeled anti-mouse IgG goat antibody (Molecular Probes) were used.
  • Plasmid and siRNA DNA encoding full-length p75 with an HA tag or Myc tag added to the N-terminus was subcloned into pcDNA3 vector (Invitrogen) (Yamashita, T., et al. J Cell Biol 157, 565-570 (2002)). The extracellular and intracellular domains of p75 were prepared from p75-HA.
  • DNA encoding PIR-B was subcloned into pcDNA3.1 Zero (+) vector (Endo, S., et al. Proc Nat Acad Sci USA 105, 14515-14520 (2008)).
  • the expression vector for TrkB was provided by Barde YA (Bibel, M., Hoppe, E.
  • TrkB A mammalian cell expression vector for TrkB was purchased from Addgene. The following siRNAs were used for knockdown experiments. For mouse SHP-1, for mouse SHP-2 (ON-TARGET plus SMARTpool, Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products) and for mouse NTRK2 (stealth siRNA, Invitrogen). ON-TARGET plus SMARTpool is a mixture of four types of double-stranded siRNA.
  • COS-7 cells were cultured using DMEM (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum.
  • DMEM Invitrogen
  • Lipofectamine 2000 Invitrogen
  • Cells were lysed 24-48 hours after transfection and subjected to immunoprecipitation.
  • Primary dissociation culture of cerebellar granule cells (CGNs) derived from 7-day-old mice was performed as described by Hata et al. (Hata, K., et al. J Cell Biol 184, 737-750 (2009)).
  • the mouse cerebellum was digested with 0.25% trypsin (Gibco / Invitrogen) and DNaseI (Takara) for 15 minutes at 37 ° C., and then the cells were gently dissociated.
  • DMEM / F12 containing 10% fetal bovine serum was added and the cells were centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes.
  • the obtained CGNs were seeded on a poly-L-lysine-coated dish and maintained at 37 ° C. under 5% CO 2 condition using DMEM / F12 to which B27 (Invitrogen) was added. After 24 hours, the medium was changed to DMEM / F12 containing 0.1% BSA. After 24 hours of incubation, CGNs were collected and subjected to immunoprecipitation or Western blotting.
  • the cells were mixed with 500 ⁇ L of DMEM / F12 containing 10% fetal calf serum pre-warmed, and the cell suspension was seeded on a poly-L-lysine-coated dish.
  • the cells were left in an incubator, and after 3 hours, the medium was replaced with fresh DMEM / F12 containing B27, and the culture was continued for 48 to 72 hours. Thereafter, the medium was replaced with serum-free medium and subjected to immunoprecipitation or Western blotting. Alternatively, the medium was removed and seeded on a poly-L-lysine coated dish and subjected to a neurite outgrowth test.
  • Immunoprecipitation Cells were washed with ice-cold PBS and lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5-1% NP-40, 10 mM NaF) containing protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics) on ice. , 1 mM Na 3 VO 4 ), and centrifuged at 4 ° C., 15000 rpm for 10 minutes. The supernatant was incubated with the desired antibody at 4 ° C. for 2 hours or overnight.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5-1% NP-40, 10 mM NaF
  • protease inhibitor cocktail Roche Diagnostics
  • Neurite outgrowth test was performed according to the method of Hata et al. (Hata, K., et al. J Cell Biol 173, 47-58 (2006)). Specifically, after treatment with MAG-Fc dissolved in DMEM / F12 or control (DMEM / F12 only) for 24 hours, cerebellar granule cells (CGNs) were fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde to recognize TuJ1. Immunostained with monoclonal antibodies.
  • cholera toxin ⁇ subunit conjugated with Alexa Fluor (trade name, 2 ⁇ g / ⁇ L, Invitrogen) was injected into the vitreous using a glass needle.
  • CTB cholera toxin ⁇ subunit conjugated with Alexa Fluor
  • the mice were euthanized by overanesthesia, refluxed with 4% PFA, and the eyeballs were removed.
  • the remaining eye cup with the nerve portion after removal of the lens and vitreous was postfixed with 4% PFA at 4 ° C. for 12 hours.
  • the eyecup was dehydrated overnight at 4 ° C. using a 10-30% sucrose solution and immersed in Tissue Tech OCT Compound (trade name).
  • the tissue was frozen with dry ice and a continuous section (16 ⁇ m) was prepared using a cryostat and collected on a MAS-coated slide glass.
  • FIG. 1 (A) shows the result of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody
  • (b) shows the result of immunoprecipitation using an anti-HA antibody.
  • HA-TrkB was deposited on the immunoprecipitation complex using anti-PIR-B antibody (see FIG. 1 (a)), and the immunoprecipitation complex using anti-HA antibody was PIR-B was precipitated (see FIG. 1 (b)).
  • FIG. 3 (a) shows the result of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody
  • FIG. 3 (b) shows the result of immunoprecipitation using an anti-HA antibody.
  • HA-TrkB T1 was not deposited on the immunoprecipitation complex using the anti-PIR-B antibody (see FIG. 3 (a)), and PIR-B was not deposited on the immunoprecipitation complex using the anti-HA antibody ( (Refer FIG.3 (b)).
  • CGNs Cerebellar granule cells derived from 7-day-old mice were treated with MAG-Fc (25 ⁇ g / mL) for 15 minutes, or a cell lysate was prepared without treatment and immunoprecipitation was performed.
  • anti-PIR-B antibody, anti-TrkB antibody or control antibody anti-IgG antibody
  • Western blotting of the cell lysate was performed using the same detection antibody. The results are shown in FIGS. 5 (a) and (b).
  • (A) shows the result of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody
  • (b) shows the result of immunoprecipitation using an anti-TrkB antibody or a control antibody.
  • TrkB was precipitated on the immunoprecipitation complex using the anti-PIR-B antibody only in the cells treated with MAG-Fc.
  • PIR-B was deposited on the immunoprecipitation complex using anti-TrkB antibody only in the cells treated with MAG-Fc. From these results, it was shown that PIR-B interacts with TrkB in a ligand-dependent manner.
  • COS-7 cells transfected with a full-length PIR-B (PIR-B FL) expression vector and a full-length p75 (p75 FL-HA) expression vector to which an HA tag has been added are expressed as MAG-Fc (25 ⁇ g / mL).
  • the cell lysate was prepared with or without treatment for 15 minutes and immunoprecipitated.
  • Anti-SHP-2 antibody was used for immunoprecipitation, and detection was performed with anti-PIR-B antibody and anti-SHP-2 antibody.
  • Western blotting of cell lysate was performed using anti-PIR-B antibody, anti-SHP-2 antibody and anti-HA antibody as detection antibodies. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 7, PIR-B was precipitated in the immunoprecipitation complex using anti-SHP-2 antibody in cells not treated with MAG-Fc. In addition, the binding of PIR-B and SHP-2 was enhanced by MAG-Fc treatment.
  • CGNs cerebellar granule cells
  • MAG-Fc 25 ⁇ g / mL
  • cell lysates were prepared and immunoprecipitated.
  • anti-PIR-B antibody, anti-SHP antibody or control antibody anti-IgG antibody
  • detection was performed with anti-PIR-B antibody and anti-SHP-2 antibody, respectively.
  • Western blotting of the cell lysate was performed using the same detection antibody. The results are shown in FIGS. 8 (a) and (b).
  • FIG. 8 (A) shows the results of immunoprecipitation using anti-PIR-B antibody or control antibody
  • (b) shows the results of immunoprecipitation using anti-SHP-2 antibody or control antibody.
  • SHP-2 was precipitated in the immunoprecipitation complex using anti-PIR-B antibody in cells not treated with MAG-Fc.
  • the binding of PIR-B and SHP-2 was enhanced by MAG-Fc treatment.
  • PIR-B was deposited on the immunoprecipitation complex using anti-SHP-2 antibody in cells not treated with MAG-Fc.
  • the binding of PIR-B and SHP-2 was enhanced by MAG-Fc treatment.
  • TrkB was involved in the formation of PIR-B-SHP-2 complex.
  • Prepare cell lysate by treating COS-7 cells transfected with HA-tagged TrkB expression vector and PIR-B expression vector or CGNs with MAG-Fc (25 ⁇ g / mL) for 15 minutes. And immunoprecipitation was performed.
  • anti-TrkB antibody or control antibody anti-IgG antibody
  • detection was performed with anti-SHP-2 antibody and anti-TrkB antibody.
  • Western blotting of the cell lysate was performed using the same detection antibody. The results are shown in FIGS. 9 (a) and (b).
  • (A) is the result of COS-7 cells
  • (b) is the result of CGNs.
  • SHP-2 was precipitated on the immunoprecipitation complex using anti-TrkB antibody in COS-7 cells not treated with MAG-Fc.
  • the binding of PIR-B and SHP-2 was enhanced by MAG-Fc treatment.
  • PIR-B was deposited on the immunoprecipitation complex using anti-SHP-2 antibody in cells not treated with MAG-Fc.
  • the binding of PIR-B and SHP-2 was enhanced by MAG-Fc treatment. From the above results, it was revealed that SHP-2 is attracted to the PIR-B-TrkB receptor complex after MAG stimulation.
  • NSC-87877 (8-hydroxy-7-
  • the experiment was conducted using (6-sulfonaphthalen-2-yl) diazenyl-quinoline-5-sulfonic acid). That is, CGNs was pretreated with NSC-87877 for 3 hours, and then the same experiment as in (3-1) was performed. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 12, by performing pretreatment with NSC-87877, dephosphorylation of the Trk receptor was not induced by MAG-Fc treatment.
  • TrkBsiRNA1 or TrkBsiRNA2 or control siRNA was transfected into CGNs, and cultured for 24 hours in the presence or absence of MAG-Fc using poly-L-lysine-coated dishes. The length of the longest neurite of each cell was measured, and the average value was obtained. In addition, the expression level of TrkB was confirmed by Western blotting. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 17, neurite growth of CGNs was significantly blocked by knocking down TrkB. In addition, the effect of MAG-Fc disappeared. This result indicates that MAG decreases the steady-state activity of TrkB and inhibits neurite outgrowth of CGNs.
  • N-terminal protein transduction domain (11 amino acids) of HIV-derived TAT protein is fused to synthesize TAT-TrkA481-494 and TAT-TrkA484-497. used.
  • FIG. 22 (a) shows the result of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody
  • FIG. 22 (b) shows the result of immunoprecipitation using an anti-HA antibody.
  • p75 FL-HA was deposited on the immunoprecipitation complex using anti-PIR-B antibody (see FIG. 22 (a)), and the immunoprecipitation complex using anti-HA antibody.
  • PIR-B was deposited on the substrate (see FIG. 22B). From these results, it was confirmed that PIR-B interacts with p75.
  • FIG. 23 (A) shows the result of immunoprecipitation using an anti-PIR-B antibody
  • (b) shows the result of immunoprecipitation using an anti-HA antibody.
  • p75 ECD + TM-HA was precipitated on the immunoprecipitation complex using anti-PIR-B antibody (see FIG. 23 (a)), and immunoprecipitation complex using anti-HA antibody.
  • PIR-B was deposited on the substrate (see FIG. 23B).
  • TrkB FL-HA and p75 FL-Myc were precipitated in the immunoprecipitation complex using the anti-PIR-A / B antibody in the cells transfected with the three expression vectors. Similar results were obtained when the TrkB FL-HA expression vector was used instead of the TrkB FL-HA expression vector (see FIG. 27).
  • FIG. 31 shows the results of quantifying the number of CTB-labeled axons extending 0.2, 0.5, and 1.0 mm from the end of the damaged site.
  • mice transfected with SHP-1 siRNA and SHP-2 siRNA respectively, significantly increased axon regeneration compared to mice transfected with control siRNA. Promoted.
  • the number of mice used was 6 control siRNAs, 6 SHP-1 siRNAs, and 7 SHP-2 siRNAs.
  • the scale bar represents 200 ⁇ m
  • * represents the damaged site.
  • * indicates P ⁇ 0.05
  • ** indicates P ⁇ 0.01.
  • TrkB full length 5 ⁇ g / mL was added to a 96-well ELISA plate, incubated at 4 ° C. for 16 hours, and immobilized. After adding a test substance and SHP-1 to each well and reacting for 2 hours, the well was washed, and an anti-SHP-1 antibody (1 ⁇ g / mL) and an HRP-labeled anti-rabbit IgG secondary antibody (1: 1000) were added. To confirm the binding state between TrkB and SHP-1. A test substance added to a well showing a binding state of 50% or less compared with the binding state of the control (no test substance added) was selected as an active ingredient candidate substance of a nerve growth promoter.
  • TrkB full length 5 ⁇ g / mL was added to a 96-well ELISA plate, incubated at 4 ° C. for 16 hours, and immobilized. After adding a test substance and SHP-1 to each well and reacting for 2 hours, the well was washed, and an anti-phosphotyrosine antibody (1 ⁇ g / mL) and an HRP-labeled anti-mouse IgG secondary antibody (1: 1000) were added. Was used to confirm the phosphorylation state of TrkB. Compared to the phosphorylated state (dephosphorylated) of the control (no test substance added), the test substance added to the well showing a dephosphorylated state of 50% or less was selected as an active ingredient candidate substance of the nerve growth promoter. .
  • test substance was added to a medium (DMEM / F12) of mouse-derived cerebellar granule cells (CGNs) and cultured at 37 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, a cell lysate was prepared and subjected to Western blotting. For detection, anti-SHP-1 antibody and anti-SHP-2 antibody were used.
  • the test substance added to the well whose expression level was reduced to 50% or less compared with the control (no test substance addition) SHP-1 and SHP-2 expression levels was selected as a candidate substance for the active ingredient of nerve growth promoter. .

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　（Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質、（Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質、（Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質は、神経成長促進剤の有効成分として有用である。また、これらの物質を有効成分とする神経成長促進剤は、脳血管障害、脳外傷、脊髄損傷等の中枢神経障害による後遺症改善用医薬に利用することができる。

Description

神経成長促進剤
　本発明は、神経成長促進剤に関するものであり、詳細には、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質を有効成分とする神経成長促進剤に関するものである。また、本発明は、神経成長促進剤の有効成分候補のスクリーニング方法に関するものである。
　成体哺乳類の中枢神経系は、一度損傷を受けると軸索の再生はほとんど起こらないことが知られている。そのため、成体脳や成体脊髄が損傷を受けると、その後一生神経ネットワークが欠損し続けることになり、損傷が重篤である場合には、重度の運動機能障害等を抱えることになる。
　本発明者は、神経系の後遺障害の克服につながる基礎研究および開発研究を行っており、すでに、骨形成タンパク質、骨形成タンパク質レセプターおよび該レセプターの下流のシグナル因子の少なくともいずれか１つを阻害する物質を有効成分として含有する軸索伸長促進剤を提案している（特許文献１参照）。その後も鋭意研究を行い、新たなメカニズムに基づく神経成長促進剤の開発に取り組んでいる。
　ミエリン由来タンパク質であるＮｏｇｏ、ＭＡＧ（myelin-associated glycoprotein）およびＯＭｇｐ（oligodendrocyte-myelin glycoprotein）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経突起の成長を強力に阻害する活性を有することが知られている。これらのタンパク質は、Ｎｏｇｏ受容体（ＮｇＲ）と相互作用することによって神経突起の成長を阻害する。しかし、ＮｇＲを遺伝的に欠損させてもこれらのミエリン由来軸索再生阻害物質による神経突起成長阻害は止まらないことが報告されていることから、ＮｇＲ以外の受容体の存在が示唆されていた。その後、ミエリン由来軸索再生阻害物質の第２の受容体として、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ受容体であるＰＩＲ－Ｂ（Paired immunoglobulin-like receptor B）が特定されたが（非特許文献１参照）、神経突起成長阻害に至るＰＩＲ－Ｂの下流のシグナル伝達経路は未知である。したがって、ＰＩＲ－Ｂとミエリン由来軸索再生阻害物質の結合によるシグナル伝達経路を解明し、そのキーとなる因子を見出すことによって、新たな神経成長促進剤開発に大きく貢献することが期待されていた。
特開２００８－２５５０７１号公報
Atwal, J.K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science 322, 967-970 (2008).
　本発明は、ミエリン由来軸索再生阻害物質の受容体であるＰＩＲ－Ｂの下流のシグナル伝達経路を解明し、新規な神経成長促進剤、中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物、および神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質を有効成分とする神経成長促進剤。
［２］前記阻害物質が、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかである前記［１］に記載の神経成長促進剤。
（Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質
（Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質
（Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質
［３］ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質が、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかである前記［２］に記載の神経成長促進剤。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第４９０位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５３２位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
（ｅ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の第５１６位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
［４］ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質が、配列番号４または配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載の神経成長促進剤。
［５］ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質が、ＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子のｓｉＲＮＡである前記［２］に記載の神経成長促進剤。
［６］前記［１］～［５］のいずれかに記載の神経成長促進剤を含有することを特徴とする中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物。
［７］中枢神経障害が、脳血管障害、脳外傷または脊髄損傷である前記［６］に記載の医薬組成物。
［８］神経成長促進剤の有効成分をスクリーニングするためのＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の使用。
［９］神経成長促進剤の有効成分が、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかである請求項８に記載の使用。
（Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質
（Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質
（Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質
［１０］被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
［１１］被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
［１２］被験物質とＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量を確認可能な細胞とを接触させる工程と、被験物質と接触した細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量と、被験物質と接触していない細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量とを比較する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
［１３］哺乳動物に対して、前記［１］～［５］のいずれかに記載の神経成長促進剤の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする中枢神経障害による後遺症改善方法。
［１４］中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物を製造するための、前記［１］～［５］のいずれかに記載の神経成長促進剤の使用。
［１５］中枢神経障害による後遺症改善に使用するための、前記［１］～［５］のいずれかに記載の神経成長促進剤。
　本発明により、新規な神経成長促進剤を提供することができる。当該神経成長促進剤は、中枢神経障害による後遺症の改善に有用である。また、本発明のスクリーニング方法により神経成長促進剤の有効成分候補物質を取得することができる。
ＨＡタグ付加全長ＴｒｋＢ（ＨＡ－ＴｒｋＢ ＦＬ）または全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 ＨＡタグ付加全長ＴｒｋＡ（ＨＡ－ＴｒｋＡ ＦＬ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 細胞内ドメインの大部分を欠失したＴｒｋＢにＨＡタグを付加したタンパク質（ＨＡ－ＴｒｋＢ Ｔ１）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 ＴｒｋＢの細胞内ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ＨＡ－ＴｒｋＢ ＩＣＤ）発現ベクターまたはＰＩＲ－Ｂの細胞内ドメインにＭｙｃタグを付加したタンパク質（ＰＩＲ－Ｂ ＩＣＤ－Ｍｙｃ）発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗Ｍｙｃ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＴｒｋＢ抗体またはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 野生型（ＷＴ）マウスおよびｐ７５ＫＯマウス由来の小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は免疫沈降の結果、（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す図である。 全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターおよびＨＡタグ付加全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞をＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＳＨＰ－２抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体またはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＳＨＰ－２抗体またはコントロール抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 ＨＡタグ付加ＴｒｋＢ発現ベクターおよびＰＩＲ－Ｂ発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞、または小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＴｒｋＢ抗体もしくはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）はＣＯＳ－７細胞の結果、（ｂ）は小脳顆粒細胞の結果を示す図である。 小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図である。 ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターおよびＭｙｃタグを付加したｐ７５発現ベクター、ならびにＨＡタグを付加したＴｒｋＢまたはＴｒｋＡ発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図であり、（ａ）はＨＡ－ＴｒｋＢを発現するＣＯＳ－７細胞を用いた結果、（ｂ）はＨＡ－ＴｒｋＡを発現するＣＯＳ－７細胞を用いた結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＳＨＰ阻害剤ＮＳＣ－８７８７７で前処理した後、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図である。 ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図であり、（ａ）はＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡを用いた結果、（ｂ）はＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡを用いた結果を示す図である。 野生型（ＷＴ）マウスおよびＰＩＲ－Ｂ ＫＯマウス由来の小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図である。 ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無による神経突起の長さを測定した結果を示す図であり、（ａ）は各群の神経突起の長さを比較したグラフであり、（ｂ）は代表的な細胞の形態を表す顕微鏡写真である。 Ｋ２５２ａで前処理した小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無による神経突起の長さを測定した結果を示す図である。 ＴｒｋＢｓｉＲＮＡ１またはＴｒｋＢｓｉＲＮＡ２またはコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無による神経突起の長さを測定した結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＦＩＴＣ標識ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７で３０分間処理して細胞に取り込まれたＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７の存在を蛍光顕微鏡観察により確認した結果を示す図である。 ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７またはコントロールペプチドで前処理した小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＴｒｋＢ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７またはＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４で前処理した小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無による神経突起の長さを測定した結果を示す図であり、（ａ）はＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７の結果、（ｂ）はＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４の結果を示す図である。 野生型（ＷＴ）マウスおよびｐ７５ＫＯマウス由来の小脳顆粒細胞を用いて、ＭＡＧ－Ｆｃ刺激の有無によるＴｒｋ受容体のリン酸化レベルを検討した結果を示す図である。 ＨＡタグ付加全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 ｐ７５の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ｐ７５ ＥＣＤ＋ＴＭ－ＨＡ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果を示す図である。 ｐ７５の細胞内ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ｐ７５ ＩＣＤ－ＨＡ）発現ベクターまたはＰＩＲ－Ｂの細胞内ドメインにＭｙｃタグを付加したタンパク質（ＰＩＲ－Ｂ ＩＣＤ－Ｍｙｃ）発現ベクターまたは両者を一過的にトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗Ｍｙｃ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＭＡＧ－ＦｃまたはＮｏｇｏ－ＦｃまたはＯＭｇｐで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 ＨＡタグ付加全長ＴｒｋＢ（ＴｒｋＢ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクター、全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターおよびＭｙｃタグ付加全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－Ｍｙｃ）発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 ＨＡタグ付加全長ＴｒｋＡ（ＴｒｋＡ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクター、全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターおよびＭｙｃタグ付加全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－Ｍｙｃ）発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞の細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 小脳顆粒細胞をＭＡＧ－Ｆｃで処理し、または処理せずに調製した細胞溶解液を試料として、免疫沈降（抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を使用）およびウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 視神経損傷モデルマウスの硝子体内にＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡまたはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の発現をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図である。 視神経損傷モデルマウスの硝子体内にＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡまたはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、視神経の組織標本を作製して軸索の再生を比較した顕微鏡写真である。 視神経損傷モデルマウスの硝子体内にＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡまたはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、視神経の組織標本から軸索再生を定量し、比較した結果を示すグラフである。
　本発明者らは、成体哺乳類の中枢神経系の再生阻害物質として知られているＮｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐが、その受容体であるＰＩＲ－Ｂに結合し、中枢神経系の神経突起（軸索）成長を阻害するに至るシグナル伝達経路の詳細を世界に先駆けて解明した。すなわち、小脳顆粒細胞においてＰＩＲ－ＢにＭＡＧが結合することにより、ＰＩＲ－ＢとＴｒｋ（tropomyosin-receptor kinase）受容体との結合が誘導される。また、ＭＡＧがＰＩＲ－Ｂに結合すると、ＳＨＰ（Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase）－１およびＳＨＰ－２がＰＩＲ－Ｂに引き寄せられ、Ｔｒｋ受容体のチロシン脱リン酸化酵素として機能する。ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の阻害は、ＭＡＧが誘導するＴｒｋ受容体の脱リン酸化を減少させ、神経突起（軸索）成長に対するＭＡＧの阻害効果を無くしてしまう。さらに、ＭＡＧに対するＰＩＲ－Ｂ／Ｔｒｋ受容体複合体にｐ７５受容体（以下、「ｐ７５」という。）が加わる。以上のシグナル伝達経路に関する新規な知見に基づいて、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質は神経成長促進剤の有効成分として有用であることが明らかとなった（実施例参照）。
〔神経成長促進剤〕
　本発明は、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質を有効成分とする神経成長促進剤を提供する。本発明のＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質は、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の機能を阻害する物質でもよく、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質のいずれでもよい。ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質は、いずれか一方の阻害物質であればよいが、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の両方を同時に阻害する物質が好ましい。以下、説明の便宜上、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２を「ＳＨＰｓ」という。
　ＳＨＰｓの阻害物質としては、ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質、ＳＨＰｓのＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質、ＳＨＰｓの発現を阻害する物質等が挙げられ、具体的には、低分子化合物、ペプチド、抗体、核酸等が挙げられる。
　ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質としては、例えば、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかのペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第４９０位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５３２位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
（ｅ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の第５１６位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
　なお、本発明における「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、結合するアミノ酸の数は問わない。すなわち、本発明における「ペプチド」にはポリペプチドが含まれる。
　配列番号１で表わされるアミノ酸配列はヒトＴｒｋ受容体Ａ（以下、Ｔｒｋ受容体Ａを単に「ＴｒｋＡ」という。）のアミノ酸配列（アクセッション番号：NM_001012331、NP_001012331.1）である。配列番号２で表わされるアミノ酸配列はヒトＴｒｋ受容体Ｂ（以下、Ｔｒｋ受容体Ｂを単に「ＴｒｋＢ」という。）のアミノ酸配列（アクセッション番号：NM_006180、NP_006171.2）である。配列番号３で表わされるアミノ酸配列はヒトＴｒｋ受容体Ｃ（以下、Ｔｒｋ受容体Ｃを単に「ＴｒｋＣ」という。）のアミノ酸配列（アクセッション番号：NM_001012338、NP_001012338.1）である。ＳＨＰ－１はヒトＴｒｋＡの第４９０位のチロシンの位置で複合体を形成することが知られており（Marsh, H.N., et al. J Cell Biol 163, 999-1010 (2003)）、ヒトＴｒｋＢでは第５３２位のチロシン、ヒトＴｒｋＣでは第５１５位のチロシンがＳＨＰｓとの結合に関与することが推定される。
　すなわち、ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害するペプチドとして、ヒトＴｒｋＡの全長または第４９０位のチロシンを含むフラグメント（部分断片）、ヒトＴｒｋＢの全長または第５３２位のチロシンを含むフラグメント、ヒトＴｒｋＣの全長または第５１５位のチロシンを含むフラグメントを好適に用いることができる。フラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個以下である。
　ヒトＴｒｋＡ、ヒトＴｒｋＢ、ヒトＴｒｋＣは、ＳＨＰｓとの結合性を有している限りにおいてそれぞれ第４９０位、第５３２位、第５１５位のチロシンのチロシン以外の配列部分おいて、変異を有するものでもよい。すなわち、上記（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）のペプチドもＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害するペプチドとして好適に使用することができる。ここで「１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害する好適なペプチドとして、具体的には、例えば配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、および、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号４で表わされるアミノ酸配列は配列番号１の第４８１位－第４９４位に該当し、配列番号５で表わされるアミノ酸配列は配列番号１の第４８４位－第４９７位に該当する。これらのペプチドは、マウス小脳顆粒細胞を用いた実験において、ＭＡＧが誘導する神経突起成長阻害効果を低下させることが確認されている（実施例参照）。なお、ＳＨＰｓとの結合性を有している限りにおいて、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列が上述の変異を有していてもよいことは言うまでもない。また、ヒト以外の哺乳動物のＴｒｋ受容体およびＳＨＰｓとの結合性を有するそのフラグメントも、ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害するペプチドとして好適に用いることができる。
　上記（ａ）～（ｆ）のペプチドは、（Ｉ）公知の遺伝子工学的手法により所望のペプチドの組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより製造することができる。または、（ＩＩ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によって製造することができる。または、（ＩＩＩ）公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。
　上記（ａ）～（ｆ）のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(－ＣＯＯ－)、アミド（－ＣＯＮＨ２）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピルもしくはｎ－ブチルなどのＣ１－６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３－８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α－ナフチルなどのＣ６－１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－Ｃ１－２アルキル基もしくはα－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基などのＣ７－１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されていてもよい。
　さらに、上記（ａ）～（ｆ）のペプチドは、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されていてもよく、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されているものでもよい。
　上記（ａ）～（ｆ）のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ－ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
　ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質として、例えば、ＳＨＰｓに対する抗体またはＴｒｋ受容体に対する抗体であって、ＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害する抗体、ＳＨＰｓのＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する抗体が挙げられる。このような抗体は、ＳＨＰ－１もしくはそのフラグメント、ＳＨＰ－２もしくはそのフラグメント、またはＴｒｋ受容体もしくはそのフラグメントを免疫原として用い、公知の方法で作製することができる。得られた抗体がＳＨＰｓとＴｒｋ受容体との結合を阻害すること、または、ＳＨＰｓのＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害することを確認すればよい。
　抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。
　抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲ（相補性決定領域：complementarity determining region）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものをいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体などとも称される。ヒト化抗体のＦＲ（フレームワーク領域：framework region）は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＷのアミノ酸配列を置換してもよい。ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列は、公知のデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等）から取得することができる。
　ＳＨＰｓの発現を阻害する物質としては、例えば、ＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ＳＨＰ－１遺伝子としては、例えば配列番号７に示される塩基配列からなるヒトＳＨＰ－１遺伝子（アクセッション番号：NM_002831）、配列番号８に示される塩基配列からなるマウスＳＨＰ－１遺伝子（アクセッション番号：NM_013545）、配列番号９に示される塩基酸配列からなるヒトＳＨＰ－２遺伝子（アクセッション番号：NM_002834）、配列番号１０に示される塩基酸配列からなるマウスＳＨＰ－２遺伝子（アクセッション番号：NM_011202）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＳＨＰ遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１～２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においてはＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
〔医薬組成物〕
　本発明は、上記本発明の神経成長促進剤を含有する中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、換言すれば、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質を有効成分とする中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物である。中枢神経障害としては、例えば、脳血管障害、脳外傷、脊髄損傷等が挙げられる。脳血管障害としては、例えば、脳卒中、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血等が挙げられる。中枢神経障害による後遺症としては、運動機能障害、感覚機能障害、言語障害等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、ＳＨＰｓの阻害物質を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　ＳＨＰｓの阻害物質がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。抗体を含む注射剤または輸液は、溶液、懸濁液または乳濁液として用いることができる。その溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。さらに、この注射剤または輸液は、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。安定剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ－５０等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。
　ＳＨＰｓの阻害物質が核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ－リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５～７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ～４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ～２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
　本発明には、上記本発明の神経成長促進剤の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする中枢神経障害による後遺症改善方法が含まれる。また、本発明には、中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物を製造するための、上記本発明の神経成長促進剤の使用が含まれる。また、本発明には、中枢神経障害による後遺症改善に使用するための、上記本発明の神経成長促進剤が含まれる。
〔スクリーニング方法〕
　今回、本発明者らが見出したシグナル伝達経路に関する新規な知見により、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質は神経成長促進剤の有効成分として有用であることが明らかとなった。つまり、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２は、神経成長促進剤の有効成分をスクリーニングするために使用できることが明らかとなった。したがって、本発明には、神経成長促進剤の有効成分をスクリーニングするためのＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の使用が含まれる。神経成長促進剤の有効成分となり得るＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質は特に限定されないが、以下の（Ａ）～（Ｃ）などが挙げられる。
（Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質
（Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質
（Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質
　本発明は、被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。また、本発明は、被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
　被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる方法は特に限定されない。例えば、(1)Ｔｒｋ受容体またはＴｒｋ受容体の細胞内ドメインを含むフラグメント、および、(2)ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２またはその両方、を含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。本発明のスクリーニング方法に用いるＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとしては、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインを含むものであればよく、全長のＴｒｋ受容体またはＴｒｋ受容体の細胞内ドメインを含むフラグメントを好適に用いることができる。なお、Ｔｒｋ受容体Ａでは配列番号１の第４３４位～第７９０位、Ｔｒｋ受容体Ｂでは配列番号２の第４５５位～第８３８位、Ｔｒｋ受容体Ｃでは配列番号３の第４５４位～第８３９位が細胞内ドメインに該当する。本発明のスクリーニング方法に用いるＴｒｋ受容体またはＴｒｋ受容体の細胞内ドメインを含むフラグメント、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２は、例えば公知の遺伝子組み換え技術を用いて取得することができる。
　Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合状態を確認する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、ＥＬＩＳＡ法を好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いて本発明のスクリーニング方法を実施する場合、(1)Ｔｒｋ受容体またはＴｒｋ受容体の細胞内ドメインを含むフラグメント、または、(2)ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２またはその両方、のいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、(1)と(2)の結合状態を適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を確認する方法も特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、市販の抗リン酸化チロシン抗体を用いることにより、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を容易に確認することができる。
　Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合状態を確認した結果、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合を阻害する物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質として選択することができる。また、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を確認した結果、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインの脱リン酸化を阻害する物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質として選択することができる。阻害は完全に阻害することを要するものではなく、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２が本来有しているＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとの結合活性、または、Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインの脱リン酸化活性を減弱するものであればよい。
　被験物質と接触していないコントロールの結合活性レベル、または脱リン酸化活性レベルを基準として、被験物質がこれらの活性レベルを低下させていれば、神経成長促進剤の有効成分候補物質と判定することができる。好ましくは上記の活性レベルを５０％以下に低下させる被験物質、より好ましくは２５％以下に低下させる被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質と判定する。
　本発明は、被験物質とＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量を確認可能な細胞とを接触させる工程と、被験物質と接触した細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量と、被験物質と接触していない細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量とを比較する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
　ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量を確認可能な細胞としては、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２を発現している細胞株、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２を発現している神経細胞、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２のレポーターアッセイ用のベクターが導入された細胞等が挙げられる。ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２を発現している細胞株としては、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａ、ＰＣ１２などが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２を発現している神経細胞としては、大脳皮質細胞、海馬細胞、小脳細胞などが挙げられ、これらの初代培養細胞を好適に用いることができる。ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量を確認可能な細胞と被験物質とを接触させる方法は特に限定されないが、例えば、被験物質を添加した培養液を用いて細胞を培養する方法が挙げられる。また、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させてもよい（実施例１(7-1)、図２９参照）。
　発現量は、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２のタンパク質量、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２のｍＲＮＡ量、レポーターアッセイのレポーター発現量等により表すことができる。タンパク質量、ｍＲＮＡ量、レポーター発現量等は、公知の方法を適宜選択して定量することができる。被験物質と接触した細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量と、被験物質と接触していない細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量とを比較し、被験物質と接触した細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量が低下していれば、当該被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質と判定することができる。好ましくは発現量を５０％以下に低下させる被験物質、より好ましくは２５％以下に低下させる被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質と判定する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
〔実験材料および実験方法〕
（１）動物
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）をチャールス・リバー・ラボラトリー社より購入し、大阪大学大学院医学系研究科・動物実験施設で飼育した。ＰＩＲ－Ｂ－/－マウスは、Ｕｊｉｋｅら（Ujike, A., et al. Impaired dendritic cell maturation and increased T(H)2 responses in PIR-B(-/-) mice. Nat Immunol 3, 542-548 (2002).）に記載のように作製し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとバッククロスした。標的であるｐ７５遺伝子の第３エクソンの破壊を保持しているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統を使用した。この系統は元々ジャクソン研究所で得られた。すべての実験手順は、大阪大学の組織委員会による承認を得た。
（２）試薬および抗体
　以下の試薬を実験に使用した。精製ＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）、組換えラットＮｏｇｏＡ－Ｆｃ（200nM、R&D Systems）、マウスＯＭｇｐ（2μg/mL、R&D Systems）、ＢＤＮＦ（100ng/mL、Peprotech）、ＮＳＣ－８７８７７（50μM、Calbiochem）、Ｋ２５２Ａ（100nM、Alomone Labs）。
　ＴＡＴ－ＴｒｋＡペプチド４８１－４９４（TAT-QGHIIENPQYFSDA：配列番号４）、ＴＡＴ－ＴｒｋＡペプチド４８４－４９７（TAT-IIENPQYFSDACVH：配列番号５）およびＴＡＴ融合コントロールペプチド（TAT-HVCAESFYQPNEII：配列番号６）は、化学的に合成した（Sigma-Aldrich）。
　安定的にヒトＭＡＧ－Ｆｃを分泌するＣＨＯ細胞は、神戸大学の遠藤氏から供与された。この細胞は、無血清培地を用いて培養した。３日間培養後に培地を回収し、プロテインＡセファロースビーズを用いてＭＡＧ－Ｆｃを精製した。
　免疫沈降、ウエスタンブロットおよび免疫染色には、以下の抗体を使用した。モノクローナル抗体として、抗ＨＡ抗体（HA-7、1:5000、Sigma-Aldrich）、抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（9E10、1:1000、Santa Cruz Biotechnology）、ビオチン標識抗ＴｒｋＢ抗体（1:2500、R&D systems）、抗ＳＨＰ－１抗体（1:1000、BD Transduction Laboratories）、抗ＳＨＰ－２抗体（1:1000、BD Transduction Laboratories）、抗αチューブリン抗体（1:1000、Santa Cruz Biotechnology）、抗ニューロナルクラスＩＩＩβチューブリン抗体（1:5000、Covance Laboratories）を使用した。ポリクローナル抗体として、抗ｐ７５抗体（1:1000、Promega）、抗ＳＨＰ－１抗体、抗ＳＨＰ－２抗体、抗Ｔｒｋ抗体、抗ＴｒｋＢ抗体、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体（以上1:1000、Santa Cruz Biotechnology）、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体（1mg/mL、R&D systems）、抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体（1:1000、BD Pharmingen）を使用した。ＨＲＰ標識抗マウス、抗ウサギ、抗ラットＩｇＧ二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Roche Applied Science）、Ａｌｅｘａ４８８または５６８標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Molecular Probes）を使用した。
（３）プラスミドおよびｓｉＲＮＡ
　Ｎ末端にＨＡタグまたはＭｙｃタグを付加した全長ｐ７５をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）にサブクローニングした（Yamashita, T., et al. J Cell Biol 157, 565-570 (2002)）。ｐ７５の細胞外ドメインおよび細胞内ドメインは、ｐ７５－ＨＡから調製した。ＰＩＲ－ＢをコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｒｏ（＋）ベクターにサブクローニングした（Endo, S., et al. Proc Nat Acad Sci USA 105, 14515-14520 (2008)）。ＴｒｋＢの発現ベクターはＢａｒｄｅ Ｙ－Ａから供与された（Bibel, M., Hoppe, E. & Barde, Y.A. EMBO J 18, 616-622 (1999)）。ＴｒｋＢの哺乳細胞発現ベクターはＡｄｄｇｅｎｅから購入した。
　以下のｓｉＲＮＡをノックダウン実験に使用した。マウスＳＨＰ－１用、マウスＳＨＰ－２用（ON-TARGET plus SMARTpool、Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products）およびマウスＮＴＲＫ２用（stealth siRNA、Invitrogen）。なお、ON-TARGET plus SMARTpoolは、４種類の２本鎖ｓｉＲＮＡのミクスチャーである。
（４）細胞培養
　ＣＯＳ－７細胞は１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）を用いて培養した。ＣＯＳ－７細胞への一過的なトランスフェクションには、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を取扱説明書に従って使用した。トランスフェクションから２４～４８時間後に細胞を溶解し、免疫沈降に供した。７日齢マウス由来の小脳顆粒細胞（ＣＧＮｓ）の初代解離培養は、Ｈａｔａら（Hata, K., et al. J Cell Biol 184, 737-750 (2009)）の記載に従って行った。すなわち、マウス小脳を０．２５％トリプシン（Gibco/Invitrogen）およびＤＮａｓｅＩ（Takara）で３７℃１５分間消化した後、細胞を穏やかに解離した。１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加し、細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。続いて、得られたＣＧＮｓをポリ－Ｌ－リジンコートディッシュに播種し、Ｂ２７（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件で維持した。２４時間後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を交換した。２４時間インキュベーションした後ＣＧＮｓを回収し、免疫沈降またはウエスタンブロッティングに供した。
（５）ヌクレオフェクション
　上記（４）で得た小脳顆粒細胞を洗浄し、予め室温に温めたマウスニューロンヌクレオフェクター溶液（Amaxa）に、終濃度５×１０６個／１００μＬとなるように再懸濁した。細胞懸濁液（100μL）と、種々の２本鎖ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（標的部位なし）５００ｐｍｏｌとを穏やかに混合した後キュベットに移し、ヌクレオフェクタープログラムＯ－０５を用いてヌクレオフェクションを行った。エレクトロポレーションの直後に、予め温めた５００μＬの１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて細胞を混和し、細胞懸濁液をポリ－Ｌ－リジンコートディッシュに播種した。細胞をインキュベーターに静置し、３時間後にＢ２７を含む新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２と培地交換し、４８～７２時間培養を続けた。その後、無血清培地に交換し、免疫沈降またはウエスタンブロッティングに供した。あるいは、培地を除いてポリ－Ｌ－リジンコートディッシュに播種し、神経突起伸長試験に供した。
（６）免疫沈降
　細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷上でプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche Diagnostics）を含む溶解バッファー（50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 0.5-1% NP-40, 10mM NaF, 1mM Na3VO4）に溶解し、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。上清を所望の抗体とともに４℃で２時間または一夜インキュベーションした。免疫複合体の回収には、プロテインＡもしくはプロテインＧ－セファロース（GE Healthcare）、または、０．１－０．５％のＢＳＡでプレコートしたストレプトアビジン－アガロースビーズ（Thermo Scientific）を用いて４℃、１時間の処理を行った。ビーズを溶解バッファーで３回洗浄後、２５μＬの２×サンプルバッファーで５分間煮沸してタンパク質を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ウエスタンブロッティングを行った。細胞の処理には２５μｇ／ｍＬのＭＡＧ－Ｆｃまたは組換えヒトＩｇＧ－Ｆｃ（R&D systems）を使用した。
（７）ウエスタンブロッティング
　細胞溶解液をサンプルバッファー中で５分間煮沸した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で調製した５％脱脂粉乳を用いてメンブレンをブロッキングし、ＰＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体とともに室温で１時間または４℃で一夜インキュベーションした。メンブレンをＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology）またはストレプトアビジン－ＰＯＤ（Roche Applied Science）でインキュベーションした。検出には、ＥＬＣ化学発光システム（GE Healthcare）を使用した。
（８）神経突起伸長試験
　神経突起伸長試験は、Ｈａｔａら（Hata, K., et al. J Cell Biol 173, 47-58 (2006)）の方法に従って実施した。すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に溶解したＭＡＧ－Ｆｃまたはコントロール（ＤＭＥＭ／Ｆ１２のみ）で２４時間処理した後、小脳顆粒細胞（ＣＧＮｓ）を４％（w/v）パラホルムアルデヒドで固定し、ＴｕＪ１を認識するモノクローナル抗体で免疫染色した。
（９）視神経損傷モデルによる試験
　視神経損傷モデルマウスは、Ｓｍｉｔｈら（Smith, P.D., et al. Neuron 64, 617－623 (2009)）の記載に従って作製した。すなわち、左視神経を眼窩内に曝し、視神経円板の後方約１ｍｍの位置を微細な鉗子で１０秒間締め付けた。続いて、１．５μｇのｓｉＲＮＡを含む溶液３μＬを硝子体内に注入した。軸索切断の１週間後に２回目の注入を行った。軸索切断後の１２日目に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商品名、2μg/μL、Invitrogen）と結合したコレラ毒素βサブユニット（ＣＴＢ）１μＬを硝子体内にガラス製の針を用いて注入した。軸索切断後の１４日目に、過麻酔によりマウスを安楽死させ、４％ＰＦＡで還流し、眼球を摘出した。レンズと硝子体を取り除いた残りの、神経部分を有する眼杯を、４％ＰＦＡを用いて、４℃で１２時間、後固定した。眼杯を、１０～３０％の蔗糖溶液を用いて４℃で一夜脱水処理し、ティシュー・テックＯ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド（商品名）に浸漬した。組織をドライアイスで凍結してクリオスタットを用いて連続断面（16μm）を作製し、ＭＡＳコートスライドグラス上に集めた。
（１０）軸索再生の定量
　コントロールソフトウェア（DP version 3.1.1.267、オリンパス）を用いるカメラ（DP71、オリンパス）付き顕微鏡（BX51、オリンパス）で、画像を取得した。軸索再生は、５枚の切片における圧搾部位の端から０．２、０．５および１．０ｍｍ伸長しているＣＴＢ標識軸索の数を数えることにより定量した。
（１１）統計解析
　結果は、３回の独立した実験の平均値±標準誤差で表した。統計解析は一元配置分散分析を行った後、ＳｃｈｅｆｆｅまたはＨｏｌｍまたはＢｏｎｆｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った。Ｐ値が０．０５より小さい場合に有意差ありとした。
〔結果〕
［１］ＰＩＲ－ＢとＴｒｋ受容体との相互作用の検討
　（1-1）ＨＡタグを付加した全長ＴｒｋＢ（ＨＡ－ＴｒｋＢ ＦＬ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体または抗ＨＡ抗体を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＨＡ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図１（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。両方の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＨＡ－ＴｒｋＢが析出され（図１（ａ）参照）、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された（図１（ｂ）参照）。これらの結果から、ＣＯＳ－７細胞において異所性に発現したＰＩＲ－ＢがＴｒｋＢと相互作用することが示された。
　（1-2）ＴｒｋＢに代えてＴｒｋＡを用いて同様の実験を行った。結果を図２（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。ＴｒｋＡの場合もＴｒｋＢと同様の結果が得られた。この結果から、ＣＯＳ－７細胞において異所性に発現したＰＩＲ－ＢがＴｒｋＡと相互作用することが示された。
　（1-3）細胞内ドメインの大部分を欠失したＴｒｋＢにＨＡタグを付加したタンパク質（ＨＡ－ＴｒｋＢ Ｔ１）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体または抗ＨＡ抗体を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＨＡ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図３（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＨＡ－ＴｒｋＢ Ｔ１は析出されず（図３（ａ）参照）、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂは析出されなかった（図３（ｂ）参照）。
　（1-4）ＴｒｋＢの細胞内ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ＨＡ－ＴｒｋＢ ＩＣＤ）発現ベクターまたはＰＩＲ－Ｂの細胞内ドメインにＭｙｃタグを付加したタンパク質（ＰＩＲ－Ｂ ＩＣＤ－Ｍｙｃ）発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗Ｍｙｃ抗体を用い、抗ＨＡ抗体および抗Ｍｙｃ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図４に示した。図４から明らかなように、両方の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降複合体にＨＡ－ＴｒｋＢ ＩＣＤが析出され、ＨＡ－ＴｒｋＢ ＩＣＤとＰＩＲ－Ｂ ＩＣＤ－Ｍｙｃの相互作用が確認された。図３および図４に示した結果から、ＰＩＲ－ＢとＴｒｋＢとは、細胞外ではなく細胞内で相互作用することが明らかとなった。
　（1-5）７日齢マウス由来の小脳顆粒細胞（ＣＧＮｓ）をＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに細胞溶解液を調製し、免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体、抗ＴｒｋＢ抗体またはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＴｒｋＢ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図５（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＴｒｋＢ抗体またはコントロール抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。図５（ａ）からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃで処理した細胞のみ、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＴｒｋＢが析出された。また、図５（ｂ）からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃで処理した細胞のみ、抗ＴｒｋＢ抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された。これらの結果から、ＰＩＲ－Ｂはリガンド依存的にＴｒｋＢと相互作用することが示された。
　（1-6）ＰＩＲ－ＢとＴｒｋ受容体との相互作用において、Ｔｒｋ受容体と共に神経栄養因子受容体複合体を形成する分子であるｐ７５が必要であるかを評価するために、ｐ７５ＫＯマウス由来のＣＧＮｓを用いて実験を行った。すなわち、野生型（ＷＴ）マウスおよびｐ７５ＫＯマウス由来のＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに細胞溶解液を調製し、免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用い、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＴｒｋＢ抗体で検出した。また、検出抗体に抗ｐ７５抗体、抗ＴｒｋＢ抗体、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗チューブリン抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図６（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は免疫沈降の結果であり、（ｂ）は細胞溶解液のウエスタンブロッティングの結果である。図６（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ＰＩＲ－ＢとＴｒｋＢとの相互作用にｐ７５は必要ないことが示された。
　以上の結果から、ＰＩＲ－Ｂへのリガンドの結合がＰＩＲ－ＢとＴｒｋＢとの相互作用を引き起こすことが明らかとなった。
［２］ＰＩＲ－Ｂ－Ｔｒｋ受容体複合体とＳＨＰとの結合の検討
　免疫系の細胞において、ＰＩＲ－Ｂはリガンドの結合によってリン酸化され、これによってＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２をＰＩＲ－Ｂに引き寄せることが知られている。そこで、ＭＡＧのシグナル伝達におけるＳＨＰの役割を検討した。
　（2-1）全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターおよびＨＡタグを付加した全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞をＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに細胞溶解液を調製し、免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＳＨＰ－２抗体を用い、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＳＨＰ－２抗体で検出した。また、検出抗体に抗ＰＩＲ－Ｂ抗体、抗ＳＨＰ－２抗体および抗ＨＡ抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図７に示した。図７からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃで処理していない細胞において抗ＳＨＰ－２抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された。また、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合が増進した。
　（2-2）７日齢マウス由来の小脳顆粒細胞（ＣＧＮｓ）を用いてＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合を検討した。ＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに細胞溶解液を調製し、免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体、抗ＳＨＰ抗体またはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＳＨＰ－２抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図８（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体またはコントロール抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＳＨＰ－２抗体またはコントロール抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。図８（ａ）からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃで処理していない細胞において抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＳＨＰ－２が析出された。また、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合が増進した。また、図８（ｂ）に示した結果も同様に、ＭＡＧ－Ｆｃで処理していない細胞において抗ＳＨＰ－２抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された。また、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合が増進した。
　これらの結果から、トランスフェクションされたＣＯＳ－７細胞およびＣＧＮｓにおけるＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２との相互作用は、リガンド依存的に増進されることが示された。
　（2-3）ＰＩＲ－Ｂ－ＳＨＰ－２複合体の形成にＴｒｋＢが関与するか否かを検討した。ＨＡタグを付加したＴｒｋＢ発現ベクターおよびＰＩＲ－Ｂ発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞、またはＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）で１５分間処理し、または処理せずに細胞溶解液を調製し、免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＴｒｋＢ抗体またはコントロール抗体（抗ＩｇＧ抗体）を用い、抗ＳＨＰ－２抗体および抗ＴｒｋＢ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図９（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）はＣＯＳ－７細胞の結果であり、（ｂ）はＣＧＮｓの結果である。図９（ａ）からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃで処理していないＣＯＳ－７細胞において抗ＴｒｋＢ抗体を用いた免疫沈降複合体にＳＨＰ－２が析出された。また、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合が増進した。また、図８（ｂ）に示した結果も同様に、ＭＡＧ－Ｆｃで処理していない細胞において抗ＳＨＰ－２抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された。また、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＰＩＲ－ＢとＳＨＰ－２の結合が増進した。
　以上の結果から、ＳＨＰ－２は、ＭＡＧ刺激後にＰＩＲ－Ｂ－ＴｒｋＢ受容体複合体に引き寄せられることが明らかになった。
［３］ＭＡＧ刺激によるＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２依存的なＴｒｋ受容体の脱リン酸化誘導の検討
　ＰＩＲ－Ｂ、Ｔｒｋ受容体およびＳＨＰ－２はＭＡＧ刺激に反応して複合体を形成することが明らかとなった。そこで、ＳＨＰｓがＴｒｋ受容体の活性を制御するか否かを検討した。
　（3-1）ＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）の存在下または非存在下で３０分間処理した。ＭＡＧ－Ｆｃ処理群および非処理群のそれぞれについて、最後の５分間に１００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）を添加する群と添加しない群を設けた。処理後細胞溶解液を調製し、抗ｐａｎＴｒｋ抗体を用いて免疫沈降を行った。検出には抗リン酸化チロシン抗体および抗Ｔｒｋ抗体を使用した。さらに、ウエスタンブロッティングの結果から、Ｔｒｋ受容体のリン酸化レベルを算出した。
　結果を図１０に示した。図１０からわかるように、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＴｒｋ受容体のチロシンが脱リン酸化された。
　（3-2）ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターおよびＭｙｃタグを付加したｐ７５発現ベクター、ならびにＨＡタグを付加したＴｒｋＢまたはＴｒｋＡ発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を用いて（3-1）と同様の実験を行った。
　結果を図１１（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）はＨＡ－ＴｒｋＢを発現するＣＯＳ－７細胞を用いてＢＤＮＦ処理を行った結果であり、（ｂ）はＨＡ－ＴｒｋＡを発現するＣＯＳ－７細胞を用いてＮＧＦ（神経成長因子）処理を行った結果である。いずれの結果も上記（3-1）と同様であり、ＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＴｒｋ受容体のチロシンが脱リン酸化された。
　（3-3）ＭＡＧ－Ｆｃが誘導するＴｒｋ受容体の脱リン酸化がＳＨＰに依存するものであるか否かを確認するために、ＳＨＰ阻害剤であるＮＳＣ－８７８７７（8-hydroxy-7-(6-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl-quinoline-5-sulfonic acid）を使用して実験を行った。すなわち、ＣＧＮｓをＮＳＣ－８７８７７で３時間前処理した後、上記（3-1）と同様の実験を行った。
　結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、ＮＳＣ－８７８７７で前処理を行うことにより、ＭＡＧ－Ｆｃ処理を行ってもＴｒｋ受容体の脱リン酸化が誘導されなかった。
　（3-4）ＳＨＰ阻害がＭＡＧ－Ｆｃが誘導するＴｒｋ受容体の脱リン酸化を無効にすることを確認するために、ｓｉＲＮＡを用いてＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のノックダウン実験を行った。ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡまたはＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡをＣＧＮｓにトランスフェクションし、７２時間後にＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）の存在下または非存在下で３０分間処理した。その後上記（3-1）と同様の実験を行った。
　結果を図１３（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）はＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡを用いた結果を示し、（ｂ）はＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡを用いた結果を示す。図１３（ａ）および（ｂ）から明らかなように、いずれのｓｉＲＮＡを用いた場合にも、対応するＳＨＰの発現を減少させ（各下段参照）、ＭＡＧ－Ｆｃが誘導するＴｒｋ受容体の脱リン酸化を消失させた。これらの結果から、Ｔｒｋ受容体のリン酸化状態に関するＭＡＧの効果を完全に減弱するためには、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のいずれか一方のノックダウンで十分であることが明らかとなった。したがって、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の両方、または両ホスファターゼの全活性のある程度の量が、Ｔｒｋ受容体に関するＭＡＧの効果に必要であると考えられた。
　（3-5）ＰＩＲ－Ｂ ＫＯマウス（Ujike, A., et al. Nat Immunol 3, 542-548 (2002)）を用いてＭＡＧの効果におけるＰＩＲ－Ｂの役割を検討した。ＰＩＲ－Ｂ ＫＯマウスからＣＧＮｓを調製し、野生型（ＷＴ）マウスおよびＰＩＲ－Ｂ ＫＯマウス由来のＣＧＮｓを用いて上記（3-1）と同様の実験を行った。
　結果を図１４に示した。図１４から明らかなように、ＰＩＲ－Ｂ ＫＯマウス由来のＣＧＮｓにおけるＴｒｋ受容体の脱リン酸化レベルは、ＷＴマウスのレベルより低かった。この結果から、ＭＡＧ－Ｆｃが誘導するＴｒｋ受容体の脱リン酸化にＰＩＲ－Ｂが必要であることが明らかとなった。
［４］ＭＡＧの神経突起成長阻害効果におけるＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２要求性の検討
　（4-1）ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡ、ＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡ、コントロールｓｉＲＮＡ、またはＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡとＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡの両方をＣＧＮｓにトランスフェクションし、ポリ－Ｌ－リジンコートしたディッシュを用いてＭＡＧ－Ｆｃの存在下または非存在下で２４時間培養した。各細胞の最も長い神経突起の長さを測定し、その平均値を求めた。
　結果を図１５（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は各群の神経突起の長さを比較した図であり、（ｂ）は代表的な細胞の形態を表す顕微鏡写真である。なお、（ｂ）のスケールバーは１０μｍを示す。図１５（ａ）から明らかなように、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のいずれか一方のノックダウンは、ＭＡＧ－Ｆｃによる神経突起成長阻害効果を減弱させた。ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のダブルノックダウンは、ＭＡＧ－Ｆｃによる神経突起成長阻害効果を完全に減衰させた。したがって、ＭＡＧ－Ｆｃによる神経突起成長阻害には、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の両方が必要であることが明らかとなった。
　（4-2）ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２はＴｒｋ受容体の活性を阻害すると考えられるので、上記（4-1）の結果は、Ｔｒｋ受容体の定常活性がＣＧＮｓにおける神経突起の成長の一因であることを示唆するものである。これを確認するために、ｐａｎ－ＴＲＫ阻害剤のＫ２５２ａを用いて実験を行った。すなわち、ＣＧＮｓの培地にＭＡＧ－Ｆｃを添加する１５分前にＫ２５２ａを添加し、ポリ－Ｌ－リジンコートしたディッシュを用いてＭＡＧ－Ｆｃの存在下または非存在下で２４時間培養した。各細胞の最も長い神経突起の長さを測定し、その平均値を求めた。
　結果を図１６に示した。図１６から明らかなように、Ｋ２５２ａはＭＡＧ－Ｆｃと同様の効果を奏し、有意に神経突起成長を阻害した。また、Ｋ２５２ａ処理したＣＧＮｓにおいて、ＭＡＧ－Ｆｃが神経突起成長をさらに低減することはなかった。
　（4-3）Ｋ２５２ａの非特異的阻害の可能性を排除するために、ＴｒｋＢのノックダウン実験を行った。すなわち、ＴｒｋＢｓｉＲＮＡ１またはＴｒｋＢｓｉＲＮＡ２またはコントロールｓｉＲＮＡをＣＧＮｓにトランスフェクションし、ポリ－Ｌ－リジンコートしたディッシュを用いてＭＡＧ－Ｆｃの存在下または非存在下で２４時間培養した。各細胞の最も長い神経突起の長さを測定し、その平均値を求めた。また、ウエスタンブロッティングによりＴｒｋＢの発現レベルを確認した。
　結果を図１７に示した。図１７から明らかなように、ＴｒｋＢをノックダウンすることにより、ＣＧＮｓの神経突起成長が有意にブロックされた。また、ＭＡＧ－Ｆｃの効果も消滅した。この結果は、ＭＡＧがＴｒｋＢの定常活性を低下させ、ＣＧＮｓの神経突起成長を阻害することを指示するものである。
［５］ＭＡＧ－Ｆｃの阻害効果において、ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２とＴｒｋＢとの結合が必要であるか否かを確認するための実験を行った。過去に、ＳＨＰ－１はＴｒｋＡの第４９０位のチロシンの位置で複合体を形成し、第６７４位および第６７５位のチロシンの位置で脱リン酸化することが報告されていることから（Marsh, H.N., et al. J Cell Biol 163, 999-1010 (2003)）、ＴｒｋＡの第４９０位のチロシンを含む配列からなる１４アミノ酸のペプチドを２種類デザインした（ＴｒｋＡ４８１－４９４、ＴｒｋＡ４８４－４９７）。また、これらのペプチドは細胞内に取り込まれる必要があるため、ＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質のＮ末端タンパク質導入ドメイン（１１アミノ酸）を融合し、ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４およびＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７を合成して使用した。
　（5-1）最初に、ＣＧＮｓをＦＩＴＣ標識ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７で３０分間処理して細胞に取り込まれたＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７の存在を蛍光顕微鏡観察により確認した。
　結果を図１８に示した。図１８から明らかなように、ＦＩＴＣシグナルの位置は、ＤＡＰＩ染色による細胞の位置と一致しており、３０分間処理することでＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７は十分に細胞内に取り込まれることが示された。ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４を用いた場合も同様であった。
　（5-2）ＣＧＮｓを１０μＭのＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７またはコントロールペプチドで１５分間前処理した後、ＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）の存在下または非存在下で１５分間処理し、細胞溶解液を調製して抗ＴｒｋＢ抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降複合体を抗ＳＨＰ－２抗体および抗Ｔｒｋ抗体で析出した。また、同じ抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図１９に示した。図１９から明らかなように、ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７が取り込まれたＣＧＮｓではＴｒｋＢとＳＨＰ－２との結合がブロックされた。データを示していないがＴｒｋＢとＳＨＰ－１との結合もブロックされた。ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４を用いた場合も同様であった。
　（5-3）ＣＧＮｓを１μＭもしくは１０μＭのＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７またはＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４で１５分間前処理し、ポリ－Ｌ－リジンコートしたディッシュを用いてＭＡＧ－Ｆｃの存在下または非存在下で２４時間培養した。各細胞の最も長い神経突起の長さを測定し、その平均値を求めた。
　結果を図２０（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）はＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７の結果を示す図であり、（ｂ）はＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４の結果を示す図である。図２０（ａ）および（ｂ）から明らかなように、ＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８４－４９７またはＴＡＴ－ＴｒｋＡ４８１－４９４を１μＭの濃度でＣＧＮｓに処理した場合に、ＭＡＧ－Ｆｃによる神経突起成長阻害効果を低下させた。
　以上の結果から、ＭＡＧのシグナル伝達においてＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体への結合が非常に重要であり、したがって、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質や、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体への結合を阻害する物質は神経成長促進剤の有効成分となり得ることが明らかとなった。
［６］ＰＩＲ－Ｂのシグナル伝達におけるｐ７５の関与の検討
　ＭＡＧの効果にｐ７５が必要であることが知られている。図６に示したように、ＰＩＲ－ＢとＴｒｋＢとの相互作用にｐ７５は必要ないが、ＰＩＲ－Ｂのシグナル伝達に必要であるか否かを検討した。
　（6-1）野生型（ＷＴ）マウスおよびｐ７５ＫＯマウス由来のＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）の存在下または非存在下で３０分間処理した。最後の５分間に１００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）を添加し、それぞれ細胞溶解液を調製した。抗ｐａｎＴｒｋ抗体を用いて免疫沈降を行った後、免疫沈降複合体を抗リン酸化チロシン抗体および抗Ｔｒｋ抗体で析出した。さらに、ウエスタンブロッティングの結果から、Ｔｒｋ受容体のリン酸化レベルを算出した。
　結果を図２１に示した。図２１からわかるように、ＷＴマウス由来のＣＧＮｓではＭＡＧ－Ｆｃ処理によりＴｒｋ受容体が脱リン酸化されたが、ｐ７５ＫＯマウス由来のＣＧＮｓではリン酸化状態に変化が生じなかった。この結果から、ＭＡＧが誘導するＴｒｋ受容体のチロシン脱リン酸化に、ｐ７５が必要であることが示された。
　（6-2）Ｃ末端にＨＡタグを付加した全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体または抗ＨＡ抗体を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＨＡ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２２（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。両方の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にｐ７５ ＦＬ－ＨＡが析出され（図２２（ａ）参照）、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された（図２２（ｂ）参照）。これらの結果から、ＰＩＲ－Ｂがｐ７５と相互作用することが確認された。
　（6-3）ｐ７５の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ｐ７５ ＥＣＤ＋ＴＭ－ＨＡ）発現ベクターまたは全長ＰＩＲ－Ｂ発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ｂ抗体または抗ＨＡ抗体を用い、それぞれ抗ＰＩＲ－Ｂ抗体および抗ＨＡ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２３（ａ）および（ｂ）に示した。（ａ）は抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行った結果であり、（ｂ）は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降を行った結果である。両方の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にｐ７５ ＥＣＤ＋ＴＭ－ＨＡが析出され（図２３（ａ）参照）、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降複合体にＰＩＲ－Ｂが析出された（図２３（ｂ）参照）。
　（6-4）ｐ７５の細胞内ドメインにＨＡタグを付加したタンパク質（ｐ７５ ＩＣＤ－ＨＡ）発現ベクターまたはＰＩＲ－Ｂの細胞内ドメインにＭｙｃタグを付加したタンパク質（ＰＩＲ－Ｂ ＩＣＤ－Ｍｙｃ）発現ベクターまたは両者をＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗Ｍｙｃ抗体を用い、抗Ｍｙｃ抗体および抗ＨＡ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２４に示した。両方の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降複合体にｐ７５ ＩＣＤ－ＨＡが析出された。
　この結果と図２３（ａ）および（ｂ）に示した結果から、ｐ７５は細胞外ドメインおよび細胞内ドメインの両方でＰＩＲ－Ｂと結合していることが確認された。
　（6-5）ｐ７５とＰＩＲ－Ｂのリガンド依存性結合について検討した。ＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）またはＮｏｇｏ－Ｆｃ（200nM）またはＯＭｇｐ（2μg/mL）の存在下または非存在下で３０分間処理し、細胞溶解液を調製して抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降複合体を抗ｐ７５抗体および抗ＰＩＲ－Ｂ抗体で析出した。また、同じ抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２５に示した。図２５からわかるように、各リガンド処理をしていない場合でも、抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にｐ７５がわずかに析出されたが、各リガンド処理を行った場合には、免疫沈降複合体中のｐ７５析出量が顕著に増加した。すなわち、ＰＩＲ－Ｂへのリガンドの結合は、ＰＩＲ－Ｂとｐ７５との結合を促進した。この結果から、ＰＩＲ－Ｂとｐ７５とＴｒｋ受容体とがミエリン由来の阻害物質に対する受容体複合体を形成する可能性が示唆された。
　（6-6）ＨＡタグを付加した全長ＴｒｋＢ（ＴｒｋＢ ＦＬ－ＨＡ）発現ベクターおよび全長ＰＩＲ－Ｂ（ＰＩＲ－Ｂ ＦＬ）発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞に、さらにＭｙｃタグを付加した全長ｐ７５（ｐ７５ ＦＬ－Ｍｙｃ）発現ベクターをトランスフェクションして培養した後、細胞溶解液を調製して免疫沈降を行った。免疫沈降には抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を用い、抗ＨＡ抗体、抗Ｍｙｃ抗体および抗ＰＩＲ－Ｂ抗体で検出した。また、同じ検出抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２６に示した。図２６からわかるように、３種の発現ベクターをトランスフェクションした細胞において、抗ＰＩＲ－Ａ／Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＴｒｋＢ ＦＬ－ＨＡおよびｐ７５ ＦＬ－Ｍｙｃが析出された。
　ＴｒｋＢ ＦＬ－ＨＡ発現ベクターに代えてＴｒｋＢ ＦＬ－ＨＡ発現ベクターを用いた場合も同様の結果が得られた（図２７参照）。
　（6-7）上記（6-6）で発現させたタンパク質をすべて内因性に発現しているＣＧＮｓを用いて同様の実験を行った。ＣＧＮｓをＭＡＧ－Ｆｃ（25μg/mL）の存在下または非存在下で３０分間処理し、細胞溶解液を調製して抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降複合体を抗Ｔｒｋ－Ｂ抗体、抗ｐ７５抗体および抗ＰＩＲ－Ｂ抗体で析出した。また、同じ抗体を用いて細胞溶解液のウエスタンブロッティングを行った。
　結果を図２８に示した。図２８からわかるように、抗ＰＩＲ－Ｂ抗体を用いた免疫沈降複合体にＴｒｋＢおよびｐ７５が析出された。
　以上の結果から、ＰＩＲ－Ｂとリガンドが結合した後に、ＰＩＲ－ＢはＴｒｋ受容体およびｐ７５と結合してＭＡＧに対する受容体複合体を形成することが明らかとなった。
［７］ＳＨＰノックダウンによる視神経再生促進の検討
　ＰＩＲ－Ｂシグナルの阻害がＣＮＳにおける軸索再生を増進するか否かを検討した。
　（7-1）視神経損傷モデルマウスを用い、ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２を阻害するためにｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡトランスフェクションを行った。ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡ、ＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡ、またはコントロールｓｉＲＮＡを投与した視神経損傷モデルマウスから視神経抽出液を調製し、ウエスタンブロッティングによりＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の発現を確認した。
　結果を図２９に示した。図２９から明らかなように、ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡおよびＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡは、それぞれ十分かつ特異的に標的のタンパク質の発現を低下させた。
　（7-2）各ｓｉＲＮＡをトランスフェクションされた視神経損傷モデルマウスのＣＴＢで標識された視神経の共焦点顕微鏡像を図３０に示した。また、損傷部位の端から０．２、０．５および１．０ｍｍ伸長しているＣＴＢ標識軸索数を定量した結果を図３１に示した。図３０および図３１から明らかなように、ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡおよびＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクションされたマウスでは、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションされたマウスと比較して、有意に軸索再生を促進した。なお、使用したマウスの匹数は、コントロールｓｉＲＮＡが６匹、ＳＨＰ－１のｓｉＲＮＡが６匹、ＳＨＰ－２のｓｉＲＮＡが７匹である。図３０中スケールバーは２００μｍを表し、＊は損傷部位を表す。図３１中＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す。
実施例２
〔ＳＨＰ－１とＴｒｋＢとの結合を阻害する物質のスクリーニング〕
　ＴｒｋＢ（全長）５μｇ／ｍＬを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃、１６時間インキュベートし、固相化した。被験物質およびＳＨＰ－１を各ウェルに添加して２時間反応させた後、ウェルを洗浄し、抗ＳＨＰ－１抗体（1μg/mL）およびＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体（1:1000）を用いてＴｒｋＢとＳＨＰ－１との結合状態を確認した。コントロール（被験物質添加なし）の結合状態と比較して、５０％以下の結合状態を示すウェルに添加した被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質として選択した。
〔ＳＨＰ－１によるＴｒｋＢのチロシン脱リン酸化を阻害する物質のスクリーニング〕
　ＴｒｋＢ（全長）５μｇ／ｍＬを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃、１６時間インキュベートし、固相化した。被験物質およびＳＨＰ－１を各ウェルに添加して２時間反応させた後、ウェルを洗浄し、抗リン酸化チロシン抗体（1μg/mL）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（1:1000）を用いてＴｒｋＢのリン酸化状態を確認した。コントロール（被験物質添加なし）のリン酸化状態（脱リン酸化）と比較して、脱リン酸化状態が５０％以下を示すウェルに添加した被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質として選択した。
〔ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の発現を阻害する物質のスクリーニング〕
　マウス由来の小脳顆粒細胞（ＣＧＮｓ）の培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に被験物質を添加し、３７℃で７２時間培養した。培養終了後細胞溶解液を調製し、ウエスタンブロッティングに供した。検出には、抗ＳＨＰ－１抗体および抗ＳＨＰ－２抗体を用いた。コントロール（被験物質添加なし）のＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２発現量と比較して、発現量が５０％以下に低下したウェルに添加した被験物質を神経成長促進剤の有効成分候補物質として選択した。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (12)

  1. 　ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の阻害物質を有効成分とする神経成長促進剤。
  2. 　前記阻害物質が、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかである請求項１に記載の神経成長促進剤。
    （Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質
    （Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質
    （Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質
  3. 　ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質が、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかである請求項２に記載の神経成長促進剤。
    （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
    （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第４９０位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第４９０位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
    （ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
    （ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第５３２位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５３２位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
    （ｅ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなるペプチド
    （ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列の第５１６位のチロシン以外の配列部分において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列またはその第５１６位のチロシンを含む部分配列からなり、かつＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２と結合するペプチド
  4. 　ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質が、配列番号４または配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載の神経成長促進剤。
  5. 　ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質が、ＳＨＰ－１遺伝子またはＳＨＰ－２遺伝子のｓｉＲＮＡである請求項２に記載の神経成長促進剤。
  6. 　請求項１～５のいずれかに記載の神経成長促進剤を含有することを特徴とする中枢神経障害による後遺症改善用医薬組成物。
  7. 　中枢神経障害が、脳血管障害、脳外傷または脊髄損傷である請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　神経成長促進剤の有効成分をスクリーニングするためのＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の使用。
  9. 　神経成長促進剤の有効成分が、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかである請求項８に記載の使用。
    （Ａ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２とＴｒｋ受容体との結合を阻害する物質
    （Ｂ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２のＴｒｋ受容体チロシン脱リン酸化酵素活性を阻害する物質
    （Ｃ）ＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２の発現を阻害する物質
  10. 　被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、
    　Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２との結合状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
  11. 　被験物質とＴｒｋ受容体の細胞内ドメインとＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２とを接触させる工程と、
    　Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメインのリン酸化状態を確認する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
  12. 　被験物質とＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量を確認可能な細胞とを接触させる工程と、
    　被験物質と接触した細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量と、被験物質と接触していない細胞におけるＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の発現量とを比較する工程とを包含することを特徴とする神経成長促進剤の有効成分候補物質のスクリーニング方法。
PCT/JP2011/054234 2010-02-26 2011-02-25 神経成長促進剤 Ceased WO2011105527A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010041180 2010-02-26
JP2010-041180 2010-02-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011105527A1 true WO2011105527A1 (ja) 2011-09-01

Family

ID=44506925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/054234 Ceased WO2011105527A1 (ja) 2010-02-26 2011-02-25 神経成長促進剤

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2011105527A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532637A (ja) * 2011-11-01 2014-12-08 ピーエイチ セラピューティクス リミテッド 肺高血圧症

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010043026A (ja) * 2008-08-13 2010-02-25 Japan Health Science Foundation チロシン脱リン酸化酵素のペプチド基質およびチロシン脱リン酸化酵素の阻害作用を有するペプチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010043026A (ja) * 2008-08-13 2010-02-25 Japan Health Science Foundation チロシン脱リン酸化酵素のペプチド基質およびチロシン脱リン酸化酵素の阻害作用を有するペプチド

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY: "Kizutsuita Shishinkei no Saisei o Yokusei suru Mechanism o Kaimei (Mouse no Jikken de Shishinkei Saisei ni Seiko)", PRESS RELEASE 2010 NENDO, 2 March 2011 (2011-03-02), OSAKA UNIVERSITY, Retrieved from the Internet <URL:http://www.jst.go.jp/pr/announce/20110302/index.html> [retrieved on 20110523] *
MARSH, H.N. ET AL.: "SHP-1 negatively regulates neuronal survival by functioning as a TrkA phosphatase", J. CELL BIOL., vol. 163, no. 5, 8 December 2003 (2003-12-08), pages 999 - 1010 *
ROSARIO, M. ET AL.: "The neurite outgrowth multiadaptor RhoGAP, NoMA-GAP, regulates neurite extension through SHP2 and Cdc42", J. CELL BIOL., vol. 178, no. 3, 30 July 2007 (2007-07-30), pages 503 - 516 *
WANG, N. ET AL.: "Antagonism or synergism: Role of tyrosine phosphatase SHP-1 and SHP-2 in growth factor signaling", J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 31, 4 August 2006 (2006-08-04), pages 21878 - 21883 *
YOKO AOKI: "Shinkei Kan Saibo ni Okeru Tyrosine Phosphatase SHP-2 no Yakuwari", IGAKU NO AYUMI, vol. 201, no. 5, 4 May 2002 (2002-05-04), pages 319 - 324 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532637A (ja) * 2011-11-01 2014-12-08 ピーエイチ セラピューティクス リミテッド 肺高血圧症

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2921774C (en) Immunoreceptor modulation for treating cancer and viral infections
JP4986370B2 (ja) Ｒｇｍおよびそのモジュレーターの用途
KR102223464B1 (ko) Ｔ 세포 활성화 저해제, 이것을 함유하는 의약 조성물 및 ｔ 세포 활성화 저해 물질의 스크리닝 방법
US20130101605A1 (en) Modulators and modulation of the interaction between rgm and neogenin
US11274131B2 (en) IgM-mediated receptor clustering and cell modulation
US20150071941A1 (en) Treatment of ischemic retinopathies
EP2048162A1 (en) Novel monoclonal antibody and use of the same
US20170202910A1 (en) Differentiation marker and differentiation control of eye cell
JP2005527235A (ja) デフェンシン：抗ウイルス剤の使用
US8906864B2 (en) Binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and their use
US20130336988A1 (en) Methods for treating early stage or mild neurological disorders
US20220380454A1 (en) Methods and compositions for treating alzheimer&#39;s disease
Gupta et al. Atypical cellular responses mediated by intracellular constitutive active TrkB (NTRK2) kinase domains and a solely intracellular NTRK2-fusion oncogene
WO2011105527A1 (ja) 神経成長促進剤
EP1878745B1 (en) Humanin receptor or humanin-like polypeptide receptor
US11999776B2 (en) IGFR-like 2 receptor and uses thereof
Gnana-Prakasam et al. Expression of the iron-regulatory protein haemojuvelin in retina and its regulation during cytomegalovirus infection
US20080125362A1 (en) Method of screening compound preventing cells from infection with Hepatitis C virus (HCV)
US20240317867A1 (en) Igfr-like 2 receptor and uses thereof
WO2011149096A1 (ja) インスリン抵抗性改善薬
JP2008506414A (ja) 癌についての治療標的としてのＭｙＤ８８
JP2008141995A (ja) 腸管ｍ細胞マーカーとしてのｇｐ２の使用
KR20240147948A (ko) Igsf1 특이적 결합 단백질 및 이의 용도
Heuermann The Role of HCN Channels and TRIP8b in Depression and Epilepsy
Bercsenyi et al. Nidogens are new therapeutic targets for the prevention of tetanus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11747483

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11747483

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP